Участие факторов экспорта мРНК человека DDX19 и Gle1 в терминации трансляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Егорова Татьяна Владимировна

• Егорова Татьяна Владимировна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Егорова Татьяна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цели и задачи исследования

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

1.1 Общая схема терминации трансляции

1.2 Фактор терминации eRF1

1.3 Фактор терминации eRF3

1.4 Комплекс eRF1-eRF3

1.5 Факторы терминации в рибосоме

2 ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

2.1 ABCE1

2.2 PABP

2.3 eIF5A

2.4 Деацилированная тРНК

2.5 Dbp5

2.5.1 DEAD-box семейство хеликаз

2.5.2 Функция Dbp5 в транскрипции

2.5.3 Dbp5 как фактор экспорта мРНК

2.5.4 Роль Dbp5 в терминации трансляции дрожжей

2.6 GLE1

2.6.1 Структура Gle1

2.6.2 Gle1 в экспорте мРНК

2.6.3 Взаимодействие Dbp5 и Gle1

2.6.4 Функция Gle1 в трансляции дрожжей

2.6.5 Роль hGle1 в образовании стресс-гранул

2.6.6 Олигомеризация Gle1

2.6.7 Болезни, ассоциированные с Gle1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 МАТЕРИАЛЫ

1.1 Клетки, штаммы бактерий и плазмиды

1.2 Используемые среды

1.3 Используемые буферы и реактивы

1.4 Используемые антитела

1.5 Используемые ферменты

1.6 Используемые олигонуклеотиды

2 МЕТОДЫ

2.1 Полимеразная цепная реакция

2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3 Очистка фрагментов ДНК из агарозы

2.4 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.5 Лигирование ДНК

2.6 Трансформация E. coli плазмидной ДНК

2.7 Анализ клонов методом ПЦР-скрининга

2.8 Выделение плазмидной ДНК из E. coli

2.9 Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК

2.10 Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ

2.11 Вестерн-блот анализ

2.12 Выделение и очистка белков

2.12.1 Выделение и очистка компонентов реконструированной системы трансляции

2.12.2 Экспрессия и выделение DDX19 и его мутантов

2.12.3 Экспрессия и выделение Gle1 и eRF3a

2.13 Получение мРНК in vitro

2.14 Сборка преТК

2.15 Toe-print анализ

2.16 Анализ гидролиза пептидил-тРНК

2.17 GTPазный тест

2.18 Pull down анализ

2.19 Связывание факторов с преТК

2.20 АТРазный тест

2.21 Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 УЧАСТИЕ DDX19 ЧЕЛОВЕКА В ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

1.1 Описание транскрипционных вариантов генов ВВХ19Л и ВВХ19Б

1.2 Белок DDX19 человека связан с полисомами

1.3 АМРРКР стимулирует связывание DDX19 с преТК

1.4 DDX19 стимулирует образование ТК

1.5 DDX19 увеличивает эффективность гидролиза пептидил-тРНК при терминации трансляции

1.6 DDX19 активирует терминацию трансляции во время распознавания стоп кодона

1.7 Мутантные формы DDX19 активируют терминацию трансляции

1.8 DDX19 стимулирует активность факторов элонгации трансляции в рибосоме

1.9 Модель функционирования DDX19 в трансляции

2 УЧАСТИЕ GLE1 В ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

2.1 Белок Gle1 человека связывается с полисомами

2.2 Получение изоформ Gle1

2.3 Разные изоформы hGle1 по-разному влияют на гидролиз пептидил-тРНК

2.4 Изоформы Gle1A и Gle1B по-разному связываются с рибосомными комплексами

2.5 Изоформы Gle1A и Gle1B по-разному влияют на формирование терминационных комплексов

2.6 Влияние мутаций С-конца Gle1 на активность в терминации трансляции

2.7 ДGle1A и ДGle1B не влияют на GTPазную активность еКЕ3

2.8 Разный уровень экспрессии мРНК Gle1B и Gle1A в клетках линии НЕК293 NT

2.9 Уровень экспрессии мРНК Gle1A клетках линии НЕК293 ^Г изменяется во время стресса

2.10 Модель функционирования Gle1 в терминации трансляции

3 ВЛИЯНИЕ КОРОТКИХ иОЯЕз НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ

3.1 uORFs 5'-НТО ингибируют трансляцию в лизате РКМ£ мРНК. Влияние DDX19 и Gle1 на трансляцию uORFs 5'-НТО мРНК РКМ^

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ADP - аденозиндифосфат AMPPNP - аденилилимидодифосфат ATP - аденозинтрифосфат GTP - гуанозинтрифосфат

MPB - maltose binding protein (белок, связывающий мальтозу) NMD - Nonsense Mediated Decay NPC - комплекс ядерной поры

PABP - Polyadenine Binding Protein (поли-А-связывающий белок)

PVDF - поливинилиденфторид

rfu - относительные единицы флуоресценции

FRET - fluorescence resonance energy transfer

а.о. - аминокислотный остаток

БАС - Боковой амиотрофический склероз

кДНК - комплементарная ДНК

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

мРНП - мессенджер-рибонуклеопротеиды

НТО - нетранслируемая область

ОРС - открытая рамка считывания

ПААГ - полиакриламидный гель

преТК - претерминационный комплекс

ПТЦ - пептидил-трансферазный центр

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

ТК - терминационный комплекс

ЭР - эндоплазматический ретикулум

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие факторов экспорта мРНК человека DDX19 и Gle1 в терминации трансляции»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Исследование особенностей биосинтеза белка, трансляции, является одним из ключевых направлений в молекулярной биологии. В трансляции можно выделить четыре стадии: инициацию, элонгацию, терминацию и рециклинг. На сегодняшний день описано много способов регуляции трансляции на уровне инициации, однако механизмы регуляции элонгации и терминации остаются не исследованными. Терминация трансляции долгое время считалась самой короткой стадией биосинтеза белка, в которой принимает участие всего два белковых фактора - еЯШ и еКР3. Однако, в последнее время эта концепция претерпела существенные изменения. С 2007 года начали появляться сообщения о дополнительных факторах терминации трансляции у дрожжей. Оказалось, что в терминации трансляции помимо двух основных факторов, принимает участие много дополнительных белков. Так, например, недавно был описан механизм увеличения стабильности терминационных и посттерминационных комплексов некоторыми деацилированными тРНК, находящимися в Е сайте рибосомы. Недавно были опубликованы работы о новых генетических кодах ресничных инфузорий и трихомонад, использующих все три стоп кодона и как значащие, и как терминирующие. В этих работах предполагается, что терминация трансляции эукариот может регулироваться дополнительным белком, в роли которого может выступать поли(А)-связывающий белок (РАВР). Одновременно в 2016 году была опубликована работа, подтверждающая участие РАВР в терминации трансляции эукариот. На сегодняшний день имеются данные о возможном участии этих белков в терминации трансляции, однако молекулярные механизмы их действия и способы регуляции описаны пока недостаточно.

Данная диссертационная работа является продолжением исследований роли дополнительных белковых факторов в терминации трансляции, ведущихся в лаборатории механизмов и контроля трансляции ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН. В работе описано влияние факторов экспорта мРНК человека DDX19 и Gle1 на терминацию трансляции, о роли и механизме действия которых ничего не было известно ранее. Полученные данные вносят существенный вклад в описание молекулярного механизма терминации трансляции эукариот и открывают перспективы для разработки подходов регуляции терминации трансляции в клетках.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование влияния факторов экспорта мРНК человека DDX19 и Glel на терминацию трансляции, а также поиск возможных путей регуляции биосинтеза белка.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Описать механизм действия DDX19 человека на терминацию трансляции in vitro.

2. Описать механизм действия Glel человека на терминацию трансляции in vitro.

3. Исследовать влияние коротких uORF на эффективность трансляции эукариот на примере мРНК PKMz.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В данной работе мы впервые обнаружили и описали механизмы действия двух белков DDX19 и Gle1, регулирующих активность факторов терминации трансляции человека. Мы показали, что фактор транспорта мРНК из ядра в цитоплазму, DDX19, является также фактором, стимулирующим терминацию трансляции человека. Эта РНК-хеликаза, связываясь с претерминационным комплексом (преТК), увеличивает эффективность терминации трансляции вероятно путем стабилизации взаимодействия фактора терминации еRF1 с рибосомой.

Одна из изоформ партнера DDX19 в процессе транспорта мРНК, белка Gle1, Gle1B также стимулирует терминацию трансляции человека. Мы показали, что она активирует терминацию трансляции как на стадии распознавания стоп кодонов, так и на стадии гидролиза пептидил-тРНК. Напротив, изоформа GlelA не стимулирует терминацию трансляции, но может эффективно связываться с преТК. Важно отметить, что белки DDX19 и Gle1, являющиеся партнерами в процессе транспорта мРНК, активируют терминацию трансляции человека независимо друг от друга.

Кроме того, на примере мРНК PKMz нам удалось показать, что уровень трансляции мРНК существенно зависит от наличия коротких uORF, которые конкурируют с главной рамкой считывания за компоненты трансляционной системы.

Итогом исследования стало расширенное описание молекулярного механизма терминации трансляции у млекопитающих. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов терапии наследственных заболеваний человека, вызванных появлением в генах преждевременных стоп кодонов. Полученные данные о различном влиянии на терминацию трансляции двух изоформ GlelA и GlelB, изменение соотношения клеточных пулов которых связывают с неизлечимым дегенеративным заболеванием центральной нервной системы

- боковым амиотрофическим склерозом (БАС), потенциально могут служить отправной точкой для понимания механизма развития этой болезни.

Методология и методы исследования

Для поиска и выяснения молекулярного механизма действия дополнительных факторов терминации трансляции нами использовалась реконструированная in vitro система трансляции млекопитающих [1]. Полученные индивидуальные компоненты трансляционного аппарата -рибосомы человека и кролика, белковые факторы трансляции человека, модельные мРНК и суммарная тРНК, использовались для сборки преТК. Дальнейшие эксперименты по определению активности факторов терминации в присутствии и отсутствии предполагаемых дополнительных факторов трансляции (DDX19 или Glel) проводились на очищенных в градиенте сахарозы преТК. Разные стадии терминации трансляции тестировались с помощью соответствующих методов: образование терминационных комплексов (ТК) - методом toe-print анализа, гидролиз пептидил-тРНК - методом определения количества высвобождения меченного пептида, связывание факторов с рибосомами - методом центрифугирования рибосомных комплексов в градиенте сахарозы с последующей детекцией белков вестерн-блот гибридизацией.

Положения, выносимые на защиту

1. Факторы транспорта мРНК из ядра в цитоплазму, белки DDX19 и Glel человека, являются дополнительными факторами, регулирующими терминацию трансляции.

2. DDX19 связываясь с преТК, увеличивает эффективность терминации трансляции путем стабилизации взаимодействия eRF1 с рибосомными комплексами независимо от гидролиза АТР.

3. А и В изоформы Gle1 по-разному влияют на терминацию трансляции.

4. Gle1B стимулирует терминацию трансляции как на стадии распознавания стоп кодонов, так и на стадии гидролиза пептидил-тРНК. Она связывается с eRF1 независимо от наличия его партнера eRF3.

5. Изоформа Gle1A подавляет терминацию трансляции, связываясь с преТК.

6. Активация терминации трансляции человека белками DDX19 и Gle1B осуществляется разными путями.

7. Уровень трансляции главного ORF напрямую зависит от количества имеющихся uORF в 5'-НТО мРНК PKMz. DDX19 и Gle1B не влияют на уровень трансляции мРНК с 5'-НТО мРНК PKMZ дикого типа.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты работы были опубликованы в 3 статьях в рецензируемых научных журналах и представлены в виде стендовых докладов на 4 международных и 1 российской научных конференциях. Цель, поставленная в работе, достигнута.

Публикации:

1. Mikhailova T, Shuvalova E, Ivanov A, Susorov D, Shuvalov A, Kolosov PM, Alkalaeva E. RNA helicase DDX19 stabilizes ribosomal elongation and termination complexes // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 3. P. 1307-1318.

2. Alkalaeva E, Mikhailova T. Reassigning stop codons via translation termination: How a few eukaryotes broke the dogma // BioEssays. 2017. Vol. 39, № 3. P. 1600213.

3. Bal NV, Susorov D, Chesnokova E, Kasianov A, Mikhailova T, Alkalaeva E, Balaban MP, Kolosov P. Upstream Open Reading Frames Located in the Leader of Protein Kinase MZ mRNA Regulate Its Translation // Front. Mol. Neurosci. 2016. Vol. 9. P. 103.

Тезисы конференций:

1. Т.В. Михайлова, А.В. Шувалов, Е.А. Чеснокова, Б.Д. Елисеев, П.М. Колосов, Christiane Schaffitzel, Е.З. Алкалаева «Роль фактора экспорта мРНК человека Gle1 в терминации трансляции» //МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ПО БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ «XII ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ АКАДЕМИКА ЮРИЯ АНАТОЛЬЕВИЧА ОВЧИННИКОВА» • VIII РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ» Москва, ИБХ РАН, 18-22 сентября 2017 (устный доклад);43 | ACTA NATURAE | СПЕЦВЫПУСК | 2017

2. Т.В. Михайлова, А.В. Шувалов, Е.З. Алкалаева "Роль белка DDX19 в регуляции терминации трансляции человека." //НАУЧНЫЕ ТРУДЫ V Съезда физиологов СНГ, V Съезда биохимиков России, Конференции ADFLIM Сочи - Дагомыс, Россия, 4-8 октября, 2016 (постерный доклад); 87 | ACTA NATURAE | СПЕЦВЫПУСК том 2 | 2016"

3. Tatiana Mikhailova, Ekaterina Shuvalova, Aleksander Ivanov, Denis Susorov, Aleksei Shuvalov, Peter Kolosov, Elena Alkalaeva "Human RNA helicase DDX19 stabilizes elongation and termination translation complexes" // The 7th EMBO meeting advancing the life sciences, page 327, Mannheim, Germany, 2016, September 10-13

4. T. Mikhaylova, E. Alkalaeva «Role of human Dbp5 in translation termination» The FEBS Journal. Abstracts of the 38th FEBS Congress. Saint Petersburg, Russia July 6-11, 2013

5. Tatiana Mikhaylova, Elena Alkalaeva «Human Dbp5 regulates translation termination activity of eRF1» EMBO Conference Series: Protein Synthesis and Translational Control EMBL Advanced Training Centre Heidelberg, Germany, 08 - 12 September 2013

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

1.1 Общая схема терминации трансляции

Терминация трансляции происходит, когда в А сайте рибосомы позиционируется один из стоп кодонов: UAA, UAG или UGA [2]. Процесс терминации состоит из распознавания стоп кодона факторами терминации и гидролиза сложноэфирной связи пептидил-тРНК, расположенной в Р сайте рибосомы. В результате этого новосинтезированный полипетид высвобождается из рибосомы. И у бактерий, и у эукариот процесс терминации трансляции осуществляется белками, которые называются факторами терминации, или RF (Release Factors).

Факторы терминации трансляции подразделяются на два класса. Факторы терминации 1 -го класса, RF1/2 у бактерий, eRF1 у эукариот, отвечают за распознавание стоп кодонов в А сайте малой субъединицы рибосомы и индукцию гидролиза пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре большой субъединицы. К факторам терминации 2-го класса относятся белки RF3 у прокариот, и eRF3 у эукариот - это рибосомозависимые GTPазы, имеющие структурное сходство друг с другом и гомологию в пределах GTP-связывающего G домена [3]. При гидролизе GTP прокариотический RF3 не нуждается в наличии фактора 1-го класса, а эукариотическому eRF3 строго необходим еRF1 [4].

Кодоны, кодирующие аминокислоты (значащие кодоны), и стоп кодоны распознаются в декодирующем центре малой субъединицы рибосомы молекулами тРНК и факторами RF 1-го класса соответственно. При элонгации тРНК доставляется в А сайт фактором элонгации EF1 (eEF-Tu у бактерий, eEF1 у эукариот). Формирование водородных связей между кодоном мРНК и антикодоном соответствующей тРНК в первых двух позициях приводит к возникновению короткой а-спирали, правильная геометрия которой контролируется эволюционно консервативными нуклеотидами рибосомы, таким образом происходит распознавание кодонов, кодирующих аминокислоты [5]. Механизм же распознавания стоп кодонов у прокариот и эукариот отличается. Третий нуклеотид стоп кодона бактерий не входит в стэкинговое взаимодействие с первыми двумя нуклеотидами, а взаимодействует с 16S рРНК. В этом случае стоп кодон распознается RF1 и RF2 через сеть водородных связей между тремя отдельными нуклеотидами стоп кодона и аминокислотными остатками факторов терминации [5]. Стоп кодоны эукариот формируют «U-turn» в кармане, образованном фактором терминации eRF1 и рибосомой, благодаря чему становится возможным различить значащие кодоны и стоп кодоны [5,6]

При терминации трансляции у эукариот, комплекс белков еRF 1 -eRF3 -GTP связывается со стоп кодоном в А сайте рибосомы [7-9]. После раотознавания стоп кодона фактором терминации еЯШ, eRF3 гидролизует GTP до GDP и либо диссоциирует из рибосомы, либо меняет конформацию [1,4,10]. В результате eRF1 полностью разворачивается в А сайте [8,11,12] и сближает GGQ мотив М домена со сложноэфирной связью между новосинтезированным полипептидом и тРНК, стимулируя ее гидролиз [13,14]. ATPаза ABCE1 связывается с eRF1 и дополнительно стимулирует высвобождение полипептида, веротяно вытесняя eRF3 [10], а далее, запускает рециклинг рибосом, то есть диссоциацию рибосом на субъединицы [15-17].

1.2 Фактор терминации eRF1

У эукариот все три стоп кодона распознаются одним фактором терминации eRF1 [18]. Аминокислотная последовательность эукариотического eRF1 не гомологична аминокислотной последовательности бактериальных RF1 и RF2 [19]. Тем не менее, все факторы терминации 1-го класса содержат консервативный GGQ мотив, который необходим для запуска гидролиза пептидил-тРНК. Важно отметить, что в отличие от бактериальных RF1/RF2, индукция гидролиза пептидил-тРНК одним эукариотическим eRF1 неэффективна, и для эффективного гидролиза ему необходим фактор терминации 2-го класса eRF3 [1].

С помощью рентгеноструктурного анализа была определена трехмерная структура eRF1 человека [20]. Он состоит из трех доменов: N-концевого домена (N домена), который отвечает за распознавание стоп кодонов [21]; М домена, в котором находится консервативный GGQ мотив [20]; и С-концевого домена (С домена), который отвечает за взаимодействие с фактором терминации 2-го класса eRF3 и фактором рециклинга рибосом ABCE1 [10,11,15,22]. eRF1 в кристалле имеет форму, напоминающую букву Y, а размеры этого белка сопоставимы с размерами молекулы тРНК (Рис.1).

N домен состоит из 4-х слойного Р-листа и четырех а-спиралей. Множество биохимических исследований, а также исследования белков eRF1 с аминокислотными заменами свидетельствуют о том, что высококонсервативный мотив TAS-NIKS (а.о. 58-64), петля GTS (а.о. 31-33) и мотив YxCxxxF (а.о. 125-131) N домена eRF1 играют важную роль при распознавании стоп кодонов [23-26].

NIKS

GGQ-

Рис. 1. Структура eRF1 человека по даннымрентгеноструктурного анализа (PDB код 1DT9) из [20] с изменениями. Красными стрелочками показано расположение мотивов NIKS и GGQ.

М домен состоит из Р-листа, окруженного а-спиралями. Спираль а5 очень сильно выдается из остального домена, экспонируя на своем конце, важный для гидролиза пептидил-тРНК, GGQ мотив [27-29]. С домен представляет из себя а-Р сэндвич, и, как упоминалось ранее, он необходим для связывания с фактором терминации eRF3 и фактором рециклинга рибосом ABCE1.

Кристаллическая структура комплекса факторов терминации трансляции человека eRF1 и урезанного eRF3, лишенного вариабельного N домена и GTPазного домена, показала, что при связывании eRF3, в пространственной структуре молекулы eRF1 происходят конформационные изменения [22]. Изменяется положение М домена eRF 1 относительно двух других доменов, и в связанном с eRF3 состоянии, eRF1 напоминает молекулу тРНК. Таким образом, eRF1 в свободном состоянии находится в «открытой конформации», а при связывании eRF3, происходит перемещение GGQ мотива М домена, и eRF1 приобретает «закрытую конформацию» (Рис. 2). Что интересно, дистанция между сайтом декодирования в рибосоме и пептидилтрансферазным центром составляет 73 А, и она меньше, чем расстояние между NIKS и GGQ мотивами свободного eRF1 ~100 А [20]. Данные малоуглового рентгеновского рассеяния подтверждают, что в растворе eRF1 также принимает «открытую конформацию» [22]. Таким образом, на этапе гидролиза пептитил-тРНК, eRF1 должен принять более «закрытую» конформацию, чтобы поместиться в рибосоме.

Аитикодои NIKS

Рис. 2. (А) Перемещение GGQ мотива М домена eRF1 после связывания с eRF3. Фактору терминации eRF1 в свободном состоянии соответствует салатовый цвет, а после связывания с eRF3 - зеленый. (Б) Сравнение пространственных структур тРНК и eRF1, связанного с eRF3 из [22] с изменениями.

1.3 Фактор терминации eRF3

Исходя из сравнения аминокислотной последовательности и анализа функциональных свойств, eRF3 разделяется на 2 региона: С-концевой регион непосредственно отвечает за терминацию трансляции (связывается с eRF1 и гидролизует GTP), он необходим для жизнеспособности клетки [30]; а N-концевой регион связывается с поли(А)-связывающим белком PABP [31-33] и долгое время считался несущественным для терминации трансляции [34]. По последним данным полноразмерный eRF3 эффективнее работает в терминации трансляции по сравнению с усеченным белком eRF3c, не имеющим N-концевого домена [35].

Структурно факторы терминации 2-го класса гомологичны факторам элонгации eEF1A и EF-Tu [36]. eRF3 состоит из трех глобулярных доменов. Домен 1 (G домен) представляет из себя GTPазный домен, а домены 2 и 3, представляют из себя 6-слойные Р-бочонки (Рис. 3). Несмотря на структурное сходство, ориентация G домена eRF3 относительно доменов 2 и 3 отличается от таковой у eEF1A/EF-Tu. Связывание с eRF3 молекул GTP/GDP не приводит к существенным конформационным изменениям, и ион Mg2+ не необходим для связывания GDP c eRF3 [36].

N-концевой участок

Рис.3. Кристаллическая структура eRF3c Schizosaccharomyces pombe. Домены G, 2, 3 и часть N-концевого участка отмечены голубым, зеленым, красным и фиолетовым цветом соответственно, из [36] с изменениями.

У человека есть 2 изоформы белка eRF3: eRF3a (GSPT1) и eRF3b (GSPT2), которые отличаются своими N-концевыми фрагментами. eRF3a присутствует во всех тканях, локализован в цитоплазме, а eRF3b является тканеспецифичной изоформой (нервная ткань). Обе связываются с eRF1 и стимулируют его активность in vitro. В клетках с короткими интерферирующими РНК к eRF3a, увеличивалось сквозное чтение стоп кодонов, а в клетках с короткими интерферирующими РНК к eRF3b, сквозное чтение стоп кодонов не изменялось [37]. Таким образом, основной изоформой работающей в терминации трансляции человека является белок eRF3a.

1.4 Комплекс eRF1-eRF3

Важной отличительной чертой эукариотических факторов терминации является их спобосность формировать стабильный комплекс [38-41]. Основной вклад в образование комплекса eRF1-eRF3 вносит С домен eRF1 и домен 3 eRF3 [39-41], дополнительный вклад вносит М домен eRF1 [42]. Ассоциация с eRF1 стабилизирует связывание eRF3 с GTP (но не с GDP) [43], таким образом, eRF1, eRF3 и GTP в присутствии ионов Mg2+ образуют относительно долгоживущий стабильный комплекс. Для стимуляции GTPазной активности eRF3 необходимы рибосомы и eRF1 [4]. Изолированный C домен eRF1 не способен стимулировать связывание/гидролиз GTP фактором терминации eRF3, а вот МС или М+С домены eRF1 стимулируют этот процесс [42]. А eRF3, в свою очередь, стимулирует высвобождение полипептида фактором терминации eRF1 [1].

В кристаллической структуре eRF1-eRF32-3 контакт между двумя белками формируется преимущественно за счет гидрофобных взаимодействий, в которые вовлечены консервативные аминокислотные остатки спиралей (а8 и а11) и Р-слоя (Р10) eRF1 и аминокислотные остатки петлевых участков между Р-слоями ф15- Р16, Р16- Р17, Р18- Р19, Р21- Р22) eRF3 (Рис. 4)[22].

eRF3

Рис. 4. Кристаллическая структура eRF1 в комплексе со 2 и 3 доменами eRF3 с изменениями по [22].

Связывание с eRF1 не влияет на сродство eRF3 к GTP [42]. В экспериментах in vivo удалось показать, что для оптимального связывания eRF1 и eRF3 необходимо присутствие GTP [44,45]. Считается, что eRF1 и eRF3 связываются с А сайтом преТК в составе тройничного комплекса eRF1-eRF3-GTP, при участии иона Mg2+, и запускают процесс терминации [14].

1.5 Факторы терминации в рибосоме

После описания кристаллических структур факторов терминации по отдельности и их комплекса, назрела задача описать структуру комплекса факторов терминации с рибосомой, которая была успешно решена в последние годы.

Одной из первых опубликованных работ является структура eRF1-eRF3с-GMPPNP, связанных с очищенными в сахарозном градиенте преТК [9]. Свободные преТК имели разрешение 17 Á, представляли из себя рибосому в незакрученной конформации с тРНК в P сайте, но со свободными А и Е сайтом. 80S-eRF1-eRF3c-GMPPNP преТК в незакрученной конформации, соответствующий стадии связывания факторов терминации с рибосомой перед

гидролизом ОТР был получен с разрешением 18 А [9]. Немного позже был получен преТК 808-еКР1-КР3с-ОВРКР с разрешением 9,7 А, также соответствующий стадии распознавания стоп кодона перед гидролизом ОТР и комплекс дрожжевых факторов терминации еКР1-еКБ3:ОВРМР с рибосомой [7,11]. Позиция и конформация связанных с рибосомой еКБ1/еКБ3с напоминает структуру связанных аа-тРНК/ББ-Ти [7,9,11] (Рис. 5).

N домен еЯБ1 формирует обширные контакты с 408 субъединицей рибосомы через шпильки Ы8, h30, Ь31, h34 и И44 188 рРНК и рибосомные белки гр830е и гр831е, ядро С домена и минидомен С домена формируют «мост» между Р стержнем и клювом 408 субъединицы. еЯБ1 взаимодействует с доменом 3 фактора терминации еЯБ3 через свой С домен, а М домен еЯБ1 находится между О доменом еЯБ3 и 608. еЯБ3 связан с универсальным ОТРаз-связывающим центром рибосомы между 8КЬ петлей 608 и шпильками Ь5 и И14 188 рРНК 408 [7,9]. Связывание терминационных факторов индуцирует конформационные изменения и в 408, и в 608 субъединицах рибосомы [7,9]. Движение шпильки И16 188 рРНК приводит к тому, что голова 408 приближается к телу 408 и происходит сужение канала входа мРНК [9]. Ь1 стержень около Е сайта остается в открытой конформации [7]; а rpL12, Н43 и Н44, образующие основу Р стебля 608 субъединицы, смещаются от 408 субъединицы, для обеспечения связывания еКБ1-еКБ3, в частности С домена еЯБ 1.

А

ш и в еГ^З

Рис. 5. (А) Крио-ЭМ структура терминационных факторов в рибосоме. (Б) Молекулярная модель структуры комплекса терминационных факторов и пептидил-тРНК в рибосоме по [11].

В 2015 году двумя группами исследователей были опубликованы структуры ТК с очень высоким разрешением, полученные с помощью криоэлектронной микроскопии [5,6].

Группа V. КашакпвЬпап получила комплекс с разрешением 3,5-3,5 А, в котором еЯБ1 млекопитающих взаимодействует со всеми тремя стоп кодонами в А сайте рибосомы. Согласно полученной структуре, связывание еЯБ1 позиционирует нуклеотид А1825 18S рРНК таким образом, что он вступает в стэкинг взаимодействие со вторым и третьим основанием стоп кодона. Эта конфигурация затягивает четвертое основание мРНК в А сайт, где оно стабилизируется путем укладки на нуклеотид 0626 18Б рРНК [6]. Получается, что мРНК в А сайте находится в уплотненном состоянии. В этой уплотненной конформации стоп кодоны мРНК используют водородные связи для взаимодействия с рРНК и важными для распознавания аминокислотными остатками еЯБ1 [6] (Рис.6).

Рис. 6. Общая структура ТК эукариот. Общий вид eRFlAAQ в рибосоме млекопитающих, содержащей стоп кодон UAG, показывающая рибосомные субъединицы 40S и 60S, тРНК в Е сайте (желтая) и Р сайте (зеленая), eRFlAAQ в А сайте (фиолетовый) и ABCEl, занимающий GTPазный центр (синий). Крупным планом показан eRFlAAQ с доменами и мотивами GGQ, NIKS и YxCxxxF, тРНК в Р сайте (зеленая), новосинтезированный полипетид, мРНК, содержащая стоп кодон (серая) и ABCEl с железо-серным кластером (оранжевый/желтый) в нуклеотид-связанном состоянии по [6].

Метод, использованный в лаборатории V. Ramakrishnan для получения структур ТК, состоит в следующем: они заменили мотив GGQ еRF1 на AAQ [27], и добавили этот мутант еЯБ1

60S

40S

к in vitro трансляции в лизате ретикулоцитов кролика (RRL). Несколько раундов трехмерной классификации in silico показали, что примерно 10% полученных комплексов содержали еКШАА^-АВСБ1. ТК были получены на всех трех стоп кодонах [6]. Ассоциация ABCE1 была увеличена в комплексах с еRF1AAQ, что подтвердило данные о том, что для функционирования после терминации ABCE1 нуждается в гидролизе пептидил-тРНК [15]. Во всех комплексах еЯЛ находился в «открытой» конформации [11], а ABCE1 оккупировал ОТРазный центр.

В группе R. Beckmann сделали крио-ЕМ структуру 80S рибосомы человека с еRF1 на матрице hCMV [5]. Была проведена in vitro трансляция в лизате клеток HeLa S3. hCMV «замораживающий» пептид нарушает ПТЦ таким образом, что еRF1 не может индуцировать гидролиз полипептида [46]. При использовании стоп кодона UAA(A) они разрешили U-петлевую конформацию стоп кодона в кармане, образованном еRF 1 и рибосомой, раскрывающую важный вклад геометрии мРНК в механизм распознавания стоп кодонов [5]. После in silico классификации данных они получили более 30000 частиц с разрешением 3.8 Ä. N домен еRF1 проникает в декодирующий центр малой субъединицы и в этом центре остается «узкий карман», в котором должны разместиться все 3 нуклеотида стоп кодона и еще четвертый нуклеотид, следующий сразу за стоп кодоном. Примечательно, что по сравнению с конфигурацией нуклеотидов, которая наблюдается для смысловых кодонов и бактериальных стоп кодонов, конформация стоп кодонов у эукариот резко отличается. А именно, она напоминает геометрию классического «U-turn» мотива РНК [47]. Формирование «U-turn» приводит к укорочению мРНК в 3' области, что хорошо коррелирует с наблюдаемыми ранее изменениями положения рибосомных комплексов при связывании еЯШ в toe-print анализе [1]. Наблюдаемая геометрия стоп кодона стабилизируется водородными связями в «U-turn». Эта геометрия очень похожа на другие «U-turn» этого типа, найденные в антикодоновой шпильке тРНК или в 23 S рРНК. У бактерий третье основание стоп кодона стабилизируется путем стекингового взаимодействия с Ec 0530. В случае стоп кодона эукариот Hs О626 (Ec 0530) вступает в стекинговое взаимодействие с +4 основанием стоп-кодона, позволяя формироваться «U-turn» между +1 и +3 основаниями. Более того, эукариотический стоп-кодон вступает в стекинговое взаимодействие с «вывернутым» основанием Hs A1825, в то время как основание A1824 продолжает входить в состав спирали h44 малой субъединицы рибосомы [5]. Уплотнение мРНК в А сайте, похоже, приводит к тому, что нисходящие нуклеотидные остатки втягиваются в канал для мРНК. Это согласуется с образованием двухнуклеотидного сдвига на toe-print анализе при связывании фактора терминации еЯЛ с рибосомой [48,49] (Рис. 7).

Что касается положения eRF1 в рибосоме, все три домена еRF1 перемещаются друг относительно друга в соответствии с опубликованной ранее кристаллической структурой [20]. N

и М домены еЯБ1 независимо друг от друга взаимодействуют с тРНК в Р сайте рибосомы и вместе напоминают структуру тРНК в А сайте [6]. Спираль а2 N домена еЯБ1 расположена параллельно антикодоновой шпильке тРНК Р сайта и взаимодействует с ней. М домен еЯБ1 функционально аналогичен акцепторной шпильке тРНК [20] и позиционирует ООО мотив в пептидилтрансферазном центре.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Егорова Татьяна Владимировна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Alkalaeva E.Z. et al. In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRF1 and eRF3. // Cell. 2006. Vol. 125, № 6. P. 1125-1136.

2. Brenner S., Stretton A.O., Kaplan S. Genetic code: the "nonsense" triplets for chain termination and their suppression. // Nature. 1965. Vol. 206, № 988. P. 994-998.

3. Kisselev L.L., Buckingham R.H. Translational termination comes of age. // Trends Biochem. Sci. 2000. Vol. 25, № 11. P. 561-566.

4. Frolova L. et al. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. // RNA. 1996. Vol. 2, № 4. P. 334-341.

5. Matheisl S. et al. Structure of a human translation termination complex // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № 18. P. 8615-8626.

6. Brown A. et al. Structural basis for stop codon recognition in eukaryotes // Nature. 2015. Vol. 524, № 7566. P. 493-496.

7. des Georges A. et al. Structure of the mammalian ribosomal pre-termination complex associated with eRF 1*eRF3*GDPNP // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 5. P. 3409-3418.

8. Muhs M. et al. Cryo-EM of ribosomal 80S complexes with termination factors reveals the translocated cricket paralysis virus IRES. // Mol. Cell. 2015. Vol. 57, № 3. P. 422-432.

9. Taylor D. et al. Cryo-EM structure of the mammalian eukaryotic release factor eRF1-eRF3-associated termination complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. Vol. 109, № 45. P. 18413-18418.

10. Shoemaker C.J., Green R. Kinetic analysis reveals the ordered coupling of translation termination and ribosome recycling in yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 108, № 51. P. E1392-8.

11. Preis A. et al. Cryoelectron microscopic structures of eukaryotic translation termination complexes containing eRF1-eRF3 or eRF1-ABCE1. // Cell Rep. 2014. Vol. 8, № 1. P. 59-65.

12. Behrmann E. et al. Structural snapshots of actively translating human ribosomes. // Cell. 2015. Vol. 161, № 4. P. 845-857.

13. Dever T.E., Green R. The Elongation, Termination, and Recycling Phases of Translation in Eukaryotes // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2012. Vol. 4, № 7. P. a013706-a013706.

14. Jackson R.J., Hellen C.U.T., Pestova T. V. Termination and post-termination events in

eukaryotic translation // Advances in protein chemistry and structural biology. 2012. Vol. 86. P. 45-93.

15. Pisarev A. V et al. The role of ABCE1 in eukaryotic posttermination ribosomal recycling. // Mol. Cell. 2010. Vol. 37, № 2. P. 196-210.

16. Barthelme D. et al. Ribosome recycling depends on a mechanistic link between the FeS cluster domain and a conformational switch of the twin-ATPase ABCE1. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 108, № 8. P. 3228-3233.

17. Becker T. et al. Structural basis of highly conserved ribosome recycling in eukaryotes and archaea. // Nature. 2012. Vol. 482, № 7386. P. 501-506.

18. Frolova L. et al. A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor // Nature. 1994. Vol. 372, № 6507. P. 701-703.

19. Kisselev L., Ehrenberg M., Frolova L. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? // EMBO J. 2003. Vol. 22, № 2. P. 175-182.

20. Song H. et al. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRF1--mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. // Cell. 2000. Vol. 100, № 3. P. 311-321.

21. Bertram G. et al. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRF1 functions in stop codon recognition. // RNA. 2000. Vol. 6, № 9. P. 1236-1247.

22. Cheng Z. et al. Structural insights into eRF3 and stop codon recognition by eRF1. // Genes Dev. 2009. Vol. 23, № 9. P. 1106-1118.

23. Frolova L., Seit-Nebi A., Kisselev L. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRF1. // RNA. 2002. Vol. 8, № 2. P. 129136.

24. Wong L.E. et al. Selectivity of stop codon recognition in translation termination is modulated by multiple conformations of GTS loop in eRF1. // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № 12. P. 5751-5765.

25. Conard S.E. et al. Identification of eRF1 residues that play critical and complementary roles in stop codon recognition. // RNA. 2012. Vol. 18, № 6. P. 1210-1221.

26. Seit-Nebi A., Frolova L., Kisselev L. Conversion of omnipotent translation termination factor eRF1 into ciliate-like UGA-only unipotent eRF1. // EMBO Rep. 2002. Vol. 3, № 9. P. 881-886.

27. Frolova L.Y. et al. Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide release factors abolish ability of human eRF1 to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis. // RNA. 1999. Vol.

5, № 8. P. 1014-1020.

28. Ling S.H.M., Song H. Mechanistic insights into mRNA export through structures of Dbp5. // RNA Biol. 2010. Vol. 7, № 1. P. 23-27.

29. Ivanova E. V et al. Eukaryotic class 1 translation termination factor eRF1--the NMR structure and dynamics of the middle domain involved in triggering ribosome-dependent peptidyl-tRNA hydrolysis. // FEBS J. 2007. Vol. 274, № 16. P. 4223-4237.

30. Zhouravleva G. et al. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. // EMBO J. 1995. Vol. 14, № 16. P. 40654072.

31. Jerbi S. et al. Studies on human eRF3-PABP interaction reveal the influence of eRF3a N-terminal glycin repeat on eRF3-PABP binding affinity and the lower affinity of eRF3a 12-GGC allele involved in cancer susceptibility // RNA Biol. 2016. Vol. 13, № 3. P. 306-315.

32. Kononenko A. V. et al. GTP-dependent structural rearrangement of the eRF1:eRF3 complex and eRF3 sequence motifs essential for PABP binding // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № 2. P. 548-558.

33. Hoshino S. et al. The eukaryotic polypeptide chain releasing factor (eRF3/GSPT) carrying the translation termination signal to the 3'-Poly(A) tail of mRNA. Direct association of erf3/GSPT with polyadenylate-binding protein. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 24. P. 16677-16680.

34. Kushnirov V. V et al. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. // Gene. 1988. Vol. 66, № 1. P. 45-54.

35. Ivanov A. et al. PABP enhances release factor recruitment and stop codon recognition during translation termination // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, № 16. P. 7766-7776.

36. Kong C. et al. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. // Mol. Cell. 2004. Vol. 14, № 2. P. 233-245.

37. Chauvin C. et al. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation. // Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25, № 14. P. 5801-5811.

38. Frolova L.Y. et al. Functional expression of eukaryotic polypeptide chain release factors 1 and 3 by means of baculovirus/insect cells and complex formation between the factors. // Eur. J. Biochem. 1998. Vol. 256, № 1. P. 36-44.

39. Ito K., Ebihara K., Nakamura Y. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational

release factor eRF1 is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. // RNA. 1998. Vol. 4, № 8. P. 958-972.

40. Ebihara K., Nakamura Y. C-terminal interaction of translational release factors eRF1 and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids. // RNA. 1999. Vol. 5, № 6. P. 739-750.

41. Merkulova T.I. et al. C-terminal domains of human translation termination factors eRF1 and eRF3 mediate their in vivo interaction. // FEBS Lett. 1999. Vol. 443, № 1. P. 41-47.

42. Kononenko A. V et al. Role of the individual domains of translation termination factor eRF1 in GTP binding to eRF3. // Proteins. 2008. Vol. 70, № 2. P. 388-393.

43. Mitkevich V.A. et al. Termination of translation in eukaryotes is mediated by the quaternary eRF1*eRF3*GTP*Mg2+ complex. The biological roles of eRF3 and prokaryotic RF3 are profoundly distinct. // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34, № 14. P. 3947-3954.

44. Kobayashi T. et al. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 44. P. 45693-45700.

45. Ivanov P. V et al. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. // EMBO J. 2008. Vol. 27, № 5. P. 736-747.

46. Janzen D.M., Frolova L., Geballe A.P. Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA. // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22, № 24. P. 8562-8570.

47. Gutell R.R. et al. Predicting U-turns in ribosomal RNA with comparative sequence analysis. // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 300, № 4. P. 791-803.

48. Shirokikh N.E. et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № 3. P. e15.

49. Kryuchkova P. et al. Two-step model of stop codon recognition by eukaryotic release factor eRF1. // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41, № 8. P. 4573-4586.

50. Chavatte L. et al. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRF1 in the ribosome. // EMBO J. 2002. Vol. 21, № 19. P. 5302-5311.

51. Bulygin K.N. et al. Three distinct peptides from the N domain of translation termination factor eRF1 surround stop codon in the ribosome. // RNA. 2010. Vol. 16, № 10. P. 1902-1914.

52. Feng T. et al. Optimal translational termination requires C4 lysyl hydroxylation of eRF1. // Mol.

Cell. 2014. Vol. 53, № 4. P. 645-654.

53. Kolosov P. et al. Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRF1. // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33, № 19. P. 6418-6425.

54. Khoshnevis S. et al. The iron-sulphur protein RNase L inhibitor functions in translation termination. // EMBO Rep. 2010. Vol. 11, № 3. P. 214-219.

55. Dong J. et al. The essential ATP-binding cassette protein RLI1 functions in translation by promoting preinitiation complex assembly. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 40. P. 4215742168.

56. Yarunin A. et al. Functional link between ribosome formation and biogenesis of iron-sulfur proteins. // EMBO J. 2005. Vol. 24, № 3. P. 580-588.

57. Baierlein C., Krebber H. Translation termination: new factors and insights. // RNA Biol. 2010. Vol. 7, № 5. P. 548-550.

58. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC transporters: the power to change // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. Vol. 10, № 3. P. 218-227.

59. Deo R.C. et al. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. // Cell. 1999. Vol. 98, № 6. P. 835-845.

60. Lin J. et al. Nanopore detachment kinetics of poly(A) binding proteins from RNA molecules reveals the critical role of C-terminus interactions. // Biophys. J. 2012. Vol. 102, № 6. P. 14271434.

61. Eliseeva I.A., Lyabin D.N., Ovchinnikov L.P. Poly(A)-binding proteins: Structure, domain organization, and activity regulation // Biochem. 2013. Vol. 78, № 13. P. 1377-1391.

62. Imataka H., Gradi A., Sonenberg N. A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-dependent translation. // EMBO J. 1998. Vol. 17, № 24. P. 7480-7489.

63. Wells S.E. et al. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. // Mol. Cell. 1998. Vol. 2, № 1. P. 135-140.

64. Cosson B. et al. Poly(A)-binding protein acts in translation termination via eukaryotic release factor 3 interaction and does not influence [PSI(+)] propagation. // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22, № 10. P. 3301-3315.

65. Roque S. et al. Interaction between the poly(A)-binding protein Pab1 and the eukaryotic release factor eRF3 regulates translation termination but not mRNA decay in Saccharomyces cerevisiae

// RNA. 2015. Vol. 21, № 1. P. 124-134.

66. Schuller A.P. et al. eIF5A Functions Globally in Translation Elongation and Termination // Mol. Cell. 2017. Vol. 66, № 2. P. 194-205.e5.

67. Dever T.E., Gutierrez E., Shin B.-S. The hypusine-containing translation factor eIF5A // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2014. Vol. 49, № 5. P. 413-425.

68. Doerfel L.K. et al. EF-P is essential for rapid synthesis of proteins containing consecutive proline residues. // Science. 2013. Vol. 339, № 6115. P. 85-88.

69. Pavlov M.Y. et al. Slow peptide bond formation by proline and other N-alkylamino acids in translation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 1. P. 50-54.

70. Gutierrez E. et al. eIF5A Promotes Translation of Polyproline Motifs // Mol. Cell. 2013. Vol. 51, № 1. P. 35-45.

71. Pelechano V., Alepuz P. eIF5A facilitates translation termination globally and promotes the elongation of many non polyproline-specific tripeptide sequences // Nucleic Acids Res. 2017.

72. Gerashchenko M. V, Gladyshev V.N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 17. P. e134.

73. Skabkin M.A. et al. Reinitiation and other unconventional posttermination events during eukaryotic translation. // Mol. Cell. 2013. Vol. 51, № 2. P. 249-264.

74. Susorov D. et al. Stabilization of eukaryotic ribosomal termination complexes by deacylated tRNA // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № 6. P. 3332-3343.

75. Snay-Hodge C.A. et al. Dbp5p/Rat8p is a yeast nuclear pore-associated DEAD-box protein essential for RNA export // EMBO J. 1998. Vol. 17, № 9. P. 2663-2676.

76. Tseng S.S.I. et al. Dbp5p, a cytosolic RNA helicase, is required for poly(A)+ RNA export // EMBO J. 1998. Vol. 17, № 9. P. 2651-2662.

77. Schmitt C. et al. Dbp5, a DEAD-box protein required for mRNA export, is recruited to the cytoplasmic fibrils of nuclear pore complex via a conserved interaction with CAN/Nup159p // EMBO J. 1999. Vol. 18, № 15. P. 4332-4347.

78. Zhao J. et al. The mRNA export factor Dbp5 is associated with Balbiani ring mRNP from gene to cytoplasm // EMBO J. 2002. Vol. 21, № 5. P. 1177-1187.

79. Chang T.H., Arenas J., Abelson J. Identification of five putative yeast RNA helicase genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. Vol. 87, № 4. P. 1571-1575.

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

Amberg D.C., Goldstein A.L., Cole C.N. Isolation and characterization of RAT1: an essential gene of Saccharomyces cerevisiae required for the efficient nucleocytoplasmic trafficking of mRNA. // Genes Dev. 1992. Vol. 6, № 7. P. 1173-1189.

Gross T. et al. The DEAD-Box RNA Helicase Dbp5 Functions in Translation Termination // Science (80-. ). 2007. Vol. 315, № 5812. P. 646-649.

Tieg B., Krebber H. Dbp5 - From nuclear export to translation // Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech. Elsevier B.V., 2013. Vol. 1829, № 8. P. 791-798.

Collins R. et al. The DEXD/H-box RNA helicase DDX19 is regulated by an {alpha}-helical switch. // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284, № 16. P. 10296-10300.

Singleton M.R., Dillingham M.S., Wigley D.B. Structure and Mechanism of Helicases and Nucleic Acid Translocases // Annu. Rev. Biochem. 2007. Vol. 76, № 1. P. 23-50.

Linder P., Fuller-Pace F. V. Looking back on the birth of DEAD-box RNA helicases // Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech. 2013. Vol. 1829, № 8. P. 750-755.

Fairman-Williams M.E., Guenther U.-P., Jankowsky E. SF1 and SF2 helicases: family matters // Curr. Opin. Struct. Biol. 2010. Vol. 20, № 3. P. 313-324.

Byrd A.K., Raney K.D. Superfamily 2 helicases. // Front. Biosci. (Landmark Ed. 2012. Vol. 17. P.2070-2088.

Linder P., Jankowsky E. From unwinding to clamping — the DEAD box RNA helicase family // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2011. Vol. 12, № 8. P. 505-516.

LINDER P. et al. Birth of the D-E-A-D box // Nature. 1989. Vol. 337, № 6203. P. 121-122.

Caruthers J.M., McKay D.B. Helicase structure and mechanism. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. Vol. 12, № 1. P. 123-133.

Tanner N.K. et al. The Q motif: a newly identified motif in DEAD box helicases may regulate ATP binding and hydrolysis. // Mol. Cell. 2003. Vol. 11, № 1. P. 127-138.

Walker J.E. et al. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. // EMBO J. 1982. Vol. 1, № 8. P. 945-951.

Pause A., Methot N., Sonenberg N. The HRIGRXXR region of the DEAD box RNA helicase eukaryotic translation initiation factor 4A is required for RNA binding and ATP hydrolysis. // Mol. Cell. Biol. 1993. Vol. 13, № 11. P. 6789-6798.

94. Rocak S. et al. Characterization of the ATPase and unwinding activities of the yeast DEAD-box protein Haslp and the analysis of the roles of the conserved motifs. // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33, № 3. P. 999-1009.

95. Cordin O. et al. The DEAD-box protein family of RNA helicases // Gene. 2006. Vol. 367. P. 17-37.

96. Hilbert M., Karow A.R., Klostermeier D. The mechanism of ATP-dependent RNA unwinding by DEAD box proteins // Biol. Chem. 2009. Vol. 390, № 12. P. 1237-1250.

97. Yang Q. et al. DEAD-Box Proteins Unwind Duplexes by Local Strand Separation // Mol. Cell. 2007. Vol. 28, № 2. P. 253-263.

98. Andersen C.B.F. et al. Structure of the exon junction core complex with a trapped DEAD-box ATPase bound to RNA. // Science. 2006. Vol. 313, № 5795. P. 1968-1972.

99. Bono F. et al. The crystal structure of the exon junction complex reveals how it maintains a stable grip on mRNA. // Cell. 2006. Vol. 126, № 4. P. 713-725.

100. Sengoku T. et al. Structural basis for RNA unwinding by the DEAD-box protein Drosophila Vasa. // Cell. 2006. Vol. 125, № 2. P. 287-300.

101. Liu F., Putnam A., Jankowsky E. ATP hydrolysis is required for DEAD-box protein recycling but not for duplex unwinding // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. Vol. 105, № 51. P. 20209-20214.

102. Chen Y. et al. DEAD-box proteins can completely separate an RNA duplex using a single ATP. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105, № 51. P. 20203-20208.

103. Henn A. et al. The ATPase cycle mechanism of the DEAD-box rRNA helicase, DbpA. // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 377, № 1. P. 193-205.

104. Lorsch J.R., Herschlag D. The DEAD box protein eIF4A. 1. A minimal kinetic and thermodynamic framework reveals coupled binding of RNA and nucleotide. // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 8. P. 2180-2193.

105. Jankowsky E., Fairman M.E. RNA helicases--one fold for many functions. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. Vol. 17, № 3. P. 316-324.

106. Weirich C.S. et al. Activation of the DExD/H-box protein Dbp5 by the nuclear-pore protein Gle1 and its coactivator InsP6 is required for mRNA export. // Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8, № 7. P. 668-676.

107. Alcázar-Román A.R. et al. Inositol hexakisphosphate and Gle1 activate the DEAD-box protein Dbp5 for nuclear mRNA export. // Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8, № 7. P. 711-716.

108. Hodge C.A. et al. Rat8p/Dbp5p is a shuttling transport factor that interacts with Rat7p/Nup159p and Gle1p and suppresses the mRNA export defect of xpo1-1 cells // EMBO J. 1999. Vol. 18, № 20. P. 5778-5788.

109. Estruch F. et al. Insights into mRNP biogenesis provided by new genetic interactions among export and transcription factors. // BMC Genet. 2012. Vol. 13. P. 80.

110. Rajakylä E.K. et al. RNA export factor Ddx19 is required for nuclear import of the SRF coactivator MKL1. // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 5978.

111. Grünwald D., Singer R.H., Rout M. Nuclear export dynamics of RNA-protein complexes // Nature. 2011. Vol. 475, № 7356. P. 333-341.

112. Fribourg S., Conti E. Structural similarity in the absence of sequence homology of the messenger RNA export factors Mtr2 and p15 // EMBO Rep. 2003. Vol. 4, № 7. P. 699-703.

113. Weirich C.S. et al. The N-terminal domain of Nup159 forms a ??-propeller that functions in mRNA export by tethering the helicase Dbp5 to the nuclear pore // Mol. Cell. 2004. Vol. 16, № 5. P. 749-760.

114. von Moeller H., Basquin C., Conti E. The mRNA export protein DBP5 binds RNA and the cytoplasmic nucleoporin NUP214 in a mutually exclusive manner. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. Vol. 16, № 3. P. 247-254.

115. Napetschnig J. et al. Structural and functional analysis of the interaction between the nucleoporin Nup214 and the DEAD-box helicase Ddx19. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 9. P. 3089-3094.

116. Noble K.N. et al. The Dbp5 cycle at the nuclear pore complex during mRNA export II: nucleotide cycling and mRNP remodeling by Dbp5 are controlled by Nup159 and Gle1. // Genes Dev. 2011. Vol. 25, № 10. P. 1065-1077.

117. Lund M.K., Guthrie C. The DEAD-box protein Dbp5p is required to dissociate Mex67p from exported mRNPs at the nuclear rim // Mol. Cell. 2005. Vol. 20, № 4. P. 645-651.

118. Tran E.J. et al. The DEAD-box protein Dbp5 controls mRNA export by triggering specific RNA:protein remodeling events. // Mol. Cell. 2007. Vol. 28, № 5. P. 850-859.

119. Bolger T.A. et al. The mRNA Export Factor Gle1 and Inositol Hexakisphosphate Regulate Distinct Stages of Translation // Cell. 2008. Vol. 134, № 4. P. 624-633.

120. Murphy R., Wente S.R. An RNA-export mediator with an essential nuclear export signal // Nature. 1996. Vol. 383, № 6598. P. 357-360.

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

Watkins J.L. et al. The human homologue of Saccharomyces cerevisiae Gle1p is required for poly(A)+ RNA export. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. Vol. 95, № 12. P. 6779-6784.

Alcázar-Román A.R., Bolger T.A., Wente S.R. Control of mRNA export and translation termination by inositol hexakisphosphate requires specific interaction with Gle1. // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285, № 22. P. 16683-16692.

Montpetit B. et al. A conserved mechanism of DEAD-box ATPase activation by nucleoporins and InsP6 in mRNA export. // Nature. 2011. Vol. 472, № 7342. P. 238-242.

Folkmann A.W., Dawson T.R., Wente S.R. Insights into mRNA export-linked molecular mechanisms of human disease through a Gle1 structure-function analysis // Adv. Biol. Regul. 2014. Vol. 54, № 1. P. 74-91.

Kendirgi F. et al. An essential role for hGle1 nucleocytoplasmic shuttling in mRNA export // J. Cell Biol. 2003. Vol. 160, № 7. P. 1029-1040.

Folkmann A.W. et al. XGle1 functions during mRNA export in an oligomeric complex that is altered in human disease // Cell. Elsevier Inc., 2013. Vol. 155, № 3. P. 582-593.

Folkmann A.W. et al. Dbp5, Gle1-IP 6 and Nup159 // Nucleus. 2011. Vol. 2, № 6. P. 540-548.

Hodge C.A. et al. The Dbp5 cycle at the nuclear pore complex during mRNA export I: Dbp5 mutants with defects in RNA binding and ATP hydrolysis define key steps for Nup159 and Gle1 // Genes Dev. 2011. Vol. 25, № 10. P. 1052-1064.

Kendirgi F. et al. Interaction between the shuttling mRNA export factor Gle1 and the nucleoporin hCG1: a conserved mechanism in the export of Hsp70 mRNA. // Mol. Biol. Cell. 2005. Vol. 16, № 9. P. 4304-4315.

Strahm Y. et al. The RNA export factor Gle1p is located on the cytoplasmic fibrils of the NPC and physically interacts with the FG-nucleoporin Rip1p, the DEAD-box protein Rat8p/Dbp5p and a new protein Ymr 255p. // EMBO J. 1999. Vol. 18, № 20. P. 5761-5777.

Bolger T.A., Wente S.R. Gle1 is a multifunctional DEAD-box protein regulator that modulates Ded1 in translation initiation. // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 46. P. 39750-39759.

Rayala H.J. et al. The mRNA export factor human Gle1 interacts with the nuclear pore complex protein Nup155. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. Vol. 3, № 2. P. 145-155.

Stutz F. et al. The yeast nucleoporin rip1p contributes to multiple export pathways with no essential role for its FG-repeat region. // Genes Dev. 1997. Vol. 11, № 21. P. 2857-2868.

York J.D. et al. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required

for efficient messenger RNA export. // Science. 1999. Vol. 285, № 5424. P. 96-100.

135. Miller A.L. et al. Cytoplasmic inositol hexakisphosphate production is sufficient for mediating the Glel-mRNA export pathway. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 49. P. 51022-51032.

136. Aditi, Folkmann A.W., Wente S.R. Cytoplasmic hGle1A regulates stress granules by modulation of translation. // Mol. Biol. Cell. 2015. Vol. 26, № 8. P. 1476-1490.

137. Dossani Z.Y. et al. Structure of the C-terminus of the mRNA export factor Dbp5 reveals the interaction surface for the ATPase activator Gle1. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 38. P. 16251-16256.

138. Hodge C.A. et al. The Dbp5 cycle at the nuclear pore complex during mRNA export I: dbp5 mutants with defects in RNA binding and ATP hydrolysis define key steps for Nup159 and Gle1. // Genes Dev. 2011. Vol. 25, № 10. P. 1052-1064.

139. Ledoux S., Guthrie C. Regulation of the Dbp5 ATPase cycle in mRNP remodeling at the nuclear pore: A lively new paradigm for DEAD-box proteins // Genes Dev. 2011. Vol. 25, № 11. P. 1109-1114.

140. Yedavalli V.S.R.K. et al. Requirement of DDX3 DEAD box RNA helicase for HIV-1 Rev-RRE export function. // Cell. 2004. Vol. 119, № 3. P. 381-392.

141. Panniers R. Translational control during heat shock. // Biochimie. 1994. Vol. 76, № 8. P. 737747.

142. Hilliker A. et al. The DEAD-box protein Ded1 modulates translation by the formation and resolution of an eIF4F-mRNA complex. // Mol. Cell. 2011. Vol. 43, № 6. P. 962-972.

143. Nousiainen H.O. et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. // Nat. Genet. 2008. Vol. 40, № 2. P. 155-157.

144. Herva R. et al. A syndrome of multiple congenital contractures: neuropathological analysis on five fetal cases. // Am. J. Med. Genet. 1988. Vol. 29, № 1. P. 67-76.

145. Kaneb H.M. et al. Deleterious mutations in the essential mRNA metabolism factor, hGle1, in amyotrophic lateral sclerosis. // Hum. Mol. Genet. 2015. Vol. 24, № 5. P. 1363-1373.

146. Aditi et al. An amyotrophic lateral sclerosis-linked mutation in GLE1 alters the cellular pool of human Gle1 functional isoforms // Adv. Biol. Regul. 2016. Vol. 62. P. 25-36.

147. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

148. Seit-Nebi A. et al. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29, № 19. P. 3982-3987.

149. Spahn C.M.T. et al. Domain movements of elongation factor eEF2 and the eukaryotic 80S ribosome facilitate tRNA translocation. // EMBO J. 2004. Vol. 23, № 5. P. 1008-1019.

150. Susorov D. et al. Eukaryotic translation elongation factor 2 (eEF2) catalyzes reverse translocation of the eukaryotic ribosome // J. Biol. Chem. 2018. Vol. 293, № 14. P. 5220-5229.

151. Firczuk H. et al. An in vivo control map for the eukaryotic mRNA translation machinery. // Mol. Syst. Biol. 2013. Vol. 9, № 635. P. 635.

152. Krasnov G.S. et al. CrossHub: a tool for multi-way analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) in the context of gene expression regulation mechanisms // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, № 7. P. e62-e62.

153. Спирин Александр Сергеевич. Молекулярная биология. Рибосомы и синтез белка. / ed. Пирогова И.В. Москва: Издательский центр "Академия," 2011.

154. Hinnebusch A.G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. // Annu. Rev. Biochem. 2014. Vol. 83, № 1. P. 779-812.

155. Hernandez A.I. et al. Protein kinase M zeta synthesis from a brain mRNA encoding an independent protein kinase C zeta catalytic domain. Implications for the molecular mechanism of memory. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 41. P. 40305-40316.

156. Bal N. V. et al. Upstream Open Reading Frames Located in the Leader of Protein Kinase MZ mRNA Regulate Its Translation // Front. Mol. Neurosci. 2016. Vol. 9. P. 103.