Теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Фролов, Алексей Евгеньевич

• Фролов, Алексей Евгеньевич
• кандидат физико-математических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Фролов, Алексей Евгеньевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Общие представления о фотосинтезе.

1.2. Цепь электронного транспорта хлоропластов.

1.3. Регуляция фотосинтеза в хлоропластах.

1.4. Цитохромный /^комплекс.

1.5. Математическое моделирование электронного транспорта в фотосинтетических системах.

1.6. Некоторые аспекты теоретического описания электронного транспорта, сопряженного с перносом протонов в биологических системах.

2. Квантово-химические методы расчетов.

2.1. Теоретические основы метода функционала плотности.

2.2. Метод квантово-химических расчетов (программа «Природа»).

3. Моделирование электронного и протонного транспорта в хлоропластах с учётом активации цикла Кальвина и изменений рН стромы.

3.1. Структура модели.

3.1.1. Геометрические характеристики модели.

3.1.2. Функциональные характеристики системы.

3.2. Система уравнений и методы решения.

3.3. Результаты расчётов и их обсуждение.

3.3.1. Поведение системы в ответ на включение света в различных метаболических состояниях.

3.3.1.1. Метаболическое состояние 3.

3.3.1.2. Активность ферментов цикла Кальвина максимальна.

3.3.1.3. Метаболическое состояние 4 (АТР-синтаза неактивна).

3.3.1.4. Метаболическое состояние 5 (разобщенные хлороппасты).

3.3.2. Влияние начальных условий на кинетическое поведение системы.

3.3.2.1. Метаболическое состояние 3.

3.3.2.2. Активность ферментов цикла Кальвина максимальна.

3.3.2.3. Влияние начальной концентрации окисленной формы конечного акцептора электрона на кинетическое поведение ФС1.

3.3.3. Влияние параметров модели на поведение системы.

3.3.3.1. Влияние кислорода.

3.3.3.2. Влияние параметров активации цикла Кальвина.

3.3.3.3. Влияние ДрНна активность ферментов цикла Кальвина.

4. Квантово-химическое моделирование реакции окисления пластохинола в активном центре Q0 цитохромного б^комплекса.

4.1. Квантово-химические расчеты спектров ЭПР аналогов пластосемихинона

4.2. Энергетика реакции окисления триметил-1,4-бензохинола.

4.2.1. Квантово-химическое моделирование реакции окисления TMQH2.

4.2.1.1. Описание модельной системы.

4.2.1.2. Оптимизация геометрии модельной системы.

4.2.1.3. Энергетический профиль первой стадии реакции окисления TMQH2.

4.2.1.4. Перераспределение зарядов.

4.2.1.5. Оценки константы скорости и энергии реорганизации

4.2.1.6. Сродство триметш-1,4-бензохинола к железо-серному белку Риске &

4.2.1.7. Редуцированная модельная система.

4.2.2. Квантово-химическое моделирование реакции окисления TMQH.

4.2.2.1. Описание модельной системы.

4.2.2.2. Оптимизация геометрии модельной системы.

4.2.2.3. Энергетика реакции окисления TMQH.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах»

Математическое моделирование давно применяется для анализа световых и темновых стадий фотосинтеза. Моделирование процессов электронного и протонного транспорта с учетом структурных и функциональных особенностей тилакоидных мембран может играть важную роль для количественного анализа механизмов регуляции электронного транспорта и энергетического сопряжения в хлоропластах. Это связано с тем, что непосредственные измерения рН внутри компартментов малых размеров (например, в узкой межтилакоидной щели) с помощью рН-чувствительных зондов затруднены. Однако количественное описание биоэнергетических процессов в фотосинтетических системах осложняется высокой степенью компартментализации фотосинтетического аппарата на разных уровнях структурной организации.

В первой части диссертационной работы рассматривается математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений, учитывающая фотоиндуцированные изменения рН во внутритилакоидном пространстве и в строме хлоропласта (Глава 3). В этой модели наряду с нециклическим (линейным) транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, учитываются процессы синтеза АТФ, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТФ-синтазу, потребление АТФ в цикле Кальвина, а также окислительно-восстановительные превращения конечного акцептора электрона ФС1. В данной модели феноменологически описываются процессы активации цикла Кальвина, обусловленные зависимостью скоростей реакций цикла Кальвина от рН стромы хлоропласта. Результаты численного эксперимента показали, что процессы светоиндуцированной активации ферментов цикла Кальвина, влияющие на скорость оттока электронов от ФС1, могут заметным образом сказываться на кинетике электрон-транспортных процессов в интактных хлоропластах. В частности, рН-зависимое ускорение оттока электронов на акцепторном участке ФС1 за счет активации цикла Кальвина может быть причиной многофазной (немонотонной) кинетики окислительно-восстановительных превращений Р700 при освещении адаптированных к темноте хлоропластов, которая наблюдается в опытах с интактными хлоропластами in situ.

Во второй части диссертации описаны свойства двух модельных систем, построенных для квантовохимического моделирования двух элементарных стадий реакции окисления хинола в хинон-связывающем центре Qc цитохромного /^комплекса, являющейся лимитирующей в цепи электронного транспорта в хлоропластах (Глава 4). Обе модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре цитохромного 6^комплекса зеленой водоросли Chlamodomonas reinhardtii. Методом функционала плотности рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре Q0, сопряженных с процессами переноса протона от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и высокопотенциальному цитохрому Показано, что построенные модельные системы дают корректное описание реакции окисления хинола в центре Q0, согласующееся с представлениями о бифуркационном характере этой реакции в соответствии с механизмом Q-цикла Митчелла. Результаты расчетов хорошо согласуются с известными представлениями о том, что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между двумя фотосистемами является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного б^комплекса.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Фролов, Алексей Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Построена математическая модель процессов электронного и протонного транспорта в хлоропластах, впервые учитывающая не только фотоиндуцированные изменения рН внутритилакоидного пространства (pHj), но и изменения рН в строме (рН0), влияющие на процессы активации реакций цикла Кальвина.

2. Выделены два основных фактора рН-зависимой регуляции электронного транспорта, определяющие немонотонную временную зависимость редокс-превращений Р700и других электронных переносчиков: а) торможение электронного транспорта между фотосистемами 2 и 1 вследствие уменьшения рН;; б) ускорение оттока электронов от ФС1, обусловленное увеличением рНо.

3. Построены модельные системы для описания методом функционала плотности двух стадий окисления пластохинола в хинон-связывающем центре Qc цитохромного Ьф комплекса фотосинтетической цепи переноса электронов.

4. Расчеты спиновой плотности на ядрах атомов водорода анион-радикала триметил-1,4-бензохинона дали хорошее согласие с экспериментом, что свидетельствует об адекватности использованного метода расчета электронных характеристик молекул хиноидной природы.

5. Впервые рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре Q0, сопряженных с процессами последовательного переноса электронов от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и цитохрому be'. Полученные результаты хорошо согласуются с представлениями о том, что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между фотосистемами 2 и 1 является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного /^комплекса.

Заключение

В диссертационной работе построена математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений и клетках цианобактерий, которая является развитием созданных ранее моделей фотосинтеза, посвященных рН-зависимой регуляции фотосинтеза [72-80]. В этой модели вместе с нециклическим (линейным) транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, учитываются процессы синтеза АТР, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТР-синтазу, а также потребление AIP и NADPH в цикле Кальвина. Наряду с фотоиндуцированными изменениями рН во внутритилакоидном пространстве, влияющими на скорость электронного переноса на пластохиноновом участке цепи электронного транспорта, были смоделированы рН-зависимые процессы электронного переноса на акцепторном участке ФС1, а также рассмотрено (в рамках феноменологического подхода) влияние фотоиндуцированных изменений стромального рН на потребление терминального акцептора ФС1 в реакциях цикла Кальвина. Учет фотоиндуцированных изменений рН в строме и во внутритилакоидном пространстве позволил описать влияние процессов активации ферментов цикла Кальвина на кинетику фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений ряда переносчиков электрон-транспортной цепи хлоропластов. Сравнение результатов численных экспериментов, выполненных для различных метаболических состояний хлоропластов, с известными из литературы экспериментальными данными для листьев высших растений и клеток цианобактерий показывает, что модель адекватно описывает основные закономерности сложной немонотонной кинетики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных изменений первичного донора электронов ФС1 (Р700), а также фотоиндуцированные изменения рН„ и рН;.

Во второй части диссертационной работы описаны свойства двух модельных систем, построенных для квантово-химического моделирования окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0. Обе модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре цитохромного комплекса b(f зеленой водоросли Chlamodomonas reinhardtii. Одна из модельных систем (рис. 3) построена для моделирования окисления хинола в центре Q0; для этой системы рассчитан энергетический профиль первой стадии реакции окисления хинола - перенос атома водорода от аналога пластохинона триметил-1,4,бензохинол (TMQH2) на железо-серный белок Риске. Вторая модельная система (рис. 4) построена для моделирования переноса протона от семихинона (TMQH) на низкопотенциальный гем цитохрома be,. Обе стадии окисления хинола рассматриваются как процессы, в ходе которых атом водорода, отдаваемый одной из гидроксильных групп TMQH2, идет к одному из акцепторов депротонированный остаток (Hisl55 или Glu78) по дну энергетической "долины", определяемой фиксированными атомами модельной системы.

Среди факторов, влияющих на энергетику реакций переноса атома водорода в модельных системах, описанных выше, выделим положение хинола и ближайших групп, принимающих протон (Hisl55 и GIu78). Вероятность переноса протона от TMQH2 на депротонированный остаток Hisl55, координирующий атом Fe (ТегЗг^кластера ISP, очень чувствительна даже к незначительным структурным изменениям комплекса. Варьирование расстояния туннелирования и ориентации донора (TMQH2) и акцептора протона (Hisl55-[Fe2S2]) может заметно влиять на энергетические профили реакции переноса протона (рис. 9). Сравнительный анализ энергетических профилей для структур с различными атомными конфигурациями позволил выбрать наиболее приемлемую, на наш взгляд, конфигурацию модельной системы для адекватного описания первой (лимитирующей) стадии окисления хинона. Анализируя изменение геометрии исходной (рентгеновской) системы в ходе оптимизации, было обнаружено, что одна из частично оптимизированных систем (обозначенная как А—1) может быть использована как базовая структура для расчетов первой стадии окисления TMQH2. Атомная конфигурация системы А—1 близка к геометрии исходной системы, построенной на основе рентгеноструктурных данных. В этой системе энергия формирования фермент-субстратного комплекса определяется как понижение энергии при взаимодействии TMQH2 со свободной частью системы, которое составляет относительно малую величину, SE ~ -2 ккал/моль.

Результаты расчетов показали, что модельные системы, представленные на рис. 3 и 4, в принципе дают правильное объяснение энергетики РСЕТ реакции окисления окисления хинола в центре Q0. Первый шаг окисления хинола, моделируемый как перенос протона от TMQH2 к Hisl55, представляет собой эндогенный процесс (AG° — 10.7 ккал/моль при 298 К) с относительно большим активационным барьером (24,36 ккал/моль при 298 К). Этот результат хорошо согласуется с известными предположениями о том, что перенос первого электрона при окислении хинола в цитохромном комплексе be 1 является энерго-акцепторным процессом [65,66,152,157,162-166]. Следующий шаг окисления хинола (QH —* £6L), рассматриваемый в рамках второй модельной системы (рис. 4), является экзогенным процессом (АЕ2~ -9,6 ккал/моль), что указывает на то, что перенос второго протона происходит значительно быстрее, чем перенос первого протона.

Эти результаты согласуются с общепринятой точкой зрения, что первый шаг окисления хинола является лимитирующим процессом, определяющим скорости родственных цитохромных комплексов b(f и Ъс\ [65,66,162-173].

Интерпретация полученных результатов, основанная на использовании уравнений классической теории электронного транспорта Маркуса, находится в хорошем согласии с кинетическими данными, доступными в литературе, что подтверждает вывод об эндогенной природе первого шага окисления хинола в центре Q0. Рассматривая первый шаг окисления TMQH2 как лимитирующую реакцию электронного транспорта, сопряженной с переносом протона вдоль водородной связи между -ОН группой TMQH2 и соседним атомом Nc остатка гистидина Hisl55 окисленного железо-серного центра, была сделана оценка общей константы скорости &рсЕТ окисления хинола. Значение &рсЕТ было вычислено на основании структурных данных и рассчитанного энергетического профиля для первой стадии окисления хинола. Были рассчитаны изменение свободной энергии A G° и высота барьера реакции AGpCET. Согласие значений расчетной и экспериментальной констант скоростей 280 с-1 [149-151]) было получено в предположении, что реакция переноса водорода характеризуется сравнительно малыми значениями энергии реорганизации Я ~ 0,9-1,4 ккал/моль (40-60 мэВ).

Большое значение константы скорости для второй стадии окисления хинола (&рсет 109-10п с"1), полученное на основании расчетных данных, может обеспечить условия для высокой эффективности бифуркционной реакции концертного двуэлекгронного окисления хинола до хинона, объясняющая механизм переноса второго электрона исключительно по высоко-потенциальную цепь. В этом случае, энергетически выгодная стадия окисления TMQH, вообще говоря, не требует обязательного смещения семихинона внутри полости Q0 в сторону цитохрома . Иными словами, можно предположить, что обе стадии переноса протона в реакции бифуркационного окисления хинола до хинона могут происходить «концертно» и без вращения семихинона в полости Q0. Разумеется, что этот механизм вовсе не исключает того, что первичные элементарные стадии окисления хинола в каталитическом центре фермента сопровождаются конформационной релаксацией белковой глобулы и релаксационными процессами в его ближайшем окружения (см., например, [175]). Нельзя также исключить того, что после переноса протона на Glu78 может происходить вращение протонированного амиокислотного остатка Glu78, которое, как предположил Крофтс с сотрудниками [65,66], необходимо для выхода протона из центра Qc цитохромного ^-комплекса. Несомненно, что более глубокое понимание механизмов работы цитохромного й^комплекса невозможно без изучения динамических особенностей этой системы методами молекулярной динамики. Однако детальный анализ этих процессов выходит за рамки задач, поставленных в данной диссертационной работе. Касаясь дальнейших перспектив нашей работы, можно предположить, что описанные выше модели могут быть использованы как базовые структуры для исследования окисления хинола в более сложных системах с использованием современных методы компьютерной химии (таких как, QM/MM метод).

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Фролов, Алексей Евгеньевич, 2009 год

1. E.I. Rabinovitch, Photosynthesis and related processes, v.I, Chemistry of photosynthesis, chemosynthesis and related processes in vitro and in vivo, Interscience Publ. Inc., N. Y., 1945.

2. A.K. Кукушкин, A.H. Тихонов, Лекции по биофизике фотосинтеза высших растений. Изд-во МГУ, Москва, 1988.

3. А.Б. Рубин, Биофизика, тт. 1 и 2, Книжный дом «Университет», Москва, 1999.

4. R.E. Blankenship, Molecular Mechanisms of Photosynthesis, Blackwell Science, 2002.

5. D.G. Nickolls, S.J. Ferguson, Bioenergetics 3, Academic Press, Inc., N.Y., 2002.

6. D.L. Nelson, M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth Edition, Worth publishers, N.Y. 2005.

7. P. Jordan, P. Fromme, H.-T. Witt, O. Klukas, W. Saenger, N. KrauB, Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature, 411 (2001) 909-917.

8. Ben-Shem, F. Frolow, N. Nelson, Crystal structure of plant photosystem I, Nature 426 (2003) 630-635.

9. Zouni, H.-T. Witt, J. Kern, P. Fromme, N. KrauB, W. Saenger, P. Orth, Crystal structure of photosystem II from Synechococcuselongatus at 3.8 A resolution, Nature 409 (2001) 739743.

10. Kamiya N., Shen J.-R. (2003) Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II from Thermosynechococcus vulcanus at 3.7-A resolution Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 100, 98103.

11. D. Stroebel, Y. Choquet, J.-L. Popot, D. Picot, An atypical heam in the cytochrome b<f complex, Nature 426 (2003) 413-418.

12. G. Kurisu, H. Zhang, J.L. Smith, W. A. Cramer, Structure of the cytochrome b<f complex of oxygenic photosynthesis: tuning the cavity, Science 302 (2003) 1009-1014.

13. J.P. Abrahams, A.G.W. Leslie, R. Lutter, J.E. Walker, Structure at 2.8 A resolution of Fl-ATPase from bovine heart mitochondria, Nature 370 (1994) 621-628.

14. D. Stock, A.G.W. Leslie, J.E. Walker, Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase, Science, 286 (1999) 1700-1705.

15. Biochim. Biophys. Acta, V. 1458 (2000) № 2-3 (Special Issue. Guest Editor: J. Walker).

16. J. Bioenerg. Biomembr., V. 32 (2000) № 4 and № 5 (Minirevievv series, ATP synthesis in the Year 2000: current views about structure, motor components, energy interconversions and catalytic mechanisms, Parts I and П).

17. C.H.Foyer, G. Noctor, Homeostasis of adenylate status during photosynthesis in a fluctuating environment, J. Exp. Botany 51 (2000) 15-19.

18. J.F. Allen, State transitions a question of balance, Science 299 (2003) 1530-1532.

19. A.R. Grossman, D. Bhaya, Q. He, Tracking the light environment by cyanobacteria and the dynamic nature by light harvesting, J. Biol. Chem. 276 (2001) 11449-11452.

20. A. Haldrup, P.E. Jensen, C. Lunde, H. V. Scheller, Balance of power: a view of the mechanism of photosynthetic state transitions, Trends in Plant Science 6 (2001) 301-305.

21. A.H. Тихонов, Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза, Соросовский Образовательный Журнал, № 11 (1999) стр.8-15.

22. В. Rumberg, U. Siggel, рН changes in the inner phase of the thylakoid during photosynthesis, Naturwissenschaften 56 (1969) 130-132.

23. A.N. Tikhonov, G.B. Khomutov, E.K. Ruuge, L.A. Blumenfeld, Electron transport control in chloroplasts. Effects of photosynthetic control monitored by the intrathylakoid pH, Biochim. Biophys. Acta 637 (1981) 321-333.

24. A.H. Тихонов, JI. А. Бшоменфельд, Концентрация водородных ионов в субклеточных частицах: физический смысл и методы определения, Биофизика 30 (1985) 527-537.

25. L.A. Blumenfeld, A.N. Tikhonov, Biophysical Thermodynamics of Intracellular Processes. Molecular Machines of the Living Cell, Springer-Verlag, New York (1994).

26. D.M. Kramer, С.A. Sacksteder, J.A. Cruz, How acidic is the lumen? Photosynth. Res. 60 (1999) 151-163.

27. В. V. Trubitsin, A.N. Tikhonov, Determination of a transmembrane pH difference in chloroplasts with a spin label Tempamine, J. Magn. Reson. 163 (2003) 257-269.

28. A.N. Tikhonov, R.V. Agafonov, I.A. Grigor'ev, I.A.Kirilyuk, V.V. Ptushenko,

29. В. V. Trubitsin, Spin-probes designed for measuring the intrathylakoid pH in chloroplasts, Biochim. Biophis. Acta 1777 (2008) 285-294.

30. H.H. Stiehl, H.L. Witt, Quantitative treatment of the function of plastoquinone in photosynthesis, Z. Naturfor'sch. 24b (1969) 1588-1598.

31. Witt H.T. Coupling of quanta, electrons, fields, ions and phosphorylation in the functional membrane of photosynthesis. Results of pulse spectroscopic methods, Q. Rev. Biophys. 4 (1971) 365-477.

32. U. Siggel, The function of plastoquinone as electron and proton carrier in photosynthesis, Bioelectrochem. Bioenerg. 3 (1976) 302-318.

33. W. Haehnel, Photosynthetic electron transport in higher plants, Ann. Rev. Plant Physiol. 35 (1984) 659-693.

34. W. Haehnel, The reduction kinetics of chlorophyll ax as an indicator of for proton uptake between the light reactions in chloroplasts, Biochim. Biophys. Acta 440 (1976) 506-521.

35. A.N. Tikhonov, G.B. Khomutov, E.K. Ruuge, Electron transport control in chloroplasts. Effects of magnesium ions on the electron flow between two photosystems, Photobiochem. Photobiophys. 8 (1984) 261-269.

36. M. Nishimura, T. Ito, B. Chance, Studies on bacterial phosphorylation. Ш. A sensitive and rapid method of determination of photophosphorylation, Biochim. Biophys. Acta 59 1962) 177-182.

37. H.W. Heldt, K.Werdan, M. Milovancev, G. Geller, Alkalization of the chloroplast stroma caused by light-dependent proton flux into the thylakoid space, Biochim. Biophys. Acta 314(1973)224-241.

38. P.R. Rich, D.S. Bendall, The kinetics and thermodynamics of the reduction of cytochrome с by substituted p-benzoquinols in solution, Biochim. Biophys. Acta 592 (1980) 506-18.

39. P.R. Rich, Electron transfer reactions between quinols and quinones in aqueous and aprotic media, Biochim. Biophys. Acta 637 (1981) 28-33.

40. P.R. Rich, Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes, Biochim. Biophys. Acta 768 (1984) 53-79.

41. P.R. Rich, The quinone chemistry of be complexes, Biochim. Biophys. Acta 1658 (2004) 165-171.

42. U. Brandt, J. Okun, Role of deprotonation events in ubihydroquinone:cytochrome с oxidoreductase from bovine heart and yeast mitochondria, Biochemistry 36 (1997) 1123411240.

43. T.A. Link, The role of the "Rieske" iron sulfur protein in the hydroquinone oxidation (Qp-) site of the cytochrome bc\ complex: the "proton-gated affinity change" mechanism, FEBS Lett 412 (1997) 257-264.

44. U. Brandt, The chemistry and mechanics of ubihydroquinone oxidation at center P (Q„) of the cytochrome bcx complex, Biochim. Biophys. Acta 1365 (1998) 261-268.

45. P. Horton, A.V.Ruban, R.G. Walters, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47 (1996) 655-684.

46. K.K. Niyogi, X.P. Li, V. Rosenberg, H. S. Jung, J. Exp. Bot. 56 (2004) 375-382.

47. H.B. Карапетян, Биохимия 72 (2007) 1385-1395.

48. D.S. Bendall, R.S. Manasse, Cyclic photophosorylation and electron transport, Biochim. Biophys. Acta 1229 (1995) 23-38.

49. P. Joliot, A. Joliot, Cyclic electron transfer in plant leaf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 10209-10214.49.