Структура и свойства малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа: Hsp20, HspB6 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Букач, Олеся Владимировна

• Букач, Олеся Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Букач, Олеся Владимировна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Структура и свойства малых Hsp.

1.1. Общие сведения о малых Hsp.

1.2. Структура малых Hsp.

1.3. Образование гетероолигомерных комплексов.

1.4. Фосфорилирование малых Hsp.

1.5. Шаперонная активность.

2. Возможная функциональная роль Hsp20.

2.1. Участие Hsp20 в предотвращении агрегации тромбоцитов.

2.2. Возможное участие Hsp20 в регуляции метаболизма глюкозы под действием инсулина.

2.3. Регуляция сократительной активности гладких мышц и возможное участие Hsp20 в этом процессе.

2.4. Возможное участие Hsp20 в регуляции сократительной активности и апоптозе кардиомиоцитов.

Материалы и методы.

1. Препаративные методы.

1.1. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантных Hsp20 и Hsp27 человека и их точечных мутантов с заменами, имитирующими фосфорилирование (Hsp20D и Hsp273D).

1.1.1 Получение препарата рекомбинантного Hsp20 дикого типа (Hsp20WT).

1.1.2. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного Hsp20 с заменой остатка Serl6 на остаток аспарагиновой кислоты (Hsp20D).

1.1.3. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантного Hsp27 дикого типа (Hsp27WT) и его мутанта с заменами остатков Serl5, Ser78, Ser82 на остатки аспарагиновой кислоты (Hsp273D).

1.2. Выделение актина из ацетонового порошка скелетных мышц кролика.

1.3. Выделение миофибрилл из скелетной и сердечной мышц человека или гладких мышц птиц.

2. Методы, использованные для изучения свойств Hsp20.

2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом гель-фильтрации.

2.2. Определение молекулярной массы Hsp20 методом нативного электрофореза в градиенте пористости геля.

2.3. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом неравновесного аналитического ультрацентрифугирования.

2.4. Изучение влияния рН на вторичную структуру Hsp20 методом кругового дихроизма (КД).

2.5. Изучение олигомерного состояния Hsp20 методом химического «сшивания».

3. Определение шаперонной активности малых Hsp.

3.1. Влияние малых Hsp на агрегацию инсулина.

3.2. Влияние малых Hsp на агрегацию алкогольдегидрогеназы.

3.3. Влияние малых Hsp на агрегацию термически денатурированного актина.

4. Методы, использованные для изучения взаимодействия Hsp20 с другими белками.

4.1. Изучение взаимодействия Hsp20 и Hsp27 методом гель-фильтрации.

4.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина.

4.2.1 Метод ультрацентрифугирования.

4.2.2 Метод флуоресцентной спектроскопии.

4.3. Изучение взаимодействия Hsp20 с комплексами актин-связывающих белков с F-актином.

4.3.1 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-тропомиозин.

4.3.2 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-а-актинин.

4.3.3 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-кальпонин.

4.3.4 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл.

5. Некоторые аналитические методы.

5.1. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS.

5.2. Изоэлектрофокусирование в денатурирующих условиях.

5.3. Вестерн-блотгинг.

5.4. Определение концентрации белка.

5.4.1 Спектрофотометрический метод.

5.4.2 Метод Брэдфорд.

6. Состав и обозначение буферных растворов, использованных в работе.

Результаты исследования.

1. Выделение Hsp20 и его S16D мутанта и определение их шаперонной активности.

1.1. Выделение Hsp20.

1.2. Определение шаперонной активности Hsp20.

2. Изучение свойств Hsp20.

2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20.

2.1.1 Влияние концентрации на олигомерное состояние Hsp20WT.

2.1.2 Влияние мутации, имитирующей фосфорилирование Serl6, на олигомерное состояние Hsp20.

2.2. Влияние рН на структуру и свойства Hsp20.

2.2.1 Влияние рН на шаперонную активность Hsp20.

2.2.2 Влияние рН на олигомерное состояние Hsp20.

2.2.3 Влияние рН на вторичную структуру Hsp20.

2.3. Влияние Hsp20 на агрегацию термически денатурированного актина.

3. Взаимодействие Hsp20 с другими белками.

3.1. Образование гетероолигомерных комплексов с Hsp27.

3.2. Взаимодействие Hsp20 и актина.

3.2.1 Влияние Hsp20 на скорость и степень полимеризации G-актина.

3.2.2 Анализ взаимодействия Hsp20 с F-актином и комплексами F-актин-акгин-связывающий белок.

3.2.3 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл.

Обсуждение результатов.

1. Некоторые физико-химические свойства Hsp20.

1.1. Олигомерное состояние и шаперонная активность Hsp20.

1.2. Влияние рН на олигомерное состояние и шаперонную активность Hsp20.

2. Образование гетероолигомерных комплексов Hsp20 и Hsp27.

3. Взаимодействие Hsp20 и актина.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и свойства малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа: Hsp20, HspB6»

Белки теплового шока (heat shock proteins, Hsp) - общее название для нескольких семейств белков-шаперонов. Это название возникло вследствие того, что повышение температуры и другие типы клеточного стресса приводят к значительному усилению синтеза этих белков. Однако и в нормальных, не стрессовых условиях содержание Hsp в клетке достаточно высоко, поскольку белки теплового шока выполняют в клетке чрезвычайно важные функции, такие как котрансляционное сворачивание новообразованных полипептидных цепей, рефолдинг частично денатурированных или элиминация неправильно свернутых белков. В зависимости от функций Hsp делятся на несколько основных семейств, названия которых основаны на молекулярных массах их основных представителей. Наиболее хорошо изученными являются Hsp60 и Hsp70, основной функцией которых является АТФ-зависимый фолдинг (или рефолдинг) белков-субстратов. Малые белки теплового шока (малые Hsp) не способны осуществлять АТФ-зависимый рефолдинг белков-субстратов, но, несмотря на это, играют важную роль в защите клетки от неблагоприятных условий. Связывая частично денатурированные белки-субстраты, малые Hsp предотвращают накопление агрегатов поврежденных белков, облегчая тем самым их последующую ренатурацию шаперонами других семейств.

В последнее время появилось большое количество данных, свидетельствующих о том, что, помимо шаперонной активности, малые Hsp обладают и другими, не менее значимыми функциями. Чрезвычайный интерес исследователей вызывают такие функции малых Hsp, как модуляция динамики актинового цитоскелета, возможная роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также возможная вовлеченность мутантов малых Hsp в развитие различных наследственных заболеваний.

В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока. При этом только а-кристаллины и Hsp27 охарактеризованы достаточно подробно, а структура и функции остальных представителей этого семейства остаются практически неизученными. Hsp20, являющийся объектом нашего исследования, был открыт сравнительно недавно, однако привлекает большой интерес разнообразием своих функций. Считается, что Hsp20 способен регулировать расслабление гладкой мускулатуры, предотвращать апоптоз кардиомиоцитов, участвовать в инсулин-зависимом транспорте глюкозы в скелетные мышцы и в регуляции агрегации тромбоцитов. К сожалению, при всем богатстве фактического материала, механизмы лежащие в основе большинства функций Hsp20, остаются не до конца понятными.

Целью данной работы был анализ структуры и свойств Hsp20 и изучение его взаимодействия с актином и актин-связывающими белками. Дня чего были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод выделения немодифицированного рекомбинантного Hsp20 без применения денатурирующих реагентов.

2. Определить шаперонную активность и олигомерное состояние Hsp20 и исследовать факторы, влияющие на эти свойства.

3. Проанализировать возможность образования гетероолигомерных комплексов между Hsp20 и Hsp27.

4. Проанализировать способность Hsp20 к взаимодействию с актином и некоторыми актин-связывающими белками.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработан метод выделения в нативных условиях рекомбинантного Hsp20 человека, а также мутанта этого белка, с заменой S16D, имитирующей фосфорилирование Hsp20 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ. Установлено, что в отличие от большинства других малых белков теплового шока, Hsp20 и его S16D мутант преимущественно представлены малыми олигомерами с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 2-2,9 S.

Hsp20 дикого типа эффективно препятствует агрегации инсулина, вызванной восстановлением дисульфидных связей, и агрегации алкогольдегидрогеназы, вызванной повышением температуры. Мутация, имитирующая фосфорилирование Hsp20, приводит к значительному снижению шаперонной активности этого белка. Понижение рН от 7,0 до 6,0 сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Hsp20, что может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией Hsp20.

Hsp20 и Hsp27 дикого типа образуют гетероолигомерные комплексы с кажущимися молекулярными массами 300 и 100 кДа. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице. Мутант Hsp27 с заменами Serl5, 78 и 82 на остатки Asp, имитирующими фосфорилирование Hsp27 под действием МАРКАР2/3 киназы, образует с Hsp20 единственный тип гетероолигомерных комплексов с кажущейся молекулярной массой 100 кДа, в котором стехиометрия Hsp20/Hsp27 близка к единице.

Установлено, что Hsp20 не влияет на скорость и степень полимеризации актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин, а также F-актином, входящим в состав миофибрилл скелетной, сердечной и гладкой мускулатуры. Фосфорилирование Serl6 Hsp20 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или мутация, имитирующая фосфорилирование, не влияют на способность Hsp20 взаимодействовать с изолированным F-актином или с F-актином в комплексе с некоторыми актин-связывающими белками или актином в составе миофибрилл.

Обзор литературы

1. Структура и свойства малых Hsp.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Букач, Олеся Владимировна

выводы

1. Разработан метод выделения рекомбинантного Hsp20 человека и мутанта этого белка с заменой, имитирующей фосфорилирование (S16D) под действием ци клону клеотид-зависимых протеинкиназ.

2. Установлено, что Hsp20 и его S16D мутант преимущественно образуют малые олигомеры с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 2 - 2,9 S.

3. Hsp20 дикого типа обладает более высокой шаперонной активностью, чем его S16D мутант при использовании в алкогольдегидрогеназы, термически денатурированного актина и инсулина в качестве белков-субстратов.

4. Уменьшение рН сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Hsp20. Это может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией олигомерных комплексов, образованных Hsp20.

5. Hsp20 и Hsp27 образуют гетероолигомерные комплексы, размер которых зависит от мутаций, имитирующих фосфорилирование Hsp27 по остаткам Serl5, 78,82. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице.

6. Hsp20 не влияет на полимеризацию актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин. Фосфорилирование Hsp20 или мутация, имитирующая фосфорилирование, не влияют на способность Hsp20 к взаимодействию с изолированным актином или с актином в составе миофибрилл.

Сердечно благодарю своего научного руководителя, Николая Борисовича Гусева за знания и опыт, полученные мной за время работы, а также за его бесконечное терпение. Выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории за помощь в работе и создание теплой дружеской атмосферы. Благодарю своих коллег, особенно к.б.н. А.С. Сейт-Неби, к.б.н. Н.А. Чеботареву, к.ф.-м.н. A.M. Арутюняна, к.б.н. М.В. Ким, д.б.н. А.Г. Катруху за помощь в проведении экспериментов и интерпретации полученных данных.

Хочу поблагодарить своих родителей и брата за любовь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Букач, Олеся Владимировна, 2006 год

1. Болотина И.А. (1973). Изучение структуры белков методом кругового дихроизма. Молекулярная биология. ВИНИТИ, Москва 1, 61-104

2. Кантор, Ч., Шиммел, П. (1984). Биофизическая химия. Москва, Мир.

3. Abulimiti, A. and Chang, Z. (2003). Alpha-crystallin promotes assembly of a trimeric form of Mycobacterium tuberculosis Hspl6.3 in a cell free system. Biochemistry (Mosc) 68,269-74.

4. Abulimiti, A., Fu, X., Gu, L., Feng, X. and Chang, Z. (2003). Mycobacterium tuberculosis Hsp 16.3 nonamers are assembled and re-assembled via trimer and hexamer intermediates. / Mol Biol 326,1013-23.

5. Allen, S. P., Polazzi, J. O., Gierse, J. K. and Easton, A. M. (1992). Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli. J Bacteriol 174,6938-47.

6. Andley, U. P., Mathur, S., Griest, T. A. and Petrash, J. M. (1996). Cloning, expression, and chaperone-like activity of human alphaA-crystallin. J Biol Chem 271, 3197380.

7. Aquilina, J. A., Benesch, J. L., Ding, L. L., Yaron, O., Horwitz, J. and Robinson, С. V. (2004). Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Chem 279,28675-80.

8. Arrigo, A. P. and Welch, W. J. (1987). Characterization and purification of the small 28,000-dalton mammalian heat shock protein. / Biol Chem 262,15359-69.

9. Augusteyn, R. C. (2004). alpha-crystallin: a review of its structure and function. Clin Exp Optom 87,356-66.

10. Augusteyn, R. C. (2004). Dissociation is not required for alpha-crystallin's chaperone function. Exp Eye Res 79,781-4.

11. Avruch, J. (1998). Insulin signal transduction through protein kinase cascades. Mol Cell Biochem 182,31-48.

12. Beall, A. C., Kato, K., Goldenring, J. R., Rasmussen, H. and Brophy, С. M. (1997). Cyclic nucleotide-dependent vasorelaxation is associated with the phosphorylation of a small heat shock-related protein. / Biol Chem 272,11283-7.

13. Benndorf, R., Hayess, K., Stahl, J. and Bielka, H. (1992). Cell-free phosphorylation of the murine small heat-shock protein hsp25 by an endogenous kinase from Ehrlich ascites tumor cells. Biochim Biophys Acta 1136,203-7.

14. Berengian, A. R., Bova, M. P. and McHaourab, H. S. (1997). Structure and function of the conserved domain in alphaA-crystallin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand located near a subunit interface. Biochemistry 36,9951-7.

15. Boelens, W. C., Croes, Y., de Ruwe, M., de Reu, L. and de Jong, W. W. (1998). Negative charges in the C-terminal domain stabilize the alphaB-crystallin complex. } Biol Chem 273,28085-90.

16. Bova, M. P., Huang, Q., Ding, L. and Horwitz, J. (2002). Subunit exchange, conformational stability, and chaperone-like function of the small heat shock protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J Biol Chem 277,38468-75.

17. Brophy, С. M., Dickinson, M. and Woodrum, D. (1999). Phosphorylation of the small heat shock-related protein, HSP20, in vascular smooth muscles is associated with changes in the macromolecular associations of HSP20. J Biol Chem 274, 6324-9.

18. Brophy, С. M., Lamb, S. and Graham, A. (1999). The small heat shock-related protein-20 is an actin-associated protein, f Vase Surg 29,326-33.

19. Brophy, С. M., Molinaro, J. R. and Dickinson, M. (2000). The macromolecular associations of heat shock protein-27 in vascular smooth muscle. Surgery 128, 320-6.

20. Brunner, F., Maier, R., Andrew, P., Wolkart, G., Zechner, R. and Mayer, B. (2003). Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice with myocyte-specific overexpression of endothelial nitric oxide synthase. Cardiovasc Res 37, 5562.

21. Buchner, J., Grallert, H. and Jakob, U. (1998). Analysis of chaperone function using citrate synthase as normative substrate protein. Methods Enzymol 290,323-38.

22. Burgio, M. R., Bennett, P. M. and Koretz, J. F. (2001). Heat-induced quaternary transitions in hetero- and homo-polymers of alpha-crystallin. Mol Vis 7,228-33.

23. Carver, J. A., Esposito, G., Schwedersky, G. and Gaestel, M. (1995). 1H NMR spectroscopy reveals that mouse Hsp25 has a flexible C-terminal extension of 18 amino acids. FEBS Lett 369,305-10.

24. Chavez Zobel, А. Т., Loranger, A., Marceau, N., Theriault, J. R., Lambert, H. and Landry, J. (2003). Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum Mol Genet 12,1609-20.

25. Chernik, I. S., Panasenko, О. O., Li, Y., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2004). pH-induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27kDa (HspBl). Biochem Biophys Res Commun 324,1199-203.

26. Chowdary, Т. K., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao, С. M. (2004). Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem } 381,379-87.

27. Clark, J. I. and Huang, Q. L. (1996). Modulation of the chaperone-like activity of bovine alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA93,15185-9.

28. Das, K. P., Petrash, J. M. and Surewicz, W. K. (1996). Conformational properties of substrate proteins bound to a molecular chaperone alpha-crystallin. } Biol Chem 271,10449-52.

29. Devlin, G. L., Carver, J. A. and Bottomley, S. P. (2003). The selective inhibition of serpin aggregation by the molecular chaperone, alpha-crystallin, indicates a nucleation-dependent specificity.} Biol Chem 278,48644-50.

30. Ding, D., Moskowitz, S. I., Li, R., Lee, S. В., Esteban, M., Tomaselli, K., Chan, J. and Bergold, P. J. (2000). Acidosis induces necrosis and apoptosis of cultured hippocampal neurons. Exp Neurol 162,1-12.

31. Ding, L. and Candido, E. P. (2000). HSP25, a small heat shock protein associated with dense bodies and M-lines of body wall muscle in Caenorhabditis elegans. / Biol Chem 275,9510-7.

32. Eefting, F., Rensing, В., Wigman, J., Pannekoek, W. J., Liu, W. M., Cramer, M. J., Lips, D. J. and Doevendans, P. A. (2004). Role of apoptosis in reperfusion injury. Cardiovasc Res 61,414-26.

33. Ehrnsperger, M., Graber, S., Gaestel, M. and Buchner, J. (1997). Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. Embo J16,221-9.

34. Ehrnsperger, M., Lilie, H., Gaestel, M. and Buchner, J. (1999). The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. / Biol Chem 274,14867-74.

35. Fan, G. C., Chu, G., Mitton, В., Song, Q., Yuan, Q. and Kranias, E. G. (2004). Small heat-shock protein Hsp20 phosphorylation inhibits beta-agonist-induced cardiac apoptosis. Circ Res 94,1474-82.

36. Fan, G. C., Ren, X., Qian, J., Yuan, Q., Nicolaou, P., Wang, Y., Jones, W. K., Chu, G. and Kranias, E. G. (2005). Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusion injury. Circulation 111, 1792-9.

37. Farahbakhsh, Z. Т., Huang, Q. L., Ding, L. L., Altenbach, C., Steinhoff, H. J., Horwitz, J. and Hubbell, W. L. (1995). Interaction of alpha-crystallin with spin-labeled peptides. Biochemistry 34,509-16.

38. Farnsworth, P. N., Frauwirth, H., Groth-Vasselli, B. and Singh, K. (1998). Refinement of 3D structure of bovine lens alpha A-crystallin. Int J Biol Macromol 22,175-85.

39. Farnsworth, P. N. and Singh, K. (2000). Self-complementary motifs (SCM) in alpha-crystallin small heat shock proteins. FEBS Lett 482,175-9.

40. Feil, I. K., Malfois, M., Hendle, J., van Der Zandt, H. and Svergun, D. I. (2001). A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. / Biol Chem 276,12024-9.

41. Feng, X., Huang, S., Fu, X., Abulimiti, A. and Chang, Z. (2002). The reassembling process of the nonameric Mycobacterium tuberculosis small heat-shock protein Hspl6.3 occurs via a stepwise mechanism. Biochem J 363,329-34.

42. Fontaine, J. M., Rest, J. S., Welsh, M. J. and Benndorf, R. (2003). The sperm outer dense fiber protein is the 10th member of the superfamily of mammalian small stress proteins. Cell Stress Chaperones 8,62-9.

43. Fontaine, J. M., Sun, X., Benndorf, R. and Welsh, M. J. (2005). Interactions of HSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun 337,1006-11.

44. Franck, E., Madsen, O., van Rheede, Т., Ricard, G., Huynen, M. A. and de Jong, W. W. (2004). Evolutionary diversity of vertebrate small heat shock proteins. / Mol Evol 59,792-805.

45. Franzmann, Т. M., Wuhr, M., Richter, K., Walter, S. and Buchner, J. (2005). The activation mechanism of Hsp26 does not require dissociation of the oligomer. J Mol Biol 350,1083-93.

46. Frobert, O., Buus, C. L. and Rembold, С. M. (2005). HSP20 phosphorylation and interstitial metabolites in hypoxia-induced dilation of swine coronary arteries. Acta Physiol Scand 184,37-44.

47. Ganea, E. (2001). Chaperone-like activity of alpha-crystallin and other small heat shock proteins. Curr Protein Pept Sci 2,205-25.

48. Golenhofen, N., Ness, W., Koob, R., Htun, P., Schaper, W. and Drenckhahn, D. (1998). Ischemia-induced phosphorylation and translocation of stress protein alpha B-crystallin to Z lines of myocardium. Am f Physiol 274, H1457-64.

49. Guo, Z. and Cooper, L. F. (2000). An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25 retains oligomerization and functional properties. Biochem Biophys Res Commun 270,183-9.

50. Haley, D. A., Horwitz, J. and Stewart, P. L. (1998). The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. / Mol Biol 277,27-35.

51. Hartl, F. U. (1996). Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381,571-9.

52. Haslbeck, M., Ignatiou, A., Saibil, H., Helmich, S., Frenzl, E., Stromer, T. and Buchner, J. (2004). A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. f Mol Biol 343,445-55.

53. Haslbeck, M., Walke, S., Stromer, Т., Ehrnsperger, M., White, H. E., Chen, S., Saibil, H. R. and Buchner, J. (1999). Hsp26: a temperature-regulated chaperone. Embo J 18, 6744-51.

54. Hedges, J. С., Dechert, M. A., Yamboliev, I. A., Martin, J. L., Hickey, E., Weber, L. A. and Gerthoffer, W. T. (1999). A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. / Biol Chem 274, 24211-9.

55. Horwitz, J., Bova, M. P., Ding, L. L., Haley, D. A. and Stewart, P. L. (1999). Lens alpha-crystallin: function and structure. Eye 13,403-8.

56. Horwitz, J., Huang, Q. and Ding, L. (2004). The native oligomeric organization of alpha-crystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp Eye Res 79,817-21.

57. Horwitz, J., Huang, Q. L., Ding, L. and Bova, M. P. (1998). Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol 290,365-83.

58. Huey, К. A., Thresher, J. S., Brophy, С. M. and Roy, R. R. (2004). Inactivity-induced modulation of Hsp20 and Hsp25 content in rat hindlimb muscles. Muscle Nerve 30,95-101.

59. Kappe, G., Franck, E., Verschuure, P., Boelens, W. C., Leunissen, J. A. and de Jong, W. W. (2003). The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8,53-61.

60. Kato, K., Goto, S., Inaguma, Y., Hasegawa, K., Morishita, R. and Asano, T. (1994). Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha В crystallin. / Biol Chem 269,15302-9.

61. Kato, K., Hasegawa, K., Goto, S. and Inaguma, Y. (1994). Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. / Biol Chem 269,11274-8.

62. Kato, K., Ito, H., Kamei, K., Inaguma, Y., Iwamoto, I. and Saga, S. (1998). Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphorylation. / Biol Chem 273,28346-54.

63. Kato, К., Shinohara, H., Goto, S., Inaguma, Y., Morishita, R. and Asano, T. (1992). Copurification of small heat shock protein with alpha В crystallin from human skeletal muscle. / Biol Chem 267, 7718-25.

64. Kim, К. K., Kim, R. and Kim, S. H. (1998). Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394,595-9.

65. Kim, M. V., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2004). Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (Hll or HspB8). Biochem Biophys Res Commun 315,796-801.

66. Kim, N. K., Joh, J. H., Park, H. R., Kim, О. H., Park, B. Y. and Lee, C. S. (2004). Differential expression profiling of the proteomes and their mRNAs in porcine white and red skeletal muscles. Proteomics 4,3422-8.

67. Kim, R., Kim, К. K., Yokota, H. and Kim, S. H. (1998). Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA 95, 9129-33.

68. Klemenz, R., Frohli, E., Steiger, R. H., Schafer, R. and Aoyama, A. (1991). Alpha B-crystallin is a small heat shock protein. Proc Natl Acad Sci US A 88,3652-6.

69. Knauf, U., Bielka, H. and Gaestel, M. (1992). Over-expression of the small heat-shock protein, hsp25, inhibits growth of Ehrlich ascites tumor cells. FEBS Lett 309, 297302.

70. Koh, T. J. and Escobedo, J. (2004). Cytoskeletal disruption and small heat shock protein translocation immediately after lengthening contractions. Am J Physiol Cell Physiol 286, C713-22.

71. Кокке, B. P., Leroux, M. R., Candido, E. P., Boelens, W. C. and de Jong, W. W. (1998). Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBS Lett 433,228-32.

72. Koteiche, H. A. and McHaourab, H. S. (2003). Mechanism of chaperone function in small heat-shock proteins. Phosphorylation-induced activation of two-mode binding in alphaB-crystallin. / Biol Chem 278,10361-7.

73. MacRae, Т. H. (2000). Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell Mol Life Sci 57,899-913.

74. Martin, J. L., Mestril, R., Hilal-Dandan, R., Brunton, L. L. and Dillmann, W. H. (1997). Small heat shock proteins and protection against ischemic injury in cardiac myocytes. Circulation 96,4343-8.

75. Matsuno, H., Ishisaki, A., Nakajima, K., Kato, K. and Kozawa, O. (2003). A peptide isolated from alpha B-crystallin is a novel and potent inhibitor of platelet aggregation via dual prevention of PAR-1 and GPIb/V/IX. f Thromb Haemost 1, 2636-42.

76. Matsuno, H., Kozawa, O., Niwa, M., Usui, A., Ito, H., Uematsu, T. and Kato, K. (1998). A heat shock-related protein, p20, plays an inhibitory role in platelet activation. FEBS Lett 429,327-9.

77. McLemore, E. G, Tessier, D. J., Thresher, J., Komalavilas, P. and Brophy, С. M. (2005). Role of the small heat shock proteins in regulating vascular smooth muscle tone. J Am Coll Surg 201,30-6.

78. Merck, К. В., De Haard-Hoekman, W. A., Oude Essink, В. В., Bloemendal, H. and De Jong, W. W. (1992). Expression and aggregation of recombinant alpha A-crystallin and its two domains. Biochim Biophys Acta 1130,267-76.

79. Michaud, S., Marin, R. and Tanguay, R. M. (1997). Regulation of heat shock gene induction and expression during Drosophila development. Cell Mol Life Sci 53, 104-13.

80. Miron, Т., Wilchek, M. and Geiger, B. (1988). Characterization of an inhibitor of actin polymerization in vinculin-rich fraction of turkey gizzard smooth muscle. Eur J Biochem 178,543-53.

81. Mogk, A., Deuerling, E., Vorderwulbecke, S., Vierling, E. and Bukau, B. (2003). Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional triade in reversing protein aggregation. Mol Microbiol 50,585-95.

82. Munchbach, M., Nocker, A. and Narberhaus, F. (1999). Multiple small heat shock proteins in rhizobia. J Bacteriol 181,83-90.

83. Nakamoto, H., Suzuki, N. and Roy, S. K. (2000). Constitutive expression of a small heat-shock protein confers cellular thermotolerance and thermal protection to the photosynthetic apparatus in cyanobacteria. FEBS Lett 483,169-74.

84. Narberhaus, F. (2002). Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol Mol Biol Rev 66,64-93; table of contents.

85. Niwa, M., Kozawa, O., Matsuno, H., Kato, K. and Uematsu, T. (2000). Small molecular weight heat shock-related protein, HSP20, exhibits an anti-platelet activity by inhibiting receptor-mediated calcium influx. Life Sci 66, PL7-12.

86. O'Connor, M. J. and Rembold, С. M. (2002). Heat-induced force suppression and HSP20 phosphorylation in swine carotid media. } Appl Physiol 93,484-8.

87. Panasenko, О. O. and Gusev, N. B. (2001). Mutual effects of alpha-actinin, calponin and filamin on actin binding. Biochim Biophys Acta 1544,393-405.

88. Panasenko, О. O., Kim, M. V., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2003). Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur } Biochem 270,892-901.

89. Panasenko, О. O., Seit Nebi, A., Bukach, О. V., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2002). Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim Biophys Acta 1601, 64-74.

90. Pardee, J. D. and Spudich, J. A. (1982). Purification of muscle actin. Methods Enzymol 85 Pt B, 164-81.

91. Park, С. O., Xiao, X. H. and Allen, D. G. (1999). Changes in intracellular Na+ and pH in rat heart during ischemia: role of Na+/H+ exchanger. Am J Physiol 276, H1581-90.

92. Pasta, S. Y., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao Ch, M. (2003). Role of the conserved SRLFDQFFG region of alpha-crystallin, a small heat shock protein. Effect on oligomeric size, subunit exchange, and chaperone-like activity. } Biol Chem 278, 51159-66.

93. Pasta, S. Y., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao Ch, M. (2004). The IXI/V motif in the C-terminal extension of alpha-crystallins: alternative interactions and oligomeric assemblies. Mol Vis 10,655-62.

94. Pipkin, W., Johnson, J. A., Creazzo, T. L., Burch, J., Komalavilas, P. and Brophy, C. (2003). Localization, macromolecular associations, and function of the small heat shock-related protein HSP20 in rat heart. Circulation 107,469-76.

95. Plater, M. L., Goode, D. and Crabbe, M. J. (1996). Effects of site-directed mutations on the chaperone-like activity of alphaB-crystallin. J Biol Chem 271,28558-66.

96. Pollard, T. D. (1983). Measurement of rate constants for actin filament elongation in solution. Anal Biochem 134,406-12.

97. Port, J. D. and Bristow, M. R. (2001). Altered beta-adrenergic receptor gene regulation and signaling in chronic heart failure. } Mol Cell Cardiol 33,887-905.

98. Rajaraman, K., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao, С. M. (1998). The chaperone-like alpha-crystallin forms a complex only with the aggregation-prone molten globule state of alpha-lactalbumin. Biochem Biophys Res Commun 249,917-21.

99. Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao, С. M. (1995). Temperature dependent chaperone-like activity of alpha-crystallin. FEBS Lett 365,133-6.

100. Raman, B. and Rao, С. M. (1994). Chaperone-like activity and quaternary structure of alpha-crystallin. J Biol Chem 269,27264-8.

101. Rao, С. M., Raman, В., Ramakrishna, Т., Rajaraman, K., Ghosh, D., Datta, S., Trivedi, V. D. and Sukhaswami, M. B. (1998). Structural perturbation of alpha-crystallin and its chaperone-like activity. Int J Biol Macromol 22,271-81.

102. Rembold, С. M. and Kaufman, E. (2003). Heat induced HSP20 phosphorylation without increased cyclic nucleotide levels in swine carotid media. BMC Physiol 3,3.

103. Rembold, С. M., O'Connor, M., Clarkson, M., Wardle, R. L. and Murphy, R. A. (2001). Selected contribution: HSP20 phosphorylation in nitroglycerin- and forskolin-induced sustained reductions in swine carotid media tone. / Appl Physiol 91, 1460-6.

104. Rembold, С. M. and Zhang, E. (2001). Localization of heat shock protein 20 in swine carotid artery. BMC Physiol 1,10.

105. Sharma, К. K., Kaur, H. and Kester, K. (1997). Functional elements in molecular chaperone alpha-crystallin: identification of binding sites in alpha B-crystallin. Biochem Biophys Res Commun 239,217-22.

106. Sharma, К. K., Kaur, H., Kumar, G. S. and Kester, K. (1998). Interaction of l,l'-bi(4-anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid with alpha-crystallin. / Biol Chem 273, 8965-70.

107. Sharma, К. K., Kumar, G. S., Murphy, A. S. and Kester, K. (1998). Identification of 1,1'-bi(4-anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid binding sequences in alpha-crystallin. / Biol Chem 273,15474-8.

108. Sharma, К. K., Kumar, R. S., Kumar, G. S. and Quinn, P. T. (2000). Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. / Biol Chem 275,3767-71.

109. Smulders, R., Carver, J. A., Lindner, R. A., van Boekel, M. A., Bloemendal, H. and de Jong, W. W. (1996). Immobilization of the C-terminal extension of bovine alphaA-crystallin reduces chaperone-like activity. / Biol Chem 271,29060-6.

110. Smulders, R. H. and de Jong, W. W. (1997). The hydrophobic probe 4,4'-bis(l-anilino-8-naphthalene sulfonic acid) is specifically photoincorporated into the N-terminal domain of alpha B-crystallin. FEBS Lett 409,101-4.

111. Stamler, R., Kappe, G., Boelens, W. and Slingsby, C. (2005). Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. JMol Biol 353,68-79.

112. Stromer, Т., Ehrnsperger, M., Gaestel, M. and Buchner, J. (2003). Analysis of the interaction of small heat shock proteins with unfolding proteins. / Biol Chem 278, 18015-21.

113. Studer, S. and Narberhaus, F. (2000). Chaperone activity and homo- and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins. / Biol Chem 275, 372128.

114. Studer, S., Obrist, M., Lentze, N. and Narberhaus, F. (2002). A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial alpha-heat shock proteins. Eur J Biochem 269,3578-86.

115. Sun, Т. X., Das, В. К. and Liang, J. J. (1997). Conformational and functional differences between recombinant human lens alphaA- and alphaB-crystallin. / Biol Chem 272, 6220-5.

116. Sun, Т. X. and Liang, J. J. (1998). Intermolecular exchange and stabilization of recombinant human alphaA- and alphaB-crystallin. } Biol Chem 273,286-90.

117. Sun, W., Van Montagu, M. and Verbruggen, N. (2002). Small heat shock proteins and stress tolerance in plants. Biochim Biophys Acta 1577,1-9.

118. Sun, X., Fontaine, J. M., Rest, J. S., Shelden, E. A., Welsh, M. J. and Benndorf, R. (2004). Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. } Biol Chem 279,2394-402.

119. Taylor, R. P. and Benjamin, I. J. (2005). Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. } Mol Cell Cardiol 38,433-44.

120. Tessier, D. J., Komalavilas, P., McLemore, E., Thresher, J. and Brophy, С. M. (2004). Sildenafil-induced vasorelaxation is associated with increases in the phosphorylation of the heat shock-related protein 20 (HSP20). / Surg Res 118,215.

121. Tessier, D. J., Komalavilas, P., Panitch, A., Joshi, L. and Brophy, С. M. (2003). The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. } Surg Res 111, 152-7.

122. Theriault, J. R., Lambert, H., Chavez-Zobel, А. Т., Charest, G., Lavigne, P. and Landry, J. (2004). Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. / Biol Chem 279,23463-71.

123. Vander Heide, R. S. (2002). Increased expression of HSP27 protects canine myocytes from simulated ischemia-reperfusion injury. Am } Physiol Heart Circ Physiol 282, H935-41.

124. Veinger, L., Diamant, S., Buchner, J. and Goloubinoff, P. (1998). The small heat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. / Biol Chem 273,11032-7.

125. Verschuure, P., Tatard, C., Boelens, W. C., Grongnet, J. F. and David, J. C. (2003). Expression of small heat shock proteins HspB2, HspB8, Hsp20 and cvHsp in different tissues of the perinatal developing pig. Eur J Cell Biol 82,523-30.

126. Vischer, U. M. (1998). Insulin resistance and the regulation of vascular tone: is insulin a vasodilator? Eur } Endocrinol 138,262-3.

127. Wang, Y., Xu, A. and Cooper, G. J. (1999). Amylin evokes phosphorylation of P20 in rat skeletal muscle. FEBS Lett 457,149-52.

128. Wang, Y., Xu, A. and Cooper, G. J. (1999). Phosphorylation of P20 is associated with the actions of insulin in rat skeletal and smooth muscle. Biochem J 344 Pt 3,971-6.

129. Wang, Y., Xu, A., Pearson, R. B. and Cooper, G. J. (1999). Insulin and insulin antagonists evoke phosphorylation of P20 at serine 157 and serine 16 respectively in rat skeletal muscle. FEBS Lett 462,25-30.

130. Wang, Y., Xu, A., Ye, J., Kraegen, E. W., Tse, C. A. and Cooper, G. J. (2001). Alteration in phosphorylation of P20 is associated with insulin resistance. Diabetes 50,1821-7.

131. Woodrum, D. A., Brophy, С. M., Wingard, C. J., Beall, A. and Rasmussen, H. (1999). Phosphorylation events associated with cyclic nucleotide-dependent inhibition of smooth muscle contraction. Am } Physiol T77, H931-9.

132. Yamboliev, I. A., Hedges, J. C., Mutnick, J. L., Adam, L. P. and Gerthoffer, W. T. (2000). Evidence for modulation of smooth muscle force by the p38 MAP kinase/HSP27 pathway. Am } Physiol Heart Circ Physiol 278, H1899-907.

133. Zantema, A., Verlaan-De Vries, M., Maasdam, D., Bol, S. and van der Eb, A. (1992). Heat shock protein 27 and alpha B-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock. } Biol Chem 267,12936-41.

134. Zhu, Y. H., Ma, Т. M. and Wang, X. (2005). Gene transfer of heat-shock protein 20 protects against ischemia/reperfusion injury in rat hearts. Acta Pharmacol Sin 26, 1193-200.

135. Zhu, Y. H. and Wang, X. (2005). Overexpression of heat-shock protein 20 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia/reperfusion injury. Acta Pharmacol Sin 26,1076-80.