Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Рубан, Михаил Константинович

• Рубан, Михаил Константинович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рубан, Михаил Константинович

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И

ТЕРМИНОВ.:.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональные свойства молекулы гемоглобина человека.

1.1.1. Структура молекулы гемоглобина человека.

1.1.2. Спектральные характеристики гемоглобина человека.

1.1.3. Связывание и перенос лигандов.

1.2. Физико-химические свойства и биологическое действие оксида азота (II).

1.2.1. Физико-химические свойства оксида азота (II).

1.2.2. Синтез и физиологическая роль N0 в организме.

1.2.3. Депонирование и эффекторный механизм действия N0.

1.2.4. Роль N0 в патологических процессах в организме.

1.2.5. Пероксинитрит.

1.2.6. Взаимодействие N0 с гемоглобином.

1.2.7. Взаимодействие гемоглобина и N0 в кровеносном русле.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Регистрация электронных спектров поглощения.

2.2.2. Получение растворов оксигемоглобина.

2.2.3. Получение растворов дезоксигемоглобина.

2.2.4. Получение растворов метгемоглобина.

2.2.5. Получение растворов полностью нитрозилированного гемоглобина.

2.2.6. Получение раствора, насыщенного газообразным N0.

2.2.7. Взаимодействие N0 различных концентраций с дезоксигемоглобином.

2.2.8. Оксигенация полностью нитрозилированного гемоглобина.

2.2.9. Оксигенация частично нитрозилированного гемоглобина.

2.2.10. Взаимодействие N0 различных концентраций с раствором оксигемоглобина.

2.2.11. Взаимодействие N0 различных концентраций с раствором метгемоглобина.

2.2.12. Методика регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина.

2.2.13. Определение величины константы Хилла.

2.2.14. Получение растворов полигемоглобина.

2:2.15. Получение растворов ТЧО-производных гемоглобина с использованием нитрозоцистеина.

2.2116; Получение теней эритроцитов.

2.2.17. Статистическая обработка;результатов экспериментов:.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ РАСТВОРОВ

ГЕМНИТРОЗИЛТЕМОТЛОБИНА В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН

240-900 НМ

3.1. Спектральные характеристики растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне 240-900 нм

3.2. Анализ спектров поглощения оксигемоглобина и гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 450-650 нм.

3.3. Исследование спектров поглощения растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 нм.

ГЛАВА 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИ-, ДЕЗОКСИ- И

МЕТГЕМОГЛОБИНА С ОКСИДОМ АЗОТА (II).

4Л . Исследование изменений спектров поглощения растворов оксигемоглобина, индуцированных N0 различных концентраций:.

4.2. Исследование изменений спектров поглощения растворов метгемоглобина, индуцированных NO различных концентраций.

4.3. Исследование изменений спектров поглощения растворов дезоксигемоглобина, индуцированных NO различных концентраций.

4.4. Исследование изменений спектров поглощения растворов частично нитрозилированного гемоглобина, индуцированных оксигенацией.

4.5. Исследование изменений спектров поглощения растворов полностью нитрозилированного гемоглобина, индуцированных оксигенацией.

4.6. Исследование кислородсвязывающих характеристик растворов дезоксигемоглобина, инкубированных с NO различных концентраций.

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ N0-ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАНОСВЯЗАННОГО ГЕМНИТРОЗИЛГЕМОГЛОБИНА.

5.1. Структурно-функциональные характеристики полигемоглобина, образованного из окси- и NO-производных гембелка.

5.1.1. Спектральные характеристики полигемоглобина, образованного из тетрамеров оксигемоглобина.

5.1.2. Изучение кислородсвязывающих свойств полигемоглобина, образованного из окси-формы гембелка.

5.1.3. Спектральные характеристики полигемоглобина, образованного из окси- и NO-производных гембелка.

5.1.4. Изучение кислородсвязывающих свойств полигемоглобина, образованного из окси- и NO-производных гембелка.

5.2. Спектральные характеристики полностью нитрозилированного мембраносвязанного гемоглобина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II)»

механизмы образования молекул Б>Ю-НЬ, диссоциации из них N0 и экспорта вазоактивных молекул из эритроцитов еще не ясны [62, 88, 104, 124, 158]. Ответы на эти и иные вопросы можно получить при дополнительных исследованиях структурно-функциональных модификаций молекулы НЬ, индуцированных N0 различных концентраций.

При изучении влияния N0 на структурно-функциональные свойства различных лигандных форм НЬ часто пользуются методом абсорбционной спек-трофотометрии в видимом и УФ-диапазоне длин волн [38, 62, 145, 149]. Имеющиеся в литературе данные в основном относятся к исследованию спектральных свойств Ж)-производных гемоглобина в видимом диапазоне длин волн (380-600 нм). Однако нами не обнаружены данные о спектральных характеристиках МО-производных гемоглобина в дальней красной и ближней ИК-области спектра (600-900 нм). Кроме того, не ясна роль боковых групп ароматических аминокислот Ж)-производных гемоглобина в поглощении УФ-света в диапазоне 240-380 нм. Получение сведений по этим вопросам, возможно, будет полезным для разработки новых методик анализа структуры белков, в частности N0-производных гемоглобина.

Достаточно глубоко изученная и методически легко доступная молекула гемоглобина является удобной моделью для исследования влияния различных агентов на ферменты, поскольку ее простетическую группу - гем - можно рассматривать как аналог активного центра. Кроме того, на примере гемоглобина можно проследить роль отдельных компонентов (белкового и неорганического) в ходе ответной реакции на воздействие физико-химических факторов и их взаимовлияние друг на друга. С другой стороны, получение новых сведений по указанным проблемам важно для медицины и экологии, поскольку фармакологическое действие ряда нитрит- и нитратсодержащих препаратов основано на их способности генерировать N0, а повышенные концентрации N0 в атмосферном воздухе, помимо острых и хронических отравлений, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию оксидов азота водители автотранспорта, работники химической промышленности, автостоянок, автозаправок и сотрудники ГИБДД). Транспорт такого экзогенного N0 также осуществляется гемоглобином.

Таким образом, исследование структурно-функциональных модификаций гемоглобина, индуцированных N0, имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы. Основной целью данной работы явилось изучение структурно-функциональных модификаций гемоглобина, индуцированных оксидом азота (II).

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование спектральных характеристик растворов гемнитрозил-гемоглобина в диапазоне длин волн 240-900-нм.

2. Отработку подхода, позволяющего анализировать тонкую структуру спектра растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне поглощения энергии квантов апобелком.

3. Изучение влияния оксида азота (II) различных концентраций на спектральные и кислородсвязывающие характеристики окси-, дезокси- и мет-гемоглобина.

4. Регистрацию и анализ спектров поглощения мембраносвязанного гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-600 нм.

5. Исследование спектральных и кислородсвязывающих характеристик молекул полигемоглобина с различным содержанием КО-производных гембел-ка.

Научная новизна. Зарегистрированы и проанализированы электронные спектры поглощения гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 и 600-900 нм. В отношении гемнитрозилгемоглобина применен разработанный нами метод анализа тонкой структуры спектров поглощения, позволивший идентифицировать 8 характеристических точек в спектре раствора' гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 нм и установить вклад каждой из ароматических аминокислот в спектр поглощения белка.

Предложена гипотеза, согласно которой в гемоглобине связь между азотом проксимальных гистидинов апобелка (Nc HisF8) и железом гемов влияет на стабильность окислительно-восстановительного состояния Fe . Напряжение или разрыв этой связи, индуцированные лигандами, способствуют окислению Fe . На основании этой гипотезы предложен механизм реакции, согласно которому в частично нитрозилированном дезоксигемоглобине NO приводит к образованию a-Fe -NO-гемов с таким максимально низким сродством к лиганду, при котором возможна внутримолекулярная перегруппировка NO к SH-группам Cys/593 с образованием S-нитрозогемоглобина.

Установлено, что присутствие в составе полигемоглобина NO-производных гембелка различных концентраций приводит к разнонаправленным изменениям кислородсвязывающих свойств образцов. На основании полученных экспериментальных данных предположено, что в качестве перспективного кислородтранспортного кровезаменителя» с вазорегуляторной функцией можно использовать полигемоглобин с низким содержанием NO-производных гембелка в составе ассоциата.

Получены данные о спектрах поглощения мембраносвязанного гемнитро-зилгемоглобина человека в диапазоне длин волн 240-600 нм. *

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы сведения расширяют и дополняют современные теоретические представления о модификации структуры и функций гемоглобина при взаимодействии с низкомолекулярными лигандами. Предложенный механизм образования S-нитрозогемоглобина может стать практической основой при разработке новых и усовершенствовании уже существующих терапевтических методов лечения патологий, связанных с дисфункциями эндогенного NO, а также методов регулирования кислородтранспортной функции гемоглобина.

Экспериментальные данные, полученные при изучении структурно-функциональных свойств полигемоглобина с различным числом NO-производных в составе образца, необходимо принимать во внимание при разработке кислородтранспортных кровезаменителей на основе химически: модифицированного гемоглобина, не вызывающих гипертонию.

Данные, полученные: при проведении детального анализа электронных спектров поглощения гемнитрозилгемоглобина в широком диапазоне длин волн. (240-900 нм), могут быть использованы исследователями как справочные при изучении взаимодействия гемоглобина с оксидом азота; (II).

Материалы диссертационной- работы могут быть полезны, при; обсуждении вопросов экологической и медицинской биофизики, прогнозирования; поведения белковых систем в условиях экологической; нагрузки, в частности, при повышенном, содержании оксидов азота в атмосфере, а также при- использовании методов-терапии, связанных с лекарственными препаратами - донорами оксида азота (II).

Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнешш диссертаци-оннойг работы, используются« в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета^ при проведении! практических занятий, в ходе выполнения дипломных, работ и магистерских диссертаций:

Апробация работы. Материалы* диссертационной«работы доложены и обсуждены на Всероссийском конкурсном отборе инновационных проектов аспирантов и студентов, по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции «Инновационное: малое предпринимательство в приоритетных направлениях науки ивысоких технологий» (Москва, 2006); Международной? школе-конференции- молодых ученых «Биотехнология будущего», проводимой - в рамках; международного форума; Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» (Санкт-Петербург, 2006); XX Съезде Всероссийского физиологического общества им. И.ГГ. Павлова (Москва, 2007); 16-й Международной научной конференции студентов^ аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); 1-ой Международной; научной школе «Наноматериалы и нанотех-нологии в живых системах» (Москва, 2009); 9-м Съезде Белорусского общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2010); научных сессиях Воронежского государственного университета (Воронеж, 2006, 2007, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Оксид азота (II) является эффективным модулятором структурно-функциональных свойств окси-, дезокси- и метгемоглобина, проявляя как окислительно-восстановительные свойства, так и функции аллостерического эффектора.

2. В частично нитрозилированном гемоглобине (при концентрациях ли-ганда < Р50) N0 модулирует связь железа гемов с азотом (Ъ1г) проксимальных гистидинов апобелка таким образом, что становится возможной внутримолекулярная перегруппировка N0 к БН-группам Суз/593.

3. Хромофорами гемнитрозилгемоглобина, ответственными за наличие идентифицированных нами максимумов поглощения в диапазоне длин волн 240-320 нм являются: фенилаланин (256,5, 260,5, 265,0 и 268,5 нм), триптофан (273,0, 279,0 и 291,0 нм) и тирозин (285,0 нм).

4. Полигемоглобин с низким содержанием МО-производных гембелка, включающий, по-видимому, в качестве Ж>производных в большей степени Б-нитрозогемоглобин, рекомендован как образец для получения кровезаменителя, не вызывающего гипертонию.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из раздела «Введение», 5 глав, «Заключения» и «Выводов». Включает 179 страниц машинописного текста, 6 таблиц и 58 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 163 источников, из них 50 отечественных и 113 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Рубан, Михаил Константинович

выводы

1. Идентифицировано 8 максимумов в спектре НЫЧО в диапазоне длин волн 240-320 нм: максимумы при 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм связаны с поглощением квантов света бензольными кольцами фенилаланина; максимумы при 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм связаны с поглощением энергии квантов индольными кольцами триптофана; поглощение энергии квантов фенольными группировками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм.

2. Установлено, что при взаимодействии с оксигемоглобином N0 меняет валентное состояние атома железа, выступая в роли окислителя. Реакция протекает при участии растворенного или связанного с гембелком кислорода через промежуточное образование нитрит-иона и пероксинитрита.

3. Показано, что в анаэробных условиях N0 полностью восстанавливает гемовые группировки метгемоглобина, преобразуя его в гемнитрозил-гемоглобин. В аэробных условиях кислород конкурирует с метгемоглобином за связывание с N0.

4. При инкубации дезоксигемоглобина с N0 в концентрациях < Р50 в «-цепях гембелка транс-лигандный эффект индуцирует резкое ослабление или разрыв связи между атомом железа Ж)-гема и азотом (К^) проксималь

• о 4. ного гистидина (Н18Р8). Следствием этого явилось образование Ре -N0-гемов с максимальным их выходом в области Р50. Дальнейшее увеличение концентрации N0 приводило к восстановлению геминов в «-субъединицах и образованию полностью нитрозилированного гемоглобина.

5. Методами спектрофотометрии и регистрации кривых диссоциации НЬ показано, что оксигенация частично нитрозилированного гемоглобина индуцирует внутримолекулярный переход N0 от а-гемов к БН-группам Суб/Ш, что, по-видимому, обусловлено транс-лигандным эффектом N0, индуцирующим окисление атомов железа гемов и образование а-субъединиц в

Т-состоянии с наименьшим сродством к лиганду, а также повышением сродства БН-групп СуБ/593 к N0 при переходе тетрамера в Л-состояние.

6. Оксид азота (II) модифицирует кислородсвязывающие характеристики НЬ. При низких концентрациях N0 (Гем:1ЧО = 20:1) сродство НЬ к 02 повышается, что может быть связано как с накоплением а-геминов, так и с образованием 81Ч0-НЬ. Увеличение концентрации N0 приводит к резкому снижению сродства НЬ к 02, обусловленному накоплением МШЬ.

7. Полимеризация НЬ02 увеличивала сродство тетрамеров к 02. Введение в состав ро1уНЬ МО-производных гембелка при соотношении компонентов НЬ02:Ж)-производные-НЪ 4:1 и 3:2 приводило в первом случае к дальнейшему повышению сродства ро1уНЬ к 02, а во втором — к резкому снижению кислородсвязывающих характеристик образцов.

8. Установлено, что в образцах полигемоглобина с соотношением компонентов НЮ2:Ж)-производные гембелка = 4:1 в качестве МО-производных в большей степени образуется Э-нитрозогемоглобин, а при соотношении компонентов 3:2 - гемнитрозилгемоглобин.

9. Показано, что положения максимумов в спектрах поглощения мем-браносвязанных окси-, дезокси и гемнитрозилгемоглобина практически идентичны таковым для спектров внутриэритроцитарного гембелка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения настоящей диссертационной работы, а также анализ литературных сведений позволяют заключить, что структурно-функциональные изменения молекулы гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II), определяются, главным образом, концентрацией N0 и Ог в растворе, структурной формой гембелка, а также наличием в составе гемоглобина аллострически регулируемых активных центров - гемов и 8Н-групп остатков Суз93Д

С одной стороны, неспаренный электрон N0, переменная валентность атомов железа гемоглобина и наличие 02 в растворе или в связанном с гембел-ком состоянии обусловливают протекание окислительно-восстановительных реакций между этими молекулами. С другой стороны, в анаэробных условиях при субсатурационных концентрациях N0 сказывается транс-лигандный эффект, приводящий к конформационным изменениям в гемоглобине на уровне третичной структуры. Во всех исследованных нами реакциях структурно-функциональные модификации окси-, дезокси- и метгемоглобином, индуцированные оксидом азота (II), находили отражение в отклонении спектральных и кислородсвязывающих характеристик от таковых параметров нативных образцов.

С использованием метода моделирования спектров поглощения нами выявлены 8 характеристических точек (А,, нм) в спектре гемнитрозилгемоглобина в диапазоне 240-320 нм: максимумы при 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм связаны с поглощением квантов света бензольными кольцами фенилаланина; максимумы при 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм связаны с поглощением энергии квантов индольными кольцами триптофана; поглощение энергии квантов фе-нольными группировками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм.

Реакция оксигемоглобина с N0 известна как способ инактивации свобод-норадикальной молекулы N0 в кровеносном русле, а также причина метгемог-лобинобразования [83, 144, 157]. Данные наших экспериментов подтверждают имеющиеся в литературе сведения о том, что реакция оксигемоглобина и N0 приводит к образованию метгемоглобина и нитрат-иона (N03""). Мы предполагаем существование как минимум двух механизмов взаимодействия N0 с НЬ02. Первый - обусловлен взаимодействием молекул N0 сначала с растворенным Ог с образованием нитрит-ионов (Ж)2)5 которые окисляют гемовые группировки белка, преобразуясь в нитрат-ионы (ТМОз-). Второй механизм начинается реакцией молекул N0 с кислородом НЮ2, или замещением в НЬ02 кислорода на N0. Далее вследствие отрыва одного электрона от атома Ре2+ гемов образуется метгемоглобин и пероксинитрит (ОЖ)СГ), диссоциирующий без изменений или в виде нитрат-иона. Таким образом, с одной стороны, в реакции оксигемоглобина и N0 атомы железа гемов окисляются при участии кислорода. С другой стороны, нами показано, что образующийся при этом метгемоглобин может восстанавливаться при повышении концентрации N0 с образованием гемнит-розилгемоглобина и, по-видимому, нитрит-иона (ИОг-)

В экспериментах с метгемоглобином оксид азота (II) выступает в роли восстановителя. Согласно литературным данным, образующийся нитрозильный комплекс НЬ(Ре3+)>Ю легко переходит в НЬ(Ре2+)1ЧО+ вследствие переноса

О I электронной плотности неспаренного электрона от N0 к Бе [113, 159]. Таким в Л I образом, соединение НЬ(Ре )1Ч0 относительно не очень стабильно и в присутствии избытка N0 подвергается восстановительной нитрозиляции с образованием НЬ(Ре2+)ТчЮ. В анаэробных условиях используемые нами концентрации метгемоглобина полностью и относительно быстро преобразовывались в гем-нитрозилгемоглобин. Поскольку в растворе скорость взаимодействия N0 с Ог (~ 106 моль^хс"1) выше, чем N0 с МШЪ (~ Ю'-Ю3 моль^хс"1), то в аэробных условиях в реакционной смеси гемнитрозилгемоглобин спектральным методом обнаруживался в небольших количествах.

Согласно литературным данным, в кровеносном русле реакция эндотели-ального N0 с внутриэритроцитарным НЬОг ограничена рядом физиологических барьеров [110, 115]. С другой стороны, доказана вазодилатирующая способность эритроцитов в условиях гипоксии, свидетельствующая о присутствии внутри клетки компонентов, не только сохраняющих N0, но и способных экспортировать его при необходимости за пределы эритроцита [123, 128, 141]. Источником МО-производных в эритроцитах может быть небольшая часть эндоте-лиального N0, которая все же проникает в эритроциты через физиологические барьеры. Кроме того, возможно, молекулы N0 синтезируются внутри эритроцитов в условиях гипоксии при участии дезоксигемоглобина и МО-производных, например нитрит-ионов.

В отличие от окси- и метгемоглобина, с которыми N0 вступает преимущественно в окислительно-восстановительные реакции, при взаимодействии дезоксигемоглобина с N0 в определенных условиях сказывался транс-лигандный эффект последнего. Так, нами установлено, что на начальных этапах взаимодействия дезоксигемоглобина с N0, когда гембелок еще пребывает в Т-состоянии, в реакционной системе накапливаются молекулы частично нитрози-лированного гемоглобина с окисленными гемовыми группировками, максимальный выход которых наблюдается при концентрациях N0, соответствующих давлению полунасыщения гембелка лигандом (Рбо)- Согласно литературным данным [96], при концентрациях N0 ниже или близких к Р50 в «-N0 гемах транс-лигандный эффект вызывает значительное напряжение или разрыв связи между атомом железа гема и азотом проксимального гистидина (Ре-Ы^.), что приводит к образованию пятикоординационных «-N0 гемов с низким сродством к лиганду. Анализируя этот эффект, необходимо учитывать известные из литературы данные о том, что связь Ре-Ы^ в определенной степени напряжена даже в нелигандированных а-цепях дезоксигемоглобина [152]. Кроме того, молекулы кислорода тоже усиливают возмущение связи Ре-Мс в а-субъединицах, которое нарастает к точке перехода гембелка в Я-состояние [96]. Сопоставляя литературные сведения и полученные нами данные, мы выдвигаем следующую гипотезу. Взаимодействие N0 с одной или двумя а-субъединицами дезоксигемоглобина вызывает сильное напряжение или разрыв связей Ре-Мй что приводит а-ферро-гемы в такое состояние, при котором значительно повышается вероятность их окисления. Возможно, именно этим эффектом объясняется известный из литературы факт, что молекула гемоглобина в состоянии полунасыщения лигандом проявляет наименьшую устойчивость к окислению, поэтому для минимизации промежутка времени, в котором вероятность окисления атомов железа максимальна, происходит ускорения ассоциации и диссоциации ли-гандов в области Р50 за счет кооперативного взаимодействия субъединиц гемоглобина [22]. Таким образом, с транс-лигандным влиянием NO связано выявленное нами в ходе изучения реакции ассоциации этого лиганда с дезоксиге-моглобином накопление метгемоглобина, максимальное количество которого было при концентрации N0, близкой к Р5о. Повышение концентрации NO индуцировало переход молекулы гемоглобина из Т- в R- шестикоординационное л I состояние (с невозмущенной связью Fe-NQ, а также восстанавливало Fe -гемы до Hb(Fe2+)4(NO)4.

Известно, что в физиологических условиях гемоглобин в кровеносном русле только частично нитрозилирован, поскольку соотношение Гем:Ж) в крови составляет ~ 1000:1 [62, 149]. По-видимому, в эритроцитах именно частично нитрозилированный гемоглобин в Т-состоянии является наиболее вероятным переносчиком N0. Полученные нами данные свидетельствуют о возможности преобразования в ходе оксигенации частично нитрозилированного гемнитро-зилгемоглобина в S-нитрозогемоглобин. Согласно сведениям литературы, при Т—>R переходе гемоглобина повышается реакционная способность SH-rpynn остатков Cys-/393 его апобелка, расположенных вблизи /?-гемов [149]. С другой стороны, известно, что при концентрациях, меньших Р50, NO может совершать внутримолекулярные переходы между а- и /?-гемами [96]. Кроме того, ранее мы обсудили механизм окисления гемовых группировок оксидом азота (И) из-за нарушения связи Fe-N^ а-субъединиц в частично нитрозилированном гемоглобине. Как известно, очень устойчивые комплексы Hb(Fe2+)NO становятся обратимыми, когда железо в гемоглобине окислено до Fe3+ [35]. Таким образом, в частично нитрозилированном гемоглобине возможны такие состояния молекулы, при которых происходит внутримолекулярная перегруппировка NO от гемов к Суз/593 гемоглобина с замещением Нь их ^-сульфгидрильных групп и отрывом одного электрона (т.е. образуется 8КЮ+-НЬ). Кроме того, нами показано, что частичная нитрозиляция дезоксигемоглобина приводит к повышению сродства гембелка к кислороду и снижению кооперативного взаимодействия субъединиц. Это может быть связано как с образованием гемина в а-субъединицах тетрамера вследствие значительного напряжения или разрыва связи Ре-М^ из-за транс-лигандного эффекта N0 [61], так и с образованием Б-нитрозогемоглобина, поскольку, как известно, в этом случае наблюдается затруднение осуществления Нлз-/?146 стабилизации Т-состояния гембелка [79, 142]. Следовательно, в случае нитрозации БН-групп Су8/393 молекула N0 может играть роль аллостерического эффектора, повышая сродство гемоглобина к кислороду. При образовании пятикоординационных «-N0 геминов N0 является модулятором состояния активного центра, что также приводит к изменению сродства гембелка к кислороду. С другой стороны, ассоциация и диссоциация молекулы 02 изменяет сродство Суз/393 к N0: в Ы-состоянии оно выше, чем в Т-состоянии. В этом случае кислород выступает в роли аллостерического модулятора, а активными центрами по отношению к N0 в молекуле гемоглобина являются ЭИ-группы Суз/393. Таким образом, обсуждаемые механизмы могут обусловливать главную функцию гемоглобина - роль сенсора, чувствительного к потребностям в кислороде клеток и тканей, способного не только транспортировать Ог и СОг, но и регулировать скорость кровотока путем диссоциации определенного количества N0, повышая эффективность газообмена [149].

Базируясь на данных, полученных в ходе изучения взаимодействия тет-рамерного гемоглобина с N0 мы предположили, что полигемоглобины, в составе которых будут присутствовать молекулы МО-производных гемоглобина, могут оказаться эффективными кислородтранспортными кровезаменителями, не вызывающими гипертонию. Нами показано, что при низких соотношениях компонентов полигемоглобина НЬОг:НЬ->Ю-производные = 4:1, по-видимому, основным МО-производным является БМО-НЪ, а увеличение соотношения компонентов до 3:2 приводит к увеличению доли гемнитрозилгемоглобина (№N0). Об этом свидетельствует повышение сродства образцов к кислороду в первом случае и резкое его снижение — во втором. Таким образом, для получения кислородтранспортного кровезаменителя на основе полигемоглобина с функцией донора N0 необходимо использовать низкие соотношения НЮггЖ)-производные. По нашему мнению, такой полигемоглобин будет в кровеносном русле, подобно частично нитрозилированному гемоглобину, в ходе циклов ок-сигенации-дезоксигенации преобразовываться в 8Ж)-НЪ, передавая N0 при переходе тетрамеров в Т-состояние на тиолсодержащие молекулы плазмы (альбумин, глутатион и др.) или непосредственно на растворимую гуанилатциклазу, предотвращая тем самым гипертонию.

На основании полученных нами экспериментальных данных и литературных сведений предложены обобщающие схемы: на рис. 57 отображены возможные реакции различных структурных форм гемоглобина с N0 и N0-производными в организме; на рис. 58 показан механизм гипоксической вазо-дилатации, действующий в микроциркуляторном русле в условиях локальной гипоксии определенной области ткани при участии гемоглобина и оксида азота (II).

Ш2 + Н*—-N0 + 02+н20

N0 + 02-^

НЬ(Ре3+ШО)4 О * ожюо: *

-■V

N03 + 02 + Н20

НЬ(аГе3+)(Ее2+02)3(Су8^93^0)

ОН + Ж)

ОШОН^ИОз

НЬ(Ре3+)4

НЬ(Ре3+ЫО)4

НЬ(Ре2+>ГО+)4

N0

-НЬ(Ре2+)4 / ЯЪ(аРе3+т)2(/^о1+)у-Ш*-ЯЪ(¥е2+Ш)4

2Ш

Н„0 1

Рис. 57. Схема процессов взаимодействия гемоглобина с оксидом азота (II) легкие сердце капилляры

2. За время, пока частично нытрозилированный гемоглобин в Т-состоянии достигнет легких, из-за мощного транс-лигандого эффекта N0 в нитрозилированной аРе2+Ж)-субъединице происходит разрыв связи Ре2+ гема с азотом проксимального гистидина, что приводит к образованию

НЬх(аЕе3+1ЧО)(аРе2+)(у0Ре2+)2 с низким сродством к N0.

1. В условиях локальной гипоксии в капиллярах часть гемоглобина в эритроцитах может в значительной степени дезоксигенироваться, переходя в Т-состояние. При этом уже в капиллярах НЬ может взаимодейсвовать с N0, образуя частично нитрозилированный НЬ:

НЬт(<*Ее2+Ш)(б^е2+)(^е2+)2 который по системному кровообращению в таком виде транспортируется к тканям.

4. В условиях локальной гипоксии в определенном участке ткани Б-нитрозооксигемоглобин дезоксигенируется. При этом сродство N0 к атому серы СуБ/ФЗ понижается пропорционально степени перехода НЬ в Т-состояние. Молекулы N0 передаются на тиолсодержащие соединения эритроцитов и экспортируются за пределы клетки, усиливая кровоснабжение в гипоксическом участке.

НЪх(огРе3+)(«Ге2+)(убР е2+)2Су$/Ш-8Н + ^N0 + 02

3. В легких при оксигенации НЬ02 переходите Я-со стояние, при котором повышается активность 8Н-групп его Су8уФЗ. Происходит внутримолекулярная перегруппировка N0 от а-Ре3+-гема к атому серы СузуФЗ с образованием 8-нитрозооксигемоглобина

НЬк(аЕе3+)(«Ре2+02)(у6Ге2+02)2Су8^3^0,

Рис. 58. Механизм гипоксической вазодилатации, действующий в ми кро циркуля торном русле в условиях локальной гипоксии определенной области ткани при участии гемоглобина и оксида азота (II)

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рубан, Михаил Константинович, 2010 год

1. Артюхов В.Г. Биофизика. / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. -Воронеж, 1994. с. 287-288.

2. Артюхов В.Г. Гемопротеиды: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения. / В.Г. Артюхов. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1995. - 280 с.

3. Артюхов В.Г. Оптические методы исследования биологических систем и объектов / В.Г. Артюхов, М.С. Бутурлакин, В.П. Шмелев. Воронеж : Изд.-во Воронеж, ун-та, 1980. - 116 с.

4. Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия: учеб. для вузов / Н.С. Ахме-тов. 4-е изд. - М. : Высш. шк. : Изд. центр «Академия», 2001. - 743 е., ил.

5. Берштейн И.Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии / И.Я. Берштейн, Ю.Л. Каминский. Л.: Химия, 1986. - 200 с.

6. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин и обратимое присоединение кислорода / Л.А. Блюменфельд. — М. : Советская наука, 1957. — 134 с.

7. Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики / Л.А. Блюменфельд. -М. : Наука : ГИ физ.-мат.лит., 1977. 336 с.

8. Ванин А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма / А.Ф. Ванин // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7, № 11. - С. 7-12.

9. Ванин А.Ф. Оксид азота и его обнаружение в биосистемах методом электронного парамагнитного резонанса / А.Ф. Ванин // Успехи физических наук. 2000. - Т. 170. - С. 455-458.

10. П.Вашанов Г.А. Роль субъединичных контактов в проявлении структурно-функциональных свойств гемоглобина в условиях различного микроокружения: дис. . д-ра биол. наук : 03.00.02 : Воронеж, 2004. 347 с.

11. Вашанов Г.А. Физико-химические и функциональные свойства гибридных макромолекул гемоглобина человека / Г.А. Вашанов, В.Г. Артюхов // Вестн. Воронеж, гос. ун-та. Сер. Химия. Биология. 2000. - № 2. - С. 94-99.

12. Вейсблут М. Физика гемоглобина / М. Вейсблут // Структура и связь. М., 1969.-С. 19-22.

13. Верболович П.А. Железо в животном организме / П.А. Верболович, А.Б. Утешев Алма-Ата : Наука, 1967. - 266 с.

14. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов : учебник для вузов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. 2-е изд., пе-рераб. и доп. - М. : Дрофа, 2006. - 285 с.

15. Волынец В.Ф. Аналитическая химия азота / В.Ф. Волынец, М.П. Волынец. -М. : Наука, 1977. -307 с.

16. Волькенштейн М.В. Биофизика / М.В. Волькенштейн. М. : Наука, 1988. -592 с.

17. Глинка Н.Л. Общая химия : учеб. пособие для нехим. спец. вузов / Н.Л. Глинка ; под ред. В.А. Рабиновича. 20-е изд. - Л. : Химия, 1979. - 720 с.

18. Детерман Г. Гель-хроматография. Гель-фильтрация. Гель-проникающая хроматография. Молекулярные сита: Пер. с нем. / Г. Детерман. 1970. - 252 с.

19. Зеленин К.Н. Оксид азота (II): новые возможности давно известной молекулы / К.Н. Зеленин // Соросовский образовательный журнал. 1997. - № 10. -С. 105-110.

20. Иваницкий Г.Р. Переливание крови: против, за и альтернатива / Г.Р. Ива-ницкий // Наука и жизнь. 1999. - № 2.

21. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства / Л.И. Иржак. М. : Наука, 1975. -240 с.

22. Калаева Е.А. УФ-индуцированные структурно-функциональные модификации гемоглобина человека в присутствии оксидов азота и углерода: дис. . канд. биол. наук : 03.00.02 : Воронеж, 2001. 188 с.

23. Кантор Ч. Биофизическая химия: в 3 т. / Ч. Кантор, П. Шиммел. М. : Мир, 1985.-312 с.

24. Козлова И.Е. УФ-чувствительность молекул гемоглобина с различным субъединичным составом : дис. . канд. биол. наук: 03.00.02 : Воронеж, 2000. -152 с.

25. Коржуев П.А. Гемоглобин. Сравнительная физиология и биохимия / П.А. Коржуев. М. : Наука, 1964. -288 с.

26. Кузнецова Н.П. Повышение кислородтранспортной эффективности гемоглобина при его химической модификации / Н.П. Кузнецова, JI.P. Гудкин, Р.Н. Мишаева // Биохимия. 1996. - Т. 61, вып. 4. - С. 680-689.

27. Лакин Г.Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. Вузов : 4-е изд., пере-раб. и доп. / Г.Ф. Лакин. М. : Высш. шк., 1990. - 352 с.

28. Лидин P.A. Химические свойства неорганических веществ: учеб. пособие для вузов: 3-е изд., испр. / P.A. Лидин, В.А. Молочко, Л.Л. Андреева ; под ред. P.A. Лидина. М. : Химия, 2000. - 480 с.

29. Манойлов С.Е. Первичные механизмы биологического действия проникающей радиации / С.Е. Манойлов Л.: Медицина, Ленингр. отд-ние, 1968. — 184 с.

30. Меныцикова Е.Б. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зен-ков, В.П. Реутов // Биохимия. 2000. - Т. 65, вып. 4. - С. 485-503.

31. Методы изучения метаболизма оксида азота / Т.В. Звягина и др.// Вестник гигиены и эпидемиологии. 2001. - Том 5, № 2, С. 128-137.

32. Монгин A.A. Деполяризация изолированных нервных окончаний мозга донорами оксида азота: мембранные механизмы. / A.A. Монгин, П.И. Недвец-кий, C.B. Федорович // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 6. - С. 787-796.

33. Недоспасов A.A. Биогенные оксиды азота / A.A. Недоспасов, Н.В. Беда // Природа. 2005. - № 7. - С. 35-42.

34. Недоспасов A.A. Биогенный оксид азота в конкурентных отношениях / A.A. Недоспасов // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 881-904.

35. Образование N0' в процессе окисления ферроформ гемоглобина нитритом /

36. A.Н. Осипов, Г.Г. Борисенко, Ю.А. Владимиров // Успехи биологической химии. 2007. - Т. 47. - С. 259-292.

37. Рабинович В.А. Краткий химический справочник : изд. 2-е, испр. и доп. /

38. B.А. Рабинович, З.Я. Хавин. Ленинград : «Химия», 1978. - 392 с.

39. Раевский К.С. Оксид азота — новый физиологический мессенджер: возможная роль при патологии центральной нервной системы /К.С. Раевский // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1997. - Т. 123, № 5. с. 484-490.

40. Рифкинд Д.М. Гемоглобин и миоглобин / Д.М. Рифкинд // Неорганическая биохимия. М.: Мир, 1978. - Т. 2. - С. 256-338.

41. Розенберг Г.Я. Проблемы создания искусственной крови / Г.Я. Розенберг, К.Н. Макаров // ЖВХО им. Менделеева. 1985. - Т.30. - С.387-394.

42. Сосунов A.A. Оксид азота как межклеточный посредник / A.A. Сосунов // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6, № 12, С. 27-34

43. Стародуб Н.Ф. Радиационное поражение гемоглобина / Н.Ф. Стародуб, Г.М. Рекун, И.М. Шурьян. Киев : Наукова думка, 1976. - 132 с.

44. Стародуб, Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко. Киев : Наукова думка, 1987.-200 с.

45. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков / В.М. Степанов. М.: Высшая школа, 1996. - 336 с.

46. Степуро И.И. Восстановление нитрита гликозилированными аминокислотами и гликозилированным альбумином / И.И. Степуро, Н.А. Чайковская, В.В. Виноградов // Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 1. - С. 106-110.

47. Столяр О.Б. Молекулярные механизмы биологического действия ионизирующих излучений / О.Б. Столяр, О.И. Петренко, В.Н. Коробов // Львов, 1979. С. 64-75.

48. Стусь Л.К. Осцилляция некоторых лигандированных форм гемоглобина при хранении крови / Л.К. Стусь, Е.Д. Розанова // Биофизика. 1992. - Т. 37, вып. 2. - С. 387-388.

49. Уайт А. Основы биохимии : в 3 т. / А. Уайт и др. ; под ред. Ю.А. Овчинникова-М. : Мир, 1981. Т. 3.-726 с.

50. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам / Р. Чанг ; пер. с англ. М.Г. Гольдфельда ; под ред. Ю.Ш. Мошковского. Москва : изд-во «Мир», 1980. - 662 с.

51. Якубке Х.-Д. Аминоксилоты. Пептиды. Белки / Х.-Д. Якубке, X. Эшкайт. -М. : Мир, 1985.-456 с.

52. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives / A. Zwart et al. // J. Clin. Chem. Clin. Bio-chem. 1981. - Vol. 19, № 7. - P. 457-63.

53. A role for endothelin and nitric oxide in the pressor response to diasprin cross-linked hemoglobin / S.C. Schultz et al. // J. Lab. Clin. Med. 1993. - Vol. 122. -P. 301-308.

54. Alayash A.I. Peroxynitrite-mediated heme oxidation and protein modification of native and chemically modified hemoglobins / A.I. Alayash, B.A. Ryan, R.E. Ca-shon // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - Vol. 349, № 1. - P. 65-73.

55. Alderton W.K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition / W.K. Alderton, C.E. Cooper, R.G. Knowles // The Biochemical Journal. 2001. - Vol. 357.-P. 593-615.

56. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide / J.S. Beckman et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87, № 4. - P. 1620-1624.

57. Arnone A. Structure of inositol hexaphosphate-human deoxyhaemoglobin complex / A. Arnone, M.F. Perutz // Nature. 1974. - Vol. 249. - P. 34-36.

58. Beckman J.S. Peroxynitrite versus hydroxyl radical: the role of nitric oxide in su-peroxide-dependent cerebral injury / J.S. Beckman // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1994.-Vol. 17, Issue 738.-P. 69-75.

59. Benesch R. The interaction of hemoglobin and its subunits with 2,3-diphosphoglycerate / R. Benesch, R.E. Benesch, Y. Enoki // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. Vol. 61, № 3. - P. 1102-1106.

60. Benesch R.E. Subunit exchange and ligand binding: a new hypothesis for the mechanism of oxygenation of hemoglobin / R.E. Benesch, R. Benesch, G. Miacduff // Proc. N. A. S. Biochemistry. 1965. - Vol. 54. - P. 535-542.

61. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient / J.S. Stamler et al. // Science. 1997. - Vol. 276. - P. 2034-2037.

62. Blood substitutes: evolution and future applications / M.G. Scott et al. // 1997. -Clinical Chemistry. Vol. 43, №. 9.

63. Bolton W. Three dimensional Fourier synthesis of horse deoxyhaemoglobin at 2,8 Angstrom units resolution / W. Bolton, M.F. Perutz // Nature. 1970. V. 228, № 5271.-P. 551-552.

64. Bonaventura J., Lance V.P. Nitric oxide, invertebrates and hemoglobin / J. Bonaventura, V.P. Lance // Amer. Zool. 2001. - Vol. 41. - P. 346-359.

65. Cassoly R. Conformation, co-operativity and ligand binding in human hemoglobin /R. Cassoly, Q.H. Gibson//J. Mol. Biol. 1975. - Vol. 91. - P. 301-313.

66. Cassoly R. Use of nitric oxide as a probe for assessing the formation of asymmetrical hemoglobin hybrids an attempted comparison between aNO/?NOadeoxy/?ieoxy, a2NQ^deoxy and ^ deoxy^No hybrids / R Cassoly // The Journal Of Biological

67. Chemistry. 1978. - Vol. 253, № 10. - P. 3602-3606.

68. Cell-free hemoglobin limits nitric oxide bioavailability in sickle-cell disease. / C.D. Reiter et al. // Nat. Med. 2002. - Vol. 8, № 12.-P. 1383-1389.

69. Chang T.M.S. Future prospects for artificial blood / T.M.S. Chang // Tibtech. -1999.-Vol. 17.-P. 61-67.

70. Crawford J.H. Vasoactivity of S-nitrosohemoglobin: role of oxygen, heme, and NO oxidation states / J.H. Crawford, R.C. White, R.P. Patel // Blood. 2003. -Vol. 101, № 11. - P. 4408-4415.

71. Culotta E. NO news is good news / E. Culotta, D.E. Koshland Jr. // Science.1997. Vol. 258, Issue 5090. - P. 1862-1865.

72. D'Agnillo F. Polyhemoglobin superoxide dismutase - catalase as a blood substitute with antioxidant properties / F. D'Agnillo, T.M. Chang // Nat. Biotechnol.1998. Vol. 16, № 7. - P. 667-671.

73. Denicola A. Diffusion 'of peroxynitrite across erythrocyte membranes / A. Denicola, J.M Souza, R. Radi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. -P. 3566-3571.

74. Di Iorio E.E. Hemoglobins / E.E. Di Iorio // Methods in enzymology. 1981. - V. 76.-P. 57-58.

75. Diffusion-limited reaction of free nitric oxide with erythrocytes / X. Liu et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, № 30. - P. 18709-18713.

76. Dodge J.T. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes / J.T. Dodge, C. Mitchell, D.J. Hanahan // Arch. Bi-ochem. Biophys. 1963. -V. 100. - P. 119-30.

77. Drablcin D.L. The chromatographic and optical properties of hemoglobin of man in comparison those of other species / D.L. Drabkin // J. Biol. Chem. 1946. - V. 164.-P. 703-723.

78. Effects of S-nitrosation on oxygen binding by normal and sickle cell hemoglobin / C. Bonaventura et al. // Journal Of Biological Chemistry. 1999. - Vol. 274, № 35.-P. 24742-24748.

79. Electron Paramagnetic Resonance and Oxygen Binding Studies of a-Nitrosyl Hemoglobin. A novel oxygen carrier having no-assisted allosteric functions / T. Yonetani et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, № 32. - P. 20323-20333.

80. Endotheliumderived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide / L.J. Ignarro et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84. -P. 9265-9269.

81. Erythrocyte consumption of nitric oxide: competition experiment and Model Analysis / M.W. Vaughn et. al // Nitric oxide: biology and chemistry. 2001. -Vol. 5, № l.-P. 18-31.

82. Evidence for a multifactorial process involved in the impaired flow response to nitric oxide in hypertensive patients with endothelial dysfunction / M. Kelm et al. // Hypertension. 1996. - Vol. 3, Pt 1. - P. 346-353.

83. Functional coupling of oxygen binding and vasoactivity in S-nitrosohemoglobin / T.J. McMahon et al. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 16738-16745.

84. Gaston B. Nitric oxide and thiol groups / B. Gaston // Biochim. Biophys. Acta. -1999. Vol. 1411. - P. 323-333.

85. Gibson Q.H. Cooperative nitric oxide binding by manganese hemoglobin. Implications for the role of steric control in hemoglobin ligation / Q.H. Gibson, B.M. Hoffman // The Journal Of Biological Chemistry. 1979. - Vol. 254, № 11. - P. 4691-4697.

86. Gladwin M.T. NO contest: nitrite versus S-nitroso-hemoglobin / M.T. Gladwin, A.N. Schechter// Circulation Research. 2004. - Vol. 94. - P. 851-855.

87. Gow A.J. Reaction between nitric oxide and haemoglobin under physiological conditions / A.J. Gow, J.S. Stamler // Nature (London). 1998. - Vol. 391. - P. 169-173.

88. Gross S.S. Physiological reactions of nitric oxide and hemoglobin: a radical rethink / S.S. Gross, P. Lane // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 9967-9969.

89. Guest C.R. Picosecond absorption studies on the photodissociation of a- and ft-nitrosyl hemoglobin monomers / C.R. Guest, L.J. Noe // Biophys. J. 1988. -Vol. 54.-P. 731-736.

90. Han T.H. Nitric oxide reaction with red blood cells and hemoglobin under heterogeneous conditions / T.H. Han et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. - Vol. 99.-P. 7763-7768.

91. Hausladen A. Nitrosative stress: metabolic pathway involving the flavohemoglo-bin / A. Hausladen, A.J. Gow, J.S. Stamler // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -Vol. 95.-P. 14100-14105.

92. Herold S. Kinetic and mechanistic studies of the NO center dot-mediated oxidation of oxymyoglobin and oxyhemoglobin / S. Herold, M. Exner, T. Nauser // Biochemistry-US.-2001.-Vol. 40.-P. 3385-3395.

93. Herold S. Reactions of deoxy-, oxy-, and methemoglobin with nitrogen monoxide. Mechanistic studies of the S-nitrosothiol formation under different mixing conditions / S. Herold, G. Rock // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 6623-6634.

94. Hille R. Chain equivalence in reaction of nitric oxide with hemoglobin / R. Hille, G. Palmer, J.S. Olson // The Journal Or Biological Chemistry. 1977. - Vol. 252, № l.-P. 403-405.

95. Hille R. Spectral transitions of nitrosyl hemes during ligand-binding to hemoglobin / R. Hille, J.S. Olson, G. Palmer // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - P. 2110-2120.

96. Identification of residues responsible for the alkaline Bohr effect in haemoglobin / M.F. Perutz et al. // Nature. 1969. - Vol. 222. - P. 1240-1246.

97. Ignarro L.J. Nitric Oxide Biology and Pathobiology / L.J. Ignarro // San Diego : Academic Press. 2000.99.1mai K. Allosteric Effects in Haemoglobin / K. Imai // Cambridge University Press, Cambridge. 1982.

98. Increased vascular resistance with hemoglobin-based oxygen carriers / J.R. Hess et al. // Artif. Cells. Blood. Substit. Immobil. Biotechnol. 1994. - Vol. 22. -P. 361-372.

99. Influence of globin structures on the state of the heme. Ferrous low spin derivatives / M.F. Perutz et al. // Biochemistry. 1976. - Vol. 15. - P. 378-387.

100. John M.E. Nitric oxide induced conformational changes in opossum hemoglobin / M.E. John, M.R. Waterman // The Journal Of Biological Chemistry. 1979. - Vol. 254, № 23. - P. 11953-11957.

101. Kim-Shapiro D.B. Hemoglobin-nitric oxide cooperativity: is NO the third respiratory ligand? / D.B. Kim-Shapiro // Free Radic. Biol. Med. 2004. - Vol. 36. -P. 402-412.

102. Kim-Shapiro D.B. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics / D.B. Kim-Shapiro, A.N. Schechter, M.T. Gladwin // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006. - Vol. 26. - P. 697-705.

103. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. / Z. Huang et al. // Biophys. J. 2003. - Vol. 85. - P. 2374 -2383.

104. Kon H. Paramagnetic resonance study of nitric oxide hemoglobin / H. Kon // The Journal Of Biological Chemistry. 1968. - Vol. 243, №. 16. - 4350-4357.

105. Kosaka H. Mechanism of autocatalytic oxidation of oxyhemoglobin by nitrite / H. Kosaka, I. Tyuma // Environmental Health Perspectives. 1987 Vol. 73. - P. 147-151.

106. Koshland D.E. Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits / D.E. Koshland Jr, G. Nemethy, D. Filmer // Biochemistry. 1966. - Vol. 5, № 1. - P. 365-385.

107. Lancaster J.R. Jr. Simulation of the diffusion and reaction of endogenously produced nitric oxide / J.R. Jr. Lancaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -Vol. 91.-P. 8137-8141.

108. Liao J.C. Intravascular flow decreases erythrocyte consumption of nitric oxide / J.C. Liao // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 8757-8761.

109. Lundberg J.O. NO generation from nitrite and its role in vascular control / J.O. Lundberg, E. Weitzberg // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005. - Vol. 25. -P. 915-922

110. Lymar S.V. Role of compartmentation in promoting toxicity of leukocyte-generated strong oxidants / S.V. Lymar, J.K. Hurst // Chem. Res. Toxicol. 1995.- Vol. 8, № 6. -P. 833-840.

111. Miller M.R. Recent developments in nitric oxide donor drugs / M.R. Miller, I.L. Megson // British Journal of Pharmacology. 2007. - P. 1-17.

112. Modulation of nitric oxide bioavailability by erythrocytes / K.T. Huang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. Vol. 98. - P. 11771-11776.

113. Moffat J.K. Structure and functional properties of chemically modified horse hemoglobin. X-ray studies / J.K. Moffat // J. Mol. Biol. 1971. - Vol. - 58, № 1. -P. 79-88.

114. Monod J. On the nature of allosteric transitions: a plausible model / J. Monod, J. Wyman, Jp. Changeux // J. Mol. Biol. 1965. - Vol. 12. - P. 88-118.

115. Moore E.G. Cooperativity in the dissociation of nitric oxide from hemoglobin / E.G. Moore, Q.H. Gibson // J. Biol. Chem. 1976. - Vol. 251. - P. 2788-2794.

116. Muirhead H. Three dimensional Fourier synthesis of human deoxyhaemoglobin at 3,5 Angstrom units / H. Muirhead, J. Greer // Nature. 1970. Vol. 228, № 5271.-P. 516-519.

117. Nathan C. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls / C. Nathan, Q. Xie.- Cell. 1994. - Vol. 78. - 915-918.

118. Nishide H. Facilitated oxygen transport with modified and encapsulated hemoglobins across non-lowing solution membrane / H. Nishide, X.S. Chen, E. Tsu-chida // Artif. Cells. Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1997. - Vol. 25. - № 4.-P. 335-346.

119. Nitric oxide determinations: much ado about NO-thing? / Han Moshage // Clinical Chemistry. 1997. - Vol. 43, №. 4. - P: 553-556.

120. Nitric oxide in the human respiratory cycle / TJ. McMahon et al. // Nat. Med. 2002. Vol.8. P. 711 717.

121. Nitric oxide, hemoglobin; and hypoxic vasodilation / A.J. Gow // American journal of respiratory cell and molecular biology. 2005. - Vol. 32. - P. 479-482.

122. Nolan V.G. Hemolysis-associated priapism in sickle cell disease / V.G. Nolan et al. // Blood. 2005. - Vol. 106, № 9.-P. 3264-3267.

123. Optically active absorption bands of hemoglobin and its subunits / S. Beychok et al // Ji Biol. Chem.- 1967. Vol: 242, ;№H'0: - P; 2460-2462.

124. Peroxynitrite, a cloaked oxidant formed by nitric oxide and superoxide / W.H. Koppenol ct al. // Chcm. Res. Toxicol. 1992. - Vol. 5. - P. 834-842.

125. Peroxynitrite-dependent tryptophan nitration / B. Alvarez et al. // Chem. Res. ToxicoL -.1996; Voli 9j № 2. - P. 390-396;

126. Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase / H. Ischiropoulos et al-.-// Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol. 298, № 2. - P: 431-437.

127. Perutz M.F. In Molecular basis of Blood diseases : ed. G. Stammatayanopoulus / M.F. Perutz // Saunders, Philadelphia. 1987. P. 127-178.

128. Perutz M.F. Regulation of oxygen affinity of hemoglobin: influence of structure of the globin on the heme iron / M.F. Perutz // Annu. Rev. Biochem. 1979; -Vol. 48.-P. 327-386.

129. Perutz M.F. Stereochemistry of cooperative effects in haemoglobin / M.F. Pe-rutz // Nature. 1970. - Vol. 228. - P. 726-734.

130. Pulmonary hypertension as a risk factor for death in patients with sickle cell disease / M.T. Gladwin et al. // N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 350. - P. 886-895.

131. Rapoport S. The regulation of glycolysis in mammalian erythrocytes / S. Rapo-port//Essays Biochem. 1968. - Vol. 4. - P. 69-103.

132. Rates of nitric oxide dissociation from hemoglobin / F. Azizi et al. // Free Rad-ic. Biol. Med. 2005. - Vol. 39. - P. 145-151.

133. Reaction mechanism between nitric oxide and glutathione mediated by Fe(III) myoglobin / G. Reichenbach et al. // Nitric Oxide: Biol. Chem. 2001. - Vol. 5. -P. 395-401.

134. Reaction of nitric oxide with heme proteins and model compounds of hemoglobin / V.S. Sharma et al. // Biochemistry. 1987. - Vol. 26. - P. 3837-3843.

135. Red blood cell nitric oxide as an endocrine vasoregulator: a potential role in congestive heart failure / B. Datta et al. // Circulation. 2004. - Vol. 109. - P. 1339-1342.

136. Relative role of heme nitrosylation and ^-cysteine 93 nitrosation in the transport and metabolism of nitric oxide by hemoglobin in the human circulation / M.T. Gladwin et al. // Biochemistry. 2000. - Vol. 97, № 18. - P. 9943-9948.

137. Riggs A. Functional properties of hemoglobins / A. Riggs // Physiol. Rev. -1965. Vol. 45, № 4. - P. 619-673.

138. Role of thiols in the targeting of S-nitroso thiols to red blood cells / D. Pietra-forte et al. //Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 7177-7185.

139. Routes to S-nitroso-hemoglobin formation with heme redox and preferential reactivity in the beta subunits / B.P. Luchsinger et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-Vol. 100.-P. 461-466.

140. Salhany J.M. Spectral-kinetic heterogeneity in reactions of nitrosyr hemoglobin / J.M. Salhany, S. Ogawa, R.G. Shulman // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. -Vol. 71, №9.-P. 3359-3362.

141. Schechter A.N. Hemoglobin research and the origins of molecular medicine / A.N. Schechter//Blood.-2008.-Vol. 112,№ 10.-P. 3927-3938.

142. Sharma V.S. The dissociation of NO from nitrosylhemoglobin / V.S. Sharma, H.M. Ranney // J. Biol. Chem. 1978. - Vol. 253. - P. 6467-6472.

143. S-nitrosohaemoglobin: dynamic activity of blood involved in vascular control / L. Jia et al. //Nature. 1996. - Vol. 380. - P. 221-226.

144. Stamler J.S. Biochemistry of nitric oxide and its redoxactivated forms / J.S. Stamler, D.J. Singel, J. Loscalzo // Science. 1992. - Vol. 258. - P. 1898-1902.

145. Stamler J.S. Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide / J.S. Stamler // Cell. 1994. - Vol. 78, № 6. - P. 931-936.

146. Sugita Y. Differences in spectra of alpha and beta chains of hemoglobin between isolated state and in tetramer / Y. Sugita // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250, №4.-P. 1251-1256.

147. The biological chemistry of nitric oxide as it pertains to the extrapulmonary effects of inhaled nitric oxide / A.J. Gow // Proc. Am. Thorac. Soc. 2006. - Vol. 3. -P. 150-152.

148. The case of the missing NO-hemoglobin: spectral changes suggestive of heme redox reactions reflect changes in NO-heme geometry / A. Fago et. al // PNAS. -2003.-Vol. 100, №.21.-P. 12087-12092.

149. The clinical sequelae of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin a novel mechanism of human disease / R.P. Rother et al. // JAMA. — 2005. - Vol. 293. - P. 1653-1662.

150. The Nobel prize in physiology or medicine / G. Hansson et al. // Stockholm, Sweden: The Nobel Committee for Physiology or Medicine at the Karolinska Institute. 1998.

151. The oxyhemoglobin reaction of nitric oxide / A.J. Gow et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 9027-9032.

152. Transport and peripheral bioactivities of nitrogen oxides carried by red blood cell hemoglobin: role in oxygen delivery / P. Sonveaux et al. // Physiology. —2007.-Vol. 22.-P. 97-112.

153. Traylor T.G. Why NO? / T.G. Traylor, V.S. Sharma // Biochemistry. 1992. -Vol. 31.-P. 2847-2849.

154. Vanin A.F. Iron catalyzes both decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and electron paramagnetic resonance studies / A.F. Vanin, I.V. Malenkova, V.A. Serezhenkov // Nitric oxide: Biology and Chemistry. 1997. - Vol. 1, № 3. -P. 191-203.

155. Wallis J.P. Nitric oxide and blood: a review / J.P. Wallis // Transfusion medicine.-2005.-Vol. 15.-P. 1-11.

156. Wang J.H. Synthetic biochemical models / J.H. Wang // Account Chem. Res. -1970.-Vol.3.-P. 90-95.

157. Zweier J.L. Non-enzymatic nitric oxide synthesis in biological systems / J.L. Zweier, A. Samouilov, P. Kuppusamy // Biochem. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1411.-P. 250-262.