«Сравнительное фармакогностическое исследование представителей рода Тополь (Populus L.)» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Куприянова Елена Александровна

• Куприянова Елена Александровна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Куприянова Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ПРЕДСТАВИТЕЛИ РОДА РОРЦЫГБ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ИСТОЧНИКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Общая характеристика рода Тополь Рори\т Ь

1.1.1. Таксономическая характеристика

1.1.2. Ареалы обитания и возделывания

1.1.3. Характеристика некоторых видов тополя, произрастающих в Самарской области

1.1.4. Химический состав фармакопейных и перспективных видов рода Тополь

1.2. Применение видов тополя

1.2.1. Общехозяйственное применение видов рода Рори\т

1.2.2. Медицинское применение видов рода Рори\т

1.3. Актуальные аспекты стандартизации сырья и препаратов видов рода Рори\т

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методики морфолого-анатомического анализа

2.2.2. Химические методы анализа

2.2.3. Хроматографические методы анализа

2.2.4. Физико-химические методы анализа

2.2.5. Технологические методы

2.2.6. Фармакологические методы анализа

2.2.7. Микробиологические методы анализа

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРЬЯ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА ТОПОЛЬ

3.1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование листьев тополя черного, тополя дрожащего, тополя итальянского, тополя краснонервного

3.1.1. Морфолого-анатомические особенности листьев некоторых видов рода Тополь

3.1.2. Особенности люминесценции тканей листьев некоторых видов рода Тополь

3.2. Петиолярная анатомия черешков листьев некоторых видов рода Тополь

3.3. Морфолого-анатомические особенности почек некоторых видов тополя

3.3.1. Особенности люминесценции тканей почек тополя черного (Populus nigra L.)

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРЬЯ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА ТОПОЛЬ

4.1. Сравнительное фитохимическое исследование листьев представителей рода Тополь

4.1.1. Тонкослойная хроматография

4.1.2. УФ-спектроскопия

4.2. Выделение индивидуальных веществ из листьев тополя черного

4.2.1. Исследование фракций, содержащих индивидуальные вещества, выделенные из листьев тополя черного

4.2.2. Идентификация выделенных веществ и их характеристики

4.2.3. Изучение химической структуры выделенных веществ

4.3. Исследование листьев тополя черного методом ВЭЖХ

4.4. Сравнительное фитохимическое исследование почек некоторых видов тополя

4.5. Сравнительное фитохимическое исследование побегов и коры тополя черного и тополя белого

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛИСТЬЕВ ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО

5.1. Разработка методик качественного анализа методом ТСХ и УФ-спектроскопии

5.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного

5.3. Разработка методики количественного определения рутина в листьях тополя черного методом ВЭЖХ

5.4. Определение динамики накопления суммы флавоноидов в листьях тополя черного

5.5. Научное обоснование числовых показателей качества нового вида лекарственного растительного сырья «Тополя черного листья»

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 6. ОБОСНОВАНИЕ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ И МЕТОДИК СТАНДАРТИЗАЦИИ ЭКСТРАКЦИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЛИСТЬЕВ, ПОЧЕК И ПОБЕГОВ ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО

6.1. Описание состава и способа получения настойки на основе листьев тополя черного

6.2. Стандартизация настойки на основе листьев тополя черного

6.2.1. Качественный анализ лекарственного растительного препарата «Тополя черного листьев настойка»

6.2.2. Количественное определение суммы флавоноидов в лекарственном растительном препарате «Тополя черного листьев настойка»

6.3. Изучение антимикробоной активности экстракционных препаратов на основе сырья тополя черного в отношении штаммов, полученных от пациентов с муковисцидозом

6.3.1. Образцы настоек на основе почек тополя черного

6.3.2. Образцы настоек на основе побегов тополя черного

6.3.3. Спиртовой раствор СО пиностробина

6.3.4. Образцы настоек на основе листьев тополя черного

6.3.5. Настой на основе листьев тополя черного

6.4. Фармакологическое исследование лекарственного растительного препарата «Тополя черного листьев настойка»

6.4.1. Изучение диуретического действия настойки листьев тополя черного

6.4.2. Изучение острой токсичности настоек на основе листьев тополя черного

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

166

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Акты о внедрении результатов диссертационного исследования

Приложение 2. Патент на изобретение «Способ получения настойки из листьев тополя черного, обладающей активностью в отношении штаммов БигккоМепа»

Приложение 3. Патент на изобретение «Способ количественного пределения суммы флавоноидов в листьях тополя черного»

Приложение 3. Проект фармакопейной статьи на новый вид ЛРС «Тополя черного листья»

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Сравнительное фармакогностическое исследование представителей рода Тополь (Populus L.)»»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время все большее значение приобретают лекарственные средства (ЛС) растительного происхождения. Лекарственные растительные препараты (ЛРП) сочетают в себе широту терапевтического действия и относительную безвредность, обладают минимальным риском развития резистентности у микроорганизмов, в силу чего рекомендуются для лечения многих хронических инфекционно-воспалительных заболеваний. В этой связи, представляются актуальными исследования в области разработки и внедрения новых лекарственных средств на базе фармакопейных растений, широко применяемых как у нас в стране, так и за рубежом (Куркин В.А., Самылина И.А. и др., 2016). Данные лекарственные препараты обладают рядом преимуществ перед синтетическими: меньшая токсичность, широкий спектр фармакологического действия, достаточно высокая эффективность (Киселева Т.Л. и др., 2009; Куркин В.А., Самылина И.А. и др., 2004; 2008; 2016; Бубенчикова В.Н. и др., 2013; Кудашкина Н.В. и др., 2015; 2016).

Однако удельный вес отечественных ЛРП недостаточен для успешного решения лекарственного обеспечения населения РФ. В рамках реализации программы «Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 года» разработка российских ЛРП является одним из приоритетных направлений. Кроме того, согласно «Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2030 года» («Фарма-2030») - важнейшим направлением является замещения импортных лекарственных средств отечественными аналогами, а также увеличение экспорта фармацевтической продукции на внешние рынки, поиск новых источников действующих веществ и создание собственных инновационных лекарственных средств.

Перспективными в этом отношении являются растения рода Тополь (Рори1ш Ь.), препараты которого обладают выраженной противомикробной активностью (Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г., Правдивцева

О.Е. и др., 1991, 1998, 2001, 2009; Wollenweber E., Egger K., 1987). В средней полосе России произрастает около 20 видов тополя, однако из них фармакопейными являются лишь тополь черный (Populus nigra L.), тополь канадский (Populus deltoides Marsh.), тополь душистый (Populus suaveolens Fisch.), тополь лавролистный (Populus laurifolia Ledеb.) и тополь бальзамический (Populus balsamifera L.), причем в качестве сырья зарегистрированы только почки вышеперечисленных видов (ФС.2.5.0042.15). На наш взгляд, перспективным источником также могут являться и другие морфологические органы растений, в частности, листья, побеги и кора тополя черного и других видов данного рода. В связи с этим актуальным является комплексное фармакогностическое исследование анатомо-морфологических особенностей, разработка методов качественного и количественного анализа сырья видов рода Тополь, отвечающих современным требованиям. Кроме того, отмечается недостаточная степень изученности химического состава листьев видов тополя. Дальнейшее изучение химического состава листьев видов тополя является целесообразным в плане решения проблемы рационального комплексного использования растения, так как листья тополя составляют значительную часть фитомассы растения, причем данный вид сырья более прост в заготовке.

Следовательно, учитывая активное применение в народной медицине листьев видов рода Тополь, а также недостаточную степень изученности анатомо-морфологических признаков, химического состава и фармакологических свойств, актуальным является проведение сравнительного фармакогностического исследования представителей рода Populus по обоснованию использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья - «Тополя черного листья».

Степень разработанности темы.

В настоящее время в Государственную Фармакопею Российской Федерации XIV издания входит фармакопейная статья «Тополя почки» (ФС.2.5.0042.15).

Статья на листья тополя в действующей фармакопее Российской Федерации не представлена. Группой авторов (Лобанова И.Ю., Турецкова В.Ф. и др., 2010) предложена методика качественного анализа листьев тополя дрожащего (или осины обыкновенной) методом тонкослойной хроматографии в системе растворителей н-бутанол:уксусная кислота: вода (4:1:5), где по характеру окраски, свечения и сравнения Я^-со стандартными образцами обнаружены гиперозид и рутин. Методом ТСХ в системе растворителей этилацетат: и-ксилол:муравьиная кислота:вода (35:1:2:2) установлено наличие в листьях осины фенологликозидов, среди которых идентифицированы по величине и сравнением со стандартными образцами - салицин и тремулацин. Полученные данные были подтверждены при исследовании качественного состава фенольных соединений листьев тополя дрожащего с использованием ВЭЖХ. Предложены методики количественного определения методом дифференциальной

спектрофотометрии суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид при аналитической длине волны 412 нм.

Также предложена методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях и почках тополя черного методом прямой спектрофотометрии (Ионова В.А. и др., 2013). Данная методика включает в себя предварительную обработку хлороформом с целью освобождения экстракта от хлорофилла, экстрагирование сырья 60% этиловым спиртом, измерение оптической плотности при аналитической длине волны 330 нм и расчет содержания суммы флавоноидов в пересчете на сухое вещество (для листьев 0,026 %, для почек 0,053%). На наш взгляд, данная методика имеет ряд недостатков, наиболее значимые из них: низкая специфичность, отсутствие пересчета на конкретный флавоноид.

Таким образом, исследования в области стандартизации лекарственного растительного сырья видов рода Тополь является актуальным.

Цель работы и основные задачи исследования.

Целью диссертационного исследования является сравнительное фармакогностическое исследование некоторых представителей рода Рори\т в плане обоснования использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья «Тополя черного листья».

Задачами исследования являлись:

1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование листьев некоторых представителей рода Рори1т\ тополя черного, тополя дрожащего, тополя итальянского, тополя краснонервного, а также почек - тополя черного, тополя дельтовидного, тополя дрожащего, тополя краснонервного.

2. Сравнительное фитохимическое исследование листьев, почек, побегов и коры некоторых видов рода Тополь.

3. Изучение химического состава листьев тополя черного с

1 1 ^

использованием Н-ЯМР-, С-ЯМР-, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии.

4. Разработка методик качественного анализа листьев тополя черного методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и УФ-спектроскопии.

5. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного с использованием дифференциальной спектрофотометрии.

6. Разработка методики количественного определения рутина в листьях тополя черного с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

7. Разработка показателей качества лекарственного растительного сырья (ЛРС) «Тополя черного листья».

8. Обоснование способа получения настойки на основе листьев тополя черного и разработка методик качественного анализа и

количественного определения суммы флавоноидов в ЛРП «Тополя черного листьев настойка».

9. Сравнительное изучение противомикробной активности настоек на основе листьев, почек и побегов тополя черного.

10. Разработка проекта фармакопейной статьи (ФС) на новый вид ЛРС - «Тополя черного листья».

Научная новизна

Сравнительное анатомо-гистологическое исследование листовых пластинок некоторых видов тополя позволило впервые выявить таксономически и диагностически значимые признаки, позволяющие отличать целевое сырье - тополя черного от листьев других видов рода Тополь, заключающиеся в очертании и характере армирования центральной жилки, а также в размерах устьичных аппаратов. В результате проведения сравнительного анализа петиолярных признаков черешков некоторых видов тополя были выявлены диагностически значимые признаки целевого сырья (тополя черного), заключающиеся в особенностях очертаний базальной, медиальной и апикальной частей черешка, армировании черешка уголковой колленхимой, особенностях эпидермы, отсутствии опушения, а также армирования склеренхимой проводящих пучков во всех частях черешка, особенности разделения на центральную и боковые жилки в базальной части черешка.

Кроме того, выявлены основные диагностически значимые признаки, характерные для почек представителей рода Тополь (размер, особенности окраски почечных чешуй, смолистость, опушение внутренних структур) и дополнительные признаки, позволяющие отличать почки рода Рори\т от почек других растений (особенность соцветия, почкосложение, листосложение). С помощью люминесцентного анализа выявлены места локализации фенольных соединений, входящих в состав почек тополя черного: флаванонов - пиностробина (в основном в смолистом выделении и

кутикуле кроющих чешуй) и флавонолов: кепферола, кверцетина, рутина (локализованы в клетках мезофилла кроющих чешуй).

В ходе изучения химического состава впервые выделены и идентифицированы для листьев тополя черного с использованием 1Н-ЯМР-,

13

С-ЯМР-, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также результатов кислотного гидролиза: рутин (3-О-рутинозид кверцетина), календофлавобиозид (3-О-гесперидозид кверцетина), феруловая кислота.

Обоснованы методики анализа листьев и препаратов тополя черного, основанные на определении доминирующего и диагностически значимого вещества - рутина методами ТСХ, УФ-спектроскопии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Обоснован способ получения лекарственного препарата на основе листьев тополя черного - «Тополя черного листьев настойка», а также разработаны методики качественного и количественного анализа данного препарата.

Научная новизна данного диссертационного исследования подтверждена патентом Российской Федерации № 2695661 «Способ получения настойки из листьев тополя черного, обладающей активностью в отношении штаммов Burkholderia» (заявка № 2019112565, от 24.04.2019 г., решение о выдаче патента 28.06.2019 г.) и патентом Российской Федерации № 2701726 «Способ количественного определения суммы фдавоноидов в листьях тополя черного» (заявка № 2018142704, от 03.12.2018г., решение о выдаче патента 01.10.2019 г.).

Теоретическая и практическая значимость

Разработаны методики качественного и количественного анализа флавоноидов в листьях тополя черного методами тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии. Предложенный качественный анализ методом ТСХ предполагает использование в качестве СО рутина, что позволяет определить подлинность листьев по наличию доминирующего флавоноида данного сырья - рутина. Количественную оценку содержания

суммы флавоноидов обосновано осуществлять с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на рутин. Разработана методика количественного анализа листьев тополя черного методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, заключающаяся в определении доминируюшего и диагностически значимого флавоноида -рутина.

Разработаны показатели качества листьев тополя черного, включая числовые (содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 2,0%). Разработан проект фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья - «Тополя черного листья».

Обосновано применение нового вида лекарственного растительного сырья «Тополя черного листья» в медицинской практике.

Разработан способ получения лекарственного препарата «Тополя черного листьев настойка». Рекомендуется к использованию в медицинской практике настойка листьев тополя черного на 70% этиловом спирте. Определены показатели качества данного ЛРП, в том числе содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Выявлено наличие антибактериальной активности в отношении штаммов, выделенных от пациентов с муковисцидозом, для экстракционных препаратов на основе почек, листьев и побегов тополя черного. Определено, что настойку на основе листьев тополя черного можно отнести к III классу токсичности (ГОСТ 12.1.007-76).

Результаты, полученные в ходе проведения диссертационного исследования, применяются в научном и учебном процессе в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России: на кафедре фармацевтической технологии, кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, кафедре управления и экономики фармации, кафедре химии фармацевтического факультета, в производственном процессе на ЗАО «Самаралектравы» и ООО «Самарская фармацевтическая фабрика», в рабочем процессе в ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области».

Методология и методы исследования

Методология диссертационной работы базируется на углубленном изучении и системном обобщении литературных источников в области фармакогностического исследования видов рода Тополь, оценки актуальности работы и степени разработки темы исследования. С учетом поставленной цели и задач был разработан план выполнения диссертационного исследования, были определены объекты и методы.

Объектами диссертационной работы являлись различные виды сырья растений рода Тополь, собранные на территории Самарской области, а также водно-спиртовые извлечения, полученные на основе сырья некоторых видов тополя. Данное исследование проводили с использованием цифровой и люминесцентной микроскопии, тонкослойной хроматографии (ТСХ), УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, колоночной хроматографии, ВЭЖХ, пробирочных реакций, микробиологических методов. Математическую обработку осуществляли с применением программного обеспечения в соответствии с ГФ РФ XIV издания.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнялась согласно тематическому плану научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (№ Гос. регистрации 115042810034 до 14.05.2019, наименование НИОКР -«Комплексные исследования по разработке лекарственных средств природного и синтетического происхождения»; с 14.05.2019 № Гос. регистрации АААА-А19-119051490148-7, наименование НИОКР - «Химико-фармацевтические, биотехнологические, фармакологические и организационно-экономические исследования по разработке, анализу и применению фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов»).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты сравнительного морфолого-анатомического исследования особенностей листовой пластинки, петиолярных признаков и почек некоторых видов рода Тополь.

2. Результаты исследования химического состава листьев тополя черного, включая выделение индивидуальных веществ и их структурный анализ.

3. Результаты исследований по разработке методик качественного анализа листьев тополя черного методом ТСХ и УФ-спектроскопии.

4. Результаты исследований по разработке методик количественного определения суммы флавоноидов (метод дифференциальной спектрофотометрии) и рутина методом ВЭЖХ в листьях тополя черного.

5. Результаты исследования по разработке способа получения ЛРП «Тополя черного листьев настойка».

6. Результаты исследования по разработке методик качественного и количественного анализа ЛРП «Тополя черного листьев настойка».

7. Результаты сравнительного исследования антимикробной активности настоек на основе почек, листьев и побегов тополя черного.

8. Результаты исследования по разработке проекта ФС «Тополя черного листья».

Степень достоверности. Достоверность диссертационной работы подтверждена экспериментальными данными, полученными с использованием цифровой и люминесцентной микроскопии, колоночной хроматографии, тонкослойной хроматографии, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, ВЭЖХ, химических,

микробиологических методов анализа.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на областных, всероссийских и международных конференциях: на конференциях «Аспирантские чтения» (г. Самара, 2017; 2018; 2019 гг.); на II, III и IV Межвузовских научно-практических конференциях «Фармацевтическая ботаника: современность и перспективы» (г. Самара, 2017, 2018, 2019 гг.); на международной научной конференции "Перспективы лекарственного растениеведения" (г. Москва «ВИЛАР», 2018 г.); на II

Научно-практической конференции студентов и молодых ученых научно-образовательного медицинского кластера «Нижневолжский» "Физика и медицина: создавая будущее" (г. Самара, 2018 г.); на II и IV Межвузовских студенческих научно-практических конференциях «Современные проблемы фармакогнозии» (г. Самара, 2017; 2019 гг.), на Международной конференции, посвященной 60-летию фармацевтического факультета учреждения образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (г. Витебск, 2019 г.).

Публикации. По теме исследования опубликованы 24 печатные работы, из них 6 статей в журналах, рецензируемых ВАК при Министерстве науки и высшего образования Российской Федерации; получены 2 патента РФ на изобретение.

Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе проведения диссертационного исследования, применяются в научном и учебном процессе в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России: на кафедре фармацевтической технологии, кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, кафедре управления и экономики фармации, кафедре химии фармацевтического факультета, в производственном процессе на ЗАО «Самаралектравы», ООО «Самарская фармацевтическая фабрика», в рабочем процессе в ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области».

Личный вклад автора. Все описанные в диссертационной работе результаты исследований получены автором. Автором исследована петиолярная анатомия и гистология листовой пластинки листьев некоторых видов тополей, выявлены характерные диагностические признаки листьев данных растений.

Проведена сравнительная оценка фитохимического состава листьев фармакопейных видов рода Тополь, из листьев тополя черного выделены и идентифицированы 3 индивидуальных соединения (рутин,

календофлавобиозид, феруловая кислота), разработаны и обоснованы методики качественного анализа листьев тополя черного, а также методики количественного определения суммы флавоноидов (метод дифференциальной спектрофотометрии) и рутина методом ВЭЖХ в данном лекарственном растительном сырье. Для целей качественного и количественного определения флавоноидов в листьях тополя черного рекомендованы методы тонкослойной хроматографии, УФ-спектроскопии и ВЭЖХ-анализ. Изучена антимикробная активность настойки и настоя на основе листьев, настоек из почек и побегов тополя черного в отношении клинических штаммов, выделенных от пациентов с муковисцидозом, и острая токсичность настойки на основе листьев тополя черного. Разработан проект фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья - «Тополя черного листья».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Основные положения, описанные в диссертационном исследовании, соответствуют паспорту научной специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки) по пунктам: 2 - «Формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств»; 3 - «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления»; 5 - «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье»; 6 - «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе».

Объем и структура работы. Диссертационная работа описана на 209 страницах машинописного текста, данные изложены в форме 25 таблиц и представлены на 63 рисунках. Данная работа включает в себя введение, литературный обзор, объекты и методы исследования, 4 главы, представляющих результаты исследований, выводы и заключение, список литературы, который состоит из 165 источников, 23 из которых - на иностранном языке, а также приложения.

Во введении описаны актуальность, цели и задачи исследования, научная новизна, степень разработанности темы и практическая значимость, основные положения, выносимые на защиту, сведения о публикациях и апробации работы.

Глава 1 представляет собой обзор литературных источников отечественных и иностранных авторов в области фармакогностических исследований некоторых видов рода Тополь (Populus Ь.). В главе подробно описаны данные, касающиеся ареала видов рода Тополь, химического состава, методик качественного и количественного анализа сырья некоторых видов рода Тополь (Populus Ь.). Кроме того, в данной главе представлена информация о применении представителей рода Тополь в официальной и народной медицине России и других стран.

Глава 2 содержит описание объектов и методов исследования.

Глава 3 посвящена результатам сравнительного морфолого-анатомического исследования сырья некоторых видов рода Тополь, в том числе с использованием люминесцентной микроскопии и петиолярной анатомии.

В главе 4 описаны результаты сравнительного фитохимического исследования листьев фармакопейных видов тополей, приведены результаты выделения индивидуальных соединений из листьев тополя черного, данные по изучению их химического строения. Представлены результаты сравнительного фитохимического исследования состава почек, побегов и коры некоторых видов тополя с целью возможности комплексного

использования растений в медицинской практике и расширения сырьевой базы за счет нефармакопейных видов рода Тополь.

Глава 5 посвящена разработанным методикам качественного и количественного анализа листьев тополя черного, а также изучению показателей качества данного сырья.

Глава 6 включает результаты исследования антибактериальной активности настойки и настоя на основе листьев, настоек из почек и побегов тополя черного в отношении клинических штаммов, выделенных от пациентов с муковисцидозом, а также острой токсичности настойки на основе сырья тополя черного.

Диссертация завершается заключением, выводами, практическими рекомендациями, списком литературы и приложениями.

В приложениях к работе представлены акты внедрения, патент РФ № 2695661 «Способ получения настойки из листьев тополя черного, обладающей активностью в отношении штаммов БигкЬоМвпа» и патент РФ № 2701726 «Способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного», проект фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья «Тополя черного листья».

ГЛАВА 1. ПРЕДСТАВИТЕЛИ РОДА POPULUS КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ИСТОЧНИКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Известно, что в средней полосе России произрастает около 20 видов рода Тополь (Populus L.) [40, 174]. Современная Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания включает статью «Тополя почки» (ФС.2.5.0042.15), причем фармакопейными видами являются тополь черный Populus nigra L., тополь бальзамический Populus balsamifera L., тополь канадский Populus deltoides Marsh., тополь душистый Populus suaveolens Fisch. и тополь лавролистный Populus laurifolia Ledеb. В настоящее время из почек тополя получают настойки и мази, которые применяют как противогрибковые, противовоспалительные, антисептические, антиоксидантные и ранозаживляющие средства при инфекционных и гнойно-воспалительных поражениях кожи и мягких тканей [7, 11, 20, 40, 44, 53, 54, 62, 64, 78, 92, 100, 101, 102, 103, 109]. За рубежом почки и кора тополя используются как лекарственные средства, обладающие противоревматическим, ранозаживляющим, антиоксидантным,

антибактериальным и противовоспалительным действием [143, 145, 148, 155, 156, 157, 158, 161, 162].

Ввиду большого видового разнообразия представителей рода Тополь научный интерес представляют не только фармакопейные виды, но и широко произрастающие в Российской Федерации и применяемые в народной медицине. Перспективным источником биологически активных соединений (БАС) наряду с почками могут быть и другие виды сырья растений, используемые в народной медицине: листья, побеги и коры. На наш взгляд, перспективными видами для дальнейшего изучения являются не только фармакопейные, но и тополь белый, тополь дрожащий, тополь итальянский, тополь краснонервный, распространенные в России, в том числе в Самарской области.

1.1. Общая характеристика рода Тополь Роры1т Ь.

Виды тополя - быстро растущие, листопадные, ветроопыляемые деревья, высотой 40-45 м (иногда до 60 м) и диаметром ствола более 1 метра [6, 64, 87, 117, 118, 132]. Кора ствола трещиноватая, буровато-серая или тёмно-серая, у ветвей - гладкая, серая или оливково-серая. Корневая система у тополей сильная, но большей частью поверхностная. Крона шатровидная, яйцевидная, яйцевидно-пирамидальная или пирамидальная; ветви с конечными и боковыми почками, защищены многочисленными чашечками и часто выделяют обильную смолу. Листья черешковые, очерёдные, голые или опушенные, от ланцетных до широкояйцевидных, форма листа зависит от побега, на котором находится, и от положения на этом побеге. Растение двудомное, иногда однодомное, цветёт до появления листьев или одновременно с ними; способность плодоносить наступает в 10-12 лет [6, 64, 87, 117, 118, 132].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Куприянова Елена Александровна, 2020 год

источник

Литературный

источник

O.

ч

9H2OH o,

/ —■— ' oh oh

Популин

P. alba L. (кора, почки)

P. nigra L. (кора, почки, листья) Р. trémula L. (кора, почки, листья)

112

2

9H2OH 0

'O^

HO

Салицин

P. alba L.(Kopa, почки) Р. laurifolia Ledeb. (кора) P. nigra L. (кора, почки, листья) Р. tremula L. (кора, почки, листья) P. deltoides Marsh. (листья)

86, 112, 121

„OH

oh

O O oh

oh

Саликортин

P. alba L.(кора) P. nigra L. (кора, листья) Р. tremula L. (кора, листья) P. deltoides Marsh. (листья)

86, 112

4

о. ^ -OH

P. alba L. (кора) Р. tremula L. (кора)

112

Салирепозид

1

3

5 oh CH2OH 0 J ^j^-o^^^/ oh \J O oh CO ó Тремулоидин P. nigra L. (листья) P. alba L. (кора) Р. trémula L. (кора, листья) 112, 121

6 oh 0 0 ho——^ \ Xoh Тремулацин P. nigra L. (листья) P. alba L.(кора) Р. trémula L. (кора, листья) 112, 121

7 oh / o Салицилтремулоидин Р. trémula L. (листья) 112

8 oh и oh Грандидентатин P. alba L. (кора) Р. tremula L. (кора) 112

9 Ниграцин P. nigra L. (кора, листья) 112

В почках тополя содержится также эфирное масло, компоненты которого в основном представлены терпеноидами. Наиболее изучен компонентный состав эфирных масел почек т. бальзамического, т. черного и т. белого (табл. 3).

Таблица 3 - Компоненты эфирного масла почек представителей рода Тополь

№ Биологически активные соединения Растительный источник Литературный источник

1 Линалоол P. balsamifera L., P. alba L., P. nigra L. 47, 146, 150

2 Борнеол P. balsamifera L. 47

3 Камфен P. balsamifera L. 47

4 Цис-лимонен-1,2-эпоксид P. balsamifera L. 47

5 Гумулен P. balsamifera L. 47

6 ßj-Куркумен P. balsamifera L., P. nigra L. 47, 159

7 ar-Куркумен P. balsamifera L., P. nigra L. 47, 159

8 а,у-Муролен P. balsamifera L., P. alba L. 47, 146

9 аДу-Эвдесмол P. balsamifera L., P. nigra L. 47, 150, 159

10 а-Бизаболол P. balsamifera L. 47

11 Кариофиллен P. balsamifera L. 47

ß-Кариофиллен P. alba L. 146

12 а-Пинен P. nigra L. 150

13 аДу -Эвдесмол P. nigra L., P. alba L. 146,150

14 10-Эпи-у-эвдесмол P. nigra L. 159

15 Булнесол P. balsamifera L., P. nigra L. 143,159

16 Бисаболен P. nigra L. 159

17 а-Копаен-11-ол P. nigra L., P. alba L. 146,159

18 Эремолигенол P. nigra L. 159

19 транс-а-Бергамотен P. nigra L. 159

20 у-Кадинен P. nigra L., P. alba L. 146,159

21 1,8-цинеол P. balsamifera L., P. alba L., P. nigra L. 143, 146,150

22 ß-Циклоцитраль P. alba L., P. nigra L. 146,150

23 у-Кадинол P. alba L. 146

24 Эвгенол P. balsamifera L., P. nigra L. 143,150

25 Гуаиол P. balsamifera L., P. nigra L. 143

Кроме того, в листьях тополей также содержатся углеводы, каротиноиды (виолаксантин, лютеин, неоксантин и др.), витамины (каротин, Е, С), азотсодержащие соединения (зеатин и его производные), большое количество органических кислот, таких как: муравьиная, яблочная, щавелевая, малоновая, фумаровая, янтарная, глицериновая, винная, а-кетоглутаровая, хинная, лимонная, лигнаны, дубильные вещества [112].

В коре тополей обнаружены высшие жирные кислоты (изопальмитиновая, каприновая, миристиновая, изомиристиновая,

лауриновая, пальмитиновая, арахиновая, лигноцериновая, пальмитолеиновая, олеиновая, стеариновая, линолевая, бегеновая, линоленовая), углеводы, алкалоиды, лигнаны, дубильные вещества [112].

Таким образом, химический состав почек представителей рода Тополь достаточно глубоко изучен на сегодняшний день, в то время как степень изученности химического состава других перспективных органов данных растений - листьев является недостаточным, чтобы сырье можно было внедрить в качестве нового вида лекарственного растительного сырья. Поэтому необходимо дальнейшее изучение и выделение действующих веществ из листьев представителей рода Тополь.

1.2. Применение видов тополя

1.2.1. Общехозяйственное применение видов рода Populus

Тополь черный широко разводят в населенных пунктах [132]. Его высаживают у домов и других построек, вдоль улиц и дорог, по берегам прудов и других водоемов, в скверах и на бульварах. Для разных видов и гибридов тополей отмечается длительный рост в течение вегетационного периода, более интенсивный фотосинтез, высокая активность образовательных тканей по сравнению с другими видами деревьев. В городских насаждениях сейчас все шире используют гибриды канадских тополей [120, 137]. Так, например, для озеленения населенных пунктов предлагается тополь краснонервный (все растения являются мужскими, не образуют пушистых семян, вид устойчив к болезням, зимостоек и газоустойчив, также отличается наибольшей энергией роста от остальных видов рода Тополь) [132, 136]. Тополь способствует очищению воздуха, которым мы дышим. К тому же летучие выделения молодых листьев тополя губительны для многих вредных для человека микробов. Эфирное масло из тополевых почек используют парфюмеры. Им, например, отдушивают некоторые сорта мыла. Пчелы собирают с почек и молодых листьев тополя клейкие смолистые выделения и превращают их в прополис, который находит все более широкое применение в качестве лекарственного средства

[132]. Древесина тополя имеет многогранное и разностороннее использование:

• в целлюлозно-бумажной промышленности. В настоящее время древесина тополя широко применяется для производства целлюлозы, полуцеллюлозы и древесной массы, они идут на изготовление бумаги и картона, а также текстильного шелка, штапеля, целлофана, кордных волокон и т. д. [132];

• при изготовлении мебели. Благодаря таким качествам древесины тополя, как легкость в обработке, мягкость, способность легко гнуться при распаривании с сохранением приданной формы при высыхании, а также сравнительно невысокая ее стоимость позволили широко ее применять для создания стульев, предметов домашнего обихода, различного вида мебели [132];

• при создании водорегулирующих, почвозащитных и полезащитных насаждений. Тополя усиленной транспирацией влаги (транспирация - испарение растением излишков влаги через устьица листьев; благодаря транспирации возникает ток воды и растворенных в ней минеральных веществ от корней к листьям) через крону осушают заболоченные места, предохраняют орошаемые поля от заболачивания, укрепляют берега рек [132];

• как сырьевая топливная база для котлов и газогенераторных установок. Тополевая древесная биомасса имеет высокие экологические показатели технологий сжигания древесины. Ее широкое использование вместо ископаемых топлив могло бы существенно повлиять на снижение парникового эффекта на планете [132].

1.2.2. Медицинское применение видов рода Populus

В настоящий момент в качестве лекарственного растительного препарата на территории РФ зарегистрированы "Тополя почки" (ФС.2.5.0042.15) [24].

На базе кафедры фармакогнозии с основами ботаники и фитотерапии Самарского государственного медицинского университета группой авторов (Куркин В. А., Браславский В. Б., Правдивцева О.Е. и др.), в рамках целого ряда диссертационных исследований, почки тополя черного были рекомендованы для использования в медицинской практике при терапии инфекционных заболеваний [100]. Группой авторов (Куркин В.А., Браславский В.Б., Правдивцева О.Е. и др.) на основе почек тополя черного разработана настойка на 80% этиловом спирте [100, 130].

В Пятигорской государственной фармацевтической академии группой авторов (Никитина Н.В., Степанюк С.Н., Клишина И.И. и др.) также ведется активная работа с экстрактами почек тополя черного [53, 89, 92, 93]. Разработана дерматологическая мазь на основе экстракта данного растения, подобраны оптимальные условия приготовления и изучены технологические свойства мази, разработаны способы стандартизации дерматологической мази на основе двухфазного экстракта почек тополя черного и изучена антибактериальная и противовоспалительная активность полученной лекарственной формы [53, 89, 92, 93].

В России запатентован многокомпонентный фитопрепарат с антимикробным ранозаживляющим действием для лечения животных, одним их компонентов которого является 10%-ая настойка почек тополя черного [102]. Также известно, что в Республике Беларусь применяется мазь на основе экстракта почек тополя черного в ветеринарной медицине как лекарственное средство, обладающее противовоспалительным и регенерирующим действием [53]. На Украине зарегистрирован препарат на основе экстракта коры осины «Феносин». Данный препарат активно изучается, доказана его противовоспалительная, жаропонижающая активность, по которой он не уступает аспирину. Обнаружено противоязвенное действие феносина, при этом препарат не обладает побочным ульцерогенным действием на слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в отличие от аспирина [29, 30].

Учеными Алтайского государственного медицинского университета (Лобанова И.Ю., Турецкова В.Ф., Рассыпова С.С. и др.) активно изучается сырье тополя дрожащего - кора и листья [78, 111, 127]. Из листьев осины обыкновенной получен сухой экстракт и капсулы «Элоскап», БАВ которого обладают противовоспалительным, выраженным антиоксидантным действием [15, 16, 39, 69, 78, 79, 111, 127]. Разработана полностью технология получения и проведена стандартизация данных лекарственных форм, по результатам испытаний острой токсичности сухой экстракт листьев осины отнесен к IV классу опасности (малоопасные вещества) [78, 111, 127]. Также доказано, что экстракт коры осины обладает ярко выраженным гастрозащитным (противоязвенным), актопротекторным (влияет на выносливость и физическую работоспособность), анальгезирующим, спазмолитическим, антимикробным, умеренным гиполипидемическим, противоопухолевым и противоописторхозным действием [15, 16, 39, 69, 79, 111, 127]. На основе экстракта коры осины были получены лекарственные препараты (Крылова С.Г., Турецкова В.Ф. и др.): таблетки «Экорсин» и капсулы «Экорсин форте», обладающие противовоспалительной и противоязвенной активностью, причем данный эффект оказался выше у капсулированной формы [39, 58]. Также из коры осины было выделено вещество - тремулоидин, которое в ряде опытов показало, что обладает выраженными диуретическими свойствами и предупреждает развитие гентамициновой нефропатии [34, 55, 56].

Необходимо отметить тот факт что, почки тополя черного в качестве биологической активной добавки представлены в аптеках в фасовке для приготовления настоя [130]. Однако, по мнению проф. Куркина В.А., настой как лекарственная форма для почек тополя нецелесообразен, в виду высокой липофильности действующих компонентов (флавоноиды агликоновой природы и эфирные масла) [96, 130].

Известно также что, за рубежом почки и листья тополя черного занесены во Французскую и Британскую Травяную Фармакопеи [52].

В настоящее время продолжается исследование фармакологической активности почек представителей рода Populus в различных областях медицины. Так, в Польше проведено исследование по оказанию противовоспалительного и антиоксидантного действия почек тополя черного в стоматологии, а точнее флавоноидов: пиноцембрина и пирностробина, на клетки фибробластов десны человека [158]. Также изучалось антиоксидантное влияние фенольных соединений почек тополя черного на старение кожи [157]. Проводились исследования противовоспалительной и антиоксидантной активности спиртовых экстрактов из почек тополя канадского [162]. В Грузии исследовали антиоксидантные свойства фенольных соединений тополя белого [145]. Научный интерес вызывают отдельные компоненты, выделенные из почек тополей: пиноцембрин и пиностробин - проводятся доклинические исследования этих веществ, оценивается их фармакокинетика и фармакодинамика [160]. Также проведены исследования по выявлению у пиностробина анксиолитических и антидепрессивных свойств под влиянием иммунодепрессанта и доказана его способность устранять явления повышенной тревожности в экспериментальных условиях [19, 94, 95]. Проводятся работы по выявлению противогрибковой и антибактериальной активности извлечений из почек тополей в отношении разных микроорганизмов, в том числе и золотистого стафилококка [2, 5, 7, 44, 51, 103, 135, 143]. В Казахстане активно изучаются почки тополя бальзамического и получен ряд эффективных препаратов: субстанция «Тополин» (промежуточный продукт, выход около 35%) [105, 106, 107]. На основе промежуточного продутка - субстанции «Тополин» были получены: мазь (используется при микозах и стрептодермии), настойка (применяется при стоматите и пародонтите), жевательная резинка (при лечении воспаления полости рта), лечебные сигареты и эфирное масло (при лечении туберкулеза), фибриновые пленки (используется в качестве нового перевязочного материала в хирургии), суппозитории (при лечении эрозии, протстатита и кольпита) [105, 106, 107]. Также на снове субстанции

разработаны пищевые продукты, которые применимы в онкологии при облучении онкологических больных и в качестве защиты кроветворной системы от ионизирующего облучения [105, 106, 107]. В ходе клинических и доклинических испытаний выявлена низкая токсичность полученного продукта - субстанции «Тополин», а также обнаружены антимикробные, ранозаживляющие, антиоксидантные, иммуномодулирующие,

гепатопротекторные свойства [107]. Таким образом, данная субстанция нашла широкое применение в медицинской практике [107]. В Канаде проводились исследования, в которых была доказана эффективность компонента саликортина, полученного из экстракта тополя бальзамического, как фактора, снижающего ожирение и ослабляющего резистентность к инсулину в экспериментах на мышах [159].

На фармацевтическом рынке РФ существуют различные сыворотки, маски и крема (рис. 2), в составах которых входят спиртовой экстракт почек тополя черного [130].

Рисунок 2 - БАДы на основе почек тополя черного.

По данным народной медицины, тополь черный используется в виде настоя коры при лихорадке, а также в мазях для лечения ожогов, подагры, геморроя. Спиртовой экстракт из почек тополя черного используют внутрь для лечения туберкулеза, ревматизма, подагры, лихорадки, цистита, простудных заболеваний, в качестве противоопухолевого, успокаивающего и

отхаркивающего средства [112]. Отвар из коры тополя черного применяют внутрь как противомалярийное, гемостатическое средство (в индийской медицине) [112]. Из экстракта почек готовят тополиную мазь, используемую в качестве дезинфицирующего, жаропонижающего, отвлекающего средства при ревматизме, ранах, ожогах. Используется как народное средство для укрепления волос. Из почек получают эфирное масло, которое входит в состав туалетного мыла [104, 130]. Также известно об использовании в народной медицине сока свежих листьев тополя черного, обладающего антибактериальным, обезболивающим при зубной боли и успокаивающим действием [112].

Сырье тополя белого также нашло применение в народной медицине: корни обладают фунгицидными свойствами, отвар из коры и почек применяется при перемежающейся лихорадке, подагре, ревматизме, ишиасе, также отвар из почек при лечении ран, ожогов, воспалений кожи и как отхаркивающее средство и в виде мази для лечения геморроя. Известно о применении отвара из коры и побегов тополя белого в качестве антигельминтного средства [112]. Листья тополя итальянского в свежем виде используются в качестве бактерицидного и протистоцидного средства [112]. Настой из листьев и коры тополя лавролистного в монгольской медицине используется для лечения болезней кровеносных сосудов и как противоопухолевое и гемостатическое средство [112].

1.3. Актуальные аспекты стандартизации сырья и препаратов видов рода Populus

Вопрос стандартизации лекарственного растительного сырья является одним из самых важных в фармации. Обзор справочных источников [46, 64] и нормативных документов [21, 24, 100, 101, 131, 132] показал, что опыт применения представителей рода Populus в РФ имеет глубокие исторические корни. Известно, что уже в Российскую ГФ I издания входили т. бальзамический P. balsamifera L., т. монолиферный P. monolifera Ait., т.

черный Populus nigra L., т. пирамидальный P. pyramidalis Borkh., более того в нём имелась общая статья на представителей рода Populus. При этом у разных видов тополя применяли почки свежие и порошок древесного угля [52].

Однако указанные виды тополя были выведены из ГФ и вновь предложены к медицинскому применению группой авторов (Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г., Правдивцева О.Е., Жданов И.П., Косякин В.А., Ткаченко А.А., 1998 г.) [100]. Ими были разработаны временная фармакопейная статья на почки, фармакопейная статья на настойку почек тополя, а также ФС на государственный стандартный образец пиностробина (ФС 42-0073-01) [133, 134]. Вновь введена статья на сырье «Тополя почки» только в 2015 году в Государственную Фармакопею РФ XIII издания [21, 60].

В настоящее время в России действует Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания 2018 года в электронном виде, в которую также включена статья «Тополя почки» (ФС.2.5.0042.15). В данной статье указаны следующие виды: тополь черный Populus nigra L., тополь дельтовидный Populus deltoides Marsh, тополь душистый Populus suaveolens Fisch., тополь бальзамический Populus balsamifera L, тополь лавролистный Populus laurifolia Ledeb. Представлены ключевые разделы анализа, при этом в качественном и количественном анализе применяется государственный стандартный образец ГСО пиностробина [24].

Кроме того, в фармакопейной статье описаны основные микроскопические признаки, характерные для почек тополя (ФС.2.5.0042.15): внутренний эпидермис чешуи состоит из столбчатых клеток, некоторые клетки заполнены желтоватым содержимым. На клетках наружного эпидермиса встречаются простые одноклеточные кутинизированные волоски с гладкой поверхностью. Под наружным и верхним эпидермисом располагается пробка. Основная ткань чешуи представлена рыхлой паренхимой, которая состоит из клеток с коричневым содержимым. Также в основной паренхиме встречаются склереиды и друзы оксалата кальция [24].

Для количественного определения пиностробина в почках тополя была также разработана методика ВЭЖХ группой авторов (Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г., 1993 г.) [61]. Предложено использование метода обращенно-фазовой ВЭЖХ в изократическом режиме на хроматографе «Миллихром-4» с УФ - детектором при Х=290нм [10, 61, 116].

Анализируемый экстракт из почек тополя хроматографировали на колонке КАХ (2х64 мм, стационарная фаза С-18). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил - вода - уксусная кислота (50:50:1). В методике использовалось ГСО пиностробина. Наибольшее содержание пиностробина было обнаружено во всех образцах почек тополя бальзамического (свыше 5,0 %) [10, 61, 114, 116].

С помощью разработанной методики ВЭЖХ проведен сравнительный анализ некоторых представителей рода Тополь, произрастающих в Европейской части России и некоторых видов, культивируемых в Сибири. Во всех исследуемых образцах было отмечено высокое содержание действующих веществ (свыше 15%), однако содержание пиностробина выше в образцах Европейского региона, а в сибирских образцах доминирует его халконовый аналог [10, 12, 61, 109].

Группой авторов (Турецкова В.Ф., Лобанова И.Ю., Масленникова К.А. и др.) была проведена работа по изучению и стандартизации сырья тополя дрожащего или осины обыкновенной методами ТСХ, ВЭЖХ и спектрофотометрии [78, 86, 127]. Методом тонкослойной хроматографии в листьях тополя дрожащего в системе растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5) было обнаружено четыря пятна, которые в ультрафиолетовом свете имеют коричневую окраску, а после обработки спиртовым раствором А1С13 светятся желтовато-зеленым цветом. По характеру свечения и величине два пятна соответствуют показателям СО гиперозида и рутина. Методом тонкослойной хроматографии в листьях осины в системе этилацетат : и-ксилол : муравьиная кислота : вода в соотношении растворителей 35:1:2:2 было обнаружено четыре вещества -

предположительно фенолгликозидов, которые окрашиваются в розовый цвет при обработке раствором серной кислоты. Среди обнаруженных фенологдикозидов по величине Rf и сравнении со стандартными образцами определено два - салицин и тремулацин. Полученные данные подтверждены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

ВЭЖХ-анализ проводили с помощью хроматографа марки «Милихром А-02»с УФ-детектором в следующих условиях: подвижная фаза: А - 0,01% водный раствор трифторуксусной кислоты; В - 100% ацетонитрил, скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем пробы - 2 мкл, температура колонки 35оС; градиент 5-55% элюента А. Проводили УФ-детектирование при длинах волн: 220, 254, 268, 300, 314, 360 нм [86, 127]. Идентификацию выявленных веществ осуществляли по времени удерживания и полученным УФ-спектрам в сравнении со стандартными образцами («Sigma-Aldrich» Германия, США). Методом ВЭЖХ в спиртовом извлечении листьев тополя дрожащего были определены флавоноиды: рутин и гиперозид, в гидролизате спиртового извлечения опеределены четыре агликона флавоноидов, при этом из них идентифицированы кверцетин и кемпферол, также идентифицированы фенолгдикозиды: салицин, тремулацин и коричная, и-кумаровая и феруловая кислоты. Количественное содержание флавоноидов в листьях тополя дрожащего определяли при помощи метода дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на гиперозид при аналитической длине волны 412 нм, а также методом прямой спектрофотометрии определяли количественное содержание фенолгликозидов и фенолкислот в исследуемом сырье [86, 127]. Таким образом, определено, что содержание суммы флавоноидов в листьях тополя дрожащего находится в пределах от 0,97±0,04 % до 2,10±0,05 %; фенологликозидов - от 3,67±0,06 % до 5,64±0,18 %: фенолокислот - от 1,06±0,05 % до 2,46±0,09 %. Также было определено содержание в листьях осины дубильных веществ - 2,35±0,09 % - 4,98±0,12 % и полисахаридов - 2,48±0,05 % - 5,52±0,14 % [86, 127]. В полученной субстанции - сухом экстракте листьев осины - также было определено

количественное содержание БАС: содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид находится в пределах от 4,02±0,14 % до 6,89±0,04 %, фенолгликозидов - от 18,15±0,89 % до 22,84±0,99 %, фенолкислот - от 4,49±0,18 % до 6,52±0,32 %, дубильных веществ - 7,50±0,26% до 9,87±0,13% [127]. Установлено, что доминирующей группой БАВ в листьях осины обыкновенной является фенолгликозиды [78, 127].

Методом ГХ-МС было проведено сравнительное исследование состава листьев и коры тополя черного и дрожащего [121]. Определено, что состав листьев и коры изучаемых видов тополя имеет значительно сходство: обнаружен во всех образцах салицин, салирепин, трихокарпин. Однако есть и различия, так, в коре осины и тополя черного обнаружен салирепозид. Популин присутствует только в коре тополя дрожащего, тремулоидин во всех объектах кроме коры тополя черного, а тремулацин в коре осины и листьях тополя черного [121].

Известен способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях и почках тополя черного методом прямой спектрофотометрии [43]. Данная методика включает такие стадии, как экстрагирование сырья 60% этиловым спиртом, предварительную обработку хлороформом с целью освобождения экстракта от хлорофилла, измерение оптической плотности исследоумого раствора при длине волны 330 нм, затем расчет содержания суммы флаваноидов, которое составило 0,026 % - для листьев и 0,053% - для почек тополя черного [43]. На наш взгляд, данная метолика имеет ряд недостатков: низкая специфичность, неточность, неполнота экстракции (экстрагент выбран неоптимальный), необъективность, заключающаяся в получении заниженных результатов анализа, отсутствие пересчета содержания суммы флавоноидов на конкретное флавоноидное вещество, трудоемкость методики (предварительная обработка экстракта хлороформом). Целесообразно использовать при анализе УФ-спектроскопии пересчет на конкретное флавоноидное вещество, содержащееся в

исследуемом виде сырья, для получения более точных и легко воспроизводимых результатов.

Для разработанной в Пятигорске (Никитина Н.В., Степанюк С.Н. и др.) лекарственной формы - 20% мази с экстрактом тополя черного были разработаны методики качественного и количественного анализа ведущей группы - флавоноидов в данном препарате [89, 92]. Для идентификации флавоноидов - пиностробина и пиноцембрина - предложен метод ТСХ (система растворителей - этиловый спирт : хлороформ в соотношении 9:1), проявляли диазореактивом. На хроматограмме обнаружены пятна со значениями Rf 0,8 и 0,71, что подтверждает присутствие в мази доминирующих флавоноидов - пиностробина и пиноцембрина. Были изучены характер УФ-спектров спиртовых растворов мази в области 220-380 нм, обнаружен максимум поглощения при X = 289±2нм, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора СО пиностробина. Для количественного анализа суммы флавоноидов в мази предложен метод прямой спектрофотометрии в пересчете на пиностробин при X = 289 нм, расчет проводили по удельному показателю поглощения пиностробина равному 685. Количественное содержание в мази составило 0,147±0,003%, средняя относительная погрешность определения при Р = 95% не более 2,04% [89, 92].

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1

1. Современная Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания включает статью «Тополя почки» (ФС.2.5.0042.15), причем фармакопейными видами являются т. черный, т. бальзамический, т. канадский, т. душистый и т. лавролистный. Однако, учитывая огромное видовое разнообразие рода, представляют интерес и другие виды с точки зрения их использования в медицинской практике.

2. Известно, что род Тополь насчитывает около 30 видов. В средней полосе РФ произрастает около 20 видов, среди них, на наш взгляд, наиболее перспективными являются тополь черный, тополь дрожащий, тополь пирамидальный, тополь канадский, тополь краснонервный, тополь белый, которые широко представлены в средней полосе России, в том числе и в Самарской области.

3. Химический состав почек тополя представлен в первую очередь агликоновыми фенольными соединениями: флавоноиды (доминирующие пиноцембрин и пиностробин), фенилпропаноиды и простые фенолы.

4. Химический состав листьев рода Тополь недостаточно изучен. В настоящее время подробно описан состав листьев только одного вида -тополя дрожащего или осины обыкновенной. Известно, что в листьях видов тополя содержатся флавоноиды и фенологликозиды. Актуально более углубленное изучение состава БАС листьев представителей рода Тополь с целью дальнейшего внедрения в качестве нового перспективного вида ЛРС.

5. В настоящий момент на территории РФ в качестве лекарственного растительного препарата зарегистрированы "Тополя почки" (ФС.2.5.0042.15). Также в России запатентован многокомпонентный фитопрепарат, в состав которого входит настойка почек тополя черного. Разработаны препараты на основе листьев тополя дрожащего - экстракт сухой и капсулы «Элоскап»,обладающие противовоспалительным действием, а также на основе коры тополя дрожащего - таблетки «Экорсин» и капсулы «Экорсин форте», которые обладают доказанной противовоспалительной и

противоязвенной активностью. Почки тополя в аптеках реализуются как БАДы (в фасовке для изготовления настоя). В Беларуси применяется мазь на основе экстракта почек тополя черного в ветеринарной практике, а на Украине активно исследуется препарат на основе экстракта коры осины таблетки «Феносин».

6. Имеется опыт применения листьев видов тополя в народной медицине в качестве средства, обладающего антибактериальным и обезболивающим действием, однако степень изученности химического состава сырья, фармакологических свойств и анатомо-морфологических особенностей большинства видов является в настоящее время недостаточным, чтобы ввести на основании полученных данных проект фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья "Тополя черного листья".

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

В качестве объектов исследования были использованы следующие образцы сырья: тополя черного (Populus nigra L.), тополя бальзамического (Populus balsamifera L.), тополя лавролистного (Populus laurifolia Ledeb.), тополя канадского (Populus deltoides Marsh.), тополя краснонервного (Populus rubrinervis Hort.), тополя итальянского (Populuspyramidalis Rozier), тополя белого (Populus alba L.), тополя дрожащего (Populus tremula L.), собранные в период с 2012 по 2019 гг. Сырье было заготовлено на территории Самарской области в период с марта по сентябрь.

Исследованы образцы лекарственного растительного сырья:

• почки тополя черного, заготовленные в п. Алексеевка Самарской области в марте 2017-2018 гг.;

• почки тополя белого, заготовленные в п. Алексеевка Самарской области в марте 2018 года;

• почки тополя краснонервного, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в апреле 2018 года;

• почки тополя итальянского, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в апреле 2018 года;

• почки тополя канадского, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в апреле 2018 года;

• почки тополя дрожащего, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в апреле 2018 года;

• кора и побеги тополя черного, заготовленные в п. Алексеевка Кинельского района Самарской области в марте 2017 года;

• кора и побеги тополя белого, заготовленные в п. Алексеевка Кинельского района Самарской области в марте 2017 года;

• листья тополя черного, заготовленные с июня по сентябрь 20122019 гг. в п. Алексеевка и с. Гаврилова Поляна Самарской области;

• листья тополя бальзамического, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в июле 2018 года;

• листья тополя лавролистного, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в июле 2018 года;

• листья тополя канадского, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в июле 2018 года;

• листья тополя итальянского, заготовленные в Ботаническом саду г. Самара в июле 2018 года.

Исследованы лекарственные растительные препараты и фармацевтические субстанции, представленные ниже.

1. Настойка побегов, почек и листьев тополя черного 1:5 (40% этиловый спирт);

2. Настойка побегов и листьев тополя черного 1:5 (70% этиловый спирт);

3. Настойка побегов, почек и листьев тополя черного 1:5 (96% этиловый спирт);

4. Настойка почек тополя черного 1:5 (80% этиловый спирт).

5. Индивидуальные вещества: рутин, календофлавобиозид, кверцетин, пиностробин, феруловая кислота.

В диссертационной работе использовалась следующая приборная база:

- весы электронные марки «САРТО ГОСМ ЛВ 210-А»;

- весы аналитические «Mettler Toledo XS 204»;

- термостат суховоздушный «ТС-1/80»;

- спектрометры моделей «BrukerAM-300» и «Bruker AV 600» (150,90

МГц);

- масс-спектрометр модели «KratosMS-30»;

- спектрофотометры «Specord 40» (Analytik Jena) и «СФ-2000»;

-жидкостной микроколоночный хроматограф «Милихром-6» («НПАО

Научприбор»), хроматографическая колонка стальная «Эликсо»

Kromasil C18 (5) (2мм х 80 мм);

- цифровые микроскопы «Motic» DM-111 и DM-39C-N9GO-A;

- цифровой люминисцентный микроскоп Альтами-ЛЮМ-2. Диссертационное исследование было выполнено с использованием следующих материалов:

- пластины для тонкослойной хроматографии марки «Sorbfil» типа ПТСХ-АФ-А-УФ и ПТСХ-П-А-УФ;

- системы растворителей для хроматографирования: н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода; хлороформ-спирт этиловый 96%-вода; хлороформ-спирт этиловый 96% в различных соотношениях;

- сита с диаметорм отверстий 0,2 мм; 0,5 мм; 1 мм; 2 мм; 3 мм; 5 мм;

- клинические штаммы, полученные от пациентов с муковисцидозом: штаммы 105, 136 - Burkholderia cenocepacia ST 208, штаммы 139, 141 -Burkholderia multivorans, штамм 799 - Pseudomonas aeruginosa.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методики морфолого-анатомического анализа

В диссертационной работе проводились иследования свежих или высушенных листьев, почек и побегов тополя черного, тополя канадского, тополя итальянского, тополя краснонервного, тополя дрожащего. Сушку осуществляли естественным путем. Пробоподготовку микропрепаратов и проведение гистохимических реакций осуществляли в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи (ОФС) Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания [22].

Фиксацию свежесобранного сырья для целей микроскопического анализа проводили в смеси глицерин очищенный-этано-вода в соотношении 1:1:1. Морфолого-анатомический анализ проводили по ОФС «Листья» и «Почки» в соответствии с ГФ РФ XIV издания [22]. Объекты лекарственного растительного сырья рассматривались с использованием лупы (х10) и невооруженным глазом. Размеры изучаемых объектов определяли с

помощью линейки и программного оборудования цифрового стереоскопического микроскопа. Цвет исследуемых объектов оценивали визуально при дневном свете; запах оценивали при растирании небольшого количества сырья; вкус - пробуя водное извлечение сырья. Микроскопический анализ проводили в проходящем свете на белом поле при помощи цифровых микроскопов «Motic» DM-111 и DM-39C-N9GO-A. А люминесценцию листьев и почек некоторых видов тополя исследовали на люминесцентонм микроскопе марки «Альтами» ЛЮМ-2 с использованием голубого и желтого светофильтров диаметрами 32 мм. В качестве источника света применяли высоковольтную ртутную лампу (HBO 100Вт). При этом спектральный диапазон возбуждения составлял для голубого светофильтра -420-550 нм, а для желтого - 330-400 нм.

2.2.2. Химические методы анализа

1. Качественные реакции. Для подтверждения наличия определенных групп БАВ в сырье тополя нами были проведены пробирочные реакции, в качестве предварительного фитохимического анализа исследуемого вида сырья:

Цианидиновая реакция (проба Shinoda) была использована для обнаружения в извлечении листьев тополя черного флавоноидов. В 1-2 мл извлечения листьев тополя добавляли 5 капель кислоты хроводородной концентрированной и около 10 мг цинка. При положительной реакции извлечение окрашивалось в красно-малиновый цвет [59, 130].

Цианидиновая реакция с модификацией по Брианту является продолжением описанной выше цианидиновой пробы. Полученный раствор после первой реакции разводят водой очищенной (1:1) и добавляют н-бутанол. Присутствие агликонов было обнаружено переходом красно-фиолетовой окраски в органический слой. Присутствие гликозидов было обнаружено при окрашивании нижнего неорганического слоя [130].

Реакция с раствором железа (III) хлорида проводили для обнаружения соединений, имеющих свободные фенольные ОН-группы. При добавлении

1% спиртового раствора железа (III) хлорида наблюдается коричневое окрашивание (в случае присутствия ОН-группы в положении 3), зеленое окрашивание (присутствует ОН-группа в положении 5) или синее окрашивание (присутствуют 31,41,51-ОН-группы).

Реакция с раствором алюминия (III) хлорида была использована для обнаружения флавоноидов. К 1-2 мл исследуемого извлечения добавляли 1-2 мл 3% раствора алюминия (III) хлорида спиртового. При наличии флавоноидов наблюдалась желтая окраска раствора, а желтовато-зеленое свечение при длине волны 366 нм [130].

Реакция с щелочным раствором диазобензолсулъфокислоты была использована для обнаружеения свободных ароматичесих ОН-групп. В 1-2 мл извлечения добавляют 1-2 капли раствора диазобензолсульфокислоты (ДСК). Появляется желтое окрашивание [130].

Реакция с раствором железа (III) хлорида была использована нами для обнаружения соединений, имеющих свободные ароматические гидроксильные группы. Наличие свободной ОН-группы в 3 положении подтверждается окраской раствора извлечения в коричневый цвет при добавлении 1% спиртового раствора железа (III) хлорида, наличие свободной ОН-группы в 5 положении по окраске раствора в зеленый цвет, а свободных 31,41,51-ОН-групп - по окраске раствора в синий цвет при добавлении того же реактива [130].

Реакция Вилъсона или борно-лимонная направлена на обнаружение в извлечении 3- и 5-гидроксифлавонов и гидроксифлавонолов. К 1-2 мл исследуемого раствора добавляли несколько капель борной и лимонной кислот, после чего наблюдали окрашивание раствора в желтый цвет с зелено-желтым свечением в результате образования батохромного комплекса. Если ароматическая группа в 3 положении является свобоной, то наблюдается образование пятичленного комплекса, устойчивого к действию раствора лимонной кислоты [130].

Реакция с едкими щелочами (KOH, NaOH). К 1-2 мл исследуемого раствора прибавляли несколько капеь 1-2% раствора гидроксида натрия. Появлялась оранжевая окраска исследуемого раствора. [130].

2.2.3. Хроматографические методы анализа

1. Тонкослойная хроматография (ТСХ) [22, 70, 87, 139]

Метод тонкослойной хроматографии применяли для проведения исследований извлечений из листьев и почек представителей рода Тополь.

В работе использовались хроматографические пластины марки «Sorbffl» типа ПТСХ-АФ-А-УФ и ПТСХ-П-А-УФ. Перед хроматографическим анализом пластинки помещали в термостат при температуре 100-105оС, тем самым удаляя влагу из сорбента.

В ходе исследования апробировалась следующие системы растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2), хлороформ - этанол 96% - вода (26:16:3), хлороформ - этанол 96% (9:1).

Образцы извлечений наносили капилляром на линию старта, закрепляли каждый образец этиловым спиртом 96%, далее пластинку погружали в хроматографическую камеру, которая насыщалась парами определенной системы растворителей в течение 24 часов перед началом исследования. Хроматографировали восходящим способом, при комнатной температуре. Когда фронт растворителя достигал 7-8 см, хроматографический анализ считался завершенным.

Пластины, извлеченные из системы, просматривали в условиях ультрафиолетового света при Х=254 и Х=366 нм, а также при дневном освещении. Для оценки химической природы обнаруживаемых на хроматограмме веществ, пластина обрабатывалась соотвествующим реактивом: щелочным раствором ДСК, 3 % спиртовым раствором алюминия хлорида (III) (на обнаружение фенольных соединений и флавоноиды).

2. Адсорбционная жидкостная колоночная хроматография [114, 130] Для изучения химического состава листьев тополя черного мы

использовали метод адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии. Колоночную хроматографию проводили на колонке с диаметром 8 см и высотой сорбента 5 см, сорбентом являлся силикагель марки L 40/100 мкм и L 100/250 мкм (Чехия). В качестве элюентов использовали хлороформ, этиловый спирт 96%, в различных соотношениях смеси спирта этилового и хлороформа, а также воду очищенную.

В результате проведенного исследования были получены фракции, содержащие биологически активные вещества листьев тополя черного. Дальнейшую очиску индивидуальных соединений проводили на колонке с диаметром 2 см и высотой сорбента 2 см, в качестве сорбента использовали силикагель марки, указанной выше, и полиамид для колоночной хроматографии (Woelm Pharma), а также методом перекристаллизации смесью хлороформа и этанола.

3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [23, 70, 130]. ВЭЖХ-анализ осуществляли на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») с ультрафиолетовым детектором в следующих условиях: изократический режим, стальная колонка «Элсико» (№28042; 2 мм х 80 мм; Kromasil C18; 5 мкм), подвижная фаза -различные соотношения ацетонитрила и воды с добавлением 1% уксусной кислоты, скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем элюента - 2500 мкл, объем пробы 2 мкл. Аналитическая длина волны - 360 нм.

2.2.4. Физико-химические методы анализа

1. ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия.

Спектральные характеристики выделенных индивидуальных веществ

1 13

исследовали с помощью ЯМР 1Н - и ЯМР 13С спектроскопии с помощью спектрометра «Bruker AM 300» (300 МГц) и «Bruker AV 600» (150,90 МГц). Масс-спектры EI-MS и ESI-MS были получены на масс-спектрометре «Kratos MS-30» при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и колебании температурного режима ионного источника от 100 до 250 °С. Определение

температуры плавления выделенных соединений проводили при помощи блока Кофлера [16, 23].

2. Спектрофотометрия [22, 70, 130].

Метод спектрофотометрии использовался для определения содержания суммы флавоноидов в извлечениях и препаратах из сырья представителей рода Тополь. Этот метод также использовался для анализа индивиудальных соединений, выделенных из листьев тополя черного. Анализ был проведен на следующих приборах: спектрофотометрах марки «Specord 40» (Analytik Jena) и марки «СФ-2000» (ОКБ Спектр) в кюветах с толщиной слоя 10 мм в диапазоне длин волн от 190 до 500 нм. Раствор сравнения - спирт этиловый 96% концентрации. Обработку результатов спектрофотометрического определения проводили с помощью программы «WinAspect Excel».

2.2.5. Технологические методы

Образцы настоек из сырья - листьев, почек и побегов - тополя черного получали методом модифицированной дробной мацерации [99] в соответствии с общими правилами фармацевтической технологии. Приготовление настоек на основе различного вида сырья тополя черного осуществлялось методом модифицированной дробной мацерации, разработанным на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ и применен для получения настоек из различного вида растительного сырья, содержащего фенилпропаноиды и флавоноиды (Патент РФ на изобретение № 2134584, № 2133620 и др.). Настойки получали на спиртах различной концентрации в соотношении 1:5. Получали настойки по приведенной ниже схеме на примере настойки из листьев тополя черного на 70% этиловом спирте.

Получение настойки листьев тополя черного методом модифицированной дробной мацерации [99].

Первый день. В три экстрактора помещают 1 часть измельченных листьев тополя черного. Первый экстрактор заполняют 8 объемами по отношению к сырью 70% этилового спирта и дают настояться в течение

суток при комнатной температуре. Во второй экстрактор помещают 3 объема 70% этилового спирта для замачивания сырья в течение суток.

Второй день. Из первого экстрактора сливают полученное извлечение во второй экстрактор и оставляют на сутки при комнатной температуре. В первый экстрактор заполняют 5 объемами чистого экстрагента и оставляют на сутки при комнатной температуре. В третий экстрактор помещают для замачивания 3 объема 70% этилового спирта.

Третий день. Извлечение из второго экстрактора переносится в третий экстрактор, а из первого экстрактора - во второй. 5 объемов чистого экстрагента добавляют в первый экстрактор и оставляют на сутки при комнатной температуре для экстракции.

Четвертый день. Извлечение сливают из третьего экстрактора в емкость с готовым продуктом (1/3 часть). Извлечение из второго экстрактора выливают в третий экстрактор и оставляют на сутки при комнатной температуре. В первом экстракторе проводят термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение получаса. Полученное извлечение из первого экстрактора выливают во второй экстрактор и оставляют на сутки при комнатной температуре. Сырье из первого экстрактора считается отработанным.

Пятый день. Извлечение из третьего экстрактора сливают в емкость с готовым продуктом (1/3 часть). Во втором экстракторе проводят термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение получаса. Полученное извлечение из второго экстрактора выливают в третий экстрактор и оставляют на сутки при комнатной температуре. Сырье из второго экстрактора считается отработанным.

Шестой день. В третьем экстракторе проводят термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение получаса. Полученное извлечение из третьего экстрактора сливают в емкость с готовым продуктом (1/3 часть). Сырье из третьего экстрактора считается отработанным.

Полученную настойку выдерживают при температуре 8 °С в течение 23 суток и фильтруют. Готовый продукт фасуют во флаконы темного стекла.

2.2.6. Фармакологические методы анализа

В ходе диссертационной работы на кафедре фармакологии имени з.д.н. РФ проф. А.А. Лебедева Самарского государственного медицинского университета (СамГМУ) было проведено исследование диуретической активности и острой токсичности настойки листьев тополя черного на спирте этиловом 70% концентрации.

Эксперимент был проведен на 20 беспородных, белых крысах, распределенных на 2 группы (опыт и контроль). Масса животных составляла 200-220 г. В опыте использовались только половозрелые крысы-самцы. Животные находились в условиях вивария на стандартном рационе. Доступ животных к воде был свободным.

Диуретическую активность настойки листьев тополя черного на 70 % спирте в дозе 100 мкл/кг определяли в хроническом эксперименте [65].

За день до опыта крысы получали водную нагрузку в объеме 3% от массы тела животного при помощи внутрижелудочного зонда. В день эксперимента животным контрольной группы вводилась водно-спиртовая нагрузка, а животным опытной группы - внутрижелудочно лекарственный препарат в аналогичном объеме, после чего животных помещали в обменные клетки на сутки. В ходе исследования собирали 4-х и 24-х часовые порции мочи, где определяли почечную экскрецию воды, регистрировали концентрацию натрия и калия методом пламенной фотометрии на пламенном анализаторе жидкости ПАЖ-1, креатинина - колориметрическим методом на фотоколориметре КФК-3.

Кроме того, была изучена острая токсичность настойки листьев тополя черного на 70% этаноле. Первая группа животных получала внутрижелудочно однократно настойку листьев тополя черного в дозе 0,5 г/кг на фоне 3% водной нагрузки, вторая, контрольная группа - 70% этиловый спирт в аналогичном объеме. В первый день эксперимента за

животными велось непрерывное наблюдение, общая продолжительность исследования составила 14 дней. В общей сложности было проведено 6 серий опытов.

2.2.7. Микробиологические методы анализа

В результате исследования был проведен скрининговый анализ антимикробной активности водно-спиртовых извлечений из листьев, почек и побегов тополя черного, полученных на этиловом спирте различной концентрации - 40%, 70%, 80% и 96% в отношении клинических штаммов, полученных от пациентов с муковисцидозом. Контролем служил экстрагент -спирт этиловый той же концентрации, что и в настойке. Определение минимальной ингибирующей концентрации осуществялось методом двойных серийных разведений в бульоне (микрометод) в соответствии с МУ 4.2.1890-04 [96]. Регистрация результатов микробиологического анализа осуществлялась через 48-72 часа после инкубации при температуре 37 °С. При этом проводилась визуальная оценка задержки роста. Из лунок с видимой задержкой роста осуществлялся высев на питательные среды (5% кровяной агар-агар), через 24 часа отсутствие роста оценивалось как бактерицидный эффект, а появление видимого роста, но с его задержкой -как бактериостатический.

Тестовыми культурами в опытах по исследованию противомикробной активности настоек из сырья тополя черного являлись клинические штаммы, полученные от пациентов с муковисцидозом: штаммы 105, 136 -Burkholderia cenocepacia ST 208, штаммы 139, 141 - Burkholderia multivorans, штамм 799 - Pseudomonas aeruginosa. Тестовые культуры являются клиническими изолятами, которые были получены из мокроты легких больных муковисцидозом, проходящих лечение на базе клиник СамГМУ. Полученные штаммы депонированы в музей микробиологических культур на кафедре общей и клинический микробиологии, иммунологии и аллергологии СамГМУ (Жестков А.В., Лямин А.В.).

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРЬЯ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА ТОПОЛЬ

Одним из важных аспектов стандартизации любого вида ЛРС является подтверждение его подлинности и доброкачественности с использованием мофролого-анатомического анализа. Указанный метод позволяет отличить целевой вид растения от примеси, выявляя фальсификат. Данный диагностический метод особенно важен в фармацевтическом анализе.

Фармакопейным видом сырья тополя являются почки (ФС.2.5.0042.15), однако по литературным данным известно о применении в официнальной и народной медицине и других перспективных морфологических органов данного растения - листьев [77, 78, 112, 127]. Зарубежные и отечественные ученые проявляли интерес к морфологии и анатомии тополя, однако, нами найдено подробное описание гистологии и анатомии листьев лишь одного вида - тополя дрожащего [75]. Информация о других видах рода Тополь, в том числе и фармакопейных, отсутствует.

Внедрение в медицинскую и фармацевтическую практику листьев тополя как нового вида лекарственного растительного сырья создает возможность безотходного и комплексного использования всего растения, как перспективного источника БАС.

В Российской Федерации и за рубежом нормативная документация на листья тополя отсутствует. Для этого необходимо получить результаты изучения по разработке одного из важнейшего раздела «Микроскопические признаки» в проекте Фармакопейной статьи на ЛРС «Тополя черного листья», для внедрения в научную практику нового вида растительного сырья.

В настоящей главе представлены результаты проведенных исследований морфолого-анатомических и гистологических особенностей органов растения рода Тополь.

3.1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование листьев тополя черного, тополя дрожащего, тополя итальянского, тополя краснонервного

Листья тополя наряду с фармакопейным видом сырья - почками являются перспективным видом ЛРС и могут быть использованы в комплексной переработке тополя черного. Листья тополя черного рассматриваются нами в качестве потенциального фармакопейного вида сырья, а листья других видов, таких как: тополь дрожащий, тополь итальянский, тополь краснонервный - в качестве примесных.

3.1.1. Морфолого-анатомические особенности листьев некоторых видов рода Тополь

Морфологические особенности строения листьев тополей являются таксономически-значимыми признаками и описаны во многих определителях растений [1, 16, 83, 90, 112, 117, 128]. По литературным данным известно, что в роде тополь выделяют 3 подрода: Туранга (Turanga), Лейка (Leuce) и Настоящие тополя (Eupopulus). Представителем подрода Лейка является вид тополь дрожащий (осина), а настоящих тополей - тополь черный, тополь итальянский [83, 112, 117]. Тополь краснонервный является межсекционным гибридом подрода настоящих тополей и является одним из перспективных видов [136, 137] (см. главу 1).

Анализ морфологии листьев сравниваемых видов тополя показал значительную долю сходства формы листовых пластинок всех представителей подрода - Eupopulus (рис. 3). У всех видов данной группы тополей отмечена яйцевидность листовых пластин: у тополя итальянского она широко-яйцевидная, у тополя краснонервного яйцевидная с сердцевидным основанием листовой пластинки. Листья же тополя черного имеют яйцевидно - ромбическую форму. У всех видов Подрода - Eupopulus верхушка листовой пластинки - остро оттянута рис. 3 А,В,Г).

Представитель подрода Leuce - тополь дрожащий значительно отличается по форме листовой пластинки. Она округлой формы с волнистым краем, тупым основанием и клиновидной верхушкой (рис. 3Б).

Рисунок 3 - Морфологические особенности листьев некоторых видов рода Тополь (фрагмент гербарного образца фонда кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ) [123].

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

Рисунок 4 - Анатомия центральной жилки листьев некоторых видов тополя (х100).

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

Сравнение поперечных сечений центральных жилок листовых пластинок выявил морфолого-анатомические особенности листа тополя черного, отличающие его от сравниваемых видов (рис. 4 А). При сравнении очертаний поперечных сечений видно, что у видов тополя итальянского, тополя дрожащего и тополя краснонервного центральная жилка листовой пластинки овальной формы с более-менее равномерной паренхимой с адаксиальной и абаксиальной сторон (рис. 4 Б,В,Г).

У тополя черного очертания центральной жилки треугольной формы с округло-оттянутой абаксиальной стороной (рис. 4 А).

Рисунок 5 - Проводящая система центральных жилок представителей рода Тополь.

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

Проводящая система центральных жилок, сравниваемых листьев в большей степени сходна (рис. 5). При этом у тополя черного относительно остальных видов центральная жилка слабо армирована: небольшой блок склеренхимы отмечен только с адаксиальной стороны, в то время как у остальных видов склерификация жилок с обеих сторон значительная (рис. 5 А).

К селективным видовым признакам можно отнести количество обособленных проводящих пучков листовой пластинки: у тополя черного и тополя итальянского с верхней стороны листа отмечено два крупных пучка, у тополя краснонервного - три, а у тополя дрожащего, как правило, непучковый тип строения проводящих тканей (рис. 5). Однако данная

особенность может варьировать в зависимости от места среза листовой пластинки и связана с жилкованием, что не позволяет нам судить о значимости выявленного признака.

Рисунок 6 - Анатомия боковой жилки представителей рода Тополь

(х40).

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

Анатомически листовые пластинки изучаемых видов тополя -дорзовентрального типа строения (рис. 6). При этом отмечено, что у тополя краснонервного значительно выражена складчатая паренхима (рис. 6 Г). У остальных видов в паренхиме доминирует столбчатый мезофилл (рис. 6).

Щ

у

А

Ж

■ с^ш

В

I

уши

Рисунок 7 - Нижний эпидермис листовой пластинки представителей рода Тополь (х400).

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

Клетки нижнего эпидермиса листьев всех сравниваемых видов вытянутые, угловатые, с четковидным утолщением кутикулы, устьичные аппараты анамоцитного типа строения. У тополя краснонервного заметны простые волоски (рис. 7 Г), листья остальных видов лишены опушенности (рис. 7 А,Б,В). Однако в литературных источниках есть информация, что у молодых листьев тополя дрожащего отмечается наличие редких простых волосков, которые со временем отрываются и на месте прикрепления волоска можно обнаружить 5-6 клеточную розетку [75]. В нашем случае трихомы не были найдены, что связано, вероятно, с возрастом листьев. Из-за описанной

особенности наличие трихом на эпидерме листьев тополей нельзя считать значимым диагностическим признаком.

Устьица листовых пластинок почти всех видов тополя многочисленные, устьичные аппараты анамоцитного типа (окружены 4-5 сопровождающими клетками эпидермиса) (рис. 7). Устьичные аппараты листьев тополя черного в отличие от других видов разноразмерные, устьица могут отличаться по величине в 2-3 раза (рис. 7 А).

Рисунок 8 - Верхний эпидермис листовой пластинки представителей рода Тополь (х400).

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

У листьев тополя клетки верхнего эпидермиса продолговатые, в то время как листья тополя дрожащего имеют извилистые стенки клеток

эпидермиса (рис. 8 Б). У всех видов устьица расположены с обеих сторон листа - амфистоматическая листовая пластина, в отличие от тополя дрожащего, у которого устьица только с нижней стороны листа -гипостоматическая листовая пластина (рис. 8 Б).

к У ■ г '■■•-•л

шжЕ.

А А

А

Б

ЛшТ

Б

Ж» уГЖЖ^

ё> +-4Л г» 4

* • ч^яК К ШЁгК 1* •

I * 5 / -г' V

«ИР, Я*« - с, ,

Ф11 ? Щ: «

Ч,

й^-лгм*:

ВЪ- .. V.;

Яш:

г :

Рисунок 9 - Анатомия эпидермиса над жилкой листовой пластинки представителей рода Тополь (х400).

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

У всех изучаемых видов тополя жилки листьев имеют кристаллоносную обкладку, составленную призматическими кристаллами оксалата кальция, что хорошо заметно при рассмотрении жилок сквозь эпидермис (рис. 9).

Рисунок 10 - Анатомия адаксиальной стороны листовой пластинки представителей рода Тополь.

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

У всех сравниваемых видов уголковая колленхима с верхней стороны листовых пластинок расположена над центральной жилкой. Отличие отмечено в основном в степени её развитости. Наиболее выражена область колленхимы у тополя черного и тополя итальянского (рис. 10 А,В).

При этом необходимо отметить значительное содержание крупных округлых друз в области колленхимы у тополя черного и тополя итальянского (рис. 10 А,В). У остальных видов содержание друз

незначительно (тополь краснонервный) или почти отсутствует - тополь дрожащий (рис. 10 Б,Г).

Рисунок 11 - Анатомия абаксиальной стороны листовой пластинки представителей рода Тополь.

Обозначения: А - тополь черный; Б - тополь дрожащий; В - тополь итальянский; Г - тополь краснонервный.

Колленхима с нижней стороны листовой пластинки значительно развита в листьях тополя итальянского и тополя краснонервного, форма клеток уголковой колленхимы угловато-смятая (рис. 11 В,Г). У тополя черного клетки колленхимы округлой формы (рис. 11 А). У тополя дрожащего и тополя итальянского в колленхиме имеются межклетники, т.е. колленхима обоих видов рыхлого типа (рис. 11 Б,В). Кроме того у тополя

краснонервного над центральной жилкой листьев отмечены редко встречающиеся кроющие трихомы в виде одноклеточных бичевидных волосков.

Данные особенности имеют видовую специфичность и могут быть использованы в диагностике листьев видов рода Рори\т.

3.1.2. Особенности люминесценции тканей листьев некоторых видов рода Тополь

Известно, что для флавоноидов как фенольных соединений при облучении различными спектрами света характерна люминесценция. Это даёт возможность с помощью оптических методов детектирования, в частности, люминесцентной микроскопии, обнаруживать в объекте указанную группу соединений [71].

Предварительному микролюминесцентному анализу подвергались пробы СО флавоноидов: пиностробина, кемпферола, кверцетина, рутина (рис. 12).

/ / 1. V, 1 »" л Д'| Л . ■ . • * ; 1 - ^ \ ЗбОнм ж ЗбОнм

< ' \ VУ!- Л 1 *>» ■ . V У А 3 ^ ЖЩ л' Л' |Ч 1 > V •V к 1 360пм. А ^ Л " X ^ щ - ' из ■ 4 ^ • • • • > •• • • ЗбОнм

Рисунок 12 - люминесцентная микроскопия порошков СО фенольных соединений.

Обозначения: 1 - пиностробин; 2 - кемпферол; 3 - кверцетин; 4 - рутин.

По результатам микроскопии видно, что характеристика люминесценции исследуемых образцов флавоноидов при облучении 360 нм

наиболее информативна и отличается в зависимости от группы флавоноидов. Так, флаванон пиностробин в заданных условиях облучения люминесцирует светло-желтым цветом; флавонол кемпферол - темно-оранжевым; флавонолы люминесцируют бурым цветом. Необходимо отметить, что в зависимости от наличия сахарного остатка степень свечения меняется: кверцетин люминесцирует красно-оранжевым, а рутин - коричнево-красным цветом (рис. 12).

При рассмотрении поверхности верхнего эпидермиса листовых пластинок тополя черного, тополя краснонервного и тополя итальянского отчетливо видна кутикула, люминесцирующая розовым светом при облучении светом с длиной волны 360 нм. Розовая люминесценция обусловлена, по всей видимости, каротиноидными структурами, включенными в состав кутина (рис. 12). Растительные пигменты, такие как хлорофилл и каротиноиды также входят в состав клеточных протопластов и могут давать активное свечение в УФ-области света красно-розового оттенка.

Эпидермис нижней стороны листьев изучаемых видов тополя люминесцирует слабо за счет элементов протопласта. Так, при облучении светом с длиной волны 420 нм фрагменты протопласта имеют желтый цвет. При облучении УФ-светом при длине волны 360 нм структуры протопласта люминесцируют голубым светом, что указывает на их простую фенольную природу. Аналогично верхнему эпидермису розовое свечение наблюдается лишь у клеточных стенок замыкающих клеток устьичного аппарата.

При рассмотрении с поверхности листьев тополя черного, тополя краснонервного и тополя итальянского на просвете мезофилла видна люминесценция проводящей системы листа. При 420 нм клеточные стенки имеют желтый, а при 360 нм светло-голубой цвет свечения, что обусловлено в основном лигнификацией оболочек сосудов и склеренхимных волокон (рис. 12).

При рассмотрении на поперечном сечении на малом увеличении (х 40) отчетливо видны люминесцирующие светло-голубым цветом (при Х=360 нм)

и светло-желтым (при ^=420 нм) одревесневшие оболочки клеток ксилемы и склеренхимы за счет наличия природного фенольного полимера лигнина (рис. 12).

Рисунок 13 - Особенности люминесценции тканей поперечного среза листьев некоторых видов тополя (х 40): 1 - тополь краснонервный, 2 - тополь черный, 3 - тополь итальянский.

Обозначения: А - базальная часть листистовой пластины в дневном свете; Б - базальная часть листовой пластины при Х=420 нм; В - базальная часть листовой пластины при Х=360 нм.

При детальном рассмотрении проводящих пучков центральной и вторичных жилок листовых пластинок в области флоэмных тканей видна буро-коричневая люминесценция при облучении УФ-светом при 360 нм. Характер свечения схож с ранее выявленным свечением флавонолов -кверцетина и рутина.

3.2. Петиолярная анатомия черешков листьев некоторых видов рода Тополь

Метод петиолярной анатомии на сегодняшний день является одним из основных эффективных методов стандартизации при фармацевтическом анализе ЛРС. Проведение адекватной диагностики близкородственных видов возможно благодаря разнообразному строению черешков листьев и их видовой специфичности.

В литературных источниках имеется описание анатомии черешка листа тополя дрожащего - осины [90]. Так, черешок листа латерально-утолщенный, в поперечном сечении в средней части яйцевидной формы, у пластинки -узкоэллиптический, суженный с вентральной стороны, а в основании уплощенно- или вдавленно-выпуклый. Эпидермальные клетки с сильно утолщенной наружной стенкой. Непосредственно под эпидермисом залегает колленхима, а глубже расположена паренхима, содержащая друзы, которые наиболее обильны в основании черешка и в наименьшем количестве наблюдаются в средней его части. Местами встречаются одиночные кристаллы [90]. Количество и расположение проводящих пучков варьирует по длине черешка: в основании базальной части имеется 3 пучка, иногда в них наблюдаются признаки ветвления; далее по черешку вверх происходит ветвление и перегруппировка пучков, в результате чего в средней части имеется несколько пучков разной ориентации, в то время как у листовой пластинки они располагаются друг над другом по вертикальной линии поперечного разреза и имеют склонность к концентрическому характеру [90]. Волокнистая обкладка у проводящих пучков наиболее развита в средней части черешка и отсутствует в его основании. Колленхима содержит вещество красноватого цвета. Не только формой черешка, но и расположением проводящих пучков в нем объясняется способность листьев осины дрожать даже при легком ветерке [90].

Нами проведено сравнительное исследование петиолярных признаков черешков родственных видов тополя - тополя черного и тополя краснонервного.

Черешок листа тополя черного тонкий, длиной до 6 см, а черешок листа тополя краснонервоного тонкий, длиной до 8 см. Также у черешков данных видов наблюдается особенность: они сплюснуты с боков от середины к основанию листа, без желобка [90]. Визуально листья и черешки обоих видов не опушены, прилистники отсутствуют (рис. 14).

Рисунок 14 - Черешки листа некоторых видов тополя: I - тополь черный, II - тополь краснонервный. А - Листовая пластинка с черешком; Б -поперечные сечения черешка (х40).

Обозначения: 1 - апикальная часть черешка, поперечное сечение; 2 -медиальная часть черешка, поперечное сечение; 3 - базальная часть черешка, поперечное сечение.

Черешок листа тополя состоит из апикальной, медиальной и базальной частей. На поперечном сечении в базальной части черешка листа тополя черного хорошо видны центральная и боковые жилки, имеющих У-образное расположение (рис. 14 I). Очертание поперечного сечения в базальной части черешка тополя краснонервного представляет собой неровную, состоящую из трёх угловатых У-образно сложенных вместе фрагментов, конструкцию. Наиболее крупным является центральная часть черешка, по сути, это

центральная жилка. А бортами черешка являются его боковые угловатые части (рис. 14 II Б)

Медиальная часть черешков исследуемых видов по форме округло-овальная, иногда широкояйцевидная (рис. 15, 16). С поверхности медиальная часть поперечного среза черешка тополя краснонервного сильно волнисто -извилистая, в отличие от черешка тополя черного - его поперечный срез ровной округлой формы (рис. 15 А, 16 А).

Рисунок 15 - Особенности медиальной части черешка листа тополя черного: А - фрагмент поперечного сечения медиальной части (х100); Б -фрагмент эпидермиса (х400).

Рисунок 16 - Особенности медиальной части черешка листа тополя краснонервного: А - Фрагмент поперечного сечения медиальной части (х100); Б - фрагмент коровой части (х400).

Обозначения: 1 - кутинизированный эпидермис; 2 - паренхима с утолщенными стенками; 3 - склеренхима; 4 - проводящие клетки флоэмы; 5 - ксилема.

Сечения в апикальной части черешка тополя краснонервного сходны по строению тканей с участками в базальной части и представлены тремя угловатыми сигментами, при этом отмечается их линейное расположение. Зауживание паренхимы отмечается между частями (рис. 14 II Б). Апикальная часть черешка тополя черного вытянута, в ней хорошо диагностируются 3 жилки: центральная и две боковые (рис. 14 I).

Следует отметить, что во всех местах сечений контур черешка тополя краснонервного сильно волнисто-извилистый, особенно это заметено в серединной части, что не наблюдается при рассмотрении поперечных сечений срезов черешков у листьев тополя черного (рис. 14).

С поверхности черешок тополя краснонервного покрыт сильно кутинизированной эпидермой. Эпидерма черешка тополя черного представлена тонкостенными клетками, поверхность ее не опушена (рис. 14 I). В полостях эпидермальных клеток тополя краснонервного диагностируется буро-окрашенный протопласт (рис. 14 II Б). Иногда на поверхности эпидермы встречаются простые однокеточные бичевидные волоски. В основном они находятся в апикальной части черешка (рис. 22 В).

кг

Рисунок 17 - Особенности базальной части черешка листа тополя черного - фрагмент борта черешка (х40).

Рисунок 18 - Особенности базальной части черешка листа тополя краснонервного: А - фрагмент борта черешка (х100); Б - фрагмент покровной ткани черешка (х400).

Обозначения: 1 - кутинизированный эпидермис; 2 - друзы; 3 -

паренхима с утолщенными стенками; 4 - флоэма пучка; 5 - ксилема пучка; 6 - паренхима ксилемы.

Основная паренхима первичной коры значительно выражена в основании черешка и находится под эпидермисом черешка тополя краснонервного. В медиальной части черешка первичная кора заметно тоньше, чем на срезах базальной и апикальной частей (рис. 16 и 18). Паренхима первичной коры плотная, однако, особенно в базальной части, встречаются крупные межклетники и воздушные полости, вероятно рексигенного происхождения (рис. 22 Б). Цитологически паренхима первичной коры сложена из мелких угловатых, иногда смятых клеток. Клеточная стенка целлюлозная и значительно утолщена. Утолщения клеточных оболочек сходны с оболочками клеток уголковой колленхимы. Протопласты клеток неструктурированные, темноокрашенные в бурый цвет. В клетках достаточно часто встречаются крупные друзы звездчатой формы (рис. 18 Б). Эндодерма не выражена. Поверхность черешка тополя краснонервного заметно складчатая. Складки первичной коры особенно заметны на срезе в апикальной части черешка (рис. 22 Б).

Основная паренхима черешка тополя черного представлена тонкостенными неодревесневшими клетками и развитым слоем уголковой

колленхимы (рис. 15 и 17). По периферии, кнаружи от склеренхимной обкладки проводящих элементов в основной паренхиме обнаруживаются друзы кристаллической формы (рис. 15 Б). Поверхность черешка гладкая, немного волнистая в апикальной и медиальной части (рис. 14).

Проводящая система черешков сложена из коллатеральных пучков, расположены по-разному в зависимости от места среза. В базальной части черешка тополя краснонервного видны три пучка С-образных по форме. Пучок центральной жилки наиболее крупный, боковые пучки мельче и более округлые (рис. 14 II Б). У черешка тополя черного в базальной части заметны три округлых по форме пучка; два боковых заметно меньше крупного -центрального (рис. 17).

Ксилемная часть пучков обоих видов представлена радиально расположенными крупными сосудами. Темно-коричневые сердцевинные лучи, расположенные в ксилеме, делят на сигменты ксилемную часть. Ткани флоэмы по цвету от темно-коричневого до черного. С периферии они незначительно армированы группами лубяных волокон (рис. 19 и 20).

На срезах в медиальной части черешка листьев тополя краснонервного проводящих пучков тоже три. Они плотно сгруппированы в центре округлого черешка и отличаются размерами. Один наиболее крупный пучок локализован с нижней, абаксиальной, стороны черешкового среза. Его особенностью является визуально замкнутая структура. Два других пучка, в два раза меньшие размерами, расположены парой с верхней стороны. Их форма также округлая или иногда сердцевидная (рис. 16 А). На срезах в медиальной части черешка тополя черного в отличие от тополя краснонервного проводящих пучков насчитывается до пяти. Они представляют собой плотную структуру, которая разделена на три округлых пучка меньших по размеру и один продолговатый крупный в середине (рис.

15).

В отличие от срезов базальной части листовых черешков тополя краснонервного пучки в медиальном фрагменте черешка значительно

армированы развитой склеренхимой, у черешка тополя черного склеренхима замента на всех срезах (рис. 16 Б). Склеренхима представлена крупными группами лубяных волокон со значительно утолщенными склерифицированными клеточными стенками (рис. 15 и 16). Остальные особенности проводящих тканей аналогичны тканям на срезах в базальной области черешка.

Рисунок 19 - Структура проводящих пучков тополя черного (х 400): А - фрагмент пучка; Б - фрагмент со склеренхимой.

Рисунок 20 - Структура проводящих пучков тополя краснонервного (х 400): А - фрагмент пучка; Б - фрагмент со склеренхимой.

Обозначения: 1 - кутинизированный эпидермис; 2 - паренхима первичной коры; 3 - воздушные полости; 4 - склеренхима; 5 - сосуды ксилемы; 6 - флоэма; 7 - друзы.

500ит !ЙШ) ]

■ • •• У

1 3$ \ ** /

А А дакй

Б

Рисунок 21 - Особенности апикальной части черешка листа тополя черного: А - общий вид (х40); Б - складки паренхимы (х100).

Рисунок 22 - Особенности апикальной части черешка листа тополя краснонервного: А - фрагмент борта (х100); Б - складки паренхимы первичной коры; В - фрагмент с трихомами.

Обозначения: 1 -складки паренхимы; 2 - кутинизированный эпидермис; 3 - флоэма; 4 - ксилема; 5 - паренхима с полостями между пучков; 6 -простые волоски.

На срезах в апикальной части черешков тополя краснонервного и тополя черного выражены три округлых по форме коллатеральных пучка с бурой слабо-армированной флоэмой. В центре ксилемы имеется паренхима

нативно слабо-коричневого цвета (рис. 21А и 22А). Между пучками в черешке тополя краснонервного локализована паренхима с крупными рексигенными полостями (рис. 21А), в черешках тополя черного такой особенности не наблюдается.

3.3. Морфолого-анатомические особенности почек некоторых видов тополя

Известно, что род Тополь Populus насчитывает 110 видов, из которых 20 видов произрастает в средней полосе России. При этом фармакопейными являются 5 видов входящих в фармакопейную статью (ФС.2.5.0042.15) [24], а именно: т. черный - Populus nigra L., т. бальзамический - Populus balsamifera L., т. канадский - Populus canadensis Marsh., т. лавролистный - Populus laurifolia Ledeb., т. душистый - Populus suaveolens Fisch. [40, 116]. Остальные виды тополей рассматриваются рядом ученых как перспективные источники биологически активных соединений [32, 40, 116]. Однако, будучи неизученными, они в настоящее время считаются примесью к целевому сырью.

К таким видам можно отнести тополь дрожащий - Populus tremula L., тополь краснонервный - Populus rubrinervis Hont., тополь дельтовидный -Populus deltoids Mansh.

Объектом исследования служили почки тополя черного как основного объекта и почки близкородственных видов - тополя дрожащего, тополя дельтовидного, тополя краснонервного.

Почки сравниваемых видов, заготавливались в марте-апреле 2018 года на территории ботанического сада Самарского университета. Видовая специфичность подтверждалась на гербарных образцах из фонда кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета с помощью определителей [123].

Морфологический анализ проводили с помощью стереоскопического цифрового микроскопа марки Motic DM-39 на увеличениях кратностью х20 и

х40. Исследование морфологических особенностей проводили согласно общей фармакопейной статье «Почки» ОФС 1.5.1.0009.15 ГФ РФ XIV издания [24].

Сравнительный анализ показал, что форма почек у всех сравниваемых видов тополя приблизительно одинаковая, а именно вытянуто яйцевидная, слегка сгибающаяся ближе к верхушке почки (рис. 23).

Размеры почек являются более вариабельными и могут служить одним из основных отличительных критериев у различных видов тополя.

В изучаемой выборке размеры почек целевого вида (тополь черный) варьируют и достигают 25 мм в длину и 9 мм в ширину, что согласуется с требованиями ФС (рис. 23).

Рисунок 23 - Почки сравниваемых видов тополя: А - тополь краснонервный; Б - тополь черный; В - тополь дельтовидный; Г - тополь дрожащий.

В группе сравнения размеры почек варьируют. Наиболее крупными оказались почки тополя краснонервного. Почки этого вида в изучаемых выборках достигают в длину 34 мм и 10 мм в толщину (рис. 23 А).

Напротив, почки тополя дрожащего наиболее мелкие. В длину они достигают максимально 10 мм, в ширину 5 мм (рис 23 Г).

Размеры длины почек у тополя дельтовидного близки к размерам почек тополя чёрного, но почки этого вида меньшей толщины - до 7-8 мм (рис. 23 В).

Цвет почек оценивался согласно ФС для воздушно-сухого сырья. При этом важно отметить, что окраска поверхности почек в процессе сушки изменяется.

Цвет почек сравниваемых видов тополей находится в одном диапазоне светло-коричневого тона. Однако имеются некоторые устойчивые различия в цвете у почек сравниваемых видов.

Так, почки тополя краснонервного отличаются от сравниваемых видов наличием зелёного оттенка кроющих чешуй. В процессе сушки внутренние чешуи могут темнеть до оттенков от тёмно-коричневого до черного цвета, причем эта пигментация неоднородна и локализована в основном на верхушках почек, а в основании зелёная окраска часто сохраняется.

Почки тополя черного (целевой вид) имеют светло-коричневый цвет чешуй. На поверхности почек часто видны красно-коричневые фрагменты засохшей смолы.

Окраска почек тополя дельтовидного не отличается от таковой у почек тополя черного.

Почки тополя дрожащего окрашены в темно-коричневый цвет. По краю чешуи имеют светлую кромку, что дает характерную черепитчатую структуру поверхности, отличая почки данного вида от остальных почек сравниваемой группы видов.

Анализ структуры продольных сечений почек показал, что морфологически почки смешанные, то есть имеют генеративные (зачатки соцветия) и вегетативные (примордии) элементы.

Соцветия, формирующиеся внутри почек, - колосовидная кисть или серёжка: не отличаются по типу в почках всех видов растений.

В почках тополя дрожащего имеется выраженный морфологический признак, значительно отличающий их в группе сравнения от почек остальных видов. Это выраженное, беловойлочное опушение внутренних элементов почки - примордиев и соцветий.

Результаты анализа поперечных сечений почек, сравниваемых видов

тополя показали, что почкосложение, то есть расположение кроющих чешуй в почках тополя чёрного полуприкрывающего типа. При этом форма поперечного сечения почек округло-треугольная. Характер упаковки примордиев (зачатков листьев), то есть листосложение внутри почки, завёрнутого типа.

Сравнение почек примесных видов показало схожесть их почко- и листосложения, а также округло-треугольной формы поперечных сечений.

Все почки плотно сомкнутые. Необходимо отметить, что почки тополя дрожащего на поперечном сечении легко распадаются, что можно объяснить

отсутствием смолистости на кроющих чешуях. Поперечные сечения остальных почек из-за наличия смолистого выделения форму не теряют.

Таким образом, благодаря проведённому сравнительному морфологическому анализу почек тополя черного и примесных к нему видов были выявлены основные диагностические признаки сырья целевого вида растения (тополь черный). К наиболее диагностически значимым признакам можно отнести: размер почек; особенности окраски почечных чешуй; смолистость почек; опушение внутренних структур почки.

Остальные, возможные для анализа признаки в группе сравнения, являются, очевидно, общими для видов рода Populus и играют диагностическую роль только для отличия почек рода Тополь от почек растений других родов. К таким дополнительным признакам можно отнести: особенность соцветия почки; почкосложение; листосложение.

3.3.1. Особенности люминесценции тканей почек тополя черного (Populus nigra L.)

Выделенные ранее методом колоночной хроматографии СО из почек тополя черного (В.Б. Браславский, В.А. Куркин): пиностробин, салицин, кемпферол, рутин, кверцетин, использовались нами в качестве объектов сравнения [11].

Основными группами БАС почек тополя черного являются флаваноны (пиностробин), флавонолы (кемпферол, рутин, кверцетин) и простые фенолы (салицин).

На первом этапе люминесцентоного анализа почек тополя черного были проанализированы особенности люминесценции основных фенольных соединений: пиностробина, рутина, кемпферола, салицина, кверцетина (рис. 12)

С помощью миксокопа с люминесцентной насадкой при спектральном диапазоне возбуждения: желтый светофильтр - 360-400 нм и голубой светофильтр - 420-550 нм определяли основные фенолы почек тополя черного. На рисунке 12 представлены результаты люминесцентной микроскопии объектов сравнения.

Рисунок 24 - люминесцентная микроскопия тканей почек тополя черного на поперечном сечении.

Обозначения: 5 - внешняя чешуя почки, 5а - мезофилл кроющей чешуи УФ-360нм, 6 - внутренняя чешуя почки, 6а - внутренняя чешуя при дневном свете, 7 - мазок смолы почечной чешуи, 7а - мазок смолы почечной чешуи при дневном свете.

При проведении люминесцентного анализа стандартных объектов отмечено, что все фенольные соединения светятся в диапазоне возбуждения ультрафиолетового спектра при длине волны 360 нм (рис. 12). При этом кемпферол имеет темно-ранжевую люминесценцию, кверцетин - оранжево-

красную, пиностробин - светло-желтую, рутин - темно-красную, при этом наблюдается светло-желтое свечение вкраплений смеси никотифлорина [14]. Для анализируемых веществ обнаружено отсутствие свечения в диапазоне возбуждения ультрафиолетового спектра при длине волны 420 нм (видимая область спектра) (рис. 12).

На втором этапе был проведен люминесцентный анализ поперечных сечений почек тополя черного при тех же диапазонах возбуждения, что использовались нами при работе со стандартными образцами. На рисунке 24 представлены результаты люминесцентного анатомо-гистологического анализа почек тополя черного.

Изучение гистологических особенностей почек методом люминесцентной микроскопии позволило выявить, что активная люминесценция характерна в основном для тканей кроющих чешуй почки. При этом ткани зачатков листьев (примордиев) почек и их соцветия практически не светятся в анализируемых диапазонах возбуждения.