Усовершенствование биотехнологических методов получения и сохранения семени домашних коз и их гибридов с сибирским козерогом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Воеводин, Владимир Александрович

• Воеводин, Владимир Александрович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Воеводин, Владимир Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 4 1.1. Актуальность темы 4 1.2 Цель и задачи исследований

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость

1.5. Положения, выносимые на защиту 6 1.6 Апробация работы

1.7. Публикации результатов исследований

1.8. Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Значение козоводства в мировом сельском хозяйстве

2.2. Систематика рода Сарга и роль гибридизации в козоводстве

2.3. Особенности репродукции коз

2.4. Получение и криоконсервации эякулированного семени козлов

2.5. Получение эпидидимального семени козлов

2.6. Методы полученйя эпидидимального семени

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Получение эякулированного семени

3.2. Определение количественных и качественных показателей сперматозоидов

3.2.1. Определение подвижности сперматозоидов

3.2.2. Определение концентрации сперматозоидов в камере Маклера

3.2.3. Морфологическая целостность акросом

3.2.4. Оценка переживаемости сперматозоидов

3.3. Методика разбавления и криоконсервации сперматозоидов

3.4. Методика искусственного осеменения коз

3.5. Методика цитогенетического исследования

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Модификация криопротективных сред

4.2. Создание криобанка семени козлов производителей

4.3. Хирургическое получение эпидидимального семени

4.3.1 Катетеризация семяпровода

4.4. Отделение плазмы семени козлов

4.5. Сравнительная оценка различных методов получения и замораживания семени представителей рода Сарга

4.6. Результаты искусственного осеменения коз замороженно-оттаянными сперматозоидами и характеристика потомства

4.7. Цитогенетика гибридного потомства

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

7. Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование биотехнологических методов получения и сохранения семени домашних коз и их гибридов с сибирским козерогом»

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы.

Создание новых высокоэффективных форм сельскохозяйственных животных с использованием высокой адаптационной способности дикой фауны является одной из важнейших задач сельскохозяйственной науки. В решении теоретических и прикладных вопросов конструирования новых селекционных форм животных главную роль играют исследования, которые включают комплекс мероприятий, связанных с сохранением и рациональным использованием генофонда [Багиров В.А. и др., 2009; Захаров-Гезехус И.А. и др., 2007; Насибов Ш.Н. и др., 2010].

По данным ФАО, за последние десять лет общая численность коз выросла с 730 млн. до 868 млн. голов, их разводят во всех зонах проживания человека, что обусловлено высокой приспособленностью данного вида животных к различным условиям обитания и высокой резистентностью [Багиров В.А. и др., 2009]. В связи, с чем наблюдается всевозрастающий интерес к проблемам генетики рода Сарга.

Во второй половине XX века, в связи с открытием и разработкой методов глубокого замораживания гамет, стало возможным создание криобанков репродуктивных клеток животных. Длительное время работа в основном проводилась с эякулированным семенем. Однако эпидидимальное семя также является важным, а зачастую и единственным источником для криоконсервации генетического материала диких животных. Так как сперматозоиды могут длительное время сохраняться в хвосте придатка в неактивном состоянии, влияние продолжительности их пребывания в последнем на оплодотворяющую способность и другие биологические свойства представляют интерес для более подробного изучения.

Актуальной задачей является разработка новых методов получения эпидидимального семени, криопротективных сред, способствующих сохранению биологической полноценности эпидидимальных

сперматозоидов при криоконсервации.

Контролируемое воспроизводство редких и исчезающих видов животных возможно благодаря использованию замороженного эпидидимального семени [Pukazhenthi В. et al., 1999]; сперма может быть получена от самцов в их естественной среде обитания и заморожена для последующего осеменения самок, содержащихся в неволе [Bailey Е. et al., 2003].

1.2. Цель и задачи исследований.

Целью диссертационной работы является разработка биотехнологических методов получения, криоконсервации семени и сравнительная характеристика эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов животных.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

-разработать новый метод ■ прижизненного получения эпидидимального семени с помощью фистулы семяпровода;

-провести сравнительную оценку и изучение биологической полноценности, морфологических показателей свежеполученных, охлажденных и замороженно-оттаянных эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов;

-изучить оплодотворяющую способность сперматозоидов и результаты осеменения животных эпидидимальным и эякулированным семенем;

-разработать метод криоконсервации семени самцов рода Сарга;

-создать криобанк семени чистопородных и гибридных козлов-производителей;

-получить от осеменения замороженно-оттаянным эпидидимальным семенем гибридов сибирского козерога и зааненской козы разных генераций;

-изучить биологические характеристики гибридных самцов и самок;

1.3. Научная новизна.

Разработан новый метод прижизненного получения эпидидимального семени с помощью фистулы семяпровода. Впервые в сравнительном аспекте изучены биологические свойства эякулированного и прижизненно полученного эпидидимального семени от одного и того же животного. Дана сравнительная цитогенетическая характеристика видов рода Сарга и их гибридов. Установлено, что гибридные животные обладают нормальными репродуктивными качествами. Впервые получены гибриды второго поколения сибирского козерога и зааненских коз.

1.4. Практическая значимость.

Разработаны новые методы получения и криоконсервации эпидидимального и эякулированного семени самцов рода Сарга. Создан криобанк семени гибридов сибирского козерога первого поколения и козлов-производителей зааненской и нубийской и оренбургской пород коз. Получены гибриды первогои второго поколения сибирского козерога и зааненской породы коз, с целью создания новых высокоэффективных селекционных форм животных.

1.5. Положения, выносимые на защиту:

-новые методы получения и криоконсервации эпидидимального и эякулированного семени животных, позволяющие получить высокую биологическую полноценность и оплодотворяющую способность;

- криоколлекция эпидидимального и эякулированного семени гибридов сибирского козерога первого поколения и козлов-производителей зааненской, нубийской и оренбургской пород;

-сравнительная цитогенетическая характеристика разных видов рода Сарга и гибридного потомства с применением прикладных компьютерных программ;

-получение гибридных животных второго поколения для создания новых высокоэффективных селекционных форм коз.

1.6. Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИ животноводства Россельхозакадемии (2008-2011гг.), на научных конференциях (Санкт-Петербург 2009, Дубровицы 2009, Москва 2010, Кострома 2011,).

1.7. Публикации результатов исследований.

Опубликовано 11 научных работ в том числе, по теме диссертационной работы 7 из них 5 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.

1.8. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка основных работ, опубликованных по теме исследований, списка использованной литературы. Материал изложен на 110 страницах компьютерного текста, содержит 8 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 184 источника, в т.ч. 170 - на иностранных языках.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Значение козоводства в мировом сельском хозяйстве.

Козоводство в последние годы динамично развивается во всем мире. По данным ФАО численность коз в мире с 2000 до 2010 года выросла с 730 млн. до 921 млн. голов (рис. 1). В России в последние годы так же наметился рост поголовья коз.

860 т 840 820 + 800 780 760 740 720 700 680 660

/

\

\

V

-+-

2.4 ^

2,35 2,3 2,25 2,2 2,15 2,1 2,05

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

годы

■•А 'В мире " в россии

Рис. 1 Динамика численности коз в России и в мире с 2000 по 2009 гг. (по данным ФАО).

В настоящее время в мире насчитывается до 500 различных пород коз, по разным данным количество пород коз в мире колеблется от 236 до 500 [Багиров В.А. и др., 2009]. Более 53% коз в мире относится к молочным и комбинированным молочно-мясным породам (рис. 2).

Породы

8,9

у

о с '/

18,6

0,3

■■ / /

и Шерстные

■ Молочные

■ Мясные в Пуховое «Мясо-шерстное в Шер стно-мясные

Мясо-шерсшо-молочное Молочно-мясное Парковое в Мясо-кожевьючное Шкуровое

Рис. 2 Доля коз разного направления продуктивности в мире.

На разных континентах структура распределения пород в зависимости от направления продуктивности существенно отличается. В Европе преобладают молочные породы коз - 66,4% и молочно-мясные - 15,9%. В Азии комбинированные породы составляют более 50% от всего поголовья разводимых коз. В Африканских странах разводят преимущественно мясные породы коз.

Козье молоко является ценным продуктом питания человека. Несмотря на то, что у нас в стране большой спрос на козье молоко, молочное козоводство находится в стадии формирования. В России имеется всего несколько крупных козоводческих хозяйств.

2.2. Систематика рода Сарга и роль гибридизации в козоводстве.

Предком домашних коз большинство исследователей считают саблерогого (безоарового) козла. Свое название безоары получили за инородные тела (минерализованные отложения остатков пищи), которые иногда находят в их желудках или кишечнике. Поскольку таким образованиям приписывались лечебные свойства, за этими животными активно охотились. Безоаров также называют бородатыми из-за густой и

длинной бороды. Ареал безоаровых коз охватывает горные районы Центральной Азии (Афганистан, Туркменистан, Иран), Кавказа, Закавказья, а также Малой Азии вплоть до греческих островов. Сейчас они сохранились только в неприступных районах и внесены в Международую Красную книгу как вид, которому угрожает вымирание.

Безоаровый горный козел по сравнению с другими представителями рода имеет небольшие размеры: длина тела — 120-160 см, высота — 70-100 см, масса — 35-40 кг (редко до 60 кг). Самки меньше самцов. У самцов средняя длина рогов 90-100 см, окружность у основания — 23-25 см, они имеют черную окраску, изогнутую саблеобразную форму, очень сильно сжаты с боков, на переднем узком ребре находятся редкие бугры. В отличие от самцов у самок рога короткие, без бугров на переднем ребре. Шерсть на спине и боках животных летом рыжевато-бурая, зимой — серовато-бурая, вдоль спины тянется черно-бурый ремень, на шее — такая же темная полоса, нижняя часть тела белая. Продолжительность жизни составляет 10-15 лет.

По данным литературы, еще одним из вероятных предков домашней козы можно считать мархура, или винторогого козла, обитающего в горах Пакистана, Афганистана, Северо-Западной Индии, Таджикистана и Киргизии. Название «мархур» происходит от персидского «мар» (змея) и «хур» (пожирающий). У винторогого козла рога плоские, направленные вверх и несколько назад. Каждый рог закручен штопорообразно (левый — вправо, правый — влево). Длина рогов у взрослых самцов может превышать 1,5 м, у самок рога короче. Длина тела мархура составляет 150-170 см, высота в холке у самцов — 85-100 см, живая масса — 80-120 кг. Голова тяжелая, слегка горбоносая. У самцов на нижней стороне шеи и груди длинная густая борода и подвес из беловатых волос. Как и безоаровый, винторогий козел занесен в Международную Красную книгу. Так как при обсуждении вопроса о происхождение домашних коз одним из признаков служат строение и форма рогов, лишь ряд исследователей называют мархура предком домашних коз, поскольку у них рога такого типа, который

представлен у мархура, встречаются крайне редко. По некоторым источникам, третьим предполагаемым предком домашних коз была так называемая первобытная коза приска — дикая европейская коза с рогами, которые по форме очень похожи на рога домашних коз. Этот вид вымерший. По мнению С.Н. Боголюбского [Боголюбский С.Н., 1959], имелось три центра одомашнивания коз: первый — в Передней и Средней Азии (безоары), второй — восточнее первого (мархуры) и третий — в Юго-Восточной Европе (первобытные козы). Однако есть мнение, что приска — не самостоятельный вымерший вид, а уже одомашненная форма безоаровой козы. Возможно, в формирование домашних коз участвовали и другие виды диких коз — сибирский козерог, кавказский тур, альпийский горный козел.

Вопрос о происхождении домашних коз окончательно не решен. Основными доводами при его обсуждении служили результаты изучения особенностей строения черепа, строение и форма рогов, а также возможность получения плодовитого потомства при скрещивании. На наш взгляд, наиболее убедительный аргумент — получение фертильных потомков при спаривании диких и домашних видов и результаты молекулярных исследований генома [Багиров В.А. и др., 2009].

Каменный козел является объектом спортивной охоты, отстрел

производится по лицензиям.

Сибирский горный козёл (Capra sibirica Pallas, 1776) - типичное горное животное, имеет обширный ареал, простирающийся от восточной части Восточного Саяна на Запад до Памира и Гималаев. Он занимает горы Тувы, Монголии, Алтая, горные массивы Средней Азии, Афганистана, Северного Пакистана и Индии. Среди представителей рода Сарга - самый многочисленный вид.

Сибирский козерог - самый крупный представитель рода козлов на невысоких и крепких ногах с длиной тела 140-165 см, высотой в холке 80-110 см, весом 100-130кг

Зимой окраска меха желтовато-белая с буроватым оттенком, вдоль спины тянется широкая коричневато-бурая полоса, борода и хвост черно-бурые. Борода у самцов длинная и занимает всю нижнюю часть головы, кроме подбородка. Летом окраска меха более темных тонов.

Среди горных козлов сибирский козел отличается и самыми большими рогами - до 147 см. Рога имеют серповидный загиб разной крутизны. На большей части длины они отчетливой трехгранной формы. Передняя грань, плоская и широкая, образует с двумя боковыми (наружной и внутренней) хорошо выраженные ребра. Поперечное сечение рога треугольной формы. Основанием треугольника служит передняя грань, а его вершина направлена назад и несколько закруглена. На передней грани расположены высокие бугры в форме поперечных валиков, которые доходят почти до конца рогов. Степень развития валиков подвержена широкой индивидуальной изменчивости. Каменные козлы - животные стадные, летом стада насчитывают до 40-50 голов, после окончания гона - до 100-150 голов.

Самцы собирают гаремы из 5-15 самок. Продолжительность беременности 170-180 дней. В мае - июне самки приносят по одному-два козленка. Козлята могут следовать за матерью в первые дни и обычно держатся около нее до рождения новых козлят.

Половозрелые самки приносят потомство в двух-трех-летнем возрасте. Продолжительность жизни 15-17 лет.

Обитая в скальных биотопах, горный козёл имеет островной характер распространения; присутствие его в том или ином месте зависит от наличия скальных массивов и не связано с высотой над уровнем моря. В целом диапазон его вертикального распространения находится в пределах от 500 до 5000 м над уровнем моря и выше.

Местообитания горного козла в меньшей степени затронуты хозяйственной деятельностью человека, он менее интенсивно конкурирует с домашними животными, поэтому его ареал, за редким исключением, сократился незначительно. Изменение его численности больше зависит от

климатических и других условий, особенно в северо-восточной части ареала, где он в отдельные годы страдает от многоснежья. Заметно уменьшается поголовье козла после эпизоотий саркоптоза, которые охватывают некоторые популяции в отдельные годы, особенно после неблагоприятных по климатическим условиям лет.

В связи с обитанием в хорошо защищенных биотопах он в меньшей степени страдает от хищников. Использование его как охотничьего объекта также связано с большими трудностями, в связи с чем численность во многих местах ещё значительна. Как охотничий объект горный козёл в основном использовался лишь местным населением, приспособленным к горным условиям и трудной охоте на него. В целом в прошлые годы всегда козла добывали в небольшом количестве. Местное население использовало его высококачественное мясо, шкуры, и, в некоторых местах, рога для поделок. В последнее десятилетие горных козлов часто отстреливают в качестве охотничьих трофеев, в том числе и в республиках Средней Азии.

Горный козёл интересен как эталон идеального приспособления к горным (высокогорным) условиям, в том числе и в зимний период. Интересен он так же, как ближайший родственник прародителей домашней козы.

Систематическое положение сибирского горного козла как самостоятельного вида оспаривалось многими систематиками. Чаще сибирский горный козёл рассматривался как подвид альпийского козла, подвидами которого также считались нубийский козёл и кубанский тур.

По особенностям строения черепа сибирский козёл имеет больше сходства с кубанским туром, в целом же он комбинирует признаки различных форм, как и другие виды рода Сарга.

Существует четыре подвида сибирского козла: алтайский (С.Б^Ыпса), козёл Гагенбека (С.з.1^епЬеск].), центрально-азиатский (С.з.аЫапа) и гималайский (С.Б.Бакееп). Центрально-азиатский сибирский козел обладает

большими массивными рогами длиной по изгибу свыше 100 см. Обитает на Тянь-Шане и Памиро-Алтае.

Алтайский сибирский козел отличается от среднеазиатского более слабыми рогами, длина которых редко достигает 100 см. Распространен на Алтае и в Саянах.

Сибирский горный козёл всегда добывался и в большинстве случаев и сейчас добывается ради мяса. Шкура вместе с головой и ноги чаще всего оставляются на месте разделки туши. В случае, если шкуру забирают, она используется как коврик; из осенних хорошо выделанных шкур шьют одеяла или спальные мешки. Мясо горного козла вкусно, питательно. Выход его составляет около 60% от живого веса; козлятина не теряет своих вкусовых качеств и питательной ценности в течение всей зимы; мясо молодого животного неплохое даже весной, когда все другие копытные сильно худеют. Охота на козлов в обычных местах обитания не очень трудна, особенно с нарезным оружием. Основные способы охоты - скрадывание на кормёжке или отдыхе; в местах с редкими водными источниками - подкарауливание на водопое, реже устраивают загоны. В Киргизии для охоты на горных козлов используют собак.

Однако охота - не единственная область интереса хозяйственного использования диких горных козлов. Сибирский козерог состоит в тесном родстве с домашними козами, и в этом отношении предпринимались попытки его использования в создании новых пород. Тем не менее, его изученность оставляет желать лучшего, особенно в отдельных регионах (на северо-востоке ареала), наиболее интересных в смысле его адаптации к суровым условиям существования.

2.3. Особенности репродукции коз

Метод искусственного осеменения - одно из важнейших достижений в животноводстве, являющееся мощным селекционным инструментом, главное преимущество которого состоит в быстром улучшении генофонда путем осеменения большого числа самок спермой выдающихся производителей.

История искусственного осеменения насчитывает несколько сотен лет. В Европе первый опыт по искусственному осеменению был проведен в Италии в 1780 году. Л. Спалланцани ввёл несколько капель спермы кобеля в половые пути суки, которая успешно забеременела и, через два месяца родила шесть щенков [БраПапгат, Ь. 1784].

Искусственное осеменение имеет ряд существенных преимуществ перед обычным спариванием:

-ускоряет селекционный процесс, за счет использования производителей, оцененных по качеству потомства. При этом значительно увеличивается число их потомков (одним эякулятом можно осеменить до 40 коз);

-позволяет целенаправленно планировать получение потомства от нужных производителей для управления селекционным процессом. Достоверное происхождение животных является необходимым условием селекционно-генетического прогресса;

-экономически выгодно для крупных хозяйств. Это позволяет сократить или вообще исключить (в случае покупки замороженного семени) число производителей, а, следовательно, и расходы на их содержание, кормление, ветеринарные мероприятия и другие;

-позволяет получить дополнительную экономию в козоводстве за счет организации туровых окотов (в случае синхронизации полового цикла). Особенно актуальным это является для крупных ферм, занимающихся производством молока. Удлинение периода осеменения за счет синхронизации позволяет получать молоко в течение всего года.

У коз в средних и высоких широтах (35° с.ш. и выше), наблюдается сезонность размножения. Длительность воспроизводительного сезона обратно зависит от географической широты: она увеличивается со снижением широты. По данным итальянских исследователей, использование искусственных циклов фотопериодизма (1-2 месяца в режиме 16 часов «день» - 8 часов «ночь» и 1-2 месяца в режиме 8 часов «день» 16 часов «ночь») позволяет контролировать половую активность у козлов в воспроизводительный сезон [Эе^асИПо З.А. й а1., 1992, 1993]. У животных, содержащихся в условиях искусственных циклов фотопериодизма, в течение трёх последовательных лет при взятии семени два раза в неделю общее число сперматозоидов в эякулятах было на 61% больше, чем у контрольных животных без снижения фертильности. Кроме того, качество семени после замораживания-оттаивания не выявило сезонных изменений, наблюдаемых у контрольных козлов. Манипуляции с фотопериодизмом позволяли брать семя от козлов круглый год вместо возможности взятий только в течение 6 месяцев в году во время полового сезона, и выход доз семени мог быть значительно повышен от каждого козла в первый год его жизни.

Большое влияние в инициации и сохранении полового поведения играют условия содержания козлов-производителей. Молодые козлы, интенсивно используемые для получения семени, обычно выращиваются в индивидуальных станках, начиная от подсоса, с целью ограничения проявления их репродуктивной функции. Выращивание козлов в однополых группах в течение претубертантного периода отрицательно влияет на их будущую половую активность. Выращивание козлов в гетеросексуальных группах благоприятно действует на спермопродукцию, тогда как выращивание в однополых группах не оказывает неблагоприятного действия на спермопродукцию и качество семени, если группировка произведена, по возможности, как можно в более раннем возрасте.

2.4. Получение и криоконсервации эякулированного семени козлов

Анализируя мировой опыт замораживания семени козлов-производителей в странах с развитым молочным козоводством (Франция, Голландия, Новая Зеландия, Италия, Германия, Австрия, Греция, США), можно отметить, что в целом существующие технологии включают следующие этапы: сбор семени, определение объема эякулята, разбавление, определение концентрации и подвижности, разбавление до конечного объема и достижения заданных параметров (обычно 300 миллионов живых сперматозоидов на пайету), эквилибрация (обычно 180 минут), расфасовка в пайеты, замораживание в жидком азоте, оттаивание нескольких случайно выбранных пайет с целью контроля качества.

Суточная спермопродукция у козлов-производителей варьирует от 2,76 до 7,23x109 клеток в зависимости от сезона года и породы [Chandler J. Е. 1988].

Семя козлов, преимущественно, собирают на искусственную вагину в присутствии козы в охоте. Реже для этих целей используется электростимуляция. По данным исследователей США [Akusu М.О. et al., 1984] электрическая стимуляция позволяет получать эякуляты большего объема, однако меньшей концентрации. По данным французских исследователей [Nunes J., 1982] семенная плазма оказывает отрицательное влияние на сохранность семени, поэтому в качестве основного метода сбора семени метод электроэякуляции не рекомендуется.

Частота сбора семени козлов производителей различается в зависимости от технологии. Так, по данным французских исследователей [Corteel J.M. et al., 1977] увеличение числа садок с 2 до 7 в неделю позволяет в три раза увеличить число получаемых сперматозоидов (а, следовательно, и спермодоз) в неделю. При этом допускаются две повторные садки с интервалом 5 минут. Положительное влияние оказывает увеличение периода отдыха между садками. Французские исследователи рекомендуют интервал между садками два дня в первой половине случного сезона, и три дня во

второй половине случного сезона [Boue P., Corteel J.M., 1992]. В течение случного сезона повторные взятия можно осуществлять через 2-5 минут после первого взятия.

Впервые семя козлов было заморожено в 1950 году при -79°С [Smith А.Н., Polge С., 1950]. В результате одного из первых опытов, проведенных канадскими исследователями [Barker С.А., 1957] был сделан вывод, что метод криоконсервации семени не найдет практического использования в козоводстве из-за низкой результативности осеменения замороженно-оттаянным семенем. Начиная с конца 50-х годов целый ряд исследователей в различных странах ставили целями своих научных опытов повышение результативности технологий' криоконсервации семени козлов. Результаты таких исследований в конце 50-х - начале 60-х годов сильно различались: результаты осеменения варьировали от 3-15% до 20-48% и даже 70%). Причиной таких низких результатов было использование в то время для замораживания семя вместе с семенной жидкостью, которая, как известно, оказывает отрицательное влияние на выживаемость сперматозоидов козлов. Только после появления работы французских исследователей в 1974 году [Corteel J.M.,. 1974], в которой было доказано, что удаление семенной жидкости непосредственно после взятия семени оказывает положительное влияние на выживаемость сперматозоидов, и предложена отмывка семени, большинство исследователей приняли этот метод.

Различные технологии предусматривают различные способы отмывки семени от семенной жидкости, различающиеся по ряду критериев.

Существующие сегодня технологии позволяют использовать как нативное семя (без отделения семенной жидкости), так и семя, отмытое от семенной жидкости. Наиболее используемыми компонентами сред для криоконсервации спермы козла, являются яичный желток и обезжиренное высушенное снятое молоко. Однако, растворение спермы козлов в разбавителе, содержащем яичный желток или молоко, может оказаться губительным для сперматозоидов. Вредные взаимодействия семенной

плазмы с яичным желтком и молоком были зарегистрированы французскими исследователями [Roy А., 1957, Nunes J., 1982]. Впервые в мире А. Roy [1957] заметил, что сперматозоиды сохраняли свою подвижность в разбавителях на основе яичного желтка, если семенная плазма была удалена. Позже было установлено, что причиной коагуляции яичного желтка является фермент, вырабатываемый куперовыми железами, который был назван ферментом, коагулирующим яичный желток (EYCE). Изначально EYCE был идентифицирован как фосфолипаза [Iritani А. и Nishikawa Y., 1961,1963]. EYCE действует как катализатор, который гидролизует лецитин яичного желтка в жирные кислоты и лизолецитин [Iritani А. и Nishikawa Y., 1961, 1963]. Это приводит к гидролизу мембран сперматозоидов, и, как следствие, обуславливает акросомную реакцию [Upreti G.C., et al., 1999] и деконденсацию хроматина [Sawyer, D.E., Brown, D.B., 1995], что является губительным для сперматозоидов [Aamdal J., 1965]. Nunes J. с соавторами [1982] идентифицировал в секрете куперовых желёз козлов белок SBUIII (55-60kDa) гликопротеинлипаза, BUSgp60, который снижал выживаемость охлажденной или замороженной спермы козла, растворенной в молоке. Этот белок вызывал акросомную реакцию и последующую гибель сперматозоидов в среде, содержащей молоко -при 37°С [Pellicer-Rubio М.Т. et al., 1998]. Липаза BUSgp60 структурно схожа с липазой поджелудочной железы свиньи [Carriere F. et al., 1994; Gourtens J.L., Paquignon M. 1985]. Подобно EYCE, белок BUSgp60 ответственен за гидролиз плазменных и мембранных триглицеридов в снятом молоке, что в свою очередь влияет на жирнокислотный состав разбавителя и делает его токсичным [Pellicer-Rubio М.Т. et al., 1997; Pellicer-Rubio М.Т., Combamous Y., 1998]. Французские исследователи высказали предположение, что EYCE и SBUIII являются одним и тем же веществом [Leboeuf В. et al., 2000].

Для преодоления вредного взаимодействия семенной плазмы с яичным желтком или белками молока сперму козлов отмывают буферными разбавителями. В качестве промывающего раствора в зависимости от

технологии используют фосфатно-солевой буфер (с добавлением или без добавления глюкозы), криосреду (снятое молоко, трис или другие среды) без глицерина.

Разбавление семени козлов промывающим раствором осуществляется, как правило, в соотношении 1:5 до 1:10. По данным австралийских исследователей увеличение степени разбавления до 1:20 позволяет повысить эффективность отмывки семенной жидкости [Ritar A.J., Salamon S., 1982]. На показатели качества семени влияет число промывок, которое обычно варьирует от 1 до 3. По данным австралийских исследователей увеличение числа промывок от 1 до 2 при разбавлении 1:5 до 1:10 позволяет повысить результативность удаления семенной жидкости [Ritar A.J., Salamon S., 1982].

Отделение сперматозоидов от семенной жидкости и промывающего раствора осуществляется, как правило, центрифугированием при 600-1000 об/мин в течение 10-15 минут [Nunes J. et al., 1982; Ritar A.J., Salamon S., 1982; Singh M.P. et. al., 1995; Leboeuf B. et al., 1998]. При этом режим центрифугирования (число оборотов в минуту и длительность) между странами (США, Австралия, Голландия, Италия) существенно не различаются. Следует отметить, что в литературе имеются данные о положительных результатах замораживания без отмывки семени от семенной жидкости [Ritar A.J. и Salamon S., 1982; Azeredo G.A. et al.. 2001; Coetzee K., 1998]. .

Для минимизации физических и химических стрессов, обусловленных охлаждением, замораживанием и оттаиванием сперматозоидов в среду криоконсервации включают криопротекторы. Криопротекторы разделяются на проникающие и непроникающие. Проникающие криопротекторы являются растворами, которые вызывают обезвоживание сперматозоидов из-за осмотических колебаний. При обезвоживании уменьшается точка замерзания клетки, образуется меньше внутриклеточного льда, который приводит к гибели клеток, и, следовательно, к сокращению активности сперматозоидов, а так же происходит перестройка мембранных липидов и

белков, которая, в свою очередь, приводит к увеличению мембранной проницаемости, большему обезвоживанию при более низких температурах, и поэтому к повышенной способности к выживанию при криоконсервации [Holt W.V., 2000]. Таким образом, непроникающие криопротекторы действуют как вещества, которые снижают температуру замерзания [Amann R.P., 1999]. К мембранно-проникающим криопротекторам относятся глицерин, сульфоксид этана, этиленгликоль, пропиленгликоль и их комбинации. Проверка вышеназванных криопротекторов показала, что наиболее оптимальным криопротектором для спермы козлов является глицерин [Ritar A.J., 1990, Tuli R.K., Holtz W., 1994; Singh M.P. et al., 1995; Kundu C.N. et al., 2000, Leboeuf В. et al., 2000]. Конечная концентрация глицерина в криосреде варьирует незначительно и составляет от 4 до 10%. Наиболее распространенными непроникающим криопротекторами, являются яичный желток в концентрации от 2 до 20% (один из вариантов австралийской и германской технологий) [Ritar A.J., Salamon S., 1982, Holtz W., 1994] и 10% обезжиренное снятое молоко (французская технология) [Corteel J.M., 1974, Leboeuf В., 1998]. Недавние исследования показали возможность использования в качестве криопротекторов смеси аминокислот [Kundu C.N., 2001].

Конечной целью любой технологии криоконсервации является достижение высокого коэффициента рождаемости при наименьшем количестве осеменений и низкой концентрации сперматозоидов. При этом при разбавлении необходимо учитывать, что в спермодозе должно содержаться достаточное количество разбавителя для адаптации сперматозоидов перед оплодотворением. Образцы спермы козлов разбавляют в соотношении 1:1-1:23 (об/об, сперма к разбавителю) [Evans G., Maxwell W.M.C., 1987; Ritar A.J. et al., 1990]. Однако для достижения более высоких показателей оплодотворяемости целесообразно рассчитывать степень разбавления, исходя из концентрации сперматозоидов. Существующие сегодня технологии криоконсервации семени в различных странах с

развитым козоводством (Франция, Голландия, Новая Зеландия, Италия, Германия, Австрия, Греция, США) существенно не различаются по показателю количества сперматозоидов в эякуляте: концентрация варьирует от 80x106 до 500x10е клеток/мл [Corteel J.M., 1974, Ritar A.J.et al., 1990, Karatzas et al., 1997]. Так, по рекомендациям австрийских исследователей, семя разбавляют из расчета 300 млн. живых сперматозоидов на пайету.

Существует два различных способа замораживания семени: в гранулах и соломинах.

При замораживании семени в гранулах непосредственно после охлаждения семени до 4°С сперму аликвотами по 0,1-0,3 мл разносят в углубления на блоке сухого льда (твердого двуокиси углерода—79°С) и замораживаются за 2-4 мин, затем гранулы погружаются в жидкий азот для хранения. Такая технология замораживания находит применение в различных странах: США [Evans G., Maxwell W.M.C., 1987], Франции [Chemineau P. et al., 1991]. Замораживание спермы в гранулах быстро и недорого. Однако данный способ замораживания получил меньшее распространение, так как сопряжен с трудностями при маркировке семени.

Наиболее распространенным способом замораживания семени является способ замораживания в соломинках. Это способ является более дорогим и трудоемким по сравнению с использованием гранул. Определяющим фактором, обусловившим выбор большинства компаний в разных странах в пользу данного способа, ■ является легкость маркировки семени, что особенно важно в племенном козоводстве. Для замораживания охлажденные образцы спермы набираются в 0,25 или 0,5 мл соломинки, которые размещают на стойке. Замораживание проводят в парах жидкого азота. Для криоконсервации спермы козла успешно используются как ящик из пенополистирола, содержащий жидкий азот, так и программируемые замораживатели.

Режимы замораживания семени различаются в зависимости от технологии. Так, французская технология [Corteel J.M., 1974, 1977] предусматривает ресуспендирование отмытых от семенной жидкости сперматозоидов в разбавителе без добавления глицерина до половины конечной концентрации, охлаждение от 30 до 4°С в течение 1 часа и дальнейшее разбавление глицерин-сод ержащим разбавителем (14% глицерина) до конечной концентрации (400 - 500*106 клеток). При этом конечная концентрация глицерина составляет 7%. Затем следует эквилибрация при 4°С в течение 4 часов и замораживание. Австралийская технология замораживания позволяет использовать не отмытое семя. Один из вариантов предусматривает разбавление свежее взятого семени добавлением глицерин-содержащего разбавителя при 30°С, охлаждение в течение 1-1,5 часа до 4-5°С и замораживание без эквилибрации [Ritar A.J. et al., 1990]. Другой вариант предусматривает двухступенчатое разбавление. Первое разбавление осуществляют разбавителем без глицерина, затем разбавленное семя охлаждают до 4-5°С в течение 1-1,5 часа, проводят второе разбавление глицерин-содержащим разбавителем, затем эквилибрацию при той же температуре в течение 1-1,5 часа и замораживание [Ritar A.J., Salamon S., 1982]. Следует отметить, что эффективность двухступенчатого способа замораживания, оцененная по жизнеспособности замороженно-оттаянного семени сопоставима с одноступенчатым способом.

Одна из американских технологий предусматривает использование ящика из пенополистирола. Образцы семени в соломинах помещают в пары жидкого азота на высоте 3-4 см над жидкостью на 7-8 мин, а затем соломинку погружают в жидкий азот для хранения [Evans G., Maxwell W.M.C., 1987]. Французские исследователи [Chemineau Р., 1991] определили, что высота расположения соломинок над жидким азотом зависит от размера соломинки. Было предложено, чтобы 0,5 мл соломинки замораживались на высоте 4 см над жидким азотом примерно в течение 5 мин, а затем погружались в жидкий азот, в то время как 0,25 мл соломинки должны

замораживаться на уровне 16 см выше жидкого азота в течение 2 мин, затем на более низком уровне (4 см) в течение 3 минут и только потом погружаться в жидкий азот для хранения. Однако в литературе есть данные и о других параметрах высоты и времени, используемых французскими авторами [Leboeuf В. et al., 2000].

Для замораживания больших объемов семени при быстром замораживании рекомендуется использование программируемых замораживателей. Преимущество программируемых замораживателей заключается в том, что кривая замораживания может быть настроена нужным образом. Например, по рекомендациям французской корпорации IMV охлаждение с 4 до 5°С происходит со скоростью 4°С/мин, с 5-110°С со скоростью 25°С/мин и от 110-140°С со скоростью 35°С/мин, и затем сперма может быть погружена в жидкий азот.

Целью добавления разбавителя при криоконсерваци является обеспечение сперматозоидов источником энергии, защитой от вредного воздействия низких температур и поддержание благоприятных условий для их дальнейшего использования. Логично, что каждый отдельный компонент разбавителя должен быть исследован, как в отдельности, так и в сочетании с другими составляющими. Как правило, среда для криоконсервации спермы козлов включает в себя непроникающие криопротекторы (молоко или яичный желток), проникающие криопротекторы (глицерин, этиленгликоль, или диметилсульфоксид), буфер (Трис или Тест), один или несколько Сахаров (глюкозу, лактозу, раффинозу, сахарозу или трегалозу), соли (цитрат натрия, лимонную кислоту) и антибиотики (пенициллин, стрептомицин) [Evans G. and Maxwell W.M.C, 1987].

Наиболее часто для криоконсервации спермы козлов используются разбавители на основе сухого обезжиренного молока (оригинальная французская технология) [Corteel J.M., 1974] или трис-глюкозный разбавитель (оригинальная австралийская технология) [Salamon S. и Ritar A.J., 1982]. Вне зависимости от вида разбавителя используемый разбавитель

должен обладать определенной осмолярностью [Bowen, J.A.B, 1988]. В то время как осмолярность среды может колебаться в определенных пределах, сперматозоидам козла предпочтительна гиперосмотическая среда для криоконсервации. Salamon S. и Ritar A.J. [1982] отмечают, что оптимальная осмолярность Трис-глюкозо-цитратного разбавителя в случае разведения в нем спермы козла составляет 948 кПа (540m0sm). Данная величина была определена как оптимальная путем сравнения комбинаций Трис-буфера и сахара, в той или иной осмотической концентрации, которая колебалась между 737 и 1112 кПа.

Другим показателем, определяющим сохранность сперматозоидов, является фактор рН. Значительные колебания рН спермы могут привести к потере сперматозоидами фертильности или их полной гибели. Поэтому в целях сохранения жизнеспособности сперматозоидов и их оплодотворяющей способности важно поддержать стабильность окружающей среды, управляя колебаниями фактора рН при криоконсервации. Установлено, что в целом для эффективного сохранения полноценности сперматозоидов буферная среда разбавителя должна обеспечивать значения рН около 7,0 (диапазон колебаний рН от 6,0 до 8,0). Поэтому существующие сегодня технологии замораживания семени козлов в различных странах (Германия, Франция, Австралия, США, Канада) предусматривают использование разбавителей, обеспечивающих значения рН именно в этих пределах [Ritar A.J., Salamon S., 1982; Salamon S., Ritar A.J., 1982; Deka, B.C. and Rao, A.R., 1987; Tuli R.K., Holtz W., 1992].

Выбор способа оттаивания образцов спермы определяется методом, используемым для заморозки семени. Гранулы семени должны оттаиваться в сухой пробирке при 37°С, в то время как размораживание соломинок может быть выполнено различными методами. Большинство технологий предусматривает оттаивание соломинок в воде при 37°С в течение 12-30 сек. По данным Deka, B.C. and Rao, A.R., [1987] этот метод обеспечивает получение 36,1% подвижных сперматозоидов после 4 ч инкубации при 37°С

по сравнению с методом оттаивания, при котором соломинка со спермой помещается в водяную баню при температуре 5°С на 2 минуты (18,9% подвижных сперматозоидов после 4 ч инкубации при 37°С). По данным германских исследователей из Университета Геттингена увеличение температуры размораживания до 70°С с экспозицией соломинок в течение 7 секунд позволяет значительно увеличить подвижность спермиев (36,9%) и целостность плазматической мембраны (39,8%) по сравнению со спермой, тающей при комнатной температуре в течение 2 минут (31,5%, 33,7% прогрессивно подвижных и содержащих интактную плазматическую мембрану сперматозоидов, соответственно) или при 40°С в течение 20 сек (32,4%, 33,5%) [Tuli R.K. et al., 1991].

Сегодняшнее состояние репродуктивных технологий коз в мире открывает широкие перспективы в данной отрасли животноводства. Замороженно-оттаянное семя используется как для искусственного осеменения, так и для оплодотворения in vitro и получения эмбрионов [Nasar А, 2008].

Существует множество приемлемых методов криоконсервации семени козлов. Необходимо направить новые исследования на повышение оплодотоворяющей способности замороженно-оттаянного семени, содержащего минимальное количество сперматозоидов. Для достижения этой цели необходима дальнейшая разработка альтернативных сред для криоконсервации семени козлов, разработанных Kundu C.N. et al., [2000, 2001, 2002]. Необходимо использование методик, требующих минимальной обработки без центрифугирования для удаления плазмы семени. Благодаря меньшим физическим повреждениям сперматозоидов после криоконсервации повысится число жизнеспособных клеток. Использование для осеменения меньшего числа клеток выгодно производителям, так как из одного эякулята можно получить больше доз для осеменения. К тому же, чем меньше времени затрачивается на обработку семени, тем выше эффективность производства, и, следовательно, тем выше прибыль.

Пока новые технологии находятся в состоянии разработки, рекомендуется использовать трис - желточный разбавитель для криоконсервации, описанный Salamon S. and Ritar A.J., [1982]. Использование трис - желточных разбавителей предпочтительно из-за лёгкости использования, в частности, из-за отсутствия необходимости центрифугирования семени [Ritar A.J. and Salamon S., 1982], возможности одноступенчатого разбавления [Salamon S. and Ritar A.J., 1982], простоты приготовления по сравнению с молочным разбавителем (не требуется кипячения). Другие исследователи, Tuli R.K. and Holtz W. [1992, 1994], рекомендуют использовать тот же разбавитель, но с концентрацией ЖКЯ не 1,5%, как Salamon S. and Ritar A.J., а 16,8%. Однако повышенная концентрация ЖКЯ (>1,5%) снижает выживаемость сперматозоидов козлов после оттаивания, если образцы семени перед криоконсервацией не были отмыты от плазмы [Ritar A.J. and Salamon S., 1982]. Оплодотворяющая способность семени козлов, замороженного в гранулах и в соломинках, сходна [Ritar A.J. et al., 1990]. Поэтому для удобства маркировки семя козлов рекомендуется замораживать с трис-желточным разбавителем в соломинках, помещаемых на 4 см над жидким азотом на 4,5 мин и затем погружаемых в жидкий азот на хранение. Такая же технология может быть использована в программируемом замораживателе семени. Соломинки с семенем козла необходимо оттаивать 20-30 сек. на водяной бане при 37°С.

2.5. Получение эпидидимального семени козлов.

В прошлом невозможность получения эякулята или неожиданная гибель ценных самцов не позволяла сохранить их генетический материал. Во многих случаях невозможно провести естественное спаривание или использовать эякулированное семя. Причинами могут служить трудности в содержании животных, смерть перед получением семени или обструктивная азооспермия, препятствующая эякуляции. В таких случаях лучшим альтернативным источником жизнеспособных фертильных сперматозоидов

является хвостовой участок эпидидимиса. Результаты многочисленных исследований подтверждают возможность получения потомства с помощью искусственного осеменения эпидидимальным семенем у целого ряда видов млекопитающих, например антилоп [Bartels Р. et al., 2001], коз [Blash S. et al., 2000], собак [Hori Т. et al., 2005], гауров [Hopkins S. et al., 1988], диких козлов [Santiago-Moreno J. et al., 2006а]. У некоторых видов, включая крупный рогатый скот [Goto К. et al., 1990], свиней [Probst S. et al., 2003] и крыс [Hirabayashi М. et al., 2002], потомство от оплодотворения эпидидимальным семенем было получено в результате интрацитоплазматической инъекции. Однако достижения технологии и знания, накопленные в области репродуктивной анатомии,: позволили исследователям получать, криоконсервировать и использовать для получения потомства не полностью созревшие сперматозоиды. Впервые строение эпидидимиса было описано в XVII веке, однако первые эксперименты с живыми эпидидимальными сперматозоидами были проведены только в начале XX века, показавшие, что сперматозоиды в проксимальном участке эпидидимиса неподвижны, в то время как сперматозоиды из дистального участка - полностью подвижны. Было проведено множество исследований эпидидимального семени различных видов млекопитающих. Образцы эпидидимального семени были получены из семенников после лабораторной эвтаназии [Hamilton D.W. et al., 1970; Perez-Sanchez F. et al., 1996], убоя [Kundu C.N. et al., 2000; Kaabi M. et al, 2003], селекционного отстрела в диких стадах [Herold F. С. et al., 2004а,b] или методом кастрации живых животных [Hewitt D. A. et al., 2001; Сагу J. А. et al., 2004].

При замораживании эпидидимальных сперматозоидов животных семейства Bovidae используются среды с глицерином, такие как среда БЭКС: лактоза (Юг), Ca комплексонат ЭДТА (0,6г), глицерин (4 мл), желток куриного яйца (5мл), антибиотик спермосан 30000 ЕД, дистиллированная вода (100 мл), или лактоза (11,5г), глицерин (6 мл), ЖКЯ (20 мл), спермосан

50000 ЕД, дистиллированная вода (100 мл) Трис-цитрат-фруктозо-желточный разбавитель.

Эиидидимис млекопитающих выполняет две основные функции. Во-первых, он образует уникальную микросреду, которая способствует превращению неподвижных, незрелых тестикулярных сперматозоидов в полностью способные к оплодотворению клетки, и, во-вторых, сохраняет фертильные сперматозоиды в жизнеспособном состоянии внутри хвоста эпидидимиса и области семяпровода до момента эякуляции. Процесс созревания сперматозоидов в эпидидимисе хорошо освещён в литературе, и значительные многолетние усилия были посвящены изучению вовлеченных в это явление процессов. Особое внимание было сконцентрировано на морфологии и секреторной активности эпителиальных клеток, выстилающих канал, состав эпидидимальной жидкости и его влияние на сперматозоиды, также как и детальное описание моделируемых процессов в плазматической мембране сперматозоидов, нуклеопротеинах, акросоме, которые связаны с приобретением оплодотворяющей способности. Благодаря абсорбции жидкости, поступающей из rete testis, в эпидидимисе изменяется величина сперматокрита. В эпидидимисе сперматозоиды находятся в жидкости (эпидидимальной плазме), заполняющей просвет канала придатка семенника. Эта жидкость образуется из секреции rete testis, изменяясь и абсорбируясь затем эпидидимальным эпителием. По данным Jindal S.K. [1984], Levine, N. and Marsh D.J. [1971], в результате существенной резорбции жидкости в проксимальном участке эпидидимиса концентрация сперматозоидов возрастает в 10 и более раз по сравнению с rete testis. У козлов при транзите через эпидидимис абсорбируется около 94% жидкости, поступающей из rete testis. С повышением концентрации сперматозоидов и потерей жидкости повышается и концентрация специфических веществ, синтезируемых эпидидимальным эпителием и поступающих с жидкостью из rete testis -факторов, способствующих созреванию сперматозоидов. Абсорбция в проксимальном участке запускает Процесс созревания сперматозоидов,

достигающий максимального развития в дистальном участке тела и/или в проксимальном участке хвоста придатка семенника. Длительность выживания сперматозоидов в хвосте эпидидимиса в зависимости от вида животного варьирует от нескольких дней до нескольких недель. Комбинация уникальной внутренней среды в просвете канала эпидидимиса и пониженной температуры в мошонке млекопитающих считается главным фактором выживаемости сперматозоидов. Считается так же, что необходимость сохранять некоторое время сперматозоиды перед эякуляцией была главной движущей силой в развитии мошонки. Примечательно, что выживаемость и фертильность сперматозоидов, инкубируемых вне хвоста придатка, измеряется скорее в часах, чем в днях.

• Один из самых важных факторов, влияющих на морфологию тестикулярных сперматозоидов - это эпидидимальное созревание. Рассматривая морфологические аномалии сперматозоидов, полученных из эпидидимиса, можно отметить снижение процента сперматозоидов с морфологическими аномалиями головки и хвоста в 2-3 раза. Причиной этого явления может являться избирательный фагоцитоз в эпидидимисе.

Эпидидимальные сперматозоиды имеют некоторые отличия от эякулированных. Наиболее заметное - наличие у эпидидимальных сперматозоидов цитоплазматической капельки, которая может быть локализована по всей длине средней части сперматозоида. Таким образом, чем дальше расположена цитоплазматическая капелька от головки, тем выше степень зрелости сперматозоида. Цитоплазматическая капелька была впервые описана Retzius in 1909 [Cooper Т. G., 2005]. Цитоплазматическая капля - это остаток цитоплазмы от сперматиды, отпадающая при попадании сперматозоида в плазму семени [Harayama Н. et al., 1996; Cooper Т. G., 2005; Holstein A., 1976]. Помимо различий в строении, существуют различия в метаболизме эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов. По сообщению Lardy, Н. A. and D. Ghosh. [1952], дыхательная активность эпидидимальных сперматозоидов значительно ниже таковой у

эякулированных, следовательно, они лучше приспосабливаются к окислительному способу использования энергии.

Предшествующие исследования показали, что эпидидимальные сперматозоиды менее восприимчивы к холодовому шоку [Lasley J. F. et al., 1944; Bialy G. et al., 1959]. Вдобавок, Barrios B. et al. [2000] в опытах на баранах показал, что белки плазмы семени вызывали обратное развитие явления холодового шока. Так же важен участок, из которого получены сперматозоиды. Эти незначительные, но очевидные различия могут относиться к окружающей сперматозоиды среде - жидкости, в которой они локализованы (плазма семени или эпидидимальная жидкость). В эпидидимальной жидкости присутствует множество защищающих эпидидимальные сперматозоиды факторов, механизм действия которых ещё не изучен. Плазма семени выполняет определённые физиологические функции. Она косвенно способствует инициации капацитации [Therien I. et al., 1999], в экспериментах и in vitro её компоненты защищают мембраны сперматозоидов от негативного воздействия факторов внешней среды и изменений температур [Arangasamy A. et al., 2005]. В плазме семени присутствует множество компонентов, включая лимонную кислоту, эрготионин, фруктозу, глицерилфосфорилхолин, сорбитол, аскорбиновую кислоту, различные аминокислоты, пептиды, протеины, липиды, жирные кислоты и множество ферментов [Garner et al., 2000]. Существуют видовые различия в химическом составе семенной жидкости, обусловленные размерами и наличием различных придаточных желез половой секреции. Мнение ученых о том, защищает или нет плазма семени сперматозоиды, неоднозначно, по этой тематике существуют противоположные теории. Например, по сообщению Hori Т. et al. [2005], при сборе эпидидимального семени в секрет простаты собак, в результате наблюдается меньшее число сперматозоидов с цитоплазматической каплей. Также в экспериментах по криоконсервации на собаках у эпидидимальных сперматозоидов, помещённых в секрет простатической железы, оказалась более высокая

выживаемость и подвижность по сравнению с эпидидимальными сперматозоидами, не контактировавшими с простатическим секретом. Сходные результаты были получены и при криоконсервации эпидидимального семени благородного оленя [Martinez-Pastor F. et al., 2006а].

Необходимо также подчеркнуть ещё некоторые физиологические особенности эпидидимальных сперматозоидов, пребывающих в неподвижном состоянии и имеющих, в отличие от эякулированных, низкую метаболическую активность. Клетки с низким метаболизмом должны лучше выдерживать криоконсервацию, однако большинство сред инициируют активацию сперматозоидов, отсюда возникает необходимость разработки специальных ингибирующих сред. Лишенные семенной плазмы эпидидимальные сперматозоиды могут быть более уязвимы для перекисного окисления липидов по сравнению с эякулированными.

Было проведено множество исследований, направленных на оценку эффективности получения эпидидимального семени от различных домашних и диких видов животных при жизни или после их смерти и дальнейшего сохранения сперматозоидов при температуре 4-5°С, -10°С, -196°С. Во всех случаях наблюдалось снижение основных характеристик до и после сохранения [Foote R.H:, 2000; Anel L. et al., 2000; Blash S. et al., 2000; Kilian I. et al., 2000; Lübbe K. et al, 2000; Soler A.J. et al., 2003; Martinez-Pastor F. et al., 2005; Dong Q. et al., 2008; Uttam Datta et al., 2009].

Необходимо отметить, что эпидидимальные сперматозоиды, полученные из придатков семенников козлов после убоя животных, по основным показателям (подвижность, процент живых сперматозоидов и целостность акросом) до и после замораживания/оттаивания не уступали эякулированным и были пригодны для оплодотворения in vitro и для искусственного осеменения [Blash S. et al., 2000].

2.6. Методы получения эпидидимального семени

Для получения эпидидимального семени используются различные методы. В нашей стране первые опыты по решению этой проблемы проводились ещё в начале прошлого века основоположником искусственного осеменения И. И. Ивановым, разработавшим технику искусственного оплодотворения сперматозоидами в искусственной среде. Сперматозоиды были получены путём предварительной кастрации или путём вырезывания семенника из трупа/туши, затем эпидидимальное семя выделялось тремя способами:

-высасыванием их через vas deferens с помощью высасывающего

насоса;

-путём надреза канальцев и собирания хирургической ложечкой белой массы, сплошь состоящей из сперматозоидов и выступающей на поверхности túnica albugínea;

-придаток может быть просто измельчён в соответствующей жидкости.

В качестве разбавителя Иванов пользовался «раствором одной или нескольких минеральных солей (NaCl, углекислый натр, двууглекислый натр, Локковская жидкость - 1л дистиллированной воды, СаС12 - 0,24; КС1 - 0,48; ЫаНСОЗ - 0,2; NaCl - 9,0; Saccharum uvicum - 1,0)».

Позднее при работе по созданию гибридов домашних овец и архара (архаромеринос) был предложен усовершенствованный способ. Способ получения семени из хвостов придатков (эпидидимиса) состоял в следующем: придаток семенников омывался разбавителем или физиологическим раствором, затем разрезались наружные и внутренние оболочки придатка, оболочки отделялись от семенных трубочек придатка, которые разрезались в разбавителе (объём его заранее измерялся) на мелкие кусочки, сперматозоиды вытекали, и всё это фильтровалось через вчетверо сложенную марлю, предварительно смоченную 1 куб. см разбавителя.

Отпрепарировнный измельченный извитой канал хвоста эпидидимиса помещали вместе с синтетической средой на поверхность стеклянного фильтра (диаметр пор 100-120 мк), вставленного через резиновый уплотнитель в стеклянную пробирку с боковым ответвлением, к которому посредством резиновой трубки присоединялся шприц Жане. Разрежение, создаваемое поршнем шприца, вызывало продвижение сперматозоидов вместе со средой через фильтр. Оставшиеся на фильтре частицы извитого канала дополнительно промывали 10 мл среды и повторяли отсос, что обеспечивало отделение всего запаса сперматозоидов из эпидидимиса.

На сегодняшний день можно выделить несколько основных современных методов получения эпидидимального семени:

Классическая методика получения эпидидимального семени животных включает в себя: отбор семенников; препарирование эпидидимиса; получение содержимого эпидидимиса; выделение сперматозоидов по фракциям: хвост придатка отделяют от семенника и осторожно освобождают от оболочек и кровеносных сосудов, оставляя чистый клубок извитого канала эпидидимиса, заполненного сперматозоидами. Через надрезы канальцев эпидидимиса получают первую фракцию. Для получения второй фракции извитой канал измельчают ножницами, получившуюся массу смешивают со средой и фильтруют через стеклянный фильтр.

Первый метод заключается в измельчении эпидидимиса в специальной среде. В среде сперматозоиды отделяются от измельченных тканей, их собирают с помощью пипетки или методом фильтрации [Songsasen N. et al, 1998; An Т. Z. et al., 1999; Hewitt D.A. et al., 2001]. Этим методом обычно пользуются при получении сперматозоидов от мелких животных, так как из-за малых размеров эпидидимиса различные манипуляции с ним затруднительны [Martinez-Pastor F. et al., 2005а].

Второй метод - метод прокола или разреза. При использовании первого и второго метода от эпидидимиса отделяется большая часть соединительной ткани и поверхностных кровеносных сосудов. Эпидидимальный проток либо разрезается скальпелем, либо прокалывается иглой. Затем из эпидидимиса извлекается максимально возможное число сперматозоидов. И вновь эпидидимис помещают в специальную среду, которая насыщается сперматозоидами, выходящими из тканей придатка. Насыщенная сперматозоидами среда собирается с помощью пипетки или фильтра [Bissett С. et al., 2005; Harshan Н. М. et al., 2005]. Недостатком этих двух методов является необходимость центрифугирования сперматозоидов с целью удаления крови и остатков эпидидимальной ткани из полученных образцов после сбора семени [Harshan Н. М. et al., 2005; Suzuki К. et al., 2003]. Центрифугирование может являться причиной структурного повреждения акросом [Mack, S.R. et al., 1987], снижения подвижности [Alvarez, J.G. et al., 1993], индукции ферментативной активности сперматозоидов [Benau D. A. et al., 1987], что снижает оплодотворяющую способность.

Третий метод - ретроградное промывание - применялся у хряков [Lasley J. F. et al., 1944], жеребцов [Bruemmer, J. E.et al., 2002], африканского буйвола [Herold F. C. et al., 2004a,b], благородного оленя [Martinez-Pastor F. et al., 2006с]. Основная идея обратного промывания - продвижение эпидидимальных сперматозоидов в направлении, противоположном их естественному направлению продвижения в канале придатка. С помощью иглы или трубочки небольшого диаметра, прикреплённой к шприцу и вставленной в семяпровод, воздухом или специальной средой выталкивают сперматозоиды через маленький разрез дистальной части хвостового участка эпидидимиса. На примере благородного оленя было доказано, что наиболее предпочтительным из вышеперечисленных методов является промывание, так как снижается степень загрязнения и повышается качество получаемой спермы [Martinez-Pastor F. et al., 2005а]. По мнению авторов, правильное

проведение промывания обеспечивает большее число полученных сперматозоидов, чем метод измельчения эпидидимиса. Gerber, D. et al. [2001] так же установили, что метод отмывания является приемлемым для работы в полевых условиях при получении эпидидимального семени от африканского буйвола. В противоположность этому, в опытах на жеребцах Сагу J. А. et al. [2004] показал, что при использовании метода промывания и модифицированного метода измельчения - флотационного метода - не наблюдалось различий в концентрации сперматозоидов, общей и прогрессивной подвижности или морфологии перед замораживанием.

В настоящее время для получения и изучения эпидидимального семени в основном используют биоматериалы, полученные от убитых или кастрированных животных [Lasley, J. F. and R. Bogart. 1944], при этом невозможно проводить повторяющиеся наблюдения над эпидидимальным семенем от одного животного, и трудно сравнивать эпидидимальное и эякулированное семя, полученное от одного животного.

Такая проблема может быть решена с помощью фистулы семяпровода одного из семенников, так что при электрической стимуляции эякулированные сперматозоиды могут быть получены из пениса, а эпидидимальные - через фистулу. В Японии были проведены исследования по получению эпидидимальных сперматозоидов быков через фистулу эпидидимиса. В течение 2-х недель после операции эпидидимальное семя выделялось в объёме 0,3-0,8 мл; 1,38-2,15 млрд. клеток/мл/день, подвижность сперматозоидов снижалась. Через 6 недель после операции выделение семени снизилось до уровня 0,26 млрд. клеток/мл/день. Фистула перестала функционировать на 48 день после операции. Однако недостатком данного метода является необходимость травмирования тканей эпидидимиса, что может повлиять на процессы естественного созревания сперматозоидов.

[Ishii К. and Morita Z., 1992; Deutscher, G. H. et al., 1974], Рядом исследователей были проведены исследования по получению эпидидимального семени через фистулу эпидидимиса быков. Подобная

технология была разработана на баранах. В асептических условиях животные под общей анестезией были зафиксированы в дорсо-вентральном положении, оперативный доступ осуществлялся на задней поверхности шейки мошонки. После разреза кожи послойно рассекали ткани мошонки и общую влагалищную оболочку. При вскрытии последней в рану выступает семенной канатик, на медиальной поверхности которого расположен семяпровод, дифференцируемый от кровеносных сосудов как извилистый голубовато-белый тяж, через разрез которого и может быть установлен катетер.

Также были разработаны хирургические способы получения тестикулярных и эпидидимальных сперматозоидов козлов, пони, быков и хряков с целью изучения физиологии семенников, количественных и морфометрических показателей сперматозоидов [КаШ 8., 1977].

Таким образом, представляется возможным дальнейшее усовершенствование технологии получения и замораживания эпидидимального семени, повышение морфо-функциональных параметров эпидидимальных сперматозоидов после замораживания-оттаивания (общая подвижность, прямолинейно-поступательное движение, сохранность акросом и, как результат, оплодотворяющая способность) путём подбора компонентов для криопротективных сред и модификации их состава, позволяющей снизить токсическое действия самих криопротекторов на эпидидимальные сперматозоиды.

Примечательно, что эпидидимальное семя используется в основном при криоконсервации генетического материала от редких и исчезающих видов животных, поскольку получение эякулята в таких случаях затруднительно.

Создание криобанков генетического материала редких, уникальных и исчезающих видов животных - одна из наиболее актуальных задач современной криобиологии, в сельском хозяйстве генетические материалы таких криобанков находят широкое применение, в частности - в создании новых селекционных форм путём межвидовой гибридизации.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2007-2011гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии. Исследования выполнены по следующей схеме (рис.3).

В экспериментах для получения эякулированого и прижизненнополученного эпидимального семени от домашних козлов и их гибридов с сибирским козерогом использовали только клинически здоровых животных в возрасте 12 месяцев и старше. Животных кормили в соответствии с нормами ВИЖ.

Для получения семени использовали гибридных козлов первого поколения (п=2), второго поколения (п=3), чистопородных: зааненских (п=8), нубийских (п=4), оренбургских (п=3). Принципиальная схема получения гибридного потомства приведена на рис.4.

3.1. Получение эякулированного семени

Эякулированное семя получали методом электроэякуляции и на искусственную вагину, в которой создавались условия, необходимые для проявления рефлекса эякуляции (давление, температура и скольжение).

Для получения спермы также использовали электроэякулятор ттйиЬе е 320, имеющий биполярный электрод для введения в прямую кишку. Предварительно животному вводят небольшое количество седативных препаратов. Электрические импульсы, вырабатываемые электродом, воздействуют на срамной и наружный семенной нерв и гладкую мускулатуру половых органов. Гладкие мышцы сокращаются, вызывая эякуляцию.

Биотехнологические методы получения и криоконсервации

семени самцов рода Сарга

^шшшш

Прижизненное получение эпидидимального семени (Катетеризация семяпровода)

Получение эякулированного семени

■мвмакнбЯЕ

lili

В Ш SÍÜ

Сравнительная оценка биологической полноценности сперматозоидов, полученных разными методами

JBk

Морфо-физиологическая оценка сперматозоидов

Комплексная оценка сперматозоидов с использованием CASA

Характеристика семени до и после криоконсервации

■ ■ ,, - .

Создание криобанка генетического материала рода Сарга

■Нн

—

Искусственное осеменение коз замороженно-оттаянным семенем

Получения межвидовых гибридов разных генераций

Js___ _JL

Сравнительный цитогенетический анализ исходных видов и гибридов

Изучение биологических особенностей межвидовых гибридов

Рис. 3 Схема исследований

Оттаивание спермы

Получение спермы

Искусств енное осеменение

Получение потомства

Криоконсерв ация спермы

Рис. 4 Схема получения гибридных животных

3.2. Определение количественных и качественных показателей сперматозоидов.

Определение количественных и качественных показателей образцов семени проводили с помощью компьютерного анализа (computer-assisted semen analysis - CASA): определение концентрации и подвижности сперматозоидов проводили с помощью программы Видеотест Зоосперм.

3.2.1. Определение подвижности сперматозоидов

Образец семени помещали под покровное стекло предварительно нагретой до 37°С микроклеточной счетной камеры Маклера и исследовали под микроскопом с нагревательным столиком при увеличении * 200. Подвижность -наиболее характерное свойство сперматозоида и осуществляется с помощью равномерных ударов хвоста путём вращения вокруг собственной оси по направлению часовой стрелки. Скорость сперматозоида достигает 10-50 микрон в секунду. Сперматозоиды по подвижности классифицируют по категориям (А), (В), (С), (D).

A) с прямолинейным поступательным движением. Скорость сперматозоидов при 37°С превышает 25мкм/сек., что приблизительно соответствует длине 5 головок или половине длины хвоста сперматозоида;

B) с медленным прямолинейным движением (скорость сперматозоидов составляет менее 25мкм/сек.);

C) с манежным или колебательным движением;

D) неподвижные сперматозоиды.

3.2.2. Определение концентрации сперматозоидов в камере Маклера

При высокой подвижности сперматозоидов, их предварительно обездвиживали путём переноса части образца на 5 мин в водяную баню 50-60 °С. Каплю хорошо перемешанного предварительно прогретого образца помещали на предметное стекло камеры и накрывали покровным стеклом.

Подсчёт сперматозоидов в квадратах сетки проводили аналогично подсчёту кровяных клеток в гемоцитометре.

При высокой концентрации сперматозоидов их число подсчитывали в полоске из 10 квадратов. Данная величина является концентрацией сперматозоидов млн/мл. Для определения среднего значения подсчёт повторяли ещё в 1-2 полосках из 10 квадратов. Для повышения достоверности оценки проводили подсчёт в 2-3 каплях одного и того же образца. В случае низкой концентрации, количество сперматозоидов подсчитывали внутри сетки. В этом случае, умножая полученное число на 106, находили значение концентрации сперматозоидов в мл.

Определение концентрации сперматозоидов также проводили с помощью программы Видеотест Зоосперм. Для этого увеличение микроскопа настраивали таким образом, чтобы в поле зрения оказалось 10 квадратов (под увеличением микроскопа х200), и автоматически определяли количество сперматозоидов (полученное число является концентрацией сперматозоидов млн/мл).

3.2.3. Морфологическая целостность акросом.

Процент интактных (неповреждённых) акросом определяли методом дифференциального окрашивания (Diff Quick набор) - азур 2 и эозин,

Окраску проводили по нижеследующей методике:

1. Высушенный мазок семени фиксировали в метаноле

2. На зафиксированный мазок на 45 мин наносили эозин (розовый)

3. После удаления красителя эозина наносили на 45 мин азур 2 (синий)

4. Окрашенный мазок промывали в буферном растворе (рН 6,8-7,2)

5. Мазок высушивали и микроскопировали.

Рис. 5. Дифференциально окрашенные сибирского козерога второго поколения, сперматозоиды с разрушенной акросомой.

сперматозоиды Стрелками

гибрида указаны

В окрашенных мазках подсчитывали количество сперматозоидов с интактными акросомами, учитывая не менее 100 сперматозоидов в 20 полях зрения под увеличением х200 (рис. 5). Оценивали целостность акросом, окрашенных розовым цветом.

3.2.4. Оценка переживаемости сперматозоидов.

Переживаемость сперматозоидов оценивали после оттаивания при 37°С. Для этого семя после размораживания в цитрате натрия или в специальном разбавителе ставили на инкубирование в термостат или водяную баню при 37°С. Через каждый час в течение трех часов проводили анализ подвижности сперматозоидов. Показателем высокой криоустойчивости является результат, когда через 3 часа культивирования при 37°С наблюдается не менее 30% сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением.

3.3. Методика разбавления и криоконсервации сперматозоидов

Эпидидимальное и эякулированное семя перед замораживанием разбавляли соответствующей криопротективной средой. Для приготовления сред использовались только химически чистые компоненты. Все криопротективные среды готовили ex tempore, проводили постепенное разбавление, таким образом, избегая негативного эффекта разбавления (dilution effect).

Для разбавления эякулированного семени козлов использовали среды, содержащие лактозу, трис, лимонную кислоту, глицерин. Образцы разбавляли одноступенчатым методом.

Для разбавления эпидидимального семени в состав модифицированной лактоза, трис, лимонная кислота, глицерин среды дополнительно был включен бычий сывороточный альбумин (ВSA). Образцы разбавляли одноступенчатым методом.

После разбавления семя в течение 2-4 часов подвергали эквилибрации при температуре +2 +4°С, необходимой для проникновения криопротективных агентов во внутриклеточное пространство сперматозоидов.

Разбавленное семя замораживали в парах жидкого азота на фторопластовой пластине в течение 2-х минут, затем фторопластовую пластину с гранулами погружали в жидкий азот, гранулы объёмом 0,25 мл переносили в алюминиевые тюбы и погружали в жидкий азот на хранение. Криоконсервированные образцы семени хранили в сосудах Дьюара при температуре - 196°С.

3.4. Методика искусственного осеменения коз

При проведении настоящих исследований было осеменено 12 голов коз, из них 7 - зааненской породы и 5 голов гибридных коз первого поколения, получены 15 козлят второго поколения.

Искусственное осеменения коз проводили замороженно-оттаянными сперматозоидами визоцервикальным методом. Для этого выбирали самок в состоянии половой охоты (эструса) с помощью козла-пробника или визуально по следующим признакам:

1. Наружные половые органы козы припухают и приобретают розовый или красный цвет.

2. Коза ведет себя неспокойно и часто блеет.

3. Коза постоянно крутит хвостом или двигает им из стороны в сторону.

4. Влагалищные выделения обычно густые и непрозрачные в начале охоты, жидкие и чистые во время охоты, густые и белые в конце охоты.

Для осеменения коз спермой, замороженной в гранулах, использовали специальный катетер для осеменения коз. Перед использованием катетер стерилизовали.

Перед осеменением проводили влажную обработку наружных половых органов и прилегающих к ним поверхностей хвоста тампоном, смоченным физраствором. Сухим тампоном насухо обрабатывали наружные половые органы (рис. 6 ).

Рис. 6 Обработка наружных половых органов козы перед осеменением

Для осеменения животных фиксировали под углом 35-40°. Если осеменение проводили непосредственно в стойле, животное фиксировали вручную. С этой целью помощник фиксировал животных путем поднятия задних конечностей, чтобы животное стояло под углом 35-40°. При осеменении следует избегать сильного шума, яркого света. После фиксации животного смазывали кончик стерильного вагинального зеркала неспермицидной смазкой и вводили его во влагалище (рис. 7). Использовали зеркало с освещением.

В зависимости от степени проходимости шейки матки возможно три варианта осеменения: (1) внутриматочное осеменение; (2) в шейку матки, если невозможно преодолеть все складки шейки матки; (3) вагинальное осеменение. Эффективность последнего очень низкая, но его использовали, когда не было возможности проникновения в шейку матки.

Рис. 7 Введение шприца - катетера со спермой

После введения влагалищного расширителя осторожно вводили шприц-катетер со спермой. Нажатием на поршень осуществляют введение спермы. При надлежащем выполнении процесс осеменения занимал не более 30 секунд.

После осеменения все инвентарь и инструменты подвергали санитарно-гигиенической обработке, одноразовые инструменты утилизировали.

Во избежание любой стрессовой ситуации животных в течение 12 часов находились в спокойной обстановке. До диагностики сукотности животных содержали отдельно от самцов.

3.5. Методика цитогеиетического исследования

Цитогенетические исследования выполнены на домашних козах и их гибридах первого и второго поколения с сибирским козерогом. Препараты хромосом получали из культуры лимфоцитов периферической крови по общепринятой схеме [Графодатский A.C., и др., 1988] с рядом внесенных модификаций [Кленовицкий П. М. и др, 2007].

Кровь в количестве 5-10 мл брали из яремной вены в стерильную одноразовую пробирку, содержащую гепарин. Время хранения при 4-8°С с момента взятия до постановки культуры не должно превышать 1,5 суток. Для культивирования использовали плазму с лейкоцитами. С целью их выделения, в силу низкой СОЭ у коз, кровь центрифугировали 10 мин. при 100g.

Лимфоциты культивировали в среде RPMI 1640 (ПанЭко). Культуральную среду для всех образцов готовили в общем объеме, исходя из расчета 8 мл на образец.. В среду добавляли конканавалин А (ПанЭко, Россия) из расчета 10 мкг на мл культуры и антибиотик-антимикотик (Sigma) в соотношении 1:100. Митоген разводили на стерильной дистиллированной воде. Готовую среду разливали в 50 мл пластиковые флаконы по 8 мл. В каждый флакон добавляли по 2 мл плазмы с лимфоцитами. Флаконы с культуральной смесью помещали в термостат при температуре 37,5°С на 71 час. На 68 часу

вводили 0,3 мкг колхицина (ПанЭко) на 1 мл культуры. На рис.8 показан общий вид культуры лимфоцитов коз.

Рис.8 Культура лимфоцитов козы, стимулированная к росту коиканавалином А

Дальнейшие обработки, приготовление и окраску препаратов осуществляли в соответствии с общепринятыми методами. Для получения и записи изображений хромосом использовали систему Image Scope 1, фирмы Системы для микроскопии и анализа (СМА) Москва, институт кристаллографии РАН.

Материалы проведённых исследований обработаны статистически с использованием стандартного пакета программ для персонального компьютера.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1. Модификация криопротективных сред

При приготовлении криопротективных сред были использованы базовые компоненты, хорошо зарекомендовавшие себя как защитные факторы в работе со сперматозоидами жвачных животных, в том числе козлов.

В качестве неэлектролита была использована лактоза. Этот дисахарид обладает высокими антиоксидантными свойствами и способен особо прочно связывать свободную воду. При добавлении Сахаров, не способных проникнуть сквозь плазматическую мембрану, таких как лактоза, сахароза, раффиноза, трегалоза или декстраны, создаётся осмотическое давление, вызывая обезвоживание клетки и предотвращая формирование внутриклеточных кристаллов льда. Эти сахара взаимодействуют с фосфолипидами плазматической мембраны, реструктуризуя её и лучше приспосабливая сперматозоиды к процессу криоконсервации. В отличие от простых Сахаров (глюкоза, фруктоза), эти дисахариды выступают в первую очередь как криопротекторы.

В качестве электролитной части среды использовали трис-цитратный буфер (трис(оксиметил)аминометан основание), поддерживающий устойчивую концентрацию водородных ионов при охлаждении семени за счет сопряженного подавления констант диссоциации трис-катиона и

основных анионов. '

Сперматозоиды млекопитающих, полученные непосредственно из эпидидимиса не обладают оплодотворяющей способностью, до тех пор, пока не претерпевают комплекс определённых изменений [Neill J.M et al., 1987; Fraser, LR. 1985; Dow, M.P.D. et al 1989; Parrish J.J. et al., 1986, 1988, 1989; van Kooij, R.J. et al., 1986; Kusunoki H., 1989; Bavister B.D. et al, 1978; Ward C.R. et al., 1984; Stewart-Savage, J. 1993], определяемых как капацитация [Austin C.R., 1951; Bracken B.G., 1975, 1982, 1984, 1989; Chang M.C., 1951].

Сперматозоиды, для консервации которых использовали среды с BS А (бычий сывороточный альбумин), по литературным данным, характеризуются более высокой выживаемостью, повышенной способностью активировать ооциты после ICSI и сохранять их способность к развитию дольше, чем сперматозоиды, сохранённые в среде без В SA. Благодаря присутствию BS А в среде для консервации сперматозоидов, они не только сохраняют способность к капацитации, но и удлиняется период, в течение которого сперматозоиды могут находится при температурах, оказывающих негативное влияние [Nguyen V.T. et al., 2005 Song F., 1985]. В связи, с чем в модифицированную среду для криоконсервации эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов козлов, нами был введён бычий сывороточный альбумин (В SA) препятствующий агглютинации головок сперматозоидов, обеспечивают отток холестерина из мембран сперматозоидов и играющий важную роль в инициации капацитации.

Состав использованных нами в работе криопротективных сред приведён в таблице 1.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Воеводин, Владимир Александрович

5. ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый метод прижизненного получения эпидидимальных сперматозоидов с использованием фистулы семяпровода, позволяющий одновременно получать и оценивать качество эпидидимального и эякулированного семени одного и того же самца.

2. Установлено, что эпидидимальные сперматозоиды козла, полученные методом катетеризации семяпровода, имеют высокую биологическую полноценность до и после криоконсервации. Подвижность, целостность акросом и количество морфологически нормальных клеток после оттаивания составили 45%, 75% 85%, соответственно. У эякулированных сперматозоидов подвижность, целостность акросом и количество морфологически нормальных клеток после оттаивания составили 33,4%, 65,6%, 78% соответственно.

3. Разработанная модифицированная среда позволяет повысить криоустойчивость как эпидидимальных, так и эякулированных сперматозоидов, подвижность эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов увеличилась на 8% и 21%, а сохранность акросом - на 8% и 5,6% соответственно.

4. Разработанный метод отделения плазмы эякулированного семени козлов с помощью фильтрации через фильтр Сатео25А8 с диаметром пор 45нм, позволяет повысить подвижность сперматозоидов, сохранность акросом и количество морфологически нормальных клеток в замороженно-оттаянном семени на 27,1%, 8,3% и 8%) соответственно.

5. Создан уникальный криобанк семени заанеской, нубийской, оренбургской пород коз и гибридов сибирского козерога с зааненской породой, позволяющий рационально использовать генофонд домашних и диких коз при создании новых селекционных форм.

6. Кариотипирование животных исходных видов и гибридов с использованием компьютерных программ показали что, разные представители рода Сарга характеризуются высоким сходством хромосомного набора. Цитогенетический анализ всех обследованных животных показал соответствие их видовой норме.

7. Гибриды второго поколения превосходят своих аналогов по высоте в холке на 12,5%, в крестце на 13,6%, косой длине туловища 24,8%, по обхвату и глубине груди на 11,2% и 21,7% соответственно.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1.В качестве альтернативного постмортальному методу получения эпидидимального семени животных рекомендуем использовать прижизненное получение эпидидимального семени с использованием фистулы семяпровода

2. Для повышения эффективности криоконсервации сперматозоидов козлов рекомендуем использовать модифицированную среду, улучшающую биологическую полноценность сперматозоидов.

3. Предлагаем для отделения плазмы семени козлов при криоконсервации в разбавителях, содержащих желток куриного яйца, использовать метод мембранной фильтрации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Воеводин, Владимир Александрович, 2012 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Багиров В.А., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М., Лесин С.А., Воеводин В.А., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Калашников В.В., Солошенко В.А. Сохранение и рациональное использование генофонда животных // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2009. № 2. С. 37-40.

2. Багиров В.А., Кленовицкий П.М., Насибов Ш.Н., Иолчиев Б.С., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. Цитогенетический анализ при отдаленной гибридизации полорогих // Достижения науки и техники АПК. 2009. № 8. С. 41-43.

3. Багиров В.А., Кленовицкий П.М., Насибов Ш.Н., Иолчиев Б.С., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Гусев И.В., Кононов В.П. Рациональное использование генетических ресурсов и гибридизация в козоводстве Сельскохозяйственная биология, 2009, №6, с. 27-33.

4. Боголюбский С.Н. Происхождение и преобразование домашних животных. - М.: Советская наука. - 1959. - 600 с.

5. Графодатский A.C., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных животных. Атлас. Новосибирск: Наука.. 1988. 284 с,

6. Дзуев Р.И. Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа. Нальчик: Эльбрус. 1998. 256 с.

7. Захаров-Гезехус И.А.; Столповский Ю.А.; Уханов C.B.; Моисеева И.Г.; Сулимова Г.Е. Мониторинг генофондов популяций животных в связи с задачами селекции и изучением филогении [Сельскохозяйственные животные]. М.: Рос. акад. наук. 2007. С. 122-124

8. Кулиев Г.К., Мамедов О.Т. Изучение кариотипов копытных животных Азербайджана// Материалы Всесоюзного симпозиума. Систематика и цитогенетика млекопитающих. М. 1975. - С.37-39.

9. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных // М: Сельхозгиз, 1962, с. 659

Ю.Мишарев С.С. Козоводство. М.: Сельхозиздат. 1963. 198 с.

П.Насибов Ш.Н., Багиров В.А., Кленовицкий П.М., Иолчиев Б.С., Зиновьева Н.А., Воеводин В.А., Амиршоев Ф.С. Генетический потенциал дикой фауны в создании новых селекционных форм // Достижения науки и техники АПК. 2010. № 8. С. 59-62.

12,Овайдис Р.Н., Соколовская И.И., Абилов А.И. Морфология гамет самцов сельскохозяздравохранения и животноводства // М.: Наука, 1984, с. 144-148

13.Орлов В.Н., Булатова Н.Ш. Сравнительная цитогенетика и кари-осистематика млекопитающих. М.: Наука. 1983. 405 с.

14.Соколовская И., Ойвадис Р., Абилов А. и др. О значении акросомы в оценке семени самцов // Животноводство, 1981, № 9. С.45-46.

15.Aamdal J. Artificial insemination in goats with frozen semen in Norway // Proc. 3rd Int. Conf. Goat Prod. Disease, 1982, Tucson, AZ, USA, p. 149-152.

16.Adalsteinsson S., Sponenberg D.P., Alexieva S., Russel A. J. F. Inheritance of colour at goats // The Journal of Heredity. 1996. V. 85. №2. P.262-272.

17.Akusu M.O., Agiang E.A., Egbunike G.N. Ejaculate and plasma characteristics of west African Dwarf (WAD) buck // 10th Int Congr. Anim. Reprod. A.I., 1984, Illinois, 2, Abstract № 50.

18.Alvarez, J. G., J. L. Lasso, L. Blasco, R. C. Nunez, S. Heyner, P. P. Caballero, and В. T. Storey. Centrifugation of human spermatozoa

induces sub lethal damage; separation of human spermatozoa from seminal plasma by a dextran swim-up procedure without centrifugation extends their motile lifetime. // Hum. Reprod., 1993. 8:1087-1092.

19.Amann, R.P., J. F. Hokanson, and J. O. Almquist. Cannulation of the bovine ductus deferens for quantitative recovery of epididymal spermatozoa. // J. Reprod. Fertil., 1963, 6:65-69.

20.An, T. Z., S. Wada, K. Edashige, T. Sakurai, and M. Kasai. Viable spermatozoa can be recovered from refrigerated mice up to 7 days after death. // Cryobiology 1999, 38:27-34.

21.Anel L, Guerra C, Alvarez M, Kaabi M, Anel E, Boixo JC, Paz P, Martinez F, Herraez P: Basic parameters in spermatozoa recovered post-mortem from the Spanish Cantabrian Chamois (Rupicapra pyrenaica parva). // Theriogenology. 2000; 53(1): 323-332.

22.Arangasamy, A., L. P. Singh, N. Ahmed, M. R. Ansari, and G. C. Ram. Isolation and characterization of heparin and gelatin binding buffalo seminal plasma proteins and their effect on cauda epididymal spermatozoa. // Anim. Reprod. Sci. 2005, 90:243-254.

23.Armstrong U.T., Pfitzner Al., Warnes G.M., Ralph M.M., Seamark E.S. Endocrine responses of goats after induction of superovulation with PMSG and FSH // J Reprod Fertil, 1983, 395-401.

24.Armstrong U.T., Pfitzner A.P., Warnes G.M., Seamark E.S. Superovulation treatments and embryo transfer in Angora goats // J Reprod Fertil, 1983, 403-410.

25.Asdell S. A., and Smith Buchanan A. D. Inheritance of color, beard, tassels and horns in the goat//The Journal of Heredity . 1928. V.19. № 9. P.425-430

26.Austin C.R. Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg. // AustJ Sci Res B 1951; 4:581-589.

27.Azeredo, G.A., Esper, C.R., Resende, K.T. Evaluation of plasma membrane integrity of frozen-thawed goat spermatozoa with or without seminal plasma // Small Rumin. Res., 2001, 41, 257-263.

28.Bailey E., Reid R.C., Skow L.C. Linkage of the gene for equine combined immunodeficiency disease to microsatellite markers HTG8 and HTG4; Synteny and FISH mapping to ECA9 // Animal Genetics, 1997, 28, 268-273.

29.Bardoloi R.K., Sharma P. K. Abnormalities and live spermatozoa in goats // J. Res. Assam Agric. Univ., 1982, 3, p. 102.

30.Bar-Gal G.K., Smith P., Tchernov E., Greenblatt C., Ducos P., Gardeisen A., Horwitz L.K. Genetic evidence for the origin of the agrimi goat (capra aegagrus cretica)// Journal of Zoology. 2002. V. 256. № 3. P. 369-377.

31.Barker C.A. Some aspects of artificial insemination in swine and goats // Proc.lOth Ann. Conv. National Assoc. Artif. Breeders, 1957, Toronto, p. 127-132.

32.Barrios, B., R. Perez-Pe, M. Gallego, A. Tato, J. Osada, T. Muino-Blanco, and J. A. Cebrian-Perez. Seminal plasma proteins revert the cold-shock damage on ram sperm membrane. // Biol. Reprod. 2000, 63:1531-1537.

33.Bartels, P., Y. Friedmann, K. Lubbe, D. Mortimer, L. A. Rasmussen, and R. A. Godke. The live birth of an eland (Taurotragus oryx) calf following estrous synchronization and artificial insemination using frozen thawed epididymal sperm. // Theriogenology 2001, 55:381. (Abstract).

34.Basler K., Oesch B., Scott M., Westaway D., Walchli M., Groth D. F., McKinley M. P., Prusiner S. B., and Weismann C. Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene // Cell, 1986, 46,417-428.

35.Baumung R., Simianer H., Hoffmann I. Genetic diversity studies in farm animals - a survey // J. Anim. Breed. Genet. 2004. Vol. 121. P. 361-373.

36.Bavister B.D., Rogers BJ, Yanagimachi R. The effects of cauda epididymal plasma on the motility and acrosome reaction of hamster and guinea pig spermatozoa in vitro. // Biol Reprod 1978; 19:358363.

37.Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extracts and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster spermatozoa in vitro// Biol Reprod, 1977, 16, 228-237.

38.Bellve A. The molecular biology of mammalian spermatogenesis. In Oxford Reviews of Reproductive Biology.Ed. C.Finn // London. Oxf Univ Press 1979, 159-261.

39.Benau, D. A. and B. T. Storey. Characterization of the mouse sperm plasma membrane zona-binding site sensitive to trypsin inhibitors. // Biol. Reprod. 1987, 36:282-292.

40.Bialy, G. and V. R. Smith. Cold shock of epididymal spermatozoa. // J. Dairy Sci. 1959, 42:2002.

41.Bindon DM, Piper LR, Cahill LP, Driancourt MA. O'Shea T. Genetic and hormonal factors affecting superovulation // Theriogenology 1986; 25:53-70.

42.Bissett, C. and R. T. Bernard. The effect of prolonged cold storage of eland (Taurotragus oryx) cauda epididymides on the spermatozoa: Possible implications for the conservation of biodiversity. Theriogenology 2005, 63:1592-1604

43.Blash, S., D. Melican, and W. Gavin. Cryopreservation of epididymal sperm obtained at necropsy from goats. // Theriogenology 2000, 54:899-905.

44.Bou S, Hanada A. Penetration of zona-free hamster eggs in vitro by ejaculated goat spermatozoa after treatment with ionophore A23187 // Jpn J Anim Reprod 1985; 31(3): 115-116

45.Boue P., Corteel J.M. Aptitude of male goat sperm to withstand freezing: combined effects of season and time of sexual rest between two successive semen collections. In: Recent Advances in Goat Productions, Ed. Lokeshar R.R. // Proc. 5th Int. Conf. on Goats, 1992, New Delhi vol. 2, p. 1042-1045.

46.Bowen, J.A., Fonda, E.S., Kooyman, D.L.,. Ultrastructural study of goat spermatozoa frozen at different diluent osmolalities. // Proceedings of the Western Section, American Society of Animal Science. J. Anim. Sei. 1988 (39) 312-315.

47.Bracken B.G., Keefer C.L., Troop C.G., Donawick W.J., Bennett K.A. Bovine twins resulting from in vitro fertilization // Theriogenology 1984; 21:224.

48.Bracken B.G., Oliphant G. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro // Biol Reprod 1975; 12:260-274.

49.Bracken B.G., Younis A., Fayrer-Hosken R.A. Enhanced viability after in vitro fertilization of bovine oocytes matured in vivo with high concentrations of luteinizing hormone. // Fertil Steril 1989; 52:319-324.

50.Bracken BG, Bousquet D, Boice ML, Donawick WJ, Evans JF, Dressel MA. Normal development following in vitro fertilization in the cow//Biol Reprod 1982; 27:147-158.

51.Bradley R. Prion Diseases // J. Collinge, M. Palmer eds., Oxford, 1997.

52.Bruemmer, J. E., H. Reger, G. Zibinski, and E. L. Squires. 2002. Effect of storage at 5°C on the motility and cryopreservation of stallion epididymal spermatozoa. Theriogenology 58:405-407.

53.Buchanan F.C., Adams L.J., Littlejohn R.P. // Genomics. 1994. Vol. 22(2). P. 397-403.

54.Buckland R.A., Evans H.J., Cytogenetic aspects of phylogeny in the bovidae. 1-G banding. // Cytogenet.Cell Genet. 1978. V. 21. №1. P. 42-63

55.Buschmann A., Ltihken G., Schultz J., Erhardt G., Groschup M.H. Neuronal accumulation of abnormal prion protein in sheep carrying a scrapie-resistant genotype (PrPARR/ARR) // Gen. Virol. - 2004. -V. 85.-P. 2727-2733.

56.Carriere, F., Thirstrip, K., Boel, E., Verger, R., Thim, L., Structure-function relationships in naturally occurring mutants of pancreatic lipase. // Protein Eng. 1994, 7, 563-569.

57.Cary, J. A., S. Madill, K. Farnsworth, J. T. Hayna, L. Duoos, and M. L. Fahning. A comparison of electroejaculation and epididymal sperm collection techniques in stallions. Can. Vet. J. 2004, 45:35-41.

58.Cavanagh K.T., Leipprandt J.R., Jones M.Z., Friderici K. Molecular defect of caprine N-acetylglucosamine-6-sulphatase deficiency. A single base substitution creates a stop codon in the 5'-region of the coding sequence // Journal of Inherited Metabolic Disease 1995, 18:96,

59.Chandler J. E. , Painter C. L. , Adkison R. W. , Menon M. A., Hoyt P. G. 1988 Semen Quality Characteristics of Dairy Goats // J Dairy Sci 1988,71:1638-1646

60.Chang M.C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. // Nature 1951; 168:697.

61.Chemineau, P., Cagnie, Y., Guerin, Y., Orgeur, P., Vallet, J.C., Training manual on artificial insemination in sheep and goats. // FAO Reproduction and Health Paper. Food and Agriculture Organization of the United Nations 1991., pp. 115-161.

62.Coetzee K, Kruger TF, Lombaard CJ. Predictive value of normal sperm morphology: a structural literature review. // Hum Reprod 1998; 4: 73-84.

63.Cooper, T. G. Cytoplasmic droplets: The good, the bad or just confusing. // Hum. Repro. 2005, 20:9-11.

64.Corteel J.M., Production, storage and artificiel insemination of goat semen. // Management of Reproduction in Sheep and Goats Symposium, Madison, 1977, July 24-25, pp. 41-57.

65.Corteel, J.M., Viabilité des spermatozoides de bouc conservés et congelés avec ou sans leur plasma seminal: effet du glucose. // Ann. Biol. Anim., Biochim., Biophys. 1974, 14 4 B, pp. 741-745.

66.Courtens J.L., Paquignon M. Ultrastructure of fresh, frozen and frozen-st thawed spermatozoa of the boar. Proc. 1 Int. Conf. Deep Freez. Boar Semen. Uppsala. 1985; pp. 977-980.

67.Crozet N, Huneau D, Desmedí V, Theron MC, Szollosi D, Torres S, Sevellec C. In vitro fertilization with normal development in the sheep.//Gamete Res 1987; 16:159-170.

68.Deka, B.C. and Rao, A.R., 1987. Effect of extenders and thawing methods on post thawing preservation of goat semen. Indian Vet. J. 64, pp. 591-594.

69.Delgadillo J.A.; Leboeuf B.; Chemineau P. Maintenance of sperm production in bucks during a third year of short photoperiodic cycles // Reprod.NutritDevelopm, 1993; Vol.33,N 6. - P. 609-617

70.Delgadillo, J. A., Leboeuf, B., and Chemineau, P.. Abolition of seasonal variations in semen quality and maintenance of sperm fertilizing ability by short photoperiodic cycles in goat bucks. Small Rumin. Res. 1992, 9, 47-59.

71.Deutscher, G. H., M. E. Wells, and R. A. Battaglia.. Evaluation of epididymal sperm by the cannulation technique and the effects of in vivo storage in Angus bulls. // J. Anim. Sci. 1974, 39:1136-1143.

72.Di Berardino, D., Hayes, H., Fries, R. and Long, S.E ISCNDA (1989) (International System for Cytogenetic Nomenclature of Domestic Animals) // Cytogenet. Cell. Genet. 1990. V.53. N 1. P. 65-79

73.Dong Q., Rodenberg SE, Huang C, Vandevoort CA: Cryopreservation of Rhesus monkey (Macaca muitatta) epididymal spermatozoa before and after refrigerated storage. // J. Androl. 2008; 29 (3): 283-292.

74.Dow M.P.D., Bavister B.D. Direct contact is required between serum albumin and hamster spermatozoa for capacitation in vitro. // Gamete Res 1989; 23:171-180.

75.Duan EK, Wang GY, Ma BH, Wang JC. Xenogenous fertilization of goat ovulated oocytes in the rabbit oviduct. Theriogenology 1990; 33:219 (abstract).

76.Evans H.J., R. A. Buckland and A. T. Sumner Chromosome homology and heterochromatin in goat, sheep and ox studied by banding techniques // Chromosoma. 1973. V. 42. №4. P.383-402.

77.Evans, G. and Maxwell, W.M.C., Salamon S. Artificial Insemination of Sheep and Goats, Butterworths, Sydney 1987, 194 pp.

78.Evenson D., Darzynkiewicz Z., Melamed M. Relation of mammalian sperm heterogeneity to fertility // Science, 1980, 210: 1131-1133.

79.Fawcett D., Anderson W., Phillips D. Morphogenetic factors influensing the shape of sperm head. // Dev Biol 1971; 26: 220-251

80.Fawcett D.W., Phillips D.M. Recent observations on the ultrastructure of mammalian spermatozoa // In: Comparative Spermatology. B. Bacetti (Ed). Academic Press, New York, 1972, p. 2-46.

81.First N.L., Parrish J.J. Sperm maturation and in vitro fertilization // Proc 11th tnt

82.Foote R.H: Letter to the Editor. // J. Androl. 2000; 21 (3): 355.

83.Fraser LR. Albumin is required to support the acrosome reaction but not capacitation in mouse spermatozoa in vitro. // J Reprod Fertil 1985;74:185-196.

84.Garner, D. L. and E. S. Hafez. Spermatozoa and seminal plasma. In: B. Hafez and E. S. Hafez (Eds.). Reproduction in Farm Animals. 2000, pp. 96-109. .

85.Gerber, D., P. C. Irons, A. Arlotto, and D. Cooper..Quality and freezability of epididymal semen from African buffalo (Syncerus Caffer) under field conditions. // Theriogenology 2001, 55:384.

86.Goto, K., A. Kinoshita, Y. Takuma, and K. Ogawa.. Fertilisation of bovine oocytes by the injection of immobilised, killed spermatozoa. //Vet. Rec. 1990 127:517-520.

87.Hamilton, D.W. and D. W. Fawcett. In vitro synthesis of cholesterol andtestosterone from acetate by rat epididymis and vas deferens. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970. 133:693-695.

88.Hanada A. In vitro fertilization in goat. // Jpn J Anim Reprod 1985; 31:21-26.

89.Hancock J.L., The morphology of Boar spermatozoa // J. R. Microsc. Soc., 1957, 76, p. 84-97.

90.Harayama, H., T. Shibukawa, M. Miyake, Y. Kannan, and S. Kato. Fructose stimulates shedding of cytoplasmic droplets from epididymal boar spermatozoa. // Reprod. Fertil. Develop. 1996 8:1039-1043.

91.Harshan, H. M., L. P. Singh, A. Arangasamy, M. R. Ansari, and S. Kumar. Effect of buffalo seminal plasma heparin binding protein (HBP) on freezability and in vitro fertility of buffalo cauda spermatozoa. //Anim. Reprod. Sci. 2005, 93:124-133.

92.Hashida, N.H, Abdullah, R.B, Rajikin, M. H. and Mat Noor, M Ultrastructural studies of fresh, frozen-thawed and acrosome-reacted goat sperm // Biomedical Research 2005; 16 (2): 119

93.Haushteck-Jungn E., Muli R. Vergleich der Chromosomensätze von Steinwild (Capra Ibex) und Hausziege (Capra Hircus) // Chromosoma. 1967. V.21. № 2. P. 198-210.

94.Hayes H. and Petit E. Comparison of RBG-banded karyotypes of cattle, sheep and goat // Citogenet. Cell Genet. 1991. V.57. N 1. P.51-55.

95.Herold, F. C., J. E. Aurich, and D. Gerber. Epididymal sperm from the African buffalo {Syncerus caffer) can be frozen successfully with AndroMed and with Triladyl but the addition of bovine seminal plasma is detrimental. // Theriogenology . 2004a 61:715-724.

96.Herold, F. C., K. de Haas, D. Cooper, B. Colenbrander, J. O. Nothling, W. Theunisen, B. Spillings, and D. Gerber. Comparison of three different media for freezing of epididymal sperm from the African buffalo {Syncerus caffer) and influence of equilibration time on the post-thaw sperm quality. // Onderstepoort J. Vet. Res. 2004b. 71:203-210.

97.Hewitt, D.A., R. Leahy, I. M. Sheldon, and G. C. England. Cryopreservation of epididymal dog sperm. // Anim. Reprod. Sei. 2001.67:101-111.

98.Hirabayashi, M., M. Kato, T. Aoto, A. Sekimoto, M. Ueda, I. Miyoshi, N. Kasai, S. Hochi.. Offspring derived from intracytoplasmic injection of transgenic rat sperm. // Trans. Res. 2002 11:221-238.

99.Holstein A. Ultrastructural observations on the differentiation of spermatids in man. //Andrologia 1976; 8: 157-163.

100. Holt W.V.,. Basic aspects of frozen storage of semen. // Anim. Reprod. Sei. 2000 62, 3-22.

101. Holtz, W. and R. H. Foote. 1974. Cannulation and recovery of spermatozoa from the rabbit ductus deferens. J. Reprod. Fertil. 39:89-92.

102. Hopkins, S., D. L. Armstrong, S. K. Hummel, and S. Junior. 1988. Successful cryopreservation of gaur (Bos gaurus) epididymal spermatozoa. J. Zoo Anim. Med. 19:195-201.

103. Hori, T., K. Hagiuda, E. Kawakami, and T. TsutsuL. Unilateral intrauterine insemination with prostatic fluid-sensitized frozen caudal epididymal sperm in beagle dogs. // Theriogenology 2005 63:1573-1583.

104. Iannuzzi L., Di Meo G.P., Perucatti, A. G- and R-banded prometaphase karyotypes in goat (Capra hircus L.)// Caryologia 1996. V.49. N2. P. 267-277.

105. Iannuzzi L., Meo G.P., Perucatti A. An improved characterization of goat chromosomes by means of G- and R-band comparison // Hereditas. 1994. V.120. № 3. P. 245-251.

106. Iritani, A. and Nishikawa, Y., Studies on the egg coagulating enzyme in goat semen: IV. On the position of yolk constituents attacked by the coagulating enzyme. // Jpn. J. Anim. Reprod. 1963 8 4, pp. 113-117.

107. Iritani, A. and Nishikawa, Y.,. Studies on the egg yolk coagulating factors in goat semen: II Properties of the coagulating factor and influential conditions for coagulation. // Proc. Silver Jubilee Lab. Anim. Husbandry, Kyoto University, 1961 pp. 97-104.

108. Iritani, A., Nishikawa, U. and Fukuhara, R., Studies on the egg yolk coagulating factor in goat sperm: I. localization of coagulating factors and decline of pH following coagulating. // Proc. Silver Jubilee Lab. Anim. Husbandry, Kyoto University, 1961 pp. 89-96.

109. Ishii K.; Morita Z. A collection of epididymal sperm by spermatic fistula from bulls // Bull.Fac.Agr.,Tottori Univ. - Tottori, 1992; Vol.45. P. 167-172 1992

110. Jindal S.K. Sperm concentration in different segments of the goat epididymis Theriogenology 1984 V22 №5:545-551

111. Kaabi, M., P. Paz, M. Alvarez, E. Anel, J. C. Boixo, H. Rouissi, P. Herraez, and L. Anel.. Effect of epididymis handling conditions on the quality of ram spermatozoa recovered post-mortem. // Theriogenology 2003 60:1249-1259.

112. Karatzas, G., Karagiannidis, A., Varsakeli, S., Brikas, Fertility of fresh and frozen-thawed goat semen during the nonbreeding season. // Theriogenology 1997 48, 1049-1059.

113. Kato S., Iritani A, Nishikawa Y. Effects of C02 on motility of spermatozoa of farm animals. Jnp J Zootech Sei 1977; 48:573-575.

114. Kilian I., Lübbe K, Bartels P, Friedmann Y, Denniston RS: Evaluating epididymal sperm of African wild ruminants: Longevity when stored at 40C and viability following cryopreservation. // Theriogenology. 2000; 53(1): 336-342.

115. Kundu, C. N., J. Chakraborty, P. Dutta, D. Bhattacharyya, A. Ghosh, and G. C. Majumder.. Development of a simple sperm cryopreservation model using a chemically defined medium and goat cauda epididymal spermatozoa. // Cryobiology 2000; 40:117-125.

116. Kundu, C.N., Das, K., Majumder, G.C., Effect of amino acids on goat caudä epididymal sperm cryopreservation using a chemically defined model system. // Cryobiology 2001 41, 21-27.

117. Kusunoki H., Sakaue M, Kato S, Kanda S. Induction of acrosome reaction in ejaculated goat spermatozoa by preincubation in chemically defined medium. // J Exp Zool 1989; 249:322-328.

118. Lardy, H. A. and D. Ghosh.. Comparative metabolic behavior of epididymal and ejaculated mammalian spermatozoa. // Ann. N. Y. Acad. Sei. 1952; 55:594-596.

119. Lasley, J. F. and R. Bogart.. A comparative study of epididymal and ejaculated spermatozoa of the boar. // J. Anim. Sei. 1944; 3:360370.

120. Leboeuf B., E. Manfredib, P. Bouec, A. Piacered, G. Bricee, G. Barilf, C. Broquae, P. Humblotg and M. Terqui Artificial insemination of dairy goats in France // Livestock Production Science, 1998, V. 55 (3), 193-203.

121. Leboeuf, B., Restall, B., Salamon, S.,. Production and storage of goat semen for artificial insemination. // Anim. Reprod. Sci. 2000; 62,113-141.

122. Levine, N. and Marsh D.J. Micropuncture studies of the electrochemical aspects of the fluid and electrolyte transport of individual siminiferous tubules, the epididymis and vas deferens of the rat // The Journal Of Physiology 1971 213:557-570

123. Ligia Souza, Lima Silveira da Mota and Rosana Silva Centric fusion in goats (Capra hircus): Identification of a 6/15 translocation by high resolution chromosome banding // Ap. Bicudo da Genet. Mol. Biol. 1998. V. 21. № 1

124. Liu Y., Baker H. Sperm nuclear chromatin normality: relationship with sperm morphology, sperm-zona pellucida binding, and fertilization rates in vitro. // Fertil Steril 1992; 58: 1178-1184.

125. Lubbe K., Bartels P, Kilian I, Friedmann Y, Godke RA: Comparing motility and morphology of horse, zebra and rhinoceros epididymal spermatozoa when cryopreserved with two different cryodiluents or stored at 40C. // Theriogenology. 2000; 53(1): 338365.

126. Lux E., Perez M., Volobouev V.T. G- and C-banded karyotype of the markhor capra falconeri heptneri, and comparison of its banding patterns with the Alpine Ibex Capra Ibex and Cattle Bos Taurus //Acta Theriologica. 2004. V. 49. № 1. P. 131-137.

127. Mack, S. R. and L. J. Zaneveld. Acrosomal enzymes and ultrastructure of unfrozen and cryotreated human spermatozoa. // Gamete Res. 1987; 18:375-383.

128. Manceau V., Despres P., Bouvet J., Taberlet P. Systematics of the genus Capra inferred from mitochondrial DNA sequence data. // Molecular Phylogenetics and Evolution . 1999. V.13. P.504-510.

129. Martinez-Pastor, F., C. Guerra, M. Kaabi, A. R. Diaz, E. Anel, P. Herraez, P. de Paz, and L. Anel. Decay of sperm obtained from epididymes of wild ruminants depending on postmortem time. // Theriogenology 2005a. 63:24-40.

130. Martinez-Pastor, F., L. Anel, C. Guerra, M. Alvarez, A. J. Soler, J. J. Garde, C. Chamorro, and P. de Paz. Seminal plasma improves cryopreservation of Iberian red deer epididymal sperm. // Theriogenology 2006a. 66:1847-1856.

131. Martinez-Pastor, F., V. Garcia-Macias, M. Alvarez, C. Chamorro, P. Herraez, P. de Paz, and L. Anel. Comparison of two methods for obtaining spermatozoa from the cauda epididymis of Iberian Red deer. // Theriogenology 2006c. 65, 471-485. (Abstract).

132. Mayr B., Tesarik E., Auer H., Burger H. Nucleolus-organizer regions and heterochromatin in three species of Bovidae// Genetica . 1987. V.75. №3. P. 207-212.

133. Monesi V. Chromosome activities during meiosis and spermiogenesis. J Reprod Fertil (suppl.) 1971; 13: 1.

134. Nadler C.F., Hoffmann R. S., Woolf A. G-band patterns, chromosomal homologies, and evolutionary relationships among wild sheep, goats, and aoudads (mammalia, artiodactyla) // Experientia. 1974, V.30. №7. p.744-746.

135. Nasar A., Rahman A., Bin Abdullah R. A Review of Reproductive Biotechnology and their application in goat // Biotechnology, 2008, 7 (2), 371-384.

136. Neill J.M., Olds-Clarke P. A computer-assisted assay for mouse sperm hyperactivation demonstrates that bicarbonate but not bovine serum albumin is required. // Gamete Res 1987; 18:121-140.

137. Nguyen Van Thuan, Sayaka Wakayama, Satoshi Kishigami, and Teruhiko Wakayama New Preservation Method for Mouse Spermatozoa Without Freezing // Biol Reprod February 2005 72 (2) 444-450

138. Nunes, J., Etude des effets du plasma séminal sur la survie in vitro des spermatozoïdes de bouc. Thèse de Doctorat, Université Pierre et Marie Curie, Paris, 1982; 33 pp.

139. Padeh B., Wysoki M., Soller M. Futher studies on a Robertsonian translocation in the Saanen goat // Cytogenetics. 1971. V.10. №1. P. 61-69.

140. PalomO M., D.Izquierdo, T.Mogas, M.Paramio Effect of semen preparation on IVF of prepubertal goat oocytes // Theriogenology, 1999. 51(5). 927-940

141. Parrish J.J., Susko-Parish J.L., Leibfriend-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., First N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen.thawed semen. // Theriogenology 1986; 25:591-600.

142. Parrish J.J., Susko-Parish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin. // Biol Reprod 1988; 38:1171-1180.

143. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Handrow R.R., Ax R.L., First N.L. Effect of sulfated glycoconjugates on capacitation and the acrosome reaction of bovine and hamster spermatozoa. // Gamete Res 1989; 24:403-413.

144. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., First N.L. Bovinein vitro fertilization with frozen-thawed semen. // Theriogenology, 1986; 25, 591-600.

145. Pellicer-Rubio, M.T., Combarnous, Y., Deterioration of goat spermatozoa in skimmed milk-based extenders as a result of oleic acid released by the bulbourethral lipase BUSgp60. // J. Reprod. Fertil. 1998; 112,95-105.

146. Perez-Sanchez, F., L. Tablado, C. H. Yeung, T. G. Cooper, and C. Soler. 1996. Changes in the motility patterns of spermatozoa from the rabbit epididymis as assessed by computer-aided sperm motion analysis. Molec. Reprod. Develop.45:364-371.

147. Petac D. and Kosec, M., Some morphological characters of bull spermatozoa and their effect on fertility. // Bornik Biotehniske Fakultete Univerze Edvarda Kardelja v Ljubljani, Veterinarstvo 1989; 26, pp. 65-72.

148. Probst, S. and D. Rath. Production of piglets using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flowcytometrically sorted boar semen and artificially activated oocytes. // Theriogenology 2003 59:961-973.

149. Pukazhenthi B., Pelican K, Wildt D, Howard J. Sensitivity of domestic cat (Fells catus) sperm from normospermic versus teratospermic donors to cold-induced acrosomal damage. Biol Reprod. 1999 Jul;61(l): 135-41.

150. Ritar, A J. and Salamon, S., 1982. Effects of seminal plasma and its removal and of egg yolk in the diluent on the survival of fresh and frozen - thawed spermatozoa of the Angora goat. Aust. J. Biol. Sci. 35, pp. 305-312.

151. Ritar, A.J., Ball, P.D. and O'May, P.J.,. Examination of methods for the deep freezing of goat semen. Reprod. Fertil. Dev.; 2, pp. 27-34.

152. Roy, A.,. Egg yolk coagulating enzyme in the semen and Cowper's gland of-the goat. //Nature 1957 (London) 179, p. 318.

153. Saacke R. G.. Morphology of the sperm and its relationship to fertility. // Third Tech. Conf. Artif. Insem. Reprod., Natl. Assoc. Anita. Breeders, Columbia, MO. 1970 Pages 17-30 in Proc.

154. Saacke, R. G., and J. M. White.. Semen quality tests and their relationship to fertility. // Proc. Fourth Tech. Conf. Artif. 1972Pages 22-27

155. Saacke, R. G., W. E. Vinson, M. L. O'Connor, J. E. Chandler, J. Mullins, R. P. Amann, R. A. Wallace,W. N. Vincel, and H. C. Kellgren. . The relationship of semen quality and fertility: a heterospermic study. // Proc.Eighth Tech. Conf. Artif. Insem. Reprod., Natl. Assoc. Anim. Breeders, Columbia, MO. 1980 Pages 71-78

156. Saacke, R.G., Dalton, J., Nadir, S., Bame, J. and Nebel, R.L., Spermatozoal characteristics important to sperm transport, fertilization and early embryonic development. // Lauria A, Gandolfi F, Enne G, Gianaroli L, eds —Gametes ¡Development and function Serono Symposia Milano, 1988 1, 320-335.

157. Saacke, R.G., Nadir, S., Dalton, J.,. Assessing bull fertility. // Proceedings of the Society for Theriogenology, 1995; 73.

158. Saitbekova N., Gaillard C., Obexer-Ruff G. Genetic diversity in swiss goat breeds on microsatellite analisis // Anim. Genet. 1999. Vol. 30. P. 36-41.

159. Santiago-Moreno, J., A. Toledano-Diaz, A. Pulido-Pastor, A. Gomez-Brunet, and A; Lopez-Sebastian. 2006a. Birth of live Spanish ibex (Capra pyrenaica hispanica) derived from artificial insemination with epididymal spermatozoa retrieved after death. Theriogenology 66:283-291.

160. Saowaros D., Raniym F. The formation of disulfide bonds in human protamines during sperm maturation. // Experientia 1979; 35: 131.

161. Sawyer, D.E., Brown, D.B., The use on an in vitro sperm activation assay to detect chemically induced damage of human sperm nuclei. // Reprod. Toxicol. 1995; 9, 351-357.

162. Singh, M.P., Sinha, A.K. and Singh, B.K., Effect of cryoprotectants on certain seminal plasma attributes and on the fertility of buck spermatozoa. // Theriogenology 1995; 43, pp. 10471053.

163. Smith, A.H. and Polge, C., Survival of spermatozoa at low temperatures.//Nature (London) 1950. 166, pp. 668-671.

164. Soler A.J., Perez-Guzman MO, Grade JJ: Storage of red deer epididymides for 4 days at 5 0C : Effects on motility, viability and morphological integrity. // J. Exp. Zool. Part A: Comparative Exp. Biol. 2003; 295A (2): 188-199.

165. Song F., Iritani A. In vitro fertilization of goat follicular oocytes with epididymal spermatozoa capacitated in a chemically defined medium. Proc 3rd MAP Anim Sd Cong. Seoul, Korea; 1985; 1:463.

166. Songsasen, N., J. Tong, and S. P. Leibo. Birth of live mice derived by in vitro fertilization with spermatozoa retrieved up to twenty-four hours after death. // J. Exp. Zool. 1998; 280:189-196.

167. Spallanzani, L. Dissertations relative to the natural history of animals and vegetables. // J. Murray: London 1784; 2:195-199.

168. Sponenberg D. P., Alexieva S., Adalsteinsson S. Inheritance of colour at goats// Genet Sei Evol. - 1998. V. 30. №4. P. 385-395.

169. Stewart-Savage, J. Effect of bovine serum albumin concentration and source on sperm capacitation in the golden hamster//Biol. Reprod. 1993; 49, 74-81

170. Suzuki, K. and T. Nagai. In vitro fertility and motility characteristics of frozenthawed boar epididymal spermatozoa separated by Percoll. // Theriogenology 2003; 60:1481-1494.

171. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Genetics. 1989. Vol. 17. P. 6463-6471.

172. Therien, I., R. Moreau, and P. Manjunath. Bovine seminal plasma phospholipidbinding proteins stimulate phospholipid efflux from epididymal sperm. // Biol. Reprod. 1999; 61:590-598.

173. Thundathil, J., Meyer, R., Palasz, A.T., Barth, A.D. and Mapletoft, R.J., 2000. Effect of theknobbed acrosome defect in bovine sperm on IVF and embryo production. // Theriogenology 54, 921-934.

174. Toyoda Y, Naito K P/F in domestic animals. In: Bavister BD, CumminsJ, Roldan E (ed),// Fertilization in Mammals. Norwell, MA. Serono Symposia; 1990: 335-347.

175. Tuli, R.K., Scmidt Baulain, R. and Holtz, W., Influence of thawing temperature on viability and release of glutamic oxaloacetic transaminase in frozen semen from Boer goats. // Anim. Reprod. Sci. 1991; 25, pp. 125-131.

176. Upreti, G.C., Hall, E.L., Koppens, D., Oliver, J.E., Vishwanath, R., Studies on the measurement of phospholipase A2 (PLA2) and PLA2 inhibitor activities in ram semen. //Anim. Reprod. Sci. 1999; 56, 107-121.

177. Uttam Datta, M Chandra Sekar, Manik Lai Hembram., Raju Dasgupta Development of a new method to preserve caprine cauda epididymal spermatozoa in-situ at -10°C // Nature Precedings 2009; 26 Jun

178. van Kooij, R.J., Balerna M, Roatti A, Campana A. Oocyte penetration and acrosome reactions of human spermatozoa. I: Influence of incubation time and medium composition. // Andrologia 1986; 18:152-160.

179. Ward C.R., Storey BT. Determination of the time course of capacitation in mouse spermatozoa using a chlortetracycline fluorescence assay.//Dev Biol 1984; 104:287-296.

180. Wilson D. E.und Reeder D. M. Mammal Species of the World. // Johns Hopkins University Press. Baltimore. 2005. 2142 p.

181. Wurster D. H., Benirschke K. Chromosome studies in the superfamily Bovoidea//Chromosoma. 1968. V. 25. N2. P. 152171.

182. Yusoff R.B.H. Cytogenetic studies on goats with inherited birth defects and reproductive problems // Dissertation Abstracts International. 1996. V.56. № 7. P. 3635.

183. Zamboni L. The ultrastructural pathology of the spermatozoon as a cause of infertility: the role of electron microscopy in the evaluation of semen quality. Fertil Steril 1987; 48: 711-734.

184. Zibrin M, Belak M, Mesaros P, Gamcik P, Tomajkova E. The ultrastructure of frozen-thawed ram spermatozoa. Z Mikrosk Anat Forsch 1987; 101: 904-912.