Глицил–тРНК синтетаза человека как неканонический фактор инициации трансляции энтеровирусных мРНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Виноградова Екатерина Сергеевна

• Виноградова Екатерина Сергеевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Виноградова Екатерина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРТУРЫ

1. Каноническая кеп-зависимая инициация трансляции на примере эукариот

2. Неканонические механизмы инициации трансляции

2.1. Кэп-независимые элементы трансляции (CITEs)

2.2. Посттранскрипционная модификация, влияющая на инициацию трансляции (N6 -метилирование остатков аденозина)

2.3. Рибосомный шунт

2.4. Инициация трансляции на коротких 5'-НТО (TISU)

2.5. Внутренний сайт посадки рибосомы (1RES)

2.5.1. IRES-трансдействующие факторы (ITAF)

Глава З. Функции и классы аминоацил-тРНК синтетаз

3.1 Глицил-тРНК синтетаза

3.1.1. Глицил-тРНК синтетаза человека

3.2. Мутации в гене глицил-тРНК синтетазы вызывают нейродегенативные заболевания

3.3. Глицил-тРНК синтетаза как регулятор трансляции энтеровирусов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы и приборы

1.1. Химические реактивы, ферменты и хроматографические носители

1.2. Микробиологические среды

1.3. Стандартные буферные растворы

1.4. Бактериальные штаммы и плазмиды

1.5. Приборы

2. Методы генной инженерии и микробиологии

2.1. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК

2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции

2.4. Получение компетентных клеток E. coli для химической трансформации

2.5. Трансформация клеток E. coli с помощью метода теплового шока

2.6. Экспрессия генов глицил-тРНК синтетазы человека

3. Биохимические методы при работе белками

З.1. Выделение и очистка белков GlyRS WT, GlyRS AWHEP, GlyRS 6 mut

3.2 . Выделение и очистка белков GlyRS AWHEP L129P, GlyRS AWHEP G240R, GlyRS AWHEP L129P/G240R

3.3. Выделение и очистка изолированного антикодон-связывающего домена глицил-тРНК

синтетазы человека

3.4. Спектрофотометрическое определение концентрации белков и нуклеиновых кислот

3.5. Электрофоретический анализ белков в ПААГ в присутствии ДСН

4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами

4.1. Транскрипция

4.2. Очистка РНК

4.2. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях

5. Биохимические методы работы с РНК-белковыми комплексами

5.1. Получение РНК-белковых комплексов

4.2. Анализ изменения подвижности РНК-белковых комплексов в ПААГ геле

5.3. Анализ сродства исследуемых белков к РНК методом поверхностного плазмонного резонанса

5. Автоматизированный мутагенез

6.1. Автоматизированный поиск и подбор точечных замен в белках с помощью программы PROSS

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение фрагментов вирусных IRES в препаративных количествах

2. Изучение взаимодействий глицил-тРНК синтетазы, ее мутантных форм и изолированного ABD домена с фрагментами IRES I типа

2.1. Получение штаммов-продуцентов глицил-тРНК синтетазы, ее мутантных форм и изолированного ABD домена

2.3. Препаративное выделение белков GlyRS WT, GlyRS AWHEP и антикодон-связывающего домена

2.4. Глицил-тРНК синтетаза - универсальный регулятор инициации трансляции на IRES I

2. 5. Изучение взаимодействия отдельных доменов глицил-тРНК синтетазы с фрагментами IRES I типа

3. Получение и изучение свойств мутантных форм GlyRS, связанных с

нейродегенеративными заболеваниями

3.1 . Получение генетических конструкции, содержащих гены мутантных белков GlyRS AWHEP L129P, GlyRS AWHEP G240R, GlyRS AWHEP L129P/G240R

3.2 . Препаративное выделение белков GlyRS AWHEP L129P, GlyRS AWHEP G240R и GlyRS AWHEP L129P/G240R из клеток штаммов-суперпрдуцентов E. coli

3.3 . Определение сродства мутантных форм глицил-тРНК синтетазы человека к фрагментам вирусных IRES

4.1. Получение генетической конструкции глицил-тРНК синтетазы, содержащей 6 точечных замен

4.2. Препаративное выделение глицил-тРНК синтетазы, содержащей 6 мутаций

4.3. Определение сродства мутантных форм глицил-тРНК синтетазы человека к

фрагментам вирусных IRES

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-НТО - 5'-нетранслируемая область (3-'НТО по аналогии)

ABD - антикодон-связывающий домен

CITEs - кэп-независимые элементы трансляции

CMT - синдром Шарко -Мари - Тута

DTT - дитиотреитол

E. coli - Escherichia coli

eIFs - факторы инициации трансляции эукариот GARS - ген глицил-тРНК синтетазы GlyRS- глицил-тРНК синтетаза HCV - вирус гепатита С

HEPES - ^2-гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота

hGlyRS- глицил-тРНК синтетаза человека

IGR - IRES межгенной области

IRES - внутренний сайт посадки рибосомы

ITAF - IRES транс-действующий фактор

m6A - N6 -метиладенозина

ORF - открытая рамка считывания

PIC - преинициаторный комплекс

PPi - пирофосфат

PV - полиовирус

TC - тройственный комплекс

Р-МЭ - Р-меркаптоэтанол

а.к. - аминокислота

АРСаза - аминоацил-тРНК синтетаза

БСА - бычий сывороточный альбумин

БФС - бромфеноловый синий

дАТФ - 2'-дезоксиаденозин-5'трифосфат (дАТФ, дСТФ, дГТФ, дТТФ - по аналогии)

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ИПТГ - изопропил-Р-0-1-тиогалактопиранозид

МБА - N N'-Метилен-бис-акриламид

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

н - нуклеотид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПМСФ- фенилметансульфонилфторид

ПСА - персульфат аммония

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТЕМЕД - N N, К, N - тетраметилэтилендиамин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Глицил–тРНК синтетаза человека как неканонический фактор инициации трансляции энтеровирусных мРНК»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Аминоацил-тРНК синтетазы - древнее семейство ферментов, которые специфически заряжают молекулу тРНК соответствующей аминокислотой для белкового синтеза. Глицил-тРНК синтетаза, в силу вариабельности своей структуры и особенностей функционирования, является одной из наиболее изучаемых аминоацил-тРНК синтетаз.

Известно, что глицил-тРНК синтетаза выполняет присоединение глицина к соответствующей тРНК в реакции этерификации, что является канонической функцией данного фермента. Помимо этого, глицил-тРНК синтетаза является регулятором инициации трансляции у энтеровирусов.

У многих вирусов инициация трансляции идет по кэп-независимому пути, при котором преинициаторный комплекс напрямую связывается со специфическим участком вирусной мРНК (сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES)). Энтеровирусы и некоторые родственных им вирусы содержат IRES I типа.

Имеющаяся на данный момент информация позволяет предположить, что специфическое взаимодействие глицил-тРНК синтетазы с IRES энтеровирусов может быть использовано в качестве мишени при борьбе с соответствующими заболеваниями. Помимо взаимосвязи глицил-тРНК синтетазы с заболеваниями, вызываемыми энтеровирусами, ее ген, ассоциирован с различными нейродегенеративными заболеваниями, в том числе с синдромом Шарко-Мари-Тута, затрагивающим функции периферической нервной системы. В большинстве случаев при этом синдроме классическая активность фермента не нарушена и проявления заболевания связаны с некой нейрон-специфичной ролью глицил-тРНК синтетазы, которая, возможно, и обусловлена ее способностью взаимодействовать с РНК различной природы. Таким образом, обнаружение у глицил-тРНК синтетазы способности регулировать трансляцию специфических мРНК может пролить свет и на ее роль в подобных заболеваниях.

Цель данной работы: определить механизм взаимодействия глицил-тРНК

синтетазы человека с IRES первого типа (IRES I)

7

В рамках работы были поставлены следующие задачи:

1. Проверить способность глицил-тРНК синтетазы (GlyRS) образовывать комплекс с различными фрагментами IRES I филогенетически удаленных вирусов и измерить константы диссоциации дпнных комплексов.

2. Проверить влияние отдельных доменов GlyRS на образование комплекса с IRES I.

3. Определить роль димеризации GlyRS при связывании IRES I.

4. Получить термостабильную форму глицил-тРНК синтетазы человека.

Научная новизна и практическая ценность исследования.

Изучение взаимодействия глицил-тРНК синтетазы человека с IRES I представляет большую значимость. Это может пролить свет на неканонические функции: роль в регуляции инициации трансляции у пикорнавирусов и связь с нейродегеративными заболеваниями.

Практическая значимость полученных результатов.

В результате выполнения данной работы были установлены основные элементы как белка, так и мРНК, ответственные за образование комплекса эукариотической глицил-тРНК синтетазы с IRES I типа. В ходе работы была смоделирована и получена термостабильная форма глицил-тРНК синтетазы человека, которая в дальнейшем может быть использована для проведения как структурных, так и функциональных исследований. Результаты диссертационной работы имеют не только важное фундаментальное значение, но и объясняют механизм регуляции трансляции энтервирусных мРНК. Полученные данные позволят в будущем разработать высокоэффективные препараты, противодействующие соответствующим вирусным инфекциям, а также в борьбе с нейродегенеративными заболеваниями.

Методология и методы исследования.

Экспрессионные вектора со вставкой гена GlyRS c различными заменами были

получены при помощи методов генной инженерии. Для получения белковых

препаратов фермента дикого типа и его мутантных форм использовали

классические методы биохимии (колоночная хроматография, гель-электрофорез и

8

др.). Фрагменты РНК были получены транскрипцией in vitro. Измерение констант диссоциации РНК-белковых комплексов проводили с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса, а также анализировали подвижность данных комплексов в гель-электрофорезе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Глицил-тРНК синтетаза может является универсальным регулятором инициации трансляции для всех IRES I.

2. Антикодон-связывающий домен глицил-тРНК синтетазы человека является узнающим модулем, а каталитический домен стабилизирует комплекс с вирусной мРНК.

3. Димеризация глицил-тРНК синтетазы человека не является необходимым условием для взаимодействия с IRES I.

4. Глицил-тРНК синтетаза человека может узнавать не только апикальную часть V домена IRES I.

Степень достоверности и апробация результатов.

Результаты работы с получены с помощью современных методов и методик, которые полностью соответствуют целям и задачам работы. Результаты работы воспроизводимы, неоднократно представлялись на конференциях и были опубликованы в 5 статьях, в том числе 2 рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором лично. Автор работы принимал непосредственное участие в выполнении всех этапов работы, а именно: осуществление генно-инженерных экспериментов, получение и очистка белков и РНК-белковых комплексов, измерении констант связывания РНК с белками различными биохимическими методами.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунков и 9 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 149 источников и 5 приложений к работе.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРТУРЫ 1. Каноническая кеп-зависимая инициация трансляции на

примере эукариот

Инициация синтеза белка — это процесс, в ходе которого происходит объединение 80S рибосомы с информационной РНК (мРНК) и инициаторной метионил тРНК (Met-тРНК!). Эти три компонента объединяются таким образом, что происходит взаимодействие пары оснований кодон-антикодон с правильным инициирующим кодоном в начале открытой рамки считывания (ORF) внутри мРНК. (Starck et. al., 2016; Kearse et. al., 2017). Взаимодействие кодон-антикодон ограничено P-сайтом 80S рибосомы. Его положение позволяет начать фазу элонгации синтеза белка путем связывания элонгирующей аминоацил-тРНК с вакантным A-сайтом 80S рибосомы для считывания следующего кодона.

Инициация трансляции эукариот, представляет собой хорошо скоординированный и поэтапно регулируемый процесс, в котором задействованы Met-тРНК!, мРНК, рибосомы и 12 специализированных белков, называемых факторами инициации трансляции (eIFs), каждый из которых играет важную роль в этом процессе. Некоторые из этих факторов являются мультисубъединичными белками (табл.1) (Merrick et. al., 2018). Процесс инициации трансляции можно разделить на две основных стадии: образование 48S-инициаторного комплекса с установленным спариванием оснований кодон-антикодон в P-сайте 40S субъединицы, и присоединение 48S-комплекса к 60S субъединице рибосомы. На большинстве эукариотических мРНК 48S-комплекс формируются по основному «сканирующему» или кэп-зависимому механизму (Jackson et. al., 2010).

Эукариотические мРНК имеют 5'-концевую модификацию, известную как

«кэп», 7-метилгуанозин, связанный через 5'-5'-трифосфатный мостик с первым

транскрибируемым нуклеотидом (m7GpppN), и, за исключением транскриптов,

кодирующих гистоны, также содержат З'-поли(А) хвост (Galloway et. al., 2019;

Marzluff et. al.,2008; Fakim et. al., 2019). Для успешной инициации трансляции

eIF4F связывается с кэпом и поли (A) связывающим белком (PABP),

10

расположенным на 3'-поли (A) хвосте (Jackson et al., 2010). Таким образом формируется комплекс циркуляризованной мРНК в конформации «замкнутой петли». eIF4F представляет собой гетеротримерный комплекс, включающий в себя eIF4E, eIF4A и eIF4G. eIF4E узнает и связывает кэп, eIF4A, АТФ-зависимая РНК-хеликаза, раскручивает структуры РНК, присутствующие в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК, а eIF4G действует как платформа, связывая eIF4E, eIF4A и 40S рибосомную субъединицу (через eIF3) (Lopez-Ulloa et al., 2022).

Это нековалентное взаимодействие между 5'- и 3'-концами мРНК способствует инициации трансляции, повторной инициации трансляции посредством рециркуляции рибосом и повышает стабильность мРНК (Gallie 1991; Fakim et al., 2019; Nicholson et al., 2019; Alekhina et al., 2020).

У млекопитающих 40 S рибосомная субъединица связывается с мРНК в составе 43S преинициаторного комплекса (PIC), который включает в себя eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5 и тройственный комплекс (Triple Complex, TC): eIF2-ГТФ-Met-тРНКi. Гетеротример eIF2, входящий в состав ТС, представляет собой ГДФ/ГТФ-связывающий белок, который обладает высоким сродством к Met-тРНК! только в ГТФ-связанном состоянии (Kapp et al., 2004). Связывание eIF1 с 40S субъединицей стерически блокирует ассоциацию с 60S, а elFIA блокирует сайт для связывания элонгационной тРНК (Lomakin et al., 2013).

После рекрутирования 43S PIC на 5'конец мРНК происходит его движение в

направлении 3'конца мРНК, сопровождаемое сканированием нуклеотидной

последовательности. Во время сканирования eIF4A, eIF4AI (DDX2A), eIF4AII

(DDX2B) и кофакторами eIF4B или eIF4H осуществляют расплетание вторичных

структур РНК. В некоторых случаях, если 5'-НТО содержит настолько

высокоструктурированные участки, что активности eIF4A-eIF4B (или eIF4H) не

хватает, то могут быть привлечены вспомогательные РНК-хеликазы, включая

Ded1, DHX29, VAS, RHA (DHX9) (Parsyan et al., 2011). Сканирование

продолжается до тех пор, пока не будет обнаружен и распознан инициаторный

кодон, обычно это первый AUG триплет в консенсусной последовательности Козак

11

(A/GXXAUGG; где X соответствует любому нуклеотиду). Распознавание места старта трансляции происходит за счет спаривания азотистых оснований AUG кодона мРНК и антикодона Met-тРНКг Спаривание оснований кодона и антикодона вызывает переход тРНК из неаккомодированного состояния P-OUT («открытой конформации») в аккомодированное состояние P-IN («закрытой конформации») (Merrick et al., 2018; Hinnebusch, 2014). На этом этапе сканирование останавливается и запускается комплексная реорганизация.

При распознавании AUG кодона eIF1 перемещается, вызывая конформационное изменение eIF2. Это значительно снижает сродство eIF2 к Met-тРНК (Algire et al., 2005). Отсутствие eIF1 способствует еШ5-опосредованному гидролизу еШ2-ГТФ, что приводит к высвобождению еШ2-ГДФ и eIF5 из комплекса. Связанный с eIF2 ГТФ может быть гидролизован до ГДФ и фосфата (Pi) во время сканирования в eIF5-зависимой реакции, но Pi высвобождается из eIF2 только при распознавании AUG кодона (Algire et al., 2005; Majumdar et al., 2005). Вместе эти изменения способствуют высвобождению eIF2-GDP и eIF5. Чтобы снова сформировать комплекс eIF2-F^ для участия в дальнейших раундах инициации, eIF2 необходимо опять активировать.

eIF5B-ГТФ способствует присоединению большой рибосомной субъединицы (60S) и переориентации инициаторной тРНК (Yamamoto et al., 2014). Высвобождение eIF5B-ГДФ и eIFIA позволяет сформировать 80S рибосому, прикрепленную к мРНК, содержащую Met-тРНЮ, связанную с AUG кодоном в P-сайте, готовую начать стадию элонгации (рис.1).

Каждый этап описанного механизма строго обязателен и сопровождается

работой более десятка белковых факторов, работа которых регулируется в

зависимости от условий жизни клетки (Merrick et al., 2018). В частности, при

некоторых видах стресса фактор eIF2 подвергается фосфорилированию, в

результате чего он уходит в неактивный комплекс с фактором обмена гуаниновых

нуклеотидов eIF2B и перестаёт доставлять Met-тРНК в инициаторный комплекс,

что приводит к подавлению клеточной трансляции. Другой объект регуляции -

12

кэп-связывающий аппарат: взаимодействие еШ4Е с eIF4G нарушается белком 4Е-ВР1, активирующимся при дефосфорилировании. Оба пути зачастую включаются в клетке при вирусных инфекциях (Богокт & а1., 2021).

Таблица 1. Эукариотические факторы инициации трансляции (Jackson et al., 2010).

Фактор инициации трансляции Субъединиц ы Мол. вес. (кДа) Функция

Основные эукариотические факторы инициации

eIF2 3 (а-36,1, ß— 38,4, у—51,1) Образует тройственный комплекс еШ2-ГТФ-Ме1-тРНК1, который связывается с 40S субъединицей

eIF3 13 (всего 800) Связывается с 40S субъединицей рибосомы, еШ1, eIF4B и eIF5. У млекопитающих непосредственно взаимодействует с комплексом eIF4F (через eIF4G), в то время как у почкующихся дрожжей эта связь отсутствует. Стимулирует связывание еШ2-ГТФ-Ме1-тРНК1 с 40Б субъединицей; способствует присоединению 43Б-комплекса к мРНК и последующему сканированию; обладает диссоциирующей и антиассоциационной активностью, препятствующей соединению 40S и 60S субъединиц

eIF1 1 (12,7) Способствует рибосомному сканированию; стимулирует связывание еШ2-ГТФ-Ме1-тРНК1 с 40Б субъединицей; предотвращает преждевременный индуцированный гидролиз еШ5 связанного с еШ2^ГТФ и высвобождение Pi

еШ1Л 1 (16,5) Стимулирует связывание еШ2-ГТФ-Ме1-тРНК1 с 40Б субъединицей; еШ1 и еШ1А совместно связываются с 40S субъединицей, для стабилизации «открытой» конформации преинициаторного комплекса и выбору инициирующего кодона

еШ4Б 1 (24,5) Связывает кэп

еШ4Л * 1 (46,1) ВБЛБ-Ьох АТФаза и АТФ-зависимая РНК-хеликаза

еШ40 ** 1 (175,5) Связывает еШ4Е, еШ4А, еШ3, РАВР, SLIP1 и мРНК; усиливает хеликазную активность eIF4A

Ш4Б 1 (69,3) РНК-связывающий белок; усиливает хеликазную активность еШ4А

еШ4И 1 (27,4) РНК-связывающий белок; усиливает хеликазную активность еШ4А; гомологичен фрагменту еШ4В

еШ5 1 (49,2) Белок, который индуцирует гидролиз связанного с еШ2 ГТФ при распознавании инициирующего кодона.

еШ5Б 1 (138,9) рибосомозависимая ГТФаза; опосредует соединение рибосомных субъединиц

еШ2Б 5 (33,7, 39,0, 50,2, 59,7, 80,3) Фактор обмена гуанозиновых нуклеозидов, который способствует обмену ГДФ/ГТФ на еШ2

Ш4Б 1 (69,3) РНК-связывающий белок; усиливает хеликазную активность еШ4А

еШ4И 1 (27,4) РНК-связывающий белок; усиливает хеликазную активность еШ4А; гомологичен фрагменту еШ4В

Вспомогательные факторы

БИХ29 1 (155,3) Белок, содержащий DExH-бокс; связывает 40S субъединицу; способствует рибосомному

сканированию мРНК с длинными высокоструктурированными 5'-НТО

Беё1р 1 (65,6) ВБАО-Ьох НТФаза/РНК-хеликаза; потенциально способствует сканированию в свгву181ав

еШ6 1 (26,6) Связывает 60S субъединицы; антиассоциативный фактор, препятствующий присоединению 40S субъединиц к 60Б субъединицам

РАВР 1 (70,7) Связывается с З'-поли(А) хвостом мРНК, eIF4G и еШЗ; усиливает связывание eIF4F с кэпом; может способствовать рекрутированию рециклированных посттерминирующих 40S субъединиц обратно на 5'-конец мРНК.

*Два паралога (eIF4AI и eIF4AII), кодируемые разными генами, функционально неразличимы, но «еШ4АШ» не обладает активностью как еШ.

** Два паралога (eIF4GI и eIF4GII), кодируемые разными генами, функционально сходны, но проявляют некоторую селективность по отношению к разным мРНК. eIF4GI обычно более распространен.

Рисунок 1. Схематическое изображение инициации трансляции эукариот (рисунок адаптирован из Иао & а!., 2020). Весь процесс эукариотической инициации трансляции может быть разделен на несколько этапов: А - рециклинг

свободных рибосомных субъединиц и eIF, которые генерируются из предыдущих раундов трансляций мРНК; B - образование тройственного комплекса еШ2-ГДФ-Met-TPHKi; C -образование 43 S PIC, который состоит из тройственного комплекса еШ2-ГДФ-Ме1-тРНК1, 40S рибосомной субъединицы, и факторов инициации трансляции eIF1, eIF1A, eIF3 и eIF5; D - активация мРНК комплексом eIF4F с помощью eIF4B, eIF3 и PABP; E - присоединение 43 S PIC к мРНК; F сканирование мРНК 5'-НТО в направлении 5'-3'с помощью 43 S PIC; G - распознавание стартового кодона и образование инициаторного 48 S комплекса; H -присоединение 60S рибосомной субъединицы к 48S комплексу с помощью eIF5B-ГТФ и eIF1A, сопутствующее отсоединение eIF2-ГТФ и других факторов, включая eIF1, eIF3, eIF4B, eIF4F и eIF5; I - гидролиз связанного с eIF5B ГТФ и высвобождение eIF1A и eIF5B-ГТФ из 80S рибосомы, переход трансляции мРНК на стадию элонгации.

2. Неканонические механизмы инициации трансляции

В течение долгого времени кэп-зависимый механизм трансляции считался единственным возможным путем, с помощью которого можно было бы начать трансляцию эукариотических мРНК. Кэп-зависимая иницииация подавляется в условиях клеточного стресса (Wek 2018) или во время некоторых вирусных инфекций (Stern-Ginossar et al., 2019). Следовательно, вирусные и клеточные белки, необходимые для выживания или адаптации к клеточному стрессу, синтезируются с использованием альтернативных механизмов инициации трансляции (Рис.2).

Рисунок 2. Неканонические механизмы инициации трансляции (рисунок адаптирован из Kwan et al., 2019). Красными пунктирными линиями обозначены цис-действующее элементы. Синими прямоугольниками обозначено положение открытых рамок считывания (ORF). Черные линии - 5'- и 3'-нетранслируемые области (НТО). A - инициация трансляции за счет узнавания вирусного белка (VPg), связанного с 5'-концом мРНК, вместо кэп-структуры B - инициация трансляции на коротких 5'-НТО (TISU). С - m6A модификации. D - Инициация трансляции на IRES элементах, располагающихся как в 5'-НТО, так и в межгенных областях (IGR). E - инициация за счет З'-кэп-независимых элементов (CITE), взаимодействующих (пунктирная линия) с петлей в 5'-НТО. F - рибосомное шунтирование (показан для вируса мозаики цветной капусты (CaMV)); высокоструктурированная область способствует переходу 40S субъединицы от «донорского» сайта к нижележащему «акцепторному» сайту.

Неканонические механизмы инициации различаются в зависимости от того, какие eIF необходимы, используются ли сканирование и распознавание кэпа, а также условия, в которых они предпочтительны. Например, рибосомное

шунтирование (ribosomal shunting) требует и 5'-кэп, и все канонические факторы инициации трансляции, в то время как для инициации трансляции на IRES (internal ribosome entry sites - сайт внутренней посадки рибосомы) набор необходимых факторов инициации трансляции может отличаться (это зависит от типа IRES) (Morley et al., 2008). Известные механизмы неканонической инициации трансляции очень разнообразны. Наше понимание этих механизмов отстает от наших знаний о кэп-зависимой трансляции, в основном из-за отсутствия хороших генетических и биохимических систем, так как большинство этих неканонических механизмов функционируют только в клетках млекопитающих, но не в дрожжах.

2.1. Кэп-независимые элементы трансляции (CITEs)

У большинства РНК-содержащих вирусов растений отсутствует и 5'-кэп, и поли (А)-хвост, но, тем не менее, они эффективно транслируются аппаратом клетки-хозяина. Трансляция в этом случае осуществляется с помощью кэп-независимых элементов трансляции CITEs, который был впервые обнаружен у сателлитного вируса некроза табака (STNV).

CITE расположены в 3'-НТО и взаимодействуют с 40 S субъединицей рибосомы, комплексом eIF4F, используя взаимодействия между 5'-НТО и 3'-НТО. Рибосомы собираются на 5'-конце или около него и сканируют мРНК до стартового кодона (Рис. 2 Е) (Simon et al., 2013; Miras et. al., 2017). Несмотря на то, что CITEs были обнаружены только в 3'-НТО, они могут способствовать инициации трансляции (Kwan et al., 2019).

CITEs широко различаются по последовательности и структуре и были разделены на семь категорий: домен энхансера трансляции (TED), независимый от кэп элемент трансляции вируса желтого карлика ячменя (BTE), энхансер трансляции, вируса мозаики Panicum (PTE), I-образные структуры (ISS), Y-образные структуры (YSS), T-образные структуры (TSS) и элемент трансляции, подобный CABYV-Xinjiang (CXTE). (Simon et al., 2013; Miras et. al., 2017). Почти все классы 3'-CITE связываются с eIF4F и замыкают в цикл мРНК. В тоже время есть и небольшие различия в механизмах инициации трансляции. BTE

предпочтительно связывается с eIF4G и рекрутирует 40 S субъединицу рибосомы в 3'-НТО перед переносом рибосомы в 5'-НТО, где инициируется трансляция. РТЕ связывается преимущественно с eIF4E и TED, а для ISS и YSS CITEs необходимо наличие интактного eIF4F (Kwan et al., 2019). Генетические, биохимические и структурные данные, полученные при изучении PTE, TED и ISS, показывают, что эти 3'-CITE взаимодействуют с кэп-связывающим карманом eIF4E, при этом высокоподвижные остатки гуанина имитируют кэп (Sorokin et. al., 2021).

Интересный механизм инициации трансляции представлен у вируса морщинистой репы, который имеет Т-образные структуры CITE (TSS). Вместо того, чтобы формировать взаимодействия с 5'-НТО, TSS взаимодействует с 60S рибосомной субъединицей. Циркуляризация РНК происходит за счет связывания 60S с 40S субъединицей, которая связана с 5'-НТО (Stupina et. al., 2008).

На сегодняшний день требуются еще дополнительные исследования, чтобы понять механизм инициации трансляции с помощью CITE. Кроме того, неизвестно, как CITE конкурируют с кэп-зависимой инициацией трансляции.

2.2. Посттранскрипционная модификация, влияющая на инициацию трансляции (N6 -метилирование остатков аденозина)

Наиболее распространенная посттранскрипционная модификация мРНК — это метилирование остатков аденина с образованием К6-метиладенозина (m6A) (Рис.2 С). Эта модификация способна влиять на циркуляризацию мРНК и эффективность трансляции (Peer et. al., 2019).

Разработка антител, позволяющих идентифицировать сайты m6A, позволила создавать карты метилирования в масштабе всего транскриптома. Такие исследования выявили наличие более 10000 модификации м6А в более чем 25% транскриптома человека. Чаще всего м6А встречались в длинных экзонах, близких к стоп-кодонам и 3'-НТО. Также было показано, что в 5'-НТО и области, окружающей старт-кодон, количество m6A может отличаться в зависимости от вида или типа клеток, или условий среды. Эти наблюдения подтвердили, что m6A

является преобладающей модификацией мРНК (Dominissini et al., 2012.; Luo et al., 2014; Zhou et al., 2015).

Белки, которые участвуют в метилировании мРНК (их называют writers-«записывающие белки»), функционируют как белковый комплекс, состоящий из четырёх компонентов: метилтрансферазоподобный белок METTL3 и METTL14,-белок, ассоциированный с опухолью 1 Вильмса, (WTAP) и KIAA1429. Модификации №-метиладенозина в 5'-НТО появляются при тепловом шоке в результате перемещения белка YTHDF2 (readers-«читающие белки») в ядро. Также к этому типу белков относится семейство белков гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина (HNRNP). К деметилирующим мРНК (erasers -«стиратель») белкам относится белок, ассоциированный с ожирением (FTO), и гомолог 5 alkB (ALKBH5) (Meyer et al., 2015; Zhou et al., 2015).

Метилирование N6 -аденозина влияет почти на все стадии метаболизма мРНК: от процессинга в ядре до трансляции и распада в цитоплазме. Было показано, что белок YTHDF1 способен значительно усиливать кэп-зависимую инициацию трансляции на т6А-модифицированных мРНК. YTHDF1 не только связывает метилированные транскрипты с рибосомами, но также рекрутирует eIF3. METTL3 функционирует также как YTHDF1, усиливая еШ4Е-зависимую трансляцию в специфической подгруппе мРНК, путем рекрутирования eIF3 во время инициации трансляции (Lin S. et al., 2016). Этот эффект не зависит от метилтрансферазной активности METTL3 (Zhou et al., 2015).

На сегодняшний день регуляция инициации трансляции на основе модификации К6-метиладенозин все еще является относительно недавно открытым механизмом и требует дальнейших исследований. (Meyer et al., 2015; Zhou et al., 2015; Kwan et al., R. 2019).

2.3. Рибосомный шунт

Рибосомное шунтирование происходит, когда рибосомы обходят или шунтируют части 5'-НТО для достижения стартового кодона (Рис.2 F). 40S субъединица рибосомы садится на 5'-конец кэпированной мРНК с последующим

ограниченным сканированием до достижения «донорского» сайта, в котором она перескакивает на следующий стартовый кодон («акцепторный» сайт), чтобы инициировать трансляцию.

Рибосомное шунтирование было обнаружено у вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и аденовирусе, а также используется рядом других вирусов растений и животных (Stern-Ginossar et al., 2019). CaMV имеет очень длинную 5'-НТО, во внутренней части которой находится протяжённая область, формирующая сложную вторичную структуру со стабильным стеблем в основании и разветвлёнными шпильками в дистальной части. (Sorokin et al., 2021).

Кроме того, некоторые клеточные мРНК, такие как BACE1, cIAP2 и HSP70, используют рибосомное шунтирование для инициации трансляции при стрессе (Yueh et al., 2000; Rogers et al., 2004; Sherrill et al, 2008; Koh et al, 2013).

Рибосомное шунтирование позволяет вирусам расширять свою кодирующую способность путем трансляции следующих ORF. Кроме того, вирусные, как и клеточные, мРНК используют шунтирование для избирательной трансляции мРНК. Предположительно, шунтирование происходит, когда хеликаза неактивна (Yueh et al., 1996). Критериями того, что происходит рибосомное шунтирование, является зависимость от кэпа, минимальное влияние или отсутствие влияния на трансляцию вышестоящего AUG и шпилечных структур, а также отсутствие в 5'-НТО IRES. Многие, но не все мРНК, использующие рибосомное шунтирование, имеют короткую ORF. Кроме того, после завершения трансляции рибосома не диссоциирует с такой мРНК, а остается связанной и продолжает шунтировать или обходить другие ORF и вторичные структуры для повторной инициации на последующих ORF (Latorre et al., 1998; Yueh et al., 2000;Racine et al., 2010)

2.4. Инициация трансляции на коротких 5'-НТО (TISU)

Для инициации трансляции на мРНК с чрезвычайно короткими 5'-НТО (<30 нуклеотидов) требует особые элементы TISU (Translation Initiation of Short 5'-UTR) (Рис.2 B). TISU расположены на расстоянии 5-30 нуклеотидов от кэпа и имеют среднюю длину 12 нуклеотидов. Последовательность TISU SAASAUGGCGGC (S

= C или G) отличается от последовательности Козак (RCCAUGG, R = A или G) для распознавания старт-кодонов. Примерно 4% мРНК содержат TISU и кодируют белки, задействованные в различных функциях: энергетический метаболизм и синтез белка. (Elfakess et al., 2008). TISU-содержащие мРНК устойчивы к ингибированию синтеза белка, вызванному энергетическим стрессом (Sinvani et al., 2015).

Для функционирования TISU требуется eIF4F, что кажется проблематичным, учитывая, что распознаваемый AUG-кодон близок к кэпу, и будет конфликтовать с 43S PIC. Однако, ключевым шагом в инициации трансляции на TISU является высвобождение eIF4F после распознавания AUG (Sinvani et al., 2015).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Виноградова Екатерина Сергеевна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гурьева, П. И. Эпидемиологическая и клинико-генетическая характеристика болезни Шарко-Мари-Тута в Республике Саха (Якутия): дисс. канд. мед. наук.

- ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, Красноярск, 2014.

- С. 109

2. Никонов О.С., Никонова Е.Ю., Михайлина А.О., Леконцева Н.В., Гарбер М.Б. (2016). Поиск предполагаемых участков связывания глицил-тРНК синтетазы на IRES-элементах пикорнавирусов Актуальные вопросы биологической физики и химии. Т. 1. № 1. С. 258-262.

3. Никонова Е. Ю. Глицил-тРНК синтетаза как потенциальный универсальный регулятор инициации/ Е. Ю. Никонова, А. О. Михайлина, М. С. Немчинова, М. Б. Гарбер, О. С. Никонов// Актуальные вопросы биологической физики и химии. - 2018. - 1. - С. 175-178.

4. Никонова Е.Ю. Взаимодействие глицил-тРНК синтетазы человека с участками IRES, находящимися за пределами V домена/ Е. Ю. Никонова, А. О. Михайлина, Н. В., Леконцева, Е. С. Черных, М. С. Немчинова, О. С. Никонов// Молекулярная биофизика и физика биомолекул. - 2017. - 2(1). - С. 175-177

5. Юшин Ю. В. Обзор питательных сред, используемых для культивации рекомбинантной Escherichia coli/ Ю. В. Юшин., Р. В. Подкопайло, Д. А. Петрова, К. А. Егоров, В. П. Трухин// Медицина экстремальных ситуаций. -2019. - 21(3). - С. 444-453.

6. Akirtava C. False-positive IRESes from Hoxa9 and other genes resulting from errors in mammalian 5' UTR annotations/ C. Akirtava, G. E. May, C. J. McManus// Proc Natl Acad Sci U S A. - 2022. - 119(36). - Р. e2122170119.

7. Alekhina O.M. Functional сус^а^оп of Eukaryotic mRNAs/ O. M. Alekhina., I. M. Terenin, S. E. Dmitriev, K. S. Vassilenko// International journal of molecular sciences. - 2020. - 21(5). - p 1677.

8. Algire M.A./ Pi release from eIF2, not ГТФ hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation/ M. A. Algire, D. Maag, J. R Lorsch// Molecular cell. - 2005.- 20.- P. 251-262

9. Ali I.K. Activity of the hepatitis A virus IRES requires association between the cap-binding translation initiation factor (eIF4E) and eIF4G/ I. K. Ali, L. McKendrick, S.J. Morley, R.J Jackson// J. Virol. - 2001.- 75.- P. 7854-7863

10. Andreev D. E. Glycyl-tRNA synthetase specifically binds to the poliovirus IRES to activate translation initiation/ D. E. Andreev, J. Hirnet, I. M. Terenin, S. E. Dmitriev, M. Niepmann, I.N Shatsky// Nucleic Acids Research. - 2012- 40. - P. 5602-5614

11. Antonellis A. Glycyl tRNA synthetase mutations in Charcot-Marie-Tooth disease type 2D and distal spinal muscular atrophy type V/ A. Antonellis, R. E. Ellsworth, N. Sambuughin, I. Puls, A. Abel, S. Q. LeeLin, A. Jordanova, I. Kremensky, K. Christodoulou, L. T. Middleton, K. Sivakumar, V. Ionasescu, B. Funalot, J. M. Vance, L. G. Goldfarb, H. F. Kenneth, E. D. Green// American Journal of Human Genetics. - 2003.- 72. - P. 1293-1299.

12. Baird S. D. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites/ S. D. Baird, S. M. Lewis, M. Turcotte, M. Holcik// Nucleic acids research. - 2007. -35. P. 4664-4677

13. Bakhshesh M. The picornavirus avian encephalomyelitis virus possesses a hepatitis C virus-like internal ribosome entry site element/ M. Bakhshesh, E. Groppelli, M. M. Willcocks, E. Royall, G. J., Belsham, L. O Roberts// Journal of virology. - 2003. - 82(4). - P. 1993-2003.

14. Balvay L.Translational control of retroviruses/ L. Balvay, M. Lopez Lastra, B. Sargueil, J. L. Darlix, T. Ohlmann// Nature reviews. Microbiology. - 2007.- 5(2). -P. 128-140.

15. Banik S. D. Mechanism of the activation step of the aminoacylation reaction: a significant difference between class I and class II synthetase/ S. D Banik, N.Nandi// Journal of biomolecular structure & dynamics.- 2012.- 30. - P. 701-715.

16. Bansagi B. Genetic heterogeneity of motor neuropathies/ B. Bansagi, H. Griffin, R. G. Whittaker, T. Antoniadi, T. Evangelista, J. Miller, M. Greenslade, N. Forester, J. Duff, A. Bradshaw, S. Kleinle, V. Boczonadi, H. Steele, V. Ramesh, E. Franko, A. Pyle, H. Lochmuller, P.F. Chinnery, R. Horvath// Neurology. -2017.- 88.- P. 12261234

17. Barrera A. Cap-independent translation initiation of the unspliced RNA of retroviruses/ A. Barrera, V. Olguin, J. Vera-Otarola, M. Lopez-Lastra// Biochimica et biophysica acta. Gene regulatory mechanisms. - 2020. - 1863(9). - P. 194583.

18. Bhatt T. K. A genomic glimpse of aminoacyl-tRNA synthetases in malaria parasite Plasmodium falciparum/ T. K. Bhatt, C. Kapil, S. Khan, M. A. Jairajpuri, V. Sharma, D. Santoni, F. Silvestrini, E. Pizzi, A. Sharma// BMC genomics. - 2009.- 10. - P. 644.

19. Bird T. D. Charcot-Marie-Tooth (CMT) Hereditary Neuropathy Overview// GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle

20. Boczonadi V. The role of tRNA synthetases in neurological and neuromuscular disorders/ V. Boczonadi, M. J. Jennings, R. Horvath// FEBS letters. - 2018. - 592.

- P. 703-717.

21. Bonnal S. IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database/ S. Bonnal, C. Boutonnet, L. Prado-Lourenfo, S. Vagner// Nucleic acids research. - 2003. - 31(1).

- P. 427-428.

22. Borman A. The involvement of a spliceosome component in internal initiation of human rhinovirus RNA translation/ A. Borman, M. T. Howell, J. G. Patton, R. J. Jackson// The Journal of general virology. - 1993. - 74 (Pt 9). - P. 1775-1788.

23. Brown M. V. MaMMalian aminoacyl-tRNA synthetases: cell signaling functions of the protein translation machinery/ M. V. Brown, J. S. Reader, E. Tzima// Vascular pharmacology. - 2010. - 52. - P. 21-26.

24. Brozkova S. D. Loss of function mutations in HARS cause a spectrum of inherited peripheral neuropathies/ S. D. Brozkova, T. Deconinck, L. B. Griffin, A. Ferbert, J. Haberlova, R. Mazanec, P. Lassuthova, C. Roth, T. Pilunthanakul, B. Rautenstrauss, A. R. Janecke, P. Zavadakova, R. Chrast, C. Rivolta, S. Zuchner, A. Antonellis, A. A. Beg, P. De Jonghe, J. Senderek, P. Seeman, J. Baets// Brain: a journal of neurology. - 2015. - 138. - P. 2161-2172.

25. Cahuzac B. A recurrent RNA-binding domain is appended to eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases// B. Cahuzac, E. Berthonneau, N. Birlirakis, E. Guittet, M. Mirande// The EMBO journal. - 2000. - 19(3). - P. 445-452.

26. Chaliotis A. The complex evolutionary history of aminoacyl-tRNA synthetases/ A. Chaliotis, P. Vlastaridis, D. Mossialos, M. Ibba, H. D. Becker, C. Stathopoulos, G. D. Amoutzias//Nucleic acids research. - 2017. - 45. - P. 1059-1068

27. Chappell S. A. A 9-nt segment of a cellular mRNA can function as an internal ribosome entry site (IRES) and when present in linked multiple copies greatly enhances IRES activity/ S. A. Chappell, G. M. Edelman, V. P. Mauro// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2000. -97(4). - P. 1536-1541.

28. Chen C. Y. Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs/ C. Y Chen, P. Sarnow// Science (New York, N.Y.). - 1995. -268(5209). - P. 415-417.

29. Chiba S. First Evidence for Internal Ribosomal Entry Sites in Diverse Fungal Virus Genomes/ S. Chiba, A. Jamal, N. Suzuki// mBio. - 2018. - 9(2). - P. e02350-17.

30. Chien C.I. Functional substitution of a eukaryotic glycyl-tRNA synthetase with an evolutionarily unrelated bacterial cognate enzyme/ C. I. Chien, Y. W. Chen, Y. H. Wu, C. Y. Chang, T. L. Wang, C. C. Wang// PloS one. - 2014. - 9(4). - P. e94659.

31. Coldwell M. J. Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry/ M. J. Coldwell, S. A. Mitchell, M. Stoneley, M. MacFarlane, A. E. Willis// Oncogene. -2000. - 19(7). - P. 899-905.

32. Dave P. Polypyrimidine tract-binding protein (PTB) and PTB-associated splicing factor in CVB3 infection: an ITAF for an ITAF/ P. Dave, B. George, D. K. Sharma, S. Das// Nucleic acids research. - 2017. - 45(15). - P. 9068-9084.

33. Deforges J. mRNAs that specifically interact with eukaryotic ribosomal subunits/ J. Deforges, N. Locker, B. Sargueil// Biochimie. - 2015.- 114. - P. 48-57.

34. Dikstein R. Transcription and translation in a package deal: the TISU paradigm// Gene. - 2012. - 491(1). - P. 1-4.

35. Dominissini D. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq/ D. Dominissini, S. Moshitch-Moshkovitz, S. Schwartz, M. Salmon-Divon, L. Ungar, S. Osenberg, K. Cesarkas, J. Jacob-Hirsch, N. Amariglio, M. Kupiec, R. Sorek, G. Rechavi// Nature. - 2012. - 485(7397). - P. 201-206.

36. Dong Q. Hsc70 regulates the IRES activity and serves as an antiviral target of enterovirus A71 infection/ Q. Dong, R. Men, X. Dan, Y. Chen, H. Li, G. Chen, B. Zee, M. H. T Wang, M. L. He// Antiviral research. - 2018. - 150. - P. 39-46.

37. Dresios J. An mRNA-rRNA base-pairing mechanism for translation initiation in eukaryotes/ J. Dresios, S. A. Chappell, W. Zhou, V. P. Mauro// Nature structural & molecular biology. - 2006. - 13(1). - P. 30-34.

38. Elfakess R. A translation initiation element specific to mRNAs with very short 5'UTR that also regulates transcription/ R. Elfakess, R. Dikstein// PloS one. - 2008. - 3(8). - P. e3094.

39. Eriani G. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs/ G. Eriani, M. Delarue, O. Poch, J. Gangloff, D. Moras// Nature. - 1990. - 347. - P. 203-206

40. Fakim H. CoMMunication Is Key: 5'-3' Interactions that Regulate mRNA Translation and Turnover/ H. Fakim, M. R. Fabian// Advances in experimental medicine and biology. - 2019. - 1203. - P. 149-164.

41. Gallie D. R. The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency// Genes & development. - 1991. - 5(11). - P. 2108-2116.

42. Galloway A. mRNA cap regulation in maMMalian cell function and fate. Biochimica et biophysica acta/ A. Galloway, V. H. Cowling// Biochimica et biophysica acta. Gene regulatory mechanisms. - 2019. - 1862(3). - P. 270-279.

43. Gamarnik A. V. Two functional complexes formed by KH domain containing proteins with the 5' noncoding region of poliovirus RNA/ A. V. Gamarnik, R. Andino// RNA (New York, N.Y.). - 1997.- 3(8). - P. 882-892.

44. Glass M. J. Identification of the hepatitis A virus internal ribosome entry site: in vivo and in vitro analysis of bicistronic RNAs containing the HAV 5' noncoding region// M. J. Glass, X. Y Jia, D. F. SuMMers// Virology. - 1993. - 193(2). - P. 842-852.

45. Goldenzweig A. Automated Structure- and Sequence-Based Design of Proteins for High Bacterial Expression and Stability/ A. Goldenzweig, M. Goldsmith, S. E. Hill, O. Gertman, P. Laurino, Y. Ashani, O. Dym, T. Unger, S. Albeck, J. Prilusky, R. L Lieberman, A. Aharoni, I. Silman, J. L. Sussman, D. W. Tawfik, S. J. Fleishman// Molecular Cell. - 2016. - 63 № 2. - P. 337-346.

46. Gruber A. R. The Vienna RNA websuite/ A. R. Gruber, R. Lorenz, S. H. Bernhart// Nucleic Acids Res. - 2008. - 36(Web Server issue). - P. W70 - 74.

47. Guo M. Functional expansion of human tRNA synthetases achieved by structural inventions/ M. Guo, P. SchiMMel, X. L. Yang// FEBS letters. - 2010. - 584. - P. 434-442.

48. Guo M. New functions of aminoacyltRNA synthetases beyond translation/ M Guo, X. L. Yang, P. SchiMMel// Nature reviews. Molecular cell biology. - 2010. - 11. -P. 668-674.

49. Gutmann L. Update on Charcot-Marie-Tooth disease/ L. Gutmann, M. Shy// Current opinion in neurology. - 28. - P. 462-467.

50. Haimov O. Cap - dependent, scanning-free translation initiation mechanisms/ O. Haimov, H. Sinvani, R. Dikstei// Biochimica et biophysica acta. - 2015. - 1849(11). - P. 1313-1318.

51. Haimov O. Efficient and Accurate Translation Initiation Directed by TISU Involves RPS3 and RPS10e Binding and Differential Eukaryotic Initiation Factor 1A Regulation/ O. Haimov, H. Sinvani, F. Martin, I. Ulitsky, R. EMManuel, A. Tamarkin-Ben-Harush, A. Vardy, R. Dikstein// Molecular and cellular biology. -2017. - 37(15). - P. e00150-17.

52. Hao P. Eukaryotic translation initiation factors as promising targets in cancer therapy/ P. Hao, J. Yu, R. Ward, Y. Liu, Q. Hao, S. An, T. Xu// Cell coMMunication and signaling: CCS. - 2020. - 18(1). - P. 175.

53. Hinnebusch A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation// Annual review of biochemistry. - 2014. - 83. - P. 779-812.

54. Hong J. J. Viral IRES prediction system - a web server for prediction of the IRES secondary structure in silico/ J. J. Hong, T. Y Wu, T. Y. Chang, C. Y. Chen// PloS one. - 2013. - 8(11). - P. e79288.

55. Isaksson A. Epstein-Barr virus U leader exon contains an internal ribosome entry site/ A. Isaksson, M. Berggren, A. Ricksten// Oncogene. - 2003. - 22(4). - P. 572581.

56. Jackson R. J. Cap-dependent and cap-independent translation: operational distinctions and mechanistic interpretations/ R. J. Jackson, S. L. Hunt, J. E. Reynolds, A. Kaminski// Current topics in microbiology and iMMunology. - 1995.

- 203. - P. 1-29.

57. Jackson R. J. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation/ R. J. Jackson, C. U. Hellen, T. V. Pestova// Nature reviews. Molecular cell biology. - 2010. - 11(2). - P. 113-127.

58. Jackson R. J. The novel mechanism of initiation of picornavirus RNA translation/ R. J. Jackson, M. T. Howell, A. Kaminski// Trends in biochemical sciences. - 1990.

- 15(12). - P. 477-483.

59. Jahan N. Polypyrimidine tract binding protein-1 (PTB1) is a determinant of the tissue and host tropism of a human rhinovirus/poliovirus chimera PV1(RIPO)/ N. Jahan, E. WiMMer, S. Mueller// PloS one. - 2013. - 8(4). - P. e60791.

60. Jan E. Divergent IRES elements in invertebrates// Virus research. - 2006. - 119(1).

- P. 16-28.

61. Jang S. K. A segment of the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation/ S. K. Jang, H. G. Kräusslich, M. J. Nicklin, G. M. Duke, A. C. Palmenberg, E. WiMMer// Journal of virology. - 1988. - 62(8). - P. 2636-2643.

62. Jordanova A. Dominant intermediate Charcot-Marie-Tooth type C maps to chromosome 1p34-p35/ A. Jordanova, F.P. Thomas, V. Guergueltcheva, I. Tournev, F. A. Gondim, B. Ishpekova, E. De Vriendt, A. Jacobs, I. Litvinenko, N. Ivanova, B. Buzhov, P. De Jonghe, I. Kremensky, V. TiMMerman// American Journal of Human Genetics. - 2003. - 73. - P. 1423-1430.

63. Kapp L. D. TTO-dependent recognition of the methionine moiety on initiator tRNA by translation factor eIF2/ L. D. Kapp, J. R. Lorsch// Journal of molecular biology. - 2004. - 335(4). - P. 923-936.

64. Kearse M. G. Non-AUG translation: a new start for protein synthesis in eukaryotes/ M. G. Kearse, J. E. Wilusz// Genes & development. - 2017. - 31(17). - P. 17171731.

65. Kieft J. S. Viral IRES RNA structures and ribosome interactions// Trends in biochemical sciences. - 2008. - 33(6). - P. 274-283.

66. Koh D. Physical evidence supporting a ribosomal shunting mechanism of translation initiation for BACE1 mRNA/ D. C. Koh, G. M. Edelman, V. P. Mauro// Translation (Austin, Tex.). - 2013. - 1(1). - P. e24400.

67. Kung Y.A. Control of the negative IRES trans-acting factor KHSRP by ubiquitination/ Y. A. Kung, C. T. Hung, K. Y. Chien, S. R. Shih// Nucleic acids research. - 2017. - 45(1). - P. 271-287.

68. Kwan T. Noncanonical Translation Initiation in Eukaryotes/ T. Kwan, S. R. Thompson// Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2019. - 11(4). - P. a032672.

69. Kwon N.H. Aminoacyl-tRNA synthetases as therapeutic targets/ N. H. Kwon, P. L. Fox, S. Kim// Nature reviews. Drug discovery. - 2019. - 18(8). - P. 629-650.

70. LaeMMli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. - 1970. - 227. - P. 680-685.

71. Latorre P. Sendai virus Y proteins are initiated by a ribosomal shunt/ P. Latorre, D. Kolakofsky, J. Curran// Molecular and cellular biology (1998). Sendai virus Y proteins are initiated by a ribosomal shunt., 18(9), 5021-5031

72. Le Quesne. Derivation of a structural model for the c-myc IRES/ J. P. Le Quesne, M. Stoneley, G. A. Fraser, A. E. Willis//Journal of molecular biology. -2001.-310(1). - P. 111-126

73. Lee K. M. Regulation Mechanisms of Viral IRES-Driven Translation/ K. M. Lee, C. J. Chen, S. R. Shih// Trends in Microbiology. - 2017. - 25(7). - P. 546-561

74. Lin J. Far upstream element binding protein 2 interacts with enterovirus 71 internal ribosomal entry site and negatively regulates viral translation/J. Y. Lin, M. L. Li, S. R. Shih// Nucleic acids research. - 2009. - 37(1). - P. 47-59.

75. Lin J. Y. mRNA decay factor AUF1 binds the internal ribosomal entry site of enterovirus 71 and inhibits virus replication/ J. Y. Lin., M. L. Li, G Brewer//PloS one. - 2014. - 9(7). - Р. e103827.

76. Lin S. The m(6)A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells/ S. Lin, J. Choe, P. Du, R. Triboulet, R. I. Gregory// Molecular cell. -2016. - 62(3). - Р. 335-345.

77. Lin S.The m(6)A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells/ S. Lin, J. Choe, P. Du, R. Triboulet, R. I. Gregory// Molecular cell. -2016. - 62(3). - Р. 335-345.

78. Lomakin I. B. The initiation of maMMalian protein synthesis and mRNA scanning mechanism/ I. B. Lomakin, T. A. Steitz// Nature. - 2013. - 500(7462). - Р. 307311.

79. López-Ulloa B. RNA-Binding Proteins as Regulators of Internal Initiation of Viral mRNA Translation/ B. López-Ulloa, Y. Fuentes, M. S. Pizarro-Ortega, M. López-Lastra// Viruses. - 2022. - 14(2). - Р. 188.

80. Lozano G. Structural insights into viral IRES-dependent translation mechanisms/ G. Lozano, E. Martínez-Salas// Current opinion in virology. - 2015. - 12. - Р. 113120.

81. Lukavsky P. J. Structure and function of HCV IRES domains// Virus research. -2009. - 139(2). - Р. 166-171.

82. Luo G. Z. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana/ G. Z. Luo, A. MacQueen, G. Zheng, H. Duan, L. C. Dore, Z. Lu, J. Liu, K. Chen, G. Jia, J. Bergelson, C. He// Nature coMMunications. - 2014. - 5. - Р. 5630.

83. Magy L. Updating the classification of inherited neuropathies: Results of an international survey/ L. Magy, S. Mathis, G. Le Masson, C. Goizet, M. Tazir, J. M. Vallat// Neurology. - 2018. - 90. - Р. 870-876.

84. Mailliot J. Viral internal ribosomal entry sites: four classes for one goal/ J. Mailliot, F. Martin// Wiley interdisciplinary reviews. RNA. - 2018. - 9(2). - Р. 10.1002/wrna.1458

85. Majumdar R. Regulation of ГТФ hydrolysis prior to ribosomal AUG selection during eukaryotic translation initiation/ R. Majumdar, U. Maitra// The EMBO journal. - 2005. - 24(21). - Р. 3737-374.

86. Martínez-Salas E. Alternative Mechanisms to Initiate Translation in Eukaryotic mRNAs/ E. Martínez-Salas, D. Piñeiro, N. Fernández// Comparative and functional genomics. - 2012. - Р. 391546.

87. Martínez-Salas E. Picornavirus IRES elements: RNA structure and host protein interactions/ E. Martínez-Salas, R. Francisco-Velilla, J. Fernandez-Chamorro, G. Lozano, R. Diaz-Toledano// Virus Research. - 2015. - 3 № 206. - P. 62-73.

88. Martínez-Salas E. RNA-binding proteins impacting on internal initiation of translation/ E. Martínez-Salas, G. Lozano, J. Fernandez-Chamorro, R. Francisco-Velilla, A. Galan, R. Diaz// International journal of molecular sciences. - 2013. -14(11). - P. 21705-21726.

89. Marzluff W. F. Metabolism and regulation of canonical histone mRNAs: life without a poly(A) tail/ W. F. Marzluff, E. J. Wagner, R. J. Duronio// Nature reviews. Genetics. - 2008. - 9(11). - P. 843-854.

90. Meerovitch K. La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate/ K. Meerovitch, Y. V. Svitkin, H. S. Lee, F. Lejbkowicz, D. J. Kenan, E. K. Chan, V. I. Agol, J. D. Keene, N. Sonenberg// Journal of virology. - 1993. - 67(7). - P. 3798-3807.

91. Merrick W. C. Protein Synthesis Initiation in Eukaryotic Cells/ W. C. Merrick, G. D. Pavitt// Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2018. - 10(12). - P. a033092

92. Merrill M. K. The double-stranded RNA binding protein 76:NF45 heterodimer inhibits translation initiation at the rhinovirus type 2 internal ribosome entry site/ M. K. Merrill, M. Gromeier// Journal of virology. - 2006. - 80(14). - P. 6936-6942.

93. Meyer K. D. 5' UTR m (6) A Promotes Cap-Independent Translation/ K. D. Meyer, D. P. Patil, J. Zhou, A. Zinoviev, M. A. Skabkin, O. Elemento, T. V. Pestova, S. B. Qian, S. R. Jaffrey// Cell. - 2015. - 163(4). - P. 999-1010.

94. Miras M. Non-canonical Translation in Plant RNA Viruses/ M. Miras, W. A. Miller, V. Truniger, M. A. Aranda// Frontiers in plant science - 2017. - 8. - P. 494.

95. Mitchell S. A. The Apaf-1 internal ribosome entry segment attains the correct structural conformation for function via interactions with PTB and unr/ S. A. Mitchell, K. A. Spriggs, M. J. Coldwell, R. J. Jackson, A. E. Willis// Molecular cell. - 2003. - 11(3). - P. 57-771.

96. Mokrejs M. IRESite—a tool for the examination of viral and cellular internal ribosome entry sites/ M. Mokrejs, T. Masek, V. Vopálensky, P. Hlubucek, P. Delbos, M. Pospísek// Nucleic acids research. - 2010. - 38(Database issue). - P. D131-D136.

97. Morley S.J. A cunning stunt: an alternative mechanism of eukaryotic translation initiation/ S. J. Morley, M. J. Coldwell// Science signaling. - 2008. - 1(25). - P. 32.

98. Nangle L. A. Charcot-Marie-Tooth disease-associated mutant tRNA synthetases linked to altered dimer interface and neurite distribution defect/ L. A. Nangle, W. Zhang, W. Xie, X. L. Yang, P. SchiMMel// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - 104(27). - P. 11239-11244.

99. Nicholson A. L. Tales of Detailed Poly(A) Tails/ A. L. Nicholson, A. E. Pasquinelli// Trends in cell biology. - 2019. - 29(3). - P. 191-200.

100. Nikonov O. S. Enteroviruses: Classification, Diseases They Cause, and Approaches to Development of Antiviral Drugs/ O. S. Nikonov, E. S. Chernykh, M. B. Garber, E. Y. Nikonova// Biochemistry. Biokhimiia. - 2017. - 82(13). - P. 1615-1631.

101. Nikonova E. Y. Determination of the minimal fragment of the poliovirus IRES that is necessary for the formation of a specific complex with the human glycyl-tRNA synthetase/ E. Y. Nikonova, A. O. Mihaylina, N. V. Lekontseva, O. S. Nikonov, V. G. Klyashtorny, O. V. Kravchenko, M. B. Garber, D. E. Andreev, I. N. Shatsky// Biophysics. - 2016. - T. 61. №2. - P. 233-240.

102. Nikonova E.Y. Glycyl-tRNA synthetase as a potential universal regulator of translation initiation at IRES-I/ E. Y. Nikonova, A. O. Mihaylina, M. S. Nemchinova, M. B. Garber, O. S. Nikonov// Molecular Biology. - 2018. - T. 52. N° 1. - P. 7-14.

103. Pang Y. L. tRNA synthetase: tRNA aminoacylation and beyond/ Y. L. Pang, K. Poruri, S. A. Martinis// Wiley interdisciplinary reviews. RNA. - 2014.- 5(4). - P. 461-480.

104. Pareyson D. Diagnosis, natural history, and management of Charcot-Marie-Tooth disease/ D. Pareyson, C. Marchesi// The Lancet. Neurology. - 2009. - 8(7). - P.-654-667.

105. Parsyan A. mRNA helicases: the tacticians of translational control/ A. Parsyan, Y. Svitkin, D. Shahbazian, C. Gkogkas, P. Lasko, W. C. Merrick, N. Sonenberg// Nature reviews. Molecular cell biology. - 2011. - 12(4). - P. 235-245.

106. Peer E. The Epitranscriptome in Translation Regulation/ E. Peer, S. Moshitch-Moshkovitz, G. Rechavi, D. Dominissini// Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2019. - 11(8). - P. a032623.

107. Peguero-Sanchez E. IRES-dependent translated genes in fungi: computational prediction, phylogenetic conservation and functional association/ E. Peguero-Sanchez, L. Pardo-Lopez, E. Merino// BMC genomics. - 2015. - 16. - P. 1059.

108. Pelletier J. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA/ J. Pelletier, N. Sonenberg// Nature. - 1988.

- 334(6180). - 320-325.

109. Pestova T. V. The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection/ T. V. Pestova, V. G. Kolupaeva// Genes & development. - 2002.- 16(22). - P. 2906-2922.

110. Pickering B. M. Bag-1 internal ribosome entry segment activity is promoted by structural changes mediated by poly(rC) binding protein 1 and recruitment of polypyrimidine tract binding protein 1/ B. M. Pickering, S. A. Mitchell, K. A. Spriggs, M. Stoneley, A. E. Willis// Molecular and cellular biology. - 2004. -24(12). - P. 5595-5605.

111. Pilipenko E. V. A cell cycle-dependent protein serves as a template-specific translation initiation factor/ E. V. Pilipenko, T. V. Pestova, V. G. Kolupaeva, E. V. Khitrina, A. N. Poperechnaya, V. I. Agol, C. U. Hellen// Genes & development. -2000. - 14(16). - P. 2028-2045.

112. Pisarev A.V. Functional and structural similarities between the internal ribosome entry sites of hepatitis C virus and porcine teschovirus, a picornavirus/ A. V. Pisarev, L. S. Chard, Y. Kaku, H. L. Johns, I. N. Shatsky, G. J. Belsham// Journal of virology.

- 78(9). - P. 4487-4497.

113. R. Kühn. Functional analysis of the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus/ R. Kühn, N. Luz, E. Beck, // Journal of virology. - 1990. -64(10). - P. 4625-4631.

114. Racine T. Facilitated leaky scanning and atypical ribosome shunting direct downstream translation initiation on the tricistronic S1 mRNA of avian reovirus/ T. Racine, R. Duncan// Nucleic acids research. - 2010. - 38(20). - P. 7260-7272.

115. Rajendran V. Aminoacyl-tRNA synthetases: Structure, function, and drug discovery/ V. Rajendran, P. Kalita, H. Shukla, A. Kumar, T. Tripathi// International journal of biological macromolecules. - 2018. - 111. - P. 400-414.

116. Rivas-Aravena A. The Elav-like protein HuR exerts translational control of viral internal ribosome entry sites/ A. Rivas-Aravena, P. Ramdohr, M. Vallejos, F. Valiente-Echeverría, V. Dormoy-Raclet, F. Rodríguez, K. Pino, C. Holzmann, J. Huidobro-ToroP., I. E. Gallouzi, M. López-Lastra// Virology. - 2009. - 392(2). -P. 178-185.

117. Rogers G. W. Differential utilization of upstream AUGs in the beta-secretase mRNA suggests that a shunting mechanism regulates translation/ G. W. Jr. Rogers,

G. M. Edelman, V. P. Mauro// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. - 101(9). - P. 2794-2799.

118. Rossor A. M. Clinical implications of genetic advances in Charcot-Marie-Tooth disease/ A. M. Rossor, J. M. Polke, H. Houlden, M. M. Reilly// Nature reviews. Neurology. - 2013. - 9. - P. 562119. Sharifulin D. E. Exploring accessibility of structural elements of the maMMalian 40S ribosomal mRNA entry channel at various steps of translation initiation/ D. E. Sharifulin, Y. S. Bartuli, M. I. Meschaninova, A. G. Ven'yaminova, D. M. Graifer, G.G. Karpova// Biochimica et biophysica acta. - 2016. - 1864(10). - P. 1328-1338.

120. Shatsky I.N. Cap-Independent Translation: What's in a Name? / I. N. Shatsky, I. M. Terenin, V. V. Smirnova, D. E. Andreev// Trends Biochem Sci. - 2018. - 43(11). -P. 882-895.

121. Sherrill K.W. Translation of cIAP2 mRNA is mediated exclusively by a stress -modulated ribosome shunt/ K.W. Sherrill, R. E. Lloyd// Molecular and cellular biology. - 2008. - 28(6). - P. 2011-2022.

122. Simon A. E. 3' cap-independent translation enhancers of plant viruses/ A. E. Simon, W. A. Miller// Annual review of microbiology. - 2013. - 67. - P. 21-42.

123. Sinvani H. Translational tolerance of mitochondrial genes to metabolic energy stress involves TISU and eIF1-eIF4GI cooperation in start codon selection/ H. Sinvani, O. Haimov, Y. Svitkin, N. Sonenberg, A. Tamarkin-Ben-Harush, B. Viollet, R. Dikstein// Cell metabolism. - 2015. - 21(3). - P. 479-492. (2015).

124. Song Y. Dengue and Zika Virus 5' Untranslated Regions Harbor Internal Ribosomal Entry Site Functions/ Y. Song, J. Mugavero, C. B. Stauft, E. WiMMer// mBio. -2019. - 10(2). - e00459-19.

125. Sorokin I. I. Non-Canonical Translation Initiation Mechanisms Employed by Eukaryotic Viral mRNAs/ I. I. Sorokin, K. S. Vassilenko, I. M Terenin, N. O. Kalinina, V. I. Agol, S. E. Dmitriev// Biochemistry. Biokhimiia. - 2021. - 86(9). -P. 1060-1094.

126. Spriggs K. A. Re-prograMMing of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate/ K. A. Spriggs, M. Stoneley, M. Bushell, A. E. Willis// Biology of the cell. - 2008. - 100(1). - P. 27-38.

127. Starck S.R. Nowhere to hide: unconventional translation yields cryptic peptides for iMMune surveillance/ S.R. Starck, N. Shastri// MMunological reviews. - 272(1). -P. 8-16.

128. Stern-Ginossar N. Translational Control in Virus-Infected Cells/ N. Stern-Ginossar, S. R. Thompson, M. B. Mathews, I. Mohr// Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2019. - 11(3). - P. a033001.

129. Studier F. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes/ F.W. Studier, A. H. Rosenberg, J. J. Dunn, J. W. Dubendorff// J. Methods Enzimol. -1990. - 185. - P. 60-89.

130. Stupina V. A. The 3' proximal translational enhancer of Turnip crinkle virus binds to 60S ribosomal subunits/ V. A. Stupina, A. Meskauskas, J. C. McCormack, Y. G. Yingling, B. A. Shapiro, J. D. DrnMan, A. E. Simon// RNA (New York, N.Y.). -2008. - 14(11). - P. 2379-2393.

131. Tahiri-Alaoui A. Identification of an intercistronic internal ribosome entry site in a Marek's disease virus iMMediate-early gene/ A. Tahiri-Alaoui, L. P. Smith, S. Baigent, L. Kgosana, L. J. Petherbridge, L. S. Lambeth, W. James, V. Nair// Journal of virology. - 2009. - 83(11). - P. 5846-5853.

132. Terenin I. A researcher's guide to the galaxy of IRESs/ I. M. Terenin, V. V. Smirnova, D. E. Andreev, S. E. Dmitriev, I. N. Shatsky// Cell Mol Life Sci. - 2017. - 74(8). - P. 1431-1455.

133. Thompson S.R. So you want to know if your message has an IRES? // Wiley Interdiscip Rev RNA. - 2012. - 3(5). - P. 697-705.

134. Tsukiyama-Kohara K. Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA/ K. Tsukiyama-Kohara, N. Iizuka, M. Kohara, A. Nomoto// Journal of virology. -1992. - 66(3). - P. 1476-1483.

135. van den Akker G. G. H. Current Practice in Bicistronic IRES Reporter Use: A Systematic Review/ G. G. H. van den Akker, F. Zacchini, B. A. C. Housmans, L. van der Vloet, M. M. J Caron, L. Montanaro, T. J. M Welting//International journal of molecular sciences. - 2021. - 22(10). - P. 5193.

136. Vinogradova E. S. Associations between Neurological Diseases and Mutations in the Human Glycyl-tRNA Synthetase. Biochemistry/ E. S. Vinogradova, O. S. Nikonov, E. Y. Nikonova// Biochemistry. Biokhimiia. - 2021. - 86(Suppl 1). - P. 12-23.

137. Wei N. Neurodegenerative Charcot-Marie-Tooth disease as a case study to decipher novel functions of aminoacyl-tRNA synthetases/ N. Wei, Q. Zhang, X. L. Yang// The Journal of biological chemistry. - 2019.0 - 294. - P. 5321-5339.

138. Weingarten-Gabbay S. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes/ S. Weingarten-

Gabbay, S. Elias-Kirma, R. Nir, A. A Gritsenko, N. Stern-Ginossar, Z. Yakhini, A. Weinberger, E. Segal// Science (New York, N.Y.). - 2016. - 351(6270). - P. aad4939.

139. Wek R.C. Role of eIF2a Kinases in Translational Control and Adaptation to Cellular Stress// Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2018. - 10(7). - P. a032870.

140. Wolf Y.I. Evolution of aminoacyl-tRNA synthetases- analysis of unique domain architectures and phylogenetic trees reveals a complex history of horizontal gene transfer events/ Y. I. Wolf, L. Aravind, N. V. Grishin, E. V. Koonin// Genome research. - 1999. - 9(8). - P. 689-710.

141. Wong S. M. Identification of plant virus IRES/ S. M. Wong, D. C. Koh, D. Liu// Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). - 2008. - 451. - P. 125-133.

142. Woo P.C. Natural occurrence and characterization of two internal ribosome entry site elements in a novel virus, canine picodicistrovirus, in the picornavirus-like superfamily/ P. C. Woo, S. K. Lau, G. K. Choi, Y. Huang, J. Teng, H. Tsoi, H. Tse, M. L. Yeung, K. Chan, D.Y. Jin, K. Yuen// J. Virol. - 2012. - 86. - P. 2797-2808.

143. Wu T. Y. IRSS: a web-based tool for automatic layout and analysis of IRES

144. secondary structure prediction and searching system in silico/ T. Y. Wu, C. C. Hsieh, J. J. Hong, C. Y. Chen, Y. S. Tsai// BMC bioinformatics. - 2009. - 10. - P. 160.

145. Yamamoto H. Structure of the maMMalian 80S initiation complex with initiation factor 5B on HCV-IRES RNA/ H. Yamamoto, A. Unbehaun, J. Loerke, E. Behrmann, M. Collier, J. Bürger, T. Mielke, C. M. Spahn// Nature structural & molecular biology. - 2014. - 21(8). - P. 721-727.

146. Yang T. H. Human IRES Atlas: an integrative platform for studying IRES-driven translational regulation in humans/ T. H. Yang, C. Y. Wang, H. C. Tsai, C. T. Liu// Database: the journal of biological databases and curation. - 2021. - P. baab025.

147. Yueh A. Selective translation initiation by ribosome jumping in adenovirus-infected and heat-shocked cells/ A. Yueh, R. J. Schneider// Genes & development. - 1996. - 10(12). - P. 1557-1567.

148. Yueh A. Translation by ribosome shunting on adenovirus and hsp70 mRNAs facilitated by complementarity to 18S rRNA/ A. Yueh, R. J. Schneider// Genes & development. - 2000. - 14(4). - P. 414-421.

149. Zhao J. IRESbase: A Comprehensive Database of Experimentally Validated Internal Ribosome Entry Sites/ J. Zhao, Y. Li, C. Wang, H. Zhang, H. Zhang, B. Jiang, X. Guo, X. Song// Genomics, proteomics & bioinformatics. - 2020. - 18(2). - P. 129139

150. Zhou J. Dynamic m(6)A mRNA methylation directs translational control of heat shock response/ J. Zhou, J. Wan, X. Gao, X. Zhang, S. R. Jaffrey, S. B. Qian// Nature. - 2015. - 526(7574). - P. 591-594.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному рукодителю Екатерине Юрьевне Никоновой за чуткое руководство, ценные советы, несмкончаймый интерес к работе. Также хочу сказать спасибо Екатерине Юрьевне за всевозможную помощь и рекомендации, сделанные как во время выполнения, так и в процессе написания данной работы.

Большое спасибо Никонову Олегу Станиславовичу за рекомендации по использованию программ и структурных данных.

Большое спасибо Михайлиной Алисе Олеговне за помощь в проведении эксперементов на биосенсорах.

Искренне признательна Алексею Донатовичу Никулину за постоянный интерес к выполняемой работе, ценные советы и замечания.

Особую благодарность хочу выразить Марии Фандо и Илье Коляденко как помощь в планировании и постановке эксперементов, так и за эмоционнальную подержку.

Благодарна всему коллективу лаборатории структурных исследований аппарата трансляции за доброе отношение и прекрасную атмосферу, способствующие выполнению данной работы.

Безмерно благодарна своей семье за любовь и поддержку.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1. Сенсограммы, показывающие взаимодействие глицил-тРНК-синтетазы c фрагментами IRES. А. - Сенсограмма комплекса GlyRS WT+ CDV. Цветными линиями обозначены различные концентрации используемых белков: красная линия - 120 нМ, пурпурная линия - 80 нМ, зеленая линия - 40 нМ, бирюзовая линия - 20 нМ, В. - GlyRS WT + CDV (межгенный участок); цветными линиями обозначены различные концентрации используемых белков: синяя линия линия - 120 нМ, красная линия - 80 нМ, пурпурная линия - 40 нМ, зеленая линия линия - 20 нМ; C. - GlyRS WT + HPVA2. Цветными линиями обозначены

различные концентрации используемых белков: зеленая линия - 120 нМ, серая линия - 80 нМ, синяя линия - 40 нМ, красная линия - 20 нМ.

А

700

100-'-'-'-'-!-'-'-'-<

-+00 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Приложение 2. Сенсограммы, показывающие взаимодействие глицил-тРНК-синтетазы c фрагментами PV IRES (Nikonova at al., 2016). Линиями обозначены различные концентрации используемых белков снизу вверх: 62,5-1000 нМ. А. - Сенсограмма комплекса GlyRS WT и PV длиной 64 нуклеотида (нуклеотиды 474-531). В. - Сенсограмма комплекса GlyRS WT и PV длиной 35 нуклеотида (нуклеотиды 482-510).

Приложение 3. Сенсограммы, показывающие взаимодействие глицил-тРНК-синтетазы и ее усеченной формы c фрагментами PV IRES (Nikonova at al., 2016). Линиями обозначены различные концентрации используемых белков снизу вверх: 62,5-1000 нМ А. - Сенсограмма комплекса GlyRS WT + PV длиной 65 нуклеотида (нуклеотиды 474-531); В. - Сенсограмма комплекса GlyRS WT + PV длиной 35 нуклеотида (нуклеотиды 482-510). C - Сенсограмма комплекса GlyRS AWHEP +PV длиной 64 нуклеотида D - Сенсограмма комплекса GlyRS AWHEP + PV длиной 35 нуклеотида.

Приложение 4. Сенсограммы, демонстрирующие взаимодействие GlyRS и GlyRS - 6 mut с фрагментом IRES I. А. - Сенсограмма комплекса GlyRS + CDV2. В. - GlyRS - 6 mut + CDV2. Цветными линиями обозначены различные концентрации используемых белков: красная линия -100 нМ, пурпурная линия -50 нМ, зеленая линия - 25 нМ, бирюзовая линия - 12,5 нМ, синяя линия - 6,25 нМ.

А

250,00

-50,00 -I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-i-1-1-1-1

-500,00 0,00 500,00 1000,00 1500,00 2000,00 2500,00

Время, с

Время, с

Приложение 5. Сенсограммы, демонстрирующие взаимодействие GlyRS А WHEP и GlyRS AWHEP L129P с фрагментом IRES I. А. - Сенсограмма комплекса GlyRS A WHEP + CDV2. В. - GlyRS AWHEP L129P + CDV2. Цветными линиями обозначены различные концентрации используемых белков: красная линия -100 нМ, пурпурная линия - 50 нМ, зеленая линия - 25 нМ, бирюзовая линия - 12,5 нМ, синяя линия - 6,25 нМ.