Везикулярный цикл в нервно-мышечных синапсах соматических клеток дождевого червя тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат наук Волков, Михаил Евгеньевич

• Волков, Михаил Евгеньевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Волков, Михаил Евгеньевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цель и задачи исследования

Положения, выносимые на защиту

Научная новизна

Научно-практическая ценность

Личный вклад диссертанта

Апробация работы

Реализация результатов исследования

Структура и объем диссертационной работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура нервно-мышечного синапса

1.1.1. Структура нервной терминали

1.1.2. Постсинаптическая область синапса

1.2. Брюшная нервная цепочка и иннервация соматической мышцы (дождевого

червя)

1.2.1.Чувствительность к медиаторам мышечных клеток соматической мышцы дождевого червя

1.2.1.1.Ацетилхоли н

1.2.1.2. Гамма-аминомаслянная кислота

1.2.1.3. Адреналин и норадреналин

1.2.2. Нервно-мышечные синапсы соматической мускулатуры аннелид (дождевого червя)

1.3. Механизмы секреции медиатора

1.3.1. Квантово-везикулярная гипотеза секреции медиатора

1.3.2. Экзо-эндоцитозный везикулярный цикл

1.3.3. Белки «молекулярной» машины везикулярного цикла

1.3.4. Кальциевые каналы пресинаптической мембраны. Роль Са2+

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования и растворы

2.2. Оптический метод изучения экзо-эндоцитозного цикла с применением эндоцитозных маркеров

2.4. Применение флуоресцентного зонда Dil, переносимого аксонным транспортом из тел мотонейронов в нервные окончания

2.5. Количественное определение содержания ацетилхолина в мышце оптическим методом

2.6. Иммуноцитохимическая идентификация Н-холинорецепторов, синтаксина 1, синаптотагмина 1, альфа 1В субъединицы Са-канала1Ч-типа методами конфокальной микроскопии

2.7. Использованные химические реактивы

2.8. Статистический анализ полученных данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение везикулярного цикла в нервных образованиях соматической мышцыЗ'

3.1.1. Определение нервно-мышечных синапсов

3.1.2. Доказательства наличия связи между «синаптическими бутономи» и ганглиями брюшной нервной цепочки

3.1.3. Изменение МПП нервных окончаний при увеличении К+ в экстраклеточном растворе

3.1.4. Изучение везикулярного цикла с помощью флуоресцентного эндоцитозного красителя FM2-10

3.1.5. Роль вне- и внутриклеточного Са2+ в экзо-эндоцитозном цикле

3.1.6. Заключение

3.2. Зависимость концентрации ацетилхолина в соматической мышце от интенсивности протекания везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах

3.2.1. Оптическое определение концентрации ацетилхолина в соматической мышце

3.2.2. Заключение

3.3. Иммуноцитохимическая идентификация Н-холинорецептора, синаптотагмина 1, синтаксина 1, Са2+ -канала N-типа в двигательных нервно-мышечных синапсах

соматической мышцы

3.3.1.Определение Н-холинорецепторов в клетках соматической мышцы

3.3.2. Определение синаптотагмина 1, синтаксина 1, Са -канала М-типа в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мышцы

3.3.3. Заключение

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Везикулярный цикл в нервно-мышечных синапсах соматических клеток дождевого червя»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Изучение механизмов передачи возбуждения в синаптических структурах является одним из актуальнейших и быстро развивающихся направлений в современной нейрофизиологии. В основе секреции медиатора в химических синапсах лежит процесс экзо-эндоцитоза синаптических везикул в активных зонах активных зонах [24]. Основные механизмы этого процесса хорошо изучены. Однако, представления об особенностях формирования данных механизмов в различных группах животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, имеют существенные пробелы. В этом отношении особый интерес представляют аннелиды. В эволюционном плане это первая группа животных, имеющая соматическую мускулатуру и двигательную иннервацию [17].

В синаптических образованиях соматической мышцы дождевого червя определяются везикулярные структуры, сходные с таковыми в двигательных окончаниях позвоночных животных [148], а в мышечных клетках регистрируются миниатюрные спонтанные постсинаптические токи [170]. При этом сведения о механизмах экзо-эндоцитозного цикла в двигательных нервно-мышечных синапсах первичной двигательной мускулатуры аннелид практически отсутствуют. В этом плане прижизненное изучение особенностей везикулярного цикла и секреции медиатора в холинергических нервно-мышечных синапсах мышечной стенки дождевого червя с применением методов флуоресцентной микроскопии представляется весьма актуальным.

Известно, что секреция медиатора осуществляется при участии большого семейства белков, формирующих «молекулярную машину» экзо-эндоцитоза синаптических везикул [24]. В этом механизме одна из ключевых ролей принадлежит синтаксинам [153]. В свою очередь, синтаксины взаимодействуют с семейством белков синаптотагминов мембраны синаптических везикул [162].

Синтаксины и синаптотагмины являются главными Са2+-сенсорами экзо-эндоцитоза [154; 176] пространственно-сопряженными с Са -каналами[146].

В свою очередь, проводящими путями Са2+-тока в пресинаптической мембране являются Са2+-каналы различных подтипов [19].

Белки семейства синтаксинов, синаптотагминов и Са -каналов обладают высокой структурной и фармакологической вариабельностью в периферических синапсах различных типов. От дифференциальной экспрессии набора данных белков и пространственной структуры активных зон нервных окончаний зависят особенности Са2+-чувствительности и синхронности вызванного и спонтанного выброса медиатора. Идентификация ключевых белков везикулярного цикла и определение структурной организации активных зон на примере периферических холинергических синапсов филогенетически первичной соматической мускулатуры дождевого червя не проводилась.

Данное исследование имеет принципиальное значение для создания полноценной картины, отражающей эволюционное формирование базовых механизмов секреции медиатора в двигательных нервно-мышечных синапсах у животных разных систематических групп.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования стало изучение механизмов везикулярного цикла, связи этого процесса с концентрацией ацетилхолина (АХ) в соматической мышце дождевого червя, а также идентификация ряда важнейших белков, участвующих в этом процессе с использованием методов флуоресцентной микроскопии.

В соответствии с целью исследования были сформулированы конкретные задачи, а именно:

1. Определить двигательные нервно-мышечные синапсы в соматической мышце дождевого червя и их связь с нейронами ганглиев брюшной нервной

цепочки.

2. Изучить потенциал- и К+-зависимость экзо-эндоцитозного цикла в двигательных синапсах.

3. Определить роль экстра- и внутриклеточного Са2+ в процессах экзо-эндоцитозного цикла.

4. Прямым количественным методом определить концентрацию АХ в соматической мышце. Установить зависимость между интенсивностью протекания процессов везикулярного цикла и концентрацией АХ в мышце.

5. Выявить зоны расположения ацетилхолиновых рецепторов (АХР) на постсинаптической мембране соматических мышечных клеток.

6. Иммуноцитохимически идентифицировать синаптотагмин 1, синтаксин 1

^ I

и альфа 1В субъединицу Са -канала Ы-типа в холинергических двигательных нервно-мышечных синапсах.

Положения, выносимые на защиту

1. Везикулярный цикл в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мышцы дождевого червя, образующих кластеры «синаптических бутонов», потенциал-, К+- и Са2+-зависимый.

2. Ускорение процессов экзо-эндоцитоза в двигательных синапсах сопровождается увеличением, а замедление — снижением концентрации АХ в соматической мышце. Содержание медиатора в мышце остается относительно высоким и в условиях блокады везикулярного цикла.

3. В синаптических образованиях идентифицируются белки синтаксин 1,

____Л I

синаптотагмин 1 и альфа 1В субъединица Са "канала Ы-типа. Расположение ацетилхолиновых рецепторов, способных связываться с альфа-бунгаротоксином, строго ограничено зоной синаптического контакта.

Научная новизна

В мышечной стенке дождевого червя с помощью флуоресцентных эндоцитозных красителей БМ1-43, БМ2-10, БМ4-64 выявлены кластеры «синаптических бутонов».

С помощью мембранного зонда ОН впервые доказана связь данных образований с нейронами ганглиев брюшной нервной цепочки.

Впервые показано, что чем выше содержание К+ в растворе и, соответственно, деполяризация нервных клеток, что контролировалось потенциал-чувствительным зондом Б1ВАС4 (3), тем быстрее идет выгрузка маркера РМ2-10 и, наоборот, процесс замедляется в отсутствии К+ в среде.

¿у, ^^

В растворах без Са в присутствии Са -буферов ВАРТА или ВАРТА-АМ захват и выгрузка РМ2-10 блокируется, но только после предварительной 40 мин инкубации.

Впервые высказано предположение, что кальциевый сенсор экзо-эндоцитозного цикла работает по принципу «все или ничего».

Впервые установлено, что усиление интенсивности везикулярного цикла в кластерах «синаптических бутонов» приводит к ограниченному увеличению концентрации АХ в соматической мышце дождевого червя. При этом содержание АХ остается значительным как в состоянии «покоя», так и в условиях блокады секреции в безкальциевых растворах в присутствии Са -буферов.

В холинергических синапсах в соматической мышце дождевого червя впервые показана экспрессия таких белков как: синтаксин 1, синаптотагмин 1 и

I

альфа 1В субъединица Са -канала Ы-типа.

Впервые высказано предположение, что число активных зон в «синаптических бутонах» может быть ограничено в виду их малых размеров (1-2 мкм).

Впервые установлено, что локализация АХР Н-типа, способных связываться с альфа-бунгаротоксином, строго ограничена зоной синаптического контакта.

Научно-практическая ценность

Проведенное исследование носит, прежде всего, фундаментальное теоретическое значение для нейрофизиологии передачи возбуждения в периферических нейромоторных синапсах двигательной мускулатуры. Последнее имеет принципиальное значение для понимания процессов формирования нервно-мышечных синапсов в эволюционно незрелых двигательных системах животных, в частности у кольчатых червей, от которых, предположительно, произошли все высшие беспозвоночные и, по некоторым данным, и позвоночные животные.

Как показали наши исследования, базовые механизмы секреции медиатора у дождевого червя и у высших позвоночных принципиально не отличаются. Данное обстоятельство дает право предлагать дождевого червя в качестве более простого и доступного объекта (лабораторного животного) для изучения особенностей везикулярного цикла, семейства белков, принимающих в нем участие и, соответственно, генетических структур, обеспечивающих экспрессию соответствующих фенотипических свойств.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (09-04-00170а и 12-0431197 мола).

Личный вклад диссертанта

Все данные, приведенные в работе, получены при личном участии соискателя на всех этапах проведения исследования, а именно: составление плана работы, подготовка и проведение экспериментов, анализ и систематизация полученных данных, а также оформление публикаций.

Апробация работы

Результаты исследования, вошедшие в диссертационную работу, доложены

на следующих конференциях, симпозиумах, съездах: XXI Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга-Москва 2010); Всероссийской конференции «Механизмы адаптации физиологических систем к факторам среды» (Санкт-Петербург, 2010);85-ой Всероссийской студенческой научной конференции (Казань, 2011); VIII Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и психологии» (Судак, 2012, 2013); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань,

2012); XXII Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Волгоград,

2013); Материалы XII Международной научной школы «Адаптация растущего организма» (Казань,2014).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 публикации в рецензируемых журналах (списка ВАК). Материалы диссертации докладывались на международных, всероссийских научных съездах, конференциях и симпозиумах.

Полученные данные представляют интерес для нейробиологов, физиологов, нейрогенетиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре «нормальной физиологии», кафедре «медицинской биологии и генетики» ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России и кафедре «анатомии, физиологии и охраны здоровья человека» ФГАОУ ВПО КФУ.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация имеет 91 страницу текста. Состоит из введения, обзора литературы, методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка иллюстративного материала и списка литературы. Список цитируемых источников включает 181 работу, из них

25 - отечественных и 156 - иностранных авторов. Диссертация содержит 15 рисунков и 1 таблицу.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура нервно-мышечного синапса

Нервно-мышечный синапс - эффекторное нервное окончание на скелетном мышечном волокне. Аксон альфа-мотонейрона, проходя через сарколемму мышечного волокна, утрачивает миелиновую оболочку (белково-липидный комплекс), где прикрыт только шванновской клеткой, и делится на тонкие терминальные веточки нервного окончания (НО), каждая из которых подходит к отдельному мышечному веретену, образуя сложную структуру с плазматической мембраной мышечного волокна - синапс.

Нервное окончание в фазных мышцах холоднокровных (лягушка) имеет вид «кустика», а в тонических - «виноградной кисти». [38; 2]. У теплокровных животных нервные окончания фазных волокон имеют вид «бутона» [18].

Нервно-мышечный синапс состоит из трёх элементов: пресинаптическая мембрана - булавовидное расширение нервного окончания аксона, обращенное к поверхности мышечного волокна; постсинаптическая мембрана — представляет собой контактирующий участок цитолеммы, куда прилегает нервное окончание (двигательная концевая пластинка); микропространство между этими мембранами - синаптическая щель [59].

1.1.1. Структура нервной терминали

Снаружи нервное окончание от химических и механических повреждений защищает специальное покрытие, образованное пресинаптическими шванновскими клетками, пальцевидные отростки которых разделяют терминаль на сегменты, расположенных с интервалом в 1-3 мкм между плотными проекциями (активная зона) нервных терминалей.

Активная зона (АЗ) - место, где везикулы сливаются с пресинаптической

мембраной и освобождают ацетилхолин в синаптическую щель[136; 54; 84; 33].

В аксоплазме нервных окончаний имеются различные органеллы -синаптические везикулы, имеющие диаметр 50 нм и содержащими медиатор ацетилхолин, митохондрии, обеспечивающие энергией клетку и контролирующие концентрацию внутриклеточных ионов Са , микротрубочки, микрофиламенты, цистерны эндоплазматического ретикулума для накопления в них ионов Са2+ путём закачивания последних с помощью встроенных Са-насосов (Са-АТФазы). [38;54; 53; 1].

1.1.2. Постсинаптическая область синапса

В постсинаптической области синапса нервные терминали уложены в синаптические ямки, напоминающие желобки, где присутствуют различные по глубине инвагинации шириной 50-100 нм — постсинаптические складки [38]. За счёт такой формы данной структуры значительно увеличивается ширина синаптического контакта [134; 136].

На постсинаптической мембране расположены никотиновые холинорецепторные ионные каналы, группирующиеся в районе устья складок [38; 127]. Выполнив свою функцию, ацетилхолин расщепляется ферментом ацетилхолинэстеразой, либо диффундирует из синаптической щели [59; 106].

1.2. Брюшная нервная цепочка и иннервация соматической мышцы (дождевого червя)

На брюшной стороне тела дождевого червя, вдоль средней линии, под мускулатурой находится нервный ствол, получивший название брюшная нервная цепочка. В каждом членике тела располагается по одному двойному нервному узлу (ганглию), состоящего из скопления нервных клеток. Каждый такой ганглий отдаёт от себя по три пары нервов. Все нервные узлы соединены между собой перемычками (коннективами). На уровне 3-го сегмента брюшная нервная цепочка

делится на правую и левую глоточные перемычки, которые образуют окологлоточное нервное кольцо, соединяющееся с надглоточным (головным) ганглием, образованного из плотно соединенных друг с другом правой и левой половин. Данный нервный узел отличается от остальных тем, что располагается на спинной стороне (над кишечником) и его можно сравнивать по морфологическим особенностям с головным мозгом более высокого организованных животных (членистоногих). В первых трёх сегментах от него отходит множество разветвляющихся нервных волокон, которые впоследствии образуют плотные нервные сплетения. Под глоткой, где расходятся глоточные перемычки, располагается глоточный ганглий, появившийся в результате слияния нескольких нервных узлов нервной брюшной цепочки. На спинной стороне нервной брюшной цепочки по всей длине тела дождевого червя под соединительнотканной капсулой можно обнаружить три толстых волокна (нейрохорды), которые по функции, строению и положению между нервной системой и кишечником сходны с хордой позвоночных. Нервы, отходящие от ганглиев брюшной цепочки, содержат двигательные волокна, заканчивающиеся в мускулатуре, и чувствительные, по которым раздражения поступают в нервную систему с периферии (рисунок 1) [159].

Рисунок 1- Нервная система передних сегментов дождевого червя[159].

1. - надглоточный ганглий; 2- нервы от окологлоточной комиссуры; 3 -окологлоточные комиссуры; 4 - сегментальные нервы; 5 - брюшная нервная цепочка; 6 - подглоточный ганглий; 7 - нервы головной лопасти; 1-У1 - 1-й-б-й сегменты.

1.2.1.Чувствительность к медиаторам мышечных клеток соматической мышцы дождевого червя

Серотонин, глютамат, глицин, аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) не влияют на МПП соматических мышечных клеток дождевого червя [4]. При этом АХ, как и его аналог карбахолин (ЮС), дозозависимо деполяризуют мышечную мембрану[7]. Следует подчеркнуть, что уже физиологические концентрации АХ (5x10"6) статистически значимо снижают МПП [7].

Адреналин, норадреналин и гамма-аминомаслянная кислота (ГАМК), наоборот, гиперполяризуют мембрану мышечных клеток [5; 9; 10;171;4].

1.2.1.1.Ацетилхолин

о

Известно, что низкие концентрации КХ (5х1(Г моль/л) вызывают увеличение МПП мышечных волокон у млекопитающих [14]. Однако, подобные концентрации в отношении потенциала покоя у червя оказались не эффективны [7]. Более высокие концентрации холиномиметиков, начиная с 5x10"6 моль/л, вызывают деполяризацию, приводящую в итоге к мышечному сокращению. Присутствие мускарина в растворе не влияет на МПП мышечных клеток [7 ]. В то же время, добавление в раствор классических Н-блокаторов, как ё-тубокурарин, а-бунгаротоксин, или М-блокатора атропина не устраняет снижения МПП, возникающего под действием КХ [7].

Все вышеперечисленные блокаторы, взятые по отдельности, не влияют на МПП мышечных клеток. Предполагается, что АХ является основным претендентом на роль возбуждающего медиатора в двигательной нервно-мышечной системе дождевого червя [13, 169]. В то же время, рецепторно-канальный комплекс мембраны мышечных клеток, по-видимому, представляет собой особый тип АХ-рецептора Н-типа, отличного от такового в скелетных мышечных волокнах позвоночных [7; 169].

1.2.1.2. Гамма-аминомаслянная кислота

На основании имеющихся данных гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) вызывает увеличение трансмембранной разности потенциалов в клетках соматической мышцы дождевого червя через активацию работы №/К-помпы [4]. Предполагается, что мышечная мембрана содержит ГАМК-ергические структуры, сходные с рецепторами А- и В-типа позвоночных [10]. При этом считается, что преобладают рецепторы В-типа, тогда как рецепторы С-типа полностью отсутствуют [10]. Активация активных ионных насосов происходит через следующую цепочку событий: активация В-рецепторов, открытие Са-каналов при посредничестве в-белков, активация входящим кальциевым током Са-акцепторных белков по типу кальмодулина [10].

Установлено, что ГАМК и баклофен, специфический аганонист В-типа рецепторов, утрачивают способность гиперполяризовать мембрану мышечных клеток дождевого червя в присутствии карбахолина. Предполагается, что карбахолин способен непосредственно ингибировать "уабаинчувствительную" составляющую К+-насоса, препятствуя тем самым активирующему влиянию на последнюю ГАМК и баклофена [13].

Таким образом, можно думать, что потенциал покоя мышечных клеток дождевого червя находится под двойным влиянием, как со стороны холинергической иннервации, так и в значительной степени ГАМК-ергической [13; 169]. Последняя может претендовать на роль «тормозной» иннервации.

1.2.1.3. Адреналин и норадреналин

Медиатор норадреналин и гормон адреналин в физиологических концентрациях - влияют на потенциал покоя клеток мышечной стенки дождевого червя [5].

Норадреналин реализует свое действие через активацию работы активных ионных насосов [5]. Адреналин обладает аналогичным действием, однако, в

данном случае прирост МПП по абсолютной величине выражен почти втрое меньше по сравнению с увеличением потенциала покоя под действием норадреналина. Данные препараты реализуют свое действие через адреночувствительные структуры альфа и бета-типа. При этом мембрана мышечных клеток дождевого червя содержит в основном адренорецепторы а-типа, количество ß-адренорецепторов значительно ниже [5]. Способность норадреналина и адреналина увеличивать потенциал покоя мышечных клеток дождевого червя через активацию работы Na+, К+-насоса при участии адренергических структур сарколеммы, носит выраженный Са-зависимый характер [5; 9]. Однако, системы циклических нуклеотидов в этот процесс не вовлечены [9].

1.2.2. Нервно-мышечные синапсы соматической мускулатуры аннелид (дождевого червя)

В кожно-мускульном мешке дождевого червя, начиная с головных сегментов и до хвостовых, в состав брюшной нервной цепочки входят гигантские: вентральный, медиальный и латеральный нервные тяжи, соединяющиеся с нейронами сегментарных ганглиев с помощью синаптических контактов.

Известно, что данные структуры принимают участие в рефлекторной деятельности (рефлекс избегания) [113].

Нервно-мышечные синапсы аннелид (дождевой червь) имеют небольшие размеры (диаметр 1-2 мкм). [104; 63; 163]. Группа таких синапсов образуют кластеры «синаптических бутонов» [115]. Данные образования наблюдаются между аксоном гигантского волокна и двигательными нейронами вентрального нервного тяжа [27; 119].

В исследованиях последних лет в периферической нервной системе червей было выявлено множество различных синаптических образований, отличающихся структурным разнообразием и являющимися «нестандартными» по сравнению с

синапсами позвоночных [173].

Использование методики окрашивания эндоцитозным маркером FM1-43 позволило выявить в мышечной стенке дождевого червя синапсы мотонейронов, интенсивность окрашивания которых менялась в зависимости от мышечной активности [148]. Так, механическая стимуляция мышечной стенки тела дождевого червя способствует выявлению флуоресцентных пятен (FM1-43). При этом интенсивность флуоресценции зависит от концентрации К и Ca в растворе [107, 115]. В то же время, более углубленные исследования в этой области не проводились.

С помощью внеклеточных электродов (работа с внутриклеточными электродами затруднена из-за спонтанной двигательной активности) в клетках мышечной стенки дождевого червя регистрируются миниатюрные возбуждающие синаптические токи (МВСТ). При этом, в одной синаптической зоне регистрируются три типа МВСТ - одноэкспоненциальные с т - спада 1,2 мс, одноэкспоненциальные с т - 8,0 мс и двухэкспоненциальные с т - 1,2 и 8,0 мс, соответственно. Высказывается предположение, что мышечные клетки дождевого червя содержат как минимум две популяции ацетилхолинчувствительных ионных каналов, различающихся временем открытого состояния [8].

1.3. Механизмы секреции медиатора

Медиатор - химическое вещество, с помощью которого осуществляется передача возбуждения в синапсе.

В нервно-мышечном синапсе медиатором является ацетилхолин. Механизмы секреции медиатора заключаются в том, что при деполяризации пресинаптической мембраны под влиянием потенциал действия происходит открытие потенциалзависимых кальциевых каналов, куда поступают ионы Са2+, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са2+, активации белков экзоцитоза, и запускает механизм слияния мембраны везикулы

с пресинаптической мембраной, в связи с чем осуществляется выброс медиатора из везикулы в синаптическую щель [99; 32; 158; 46]. Затем ацетилхолин связывается с холинорецепторами на постсинаптической мембране, изменяя проницаемость последней для ионов и К+, и влечёт за собой генерацию ТКП.

1.3.1. Квантово-везикулярная гипотеза секреции медиатора

В основе современных представлений о передаче возбуждения в нервно-мышечном синапсе лежит квантово-везикулярная гипотеза секреции медиатора. Согласно данной гипотезе, секреция медиатора из нервных окончаний происходит определёнными порциями - квантами [56; 40].

Основанием для формирования этой гипотезы послужил факт открытия миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) [62].

Известно, что в состоянии физиологического покоя наблюдается асинхронная секреция ацетилхолина из нервных окончаний в виде небольших порций. Квант медиатора - порция медиатора, приводящая к генерации одного МПКП [99]. Затем в цитоплазме нервных окончаний были обнаружены синаптические везикулы, что привело к возникновению квантово-везикулярной теории секреции медиатора, а носителем кванта признали синаптическую везикулу [55; 99; 53].

Синхронное освобождение медиатора в синаптическую щель, при котором возникает потенциал концевой пластинки (ПКП), превосходящий МПКП в десятки раз, происходит в ответ на электрический стимул [55; 98].

Квантово-везикулярная гипотеза получила широкое признание во всём мире, подтверждена многочисленными экспериментальными физиологическими и морфологическими исследованиями [99; 90; 44; 89; 53; 120].

1.3.2. Экзо-эндоцитозный везикулярный цикл

Чтобы наступил экзоцитоз, синаптическим везикулам необходимо пройти через несколько этапов: транспорт (мобилизация) везикулы мобилизационного пула по направлению к активной зоне; локирование везикулы, когда происходит обратимое, но прочное соединение с мембраной активной зоны; прайминг везикулы, что приводит к комплексной трансформации белкового комплекса экзоцитоза, и становление синаптической везикулы полностью компетентной к данному процессу. После чего синаптической везикуле остаётся только ждать входа ионов Са2+.

На этой стадии синаптические везикулы «предохранены» специальными

факторами от немедленного слияния и в тоже время способны молниеносно

1

ответить на вход ионов Са , освобождением медиатора. Когда осуществляется открытие потенциал-зависимых Са2+-кананалов и увеличение концентрации ионов

гу I

Са в области везикулы, производится слияние мембраны везикулы с плазматической мембранной (экзоцитоз). Различают полный и неполный экзоцитоз.

Первый случай подразумевает под собой встраивание мембранного фрагмента синаптической везикулы в пресинаптическую мембрану, а второй -образование короткоживущей поры между полостью везикулы и синаптической щелью, откуда происходит выброс медиатора. Этот механизм получил шутливое название «поцеловал и убежал» (от англ. «ЫзБ-апё-гип») и часто рассматривается как сверх-быстрый путь образования везикул.

Считается, что при приближении и слиянии мембран создается нестабильный посредник. По поводу его устройства существует несколько моделей [95; 167; 96]. Первая модель «полуслившегося» состояния полагает объединение только цитоплазматических листков билипидных мембран. В соответствии со второй - сплав мембран закончен, но расширение поры слияния заблокировано. Так или иначе, нестабильный посредник способен преобразовываться в «сквозную» пору слияния или регрессировать обратно в

локированное состояние. [161; 167; 143]. После всего наступает слияние везикулы с пресинаптической мембраной, что инициирует образование новой везикулы (эндоцитоз).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Волков, Михаил Евгеньевич, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балезина О.П. Роль внутриклеточных кальциевых каналов нервных терминалей в различиях секреции медиатора / О. П. Балезина // Успехи физиол. наук. - 2002. - Т. 33, №3. - С. 38-56.

2. Блохина Г.И. Электрофизиологическое исследование и морфологическое исследование синаптической организации тонических мышечных волокон / Г. И Блохина, А. Л. Зефиров // Физиол. журн. СССР. - 1984. -Т. 70,№2.-С. 157-165.

3. Волков Е.М. Влияние натриевого насоса и ко-транспорта Ыа+, К+ и С1" на мембранный потенциал покоя соматических мышечных клеток дождевого червя ЬитЬпсш terrestris. / Е.М. Волков, Л.Ф. Нуруллин, Е.Е. Никольский // Росс. Физиол. Журн. им. И.М Сеченова - 2001. - Т. 87, № 9. - С. 1153-1160.

4. Волков Е.М. Влияние некоторых медиаторов на мембранный потенциал покоя соматических клеток мышечной стенки дождевого червя/ Е.М. Волков, Л.Ф. Нуруллин, С.Н. Гришин, А. Л. Зефиров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2003. - Т. 136, № 8. - С. 217-220.

5. Волков Е.М. Влияние норадреналина и адреналина на мембранный потенциал покоя соматических мышечных клеток дождевого червя. / Е.М. Волков, Л.Ф. Нуруллин, Г.И. Блохина, Е.Е. Никольский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2002. - Т. 132, № 9. - С. 244-246.

6. Волков Е.М. Влияние холиномиметиков и холинолитиков на миниатюрные возбуждающие постсинаптические ионные токи соматических мышечных клеток стенки дождевого червя ЬитЬпсш /еггау/га. / Е.М. Волков, Л.Ф. Нуруллин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005. -Т. 139, №3.-С. 392-396.

7. Волков Е.М. Влияние холиномиметиков на мембранный потенциал покоя мышечных клеток кожно-мускульного мешка дождевого червя. / Е.М. Волков, Л.Ф. Нуруллин, В.Н. Фросин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2001. - Т. 134, № 4. - С. 469-471.

8. Волков Е.М. Две популяции миниатюрных возбуждающих синаптических ионных токов в соматических мышечных клетках дождевого червя. / Е.М. Волков Л.Ф. Нуруллин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины-2003.-Т. 136,№11. -С. 567-570.

9. Волков Е.М. Кальциевый механизм активации ионного насоса норадреналином в соматических клетках мышечной стенки дождевого червя Lumbricus terrestris// Е.М. Волков, Л.Ф. Нуруллин, A.C. Обухова, A.B. Чикин, Е.Е. Никольский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2002. - Т. 134,№7.-С. 24-26.

10. Волков Е.М. Механизмы гиперполяризующего влияния ГАМК на потенциал покоя соматических мышечных клеток стенки дождевого червя Lumbricus terrestris. // Е.М. Волков, А.Р. Сабирова, С.Н. Гришин, А.Л. Зефиров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005. - Т. 139, № 2. - С. 219-223.

11. Волков Е.М. Принимает ли участие неквантовая секреция ацетилхолина из двигательных нервных окончаний в нейротрофическом контроле мембранного потенциала покоя мышечных волокон крысы / Е.М. Волков, В.Н. Фросин, Г.И. Полетаев //Нейрофизиология - 1985. - Т. 17, №3, - С. 289-296.

12. Волков Е.М. Факторы нейротрофического контроля холинорецепции скелетных мышц. / Е. М. Волков // Успехи физиол. наук. - 1989. - Т. 20, № 2. - С. 26-45.

13. Волков Е.М. Холинергическая и гамкергическая иннервации контролируют работу электрогенного ионного насоса в соматических мышечных клетках дождевого червя / Е.М. Волков, А.Р. Сабирова, М.Е. Волков, А.Л. Зефиров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007. - Т. 144, №8.-С. 128-130.

14. Волков Е.М., Поступление циклических нуклеотидов в мышцу лягушки // Е.М. Волков,И.В. Кудрявцева, Г.А. Наследов, H.H. Никольский // Украинский биохим. журн. - 1988. - Т. 60, №5. - С. 40-45.

15. Волков М.Е. Изучение везикулярного цикла в нервных образованиях

соматической мускулатуры дождевого червя (Lumbricus terrestris). / М.Е. Волков, A.M. Петров, Е.М. Волков, A.JI. Зефиров // Цитология. - 2011. - Т. 53, № 10. - С. 37-43.

16. Волков М.Е. Прижизненная окраска нервных образований флуоресцентными красителями и оптическое определение ацетилхолина в соматической мышце дождевого червя Lumbricus terrestris. / М.Е. Волков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2012. - Т. 153, № 7.

17. Давид О.Ф. Морфофизиологические основы локомоции аннелид. / О.Ф. Давид // Ленинград: Наука, 1990. - 167 с.

18. Добрецов М. Г. Формирование нервных окончаний в фазных мышцах лягушки / М.Г. Добрецов, А.Л. Зефиров, Р. С. Куртасанов, H.A. Халилов, И.М. Виноградова// Нейрофизиология. - 1983. - Т. 15, №1. - С. 89-107.

19. Зефиров А.Л. Ионные каналы возбудимой клетки (структура, функция, патология). / А.Л. Зефиров, Г.Ф. Ситдикова // Казань: Издательство «Арт-кафе», 2010. - 270 с.

20. Зефиров А.Л. Везикулярный цикл в пресинаптическом нервном окончании / А.Л. Зефиров // Росс. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова - 2007. - Т. 93, №5.-С. 544-562.

21. Зефиров А.Л. Внутриклеточный кальций и механизмы эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки. / А.Л. Зефиров, М.М. Абдрахманов, П.Н. Григорьев, A.M. Петров // Цитология. - 2006. -Т. 48, №1.-С. 34-41.

22. Зефиров А.Л. Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе / А. Л. Зефиров, С. Ю. Черанов // Успехи физиол. наук. -2000. - Т. 31, №3.-С. 3-22.

23. Зефиров А.Л. Прижизненное флуоресцентное исследование двигательного нервного окончания лягушки с использованием эндоцитозного маркера FM1-43 / А.Л. Зефиров, П.Н. Григорьев, A.M. Петров и др. // Цитология. - 2003. - Т. 45, № 12. - С. 1163-1167.

24. Зефиров А.Л. Синаптическая везикула и механизмы освобождения

медиатора. / A.JI. Зефиров, A.M. Петров // Казань: Издательство «Арт-кафе», 2010.-324 с.

25. Зефиров A.JI. Эндоцитоз в нервной системе / A.JI. Зефиров A.M. Петров // Природа. - 2009. - № 9. -С. 12-20.

26. Acuado F. Syntaxin I A and I В display distinct distribution patterns in the rat peripheral nervous system. / F. Acuado, G. Majo, D. Ruiz-Montasell et al. // Neuroscience. - 1999. - V. 88, № 2. - P. 437-445.

27. Al-Yousuf S. An electron microscopic study of neurosecretion in the cerebral ganglion of the earthworm / S. Al-Yousuf, A. Konishi, S. Nomura, N. Mizuno //Neurosci. Lett. - 1992. - V.140. - P. 189-191.

28. Andersson F. Perturbation of syndapin/PACSIN impairs synaptic vesicle recycling evoked by intense stimulation /F. Andersson, J. Jakobsson, P. Luw, O. Shupliakov, L. Brodin // J Neurosci. - 2010 - V. 28. - P.3925-33.

29. Artalejo C.R. Sustained stimulation shifts the mechanism of endocytosis from dynamin-1-dependent rapid endocytosis to clathrin- and dynamin -2-mediated slow endocytosis in chromaffin cells / C.R. Artalejo, A. Elhamdani, H.C. Palfrey // PNAS. - 2002. - V. 99, № 9. - P.6358-6363.

30. Atwood H.L. Diversification of synaptic strength: presynaptic elements / H.L. Atwood, S. Karunanithi // Nat. Rev. Neurosci. - 2002. - V. 3. - P. 497-516.

31. Augustin I. / Muncl3-1 is essential for fusion competence of glutamatergic synaptic vesicles. / I. Augustin, C. Rosenmund, T.C. Sudhof, N. Brose // Nature. -1999.-V. 400.-P. 457-461.

32. Augustine G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release? / G. J. Augustine // Curr. Opin. Neurobiol. - 2001. - V. 11. - P. 320-326.

33. Auld D.S. Perisynaptic Schwan Cells at the Neuromuscular Junction: Nerve-and Activity-Dependent Contributions to Synaptic Efficacy, Plasticity, and Reinnervation / D.S. Auld, R. Robitaille // The Neuroscientist. - 2003. - V. 9. - P. 144157.

34. Bacci A. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin / A.

Bacci, S.Coco, E.Pravettoni et al. // J. Neurosci. - 2001. - V. 21. - P.6588-6596.

35. Benmerah A. The ear of alpha-adaptin interacts with the COOH-terminal domain of the Eps 15 protein / A. Benmerah, B. Begue, A. Dautry-Varsat // J.Biol. Chem.- 1996.-V. 271.-P. Ill -116.

36. Bethoney K.A., A possible effector role for the pleckstrin homology (PH) domain of dynamin / K.A. Bethoney,M. C. King, J. E. Hinshaw,E. M. Ostap, M. A.Lemmon // PNAS. - 2009. - V. 106. - P. 13359-13364.

37. Betz W.J. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. / W.J. Betz, G. Bewick // London: J. Physiology.-1993.- V. 460. - P. 287-309.

38. Birks R. The fine structure of neuromuscular junction / R. Birks, H. E. Huxley, B. Katz // J. Physiol. Lond. - 1960. -V. 150. - P. 134-144.

39. Bonanomi A. Phosphoiylation of synapsin by cAMP-depend protein kinase controls synaptic vesicle dynamics in developing neurons / A. Bonanomi, A. Megegon, N. Miccio et al // The J. of Neurosci. - 2005. - V. 25, № 32. - P.7299-7308.

40. Boyd J. A. Spontaneous subthreshold activity at mammalian neuromuscular junction / J. A. Boyd, A. R. Martin // J. Physiol. - 1956. - V. 132. - P. 61-73.

41. Brodsky F.M. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles / F.M. Brodsky, C.Y. Chen, C. Knuehl et al. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 2001. - V. 17. - P.517-568.

42. Calacos N. Vesicle-associated membrane protein and synaptophysin are associated on the synaptic vesicle / N. Calacos, R. H. Scheller// J. Biol. Chem. - 1994. -V. 269. - P. 24534-24537.

43. Ceccarelli B. Freeze-fracture studies of frog neuromuscular junction during intense release of neurotransmitter / B. Ceccarelli, F. Grohovaz, W.P. Hurlbut // J. Cell Biol. - 1979. - V. 81. - P. 163-192.

44. Ceccarelli B. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. / B. Ceccarelli, W. P. Hurlbut, A. J. Mauro // Cell. Biol. -1973.-V. 57.-P. 499-524.

45. Chapman E.R. Synaptotagmin: a Ca(2+) sensor that triggers exocytosis? / E.R. Chapman // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2002. - V.3. - P.498-508.

46. Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release? / E. R. Chapman // Annu. Rev. Biochem. - 2008. - V. 77 - P. 615—641.

47. Chicka M.C. Concurrent binding of complexin and synaptotagmin to liposome-embedded SNARE complexes / M.C. Chicka, E.R. Chapman // Biochemistry.

- 2009. - V.48. - P. 657-659.

48. Cooper R.L. Synaptotagmin-like expression in the motor nerve terminals of crayfish. / R.L. Cooper, D.R. Hampson, H.L. Atwood // Brain research. - 1995. - V. 703.-P. 214-216.

49. Cousin M. A. Mechanisms of synaptic vesicle recycling illuminated by fluorescent dyes / M. A. Cousin, P. J. Robinson // J. Neurochem. - 1999. - V. 73. - P. 2227-2239.

50. Cremona O. Phosphoinositides in membrane traffic at the synapse / O. Cremona, PJ DeCamilli // J. Cell Sci. - 2001. - V.l 14, № 6. - P.1041-1052.

51. Damke H. Induction of mutant dynamin specifically blocks endocytotic coated vesicle formation / H. Damke, T. Baba, D. E. Warnock, S. L. Schmid // J. Cell Biol. - 1994. - V. 127. - P. 915-934.

52. DeBello W. M. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release / W. M. DeBello. V. O'Connor, T. Dresbach // Nature. - 1995. -V.373.-P. 626-630.

53. DeCamilli P. The structure of synapses / P. DeCamilli, V. Haucke, K. Takei, E. Mugnaini // Baltimore: Synapses, 2001. - P. 89-133.

54. DeCamilli, P. The synapsins. / P. DeCamilli, F. Benfenati, F. Valtorta, P. Greengard // Annu. Rev. Cell Biol. - 1990. - V. 6. - P. 443-460.

55. Del Castillo J. Effects of vagal and sympathetic nerve impulse on the membrane potential of the frog's heart / J. Del Castillo, B. Katz // J. Physiol. (Gr. Brit.).

- 1955 - V. 129.-P. 48-49.

56. Del Castillo J. Quantal components of the end-plate potential / J. Del Castillo, B. Katz // J. Physiol. (Gr. Brit.). - 1954. - V. 124. - P. 560-573.

57. Dodge F.A. Co-operative action a calcium ions in transmitter release at the neuromuscular junction / F.A. Dodge, R. Rahamimoff // J. Physiol. - 1967. - V. 193. - P. 419-432.

58. Dulubova I. A conformational switch in syntaxin during exocytosis / I. Dulubova, S., Sugita, S.Hill et al. // EMBO J. - 1999. - V.18. - P.4372-4382.

59. Eccles, J. C. The physiology of synapses / J. C. Eccles // Springer-Verlag Berlin Gottingen. - 1963. - P. 396.

60. Evans R.M. Presynaptic Ca-channels - integration centers for neuronal signaling pathway. / R.M. Evans, G.W. Zamponi // Trends Neuroscience. - 2006. - V. 29.-P. 617-624.

61. Farnesi R.M. The fine structure of the myoneural junctions in the body wall muscles in Branchiobdeella pentodanta Whit. (Annelida, Oligochetta). / R.M. Farnesi, D. Vagnetti // Anatomy Rec. - 1975. - V.182, № 1. - P. 91-101.

62. Fatt P. Some observations on biological noise / P. Fatt, B. Katz // Nature. -1950.-V. 166.-P. 597-598.

63. Fernandez-de-Miguel F. Synapse formation and function: insights from identified leech neurons in culture / F. Fernandez-de-Miguel, P. Drapeau // J. Neurobiol. - 1995. - V.27. - P. 367-379.

64. Fischer von Mollard G. Rab proteins in regulated exocytosis / G. Fischer von Mollard, B. Stahl, C. Li et al. // Trends Biochem Sci. - 1994. - V.19. - P. 164-168.

65. Ford M.G. Curvature of clathrincoated pits driven by epsin / M. G. Ford, I.G. Mills, J.B. Peter et al. // Nature. - 2002. - V. 419. - P. 361-366.

66. Fotin A., Molecular model for complete clathrin lattice from electron cryomicroscopy / A. Fotin, Y.F. Cheng, P. Sliz et al. // Nature. - 2004. - V.432. -P.537-579.

67. Fujita Y. Tomosyn: a syntaxin-1-binding protein that forms a novel complex in neurotransmitter release process / Y. Fujita, H. Shirataki, T. Sakisata.et al. // Neuron. - 1998. - V 20. - P.905-915.

i

68. Gad H. Dissociation between Ca triggered synaptic vesicle exocytosis and clathrin- mediated endocytosis at a central synapse / H. Gad, P. Low, E. Zotova et

al. //Neuron. - 1998. - V. 21. - P. 607-616.

69. Gad H. Fission and uncoating of synaptic clathrin-coated vesicles are pertrurbed by disruption of interactions with the SH3 domain of endophilin / H. Gad, N. Ringstad, P. Low et al. // Neuron. - 2000. - V. 27. - P. 301-312.

70. Gaidarov I. Phosphoinositide-AP-2 interactions required for targeting to plasma membrane clathrin-coated pits /1. Gaidarov, J. H. Keen // J. Cell Biol. - 1999. -V. 146.-P. 755-764.

71. Gallop J.L. Endophilin and CtBP/BARS are not acyl transferases inendocytosis or Goldgi fission / J.L. Gallop, P.J. Blutler, T. McMahon //Nature. -2005.-V. 438.-P. 675-678.

72. Gandhi S. P. Three modes of synaptic vesicular recycling revealed by single-vesicle imaging / S. P. Gandhi, C.F. Stevens // Nature. - 2003. - V. 423. - P. 607-613.

73. Geppert M. / Synaptotagmin I: a major Ca sensor for transmitter release at a central synapse / M. Geppert, Y. Goda, E.R. Hammer et al. // Cell. - 1994. - V. 79. -P. 717-727.

74. Geppert M. The small GTP-binding protein Rab3A regulates a late step in synaptic vesicle fusion / M. Geppert, Y. Goda, C.F. Stevens, T. C. Sudhof // Nature. -1997.-V. 387.-P. 810-814.

75. Goodman O.B. The alpha chain of the AP-2 adaptor is a clathrin binding subunit / O. B. Goodman, J. H. Keen // J. Biol. Chem. - 1995. - V. 270. - P. 768-773.

76. Gray N.W. A dynamin-3 spliced variant modulates the acrin/cortactin-dependent morphogenesis of dendritic spines / N.W. Gray, A.E. Kruchten, J. Cheng, M.A. McNiven // J. Cell Sci. - 2005. - V. 118. - P. 1279-1290.

77. Guo S. SAC 1-like domains of yeast SAC1, INP52, and INP53 and of human synaptojanin encode polyphosphoinositide phosphatases / S. Guo, L.E. Stolz, S.M. Lemrow, J.D. York // J. Biol. Chem. - 1999. - V. 274. - P. 990-995.

78. Haar E.T. Peptide-in-groove interactions link target proteins to the betapropeller of clathrin / E.T. Haar, S.C. Harrison, T. Kirchhausen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. -V. 97. - P. 1096-1100.

79. Haffner C. Direct interaction of the 170 kDa isoform of synaptojanin 1 with clathrin and with the clathrin adaptor AP-2 /C. Haffner, G. Di Paolo, J.A. Rosenthal, P. DeCamilli // Curr Biol - 2000. - V. 10. - P. 471-474.

80. Han X. Transmembrane segments of syntaxin line the fusion pore of Ca2+-triggered exocytosis / X. Han, C. T. Wang, J. Bai et al. // Science. - 2004. - V. 304. - P. 289-292.

81. Hao W. API80 and AP-2 interact directly in a complex that cooperatively assembles clathrin / W.Hao, Z. Luo, L. Zheng et al. // J.Biol. Chem. - 1999. - V. 274. -P. 785-794.

82. Harlow L.H. The architecture of active zone material at the frog's neuromuscular junction / L.H. Harlow, D. Ress, A. Stoschek // Nature. - 2001. - V. 409. - P. 479-484.

83. Haucke V. AP-2 recruitment to synaptotagmin stimulated by tyrosine-based endocytic motifs / V. Haucke, P. DeCamilli // Science. - 1999. - V. 285. - P. 1268-1271.

84. Haydon P.G. GLIA: listening and talking to the synapses / P.G. Haydon // Nat. Rev. Neurosci. - 2001. - V. 2. - P. 185-193.

85. Heidelberger R. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal / R. Heidelberger, C. Heinemann, E. Neher, G. Matthews // Nature. - 1994. -V. 371.-P. 513-515.

86. Heilker R. Recognition of sorting signals by clathrin adaptors / R. Heilker, M. Spiess, P. Crottet// Bio Essays. - 1999. - V. 21. - P. 558-567.

87. Herskovits J.S. Effects of mutant rat denamin on endocytosis. / J.S. Herskovits, C.C. Burgess et al. // J. Cell Biol. - 1993. - V. 122.- P. 565-578.

88. Heuser J. E. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction / J. E. Heuser, T. S. Reese // J. Cell Biology. - 1973. - V. 57. - P. 315-344.

89. Heuser J. E. Review of electron microscopic evidence favouring vesicle exocytosis as the structural basis of quantal release during synaptic transmission / J. E. Heuser // J. Exp. Physiol. - 1989. - V. 74. - P. 1051-1069.

90. Heuser J. Effect of lanthanum ions on function and structure of frog neuromuscular junctions / J. Heuser, R. Miledi // Proc. R. Soc. - 1971. - V. 179. — P. 247-260.

91. Hilfiker S. Synapsins as regulators of neurotransmitter release /S .Hilfiker, V.A. Pieribone, A. J Czemik et al. // Philos Trans R Soc Lond BBiol Sei. - 1999. -V.354.-P. 269-279.

92. Hill E. The role of dynamin and its binding partners in coated pit invagination and scission / E.Hill, J. van Der Kaay, C.P. Downes, E. Smythe// J. Cell Biol.-2001.-V. 152.-P. 309-323.

93. Hirst J. Clathrin and adaptors / J. Hirst, M. S. Robinson // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - V. 1404. - P. 173-193.

94. Itoh T. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins /T. Itoh, K.S. Erdmann, A. Roux, et al. // Dev Cell. — 2005. - V.9. - P.791- 804.

95. Jahn R. Membrane fusion / R. Jahn, T. Lang, T.C. Sudhof// Cell. - 2003. -V. 112.-P.519-533.

96. Jahn R. SNAREs - engines for membrane fusion / R. Jahn, R. H. Scheller // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2006. - V. 7. - P. 631-643.

97. Jakobsson J. Role of epsin 1 in synaptic vesicle endocytosis /J.Jakobsson H. Gad, F. Andersson et al. // Proc Natl Acad Sei. - 2008. - V.105. - P.6445-6450.

98. Katz B. The effect of temperature on the synaptic delay at neuromuscular junction / B. Katz, R. Miledi // J Physiol. - 1965. - V. 181. - P. 656-670.

99. Katz B. The Release of Neurotransmitter Substances / B. Katz // Springfield, 1969.

100. Kelly L.E. Molecular and genetic characterization of the interactions between the Drosophila stoned-B protein and DAP-160 (intersectin) / L.E.Kelly, A.M.Phillips // Biochem J. - 2005. - V.388. - P. 195-204.

101. Kirchhausen T. Three ways to make a vesicle / T. Kirchhausen // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2000. - V.l. - P.650-652.

102. Koh T.W. Epsl5 and Dapl 60 control synaptic vesicle membrane retrieval

and synapse development / T.W. Koh, V.l. Korolchuk, Y.P. Wairkar et al. // J Cell Biol.

- 2007. - V.178. - P. 309-322.

103. Krause M. The distribution of acetylcholine receptors in the normal and denervated neuromuscular junction of the frog / M. Krause, A. Wernig // J. Neurocytology. - 1985. - V.14. - P. 765-780.

104. Landis B. Differences in membrane structure between excitatory and inhibitory synapses in the cerebellar cortex. / B. Landis, T.S. Reese // J. Comp. Neurol.

- 1974-V.155.-P. 93-126.

105. Lando. L. Ca cooperativity in neurosecretion measured using photolabile Ca2+ chelators / L. Lando, R.S. Zucker // J Neurophysiol. - 1994. - V. 72. - P. 825-830.

106. Letinsky M. S. Histological staining of preand postsynaptic components of amphibian neuromuscular junction / M. S. Letinsky, P. DeCino // J. Neurocytol. - 1980. -V.9.-P. 305-320.

107. Llina R. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. / R. Llina, T.L. McGuinness, C.S. Leonard et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA - 1985. -V. 82.-P. 3035-3039.

108. Maximov A. Synaptotagmin-12, a synatic vesicle phosphoprotein that modulates spontaneous neurotransmitter release /A. Maximov, O. H.Shin, X.Liu, T.C. Sudhof// J. Cell Biol. - 2007. - V.176. - P. 113-124.

109. McPherson P.S. A presynaptic inisitol-5-phosphatase / P.S. McPherson, E.P. Garcia, V.l. Slepvev et al. // Nature. — 1996. - V.379. — P. 353-357.

110. McPherson P.S. Peptide motifs: building the clathrin machinery /P.S.McPherson, B.Ritter // Mol. Neurobiol. - 2005. -V.32. - P.73-87.

111. Meir A. Ion channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release / A. Meir, S. Ginsburg, A. Butkevich, S.G. Kachalsky, I. Kaiserman, et al. // Physiol. Rev. - 1999. - V. 79. - P. 1019-1088.

112. Mennerick S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAa receptor function. / S. Mennerick, M. Chisari, H. Shu, A. Taylor, M. Vasek, L. Eisenman, Ch. Zorumski // J. Neuroscience . - 2010. - V. 30, №8. - P. 2871-2879.

113. Mill P.J. Recent developments in earthworm neurobiology. / P.J. Mill // Comp. Biochem. Physiol. - 1982 - V.73A. - P. 641-661.

114. Misura K.M.S. Three-dimensional structure of the neuronal secl-syntaxin 1A complex / K.M.S. Misura, R.H. Scheller, W.I. Weis // Nature. - 2000. - V.404. -P.355-362.

115. Mizutani K. Identification of two types of synaptic activity in the earthworm nervous system during locomotion. / K. Mizutani, T. Shimoi, Y. Kitamura, H. Ogawa, K. Oka//Neuroscience. - 2003. -V. 121, № 12. P. 473-478.

116. Morgan A. A role for soluble NSF attachement proteins (SNAPs) in regulated exocytosis in adrenal chromaffin cells / A. Morgan, R. D. Burgoyne // EMBO J. - 1995. - V. 14. - P. 232-239.

117. Mousavi S.A. Clathrin-dependent endocytosis /S.A. Mousavi, L.Malerod, T.Berg, R. Kjeken // Biochem. J. - 2004. - V.377. - P. 1-16.

118. Muhlberg A. B. Domain structure and intramolecular regulation of dynamin GTPase / A. B. Muhlberg, D. E. Warnock, S. L. Schmid // EMBO J. - 1997. -V. 16.-P. 6676-6683.

119. Mulloney B. Structure of the giant fibers of earthworms / B. Mulloney // Science - 1970. - V. 168. - P. 994-996.

120. Murthy N. V. Cell biology of the presynaptic terminal / N. V. Murthy, P. DeCamilli // Annu. Rev. Neurosci. - 2003. - V. 26. - P. 701-728.

121. Musacchio A. Functional organization of clathrin in coats: combining electron cryomicroscopy and X-ray crystallography / A. Musacchio, C.J. Smith, A.M. Roseman et al. // Mol. Cell — 1999. — V. 3. — P. 761-770.

122. Nagwaney S. Macromolecular connections of active zone material to docked synaptic vesicles and presynaptic membrane at neuromuscular junctions of mouse. / S. Nagwaney, M.L. Harlow, J.M. Jung et al. // J. Comparative neurology. -2009.-V. 513.-P. 457-468.

123. Nguen S. Simultaneous labeling of projecting neurons and apoptotic state / S. Nguen, Ch. Lieven, L. Levin // J. Neuroscience Methods. - 2007. - V. 161, № 2. - P. 281-284.

124. Nonet M.L. UNC-11, a Caenorhabditis elegans AP180 homologue, regulates the size and protein composition of synaptic vesicles / M.L. Nonet, A.M. Holgado, F. Brewer et al. // Mol. Biol. Cell. - 1999. - V. 10. - P. 2343-2360.

125. Nossal, R. Assembly of clathrin basket / R. Nossal // Macromolecular Symp. - 2005. -V. 219. - P. 1-8.

126. Nurullin L.F. Voltage-dependent P/Q-type calcium channels at the frog neuromuscular junction / L.F. Nurullin, A.R. Mukhitov, A.N. Tsentsevitsky et al. // Physiological research. - 2011. - V. 60, № 5. - P. 815-823.

127. Peper K. Distribution of acetylcholine receptor in the vicinity of nerve terminals on skeletal muscle of the frog / K. Peper, U. J. McMahon // Proc. Roy. Soc. Lond. - 1972. - V. 18 IB. - P. 431-440.

128. Perez-Reyes E. Molecular characterization of two members of the T-type calcium channel family / E. Perez-Reyes, J.H. Lee, L.L. Cribbs // Ann. NY Acad. Sci. -1999.-V. 868.-P. 131-143.

129. Petrov A.M. The role of cGMP-dependent signaling pathway in synaptic vesicle cycle at the frog motor nerve terminals / A.M. Petrov, A.R. Giniatullin, G.F. Sitdikova, A.L. Zefirov // J. Neuroscience. - 2008. - V. 28, № 49. - P. 13216-13222.

130. Richards D. A. Two endocytic recycling routes selectively fill two vesicle pools in frog motor nerve terminal / D. A. Richards, C. Guatimosim, W. J. Betz // Neuron. - 2000. - V. 27. - P. 551-559.

131. Ringstad N. Endophilin/SH3P4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis / N. Ringstad, H. Gad, P. Low et al. // Neuron. — 1999. - V. 24. — P. 143-154.

132. Rivosecchi R. Implication of frequenin in the facilitation of transmitter release in Drosophila / R. Rivosecchi, O. Pongs, T. Theil, A. Mallart // J. Physiol. -1994.-V. 474. - P.223-232.

133. Rizo J. Synaptic vesicle fusion / J.Rizo, C.Rosenmund // Nat Struct Mol Biol. - 2008. - V. 15. - P. 665-674.

134. Robertson, J. D. The ultrastructure of reptilian myoneural junction / J. D. Robertson // Ann. Rev. Biochem. - 1983. - V. 52. - P. 871-926.

135. Rosenbluth J. Myoneural junctions of two ultrastractural distinct types in the earthworm body wall muscle / J. Rosenbluth // J. Cell Biology. - 1972. - V. 54, № 3.-P. 566-579.

136. Ross-Canada G. Synaptic vesicles and nerve muscle preparation is resinless section / G. Ross-Canada, R.P. Becker, G. Pappas // J. Neurocyt. - 1983. - V. 12. - P. 817-830.

137. Rothman J. E. Mechanisms of intracellular protein transport / J. E. Rothmann // Nature. 1994. - V. 372. - P. 55-63.

138. Rothman J. E. The machinery and principles of vesicle transport in the cell // J.E. Rothman // Nat. Med. - 2002. - V.8. - P. 1059-1062.

139. Royle S. J. Endocytosis at the synaptic terminal / S. J. Royle, L. Lagnado // J. Physiol. - 2003. - V. 533. - P. 345-355.

140. Royle S. J.The cellular functions of clathrin / S. J. Royle// Cell Mol Life Sci.-2006-V. 63.-P. 1823-1832.

141. S. Sugita. Synaptotagmins form a hierarchy of exocytotic Ca sensors with distinct Ca2+ affinities / S. Sugita, O.H. Shin, W. Han et al. // EMBO J. - 2002. - V. 21.

- P. 270-280.

142. Salcini A.E. The Epsl5 C. elegans homologue EHS-1 is implicated in synaptic vesicle recycling / A.E Salcini, M.A. Hilliard, A. Croce et al. // Nat Cell Biol. -2001. V.3-P. 755-760.

143. Schaub J.R. Hemifusion arrest by complexin is relieved by Ca2+-synaptitagmin 1 / J.R Schaub, X. Lu, B. Shin et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2006. -V. 13.-P. 748-750.

144. Schmid S.L. A role for clathrin light chains in the recognition of clathrin cages by "uncoating ATPase" / S.L. Schmid, W.A. Braell, D.M. Schlossman, J.E. Rothman // Nature. - 1984. - V. 311. - P. 228-231.

145. Schmidt A. Endophilin I mediates synaptic vesicle formation by transfer of arachidonate to lysophosphatidic acid / A. Schmidt, M. Wolde, C. Thiele et al. // Nature.

- 1999. - V. 401.-P. 133-141.

146. Seagar M. Interaction between presynaptic calcium channels and proteins

implicated in synaptic trafficking and exocytosis / M. Seagar, M. Takahashi // J. Bioenergetic and biomembranes. - 1998. - V. 30, № 4. - P. 347-356.

147. Sengar A.S. The EH and SH3 domain Ese proteins regulate eridocytosis by linking to dynamin and Epsl5 / A.S. Sengar, W. Wang, J. Bishay et al. // EMBO J. -1999. - V. 18. - P. 1159-1171.

148. Shimizu R. Optical monitoring of the neuronal activity evoked by mechanical stimulation in the earthworm nervous system with fluorescent dye, FM1-43 / R. Shimizi, K. Oka, H. Ogawaet al. // Neuroscience Letters. - 1999. - V. 268, № 3. -P. 159-162.

149. Slater C.R. Structural factors influencing the efficacy of neuromuscular transmission / C.R. Slater // Annual N.Y. Academy science. - 2008. - V. 1132. - P. 112.

150. Slepnev V.I. Accessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle endocytosis / V.I. Slepnev, P. DeCamilli // Nat. Rev. Neurosci. - 2000. - V. - 1. - P. 161-172.

151. Slepnev V.I. Role of phosphorylation in regulation of the assembly of endocytic coat complexes / V.I. Slepnev, G.C. Ochoa, M.H. Butler et al. // Science. -1998.-V.281.-P. 821-824.

152. Slepnev V.I. Tandem arrangementof the clathrin and AP-2 binding domains in amphiphysin 1, and disruption of clathrin coat function mediated by amphiphysin fragments comprising these sites / V.I. Slepnev, G.C. Ochoa, M.H. Butler, P. DeCamilli // J. Biol. Chem. - 2000. - V.275. - P.583-589.

153. Sollner T.A. Protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic vesicle docking, activation, and fusion / T.A. Sollner, M.K. Bennet, S.W. Whiterheart // Cell. - 1993. - V. 75. - P. 409-418.

154. Sorensen J.B. Examining Synaptotagmin 1 function in dense core vesicle

* 2+

exocytosis under direct control of Ca . / J.B. Sorensen, F.R. Chacon, T.C. Sudhof, E. Neher // J. General Physiology. - 2003. - V.122. - P. 165-276.

155. Stanley E. F. The calcium channel and the organization of the presynaptic transmitter release face / E.F. Stanley // Trends Neurosci. - 1997. - V. 20. - P. 404-409.

156. Steel G. J. Evidence for interaction of the fusion protein alpha-SNAP with membrane lipid / G.J., Steel, G. Bucheim, J.M. Edwardson, P.G. Woodman // Biochem. J. - 1997.-V. 325.-P. 511-518.

157. Stevens C. F. "Kiss and run" exocytosis at hippocampal synapses / C. F. Stevens, J.H. Williams // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 2000. - V. 97, №12. - P.828-833.

158. Stevens C. F. Neurotransmitter Release at Central Synapses / C. F. Stevens // Neuron. - 2003. - V. 40. - P. 381-388.

159. Stolte H.A. Oligochaeta. Bronn's Klassen und Ordnungen des Tierreiches / H.A. Stolte // Leipzig: Greest and Portig, 1955. -890 p.

160. Sudhof T. C. The synaptic vesicle cycle / T. C. Sudhof // Annu. Rev. Neurosci. - 2004. - V. 27. - P. 509-547.

161. Sudhof T.C. Neurotransmitter release. / T.C. Sudhof // Handb. Exp. Pharmacol. -2008.-V. 184.-P. 1-21.

162. Sudhof T.C. Synaptotagmins: why so many? / T. C. Sudhof // J. Biological chemistry. - 2002. - V. 277, № 10. - P. 7629-7629.

163. Sun Z.Y. Binding of serotonin to receptors at multiple sites is required for structural plasticity accompanying long-term facilitation of Aplysia sensorimotor synapses / Z.Y. Sun, S. Schacher // J. Neurosci. - 1998. - V. 18. - P. 3991-4000.

164. Takei K. Functional partner ship between amphiphysin and dynamin in clathrin-mediated endocytosis / K. Takei, V.l. Slepnev, V. Haucke, P. DeCamilli //Nature Cell Biol. - 1999. - V.l. - P.33-39.

165. Takei K. Generation of coated intermediates of clathrin-mediated endocytosis on protein-free liposomes / K. Takei, V.Haucke, V.l. Slepnev et al. // Cell. -1998.-V. 94. — P. 131-141.

166. Traub L.M. Crystal structure of the alpha appendage of AP-2 reveals a recruitment platform for clathrin-coat assembly / L.M. Traub, M.A. Downs, J.L. Westrich, D.H. Fremont// Proc. Nati. Acad. Sei. USA. - 1999. - V. 96. - P. 8907-8912.

167. Ungermann C. Function of SNAREs in intracellular membrane fusion and lipid bilayer mixing / C. Ungermann, D. Langosch // J. Cell Sei. - 2005. - V. 118. -

P.3819-3838.

168. Van der Kloot W. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction / W. Van der Kloot, J. Molgy // Physiol. Rev. - 1994. - V. 74. — P.899-991.

169. Volkov E.M. Mechanism of carbacholine and GAB A action on resting membrane potential and Na/K-ATPase of Lumbricus terrestris body wall muscle. / E.M. Volkov, L.F. Nurullin, M.E. Volkov, E.E. Nikolsky, F. Vyskocil // J. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. - 2011. - V. 158. - P. 520-524.

170. Volkov E.M. Miniature excitatory synaptic currents in the earthworm Lumbricus terrestris body wall muscles / E.M. Volkov, L.F. Nurullin, E.E. Nikolsky, F. Vyskocil // Physiological research. - 2007. - V. 56. - P. 655-658.

171. Volkov E.M., A calcium aspect of the effect of noradrenaline on the resting membrane potential in the somatic muscle cells of the earthworm. / E.M. Volkov, L.F. Nurullin // Neurophysiology. - 2002. - V. 34, 2/3. - P. 264-266.

172. Von Gersdoff H. Dynamics of synaptic vesicle fusion and membrane retrieval in synaptic terminals / H. Von Gersdoff, G. Matthews // Nature. - 1994. V. 367.-P. 735-739.

173. Westfall J.A. Ultrastructure of invertebrate synapses. In M.A. Ali (ed.): Nervous systems in invertebrates / J.A Westfall. // New York: Plenum Press, 1987 - P. 3-15.

174. Xu J. Synaptotagmin-1 functions as a Ca sensor for spontaneous release / J. Xu, Z.P. Pang, O.H. Shin, T.C. Sudhof// Nat Neurosci - 2009 - V.12. - P.759-766.

175. Yamabhai M. Intersectin, a novel adaptor protein with two Epsl5 homology and five Src homology 3 domains / M. Yamabhai, N.G. Hoffman, N.L. Hardison et al. // J. Biol. Chem. - 1998. - V. 273. - P. 401-407.

176. Yao J. Uncoupling the roles of synaptotagmin 1 during endo-exocytosis of synaptic vesicles / J. Yao, S.E. Kwon, J.D. Gaffaney, F.M. Dunning, E. Chapman // Nature Neuroscience. - 2011. - V. 15, № 2. - P. 243-249.

177. Ybe J. A. Clathrin self-assembly is mediated by a tandemly repeated superhelix / J. A. Ybe, F. M. Brodsky, K. Hofmann et al.// Nature. - 1999. - V. 399. -

P. 371 -375.

178. Yoshihara M. Is synaptotagmin the calcium sensor? / M. Yoshihara, B. Adolfsen, J. T. Littleton // Curr. Opin. Neurobiol. - 2003. - V. 13. - P. 315- 323.

179. Yoshihara M. Synaptotagmin I functions as a calcium sensor to synchronize neurotransmitter release / M. Yoshihara, J.T. Littleton // Neuron. - 2002. -V. 36.-P. 897-908.

180. Zefirov A.L. The role of intra & extracellular calcium in recycling of synaptic vesicle at frog motor nerve endings / A.L. Zefirov, M.M. Abdrakhmanov, M.A. Mukhamedyarov, P.N. Grigoryev // Neuroscience. - 2006. - V.143. - P. 905910.

181. Zhang B. Synaptic vesicle size and number are regulated by a clathrin adaptor protein required for endocytosis / B. Zhang, Y.H. Koh, R.B. Beckstead et al. // Neuron. - 1998. - V. 21. - P. 1465-1475.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Рисунок 1 - Нервная система передних сегментов дождевого червя.................15

Рисунок 2 - Калибровочная кривая перерасчета условных оптических единиц свечения в концентрацию ацетилхолина в растворах Древеса-Пакса различной

модификации......................................................................................33

Рисунок 3 - Флуоресценция маркера РМ1-43.............................................39

Рисунок 4 - Двойное флуоресцентное окрашивание препарата дождевого червя.41 Рисунок 5 - Динамика изменения флуоресценции нервных образований в мышце дождевого червя, окрашенных Б1ВАС4 (3) в интервале времени от 2 до 10 мин

после смены растворов с различным содержанием К+ (ммоль/л).....................43

Рисунок 6 - Изменение интенсивности флуоресценции (деполяризация мембраны) нервных образований на 2-Зй мин после смены растворов с различным

содержанием К+(0,3,10,40 ммоль/л).......................................................44

Рисунок 7 - Увеличение интенсивности флуоресценции в скоплениях «синаптических бутонов» через 2 мин после смены раствора с 3 ммоль/л К+ на

раствор с 10 ммоль/л К+........................................................................46

Рисунок 8 - Загрузка и выгрузка маркера РМ2-10........................................47

Рисунок 9 - Влияние ионов Са на загрузку маркера РМ2-10.........................49

Таблица 1 - Значения свечения и концентрации АХ в соматической мышце дождевого червя через 2-3 мин после смены растворов, а также после 40 мин.

/у,

инкубации без Са ив присутствии ВАРТА...............................................53

Рисунок 10 - Свечение кластеров «синаптических бутонов», окрашенных РМ2-10 в соматической мышце дождевого червя на 2-3 мин после смены

растворов...........................................................................................54

Рисунок 11 - Мышечный препарат дождевого червя (РМ1-43 и ТМЯ-альфа-

бунгаротоксина)...................................................................................58

Рисунок 12 - Мышечный препарат дождевого червя (РМ4-64 и ТМЯ-альфа-

бунгаротоксин)....................................................................................59

Рисунок 13 - Мышечный препарат дождевого червя (синтаксина 1 и ТМЯ-альфа-

91

бунгаротоксин)....................................................................................62

Рисунок 14 - Мышечный препарат дождевого червя (синаптотагмина 1 и ТМЯ-

альфа-бунгаротоксин)...........................................................................63

Рисунок 15 - Мышечный препарат дождевого червя (альфа 1В-субъединицы Са -канала Ы-типа и ТМЯ-альфа-бунгаротоксин)...............................................64

! I