Влияние криорадиационной обработки плазмы донорской крови на ее белковый состав тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Шангареева, Райхана Фаатовна

• Шангареева, Райхана Фаатовна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шангареева, Райхана Фаатовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Проблемы вирусной безопасности гемотрансфузий.

1.2 Эффективные технологии вирусной инактивации плазмы крови и ее препаратов.■.

1.2.1 Методы инактивации вирусов в плазме крови и ее препаратах.

1.2.2 Гамма-облучение, как один из возможных методов обеспечения стерильности плазмы и ее препаратов.

1.3 Основные белки плазмы крови. Значение и методы определения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Радиационная обработка незамороженной плазмы крови.

3.2 Влияние замораживания и транспортировки плазмы крови на ее основной белковый состав.'.

3.3 Влияние криорадиационной обработки плазмы донорской крови на ее белковый состав.

3.3.1 Содержание общего белка.

3.3.2 Изучение фракционного состава основных белков плазмы крови методом ВЭЖХ.

3.3.3 Электрофоретическое фракционирование белков плазмы крови.

3.3.3.1 Электрофорез на ацетат целлюлозных пластинах.

3.3.3.2 Электрофорез в полиакриламидном геле.

3.3.4 Изучение липопротеидного состава плазмы крови.'.

3.3.4.1 Фракционирование липопротеидов.

3.3.4.2 Определение содержания липидов.

3.3.5 Изучение коагуляционных показателей плазмы крови.

3.3.6 Функциональная активность белков системы комплемента.

3.3.7 Изучение концентрации водородных ионов в плазме крови.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.ПО

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние криорадиационной обработки плазмы донорской крови на ее белковый состав»

Актуальность проблемы. В современной медицине широко используются донорская кровь, ее компоненты и препараты. Вместе с тем, в клинической и производственной трансфузиологии имеется много нерешенных и сложных вопросов. Одним из ключевых аспектов гемотрансфузионной терапии во всем мире является ее вирусная безопасность (R.C. Gallo et al., 1984; D.W.Schwartz et al., 1995; Ю.М Зарецкая, С.И Донсков, 1998; M.A. Ажигирова, И.Р. Колонина, 1999; Г.И. Козинец с соавт., 1999; В.К. Калнберзс с соавт., 1999).

Случаи заражения вирусами иммунодефицита человека, гепатита В, С и другими патогенными агентами через плазму донорской крови и ее препараты приобретают опасно возрастающие цифры во всем мире (В. Cuthbertson, 1991; В.Н. Мигунов, 2001). Так, например, при обследовании 2615 доноров крови в Санкт-Петербурге было установлено, что у 1,3% доноров в крови присутствуют антитела к вирусу гепатита С (Е.Б. Жибурт с соавт., 1995). По материалам лабораторий диагностики СПИД в нашей республике за последние пять лет среди доноров выявлено 3,1% диагностированных случаев ВИЧ (М.М. Асылгужина с соавт. 1998), Сохраняется высокая частота выявления хронических носителей вируса гепатита В среди разовых (3,5 - 5,2%) и профессиональных (2,4%) доноров (А.Я. Мыльников с соавт., 1994).

При недостаточном контроле плазмы крови при ее заготовке, полученные из инфицированного сырья препараты продолжают печальную статистику заражения населения. Имеются сообщения об инфицировании вирусом гепатита С тысячи беременных женщин в Германии при применении иммуноглобулина (A. Tuffs, 1995), о вспышке острого гепатита С в Великобритании, связанного с применением внутривенного иммуноглобулина (С. Healey et al., 1996), о заражении гепатитом не-А, не-В после лечения иммуноглобулином в Скандинавии (К. Bjoro et al., 1994).

Опасность передачи вирусных инфекций через применение донорской плазмы крови и ее препаратов может быть реально снижена за счет соблюдения комплекса мер, в число которых входит разработка эффективных технологий инактивации вирусов крови и ее компонентов (В. Horowitz, 1988; E.JI. Назарова, Т.В. Кощеева, 1999).

Одним из таких предлагаемых методов является криорадиационная стерилизация.

Радиационный метод широко применяется в области стерилизации фармацевтических препаратов во многих странах мира (С.А.Сафаров, 1987). В настоящее время достаточно четко установлены типичные дозы излучения, необходимые для надежной обработки (обычно 20-30 кГр), разработано радиационное оборудование для высокопроизводительного процесса, решены вопросы безопасности работы установок для персонала и населения (В.Б. Осипов, 1985).

Основной проблемой при радиационной стерилизации любых препаратов, содержащих водную фазу, является разрушение компонентов действующего начала лекарственного средства за счет косвенного действия излучения (А.К.Пикаев, 1975; С.А. Сафаров, 1989; Д.В. Парамонов с соавт., 2000). Особенно чувствительны к структурным повреждениям соединения белковой природы.

Одним из способов устранения эффекта косвенного действия излучения и тем самым существенного снижения глубины радиационной деструкции является применение метода, названного авторами криорадиационной стерилизацией с программируемым замораживанием (В.И. Трофимов с соавт., 1981, 1985, 1995). Метод состоит в облучении препаратов в замороженном состоянии, при этом предварительное замораживание по специальной программе должно обеспечить создание такой гетерогенной фазовой структуры, в которой исключены вторичные реакции компонентов препаратов с продуктами радиолиза воды.Вопрос возможного применения криорадиационной обработки для плазмы крови в литературе широко не представлен.

-6В работах A.D. Kitchen et al., 1989; В. Cuthbertson et al., 1991; ЕВП №0334679, МПК A 61 L 2/08, 1989 показано, что радиационный метод обработки замороженной плазмы крови обеспечивает надежную инактивацию ВИЧ и ряда других вирусов - контаминантов. Но вопрос сохранения при этом основного белкового состава плазмы практически не изучен.

Более полно исследована устойчивость при криорадиационной обработке препаратов плазмы крови: альбумина (А.Х. Купцов с соавт., 1985), иммуноглобулина G (Т.Г. Нигматуллин с соавт., 1995). Именно при низких температурах радиационная обработка не приводила к заметному нарушению структуры указанных белков и характеристик готовых препаратов.

В литературе высказывается предположение, что наиболее эффективным применение данного метода будет для плазмы крови в ее нативном состоянии, что приведет к обеспечению безопасности сырья для изготовления белковых препаратов и устранению необходимости пост-производственной инактивации вирусов.

Учеными НТЦ «Лекбиотех» (г. Москва) и «Вектор» (г. Новосибирск) разработаны следующие режимы криорадиационной антивирусной обработки плазмы крови: комбинированное воздействие ультразвука и радиации в дозе (25+10) кГр; радиационное воздействие у-излучением дозами (25+10) кГр и (25+25) кГр.,Показано, что при данных режимах обработки происходит надежная инактивация вирусов гепатита А, В, С, осповакцины, аденовирусов, парво-вирусов. При этом остался не исследованным вопрос влияния указанных режимов на нативное состояние плазмы крови. В связи с вышеизложенным была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.

Цель исследования: Оценить влияние различных режимов криорадиационной обработки плазмы донорской крови, при которых происходит надежная инактивация ряда вирусов, на состояние ее основного белкового состава.

- ■/Задачи исследования:

1. Используя широкий спектр исследований биохимических показателей плазмы крови: определение содержания общего белка, концентрации водородных ионов, фракционного состава, электрофоретических свойств основных белков, липопротеидного состава, коагуляционных показателей, активности белков системы комплемента изучить: а) Состояние основных белков незамороженной плазмы крови после ее радиационной обработки дозами 20 и 30 кГр. б) Влияние процессов замораживания/оттаивания и транспортировки плазмы крови на ее белковый состав. в) Влияние на состояние белковых фракций следующих режимов обработки замороженной плазмы крови: комбинированного воздействия ультразвука и радиации дозой (25+10) кГр; радиационного воздействия у-излучения дозами (25+10) и (25+25) кГр.

2. Определить оптимальные режимы криорадиационной обработки плазмы крови, при которых не происходит значительных нарушений состава и свойств ее основных белков.

Научная новизна работы. Впервые проведены исследования по определению ряда основных параметров процесса подготовки к криорадиационной стерилизации плазмы донорской крови. Установлено, что замораживание плазмы крови по специальной программе до (-78) °С и ее транспортировка не оказывают существенного влияния на состав и содержание ее белков.

Впервые проведены исследования широкого спектра показателей плазмы донорской крови после ее криорадиационной обработки, обеспечивающей надежную инактивацию ряда вирусов-контаминантов. Показано, что режимы обработки плазмы: УЗ+(25+10) кГр, (25+10) кГр и (25+25) кГр не приводят к значительным деструктивным нарушениям ее основных белковых фракций: альбуминовой, а2-, (3-, у-глобулиновых; отдельных белковых комплексов: липопротеидов высокой и низкой плотности. При этом отмечено незначительное повышение содержания белков зоны a i-глобулинов при всех режимах обработки и снижение содержания липопротеидов очень низкой плотности при режиме (25+10) кГр. Происходит снижение активности лабильных белков плазмы крови: факторов свертывания (наименьшее при режиме (25+10) кГр, наибольшее при комбинированном воздействии ультразвука и и радиации) и белков системы комплемента (при режимах (25+10) и (25+25) кГр).

Практическая значимость. Результаты работы позволяют внести вклад в разработку метода криорадиационной стерилизации плазмы донорской крови с возможным применением данного метода в производстве препаратов плазмы крови: альбумина, иммуноглобулинов и ряда других.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Радиационная обработка незамороженной плазмы донорской крови дозами 20-30 кГр оказывает значительное влияние на состав и содержание ее основных белков: высокомолекулярных компонентов, иммуноглобулинов, альбумина, низкомолекулярных компонентов, факторов свертывания, белков системы комплемента.

2. Предварительное замораживание плазмы крови по специальной программе перед радиационной обработкой стабилизирует ее основные белки. Разработанные режимы замораживания / оттаивания и транспортировки плазмы крови не изменяют ее биохимические показатели.

3. Криорадиационная обработка плазмы донорской крови в режимах УЗ+(25+10) кГр, (25+10) кГр, (25+25) кГр не приводит к значительным функционально-структурных изменениям ее основных белков: альбумина, иммуноглобулинов G и А, трансферрина, церулоплазмина, липопротеидов высокой и низкой плотности. Более подвержен воздействию исследованных режимов ряд плазменных белков факторов свертывания крови и белков системы комплемента.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), научно-практической конференции с международным участием «Клиническая и производственная трансфузиология - единство целей» (Москва, 2001), IV съезде по радиационным исследованиям с международным участием (Москва, 2001), на заседании Башкирского отделения ВБО, Ученом совете ГУП «Иммунопрепарат» (2000-2002 г.г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шангареева, Райхана Фаатовна

выводы

1. Показано, что радиационная обработка незамороженной плазмы крови дозами 20 и 30 кГр значительно изменяет конформационную структуру ее основных белков: альбумина, иммуноглобулинов, высокомолекулярных и низкомолекулярных компонентов; факторов свертывания, белков системы комплемента.

2. Установлено, что замораживание плазмы крови по специальной программе до (-78) °С и транспортировка не изменяют состояние ее основных белковых фракций, что позволяет исключить возможное влияние указанных параметров при оценке предлагаемых режимов криорадиационной стерилизации.

3. Показано, что радиационная обработка предварительно замороженной по специальной программе плазмы крови в режимах УЗ+(25+10) кГр, (25+10) кГр, (25+25) кГр не приводит к нарушениям состояния ее основных белковых фракций: альбуминовой, иммуноглобулиновой, а2-, Р~ глобулиновых; белковых комплексов - липопротеидов высокой и низкой плотности.

4. Выявлено повышение содержания белков зоны а,-глобулинов при криорадиационной обработке плазмы всеми режимами, что, видимо, связано с частичной агрегацией белков данной фракции.

5. Показано, что при обработке плазмы крови в режиме (25+10) кГр происходит снижение содержания липопротеидов очень низкой плотности и увеличение триглицеридов.

6. Выявлен неодинаковый характер снижения активности плазменных факторов свертывания крови (наименьшее при режиме (25+10) кГр, наибольшее при режиме УЗ+(25+10) кГр). Отмечено снижение активности белков системы комплемента при режимах (25+10) и (25+25) кГр.

7. Установлено, что оптимальным режимом криорадиационной стерилизации плазмы донорской крови, при котором происходит наименьшее изменение ее основного белкового состава, является режим (25+10) кГр.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как отмечалось выше, настоящая работа является самостоятельной частью общей программы исследований по разработке надежного метода стерилизации плазмы крови и ее препаратов с целью инактивации возможных виру-сов-контаминантов при максимальном сохранении основных физико-химических и биологических свойств плазмы крови, обусловленных ее белковым составом.

Радиационная обработка плазмы крови при температуре (20±2) °С, как показано в наших исследованиях, приводит к значительным повреждениям структур плазменных белков. Этот факт подтверждается и литературными данными (J.S. Haskill, J.W. Hunt, 1967; Л.И. Харченко, Т.П. Павловская, 1973; D. Kowalsky, 1979; Н.Н. Соболева с соавт., 1980; L.N. Kirpichenok et al., 1997; B.C. Сааков, 2000).

Так, при дозах облучения 20 и 30 кГр незамороженной плазмы крови наблюдали повышение относительного содержания фракции высокомолекулярных белков плазмы на 73,5% и понижение содержания фракции иммуноглобулинов и альбумина на 8,13 и 61,2% соответственно.

Некоторый сдвиг величины рН обработанной плазмы в более щелочную сторону (на 0,23 - 0,28 ед.) связан, по-видимому, с увеличением в ней свободных аминогрупп, вследствие структурных изменений белков.

При определении активированного парциального тромбопластинового времени не происходило свертывания крови, что указывало на полную потерю активности антигемофильного глобулина А и В (факторов свертывания VIII и IX).

В этих условиях отмечали резкое падение активности всех компонентов комплемента на 67-83%о, при увеличении дозы облучения происходила полная потеря функциональной активности белков системы комплемента, что свидетельствует об их разрушении.

При увеличении дозы радиации наблюдали понижение содержания общих липидов на 12%, что, вероятно, указывает на частичный разрыв связей ли-пид-белок в липопротеидных комплексах.

Таким образом, полученные экспериментальные материалы согласуются с литературными данными в том, что радиационное облучение плазмы крови при положительных температурах обладает значительным повреждающим свойством практически для всех исследуемых белков.

Вышеизложенные факты подтверждают известное положение о косвенном действии излучения при радиационной обработке водных сред, содержащих растворенные соединения с высокой биологической активностью. Одним из способов устранения эффекта косвенного действия и тем самым существенного снижения глубины радиационной деструкции, является метод криорадиационной стерилизации с программируемым замораживанием (В.И. Трофимов с соавт., 1981, 1985, 1995). Метод состоит в облучении препаратов в замороженном состоянии, при этом предварительное замораживание по специальной программе должно обеспечить создание в среде такой гетерогенной фазовой структуры, в которой исключены вторичные реакции компонентов препаратов с продуктами радиолиза воды.

Было решено изучить вопрос возможного применения указанного способа стерилизации лекарственных средств, содержащих водную фазу, для обработки плазмы крови и ее препаратов. Для стабилизации белков плазмы крови при радиационной обработке необходимо провести ее предварительное замораживание. Такой подход к решению данной проблемы подтверждается и в работах В. Horowitz et al., 1985; A.D. Kitchen et al., 1989, B. Cuthbertson et al., 1991.

Для того, чтобы в дальнейших исследованиях при оценке влияния различных режимов криорадиационной обработки на белки плазмы исключить возможное действие замораживания и транспортировки, было решено выяснить влияние данных факторов на показатели плазмы крови.

Главным повреждающим фактором при низких температурах является кристаллизация льда. Обезвоживание при замораживании связано с образованием при этом концентрированных солевых растворов, которые приводят к денатурации белков. Плазма крови, как и многие биологические материалы, не повреждается при быстром и сверхбыстром замораживании, если температура, при которой она хранится, достаточно низка. В этих условиях после выделения льда остается меньше времени для действия концентрированных солевых растворов на белки до достижения их эвтектической точки. Скорость оттаивания играет также немаловажную роль. При медленном оттаивании плазмы образуется хлопьевидный осадок вследствие денатурации грубодисперсных белков (Е.Е.Никитин, И.В Звягин, 1971; Б.Е. Мовшев с соавт., 2001).

Авторы криорадиационного метода предложили замораживать плазму крови по специальной программе, которая направлена на создание гетерогенной фазовой структуры, где будут находиться плазменные белки с их максимальной концентрацией. Это обеспечило бы стабильность плазменным белкам при радиационном воздействии исследуемыми дозами гамма-излучения. Данный эффект достигается в диапазоне температур (-60) - (-90) °С.

При радиационной обработке в криостатах в качестве хладоагента применяли сухой лед (твердая углекислота), температура сублимации которой равняется (-78) °С. Поэтому и предварительное замораживание плазмы крови было решено проводить при данной температуре. Такое решение обосновывается и результатами наших исследований (глава 3, раздел 3.2).

Полученные результаты по влиянию замораживания при температуре (-78) °С на свойства плазмы крови позволили заключить, что существенных изменений при этом не происходило ни для одного исследуемого показателя.

При замораживании плазмы крови сохранился состав и содержание ее основных белковых фракций: высокомолекулярных компонентов, иммуноглобулинов, альбумина, низкомолекулярных компонентов плазмы. Сохранилась активность антигемофильного глобулина А и В, активность белков системы комплемента. Не изменилось содержание общих липидов. Наблюдали незначительное понижение рН плазмы при замораживании на 0,16 ед.

При изучении влияния транспортировки плазмы крови на ее белки, также не отмечали существенных изменений в указанных выше показателях.

Приведенные выше данные дают основание полагать, что нами отработан оптимальный режим замораживания / оттаивания плазмы крови для использования с целью уменьшения повреждающего действия радиации на ее белки.

Дальнейшие исследования заключались в изучении действия различных режимов антивирусной обработки плазмы крови на состояние ее основного белкового состава. Выбор режимов криорадиационной обработки плазмы крови был обусловлен следующими доводами, приведенными учеными НТЦ «Лек-биотех» и «Вектор».

Значительная часть опасных вирусов, контаминирующих кровь доноров (реально или потенциально) показывают достаточно высокую резистентность к действию у-изл учения. При понижении температуры резистентность вирусов повышается. И поглощенная доза излучения для надежного обеззараживания плазмы в данных опытах не может быть менее 40-60 кГр. Это большая величина («стерилизующая» доза при обработке медицинской продукции принята 25 кГр) как с точки зрения ее воздействия на свойства плазмы, так и с позиции экономичности и производительности при возможном использовании метода в иммунобиологическом производстве. По этой причине были проанализированы различные возможности снижения поглощенной дозы за счет применения наиболее простых в технологическом отношении дополнительных антивирусных воздействий.

В результате проведенных исследований таковыми стали:

1) комбинированное воздействие на плазму крови ультразвука и последующего у-излучения. Режим УЗ+(25+10) кГр.

2) облучение плазмы крови путем дробного воздействия при одной и той же суммарной поглощенной дозе с перерывами между облучениями.

Режимы (25+10) кГр и (25+25) кГр.

Указанные способы обеспечивали существенное снижение эффективной дозы излучения для инактивации вирусов в плазме крови.

Наша задача состояла в изучении влияния данных режимов обработки плазмы крови на ее белковый состав. Для исследований применяли как плазму крови от индивидуальных доноров, так и объединенную плазму от 7 и 100 доноров. Тем самым мы пытались учесть возможные различия и в объединенной плазме крови, так как белковые препараты в производственных условиях готовят из плазменных пулов.

В выборе методов исследований мы опирались на требования Фармакопейных статей на белковые препараты плазмы крови, а также опыт научных и клинико-диагностических лабораторий. В работе использовали следующие методы:

- определение содержания общего белка;

- изучение фракционного состава основных белков плазмы крови с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- электрофоретический анализ плазмы крови на ацетат целлюлозе и в полиак-риламидном геле; определение липопротеидного состава плазмы (содержание липопротеидов разных классов, общих липидов, общего холестерина, триглицеридов);

- исследование коагуляционных показателей плазмы крови (активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового, тромбиново-го времени, концентрации фибриногена);

- изучение функциональной активности белков системы комплемента;

- кислотно-основное равновесие плазмы крови (рН).

При определении содержания общего белка в обработанных образцах плазмы крови отмечали отсутствие значимых изменений исследуемого показателя относительно необработанной контрольной плазмы крови.

При разделении белков обработанной плазмы крови методами ВЭЖХ, разными формами электрофореза статистически значимых различий относительно контрольной необработанной плазмы также не отмечали.

При хроматографическом разделении белков плазмы крови выделены фракции высокомолекулярных компонентов плазмы (ММ 440-670 кДа), иммуноглобулинов (ММ 150-170 кДа), альбумина (ММ 60-70 кДа) и низкомолекулярных компонентов (ММ менее 20 кДа). Площади и время удерживания полученных пиков на хроматограммах существенно не различались между образцами плазмы крови, обработанных в трех режимах, а также относительно тех же показателей контрольной плазмы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что криорадиационная обработка предлагаемыми режимами не приводила к изменению молекулярной массы белков основных фракций плазмы крови, к разрыву в связях аминокислотных остатков, отдельных полипептидных цепей, что позволило сохранить состав и содержание основных белков плазмы.

Дальнейшие исследования полученных элюатов фракций высокомолекулярных белков, иммуноглобулинов класса G и альбумина методом электрофореза в полиакриламидном геле позволили установить, что в основном картина разделения белков указанных фракций криорадиационно обработанной плазмы всеми режимами не отличается от таковой в контрольной плазме крови.

Эти данные еще раз подтвердили отсутствие значительных изменений в молекулярной массе, электрофоретической подвижности основных белков обработанной плазмы крови.

Проведение различных методов электрофореза (на ацетат целлюлозе, в полиакриламидном геле), подтвердили вышеизложенные результаты и позволили получить дополнительную информацию о влиянии криорадиационной обработки на белки плазмы крови.

Поведение белков при электрофорезе в основном определяется их аминокислотным составом, но при этом важную роль играет так же третичная и четвертичная структуры белков. Дело в том, что изменение конформации молекулы белка может вызывать изменение ее размеров, а это существенно для проведения электрофореза в полиакриламидном геле, где присутствует эффект молекулярного сита. Проведение электрофореза на ацетат целлюлозе, в полиакриламидном геле позволило учесть возможные изменения в числе и характере ионизируемых групп аминокислот, в размере и конформации белковых молекул криорадиационно обработанной плазмы крови.

Согласно полученным результатам, происходили некоторые изменения в вышеназванных характеристиках обработанной плазмы относительно необработанной, но они не носили значимый характер. Так по результатам электрофореза на ацетат целлюлозе можно отметить, что различий в электрофоретиче-ской подвижности и содержании фракций альбумина, а2-глобулинов, (3-глобулинов криорадиационно обработанной плазмы крови относительно контрольной не происходит. Отмечали некоторое повышение площади пика зоны а]-глобулинов на 25-35 % в индивидуальной и на 17-30% в объединенной плазме. По-видимому, данные отклонения связаны с некоторыми конформацион-ными изменениями белков указанной фракции.

Визуальное сравнение электрофореграмм, полученных при проведении электрофореза в полиакриламидном геле, показало, что треки криорадиационно обработанной плазмы крови окрашены интенсивнее треков контрольной плазмы. Зона аг глобулинов образцов плазмы, обработанных в режиме (25+10) и (25+25) кГр проявлена сильнее, чем аналогичная зона контрольного образца. При режиме УЗ+(25+10) кГр данная белковая зона по сравнению с контролем имела боле размытый вид. При всех режимах обработки четче проявлялись полосы церулоплазмина и трансферрина. Полосы белков зоны альбумина, иммуноглобулинов и посттрансферриновой зоны были идентичны полосам контрольного образца плазмы крови. Электрофоретическая подвижность разделенных белков обработанных образцов плазмы не отличалась от таковой необработанных образцов.

Таким образом, анализ электрофоретической картины исследуемой плазмы показал, что криорадиационная обработка выбранными режимами не влияет на число ионизируемых групп, на размеры и конформацию основных белковых молекул. Тем не менее, изменения высокомолекулярных белков фракции а |-глобулинов позволяет предположить, что в этой зоне происходит некоторая денатурация ряда белков, приводящая к их агрегации.

После того, как мы получили общую картину влияния криорадиационной обработки плазмы крови на ее основные белки, было решено продолжить исследования по определению ряда отдельных белков специфическими методами.

Обработка индивидуальной и объединенной плазмы крови предлагаемыми режимами не изменяла в значительной степени содержание в ней липо-протеидов высокой плотности (а-ЛП) и низкой плотности ((3-ЛП) относительно этих показателей в контрольной плазме. При этом наблюдали некоторое понижение липопротеидов очень низкой плотности (пре-(3-ЛП). В большей степени отклонения проявились при режиме обработки плазмы крови (25+10) кГр, на 29% в индивидуальной и на 43% в объединенной плазме крови.

Определение содержания при этом основных липидов плазмы подтвердило вышеприведенные результаты. При всех режимах обработки индивидуальной и объединенной плазмы крови отмечали отсутствие изменений в количестве общих липидов, общего холестерина. Но при этом наблюдали повышение триглицеридов на 31-39%) в индивидуальной и на 30-55%о в объединенной плазме крови, более выраженное при режиме (25+10) кГр. В составе липопротеидов очень низкой плотности из всех липидов преобладают триглицериды (от 50 до 70%). Их повышение при криорадиационной обработке плазмы крови, по-видимому, указывает на происходящий разрыв связи липид-белок в липопро-теидной частице, в связи с чем и происходит понижение количества данного класса липопротеидов.

Наиболее значительное влияние все режимы обработки плазмы крови оказывали на ее лабильные белки: факторы свертывания крови и белки системы комплемента.

Отмечали повышение коагуляционных показателей обработанной плазмы крови: ■ активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового (ПВ), тромбинового (ТВ) времени и снижение концентрации фибриногена. Увеличение показателя АПТВ в 1,5-3,0 раза в индивидуальной плазме и в 1,9-2,8 раза в объединенной плазме крови указывает на снижение активности антигемофильных глобулинов А и В при криорадиационной обработке плазмы крови.

Отмеченное увеличение ПВ и в индивидуальной, и в объединенной плазме в 1,4-2,1 раза и в 1,5-2,6 раза соответственно, может свидетельствовать о влиянии режимов обработки на факторы протромбинового комплекса (про-тромбииа-И,проакцелерина-У, проконвертина-УП, фактора Стюарта-Х) в сторону уменьшения их активности.

При криорадиационной обработке происходило снижение концентрации фибриногена в 1,9-7,5 раз в индивидуальной и в 1,2-11 раз в объединенной плазме крови. По-видимому, в данном случае происходит деградация фибриногена. Накопление продуктов деградации, обладающих антитромбиновой активностью, приводит к повышению тромбинового времени, что и наблюдали в опытах. Увеличение ТВ отмечали в пределах 1,9-3,5 раза для индивидуальной и 1,9-2,7 раза для объединенной плазмы крови.

Наименьшее повреждение факторов свертывания происходило при режиме (25+10) кГр, более выраженный характер эти изменения носили при обработке плазмы крови режимом УЗ+(25+10) кГр.

Таким образом, выбранные режимы обработки плазмы крови действуют отрицательно на ряд плазменных белков - факторов свертывания крови, нарушая их конформационную структуру, что и приводило к понижению их активности.

Свежезамороженная плазма крови является наилучшим трансфузион-ным средством для восполнения компонентов системы гемостаза, так как содержит оптимальный набор плазменных факторов свертывания (В.М. Городецкий, 1992). Поэтому изменения структуры этих белков в результате криорадиации, повлекшие значительное снижение их активности, является показателем того, что предлагаемые условия обработки плазмы не применимы в клинике, а также в производстве препаратов - концентратов факторов свертывания VIII и IX.

При всех режимах обработки плазмы крови отмечали понижение функциональной активности белков системы комплемента. При облучении дозой (25+10) кГр отклонения от контроля составили 14,6 - 31,5 %. Облучение плазмы крови дозой (25+25) кГр снижало активность белков комплемента на 21,7 -35,7 %. Эти данные, по-видимому, свидетельствуют о происходящих конфор-мационных изменениях белков системы комплемента.

Снижение активности комплемента и его компонентов после криорадиационной обработки плазмы имеет значение разной степени, в зависимости от цели использования этой плазмы. Для получения белковых препаратов альбумина и иммуноглобулина снижение активности комплемента и его компонентов, видимо, не будет иметь значения, так как все белки системы комплемента при этом переходят в балластные фракции и в конечных лекарственных формах отсутствуют. Использование облученной плазмы непосредственно для переливания по жизненным показаниям может быть связано с некоторыми проблемами. Переливание плазмы больным гемофилией напрямую от активности факторов комплемента не зависит, хотя система комплемента может участвовать в процессе свертывания крови. Наибольшую проблему при переливании облученной плазмы со сниженной активностью компонентов комплемента может представлять для пациентов с токсикоинфекционными состояниями, когда требуется связывание, разрушение и полноценное выведение чужеродных клеток, токсинов и других агентов.

Криорадиационная обработка плазмы крови не приводила к значимым отклонениям в показателе ее рН. Отмечали весьма незначительный сдвиг рН вправо в сторону слабощелочной среды на 0,13 ед. при режиме УЗ+(25+10) кГр в индивидуальной плазме и на 0,19 ед. при режиме (25+10) кГр в объединенной плазме. Это подтверждает вышеприведенные наблюдения о влиянии криорадиационной обработки плазмы крови на ее белки. По-видимому, отмеченные изменения ряда белков связаны с явлениями денатурации, конформационными нарушениями с разрывом в основном нековалентных связей и дисульфидных мостиков. При этом не происходило деструктивных процессов, сопровождающихся образованием ионизированных частиц, с выходом свободных аминных или карбоксильных групп аминокислот белков.

Итак, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что изученные режимы обработки плазмы крови не влияют в значительной степени на состав и содержание основных плазменных белков: альбумина, иммуноглобулинов, трансферрина, церулоплазмина, липопротеидов высокой и низкой плотности и других. Более подверженными к криорадиационной обработке оказались лабильные белки плазмы: факторы свертывания и белки системы комплемента.

Полученные результаты данной работы позволили наметить пути дальнейших исследований по указанной проблеме, которые заключаются в более углубленном изучении структуры, физико-химических и биологических свойств отдельных важнейших белков плазмы крови после е криорадиационной стерилизации.

Таким образом, проведенные и продолжаемые исследования в ряду с работами коллег из НТЦ «Лекбиотех» и НТЦ «Вектор» позволят решить вопрос о возможности применения на практике нового метода стерилизации плазмы крови, обеспечивающего ее надежную вирусную безопасность.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шангареева, Райхана Фаатовна, 2002 год

1. Ажигирова М.А., Вязова Е.П. Перспективы производства препаратов плазмы крови с применением хроматографического фракционирования // Проблемы гематологии и переливания крови. 2001. - т. 46. - № 3. - С.82-84.

2. Ажигирова М.А., Колонина И.Р. О разработке документа "Безопасность и эффективность в службе крови. Основные положения" // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века: Тез. докл. науч.-практич. конф. М.: НГМА, 1999. - С.92-93.

3. Асылгужина М.М., Даянова З.Х., Мулюков Ф.И. Диспансеризация ИФА-серопозитивных лиц на антитела к ВИЧ в республике Башкортостан // Здравоохранение Башкортостана. 1998. - № 2. - С.20-22.

4. Бабакина Г.С., Барелко Е.В., Солянина И.П. и др. Солевой эффект при радиолизе замороженных растворов цианкобаламина // ДАН. 1979. - т. 246. -№ 2. - С.362-365.

5. Бабакина Г.С., Львова Г.В., Солянина И.А. и др. Роль косвенного действия излучения в разложении компонентов неинъекционных готовых лекарственных средств при радиационной стерилизации // Хим.-фарм. журнал. 1979. - № 9. - С.62-66.

6. Беллами Л. Новые данные по ИК-спектрам сложных молекул. М.: Мир, 1971.-318 с.

7. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. -С.438-472.

8. Берковский A.JT., Сергеева Е.В., Качалова Н.Д. и др. Тест АЧТВ с эл-лаговой кислотой // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. - № 6-С. 18-20.

9. Бокарев И.Н., Савин А.Г., Нефедова Т.Б. К вопросу о взаимодействии системы комплемента с основными звеньями гемостаза // Гематология и трансфузиология. 1985. - т. XXX. -№ 1. -С.32- 35.

10. Бочкарев В.В., Павлов Е.П., Седов В.В., Хрущев В.Г. Радиационная стерилизация лекарственных средств (обзор литературы) // Хим.-фарм. журнал.- 1972. -№7,- с.31-36.

11. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / А. Хеншен, Ф. Лотшпайх и др.; под ред. И.В. Березина. М.: Мир, 1988 - 688 с.

12. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. - С.212-278.

13. Гайда Г.З., Довганик З.В., Новак В.Л. Проблема вирусной безопасности белковых препаратов крови // Проблемы гематологии и переливания крови.- 2001. № 3. - С.49.

14. Гинзбург С.Ф., Сафаров С.А., Павлов Е.П. и др. Стерилизация гамма-облучением кобальта-60 растворов s-аминокапроновой кислоты и ее N-ацетилпроизводного // Хим.-фарм. журнал. 1987. - № 8. - С.993-996.

15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999.459 с.

16. Голосова Т.В. Инфекционная безопасность гемотрансфузионной терапии // Трансфузиология. 1997. - Вып. 1(3). - С.5-7.

17. Городецкий В.М. Синдром массивных трансфузий // Проблемы гематологии. 1999. - № 2. - С.7-8.

18. Государственная Фармакопея СССР. XI изд. вып. 2. М.: Медицина, 1987.-С.24.

19. Грачев С.А., Чакчир Б.А., Кропачев Е.В., Литвякова Г.И. Исследование возможности радиационной стерилизации метилурацила // Фармация в XXI веке: инновации и традиции: Тез. науч.-практ. конф. Санкт-Петербург, 1999 г. - С.231-232.

20. Грачев С.А., Чакчир Б.А., Кропачев Е.В., Литвякова Г.И. Радиолити-ческие процессы, протекающие при радиационной стерилизации водных растворов пеницилламина // там же С.231.

21. Григорьева О.Л., Сафаров С.А., Седов В.В., Мартьянов Б.М. Изучение возможности радиационной стерилизации стабилизированного 5% раствора гидрохлорида эфедрина // Хим.-фарм. журнал. 1984 - т. 18 - № 6. - С.727-730.

22. Доронина Э.М., Каира А.Н. Особенности эпидемического процесса при гепатите В в Московской области // Гепатит В, С, Д проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. науч. конф. - М., 1997. - С.67.

23. Дячина Е.Г. Выявление "патологической" фракции липопротеинов сыворотки крови у больных с заболеваниями желчевыводящих путей, печени и непеченочными заболеваниями // Лабораторное дело. 1973 - № 8 - С.485-486.

24. Емельянов С.И., Бобринская И.Г., Писаревский Г.Н. и др. Иммунологические и инфекционные проблемы переливания крови на современном этапе // Российский журнал анестезиологии и интенсивной терапии. 1999. -№2. -С.2-11.

25. Жибурт Е.Б., Данильченко В.В. Инфекционная безопасность гемо-трансфузионной терапии // Новое в трансфузиологии. 1997. - Вып. 17. -С.61-68.

26. Жибурт Е.Б., Данильченко В.В., Бельгесов Н.В. и др. Специфические и суррогатные маркеры гепатита С при скрининге донорской крови // Гематология и трансфузиология. 1995. -№ 1. - С. 16-18.

27. Жибурт Е.Б., Онуфриевич А.Д., Лазаренко М.И. и др. Доноры-родственники категория особого риска // Трансфузиология и служба крови: Тез. докл. науч.-практ. конф.-М., 1998.-С. 14.

28. Зарецкая Ю.М., Донсков С.И. Иммунологическая безопасность гемо-компонентной терапии сегодня и завтра // Проблемы гематологии. 1998. -№ 3. - С.7-13.

29. Зверев В.В. Серодиагностика массовых вирусных заболеваний (вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция) // Клиническая лабораторная диагностика. -1999. № 11.-С.З.

30. Зубкова Н.В. Применение сольвент-детергентного метода для инактивации вирусов при получении иммуноглобулина // Проблемы гематологии и переливания крови. -2001. № 3. - С.51-52.

31. Калнберзс В.К., Калнберза М.В., Жукова Ю.В. Гемотрансфузия в современной хирургии // Проблемы гематологии. 1999. - № 2. - С.9-10.

32. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000. - Т. 1. - С. 171-239. - Т. 2. -С.106-190.

33. Карякин А.В. Контроль и обеспечение вирусной безопасности препаратов крови (состояние и перспективы) // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века: Тез. докл. науч.-практ. конф. М.: НГМА, 1999. - С.78-79.

34. Карякин А.В., Терентьева J1.A. Валидация ИФА-тест-систем для проведения контроля вирусной безопасности препаратов, изготовленных из крови человека // Проблемы гематологии и переливания крови. 2001. - № 3. -С.52-53.

35. Климов А.Н. Дислипопротеидемии и ишемическая болезнь сердца. -М.: Наука, 1980. С.10-25.

36. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей /

37. B.А. Долгов, В. Морозова и др.; под ред. В.А. Долгова. М.: Центр, 1995.1. C. 113-121.

38. Князева O.K., Мирхайдарова М.Р., Гареева А.Б., Нигматуллин Т.Г. Влияние облучения на молекулярную структуру гаммаглобулина // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Матер.междунар. сим-поз.-Уфа, 1995.-ч.2.-С.134-137.

39. Козинец Г.И., Куликов С.А., Точенов А.В. Вопросы современной тактики лечения острой кровопотери при подготовке врача-трансфузиолога на этапе последипломного образования // Проблемы гематологии. 1999. - № 2. -С.20.

40. Козлов JI.B. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, СЗ, С4 и С5 // Биоорганическая химия. 1982. - №5. - С.652-654.

41. Козлов JI.B., Гузова В.А. Определение комплементактивирующей активности препаратов для внутривенного введения // Методические рекомендации. М., 1998. -7 с.

42. Козловская J1.B., Николаев А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследований. М.: Медицина, 1984. - С.84-88.

43. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь, 1982. -311 с.

44. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. Элиста: Джангар, 1998. - С.49-53.

45. Комиссаров А.В., Комоско Г.В., Лещеико А.А. и др. Изучение процесса стерилизующей фильтрации жидкого противосибиреязвенного лошадиного глобулина // Биотехнология. 2002. - № 2. - С.66-74.

46. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицина, микробиология, иммунология и вирусология. С-П.: Спец. лит., 1998. - С. 158-161.

47. Кузин A.M. Радиационная биохимия. М.: АН СССР, 1965. - 336 с.

48. Купцов А.Х., Львова Г.В., Трофимов В.И. и др. Радиационная устойчивость препаратов альбумина // Хим.-фарм. журнал. 1985. - № 1. - С.90-94.

49. Курабекова P.M. Фирма ИММУНО // Геминформ. 1996. - №1.1. С.5-7.

50. Лабораторные методы исследования системы гемостаза / В.П. Балу-да, З.С. Баркаган и др.; под ред. Е.Д. Гольдберг. Томск: Томск, мед. ин-т, 1980,- 309 с.

51. Лукичева Т.И., Прудник И.М. Определение индивидуальных белков в биологических жидкостях на анализаторах, использующих принцип вертикальной фотометрии // Клиническая лабораторная диагностика. № 9. - 1999. -С.42.

52. Львова М.Ш., Озеринина Т.В., Белкина Н.П. и др. у-облучение инъекционных растворов D-пантотената кальция // Хим.-фарм. журнал. 1983. -t.XVII. - № 4. - С.462-466.

53. Львова М.Ш., Чугунов В.В., Белкина Н.П., Козлов Э.И. Стабильность водорастворимых витаминов и коферментов. Исследование радиационной устойчивости водных растворов пиридоксаль-5'-фосфата // Хим.-фарм. журнал. -1979. -т.ХШ. -№ 8. С.90-93.

54. Мавлютов О.А., Суворов В.В. Эпидемиологическая ситуация по ВИЧ-инфекции в республике Башкортостан и организационные основы ее стабилизации // Здравоохранение Башкортостана. 1998. - № 2. - С.3-5.

55. Маурер Г. Диск-электрофорез. -М.: Мир, 1971. -С.159-181.

56. Медведев В.В., Волчек Ю.З. Клиническая лабораторная диагностика. -С-П, 1995.-С.50- 54.

57. Мигунов В.Н. Оценка риска заражения пациентов вирусами гепатита при лечении препаратами крови // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века: Тез. докл. науч.-практич. конф. М., 1999. - С.З.

58. Мовшев Б.Е., Витвицкий В.М., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Трансфузионные среды: перспективы // Новое в трансфузиологии. Инфор. бюл. -2001. -Вып. 28.-С.25-45.

59. Муртазин З.Я., Габбасов Ш.Ф. Организация работы по профилактике ВИЧ-инфекции в республике Башкортостан // Здравоохранение Башкортостана. 1998,- №2. -С. 1-2.

60. Мыльников А.Я., Лыцарь Б.Н., Горбаток Л.Е. и др. Выявляемость поверхностного антигена вируса гепатита В у военнослужащих-доноров крови // Военно-медицинский журнал. 1994. - № 3. - С.44-45.

61. Назарова Е.Л., Кощеева Т.В. Выявление маркеров вирусных инфекций, передаваемых с кровью, у доноров концентрата тромбоцитов // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века: Тез. докл. науч.-практич. конф. -М„ 1999. -С.52-53.

62. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971. - С.43-45.

63. Никитин И.К., Козинец Г.И. Показатели качества компонентов крови // Проблемы гематологии и переливания крови. 2001. - № 3. - С.58.

64. Нурхаметов А.Х., Трофимов В.И. Влияние у-облучения на конфор-мационные характеристики молекул инсулина в лекарственных препаратах // Хим.-фарм. журнал. 1981,- т.ХУ.-№ 10 - С. 102-106.

65. Осипов В.Б., Ракитская Г.А., Трофимов В.И. Актуальные вопросы радиационной стерилизации // Химико-фармацевтическая промышленность. -1984.-№9.-36 с.

66. Осипов В.Б., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. О токсилогической безопасности радиационной стерилизации лекарственных препаратов // Химия высоких энергий. 1985. - Т. 19. - № 3. - С.241-249.

67. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.'- С.3-75.

68. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - С.3-116.

69. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-С. 145-162.

70. Павлов Е.П., Тушов Э.Г., Гринев М.П., Радзиевский Г.Б. Эффективность стерилизации лекарственных средств с помощью электронного излучения, генерируемого высоковольтным трансформаторным ускорителем // Хим.-фарм. журн. 1989. - № 3. - С.330-332.

71. Павлов Е.П., Тушов Э.Г, Самойленко И. И. и др. Использование гамма-излучения для микробной деконтаминации лекарственных средств // Хим.-фарм. журнал. 1992. -№ 2. - С.76-78.

72. Паламарчук В.И., Трикаш И.О., Антоненко Л.В. Содержание сквале-на и стеринов в тканях кроветворной системы крыс в норме и при экспериментальном лейкозе // Вопр. мед. химии. 1983. - Т. 29. - С.64-67.

73. Пашкова Т.А., Туполева Т.А., Гуляева А.А и др. Формирование группы ЦМВ-негативных доноров крови в ГНЦ РАМН // Трансфузиология и служба крови: Тез. конф. М., 1998. - С.13.

74. Певцов В.А., Кагарманова М.М., Насырова Р.В. Состояние службы крови республики Башкортостан // Здравоохранение Башкортостана. 1998. -№ 1.-С.12-14.

75. Пикаев А.К. Дозиметрия в радиационной химии. М.: Наука, 1975.311с.

76. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Радиолиз газов и жидкостей. М.: Наука, 1986. - 440 с.

77. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. М.: Медицина, 1983. - 224 с.

78. Сааков B.C. Изменения оптических спектров у-глобулина и возможные механизмы его физиологического воздействия в организме при у-облучении // ДАН. 2000. - Т. 370. - № 4. - С.562-567.

79. Сааков B.C. Сопряженность изменения производных спектров альбумина с точностью определения альбумино/глобулинового коэффициента при лучевых поражениях // ДАН. 2000. - Т. 371. - № 4. - С.548-552.

80. Сааков B.C. Специфика денатурации альбумина в физиологических препаратах при термальном и радиационном воздействиях // ДАН. 2000. - Т. 374.-№ 1,-С. 124-129.

81. Савин Е.А., Кузин С.Н., Васильев А.Н. и др. Особенности профилактики НВ-вирусной инфекции в отделениях гемодиализа // Терапевтический архив. 1995. - № 2. - С.47-50.

82. Салахова А .Г. Деятельность лаборатории диагностики ВИЧ-инфекции г. Нефтекамска // Здравоохранение Башкортостана. 1998. - № 2. -С.25-26.

83. Сафаров С.А. Возможность оценки количества побочных продуктов, образующихся при радиационной стерилизации и "пастеризации'1 лекарственных средств // Хим.-фарм. журн. 1989. - № 2. - С.218-224.

84. Сафаров С.А., Григорьева О.Л., Харламов В.Т. и др. Стабилизация инъекционного раствора кордиамина в целях стерилизации ионизирующим излучением // Хим.-фарм. журн. 1979. - т.ХШ. - № 7. - С.82-86.

85. Сафаров С.А., Седов В.В., Тырина Е.А., Дейкина Л.Н. Снижение микробной загрязненности таблетированных и порошкообразных готовых лекарственных средств в промышленной упаковке у-излучением 60Со // Хим.-фарм. журн. 1985. -№ 3. -С.223-228.

86. Сафаров С.А., Трофимов В.И. Радиационная стерилизация и «пастеризация» лекарственных препаратов, сырья и вспомогательных материалов и контроль их качества // Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств. 1991. - Т.З. - С.9-10.

87. Соболева Н.Н., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Изменение молекулярной массы инсулина при у-облучении водных растворов и суспензий // Хим.-фарм. журн. 1980. - t.XIV - № 4. - С.69-72.

88. Старицына Н.Н., Шанская А.И., Пучкова С.М., Недачина Н.А. Применение фракционированных фосфолипидов сои в тесте активированного парциального тромбопластинового времени // Гематология и трансфузиология. -1995. Т.40. - № 4Б. - С.36-38.

89. Судакова Е.В., Гарькавая О.И., Рогутский С.В. Некоторые особенности эпидемического процесса гепатита В в г.Смоленске в 1986-1996 гг. // Гепатит В, С, Д проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. - М., 1997. - С.207-208.

90. Титов Л.П. Физиологические и патологические закономерности функционирования системы комплемента. Автореф. дис. докт. мед. наук. Киев, 1991.-С. 8-12.

91. Трофимов В.И. Достижения в области стерилизации фармацевтических препаратов (обзор) // Хим.-фарм. журн. 1988. - № 9. - С.1111-1121.

92. Трофимов В.И. Радиационные технологии обеззараживания и стерилизации: современное состояние и перспективы, техника и оборудование // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Мат. между -нар. симпоз.Уфа, 1995. 4.2. - С.233-238.

93. Туточкина Л.Т., Рыжов Н.И., Давыдова С.А. и др. В кн.: Биологическое действие протонов высоких энергий. -М., 1967. - С.235-261.

94. Уотерфилд М.Д. Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // в кн. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989. - С.197-222.

95. Уразов С.Х., Афонин Н.И. Карантинизация гарантия вирусной безопасности плазмы и ее препаратов // Проблемы гематологии и переливания крови. - 2001. -№3. - С.62-63.

96. Федорова Т. А., Терещенко О .Я., Мазурик В.К. Нуклеиновые кислоты и белки в организме при лучевом поражении. М., 1972. - 407 с.

97. Филатов Ф.П., Голосова Т.В. Общие принципы национальной концепции вирусной безопасности гемотрансфузий // Новое в трансфузиологии. -2001. -Вып.28.- С. 19-24.

98. Харченко Л.И., Павловская Т.Е. Изменение поглощения белка в области амид I при облучении // Радиобиология. 1973. - т.ХШ. - Вып.5. -С.669-673.

99. Хенох М.А., Лапинская Е.М. Радиационная стерилизация и ее место в ряду методов стерилизации // ДАН. 1955. - Т. 102. - № 5. - С.993-996.

100. Чернядьева И.Ф., Титов В.Н. Апопротеины эфферентного транспорта холестерина в крови (обзор) // Вопр. мед. химии. 1987. - Т. 33. - Вып. 1. - С.2-13.

101. Шабалин В.Н, Шатохина С.Н., Суровикова М.С. и др. Системная организация плазмы крови и кининогенез при сосудистых заболеваниях у больных пожилого возраста // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. -№ 9. - С. 14.

102. Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Е., Хухлович П.А. и др. Итоги изучения и нерешенные вопросы эпидемиологии и профилактики вирусных гепатитов в России // ЖМЭИ. 1994. -№ 5. - С.25-32.

103. Шляхтенко Л.И., Мукомолов С.Л., Крыга Л.Н. Эпидемиология вирусного гепатита В накануне третьего тысячелетия // Гепатит В, С, Д проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. науч. конф. -М., 1997. - С.252-253.

104. Шевченко О.П., Чернова А.В., Чиликина Г.В. Клиническое значение анализа специфических белков // Клиническая лабораторная диагностика. -1999. № 9. С.32.

105. Щеглова С.Г., Павлов Е.П., Седов В.В. Выбор «пастеризующих» доз гамма-излучения // Хим.-фарм. журн. 1982. - № 2. - С.222-224.

106. Патент Великобритании №2222081, МПК6 А 61 К 41/00, 1990.

107. Патент ЕПВ №0103196, МПК А 61 L 2/04, 1984.

108. Патент ЕПВ №0117064, МПК А 61 L2/04, 1984.

109. Патент ЕПВ №0334679, МПК А 61 L 2/08, 1989.

110. Патент ФРГ №3330770, МПК А 61 Д2/04, 1985.

111. Заявка на патент МПК6 А 61 L 2/08, А 61 К 35/16, 2002.

112. Andersson I., Eriksson S., Lind О. Metods for the removal of IN-ACTINE ™ compound from human plasma // Downstream. 2001. - № 11,- P.8-11.

113. Armbrust R. F. Radiosterilization of medical products. Vienna.: IAEA, 1975. - P.379-382.

114. Barre-Sinoussi F., Cherman J.C., Rey F. et al. Isolation of a T lympho-tropic retrovirus from a patients at risk for acguired immunodeficiency syndrome (AIDS) // Science. 1983. - P.868-871.

115. Baseiga J.M., Buti M., Esteban R. et al. HTLV-III antibodies and Christman Disease//Lancet. 1986.-№ 1.- P. 1033.

116. Bergvall P., Ahmad Т., Bauman H. et al. Inactivation of enveloped and non enveloped viruses in protein solutions halogenacetaldehydes // Downstream. -2001,- № 11.- P.34-36.

117. Bjoro K., Stig S. Froland, Zhibing Yun. Hepatitis С infection in patients with primary hypogammaglobulinemia after treatment with contaminated immune globulin//N. Engl. J. Med. 1994. - V.331. - № 24. - P. 152-165.

118. Bos O.J., Sunye D.G., Nieuweboer C.E. et al. Virus validation of pH4-treated human immunoglobulin produkt produced bu the Cohn fractionation process // Biologicals. 1998. - V.26. - № 4. - P.267- 276.

119. Bowden R.A. Transfussion-transmitted cytomegalovirus infection // Hematol. Oncol. Clin. North Am. 1995. - V.9. - P.155-166.

120. Breese J.S., Mast E.E., Coleman P.J. Hepatitis С virus infection associated with administration of intravenous immune globulin: a cohort study // JAMA. -1996,- V.276. P.1563-1567.

121. Bridonneau P., Marcilly H., Vernois-Martin M. et al. Liguid pasteurization of an immunoglobulin preparation without stabilizer: effects on its biological and biochemical properties // Vox Sang. 1996. - V.70. - № 4. - P.203-209.

122. Burnouf Т., Burnouf-Radosevich M., Huart J.J., Goudemand M. A highly purified factor VIII:c concentrate prepared from cryoprecipitate by ion-exchange chromatography // Vox Sang. 1991. - V.60. - № 1. - P.8-15.

123. Button L.N., De Wolf W.C., Newburger P.E. et al. The effect of irradiation on blood components // Transfusion. 1981.- V.21. - P.419- 426.

124. Chin S., Jin R., Wang X.L. et al. Virucidal treatment of blood protein products with UVC radiation // Photochem. Photobiol. 1997. - V.65. - №3.1. P.432-435.

125. Curran J.W., Lawrence D.N., Jaffe H. et al. Acguired Immuuodeficiency Syndrome (AIDS) associated with transfusions // N.Engl. J.Med. 1984. - V.310. -№ 2. - P.69- 75.

126. Cuthbertson В., Reid K.G., Foster P.R. Viral contamination of human plasma and procedures for prefentig virus transmission by plasma products // Blood separation and plasma fractionation. 1991. - P.385-435.

127. Dichtelmuller H., Rudnick D., Breuer В., Kotitschke R. et al. Improvement of virus safety of a S/D-treated factor VIII concentrate by additional dry heat treatment at 100 degrees С // Biologicals. 1996. - V.24. - №2. - P. 125-130.

128. Dichtelmuller H., Stephan W., Prince A.M. et al. Inactivation of HIV in plasma derivatives by beta-propiolactone and UV irradiation // Infection. 1987. -V. 15. - № 5. - P.367- 369.

129. Eisenberg S. Lipoproteins and lipoprotein metabolism. A dynamic evaluation of the plasma fat transport system / / Klin.Wochenschr. 1983. - V.61. -№3.-P.119-132.

130. Elliott L.H., McCormick J.В., Johnson K.M. Inactivation of Lassa, Marburg and Ebola viruses by gamma irradiation // J. Clin. Microbiol. 1982. - V.16. -№ 4. - P.704-708.

131. Evatt B.L., Gomperts E.D., McDougal J.S. et al. Coincidental appearance of LAV/HTTLLV-III antibodies in haemophiliacs and the onset of the AIDS epidemic // N. Engl. J. Med. 1985. - V.31. - № 8. - P.483- 486.

132. Figueroa J.P., Morris J., Brathwaite A., et al. Risk factors for HTLV-I among heterosexual STD clinic attenders // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 1995. - V.9. - P.81-88.

133. Foster J.F. The Plasma Protein. New York: Acad. Press, 1960. - 66 p.

134. Franglen G., Swaniker G.R. Preparation and analysis of fragments produced by pepsin hydrolysis of human plasma albumin and their relationship to its structure // Biochem. J. 1968. -№ 5. - P. 107-109.

135. Friedli H., Morgenthaler J.J., Kistler G. Nitschmann plasma fractionation methods // Lancet. 1985. - V.25.-P.1215.

136. Gallo R.C., Salahuddin S.Z., Popovic M. Freguent detection and isolation of a T lymphotropic retrovirus (HTLV-III from patients with AIDS and at risk for AIDS // Science. 1984. - V.4. - P.500-503.

137. Gao F., Prince A.M., Pascual D., Horowitz B. Enhancement in the safety of immune globulins prepared from High risk plasma // Vox Sang. - 1993. - V.64. - № 4. - P.204.

138. Ginoza W. Inactivation of viruses by ionising radiations and by beat: in Maramorosch K. Koprowski H. (eds). Metods in Virology IV. New York.: Academic Press. - 1968. - P. 139-209.

139. Gunter K.C. Transfussion-transmitted cytomegalovirus: the part-time pathogen // Pediatr. Pathol. Lab. Med. 1995. - V. 15. - P.515-534.

140. Hamalainen E., Suomela H., Ukkonen P. Virus inactivation during intravenous immunoglobulin production // Vox Sang. 1992. - V.63. - P.6-11.

141. Haskill J.S., Hunt J.W. Radiation damage to crystalline ribonuclease; Identification of the physical alterations by gel filtration on sephadex // Radiation Res. 1967. -V.31.-P.327.

142. Hassig A. Reguirements for modern intravenous immunoglobulin preparations and their safe clinical use // Triangle. 1987. - V.26. - № 1. - P.24-25.

143. Hawthorne J.N., Ansell G.B. Phospholipids: New comprehensive bio-chemistru. -Amsterdam ets.: Elsevier, 1982. V.4. - 484 p.

144. Healey C.J., Sabharwal N.K., Daub J. Outbreak of acute hepatitis С following the use of anti-HCV screened intravenous immunoglobulin therapy // Gastroenterology. - 1996. - V. 110. - № 4. - P. 1120-1126.

145. Hogman C.F., Gong J., Eriksson L. et al. White cells protect donor blood against bacterial contamination // Transfusion. 1991. - V.31. - № 7. - P.620-626.

146. Horowitz B. Inactivation of viruses found with plasma proteins // Biotechnology. 1991. - V. 19. - P.417-430.

147. Horowitz B. Ways to reduce the risk of transmission of viral infections by plasma and plasma product // Vox Sang. 1988. - V.54. - P.235.

148. Horowitz В., Wiebe M.E., Lippin A., et al. Inactivation of viruses in labile blood derivatives. Physical methods // Transfusion. 1985. - V.25. - P.523-527.

149. Herwaldt B.L., Kjemtrup A.M., Conrad P.A., et al. Transfussion-transmitted babesiosis in Washington State: first reported case caused by a WAl-type parasite//J. Infect. Dis. 1997. - V. 175. - P. 1259-1262.

150. John T.J., Ninan G.T., Rajagopalan M.S. et al. Epidemic hepatitis В caused by commercial human immunoglobulin // Lancet. 1979. - V.19. - P. 1074.

151. Kaplan L.J., Foster J.F. Isoelectric focusing behavior of bovine plasma albumin, mercaptalbumin and beta-lactoglobulins A and В // Biochemistry. 1971. -V.10.-№4.-P.630-636.

152. Kiprichenok L.N., Gidranovich L.G., Kneidorov V.P. The joint action of nitrates and gamma radiation on the blood plasma proteinase-inhibiting and antioxi-dative systems in rats // Radiats. Biol. Radioecol. 1997. - V.37. - № 3. - P.297-302.

153. Kitchen A.D., Mann G.F., Harrison J.F., Zuckermann A.J. Effect of gamma irradiation on the human immunodeficiency virus and human coagulation proteins // Vox Sang. 1989. - V.56. - P.223-229.

154. Koerper M.A., Kaminsky L.S., Levy J.A. Differential prevalence of antibody to AIDS associated retrovirus in haemophiliacs treated with Factor VIII concentrate versus cryoprecipitate: recovery of infectious virus // Lancet. 1985. - V.l. - P.275.

155. Kowalsky D. Radiation-induced changes in the molecular confirmation and amino acid composition of H-2d glycoprotein // Nucleonika. 1979. - V.24. -P. 513-522.

156. Lange J.M.A., Van den Berg H., Dooren L.J. et al. HTLV-III LAV infection in nine children infected by a single plasma donor. Clinical outcome and recognition patterns of viral proteins // J. Infect. Dis. 1986. - V.l 54. - P. 171-174.

157. Louie R.E., Galloway C.J., Dumas M.L., et al. Inactivation of hepatitis С virus in low pH intravenous immunoglobulin // Biologicals. 1994. - V.22. - № 1. -P.13-19.

158. Mann G.F., Allison L.M., Copeland J.A. A simplified plague assay system for measies virus // J. Biol. Sand. 1980. - V.8. -P.219-225.

159. Mieklca S.I., Busby T.F., Reid B. et al. New methods for inactivation of lipid-enveloped and non-enveloped viruses // Haemophilia. 1998. - V.4. - № 4. -P.402.

160. Mohr H., Lambrecht В., Schmitt H. Photo-inactivation of viruses in therapeutical plasma //Dev. Biolog. Stand. 1993. - V.81. - P. 177.

161. Mortimer P.P., Luban N.L.C., Kelleher J.F. et al. Transmission of serum parvovirus-like virus clotting factor concentrates // Lancet 1983 -V.l 1 -P.482-484.

162. Mortimer P.P., Parry J.V., Mortimer J.Y. Which anti-HTLV III/LAV assays for screening and confirmatory testing // Lancet. 1985. - P.873-877.

163. Murano G. The 'Hageman' connection: interrelationships of blood coagulation, fibrino(geno)lysis, kinin generation and complement activation // Amer. J. Hemat. 1978. - V.4. - № 4. - P.409-417.

164. Nablo S.V. -Technical developments and prospects of sterilization by ionizing radaition. Montreal: Quebec, 1974. - 51 p.

165. Preuss Т., Kamstrup S., Kyvsgaard N.C. et al. Comparison of two different methods for inactivation of viruses in serum // Clin. Diagn. Lab. Immunol.1997. V.4. - № 5. - P.504-508.

166. Reid B.D. The Sterways process: a new approach to inactivating viruses using gamma radiation // Biologicals. 1998. - V.26. - № 2. - P. 125-129.

167. Romisch J., Groner A., Bernhardt D. et al. Nanofiltration in production of Beriplex P/N: increasing the capacity of virus elimination while maintaining product guality // Beitr. Infusionsther Transfusionsmed. 1996. - V.33. - P.220-224.

168. Saint-Lebe L., Berger G., Mucchielli A. Improved Food Qualitty Irradiation. Vienna: IAEA, 1974. - P.51-60.

169. Schwartz D.W., Simson G., Baumgarten K. et al. Risk of human immunodeficiency virus (HIV) transmission by anti-HIV-negative blood components in Germany and Austria // Ann. Hematol. 1995. -V.70. - P.209-213.

170. Soboleva N.N., Ivanova A.I., Talrose V.L. et al. On the radiation sensiv-ity of insulin solution and suspensions // Int. J. appl. Radiat. 1981. - V.32. -P.753-756. "

171. Spire В., Dormont D., Barre-Sinoussi F. et al. Inactivation of lymphade-nopathy-associated virus by heat, gamma rays and ultraviolet light // Lancet. 1985. -V.L-№ 8422.-P. 185-189.

172. Stephan W., Dichtelmuller H. Beta-propiolactone as a sterilizing agent in the manufacture of intravenous immunoglobulin preparations // Arzneimittelfor-schung. -1983. V.33. - № 9. - P.220.

173. Teitel J.M. Safety of coagulation factor concentrates // Haemophilia.1998. V.4. - № 4. - P.393-401.

174. Troccoli N.M., Mclver J., Losikoff A., Poiley J. Removal of viruses from human intravenous immune globulin by 35 nm nanofiltration // Biologicals. 1998. -V.26. - № 4. - P.321.

175. Tuffs A. East German HCV contamination uncovered // Lancet. 1995. -V.346.-P.42.- 129182. Williams A.E., Sullivan M.T. Transfussion-transmitted retrovirus infection//Hematol. Oncol. Clin. North Am. 1995. -V.9. -P.115-136.

176. Wilson W.D., Foster J.F. Alterations in proteins and polyamino acids caused by ultraviolet irradiation in a spectropolarimeter // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. - V.38. - № 4. - P.552-558.