Структура и функция гена РАХ-7 человека в норме и патологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Воробьев, Евгений Владимирович

• Воробьев, Евгений Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Воробьев, Евгений Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Открытие PAX генов

1.2. Структурная организация белков PAX семейства

1.3. Структура ДНК - связывающих доменов PD и HD

1.3.1. Структура домена HD

1.3.2. Структура домена PD

1.4. Экспрессия PAX генов в эмбриогенезе

1.5. PAX гены и раковые заболевания человека

1.6. Гены РАХЗ и РАХ7

1.6.1. Экспрессия генов РАХЗ и РАХ7 в эмбриональном развитии

1.6.2. Патологии, связанные с потерей функции гена РАХЗ

1.6.2.1. Мутация Splotch мыши

1.6.2.2. Синдром Ваарденбурга

1.7. Альвеолярная рабдомиосаркома

1.7.1. Транслокация [t(2; 13)(q35; q 14)] в альвеолярной рабдомиосаркоме

1.7.2. Транслокация [t(1;13)(p36.2; q14)] в альвеолярной рабдомиосаркоме

2. Материалы и методы исследований

2.1. Клеточные линии

2.2. Клонирование кДНК гена РАХ7

2.3. Клонирование кДНК химерного гена PAX7-FKHR

2.4. Клонирование и анализ геномных клонов гена РАХ7

2.5. Конструирование экспрессионных векторов

2.6. Культивирование клеток и получение клеточных линий

2.7. Анализ ДНК-связывающей активности белков

2.8. Метод мягкого агара

2.9. Анализ клеточного цикла

2.10. Эксперименты с бестимусными мышами

2.11. Анализ экспрессии известных генов методом обратной гибридизации

2.12. Дифференциальный дисплей

2.13. Компьютерный анализ

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Клонирование и анализ кДНК гена РАХ7

3.1.1. Скрининг фаговой библиотеки кДНК

3.1.2. Рабдомиосаркома как источник РНК для клонирования

кДНК гена РАХ7

3.1.3. Клонирование кДНК гена РАХ7 методом RACE

3.1.4. Старт трансляции белка РАХ7

3.1.5. Альтернативная терминация транскрипции гена РАХ7

3.1.6. Альтернативный сплайсинг транскриптов гена РАХ7

3.1.7. Белок РАХ7 отличается от РАХЗ уникальной последовательностью

в С - конце

3.2. Клонирование кДНК гибридного гена PAX7-FKHR

3.3. Геномная организация гена РАХ7 человека

3.3.1. Клонирование и анализ геномных клонов гена РАХ7

3.3.2. Гены РАХ7 и РАХЗ имеют сходную геномную организацию

3.3.3. Седьмой интрон гена РАХ7 вовлечен в транслокацию t(1; 13)

3.4. Клонирование геномных фрагментов генов РАХЗ и FKHR

3.5. РАХ7 - вероятный кандидат на роль гена опухолевого супрессора

3.6. РАХ7 и синдром Ваарденбурга

3.7. Перенос генов РАХ7 и PAX7-FKHR в клетки NIH3T3 и получение стабильных клеточных линий с конститутивной экспрессией соответствующих белков

3.7.1. Эктопическая экспрессия как подход для функционального анализа

генов РАХ7 и PAX7-FKHR

3.7.2. Эмбриональные фибробласты мыши в качестве тестовых клеток

3.7.3. Получение клеточных линий, экспрессирующих белки РАХ7

и PAX7-FKHR

3.8. Функциональный анализ генов РАХ7 и PAX7-FKHR

3.8.1. Общие характеристики полученных клеточных линий

3.8.2. Анализ клеточного цикла

3.8.3. Анализ клеток методом мягкого агара

3.8.4. Клетки, экспрессирующие PAX7-FKHR, образуют опухоли in vivo

3.8.5. Обобщение результатов функционального анализа генов РАХ7

и PAX7-FKHR

3.9. Анализ дифференциальной экспрессии генов

3.9.1. Анализ экспрессии известных генов методом обратной гибридизации

3.9.2. Идентификация и клонирование генов методом "дифференциального дисплея"

Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ак - аминокислота

АРМС - альвеолярная рабдомиосаркома

кДа - килодальтон

РМС - рабдомиосаркома

скДНК - суммарные ДНК-копии клеточной РНК

(т.)п.н. - (тысяча) пар нукпеотидов

ФР - фактор роста

ЭРМС - эмбриональная рабдомиосаркома

DD - дифференциальный дисплей (differential display)

FISH - флюоресцентная гибридизация in situ

FKHR - fork head in rhabdomyosarcoma

HB - homeobox

HD - homeodomain

OP - octapeptide

PAX - paired box

PB - paired box

PD - paired domain

PCR - полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

RACE - быстрая амплификация концов кДНК (rapid amplification of cDNA ends)

RH - обратная гибридизация (reverse hybridization)

RT - обратная транскрипция (reverse transcription)

WS - синдром Ваарденбурга (Waardenburg syndrome)

Английское или латинское написание будет сохранено для слов, являющихся именами собственными, имеющих устойчивое употребление в международной научной литературе в качестве специфических терминов, и для слов, которые могут быть ключевыми при поиске соответствующей информации в литературе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и функция гена РАХ-7 человека в норме и патологии»

ВВЕДЕНИЕ

Гены, принадлежащие к PAX семейству, кодируют транскрипционные фаюгоры, общей чертой которых является наличие эволюционно консервативного ДНК - связывающего домена Paired domain (PD). PAX гены экспрессируются в эмбриогенезе и играют важную роль в детерминации зачатков различных структур будущего организма.

PAX гены впервые были обнаружены у дрозофилы, а позже гомологичные им гены были идентифицированы и у других организмов, включая мышь и человека. В настоящее время PAX гены человека являются объектом интенсивного изучения. Выяснилось, что нарушение функции PAX генов связано с развитием ряда заболеваний человека. В частности, потеря функции PAX генов приводит к развитию наследственных болезней, связанных с аномальным формированием определённых органов и тканей, в то время как гиперактивность этих генов ассоциируется с развитием раковых заболеваний.

Семейство PAX генов человека состоит из девяти членов. На основании структурного сходства белковых продуктов это семейство подразделено на четыре группы генов. Одна из групп представлена двумя высоко гомологичными генами РАХЗ и РАХ7. В последние годы было обнаружено, что потеря функции гена РАХЗ приводит к развитию тяжёлого наследственного заболевания человека - синдром Ваарденбурга. В связи с этим, ген РАХЗ привлек к себе большое внимание и был подвергнут всестороннему изучению. В то же время ген РАХ7 оставался одним из наимение изученных членов PAX семейства. Его полная белковая последовательность и геномная организация не были известны ни у одного из организмов.

Недавно было установлено, что развитие одной из превалирующих форм рака, образующегося в детском возрасте, альвеолярной рабдомиосаркомы (АРМС) связано со структурными изменениями генов РАХЗ и РАХ7. Вместе с

тем, появились данные, позволяющие предполагать, что ген РАХ7 может являться кандидатом на роль тканеспецифического опухолевого супрессора. Делеции хромосомного участка, где расположен этот ген, часто обнаруживаются в клетках раковых опухолей, мышечного и нейрального происхождения. При этом, известно, что функция гена РАХ7 тесно связана с формированием именно этих двух типов тканей. Однако чтобы обнаружить действительную связь между нарушением функции гена РАХ7 и развитием выше упомянутых заболеваний, важно знать его полную структуру и геномную организацию. Такая информация является необходимой для проведения мутационного анализа экзонов этого гена в поисках более тонких изменений, таких как нуклеотидные замены, небольшие делеции или инсерции.

Цель настоящей работы состоит в изучении структуры и функции транскрипционного фактора РАХ7 человека в норме и патологии. Для достижения поставленной цели предполагается решить следующие задачи:

1. Клонировать полную кодирующую последовательность гена РАХ7 человека.

2. Определить геномную организацию гена РАХ7 человека.

3. Клонировать кДНК химерного гена PAX7-FKHR, образуемого в результате хромосомной транслокации в клетках раковой опухоли - альвеолярной рабдомиосаркомы (АРМС).

4. Осуществить перенос генов РАХ7 и PAX7-FKHR в культивируемые эмбриональные фибробласты мыши и получить стабильные клеточные линии с конститутивной экспрессией соответствующих белков.

5. Исследовать функциональные свойства генов РАХ7 и PAX7-FKHR путем сравнительного анализа изменений клеточных характеристик, происходящих в ответ на эктопическую экспрессию этих генов.

6. Идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся под влиянием транскрипционных факторов РАХ7 и PAX7-FKHR.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Открытие PAX генов

Гены, принадлежащие к PAX семейству, кодируют транскрипционные факторы, общей чертой которых является наличие эволюционно консервативного ДНК - связывающего домена Paired domain (PD). Впервые такие гены были обнаружены у дрозофилы. Основанием для их открытия послужила гипотеза "gene network". Эта гипотеза, исходящая из эволюционных наблюдений, была сформулирована Маркусом Нолом в 1986 году (Ворр et al., 1986; Frigerio et al., 1986). Суть гипотезы сводится к следующим положениям. Новые гены (транскрипционные факторы) возникают в результате дупликации уже существующих генов или путем рекомбинации последовательностей, кодирующих отдельные домены. Продукты новообразованных генов, в силу своего родства или наличия сходных доменов, становятся участниками сходных процессов (взаимодествий). В результате, образуются сети генов с аналогичными функциями. Согласно своему происхождению, все гены, принадлежащие к таким сетям, состоят из комбинаций относительно небольшого числа субпоследовательностей, кодирующих определенные функциональные домены. Эта концепция предсказывает, что любой член какой - либо генной сети содержит один или несколько доменов, присущих и другим членам этой сети. Следовательно, возможно найти все гены и домены, принадлежащие одной генной сети. В дальнейшем эта гипотеза оказалась очень плодотворной, хотя и не стала парадигмой. В качестве объекта для её экспериментального подтверждения

был использован гомеобокс-содержащий ген дрозофилы, paired. Фенотип мух, мутантных по гену paired, свидетельствовал о важной роли этого гена в ранних процессах сегментации эмбриона, а именно, в определении парности сегментов. Чтобы обнаружить другие гены, относящиеся к той же функциональной группе, что и paired, его кДНК разделили на три примерно равные части и использовали эти фрагменты в качестве зондов для поиска гомологичных последовательностей других генов, кодирующих родственные домены. В результате, были изолированы новые гены, такие как bicoid, goosebery, neural goosebery, pox meso и pox neural. Общей чертой этих генов, за исключением bicoid, является наличие консервативной последовательности, которая была названа Paired box (РВ). В дальнейшем было установлено, что все эти гены, действительно, относятся к одной фенотипической группе мутаций парности сегментов (pair - rule). Позднее, используя в качестве зонда фрагмент ДНК, содержащий Paired box гена paired дрозофилы, были клонированы подобные гены других организмов. К настоящему моменту у мыши и человека известны девять членов этого семейства, получившего название PAX (paired box).

1.2. Структурная организация белков PAX семейства

Основным объединяющим признаком для белков, кодируемых генами PAX семейства, является наличие большого эволюционно консервативного ДНК - связывающего домена, Paired domain (PD). Этот домен находится в N -концевой части белка и состоит из 128 аминокислотных остатков. Некоторые PAX белки содержат ещё один ДНК - связывающий домен, Homeodomain (HD),

или не полный HD, а лишь его N - концевую половину. Homeodomain -содержащие белки, как известно, также образуют суперсемейство транскрипционных факторов, контролирующих развитие организмов. Однако Homeodomain PAX белков имеет специфические отличия по ряду аминокислотных остатков, которые являются инвариантными в HD домене НОХ белков и поэтому получил название "paired type homeodomain". Помимо этих двух доменов, некоторые PAX белки содержат ещё один консервативный элемент, октапептид (octapeptide, OP). Это восемь аминокислотных остатков -HSIDGILS, которые располагаются между PD и HD. Подобная последовательность встречается также у ряда белков, не содержащих PD. Функция октапептида до сих пор остается невыясненной.

В С-концевой области PAX белков находятся последовательности, играющие роль в транскрипционной транс-регуляции. В настоящее время ведется работа по выяснению их детальной структуры и функциональных особенностей. Сейчас можно лишь отметить, что эти последовательности являются уникальными и специфичными для каждого из членов PAX семейства.

На основании структурного сходства девять PAX белков мыши и человека подразделены на четыре группы. Обобщенные сведения о них приведены в таблице 1. Первая группа состоит из двух членов РАХЗ и РАХ7. По-видимому, эти белки наиболее близки к предковой форме, так как они сохранили все основные консервативные элементы, встречающиеся у белков PAX семейства: PD, ОР и HD. Во вторую группу входят белки, не имеющие лишь октапептида: РАХ4 и РАХ6. В третьей группе - три члена: РАХ2, РАХ5 и

РАХ8. Они содержат Рй, ОР и НО, но не весь Нотеоскэплат, а лишь его 1М-концевую половину. Четвертую группу составляют Рах1 и Рах9, для которых характерно полное отсутствие домена НО.

Таблица 1. Структурная организация белков РАХ семейства (ЗЛиаЛ & Стээ, 1995).

ГЕН

СТРУКТУРА БЕЛКА

ХРОМОСОМА

РО

ОР

НО

мышь человек

Группа I РАХ-3 -С

РАХ-7 ?£

х>

]—о

1 2q35 4 1р36.2

Группа II РАХ-4 -С

РАХ-6

6

2 11р13

Группа III РАХ-2 -С

РАХ-5 -[ РАХ-8

]—о

ьо

х>

19 4 2

10я25 9р13 2я12-я14

Группа IV РАХ-1

РАХ-9 ?£

и—о-

2 20р11 12 14д12-д13

Необходимо добавить, что недавно появились сведения о новом члене PAX семейства дрозофилы, структура которого не позволяет отнести его ни к одной из четырёх групп. Это ген Lune; его последовательность еще не опубликована, но он упоминается в ряде статей, где сообщается, что данный ген кодирует белок, содержащий полный HD, но не имеющий первой наиболее консервативной половины домена PD (Jun & Desplan, 1996).

В геноме мыши и человека все PAX гены расположены на разных хромосомах и не организованы в кластеры, подобно большинству НОХ генов. Это предполагает независимость паттерна экспрессии PAX генов от взаимного расположения их на хромосомном уровне, как это свойственно для кластерных НОХ генов.

1.3. Структура ДНК - связывающих доменов PD и HD

В этой главе мы приводим сведения о детальной структуре двух ДНК-связывающих доменов, Paired domain и Homeodomain, которые составляют наиболее консервативную часть белков PAX семейства. В первую очередь, будет рассмотрена структура домена HD, являющегося эволюционно более древним, чем PD.

Homeodomain - содержащие белки были обнаружены у всех эукариот, включая царства грибов и растений. Роль этого домена является настолько фундаментальной, что его последовательность, состоящая из 60 аминокислотных остатков, порой сохраняется эволюцией в высшей степени неизменной. Например, при том, что позвоночные и насекомые разошлись в эволюции более, чем полмиллиарда лет назад, последовательности HD

доменов человеческого белка Нох-А7 и ортологичного белка дрозофилы Antennapedia отличаются лишь одним аминокислотным остатком.

Paired domain - содержащие белки, по-видимому, появились в эволюции значительно позже. В настоящее время полностью секвенированы геномы ряда прокариот и эукариот, включая E.coli и S.cerevisiae. В результате компьютерного анализа всех возможных кодирующих последовательностей в геномах этих организмов не удалось обнаружить наличие какой-либо значительной гомологии с последовательностью Paired box. Однако гены, кодирующие Paired domain, были идентифицированы даже у самых примитивных многоклеточных, таких как гидра, медузы и коралловые полипы. Таким образом, предполагается, что возникновение этого домена связано с появлением многоклеточное™.

1.3.1. Структура домена HD.

Вторичная и третичная структуры домена HD ряда НОХ белков были определены методом ядерномагнитного резонанса (Kissinger et al., 1990; Gehring et al., 1994). В результате, было выяснено, что Homeodomain состоит из трёх а - спиралей, образующих плотную глобулярную структуру. Спираль I, которой предшествует гибкий (не имеющий постоянной структуры) N-конец, отделена от спирали II небольшой петлёй, и вместе со спиралью III они формируют структуру спираль - поворот - спираль (helix-turn-helix). Подобный структурный мотив был ранее описан для ряда прокариотических транскрипционных факторов, включая репрессоры X и 434 (Steitz, 1990; Pabo and Sauer, 1992). Однако, в отличие от последних, третья спираль домена HD

имеет небольшой гибкий поворот, за которым следует несовершенный спиральный участок - спираль IV. Предполагается, что этот участок принимает форму близкую к а - спирали в результате связывания с ДНК. Структура, в большей степени напоминающая домен Нй белков многоклеточных организмов, обнаруживается у ряда белков низших эукариот. Например, НР -подобный домен гена МАТа2 (Б. сеге^ае), который лишь на двадцать восемь процентов гомологичен последовательности Нотеос1отат белка А^еппаресПа, имеет точно такую же пространственную укладку (\Л/о1Ьегдег е! а1., 1991). Можно заключить, что третичная структура домена НО в целом сохраняется в эволюции неизменной, даже при значительной вариабильности аминокислотного состава.

При специфическом контакте домена НР с ДНК наблюдаются следующие взаимодействия и пространственные взаимоотношения (Рис.1).

5'Р З'а

5'а З'р

Рис. 1. Пространственные взаимодействия домена Нй с ДНК. (веЫпд е1а1., 1994).

Спирали I и II расположены антипаралельно друг другу и перпендикулярно направлению малой борозды ДНК. Петля между спиралью I и II взаимодействует с фосфатным остовом ДНК. Два участка непосредственно контактируют с азотистыми основаниями ДНК: спираль III-IV ("узнающая спираль") и гибкий N-конец, предшествующий первой спирали. "Узнающая спираль" ложится в большую борозду ДНК и контактирует с обоими цепями ДНК, а гибкий N-конец контактирует с малой бороздой ДНК.

Третичная структура домена HD, специфичного для белков PAX семейства, была выяснена на примере белка paired дрозофилы, который является прототипом для этого семейства (Wilson et al., 1995). Как и предполагалось, HD домен белка paired имеет точно такую же пространственную укладку как и HD НОХ белков. Вторичная структура и сравнение аминокислотных последовательностей домена HD некоторых PAX белков приведены на рисунке 2.

N al a2 <x3 a4

1 10 20 30 40 50 59

I I I I I I I

prd QRRCRTTFSASQLDELERAFERTQYPDIYTREELAQRTNLTEARIQVWFSNRRARLRKQ

PAX 7---S------Е—Е---К-----Н--------------К-----V----------W---

РАХЗ---S----Т-Е--Е---------Н-------------AK-----V----------W---

Gsb ---S----Т-Е—ЕА-----S------V--------Т-А-------------------Н

Gsbn---S-----ND-I-A---I-A------V--------S-G-----V--------------

PAX б LQ-N—S-TQE-IEA—КЕ----Н---VFA—R—AKID-P-------------KW-RE

pax4 SH-N—I — PG-AEA—KE-Q-G----SVA-GK—AA-S-P-DTVR--------KW-R-

— ..R.RT.F...Q...LE..F.R..YPD...R..LA____L.E....VWFSNRRA..R..

I I .......F.............RT. .PD. . . .E.L........AR.Q...S...A.....

r-1 irarararanmmm..................................ММММ1^М1ШУ1ММ]У1М1ШМ.

Ц- постоянные амино кислоты ]- paired консенсус I- контакт с ДНК

Рис. 2. Вторичная структура и сравнение аминокислотных последовательностей ДНК-связывающего домена HD ряда белков PAX семейства. N -N-концевой гибкий участок, m - малая и М - большая борозды спирали ДНК. (Wilson et al., 1995)

1.3.2. Структура домена PD.

После открытия Paired domain как консервативного белкового домена закономерно возник вопрос о его функциональной роли. Изначально было известно, что PAX гены кодируют транскрипционные факторы, так как они содержат ДНК-связывающий домен HD. По мере обнаружения новых членов PAX семейства были клонированы и такие гены, которые совсем не содержат Homeobox (Pox meso, Pox neuro, Pax1, Pax9). На основании анализа мутантных фенотипов, вызванных нарушением функции этих генов, предполагалось, что соответствующие белки играют регуляторную роль. Вместе с тем, было показано, что эти белки имеют ядерную локализацию и, следовательно, могут являться транскрипционными факторами. Такие факты позволили предполагать, что функция домена PD состоит в связывании с ДНК. В конечном итоге, удалось прямо показать ДНК-связывающую активность PD, которая не зависит от присутствия HD и имеет отличную от HD специфичность по отношению к ДНК. Была идентифицирована определенная нукпеотидная последовательность в промоторе гена even-skipped, названная е5, с которой связывается белок paired. Более того, было показано, что paired - зависимая активация гена even-skipped определяется наличием интактного домена PD в белке paired (Treisman et al.,1991).

Вторичная структура и пространственная организация домена PD были выяснены с помощью двумерного ядерномагнитного резонанса на кристаллах соответствующего ДНК-белкового комплекса (Xu et al., 1995). В результате, было обнаружено, что PD состоит из двух независимых глобулярных субдоменов. Оба субдомена образованы тремя а - спиралями и каждый из

них имеет структуру, в общих чертах напоминающую структуру домена HD. N-концевой субдомен является наиболее консервативной частью PD и отвечает за специфическое связывание с ДНК. С-концевой субдомен менее консервативен и, по-видимому, не участвует в ДНК - белковых взаимодействиях. Эти два субдомена получили условные названия, происходящие от двух частей слова paired: PAI и RED. Субдомен PAI не только внешне напоминает HD по типу пространственной укладки, но и связывается с ДНК аналогичным образом. Его третья спираль является "узнающей" и контактирует с большой бороздой спирали ДНК. Подобно гибкому N-концу HD, N-конец субдомена PAI, предшествующий первой а -спирали, образует контакты с малой бороздой ДНК посредством бета-поворота второго типа (т2) (Рис. 3).

5'

Рис. 3. Пространственные взаимодействия домена PD с ДНК (Xu et al.,1995).

PAI субдомен

RED субдомен

al a2 <хЗ ot4 а5 аб

120

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Воробьев, Евгений Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Методом RACE клонирована кДНК гена РАХ7 человека. В результате секвенирования и последующего компьютерного анализа определены 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, кодоны инициации и терминации трансляции, участок альтернативного сплайсинга и район альтернативной терминации транскрипции этого гена. Выяснено, что полученная кДНК содержит полную открытую рамку считывания и кодирует белок, состоящий из 520 аминокислотных остатков, с предполагаемой массой 56,9 кДа.

2. В результате скрининга фаговой библиотеки ДНК человека клонированы фрагменты геномной последовательности гена РАХ7. Посредством рестрикционного анализа и Southern гибридизации 39 изолированных фагов выявлены три группы клонов, содержащих перекрывающиеся последова-тельности вставок. Путем субклонирования и секвенирования наименьших экзон-позитивных рестрикционных фрагментов определены точная локализация экзонов и их интронные границы. На основании этих данных полностью определена геномная структура гена РАХ7 и построена крупномасштабная карта соответствующего геномного локуса. Установлено, что ген РАХ7 человека состоит из восьми экзонов и имеет протяженность более 90 т.п.н.

3. Методом RT-PCR, из РНК опухолевых клеток АРМС, клонирована кДНК, содержащая полную кодирующую область химерного гена PAX7-FKHR. Открытая рамка считывания соответствует белку, состоящему из 830 аминокислотных остатков, с молекулярным весом 90,8 кДА. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей кДНК РАХ7 и гибридной кДНК PAX7-FKHR, с учетом выясненной экзон-интронной организации гена РАХ7, установлено, что хромосомные транслокации, ведущие к образованию химерного гена PAX7-FKHR, происходят в седьмом интроне гена РАХ7.

4. Осуществлен перенос генов РАХ7 и PAX7-FKHR, в составе экспрессионных векторов, в культивируемые эмбриональные фибробласты мыши, и путем клональной селекции получены стабильные клеточные линии с конститутивной экспрессией соответствующих белков. Эктопическая экспрессия функциональных белков РАХ7 и PAX7-FKHR и их ДНК-связывающая активность, в полученных клеточных линиях, подтверждены методом ретардации в геле.

5. Используя различные условия культивирования клеток, а также методы проточной цитофлюорометрии и мягкого агара, проведен систематический сравнительный анализ изменений основных клеточных характеристик, происходящих в ответ на эктопическую экспрессию генов РАХ7 и PAX7-FKHR. Установлено, что функция гена РАХ7 тесно связана с регуляцией клеточной пролиферации и дифференциации. Экспериментально показано, что экспрессия химерного транскрипционного фактора PAX7-FKHR приводит к неопластической трансформации клеток in vivo.

6. Методом обратной гибридизации идентифицированы 13 генов с известной функцией, которые дифференциально экспрессируются под влиянием транс-фактора PAX7-FKHR. Методом дифференциального дисплея клонированы 3 новых гена, транскрипция которых специфически активируется в ответ на эктопическую экспрессию как гена РАХ7, так и его химерной формы PAX7-FKHR.

Я приношу искреннюю и глубокую благодарность моим товарищам, благодаря участию которых эта работа стала успешной. Илья Мерцалов (Институт Биоорганической Химии, Москва) участвовал в клонировании и рестрикционном картировании геномных фагов гена РАХ7. Александр Кондрашов (Институт Цитологии, С.Петербург) определил условия для выявления специфической ДНК-связывающей активности белков РАХ7 и PAX7-FKHR. Владимир Курышев (Институт Экспериментальной Медицины, С.Петербург) секвенировал PCR-продукты генов, идентифицированных методом "дифференциального дисплея".

Я очень признателен сотрудникам Университета г.Мюнстер (Германия) Christian Schulz, за помощь в использовании клеточного сортера; Rita Exeler, за проведение FISH экспериментов; Hans-Gerd Pauls, за помощь в экспериментах с бестимусными мышами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Воробьев, Евгений Владимирович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Arnold, Н.Н., Braun, Т. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their roles during myogenesis. // Int. Dev. Biol. 1996. v.40. pp.345 - 363.

2. Asmar, L„ Gehan, E.A., Newton, W.A.Jr., Webber, B.L., et al. Agreement among and within groups of pathologists in the classification of rhabdomyosarcoma and related childhood sarcomas: report of an international study of four pathology classifications. II Cancer. 1994. v.74. pp. 2579 - 2588.

3. Baldwin, C.T., Hoth, C.F., Amos, J.A., Da-Silva, E.O., Milunsky, A. An exonic mutation in the HuP2 paired domain gene causes Waardenburg syndrome. // Nature. 1992. v. 355. pp. 637 - 638.

4. Barr, F.G., Galili, N„ Holick, J., Biegel, J.A., Rovera, G., Emanuel, B.S. Rearrangement of the PAX3 paired box gene in the paediatric solid tumour alveolar rhabdomyosarcoma. // Nature Genet. 1993. v. 3. pp. 113 -117.

5. Barr, F.G., Nauta, L.E., Davis, R.J., Schafer, B.W., Nycum, L.M., Biegel, J .A. In vivo amplification of the PAX3-FKHR and PAX7-FKHR fusion genes in alveolar rhabdomyosarcoma. // Hum. Mol. Genet. 1996. v. 5. pp. 5-12.

6. Barr, F.G. Fusions involving paired box and fork head family transcription factors in the pediatric cancer alveolar rhabdomyosarcoma. // Curr.Top.Microbiol.-Immunol. 1997. v.220. pp. 113-29.

7. Biegel, J.A., Meek, R.S., Parmiter, A.H., Conard, K., Emanuel, B.S. Chromosomal translocation t(1;13)(p36.2; q14) in a case of rhabdomyosarcoma. II Genes Chromosom Cancer. 1991. v. 3. pp. 483 - 484.

8. Blair, D.G., Cooper, C.S., Ea, L.A., Vande Woude, G.F. New method for detecting cellular transforming genes. //Science. 1982. v. 218. pp. 1122-1125.

9. Bopp D., Burri M., Baumgartner S., Frigerio G., Noll M. Conservation of a large protein domain in the segmentation gene paired and in functionally related genes of Drosophila. // Cell. 1986. v. 47. pp. 1033 -1040.

10. Burri, M., Tromvoukis, Y., Bopp, D., Frigerio, G., and Noll, M. Conservation of the paired domain in metazoans and its structure in three isolated human genes. // EMBO J. 1989. v.8. pp. 1183 - 1190.

11. Caron, H., Peter, M., P. van Sluis et al. Evidence for two tumour suppressor loci on chromosomal bands 1p35-36 involved in neuroblastoma: one probably imprinted, another associated with N-myc amplification. // Hum. Mol. Genet. 1995. v.4. pp. 535 - 539.

12. Cheng, N.C., Van Roy, N„ Chan, A., Beitsma, M„ Westerveld, A., Speleman, F., Versteeg, R. Deletion mapping in neuroblastoma cell lines suggests two distinct tumour suppressor genes in the 1p35-36 region, only one of which is associated with N-myc amplification. // Oncogene. 1995. v. 10. pp. 291 - 297.

13. Chomczynski P. & Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction. // Anal.Biochem. 1987. v. 162. pp. 156-159.

14. Cvekl A., Piatigorsky J. Lens development and crystallin gene expression: many roles for Pax6. // BioEssays. 1996. v. 18. pp. 621 - 630.

15. Dahl E., Koseki H., Balling R. PAX genes and organogenesis. // BioEssays. 1997. v. 19. pp. 755-765.

16. Davis, R.J., D'Cruz, C.M., Lovell, M.A., Biegel, J.A., and Barr, F.G. Fusion of PAX7 to FKHR by the variant t(1;13) (p36;q14) translocation in alveolar rhabdomyosarcoma. // Cancer. Res. 1994. v.54. pp. 2869 - 2872.

17. Davis, R.J., Bennicelli, J.L., Macina, R.A., Nycum, L.M., Biegel, J.A. & Barr, F.G. Structural characterization of the FKHR gene and its rearrangement in alveolar rhabdomyosarcoma. // Hum. Mol. Genet. 1995. v.4. pp. 2355 - 2362.

18. Dickie, M.M. Splotch, a new mutation in the house mouse Mus musculus. II J. Hered. 1964. v. 5. p. 97.

19. Douglass, E.C., Valentine, M., Etcubanas, E., Parham, D., Webber, B.L., Houghton, P.J., Green, A.A. A specific chromosomal abnormality in rhabdomyosarcoma. //Cytogenet. Cell Genet. 1987. v.45. pp. 148 -155.

20. Douglass, E.C., Rowe, S.T., Valentine, M., Parham, D., Berkow, R„ Bowman, W.P., Maurer, H.M. Variant translocations of chromosome 13 in alveolar rhabdomyosarcoma. // Genes Chromosom Cancer. 1991. v.3. pp. 480 - 482.

21. Ellmeier, W., Barnas, C., Kobrna, A., Kleiner, E., Kurzbauer, R„ Weith, A. Cloning and characterization of CpG islands of the human chromosome 1p36 region. II Genomics. 1996. v.32. pp. 155 -158.

22. Epstein, D.J., Vekemans, M. and Gros, P. Splotch, a mutation affecting development of the mouse neural tube, shows a deletion within the paired homeodomain of Pax3. // Cell. 1991. v.67. pp. 767 - 774.

23. Farrer, L.A., Grundfast, K.M., Amos, J., Arnos, K.S. et al. Waardenburg syndrome (WS) type I is caused by defects at multiple loci, one of which is near ALPP on chromosome 2: first report of the WS consortium. // Am. J. Hum. Genet. 1992. v.50. pp. 902-913.

24. Flether, J. A. Cytogenetics and experimental models of sarcomas. // Current Opinion in Oncology. 1994. v.6. pp. 367 - 371.

25. Frigerio G., Burri M., Bopp D., Baumgartner S., Noll M. Structure of the segmentation gene paired and the Drosophila PRD gene set as part of a gene network. // Cell. 1986. v.47. pp. 735 - 746.

26. Galili, N., Davis, R.J., Fredericks, W.J., Mukhopadhyay, S„ Rauscherlll, F.J., Emanuel, B.S., Rovera, G. and Barr, F. Fusion of a fork head domain gene to PAX3 in the solid tumour alveolar rhabdomyosarcoma. // Nature Genet. 1993. v.5. pp. 230 - 235.

27. Gehring, W., Qian, Y.Q., Billeter, M., Furukubo-Tokunaga, K., Schier, A.F., Resendez-Perez, D., Affolter, M., Otting, G., Wuthrich, K. Homeodomain - DNA recognition. // Cell. 1994. v.78. pp. 211 - 223.

28. Goulding, M.D., Chalepakis, G., Deutsch, U., Erselius, J.R., Gruss, P. Pax-3, a novel murine DNA binding protein expressed during early neurogenesis. // The EMBO-J. 1991. v. 10. pp. 1135 - 1147.

29. Goulding, M., Sterrer, S., Fleming, J., Balling, R., Nadeau, J., Moore, K.J., Brown, A.D.M., Steel, K.P. and Gruss, P. Analysis of the Pax3 mouse mutant splotch. // Genomics. 1993. v. 17. pp. 355 - 363.

30. Haider G., Callaerts P., Gehring W.J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. // Science. 1995. v. 267. pp. 1788 -1792.

31. Harris W.A. Pax6: where to be conserved is not conservative. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1997. v. 94. pp. 2098 - 2100.

32. Hoey T., and Levine M. Divergent homeobox proteins recognize similar DNA sequences in Drosophila. II Nature. 1988. v.332. pp. 858 - 861.

33. Hoth, C.F., Milunsky, A., Lipsky, N„ Sheffer, R., Clarren, S.K. and Baldwin, C.T. Mutations in the paired domain of the human PAX3 gene cause Klein-Waardenburg syndrome (WS-III) as well as Waardenburg syndrome type I (WS-I). //Am. J. Hum. Genet. 1993. v.52. pp. 455 - 462.

34. Hromas, R., Costa, R. The hepatocyte nuclear factor-3 / forkhead transcription regulatory family in development, inflammation, and neoplasia. // Critical Rev. Oncology Hematology. 1995. v. 20. pp.129 -140.

35. Jostes, B., Walther, C. and Gruss, P. The murine paired box gene, Pax7, is expressed specifically during the development of the nervous and muscular system. // Mech. Dev. 1991. v.33. pp. 27 - 38.

36. Jun, S. & Desplan, C. Cooperative interactions between paired domain and homeodomain. // Development. 1996. v. 122. pp. 2639 - 2650.

37. Kaufmann, E., Knochel, W. Five years on the wings of forkhead. // Mach. Dev. 1996. v.57. pp.3 - 20.

38. Kissinger, C.R., Liu, B., Martin-Blanco, E., Kornberg, T.B., Pabo, C.O. Crystal structure of an engrailed homeodomain-DNA complex at 2.8 A resolution: a framework for understanding homeodomain-DNA interactions. // Cell. 1990. v.65. pp. 579 - 590.

39. LalwaniA.K., Brister, J.R., Fex, J., Grundfast, K.M. Ploplis, B., San Agustin, T.B., Wilcox, E.R. Furthe elucidation of the genomic structure of PAX3 and identification of two different point mutations within the PAX3 homeobox that

cause Waardenburg syndrome typel ¡n two families. // Am.J.Hum.Genet. 1995. v.56. pp. 75 - 83.

40. Land H., Parada L., Weinberg R. Tumorigenic conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes. // Nature. 1983. v.304. pp. 596 - 602.

41. Liang, P. and Pardee, A.B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. // Science. 1992. v.257. pp. 967 -971.

42. Macina, R.A., Barr, F.G., Galili, N. and Riethman, H.C. Genomic organization of the human PAX3 gene: DNA sequence analysis of the region disrupted in alveolar rhabdomyosarcoma. // Genomics. 1995. v.26. pp. 1-8.

43. Mansouri, A, Stoykova, A., Torres, M., Gruss, P. Dysgenesis of cephalic neural crest derivatives in PAX7 -/- mutant mice. II Development.. 1996. v. 122. pp. 831 - 838.

44. Mansouri, A, Hallonet, M., Gruss, P. Pax genes and their roles in cell differentiation and development. // Curr. Opin. Cell. Biol. 1996. v.8. pp. 851 - 857.

45. Maulbecker C. & Gruss P. The oncogenic potential of Pax genes. // The EMBO J. 1993. v.12. pp. 2361 - 2367.

46. Pabo, C.O., and Sauer R.T. Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition. //Annu. Rev. Biochem. 1992. v.61. pp. 1053 - 1095.

47. Protein structure prediction. / Ed. Sternberg, M.J.E. IRL Press at Oxford Press, England, 1996. 298 pp.

48. Quiring R., Walldorf U., Kloter U., Gehring W.J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. // Science. 1994. v.265. pp. 785 - 789.

49. Report of the Second International Workshop on Human Chromosome 1 Mapping. II Cytogenet. Cell Genet. 1996. v.72. pp. 113 -154.

50. Sambrook, J., Maniatis, T., and Fritsch, E.F. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" / Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989..

51. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. v. 74. pp. 5463 - 5467.

52. Schafer, B.W., Czerny, T., Bernasconi, M., Genini, M. and Busslinger, M. Molecular cloning and characterization of a human PAX7 cDNA expressed in normal and neoplastic myocytes. // Nucleic Acids Res. 1994. v.22. pp. 4574 -4582.

53. Schafer, B.W. and Mattei, M.G. The human paired domain gene PAX7 (Hup1) maps to chromosome 1p35 - 1p36.2. // Genomics. 1993. v. 17. pp. 249 -251.

54. Scheidler, S., Fredericks, W.J., Rauscher III, F.J., Barr, F.G. The hybrid PAX3-FKHR fusion protein of alveolar rhabdomyosarcoma transforms fibroblasts in culture. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1996. v.93. pp. 9805 - 9809.

55. Schleiermacher, G., Peter, M., Michon, J., Hugot, J.-P., Vielh, P., Zucker, J.-M., Magdelenat, H., Thomas, J. and Delattre, O. Two distinct deleted regions on the short arm of chromosome I in neuroblastoma. // Genes Chrom. Cancer. 1994. v.10. pp. 275-281.

56. Shapiro, D.N., Sublett, J.E., Li, B., Downing, J.R., Naeve, C.W. Fusion of PAX3 to a member of the forkhead family of transcription factors in human alveolar rhabdomyosarcoma. // Cancer Res. 1993, a. v.53. pp. 5108 - 5112.

57. Shapiro, D.N., Sublett, J.E., Li, B., Valentine, M.B., Morris, S.W. and Noll, M. The gene for PAX7, a member of the paired-box-containing genes, is localized on human chromosome arm 1p36. // Genomics. 1993, b. v. 17. pp. 767 - 769.

58. Stapleton, P., Weith, A., Urbanek, P., Kozmik, Z. and Busslinger, M. Chromosomal localization of seven PAX genes and cloning of a novel family member, PAX9. // Nature Genet. 1993. v.3. pp. 292 - 298.

59. Steitz, T.A. Structural studies of protein - nucleic acid interaction: the sources of sequence-specific binding. // Quart. Rev. Biophys. 1990. v.23. pp. 205 -280.

60. Stuart, E.T. and Gruss, P. PAX genes: what's new in developmental biology and cancer? // Hum. Mol. Genet. 1995. v. 4. pp. 1717 -1720.

61. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis: Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. //Cell. 1997. v.89. pp.127 -138.

62. Tassabehji, M., Read, A.P., Newton, V.E., Harris, R., Balling, R., Gruss, P., Strachan, T. Waardenburg's syndrome patients have mutations in the human homologue of the Pax3 paired box gene. // Nature. 1992. v. 355. pp. 635 - 636.

63. Tassabehji, M., Newton, V.E., Liu, X.-Z., Brady, A. et al. The mutational spectrum in Waardenburg syndrome. // Hum. Mol. Genet. 1995. v. 4. pp. 2131 -2137.

64. Tassabehji, M., Newton, V.E., Leverton,K., Turnbull, K., Seemanova, E., Kunze, J., Sperling, K., Strachan, T„ Read, A.P. PAX3 gene structure and mutations: close analogies between Waardenburg syndrome and the Splotch mouse. // Hum. Mol. Genet. 1994. v. 3. pp. 1069 -1074.

65. Taylor, S.M., Jones, P.A. Multiple phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. //Cell. 1979. v. 17. pp. 771 - 779.

66. Tomarev S., Callaerts P., Kos L., Zinovieva R., Haider G., Gehring W., Piatigorsky J. Squid Pax6 and eye development. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1997. v.94. pp. 2421 - 2426.

67. Treisman J., Harris E., Desplan C. The paired box encodes a second DNA-binding domain in the paired homeo domain protein. // Genes Dev. 1991. v.5. pp. 594 - 604.

68. Turc-Carel, C., Lizard-Nacol, S., Justrabo, E., Favrot, M., Philip, T., Tubone, E. Consistent chromosomal translocation in alveolar rhabdomyosarcoma. // Cancer Genet. Cytogenet. 1986. v. 19. pp. 361 - 362.

69. Vogan, K.J., Epstein, D.J., Trasler, D.G., and Gros, P. The Splotch -delayed mouse mutant carries a point mutation within the paired box of the Pax3 gene. // Genomics. 1993. v. 17. pp. 364 - 369.

70. Waardenburg, P.J. A new syndrome combining developmental anomalies of the eyelids, eyebrows, and nose root with pigmentary defects of iris and head hair and with congenital deafness. // Am.J.Hum.Genet. 1951. v. 3. p. 195.

71. Wang-Wuu, S., Soukup, S., Ballard, E., Gotwals, B., Lampkin, B. Chromosomal analysis of sixteen human rhabdomyosarcomas. // Cancer Res. 1988. v.48. pp. 983-987.

72. Wilson, D.S., Guenther, B., Desplan, C., Kuriyan, J. High resolution crystal structure of a paired (Pax) class cooperative homeodomain dimer on DNA. // Cell.

1995. v.82. pp. 709-719.

73. Whang-Peng, J., Knjutsen, T., Theil, K., Horowitz, M.E., Triche, T. Cytogenetic studies in subgroups of rhabdomyosarcoma. // Genes Chromosom. Cancer. 1992. v.5. pp. 299 - 310.

74. White, P.S., Maris, J.M., Beltinger, C., et al. A region of consistent deletion in neuroblastoma maps within human chromosome 1p36.2-36.3. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. v.92. pp.5520 - 5524.

75. Wilm, B., Dahl, E., Peters, H., Balling, R., lmai,K. Targeted disruption of Pax1 defines its null phenotype and proves haploinsufficiency. II Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. v.95. pp. 8692 - 8697.

76. Wolberger, C„ Vershon, A.K., Liu, B., Johnson, A.D., Pabo, C.O. Crystal structure of a MATa2 homeodomain-operator complex suggests a general model for homeodomain-DNA interactions. //Cell. 1991. v.67. pp. 517 - 528.

77. Xia, S.H., Yao, Z., Mansouri, A., Gruss, P. The expression of Pax7 in C2C12 cell line and its inducible inactivation. // Shih-Yen-Sheng-Wu-Hsueh-Pao.

1996. v.29. 185-189.

78. Xu, W., Rould, M.A., Jun, S., Desplan, C., Pabo, C.O. Crystal structure of a paired domain - DNA complex at 2.5 A resolution reveals structural basis for PAX developmental mutations. // Cell. 1995. v.80. pp. 639 - 650.