Фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Цибина Анастасия Сергеевна

• Цибина Анастасия Сергеевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Цибина Анастасия Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. МОНАРДА ДУЧДАТАЯ (MONARDA FISTULOSA L.) -ПЕРСПЕКТИВНЫЙ СЫРЬЕВОЙ ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Опыт применения тимолсодержащих растений

1.1.1. Тимьян обыкновенный

1.1.2. Тимьян ползучий или чабрец

1.1.3. Душица обыкновенная

1.2. Монарда дудчатая как перспективный источник БАС

1.2.1. Этимология названия монарды дудчатой

1.2.2. Ботаническое описание растения

1.2.4. Химический состав монарды дудчатой

1.2.5. Фармакологические свойства травы монарды дудчатой

1.2.6.Область применения травы монарды дудчатой

1.2.7. Проблемы стандартизации травы монарды дудчатой

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ I

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методики морфолого-анатомического анализа

2.2.2. Химические методы анализа

2.2.3. Физико-химические методы анализа

2.2.4. Микробиологические методы анализа

2.2.5. Технологические методы

2.2.6. Фармакологические методы анализа

2.2.7. Фармакогностические методы изучения показателей качества лекарсвтенного растительного сырья «Монарды дудчатой трава»

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАВЫ МОНАРДЫ ДУДЧАТОЙ И ВОЗМОЖНЫХ ПРИМЕСНЫХ ВИДОВ

3.1. Морфолого-анатомические особенности травы монарды дудчатой

3.2. Петиолярная анатомия монарды дудчатой

3.3. Люминесцентная микроскопия травы монарды дудчатой

3.4. Петиолярная анатомия некоторых представителей рода ЫвпаМа

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАВЫ МОНАРДЫ ДУДЧАТОЙ

4.1. Выделение индивидуальных веществ из травы монарды дудчатой

4.1.1. Исследование фракций, содержащих перспективные индивидуальные вещества, выделенные из травы монарды дудчатой

4.1.2. Идентификация выделенных веществ и их характеристики

4.1.3. Изучение химической структуры выделенных веществ

4.2. Изучение эфирного масла монарды дудчатой

4.2.1 Газожидкостная хроматография эфирного масла монарды дудчатой

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ТРАВЫ МОНАРДЫ ДУДЧАТОЙ

5.1. Предварительное фитохимическое исследование некоторых представителей рода Монарда

5.1.1. Качественный анализ сырья растений рода Монарда методом тонкослойной хроматографии

5.1.2. Исследование некоторых видов рода Монарда методом УФ-спектроскопии

5.2. Разработка методики качественного анализа травы монарды дудчатой

5.2.1. Качественный анализ методом тонкослойной хроматографии

5.2.2. Качественный анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

5.2.3. Качественный анализ методом УФ-спектроскопии

5.3. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой

5.4. Определение динамики накопления суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой

5.5. Числовые показатели для нового вида лекарственного растительного сырья «Монарды дудчатой трава»

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 6. ОБОСНОВАНИЕ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ И МЕТОДИК СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА «МОНАРДЫ ДУДЧАТОЙ ТРАВЫ НАСТОЙКА»

6.1. Разработка методик стандартизации настойки травы монарды дудчатой

6.1.1. Качественный анализ лекарственного растительного препарата «Монарды дудчатой травы настойка»

6.1.2. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в образцах настоек травы монарды дудчатой, полученных на спиртах различной концентрации

6.2. Изучение антимикробной активности настоек и настоя травы монарды дудчатой в отношении штаммов БигкЬоМвпа, выделенных от пациентов с муковисцидозом

6.3. Исследование влияния разработанного ЛРП на выделительную функцию почек

6.4. Изучение острой токсичности «Монарды дудчатой травы настойка»

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Акты о внедрении результатов диссертационного

исследования

Приложение 2. Патент на изобретение «Средство на основе травы монарды дудчатой, обладающее активностью в отношении штамма БыгкИоШвпа при

муковисцидозе»

Приложение 3. Патент на изобретение «Способ количественного пределения

суммы фдавоноидов в траве монарды дудчатой»

Приложение 4. Проект фармакопейной статьи на новый вид ЛРС «Монарды дудчатой трава»

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.)»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В соответствии с Приказом МЗ РФ от 13.02.2013 г. № 66 «Об утверждении Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 года», а также проектом распоряжения Правительства РФ «Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2030 года» («Фарма-2030») - важнейшим направлением является замещение импортных лекарственных средств (ЛС) отечественными аналогами;, кроме того, в задачи «Фарма-2030» входит увеличение экспорта российской фармацевтической продукции на внешние рынки, а также поиск новых источников действующих веществ и создание отечественных высокоэффективных инновационных ЛС.

В этой связи, актуальность приобретают лекарственные растительные препараты (ЛРП), которые становятся все более популярными и применяются как для лечения, так и для профилактики различных нозологий. Известно, что лекарственные препараты (ЛП) на растительной основе при рациональном использовании вызывают значительно меньше побочных эффектов, предотвращают быстрое формирование микробной резистентности и обладают широким спектром биологической активности (Бубенчикова В.Н. и др. 2013; Киселева Т.Л., 2010; Пупыкина К.А., Кудашкина Н.В., 2009). Особое место занимают ЛРП при лечении хронических заболеваний, когда приём лекарственных средств требует длительного применения (Куркин В.А., 2014, 2019; Самылина И.А., Куркин В.А. и др. 2016).

Одним из перспективных растительных объектов является трава монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.) семейства Яснотковые (Lamiaceae), родина монарды - Северная Америка, в тоже время на территории Российской Федерации монарда дудчатая успешно культивируется во многих регионах: Ставропольском крае, Республике Башкортостан, Республике Крым, Сибири, а также в Самарской области.

Трава монарды дудчатой отличается высоким содержанием эфирного масла - более 3,0%, компоненты которого (тимол, карвакрол) обусловливают высокую бактерицидную, фунгицидную, противовоспалительную и антигельминтную активность. Наряду с эфирным маслом растение содержит и другие ценные биологически активные соединения (БАС) - флавоноиды (флавоны, флавонолы, флаваноны, антоцианы), аскорбиновую кислоту, каротиноиды, витамины В1, В2, горечи, дубильные вещества, которые также вносят свой вклад в фармакологическое действие (Красюк Е.В., Пупыкина К.А., 2016).

Монарда является ценным растением, однако она пока не нашла широкого применения в научной медицине. На траву монарды дудчатой отсутствует фармакопейная статья (ФС) как в Российской Федерации (РФ), так и за рубежом. В Государственную фармакопею Российской Федерации XIV издания внесены такие виды эфиромасличного сырья, как тимьяна обыкновенного трава, тимьяна ползучего трава, душицы обыкновенной трава. Необходимо учесть, что трава монарды дудчатой обладает рядом преимуществ по сравнению с перечисленными растениями: высокий выход эфирного масла, большое количество фитомассы растения (достигает в высоту до 120 см), что значительно облегчает заготовку сырья и повышает возможность механизированной заготовки, возможность широкого культивирования на территории РФ.

Несмотря на имеющиеся в литературе данные относительно химического состава травы монарды дудчатой, имеются и некоторые противоречия, касающиеся флавоноидного состава сырья. Что, в свою очередь, приводит к появлению различных подходов к стандартизации: использование экстрагента различных концентраций для извлечения действующих веществ, отсутствие единообразия во времени экстракции, используемой длины волны и т.д. Это не позволяет успешно решать проблемы стандартизации и разработки рациональной технологии получения препаратов на основе данного сырья.

Анализ научной литературы демонстрирует перспективность создания лекарственных препаратов из сырья монарды дудчатой, однако в настоящее время препараты на ее основе на фармацевтическом рынке РФ отсутствуют. Разработка новых лекарственных средств на основе травы монарды дудчатой позволит расширить ассортимент отечественных препаратов, а также решить вопрос о возможности более широкого использования исследуемого растения.

Таким образом, актуальным вопросом является углубленное фармакогностическое исследование монарды дудчатой с целью научного обоснования целесообразности использования в медицинской и фармацевтической практике.

Степень разработанности темы. В настоящее время трава монарды дудчатой не внесена в отечественную фармакопею, в зарубежных фармакопеях сырье монарды так же отсутствует.

В отечественной и зарубежной литературе широко описывается компонентный состав эфирного масла монарды дудчатой. Однако, в виду того, что возможно использование сырья монарды дудчатой для получения водных, спиртовых, спирто-водных извлечений, экстрактов необходимо проводить стандартизацию и по веществам гидрофильной природы -флавоноидам. В РФ и за рубежом отсутствуют фармакопейные методики стандартизации для травы монарды дудчатой. Методики количественного анализа травы монарды дудчатой, предложенные отдельными авторами, различаются между собой как в плане экстрагента, времени экстракции, так и в плане используемой аналитической длины волны.

Учитывая тот факт, что род Монарда насчитывает около 20 видов, актуальным является вопрос определения подлинности растительного сырья. В настоящий момент в литературе содержатся данные морфолого-анатомического описания травы монарды дудчатой. Сотрудниками Никитского ботанического сада проведены исследования морфолого-анатомического строения листа, стебля, чашечки и венчика цветка монарды

дудчатой. Сравнительный морфологический анализ нескольких видов рода Монарда, культивируемых в Республике Башкортостан, проведен в Башкирском государственном медицинском университете. В зарубежных источниках приведены лишь морфологические особенности строения монарды дудчатой. Стоит заметить, что перспективным в плане определения подлинности травы являются не только результаты марфолого-анатомического и гистологического исследования стеблей, листьев и цветков, но и исследования петиолярной анатомии листьев. Литературный обзор показал отсутствие различных исследований анатомического строения черешка для листьев видов рода Монарда.

Изложенное свидетельствует о том, что исследования в области стандартизации лекарственного растительного сырья травы монарды дудчатой являются актуальными.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.) в плане обоснования использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья «Монарды дудчатой трава».

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование травы некоторых видов рода Монарды.

2. Изучение химического состава травы монарды дудчатой.

3. Изучение компонентного состава эфирного масла монарды дудчатой.

4. Сравнительное фитохимическое исследование монарды дудчатой и некоторых других видов рода Монарда.

5. Разработка методик качественного анализа для травы монарды дудчатой с использованием методов ТСХ, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ.

6. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии.

7. Изучение и разработка нормируемых показателей качества нового вида ЛРС «Монарды дудчатой трава».

8. Обоснование способа получения лекарственного препарата «Монарды дудчатой травы настойка».

9. Сравнительное изучение антимикробной и диуретической активности экстракционных препаратов на основе травы монарды дудчатой.

10. Разработка методик качественного и количественного анализа лекарственного препарата «Монарды дудчатой травы настойка».

11.Разработка проекта фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья - «Монарды дудчатой трава». Научная новизна. Впервые проведено исследование черешков листьев

монарды дудчатой и возможных примесных видов рода Монарда. Определено, что наиболее значимыми в диагностике травы монарды дудчатой являются очертания поперечных сечений черешков листьев в их базальной части. Проведено исследование травы монарды дудчатой с применением метода люминесцентной микроскопии, результаты которого позволили объяснить взаимосвязь характера свечения с компонентным составом сырья.

В ходе изучения химического состава травы монарды дудчатой впервые был выделен флавоноид - 5-О-рутинозид апигенина, являющийся новым природным соединением, названным нами монардозидом, для которого установлено химическое строение. Впервые для монарды дудчатой выделены и идентифицированы: изороифолин (7-О-рутинозид апигенина), линарин (7-О-рутинозид акацетина) и дидимин (7-О-рутинозид изосакуранетина), апигенин и акацетин. Линарин и дидимин ранее выделялись из других видов рода Монарда, а именно монарды двойчатой. Из

всех перечисленных флавоноидв ранее из рода Монарда, а именно из монарды двойчатой, были выделены только линарин и дидимин.

Показана целесообразность проведения стандартизации травы монарды дудчатой не только по ведущей группе биологически активных веществ -эфирному маслу, но и по флавоноидам. Качественный анализ предложено проводить с помощью метода тонкослойной хроматографии с использованием стандартного образца тимола, а также определение отношения коэффициентов удерживания пятна, соответствующего изороифолину, к коэффициенту удерживания пятна, соответствующего рутину. Предложено применение метода ВЭЖХ для качественного анализа травы монарды дудчатой.

В ходе диссертационного исследования впервые разработана методика количественного определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на диагностически значимый флавоноид изороифолин при аналитической длине волны 394 нм.

Обоснована целесообразность использования в фармацевтической практике нового вида лекарственного растительного сырья «Монарды дудчатой трава», на который разработан проект фармакопейной статьи.

Обоснован способ получения лекарственного препарата на основе травы монарды дудчатой - «Монарды дудчатой травы настойки», для которого доказано наличие и бактериостатического действия в отношении штамма Burkholderia у пациентов с диагнозом муковисцидоз. Кроме того, доказано влияние разработанного ЛРП на экскреторную функцию почек.

Научная новизна данного исследования подтверждена патентами Российской Федерации на изобретение № 2695663 «Средство на основе травы монарды дудчатой, обладающее активностью в отношении штамма Burkholderia при муковисцидозе» (заявка № 2019112568, от 24.04.2019 г., дата регистрации 25.07.2019) и № 2696770 «Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой» (заявка № 2018139596 от 08.11.2018 г., решение о выдачи патента 06.08.2019 г.).

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны методики для качественного и количественного анализа флавоноидов травы монарды дудчатой методами тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и дифференциальной спектрофотометрии. Предложенный качественный анализ методом ТСХ предполагает использование стандартных образцов тимола и рутина. Для качественного определения доминирующего флавоноида монарды дудчатой -изороифолина - введена величина Я^. Количественную оценку содержания суммы флавоноидов предлагается проводить методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на доминирующий флавоноид изороифолин при аналитической длине волны 394 нм.

Разработаны числовые показатели качества травы монарды дудчатой, включая содержания суммы флавоноидов в пересчете на изороифолин не менее 3,0 %. Разработан проект фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья - «Монарды дудчатой трава».

Определено, что монарда дудчатая является перспективным растением, сырье которого может быть использовано для разработки и создания ЛРП.

Выявлено наличие диуретической и бактериостатической активности в отношении клинических штаммов БигкЬоМвпа, выделенных от пациентов с муковисцидозом, для нового ЛРП «Монарды дудчатой травы настойка».

Разработан раздел «Микроскопия» для проекта ФС на новый вид лекарственного растительного сырья «Монарды дудчатой трава».

Результаты, полученные в ходе проведения диссертационного исследования, применяются в научном и учебном процессе в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России: на кафедре фармацевтической технологии, кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, кафедре управления и экономики фармации, кафедре химии фармацевтического факультета, в производственном процессе на ЗАО «Самаралектравы», в рабочем процессе в ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области» и ООО «Самарская фармацевтическая фабрика».

Методология и методы исследования. Методология диссертационной работы основана на изучении и системном обобщении литературных источников в области фармакогностического исследования монарды дудчатой, оценки актуальности работы и степени разработки темы исследования. Учитывая поставленную цель и задачи, был разработан план выполнения диссертационного исследования, выбраны объекты и методы исследования.

Объектами диссертационного исследования выступала трава монарды дудчатой, монарды двойчатой, монарды хаотической, монарды серединной и монарды лимонной, интродуцируемые в Самарской области, а также трава монарды дудчатой, культивируемой в Республике Крым. Трава монарды была заготовлена в Ботаническом саду Самарского университета и в Никитском ботаническом саду. Кроме того, использовались водно-спиртовые извлечения, полученные на основе травы монарды дудчатой и других видов рода Монарда. Данное исследование проводили с использованием цифровой и люминесцентной микроскопии, тонкослойной хроматографии, УФ-спектрометрии, масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, колоночной хроматографии, пробирочных и гистохимических реакций, фармакологических и микробиологических методов. Математическую обработку осуществляли с применением программного обеспечения в соответствии с ГФ РФ XIV издания.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнялась согласно тематическому плану научно -исследовательских работ ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (№ Гос. регистрации 115042810034 до 14.05.2019, наименование НИОКР -«Комплексные исследования по разработке лекарственных средств природного и синтетического происхождения»; с 14.05.2019 № Гос. регистрации АААА-А19-119051490148-7 наименование НИОКР - «Химико-фармацевтические, биотехнологические, фармакологические и

организационно-экономические исследования по разработке, анализу и применению фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов»).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Результаты морфолого-анатомического исследования травы монарды дудчатой, особенности петиолярных признаков, а также особенности люминесценции тканей.

2. Результаты исследования химического состава травы монарды дудчатой, включая выделение индивидуальных веществ и их структурный анализ.

3. Данные по исследованию компонентного состава эфирного масла монарды дудчатой.

4. Результаты исследования методом ТСХ и спектрофотомерии некоторых видов рода Монарда.

5. Результаты исследований по разработке методик качественного анализа травы монарды дудчатой (ТСХ и УФ-спектроскопия).

6. Результаты исследования по разработке методик количественного определения содержания суммы флвоноидов в траве монарды дудчатой (дифференциальная спектрофотометрия).

7. Данные по разработке нормируемых показателей качества травы монарды дудчатой.

8. Результаты исследования качественного и количественного исследования образцов настоек травы монарды дудчатой на спиртах различной концентрации.

9. Результаты сравнительного исследования микробиологической активности настоя и настоек на основе травы монарды дудчатой в отношении штаммов БиткЬоМвпа, выделенных от пациентов с муковисцидозом.

10. Результаты исследования диуретической активности препарата «Монарды дудчатой травы настойка» на основе монарды дудчатой.

11. Результаты исследования по разработке проекта ФС на новый вид

лекарственного растительного сырья «Монарды дудчатой трава».

Степень достоверности. Достоверность диссертационной работы подтверждена экспериментальными данными, полученными с использованием цифровой и люминесцентной микроскопии, колоночной хроматографии, тонкослойной хроматографии, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, хромато-масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, химических, фармакологических и микробиологических методов анализа.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на областных, российских и международных конференциях: Международной научно-практической конференции «Ароматические и лекарственные растения: интродукция, селекция, агротехника, биологически активные вещества, влияние на человека» (Ялта, 2018 г,); на конференциях «Аспирантские чтения» (г. Самара, 2017; 2018; 2019 гг.); на II, IV Межвузовской студенческой научно-практической конференции «Фармацевтическая ботаника: современность и перспективы» (г. Самара, 2017, 2019 гг.); на II Межвузовской студенческой научно-практической конференции «Современные проблемы фармакогнозии» (г. Самара, 2017 г.); на III Межвузовской студенческой научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы фармакогнозии» (г. Самара, 2018 г.); на X Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 2018 г.); на Международной научной конференции «Перспективы лекарственного растениеведения» (г. Москва, 2018); на Международной конференции, посвященной 60-летию фармацевтического факультета учреждения образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (г. Витебск, 2019).

Публикации. По теме исследования опубликовано 23 печатные работы, из них 5 статей, в журналах, рекомендуемых ВАК Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, получено 2 патента Российской Федерации на изобретение.

Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в учебном и научном процессах ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России на кафедре фармацевтической технологии, кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, кафедре управления и экономики фармации, кафедре химии фармацевтического факультета, в производственном процессе на ЗАО «Самаралектравы», в рабочем процессе в ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», а также на производстве ООО «Самарская фармацевтическая фабрика».

Личный вклад автора. Все описанные в диссертационной работе результаты исследований получены автором. Автором проведено исследование морфолого-анатомическое исследование травы монарды дудчатой, в том числе выполнена работа по изучению петиолярной анатомии листьев травы монарды дудчатой и других видов. Автором выявлены характерные диагностические признаки изучаемого вида, заключающиеся в характере опушения чашечки, форме поперечного среза черешка в его базальной части, наличие в тканях завязи, столбика и рыльца и в тканях проводящего пучка черешка кристаллического включения. Выявлены характерные особенности свечения тканей монарды дудчатой и объяснена связь свечения с содержанием основных действующих веществ.

Проведено исследование фитохимического состава травы монарды дудчатой, методом колоночной хроматографии, выделено и идентифицировано 9 индивидуальных соединений, в том числе 6 флавноидов. Установлено, что флавоноид монардозид - новое природное соединение, выделенное впервые. Линарин и дидимини, которые известны в литературе для травы монарды двойчатой, автором впервые были из травы

монарды дудчатой. Флавоноиды - изороифолин, апигенин и акацетин впервые выделены как из рода Монарда, так и из травы монарды дудчатой. Автором разработаны и обоснованы методики качественного анализа сырья и количественного определения флавоноидов в траве монарды дудчатой. Для целей качественного и количественного определения флавоноидов в траве монарды дудчатой рекомендованы методы ТСХ, ВЭЖХ анализ и УФ-спектроскопии. Изучена антимикробная активность настоек на основе травы монарды дудчатой в отношении штаммов Burkholderia. Проведено определение острой токсичности нового лекарственного растительного препарата «Монарды дудчатой травы настойка». Разработан проект фармакопейной статьи на новый вид лекарственного растительного сырья -«Монарды дудчатой трава».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Основные положения, описанные в диссертационном исследовании, соответствуют паспорту научной специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки) по пунктам: 2 - «Формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств»; 3 - «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления»; 5 - «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье»; 6 - «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе».

Объем и структура работы. Диссертационная работа описана на 209 страницах машинописного текста. Результаты исследования изложены в

форме 20 таблиц и 59 рисунков. Данная работа включает в себя введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, четыре главы, включающие результаты исследований, выводы и заключение, список литературы, который состоит из 167 источников, 38 из которых - на иностранном языке, а также приложения.

Во введении описаны актуальность, цели и задачи исследования, научная новизна, степень разработанности темы и практическая значимость, основные положения, выносимые на защиту, сведения о публикациях и апробации работы.

Глава 1 содержит обзор литературных данных отечественных и зарубежных авторов в области фармакогностических исследований тимолсодержащих растений. В данной главе приведены имеющиеся сведения морфолого-анатомического строения травы монарды дудчатой. В главе подробно описаны данные о химическом составе, методиках качественного и количественного анализа травы монарды дудчатой. Кроме того, в данной главе представлена информация о фармакологических свойствах травы монарды дудчатой, а также о применении травы монарды дудчатой в официальной и народной медицине.

В главе 2 приведено описание объектов и методов исследования. Глава включает методики анатомо-морфологической, химической и физико-химической идентификации лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также методики количественного определения содержания БАС в траве монарды дудчатой.

В главе 3 представлены результаты морфолого-анатомического исследования, в том числе петиолярной анатомии травы монарды дудчатой. Кроме того, в главе описаны особенности люминесценции тканей изучаемого растения. В главе также приведены исследования петиолярной анатомии возможных примесных видов рода Монарда.

В главе 4 приведены результаты выделения индивидуальных соединений (флавоноидов и монотерпеновых фенолов) из травы монарды

дудчатой, данные по изучению их химического строения. В главе приводятся результаты получения и газожидкостной хроматографии эфирного масла монарды дудчатой.

Глава 5 содержит результаты сравнительного фитохимического исследования некоторых представителей рода Монарда. Кроме того, в главе отражены результаты разработки методик качественного и количественного анализа травы монарды дудчатой, описано определение динамики накопления суммы флавоноидов в сырье, а также приведены рекомендуемые числовые показатели сырья, включенные в проект ФС на новый вид ЛРС «Монарды дудчатой трава».

Глава 6 включает результаты исследования антибактериальной активности настоек на 40%, 70%, 96% спирте этиловом и настоя на основе травы монарды дудчатой в отношении клинических штаммов БигккоМвпа, выделенных от пациентов с муковисцидозом, а также диуретической активности и острой токсичности ЛРП «Монарды дудчатой травы настойка».

Диссертация завершается заключением, практическими рекомендациями, перспективами дальнейшей разработки и списком литературы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Цибина Анастасия Сергеевна, 2020 год

- 22 с.

124. Шорин, Н.В. Интродукция перспективного эфиромасличного вида Монарды двойчатой (Monarda didma L.) в условиях Омского Прииртышья / Н.В. Шорин, А.Н. Крикливая // Агрометеорология и сельское хозяйство: история, значение и перспективы: сборник материалов Национальной (Всероссийской) науч. -практич. конференции, повящ. 100-летнему юбилею со дня образования учебной лаборатории Агрометеорологии ФГБОУ ВО Омский ГАУ.

- Омск: ФГБОУ ВО Омский ГАУ, 2016. - С. 16-21

125. Шутова Т.Г. Ингибирование окисления эмульсий ненасыщенных жирных кислот эфирными маслами монарды дудчатой и тысячелистника обыкновенного / Т.Г. Шутова, А.Г. Шутова, Л.Р. Варданян, и др. // Труды БГУ. - 2013. - Т. 8 (1). - С. 111-116.

126. Эседов, Э.М. Муковисцидоз - актуальная проблема медицины / Э.М. Эседов, Г.А. Гаджимирзаев, Ф.Д. Ахмедова и др. // Вестник оториноларингологии. - 2016. - Т. 81, № 5. - С. 15-18.

127. Янченко, И.А. Продуктивность сортов монарды двойчатой (Monarda didyma) в первый год вегетации в условиях южной степи Украины / И.А. Янченко, О.А. Кораблева // Лекарственные растения: фундаментальные и прикладные проблемы: Материалы II Международной научной конференции. - Новосибирск: Новосибирский государственный аграрный университет, 2015. - С. 172-175.

128. Яшкин, С.Н. Метод структурной аналогии в бесстандартной идентификации изомерных фенолов в экстракте эфирного масла монарды дудчатой (Monarda fistulosa) / С.Н. Яшкин, Ю.А. Агеева // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2013. - Т. 13, № 2.

- С. 173-181.

129. Aksit, H. ^mplete isolation and characterization of polar portion of Mentha dumetorum water extract / H. Aksit, S.M.Qelik, O. Sen, R. Erenler, I. Demirtas, I. Telci, M. Elmastas //.Records of Natural Products.

- 2014. - Vol. 8, No. 3. - P. 277-280.

130. Azimova, S.S. Natural Compounds: Flavonoids / S.S. Azimova, V.I. Vinogradova. - Tashkent: Springer, 2012. -661 p.

131. Borosa B. Determination of polyphenolic compounds by liquid chromatography-mass spectrometry in Thymus species / B. Borosa, S. Jakabova, A. Dornyei, G. Horvath, Z. Pluhar, F. Kilar, A. Felinger // Journal of Chromatography A. - 2010. - Vol. 1217, No. 51. - P. 7972 -7980.

132. Carron, C.-A. Monarda fistulosa, a natural source of geraniol, rosmarinic acid and flavonoids / C.-A. Carron // Revue suisse de viticulture, arboriculture, horticulture (Switzerland). - 2009. - Vol. 39, No. 4. - P. 229 -235.

133. Catty, S. Treating otitis media in children and infants / S. Catty // International Journal of Aromatherapy. - 2005. - Vol. 15, No. 4. - P. 193-198.

134. Davies, A.J. Separation and characterization of anthocyanins of Monarda fistulosa by high-performance liquid chromatography / A.J. Davies, G. Mazza // Journal of agricultural and food chemistry (USA). -1994. - Vol. 40, No.8. - P. 1341-1345.

135. Drew, B.T. Amphitropical disjunctions in New World Menthinae: Three Pliocene dispersals to South America following late Miocene dispersal to North America from the Old World / B.T. Drew, S. Liu, J.M. Bonifacino, K. J. Sytsma // American Journal of Botany. - 2017. - Vol. 104, No. 11.- P. 1695-1707 https://doi.org/10.3732/ajb.1700225

136. Duke, J. A. Handbook of phytochemical constituent grass, herbs and other economic plants / J. A. Duke. - United States of America: CRC Press, 2000. - 676 p.

137. Gill, L.S. A Cytosystematics Study of the Genus Monarda L. (Labiatae) in Canada / L.S. Gill // Caryologia. - 1977. - Vol. 30, No.4. -P. 381-394.

138. Gulluce, M. Isolation of some active compounds from Origanum vulgare L. ssp. vulgare and determination of their genotoxic potentials / M. Gulluce, M. Karadayi, Z. Guvenalp, H. Ozbek, T. Arasoglu, O. Baris // Food Chemistry. - 2012. - Vol. 130, No. 2. - P. 248-253.

139. Hana, B.-X. Acacetin-7-rutinoside from Buddleja lindleyana, a New Molluscicidal Agent against Oncomelania hupensis / B.-X. Hana, J. Chen // Zeitschrift fur Naturforschung C. - 2014. - No. 69 (5-6). - P. 186-190.

140. Heinrich, G. Fine structure and the essential oil of a certain type of gland hair in Monarda fistulosa / G. Heinrich // Biochemie und Physiologie der Pflanzen. - 1977 - Vol. 171, No. 1. - P. 17-24

141. Hörhammer, L. Linarin aus dem kraut von Monarda didyma / L. Hörhammer, G. Aurnhammer, H. Wagner // Phytochemistry. - 1970. -Vol. 9, No. 4 - P. 899.

142. Jovanovica, A. Optimization of the extraction process of polyphenols from Thymus serpyllum L. herb using maceration, heat- and ultrasound-

assisted techniques / V.B. Dordevic, G.M. Zdunic, D.S. Pljevljakusic, K.P. Savikin, D.M. Godevac, B.M. Bugarski // Separation and Purification Technology. - 2017. - Vol. 179. - P.369-380.

143. Keefover-Ring, Kenneth Michael. One chemistry, two continents: Function and maintenance of chemical polymorphism in the mint family (Lamiaceae).University of Colorado at Boulder, ProQuest Dissertations Publishing, 2008. 3303896. https://search.proquest.com/openview/c8869adbf80c3290348bf54f55b14 780/1?pq-origsite=gscholar&cbl=18750&diss=y

144. Kremers, E. A survey of the inorganic constituents of the several parts of Monarda fistulosa / E. Kremers, A. A. Harwood // The Journal of the American Pharmaceutical Association. - 1912. - Vol. 20, No. 12. - P. 1268-1272.

145. Laquale, S. Nematotoxic activity of essential oils from Monarda species / S. Laquale, P. Avato, M. P. Argentieri, M. G. Bellardi, T. D'Addabbo // Journal of Pest Science. - 2018. - Vol. 91, No. 3. -P. 1115-1125.

146. Linnaei, С. Species plantarum :exhibentes plantas rite cognitas, ad genera relatas, cum differentiis specificis, nominibus trivialibus, synonymis selectis, locis natalibus, secundum systema sexuale digestas... Режим доступа: https://www.biodiversitylibrary.org/page/358043#page/34/mode/1up https://doi.org/10.5962/bhl.title.669

147. Mabry, T.J. The Systematic Identification of Flavonoids / T.J.Mabry, K.R. Markham, M.B. Thomas. - Berlin-H144eidelberg-New York: Springer Verlag. - 1970. - 354 p.

148. Marchese, A. Antibacterial and antifungal activities of thymol: A brief review of the literature / A. Marchese, I.E. Orhan, M. Daglia, R. Barbieri, A. Di Lorenzo, SF. Nabavi, O. Gortzi, M. Izadi, SM. Nabavi // Food Chem. - 2016. - Vol. 1, No. 210. - P. 402-414.

149. Monarda fistulosa. Missouri Botanical garden. [Электронный ресурс] URL: http://www.missouribotanicalgarden.org/PlantFinder/PlantFinderDetails. aspx?kempercode=g560 - 10.08.2019 .

150. Monarda fistulosa. Prairie moon nursery. [Электронный ресурс] URL: https://www.prairiemoon.com/monarda-fistulosa-wild-bergamot-prairie-moon-nursery.html - 10.08.2019

151. Pang, J. Thymoquinone exerts potent growth-suppressive activity on leukemia through DNA hypermethylation reversal in leukemia cells / J. Pang, N. Shen, F. Yan, N. Zhao, L. Dou, LC. Wu, C. L. Seiler, L.Yu, K.Yang, V. Bachanova, E. Weaver, N.Y. Tretyakova, S. Liu // Oncotarget. - 2017. - Vol. 8, (No. 21). - Р. 34453-34467.

152. Rang, K.H. The Corolla of Monarda fistulosa L. / K.H. Rang, // The Journal of the American Pharmaceutical Association (1912). - 1928. -Vol. 17, No. 6. - P. 525-527.

153. Salem, L.M. Immunomodulatory and therapeutic properties of the Nigella sativa L. seed / L.M. Salem, // International Immunopharmacology. - 2005. - Vol. 5. - P. 1749-1770.

154. Scora, R.W. Isolation and identification of alkanes from three taxa of Monarda. / R.W. Scora, W. Tin. // Phytochemistry. - 1971. - Vol. 10, No. 2. - P. 462-464.

155. Scora, R.W. Study of the essential leaf oils of the genus Monarda (Labiatae) / R.W. Scora // American Journal of Botany. - 1967. - Vol. 54, No. 4. - P. 446-452.

156. Sovova, H. Supercritical CO2 extraction of volatile thymoquinone from Monarda didyma and M. fistulosa herbs / H. Sovova, M. Sajfrtova, M. Topiar. // Supercritical fluids. - 2015. - Vol. 105. - P. 29-34.

157. Stevens, O.A. Notes on the distribution and growth of North Dakota cuscutae / O.A. Stevens // Americal Journal of Botany. - 1916. - Vol 3, No. 4. - P. 185-188. https://doi.org/10.1002/j.1537-2197.1916.tb05409.x

158. The Dispensatory of the United States of America Twentieth Edition / Edited by Joseph P. Remington, Horatio C. Woods and others. -Philadelphia: Lippincott, 1918. - 1576 p.

159. Wagner, H. Structure clarification and synthesis of didymin, an isosakuranetin-7-beta-rutinoside from Monarda didyma L. / H. Wagner, L. Hörhammer, G. Aurnhammer, L. Farkas // Chem Ber. - 1968. - Vol. 101, No. 2. - P. 445-449.

160. Wagner, H. Strukturaufklärung von didymin, einem isosakuranetin-rutinosid aus Monarda didyma L. / H. Wagner, L. Hörhammer, G. Aurnhammer, L. Farkas // Tetrahedron Letters. - 1967. - Vol. 8, No. 19. - P. 1837-1839.

161. Whitten, W.M. Pollination ecology of Monarda didyma, M. clinopodia, and hybrids (Lamiaceae) in the southern appalachian mountains / W.M. Whitten, // American Journal of Botany. - 1981. -Vol. 68, No. 3. - P. 435-442. https://doi.org/10.1002/j.1537-2197.1981.tb06382.x

162. Wild bergamot (Monarda fistulosa L.). United States Department of Agriculture Natural Resourced Conswevation Service. URL: https://plants.usda.gov/plantguide/pdf/cs mofi.pdf- 20.08.2019

163. Wild bergamot (Monarda fistulosa). Verginia Native Plant Society. URL: https://vnps.org/wildflowers-of-the-year/1993-wild-bergamot-monarda-fistulosa/ - 15.08.2019

164. Wu, Z.Y. Flora of China / Z.Y. Wu, P.H. Raven, D.Y. Hong. -Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press (St. Louis), 2007 - Vol. 13. [Электронный ресурс]: URL: http://flora.huh.harvard.edu/china/mss/Vol.13/index.htm - 28.02.2019.

165. Yamada, K. A lipase inhibitor monoterpene and monoterpene glycosides from Monarda punctate / K. Yamada, T. Murata, K. Kobayashi, M. Toshio, Y. Fumihiko. // Phytochemistry. - 2010. - Vol. 71, No. 16. - P. 1884-1891.

166. Zamureenko, V.A. Investigation of the component composition of the essential oil of Monarda fistulosa / V.A. Zamureenko, N.A. Klyuev, B.V. Bocharov, V.S. Kabanov, A.M.N. Zakharov // Chemistry of Natural Compounds. - 1989. - Vol. 25, No. 5. - P. 549-551.

167. Zarivna, N.O. Standardization of liquid wild thyme extract / N.O. Zarivna, L.V. Vronska // Украшський бюфармацевтичний журнал. -2012. - No. 5-6. - P. 108-112.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Акты о внедрении результатов диссертационного

исследования

«Утверждаю»

Генеральный директор

Н.Д. ЛУЖНОВ ¿_ 2019 г.

АКТ

о внедрении результатов диссертационной работы Лапиной Анастасии Сергеевны «Фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monardafistulo.su Ь.)» на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.04.02 -

Комиссия в составе сотрудников ЗАО «Самаралектравы» зав. производством BAO «Самаралектравы» А.Н. Загорянского. главного инженера A.B. Никитенкова подтверждает использование материалов диссертационного исследования Лапиной A.C.. посвященного исследованию химического состава, а также разработке методик сырья монарды дудчатой, определению диагностических признаков и обоснованию подходов к стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья - «Монарды дудчатой трава» и лекарственного растительного препарата - «Монарды дудчатой гравы настойка» в работе предприятия.

Разработанные методики качественного и количественного анализа травы монарды дудчатой апробированы в процессе работы предприятия. Внедренные результаты способствуют повышению объективности стандартизации сырья и лекарственных препаратов на основе монарды дудчатой.

Члены комиссии:

Заведующий производством ЗАО «Самаралектравы» А.Н. ЗАГОРЯНС'КИЙ

Главный инженер ЗАО «Самаралектравы» ^ A.B. НИКИТЕНКОВ

446554, Самарская обл.. Сергиевский район, с. Антоновка, ул. Полевая, д. 19А

«Фармацевтическая химия, фармакогнозия» в ЗАО «Самаралектравы»

«Утверждаю»

Начальник центра ГБУЗ «Цеятртсспнроля качества йкарственны* средств

/ ' Р \ - А\ г

' «оитсол, г\\

Самарской области»

€ nil

¿L_J.i О/.в. ОСИПОВА

>> .-¿Яг^

2019 г.

АКТ

о внедрении результатов диссертационной работы Лапиной Анастасии Сергеевны «Фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monardafistulosa L.) на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки) в ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области»

Комиссия в составе сотрудников ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области» заместителя начальника центра Жнякиной Л.Е.. провизора-аналитика Власовой Г.И., провизора-аналитика Мироновой Е.Е. подтверждает использование материалов диссертационного исследования Лапиной A.C., посвященного фармакогностическому исследованию травы монарды дудчатой при анализе лекарственного растительного сырья и препаратов на её основе. Разработанные методики качественного и количественного анализа апробированы в процессе работы Центра. В основе разработанных методик лежат методологические подходы, предусматривающие использование ТСХ и УФ-спектроскопии в присутствии СО тимола. СО рутина. СО изороифолина. Методики определения подлинности сырья и препаратов травы монарды дудчатой, а также методики определения суммы флавоноидов в сырье монарды воспроизводимы и удобны в работе.

Таким образом, внедрение результатов диссертационного исследования Лапиной A.C. будет способствовать повышению объективности стандартизации лекарственного растительного сырья монарды дудчатой, а также лекарственных препаратов на основе данного вида сырья.

Члены комиссии:

Заместитель начальника ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», кандидат фармацевтических наук

Провизор-аналитик ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области»

Провизор-аналитик ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области»

Mad

JI.E. ЖНЯКИНА

Г.И. ВЛАСОВА

Е.Е. МИРОНОВА

443070. г. Самара, ул. Партизанская, л. 33

«Утверждаю» Проректор по научной работе ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, лауреат премии Правительства РФ, доктор медицинских наук, профессор*^) ¡I

___{ П^ И.Л. Давыдкин

ноября 2019 г.

акт

о внедрении результатов диссертационной работы Цибиной Анастасии Сергеевны «Фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monardafistulosa L.)» на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.04.07 - «Фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки) на кафедре химии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Комиссия в составе сотрудников кафедры химии фармацевтического факультета: зав. кафедрой химии фармацевтическою факультета, к. фарм.н.. доцента А.В. Воронина доцента, к.х.н. С.Х. Шариповой. доцента, к.б.н. Н.В. Расцветовой подтверждает использование материалов диссертационного исследования Цибиной А.С., посвященного изучению химического состава, определению диагностических признаков и обоснованию подходов к стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов, монарды дудчатой, в учебном процессе при проведении практических занятий со студентами, а также в научно-исследовательской работе в области изучения лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды.

Внедренные результаты способствуют повышению объективности стандартизации лекарственных препаратов на основе монарды дудчатой.

Члены комиссии:

Зав. кафедрой химии фармацевтического факультета, к. фарм. н., доцент

Доцент кафедры химии фармацевтического факультета, к. х. н., доцент

Доцент кафедры химии фармацевтического факультета.

к. б. н.. доцент ' '/h:jl\. ! Н.В. РАСЦВЕТОВА

443099, г. Самара, ул. Чапаевская, д. 89

УТВЕРЖДАЮ

Генеральный директор ООО «Самарская фармацевтическая

АКТ ВНЕДРЕНИ

Ф

результатов диссертационной работы Цибиной Анастасии Сергеевны «Фармакогностическое исследование травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.)» на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук по специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки) в ООО «Самарская фармацевтическая фабрика»

Результаты диссертационной работы Цибиной А.С., посвященные исследованию химического состава, а также разработке методик анализа сырья монарды дудчатой, обоснованию подходов к стандартизации нового вида

\

лекарственного растительного сырья - «Монарды дудчатой трава» и лекарственного растительного препарата - «Монарды дудчатой травы настойка», используются в условиях производства ООО «Самарская фармацевтическая фабрика».

Внедренные результаты способствуют научному обоснованию целесообразности использования нового вида лекарственного растительного сырья на основе травы монарды дудчатой, а также созданию импортозамещающих растительных лекарственных препаратов на основе данного вида сырья.

Приложение 2. Патент на изобретение «Средство на основе травы монарды дудчатой, обладающее активностью в отношении штамма БыгккоМепа при муковисцидозе»

Приложение 3. Патент на изобретение «Способ количественного пределения суммы фдавоноидов в траве монарды дудчатой»

Приложение 4. Проект фармакопейной статьи на новый вид ЛРС

«Монарды дудчатой трава»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УТВЕРЖДАЮ

Директор Центра фармакопеи и международного сотрудничества

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», доктор фармацевтических наук, профессор

_Е.И. САКАНЯН

« » 20 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Организация-разработчик: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Монарды дудчатой трава ФС.2.5. .

Вводится впервые

МвпаМав ^Ывзав ИвтЪа_

Срок введения установлен

с «__ » ____________20___г.

до «__ » ___________20___ г

Собранная в фазу цветения и высушенная трава многолетненго культивируемого многолетнего растения монарды дудчатой - Monarda

fistulosa L., сем. яснотковые - Lamiaceae._

ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА

ПОДЛИННОСТЬ

Внешние признаки. Сырье изучается невооруженным глазом, с помощью лупы (х10) или под микроскопом (8х, 16х, 20х, 40х) в соответствии с разделом «Методы анализа лекарственного растительного сырья» (ГФ РФ XIV издания).

Цельное сырье

Цельные или частично измельченные цветоносы, олиствененные стебли до 20 см. Листья супротивные, черешковые, ближе к верхушке стебля коротко-черешковые, узко-яйцевидные, с остро-клиновидной верхушкой и сдвинутым, неравнобоким основанием, каждый с двумя крпными прилистниками, край листа пильчатый, жилкование листа пересто-дуговое.

Стебли четырехгранные, слабо опушенные, прямостоячие. Соцветие соцветие типа головка. Цветки мелкие 1,5 - 3 см, зигоморфные с двойным околоцветником, чашечка пяти зубчатая. Венчик спайнолепестный, трубчато-двугубый, с длинной трубкой и характерным двугубым отгибом. Верхняя губа венчика плоская, цельнокрайняя; нижняя отогнутая, трехлопастная. На верхней губе венчика, образованной двумя сросшимися лепестками, расположены три жилки проводящих тканей. На нижней губе венчика, состоящей из трех сросшихся членов, видны восемь жилок. Трубка венчика тонкая больше, чем на половину, погружена в чашечку до её расширения к отгибу. Венчик опушен. Чашечка крупная, сростнолистная с короткими, оттянутыми, клиновидно-заостренными зубцами.

Цвет листьев с верхней стороны темно-зеленый, с нижней стороны -светло-зеленый, стеблей - желто-зеленый, чашечки - зеленый; венчика -розовый, ярко-окрашенный. Запах ароматный. Вкус водного извлечения пряный.

Измельченное сырье

Кусочки стеблей, листьев, а также цветков, проходящие сквозь сито с отверстиями 1 мм.

ФС 42-_с.3

Цвет листьев с верхней стороны темно-зеленый, с нижней стороны -светло-зеленый, стеблей - желто-зеленый, чашечки - зеленый; венчика -розовый.

Микроскопические признаки. Сырье исследуется с помощью микроскопа (40х, 100*, 400*) в соответствии с разделом «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ РФ XIV издания).

Цельное сырье

При рассмотрении микропрепаратов с поверхности должны быть видны клетки эпидермиса с сильно извилистыми стенками. Устьичные аппараты диацитного типа и расположены с обеих сторон листовой пластинки. Трихомы трех типов. Основную часть опушения образуют простые одно- и многоклеточные волоски с утолщенными целлюлозными клеточными стенками. Снаружи волоски покрыты бородавчатой кутикулой, окрашивающейся раствором Судана III в розовый цвет. Второй вид -кроющих трихом - простые сосочковидные волоски с толстостенной кутикулой, также окрашивающейся раствором Судана III в розовый цвет. Третий тип - железки типичного строения: с одноклеточной ножкой и восьмиклеточной головкой, заполненной эфирным маслом. При обработке раствором Судана III клетки головки окрашиваются в ярко-красный цвет.

Клетки эпидермиса стебля вытянутой многоугольной формы, извилистость отсутсвует. Устьица встречаются редко, устьица окружены двумя клетками, смежные стенки которых расположены перпендикулярно устьичной щели (диацитный тип). На поверхности располагаются редкие простые многоклеточные и железки с эфирным маслом.

Поверхность чашечки опушена изнутри, снаружи и между зубцами. Опушение представлено длинными простыми многоклеточными волосками. По поверхности зубцов локализованы эфиромасличные железки, мелкие простые железистые волоски, изредка встречаются пельтатные железистые

ФС 42-_с.4

трихомы. Эпидермис внутренней поверхности трубки венчика покрыт многочисленными небольшими железистыми волосками. Ножки волосков многоклеточные (2-3 клетки), головки, содержащие бурый по цвету пигмент, одноклеточные. Кроме них много мелких железистых трихом, состоящих из двух мелких равно-размерных клеток: клетки-ножки и бурой клетки-головки. На поверхности эпидермы изредка встречаются и эфиромасличные желёзки, характерные для растений семейства Яснотковые. Эпидермис заметно опушен и простыми многоклеточными волосками. Клетки эпидермиса внутренней и наружной поверхностей чашечки, сильно извитые по форме, более или менее одинаковые по размерам. Фертильная часть цветка представлена пестиком с четырехлопастной завязью, скрытой в трубке венчика, длинным столбиком, иннервированным по всей длине проводящими сосудами. Поверхности длинного столбика опушены небольшими простыми волосками, сложенными из 1-3 клеток. Рыльце пестика двухлопастное. Лопасти отличаются размерами, одна лопасть длиннее другой. В тканях завязи, столбика и рыльца заметны многочисленные кристаллические осадки, диагностируемые нами ранее в тканях листовых черешков монарды. Такие же пятна наблюдаются по всей длине тычиночных нитей. Пыльники тычинок овальные по форме с характерной пыльцевой щелью, перетянутой в центре. Поверхности это щели покрыты мелкими сосочковидными клетками эпидермиса. В пыльнике видны пыльцевые зерна. Эпидермальная поверхность пыльника содержит многочисленные эфиромасличные железки.

Форма поперечного среза черешка в базальной части - неправильная овальная, тангентально вдавленная с адаксиальной стороны. Ребра черешка в базальной части поперечного среза и абаксиальная его сторона широко -округлой формы. Ширина поперечного среза базальной части черешка достигает 4 мм. В средней (медиальной) части черешок зауживается (ширина - до 2 мм). Очертание поперечного среза в апикальной имеет «и»-образную форму с угловатой абаксиальной стороной и округлой выемкой в

ФС 42-_с.5

адаксиальной части черешка. Ребра задраны к верхней стороне листа и имеют округлые очертания. Проводящие ткани черешка представлены одним крупным дугообразным пучком, расположенным в центре и окруженном однородной крупноклеточной паренхимой. По краям центрального пучка имеются петлевидные сегменты, состоящие из клеток флоэмы. В базальной части черешка, в области петлевидных сегментов, обнаруживается большое скопление мелкокристаллического включения. Помимо центрального пучка, в ребрах черешка, по всей его длине отмечаются мелкие вторичные пучки, округлые по форме.

При проведении люминисцентной микроскопии отмечаются следующие особенности свечения: клеточные стенки основной выполняющей паренхимы стебля в УФ-свете при 360 нм люминесцируют розовым цветом. Свечение эфиромасличной железки не однородно: в субкутикулярном слое отмечается светло-голубое свечение при X = 360 нм, ножка железистой трихомы при этом же облучении светится бурым с оранжевыми вкраплениями цветом. Кристаллический осадок в проводящих тканях проводящего пучка черешка, при 360 нм имеет характерное бурое свечение, при облучении спектром дневного света при 420 нм цвет люминесценции меняется в сторону желтой или желто-зелёных оттенков.

1. 2.

Рисунок 1 - Монарды дудчатой трава 1 - фрагмент стебля (х40); 2 - эпидермис нижней стороны листа (х400); 3 -многоклеточные простые волоски (х400); 4 - эпидермис нижней стороны венчика; 5 - окрашенная раствором Судана III эфиромасличная желёзка; 6 -железка при облучении светом с длиной волны X 360 нм; 7 - зубцы чашечки

(х40); 8 - рыльце пестика (х40).

Измельченное сырье.

При исследовании микропрепаратов должны быть видны фрагменты листовой пластинки с эпидермисом, состоящим из клеток с сильно извилистыми стенками, а также диацитным устьичным аппаратом. На некоторых фрагментах должны быть видны простые одноклеточные и многоклеточные волоски с утолщенными целлюлозными клеточными стенками, покрытыми бородавчатой кутикулой, а также сосочковидные волоски с толстостенной кутикулой. Часто должны встречаться эфиромасличные железки с одноклеточной ножкой и восьмиклеточной головкой, заполненной эфирным маслом. В микропрепарате могут встречаться отдельные волоски или их обломки. Кроме того в микропрепарате обнаруживаются фрагменты цветка (тычинок, пестика, чашечки, венчика) и стебля.

Определение основных групп биологически активных веществ: 1. Тонкослойная хроматография

Раствор стандартного образца (СО) рутина. Около 0,005 г СО рутина растворяют в 10 мл спирта 70% и перемешивают. Срок годности раствора 1 мес при хранени в прохлдном, защищенном месте.

Раствор стандартного образца (СО) тимола. Около 5 мг СО тимола растворяют в 10 мл спирта этилового 95% и перемешивают. Срок годности раствора 1 мес при хранени в прохлдном, защищенном месте.

Хроматографические пластинки «Сорбфил-ПТСХ-АФ-Ф-УФ» или «Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ» предварительно активируют в сушильном шкафу при температуре 100-105оС (60 мин). На линию старта пластинки микропипеткой наносят 0,02 мл водно-спиртового извлечения, полученного в разделе «Количественное определение». В качестве вещества-свидетеля используют спиртовые растворы СО рутина, тимола и изороифолина. Пластинку помещают в хроматографическую камеру, насыщенную парами

ФС 42-_с.8

смеси растворителей хлороформ - спирт этиловый - вода (26:16:3). Хроматографируют восходящим способом.

После того, как фронт растворителя проходит около 8 см, пластинку достают из камеры, высушивают и просматривают в УФ-свете при длине волны 366 нм. При этом на хроматограмме обнаруживается зелено-бурое пятно (366 нм) с величиной Rf около 0,4 (изороифолин и линарин), а также темно-синее (366 нм) с величиной Rf около 0,9 (СО тимол). Затем хроматограмму проявляют 3% спиртовым раствором алюминия хлорида, высушивают. Пятно изороифолина приобретает яркую желто-зеленую флуоресценцию. После этого хроматограмму проявляют щелочным раствором диазобензолсульфокислоты, высушивают. Пятна приобретают желто-оранжевое окрашивание. Допускается обнаружение других окрашенных зон. Затем происходит расчет величины Rst, равной отношению коэффициента удерживания изороифолина к коэффициенту удерживания рутина. Величина Rst должна быть равна 1,15.

2. УФ-спектроскопия

Испытуемый раствор, приготовленный как указано в разделе «Количественное определение» имеет два максимума поглощения: коротковолновый при длине волны 270±2 нм, длиноволновый при длине волны 330±2 нм (рис. 2).

[А] 2,75 2,5 2,25 2

1,75 1,5 1,25

0,75 0,5 0,25

200 250 300 350 400 450 [пгп]

Рисунок 2 - Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения

из травы монарды дудчатой Обозначения: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор извлечения с добавлением

алюминия хлорид 3. Качественные реакции

К 1 мл полученного извлечения, приготовленного как указано в разделе «Количественное определение», прибавляют 2 мл 3% раствора алюминия (III) хлорида спиртового, через 20-30 минут появляется зеленовато-желтое окрашивание.

ИСПЫТАНИЯ Влажность. Цельное сырье, измельченное сырье - не более 12%. Зола общая. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более

10%.

Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 3%.

Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, не более 5%. Измельченное сырье: проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм не более 5%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями, размером 0,5 мм не более 5%.

Посторонние примеси.

Стеблей. Цельное, измельченное сырье: не более 50%.

Органическая примесь. Цельное, измельченное сырье: не более 1%.

Минеральная примесь. Цельное, измельченное сырье: не более 1 %.

Тяжелые металлы. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» (ГФ РФ XIV издания).

Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» (ГФ РФ XIV издания).

Остаточные количества пестицидов. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» (ГФ РФ XIV издания).

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота» (ГФ РФ XIV издания).

Количественное определение. Цельное сырье, измельченное сырье: эфирного масла - не менее 1,0%, суммы флавоноидов в пересчете на изороифолин не менее 3,0 %, экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 % не менее 15,0 %..

Эфирное масло.

В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания эфирного масла в лекарственном растительном сырье и лекарственных препаратах» (метод 1 из навески 50,0 сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 2 мм, время перегонки -1,5 ч).

Сумма флвоноидов.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 60 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки (раствор сравнения).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 394 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Для расчета содержания суммы флавоноидов используют теоретическое значение удельного показателя поглощения изороифолина при длине волны 394 нм, равное 195.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на изороифолин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

Б * 50 * 50 * 100

Х =_

ш* 1 * 195 * (100-Ж)

где

О - оптическая плотность испытуемого раствора; т - масса сырья, г;

195 - удельный показатель поглощения (Е!<%.) изороифолина при 394

нм;

Ж - потеря в массе при высушивании, %.

Экстрактивные вещества. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах (метод 1, экстрагент - спирт 70%).

Примечание. Определение суммы флавоноидов в пересчете на изороифолин проводят в сырье, предназначенном для получения лекарственных растительных препаратов (пачки); эфирного масла и экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70%, - в сырье, предназначенном для получения настоек.

Упаковка, маркировка и транспортирование. В соответствии с требованиями ОФС «Упаковка, маркиковка и транспортирование лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов» (ГФ РФ XIV издания).