Спектроскопические исследования физико-химических свойств церулоплазмина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.14, кандидат физико-математических наук Яковлева, Татьяна Юрьевна

  • Яковлева, Татьяна Юрьевна
  • кандидат физико-математических науккандидат физико-математических наук
  • 1999, Санкт-Петербург
  • Специальность ВАК РФ01.04.14
  • Количество страниц 110
Яковлева, Татьяна Юрьевна. Спектроскопические исследования физико-химических свойств церулоплазмина: дис. кандидат физико-математических наук: 01.04.14 - Теплофизика и теоретическая теплотехника. Санкт-Петербург. 1999. 110 с.

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Яковлева, Татьяна Юрьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Некоторые применяемые в диссертации сокращения

ВВЕДЕНИЕ

1. ПАРАМАГНИТНЫЕ И СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕДЬСОДЕРЖАЩЕЙ ГОЛУБОЙ ОКСИДАЗЫ - ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

1.1. Основные физико-химические свойства церулоплазмина

1.2. Оптические свойства церулоплазмина

1.3. Флюоресценция церулоплазмина

1.4. Спектры ЭПР церулоплазмина

1.5. Окислительно-восстановительные потенциалы медьсодержащих центров церулоплазмина

1.6. Структура медьсодержащих центров 1, 2 и 3 типов

в церулоплазмине

1.7. Антиоксидантные свойства медьсодержащих белков

1.7.1. Связь между каталитической активностью белка

и присутствием в нем иона меди

1.7.2. Восстановительные реакции медьсодержащих белков

1.7.3. Окислительные реакции медьсодержащих белков

1.7.4. Феррооксидазная активность церулоплазмина

1.7.5. Антиоксидантная активность церулоплазмина

1.7.6. Внутримолекулярная цепь переноса электронов

в церулоплазмине

1.8. Действие лазерного излучения на кровь in vitro,

СОД и церулоплазмин

2. МЕТОДИКА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1. Характеристики использованных препаратов церулоплазмина

2.2. Материалы, использованные для моделирования

цепи переноса электронов в церулоплазмине

2.2.1. Доноры электронов

2.2.2. Акцепторы электронов

2.2.3. Ингибиторы ионов меди 2 типа

2.3. Моделирование цепи переноса электронов

2.4. ЭПР-спектроскопия

2.4.1. ЭПР-спектрометры

2.4.2. Методика приготовления образцов для ЭПР-спектроскопии

2.5. Оптическая спектроскопия

2.6. Флуоресценция

2.7. Материалы и методы, используемые для изучения действия гелий-неонового лазера на кровь in vitro

2.8. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидов

2.9. Определение антиоксидантной активности плазмы

2.10. Определение оксидазной активности церулоплазмина, супероксиддисмутазной активности плазмы, активности супероксиддисмутазы в эритроцитах

3. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМА ОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

3.1. Механизм внутримолекулярного переноса электронов

в лакказе

3.2. Существование внутримолекулярного переноса электронов в ЦП

3.3. Спектры поглощения ЦП при моделировании внутримолекулярной цепи переноса электрона

3.4. Спектры ЭПР ЦП при моделировании внутримолекулярной цепи переноса электрона

3.5. Флуоресценция белкового лиганда

3.6. Спектры флуоресценции ЦП при моделировании внутримолекулярной цепи переноса электрона

3.7. Обсуждение результатов

4. ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ГЕЛИЙ-НЕОНОВОГО ЛАЗЕРА

НА КРОВЬ IN VITRO

4.1. Применение облучения крови Не-Ые лазером

4.2. Регистрация влияния облучения крови Не-Ые

лазером

4.3. Изучение влияния различных доз облучения

на процессы перекисного окисления липидов

4.4. Изучение влияния различных доз облучения на оксидазную активность ЦП и супероксиддисмутазную активность плазмы крови

4.5. Роль повышения уровня меди в плазме после облучения крови в повышение общего антиоксидантного

статуса плазмы крови

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Некоторые применяемые в диссертации сокращения:

ЦП - стр. 6 - церулоплазмин;

ЭПР - стр. б - электронный парамагнитный резонанс; ПОЛ - стр. 7 - перекисное окисление липидов; СОД-ная активность - стр. 7 - супероксиддисмутазная активность ;

СТР - стр.19 - сверхтонкое расщепление СОД - стр. 28 - супероксиддисмутаза;

ЫАБРН - стр. 43 - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) (восстановленная форма);

АОР-Ее3+ - стр. 43- аденозиндифосфат (АДФ) в комплексе с Ее3+;

АОС - стр. 47 - антиоксидантная система; п-ФДА - стр. 4 9 - парафенилендиамин; ДК - стр. 58 - диеновые конъюгаты; МДА - стр. 58 - малоновый диальдегид; ТБК - стр. 58 - тиобарбитуровая кислота; НТС - стр. 61 - нитротетразолий синий; ЫАБН - стр. 61 - никотинамидадениндинуклеотид (НАД) (восстановленная форма)

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Теплофизика и теоретическая теплотехника», 01.04.14 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Спектроскопические исследования физико-химических свойств церулоплазмина»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы данной диссертационной работы обусловлена тем, что изучение церулоплазмина (ЦП) , медьсодержащего белка плазмы крови, имеет большое практическое значение. Функциональный дефицит ЦП, определяемый как снижение его ферментативной оксидазной активности в крови, является основным моментом, по крайней мере, в большинстве случаев, в развитии тяжелого наследственного заболевания - гепатолентикулярной дегенерации (болезни Вильсона-Коновалова). Для диагностики многих заболеваний и наблюдения за ходом их развития, используют различный характер изменения относительного содержания в крови ЦП и трансферрина. Кроме того, в последнее время для лечения некоторых заболеваний используется метод облучения крови излучением Не-Ые лазера {X = 632, 8 нм) , соответствующим поглощению голубых оксидаз: ЦП и супероксиддисмутазы. В связи с этим представляет научный интерес изучение физико-химических свойств фотовозбужденного ЦП. Таким образом, изучение ЦП, помимо чисто практического значения, имеет и академический интерес.

Цель исследования:

- рассмотреть особенности поведения ионов Си2+ в молекуле ЦП в ходе окислительно-восстановительного процесса;

- изучить влияние различных доз облучения Не-Ые лазером на процессы перекисного окисления липидов;

- изучить влияние различных доз облучения на оксидазную активность ЦП и супероксиддисмутазную активность плазмы крови.

Основные методы исследования: ЭПР-спектроскопия, оптическая спектроскопия, флуоресценция, облучение Не-Ые лазером.

Объекты исследования: интактный ЦП; ЦП, ингибирован-

ный азидом натрия; плазма крови; кровь.

Научная новизна результатов заключается в том, что

- получены экспериментальные данные в пользу кооперативного взаимодействия ионов меди в молекуле ЦП при осуществлении этим ферментом оксидазной реакции, подтверждена возможность переноса электрона с "голубого" иона 1 типа на ионы 3 типа, цепь переносчиков электронов в ЦП может работать в полном составе и в "редуцированном" виде;

- обнаружено в результате облучения крови He-Ne лазером достоверное снижение в плазме крови стационарного уровня как первичных метаболитов ПОЛ - диеновых конъюгатов, так и одного из конечных продуктов - малонового диаль-дегида в плазме крови;

- таким образом, облучение крови in vitro излучением гелий-неонового лазера в использованных дозах снижает интенсивность протекания процессов ПОЛ и увеличивает устойчивость липидов плазмы к индуцированному окислению;

- показано увеличение устойчивости плазменной липидной фракции к окислению после лазерного облучения при активировании ионами Fe2+ плазмы облученной крови;

- установлена отрицательная корреляция между оксидазной активностью ЦП и интенсивностью протекания процессов ПОЛ после активирования плазмы ионами Fe2+, а также между СОД-ной активностью плазмы и интенсивностью протекания процессов ПОЛ после активирования при дозах облучения от 0,9 до 1,8 Дж;

- показано, что облучение He-Ne лазером крови in vitro в дозах от 0,9 до 1,8 Дж активирует систему антиоксидант-ной защиты крови, отражением чего является снижение интенсивности протекания процессов ПОЛ.

Практическая значимость работы состоит в том, что полученные в работе данные расширяют существующие представления об особенностях поведения ионов Си2+ в молекуле ЦП в ходе окислительно-восстановительного процесса; о кооперативном взаимодействии ионов меди в молекуле ЦП при осуществлении этим ферментом оксидазной реакции; облучение Не-Ые лазером крови активирует систему антиоксидантной защиты крови, что позволяет расценивать биоантиоксидантный эффект как один из положительных моментов фотобиологического действия на кровь лазерного излучения с длиной волны X = 632,8 нм.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения (выводов) и списка цитируемой литературы.

1. ПАРАМАГНИТНЫЕ И СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

МЕДЬСОДЕРЖАЩЕЙ ГОЛУБОЙ ОКСИДАЗЫ - ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

1.1. Основные физико-химические свойства церулоплазмина

Церулоплазмин (ЦП, феррооксидаза КФ 1.16.3.1) - медьсодержащий белок плазмы крови млекопитающих, относящийся, как и два растительных белка - лакказа и аскорбатоксида-за, к семейству голубых оксидаз /1,2/. Являясь мульти-функциональным белком плазмы крови, ЦП катализирует окисление кислородом Ге2+ до Ее3+, что жизненно необходимо для встраивания ионов железа в апотрансферрин и, далее, в гемоглобин. ЦП также катализирует окисление биологически активных аминов в мозге (норадреналина, серотонина). Кроме того, ЦП осуществляет транспорт ионов меди из печени к другим медьсодержащим белкам тканей.

ЦП содержит 0, 28 - 0,34 % меди /3-8/ и 7 - 8 % угле-родов /9,10/. Молекула ЦП представляет собой полипептидную цепь /11/. Молекулярный вес ЦП долгое время определялся от 122000 до 161000 /1,3,9/, а количество остатков аминокислот от 1002 до 1276 /12,13/. Недавно была определена полная первичная структура ЦП человека: молекула ЦП содержит 104 6 аминокислотных остатков, их молекулярный вес 120085. ЦП, по сравнению с другими медьсодержащими белками, характеризуется необычно большим содержанием триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков /14/. Четыре аминокислотных остатка связаны с полисахаридами (61СЫ) ; с их учетом молекулярный вес ЦП составляет 132000 /8,15,16/. ЦП, вероятно, имеет 5 дисульфидных связей и 4 свободные ЭН-группы на молекулу. Цепь белка состоит из трех высокогомологичных участков, каждый из ко-

торых состоит из 350 остатков /17/. В положениях 79 и 449 обнаружены по две аминокислотные замены глицина 20 %) на лизин. Полагают, что это может объяснить существование двух типов ЦП, отличающихся между собой хроматографиче-скими свойствами и подвижностью при электрофорезе. Вторичная структура ЦП имеет р-конфигурацию и беспорядочную

укладку с небольшой примесью а-спиралей или при их отсутствии. Третичная структура его молекулы представляет собой очень плотную упаковку с незначительной степенью асимметрии /18/. Форма молекулы ЦП может быть апроксимирова-на вытянутым эллипсоидом вращения размером 6,5x6,5x13 нм. Объем молекулы составляет (0,26 - 0,28)'105 нм3 /18/.

Атомы меди являются неотъемлемой частью молекулы ЦП и в ходе всех процессов с ее участием они постоянно соединены с белком. Большая прочность связывания меди белком в ЦП обусловлена строением всей молекулы белка. Число атомов меди в ЦП до сих пор точно не определено. Первоначально предполагалось наличие 5-8 атомов меди на молекулу ЦП /1,3,4/. Но, поскольку в последние годы была уточнена молекулярная масса ЦП, то сейчас считается, что ЦП содержит 6 /8,13,19/ или 7 атомов меди на молекулу ЦП /7,9/.

Активные центры ЦП, в состав которых входят атомы меди, связывают с такими жизненно важными биологическими функциями, как электронный транспорт, метаболизм железа и другие. Одной из главных целей изучения активных центров в медьсодержащих белках, в том числе в ЦП, является понимание связи спектроскопических характеристик белков со строением активных центров. Это привело к классификации медьсодержащих активных центров в белках на три /20-22/

или, возможно, четыре /13/ основных типа на основе их различных спектральных свойств:

- центр Си2+ 1 типа ("голубая" медь) характеризуется оптическим поглощением в области 600 - 610 нм и спектром электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с необычной по сравнению с низкомолекулярными комплексами меди структурой сверхтонкого расщепления;

- центр Си2+ 2 типа ("не голубая" медь) обладает обычными для низкомолекулярных комплексов меди параметрами ЭПР и очень слабым поглощением в ближней УФ- и видимой областях. Ион меди этого центра очень сильно связывается с некоторыми ингибирующими анионами, такими как

N3", СЫ", N03";

- центр ионов Си2+ 3 типа обычно не детектируется методом ЭПР, так как представляет собой два сильно антиферро-магнитно спаренных иона меди. Этот центр имеет сильную полосу поглощения при 330 нм, пропадающую при восстановлении центра.

В молекуле ЦП к центру 1 типа относят два иона Си2+, к центру 2 типа - один ион Си2+, к центру 3 типа - два спаренных иона Си2+. Следовательно, если в ЦП находятся 6 ионов меди, то требуется еще один ЭПР-недетектируемый ион меди, который не может быть включен в такую модель и поэтому отнесен к центру 4 типа, - Си+ /13/. Если в ЦП находятся 7 ионов меди, то к центру 3 типа относят две пары диамагнитных ионов меди.

Недавно была определена кристаллическая структура ЦП человека с разрешением 3,0 А /19/.

1.2. Оптические свойства церулоплазмина

Наличие в ЦП большого количества остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана)

обусловливает его сильное оптическое поглощение в ультрафиолетовой области (максимумы полос поглощения находятся около 230 и 280 нм) . Для получения спектра поглощения, обусловленного медными хромофорами белка/ наблюдают разностный спектр нативного и апо-ЦП, из которого удалены ионы меди. В полученном таким образом спектре полосу 330 нм относят к медьсодержащему центру 3 типа, а все остальные полосы - к центру 1 типа (Таблица 1.1).

Точное определение положения и интенсивности полос поглощения иона меди 2 типа в ЦП затруднительно вследствие наличия интенсивных полос поглощения других хромофорных групп. В тех белках, где нет других хромофоров, кроме ионов Си 2 типа, интенсивность полос поглощения настолько мала, что при доступных концентрациях очищенных препаратов эти полосы не наблюдаются /27/.

Для ионов меди 1 типа как в ЦП, так и в других "голубых" белках, характерны необычно высокие коэффициенты молярного поглощения по сравнению с обычными низкомолекулярными комплексами Си2+. Коэффициент молярного поглощения полосы 610 нм для ЦП около 11300 л'моль^'см-1 (в расчете на грамм-молекулу белка). Если учесть, что в молекуле ЦП содержится два "голубых" иона Си2+ , то его коэффициент молярного поглощения в расчете на один грамм-атом меди составит 5650 л"моль~1"см~1 /1,20/, в то время как для d-d перехода в низкомолекулярных тетрагональных

О I

комплексах Си эта величина обычно меньше, чем 100 л'моль-1'см-1. Правда, иногда и низкомолекулярные комплексы меди обладают довольно интенсивными полосами поглощения. В этих случаях предполагается, что они носят характер полос переноса заряда, хотя причиной увеличения интенсивности d-d полос может быть также искажение симметрии /27, 28/.

Таблица 1.1 Электронные спектроскопические свойства ЦП и анион-связанных производных ЦП /23-2 6/

Поглощение Круговой дихроизм Переходы

Белок см 1 нм см 1 нм Ае

1 2 3 4 5 6 7

Натив- 6100 1640 + 2,0 2в2-*2е

ный ЦП 10000 1000 10000 1000 -0, 9 2в2->2в!

11500 870 2в2->2а!

13000 770 13750 730 -9, 0 ТСБ—К1Х2-у2

16400 610 16400 610 +3,4 аЗ—>с!х2-у2

18350 545 + 5,0 СТБ*—»С1х2-у2

23000 435 22000 450 -4,8 7ГЫ->с1Х2-у2

28000 355 + 0,8

30750 325 -0,5

ЦП, 8940 1120 + 1, 4 2в2->2е

инги- 12000 835 -1,6 2в2->2в!

биро- (14000) (710) 15300 655 -6, 0 тсэ—»(Зх2-у2

ванный 16500 605 15300 655 -6,0 сб—>с!Х2-у2

n3" 19250 520 +2,6 стб*—х1х2-у2

22500 445 "6,7 7гы^с1Х2-у2

26000 385 27000 370 + 8,0 Ыз~—>Си2+

ЦП, (13000) (770) 13000 770 "7,8 7СЗ-»(1Х2-у2

инги- 16400 610 16400 610 -2,1 аЗ->с!Х2-у2

биро- 18750 530 + 0,4 СТЗ*->с1х2-у2

ванный 23500 430 22000 455 -10, 6 7Ш->с1х2-у2

ЫСБ" 26650 375 25600 390 + 8,4 ЫСЗ~->Си2+

Спектры поглощения измерялись при температуре 20 К.

Совместный анализ спектров поглощения при комнатной температуре и спектров кругового дихроизма позволил заключить, что медные хромофоры ЦП обусловливают, по крайней мере, шесть электронных переходов в области 300 - 900 нм (323, 455, 545, 615, 714, 816 нм) (рис .1.1) /2326,29/. Низкотемпературные спектры поглощения впервые позволили получить данные о полосах поглощения ЦП в области 1000 и 870 нм /23/. Теоретическое представление длинноволновых полос поглощения ЦП в виде гауссианов действительно предполагает серию полос электронного поглощения в области 375-870 (Рис.1.1). Тем не менее самой интенсивной полосой в ЦП, наблюдаемой экспериментально, является полоса с А, = 610 нм, соответствующая переходу стЗ—>с!Х2-у2 • Инфракрасный спектр поглощения ЦП состоит из двух полос 1632 и 1530 см"1 (6127 и 6536 нм) (рис.1.2) /26/.

1.3. Флюоресценция церулоплазмина

Нативный и апо-ЦП обладает собственной УФ-флуоресцен-цией /26,30-32/, достаточно сложной из-за большого числа триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков в молекуле белка. Применение метода собственной УФ-флуорес-ценции позволило впервые получить данные о пространственной близости части триптофановых остатков к остаткам гис-тидина и к ионам меди, ответственным за оксидазную активность ЦП /31/.

Сравнение флуоресцентных свойств нативного и апо-ЦП показало, что присутствие меди вызывает тушение флуоресценции триптофана путем переноса энергии к медным хромофорам (рис.1.3) /2 6/. Этот факт подтверждается низкой степенью поляризации собственной УФ-флуоресценции ЦП в

Разностные спектры поглощения человеческого нативного и апо-ЦП

Разностный спектр поглощения - (о о о),

гауссианы - (- - -) , их сумма - (-) /2 6/

Рис. 1.1

Спектр поглощения ЦП на твердой пленке в ИК-области /2 6/

18 1-в 14 Ъо3«1

Рис. 1.2

Спектры флуоресценции при Хвозб, = 280 нм апо-ЦП, нативного ЦП и разностный спектр флуоресценции апо-ЦП и нативного ЦП

320

360

400

нм

Спектры флуоресценции апо-ЦП (-) , нативного ЦП (-----) и

разностный спектр флуоресценции апо- и нативного ЦП (- -) Условия: 0,1 М ацетатного буфера; рН 6,0; Т = 25 °С. /26/

Рис. 1.3

коротковолновой части спектра, что обусловлено эффективным переносом энергии между остатками ароматических аминокислот в ЦП /31/. При возбуждении флуоресценции светом

с длиной волны А-возб. = 2 96 нм вкладом флуоресценции тирозина и фенилаланина в спектр триптофановых остатков можно пренебречь /32,33/.Установлено существование подвижности индольных колец в боковых цепях триптофановых остатков ЦП, которая характеризуется либо временем вращательной релаксации р « тфл., либо р, сопоставимым по величине с Тфл./ но не зависящим от вязкости растворителя /34/.

Как уже отмечалось, центр Си2+ 3 типа обусловливает полосу поглощения около 330 нм, которая накладывается на спад полосы поглощения ароматических аминокислот ЦП (максимум 280 нм). Благодаря такому перекрыванию полос поглощения можно одновременно возбуждать две полосы флуоресценции при А,Возб.= 310 нм (см. главу 3) . Предполагалось, что в этом случае за флуоресценцию может быть ответственен не только медный хромофор 3 типа, а, например, карбоксильные группы, изменившие свои свойства вследствие близкого расположения к этому медному хромофору /35,3 6/. При возбуждении ЦП в длинноволновой области поглощения флуоресценция не наблюдалась /36/.

1.4. Спектры ЭПР церулоплазмина

В ЦП 40 - 50 % атомов меди ЭПР-недетектируемы. Эта диамагнитная форма меди в белке находится, по-видимому, в виде восстановленной меди Си+ и в виде димера Си2+ - Си2+ со спаренными спинами электронов. Методом ЭПР можно изучать только парамагнитный ион Си , так как ион Си не содержит неспаренных электронов. Ион Си2+ в белках может

быть охарактеризован параметрами, экспериментально получаемыми из спектров ЭПР: формой линии, величиной д-фактора, константой сверхтонкого расщепления А и интегральной интенсивностью сигнала ЭПР. Тетрагональные комплексы Си2+ обладают магнитной анизотропией, и поэтому в зависимости от ориентации по отношению к внешнему магнитному полю могут давать два сигнала ЭПР с двумя различными д-факторами: д± и д| | . Вследствие того, что ядерный спин меди равен 3/2, сигнал ЭПР в поле каждого ядра Си2+ расщепляется на четыре равноудаленных компонента СТР (сверхтонкое расщепление). Расстояния между ними определяются константой СТР А. Величины д и А в комплексах двухвалентной меди характеризуют как симметрию окружения центрального иона, так и ковалентность связи его с лигандами. Интегральная интенсивность сигнала ЭПР пропорциональна количеству неспаренных электронов и может быть использована для расчета действительной концентрации парамагнитных ионов Си2+ в белке не прибегая к его разрушению. Экспериментальный спектр ЭПР ЦП (рис. 1.4) состоит из суммы трех спектров, обладающих различными спектроскопическими параметрами /37/. Спектр интерпретируется следующим образом: в молекуле ЦП находятся три парамагнитных иона Си2+ - два иона 1 типа и один ион 2 типа (общая интенсивность сигнала ЭПР вычислялась интегрированием записанного спектра, интенсивность сигнала ЭПР меди 2 типа устанавливалась интегрированием соответствующей низкопольной компоненты СТР /38/ (таблица 1.2).

Медьсодержащие центры 1 типа (два иона Си2+) имеют различающиеся значения величин констант сверхтонкого расщепления А и по-разному реагируют на изменение рН в области 4,5 - 7,0 /37/. Спектры ЭПР, записанные при различных величинах рН между 4,5 и 7,0 очень похожи на спектр

Экспериментальный и теоретический спектры ЭПР ЦП.

-I_I_I_I_I__2

2.6 3.0 3.4 В, Ю мТл

Спектры ЭПР ЦП - экспериментальный (А) и теоретический (В) . Спектр представлен двумя ионами Си2+ 1 типа и одним ионом Си2+ 2 типа. Теоретический спектр является суммой трех составляющих его спектров /37/

Рис. 1.4

Таблица 1.2 Параметры, характеризующие спектры ЭПР ЦП

Белок д| 1 А|| Литература

Нативный ЦП 2, 056 2,209 0, 008 см"1 /39/

Денатурированный ЦП 2, 056 2, 257 0,018 см"1 /20,39/

Нативный ЦП, спектр экспериментальный 2, 048 2, 214 0, 0083 см"1 /40/

Спектр ЦП промоделирован на ЭВМ (Лоренцова форма) 2, 048 2, 214 8 мТл /40/

Нативный ЦП, Си2+ 1 типа Си2+ 1 типа Си2+ 2 типа 2,06 2, 05 2, Об 2,215 2,206 2, 247 9,2 мТл 7,2 мТл 18 мТл /37,22/ /37,22/ /37,22/

Нативный ЦП, 2 Си2+ 1 типа Си2+ 2а типа 2,204 2,241 7,5 мТл 17 мТл /44/

Нативный ЦП 2, 056 2, 214 0, 008 см"1 /41/

ЦП, обработанный аскорбатом 2Си2+ 1типа Си2+ 2 типа Си2+ 2 типа 2, 062 2, 060 2,06 2, 213 2, 264 2, 26 0, 008 см"1 0,019 см"1 17 мТл /41/ /41/ /23/

при рН 5,5, но выявляются два очевидных изменения спектра с уменьшением рН в этой области. Три компонента СТР одного из ионов Си2+ на 287, 294 и 301 мТл, связанные с медью 1 типа, сдвигаются в высокие поля, а низкопольная компонента СТР на 2 65 мТл сигнала от меди 2 типа расширяется и, возможно, слегка сдвигается в малые поля. Большая схожесть по величине рН-зависимых сдвигов трех сверхтонких пиков от меди 1 типа указывает на то, что изменения рН не действуют на соответствующие константы сверхтонкого расщепления, а воздействуют, главным образом, на величину g|¡ /37/. Структурная неоднородность, выраженная в ширине распределения тензоров g и А, зависит от процедуры замораживания и состава растворителя, как показал анализ спектров ЭПР медьсодержащих белков азурина и пластоциани-на /42/.

В определенных случаях сравнения параметров спектров ЭПР д| | и А с аналогичными параметрами спектров модельных комплексов могут быть использованы, особенно в комбинации с другими методами, для определения лигандов медьсодержащих центров 2 типа в "неголубых" белках. Анализ g| | и А| | позволил сделать заключение о том, что лигандами Си 2 типа могут быть атомы кислорода и азота, но не серы /43/. Параметры ЭПР спектров Си2+ 2 типа в ЦП типичны для меди, координированной кислородом и азотом в тетрагональных комплексах /20,22,27/.

Си2+ 2 типа в ЦП человека существуют не в одной, а в двух устойчивых формах, отличающихся параметрами спектров ЭПР и оптическим поглощением /44/. Параметры спектра ЭПР ЦП человека: для Cu2+ 1 типа д|| = 2,204, А|| = 7,5 мТл; для первой (2а) формы Си2+ 2 типа аксиальной симметрии окружения д|| = 2,241, А| | = 17,0 мТл; для второй (26) формы

Си2+ 2 типа орторомбической симметрии окружения дх = 1, 965, ду = 2,06, д2 - 2,183, А2 = 20,0 мТл. Заметный вклад в относительное содержание этих форм оказывает физиологическое состояние человека и наличие патологии (форма 26 практически отсутствует у здоровых беременных женщин). В спектрах ЭПР различных препаратов ЦП новая форма иона меди 2 типа проявляется в виде перегиба или слабой линии вблизи 330 мТл на высокопольном склоне основной линии спектра (д = 2,06). Появление этого перегиба сопровождается уменьшением относительного вклада центров Си2+ 1 типа в спектр ЭПР и симбатным обесцвечиванием белка в результате их частичного обратимого восстановления, особенно достаточно нестабильного третьего иона Си2+ 1 типа. Конформация ЦП и его медных центров 2 типа существенно зависит от окружения белка. Для отдельной молекулы ЦП переходы центров 2 типа друг в друга происходят скачкообразно .

Для ЦП, обработанного аскорбатом согласно методикам /23,45/, обнаружено наличие трех ионов меди на молекулу белка и отсутствие оксидазной активности. По-видимому, ЦП потерял при диализе один ион меди 1 типа, пару - 3 типа и, быть может, один - 4 типа /23/. Значительное поглощение около 30000 см-1 (330 нм) указывает на присутствие, по крайней мере, одного медьсодержащего центра 3 типа в модифицированном белке. Наблюдается также более слабый максимум поглощения на 16000 см-1 (600 нм) . В спектре кругового дихроизма заметны полосы при 13700 (730), 17000 (590), 19800 (505), 22200 (450), 25300 (395) и 32000 см-1 (315 нм) . Не наблюдались дополнительные полосы в ближней ИК-области (800 - 2000 нм) в спектре кругового дихроизма. Спектр ЭПР модифицированного ЦП (рис.1.5) (д± = 2,06, д||= 2,26; А| | = 17 мТл, А± = 1,4 мТл) позволяет получать

Спектр ЭПР обработанного аскорбатом ЦП

1 мМ ЦП; 0,05 М ацетатного буфера; 0,3 М ЫаС1; рН 7,2; при 80 К и 9,1750 ГГц. Мощность 20 мВт и амплитуда модуляции 0,32 мТл.

(A) - полный спектр (верхняя шкала),

(B) - участок спектра от 310 до 330 мТл в увеличенном масштабе (нижняя шкала) /23/

Рис.1.5

дополнительную информацию о природе ионов меди 2 типа в обработанном аскорбатом ЦП /23,41/.

Параметры спектра ЭПР ионов меди центра 2 типа согласуются с тетрагональной конфигурацией окружения иона меди; основным состоянием является 2Bi, соответствующее не-спаренному электрону на Cu2+ dX2-y2 орбитали. Данные спектров поглощения и кругового дихроизма также вполне согласуются с такой структурой. В области д± наблюдается слабое девятикомпонентное суперсверхтонкое расщепление спектра, ширина которого указывает на наличие четырех эквивалентных лигандов, возможно, атомов азота от имидазолов. Анионы-ингибиторы CN~, N3~, F~ обычно сильно связываются с Си2+ 2 типа в нативном ЦП и других медьсодержащих белках /22,46-49/ и это легко наблюдать по изменению спектров ЭПР. В случае же ЦП, обработанного аскорбатом, для фторида F- связи с центром 2 типа не наблюдают /23,50/. Новых сигналов, которые можно было бы отнести к центру 3 типа, не наблюдалось, что указывает на то, что ионы Си2+ 3 типа остаются диамагнитными.

При большинстве экспериментальных условий ионы Си2+ центра 3 типа в ЦП методом ЭПР недетектируемы. Однако в последние годы проведены наблюдения сигналов ЭПР при 7 7 К от медьсодержащего центра 3 типа при реокислении нативной Rhus лакказы и Rhus лакказы с удаленным центром 2 типа. Подобный сигнал наблюдается и в Rhus, и в fungal лакказе, предварительно освобожденных от центров 2 типа, при восстановлении центра 1 типа (рис.1.6) (для нативной Rhus лакказы: дх = 2,05, ду = 2,15, gz = 2,305, Az = 0,84 мТл; для Rhus лакказы с удаленным Си2+ 2 типа: дх = 2,03, ду = 2,15, д2 = 2,277, Az = 1,32 мТл) /22,51,52/. Сигналы ЭПР от пары ионов Си2+ 3 типа становятся детектируемыми, когда остальные центры восстановлены или удалены

Спектр ЭПР ¡Плие лакказы

2,6 2,4 2,2 2,0 -1-1-1-!—

(А) - нативный белок, (В) - белок с удаленным медьсодержащим центром 2 типа, (С) - реокисленный белок с сигналом ЭПР от медьсодержащего центра 3 типа /22,51/

Рис.1.6

и сигнала ЭПР от них нет. Сигналы ЭПР центров 3 типа показывают сильный ромбический характер геометрии ближайшего окружения ионов меди. Аналогичные спектры были получены и для других белков с биметаллическими центрами. Кроме того, были получены экспериментально и теоретически, в зависимости от электронной структуры ионов металла и характера связи их с лигандами, параметры спин-гамильтониана (д, А и другие) для биметаллических центров разных металлов (например, Cu-Cu, Cu-Mn, Cu-Zn, Cu-Ni, Ni-Co, Fe-Fe) /53/.

В ряде работ было прослежено за изменениями парамагнитных медных центров ЦП при облучении белка видимым и ближним ультрафиолетовым светом, при лазерном облучении

(337 нм) и у-облучении /54-58/. Было обнаружено, что по мере облучения при температуре 7 7 К происходит уменьшение интенсивности полосы поглощения при 610 нм и появление нового сложного спектра поглощения в области от 300 до 500 нм /54,57/. Обесцвечивание поглощения медных центров 1 типа является сопутствующим обстоятельством уменьшению интенсивности сигнала ЭПР, приписываемого центрам 1 типа.

Эти результаты указывают на восстановление первичных акцепторов электронов - Cu2+ 1 типа, причем оба иона меди 1 типа подвержены восстановлению примерно одинаково.

На Си2+ 2 типа не воздействует видимое и ближнее

ультрафиолетовое облучение, у-облучение при температуре 77 К, на что указывает неизменность низкопольной компоненты спектра ЭПР ЦП. Размораживание раствора ЦП на воздухе приводит к постепенной регенерации исходного спектра ЭПР, обусловленного медными хромофорами.

Получены экспериментальные доказательства существования высокотемпературной сверхпроводимости в ЦП /5 9/. По

диамагнитному отклику определена Тс ЦП, равная 135 К, а оцененное верхнее критическое поле составляет 1000 мТл. Температурная зависимость нормализованного спина для ЦП хорошо описывается теорией Абрикосова-Горькова /60/.

Попытки представить картину каталитической деятельности ЦП предпринимались не один раз /45/. При осуществлении ЦП катализа окислительно-восстановительных реакций при переносе электронов предполагается кооперативное взаимодействие между медьсодержащими центрами трех типов /22,36/. Получены данные, указывающие на возможность существования в ЦП, по крайней мере, двух различных способов окисления in vitro различных субстратов /61/. Косвенным подтверждением этого служит и кинетический анализ спектров ЭПР во время редокс-реакций /62/, который выявил различное поведение двух ионов Си2+ в центре 1 типа в этих реакциях. Аналогичные результаты получены при ЭПР-измерениях редокс-реакций спин-меченого ЦП /63/.

1.5. Окислительно-восстановительные потенциалы медьсодержащих центров церулоплазмина

Методы определения редокс-потенциалов медьсодержащих центров основаны на оптическом поглощении и ЭПР-измерениях в комбинации 'с потенциометрическими измерениями во время восстановления или окисления этих центров. Редокс-потенциалы центров трех типов отличаются для разных белков. Но, для голубых оксидаз, по-видимому, имеются общие закономерности. В голубых оксидазах медь 2 типа из всех трех электронных акцепторов имеет наименьший потенциал, а медь 3 типа обладает наибольшим потенциалом. Для Rhus лакказы значения потенциалов 1, 2 и 3 типов равны, соответственно 394, 365 и 434 мВ. Для ЦП известны редокс-

потенциалы только для двух ионов меди 1 типа - 4 90 и 580 мВ /64/. Такое большое различие потенциалов, как 90 мВ, для двух "голубых" Си2+ в одном белке не удивительно после сравнения с величинами потенциалов, найденных для Cu2+ 1 типа в других "голубых" белках: стеллацианине (184 мВ) , Rhus лакказе (394 мВ) и Polyporus лакказе (785 мВ) . Из сравнения разных белков следует, что нет корреляции между ЭПР-свойствами меди 1 типа и ее редокс-потенциалами (ЭПР-свойства стеллацианина и растицианина почти идентичны, а потенциалы меди 1 типа сильно отличаются (184 и 680 мВ соответственно)).

Причинами высоких редокс-потенциалов в лакказе и ЦП, по сравнению с другими комплексами Си2+, являются: окружение из серных и других восстанавливающих лигандов; связь с ненасыщенными группами; искажения в центрах Си2+, которые не допускают тетрагональную симметрию вокруг металла /20/.

Эксперименты по определению окислительно-восстановительного потенциала медьсодержащего центра 2 типа в ЦП наиболее сложны для выполнения, так как для измерений требуется большая концентрация этого белка, но результаты восстановительного титрования показали, что его окислительно-восстановительный потенциал ниже, чем других электронных акцепторов /22/.

Титрование полосы поглощения на 330 нм, связываемой с парой ионов меди 3 типа, дает кооперативный двухэлектрон-ный акцептор в обеих лакказах, но для ЦП не найдено простого объяснения, непосредственно связывающего это поглощение с редокс-состоянием одно или двухэлектронного акцептора, поскольку в результате титрования получен коэффициент Нернста скорее 0,5 - 1, чем 2; полоса поглощения на 330 нм уменьшается не только при восстановлении меди,

но и в результате модификации других участков ЦП /64/. Как было установлено нами (см. главу 3) , для подтверждения участия ионов Си2+ центров 3 типа в окислительно-восстановительных реакциях необходимо исследовать флуоресцентные свойства этих центров.

1.6. Структура медьсодержащих центров 1, 2 и 3 типов в церулоплазмине

Ионы меди в биологических системах проявляют различные спектроскопические и химические свойства из-за различного состава лигандного окружения и лигандной координации медьсодержащих центров.

Геометрию и лигандное окружение медьсодержащего центра 1 типа нельзя определить непосредственно, но на основании спектроскопических данных можно предположить почти все мыслимые варианты лигандов и их комплексов с Си2+ /65,66/. Оказалось, что спектроскопические данные о медьсодержащем центре 1 типа могут быть удовлетворительным образом проанализированы, если предположить уплощенную тетраэдрическую (D2d) координационную геометрию для этого центра /17,23/. В этом D2d лигандном поле основным состоя-

о

нием является В2 (dx2-Y2) и энергии трех возбужденных состояний уменьшаются в следующем порядке 2Е < 2В2 < 2Ai . В ЦП установлены три параметра для энергий d-d переходов. Параметры лигандного поля, полученные для меди 1 типа в ЦП, очень похожи на параметры, полученные из анализа d-d спектров пластоцианина /23,28/. Это дает возможность предположить, что в ЦП присутствуют две пластоцианино-подобные "голубые" меди CuN2SS* (N - гистидин 37 и 87, S -цистеин 84, S* - метионин 92). Структура медьсодержащего центра 1 типа в пластоцианине была уточнена благодаря ме-

тоду рентгеновской кристаллографии. Длина связей Си...N (гистидин 37) ~ 0,204 нм; Cu...N (гистидин 87) ~ 0,210 нм; Cu...S (цистеин 84) ~ 0,213 нм; Cu...S* (метионин 92) ~ 0,290 нм /67-69/. Предполагаемая структура искаженного тетраэдрического центра 1 типа и диаграмма уровней энергии меди и некоторых лигандов с а- и тс-орбиталями, основа ных на спектроскопических данных изучения белков приведены на рис. 1.7 /28,67,69,70/. Кроме параметров лиганд-ного поля, для ЦП и пластоцианина (или азурина) похожи спектры поглощения, кругового дихроизма, магнитного кругового дихроизма в области переноса заряда. Следует также заметить, что спектроскопические данные указывают на подобную структуру "голубой" меди ЦП и Rhus лакказы, хотя могут быть значительные расхождения в лигандном составе "голубых" центров Polyporus лакказы /71,72/.

О лигандах медьсодержащего центра 2 типа существуют только ограниченные данные /67/. Выборочно обесцвечивая в ЦП центры 1 типа, можно изучать центры 2 и 3 типов /23,36,50/. Для ЦП методом ЭПР показано присутствие четырех почти эквивалентных азотных донорных лигандов в искаженном тетрагональном медном центре 2 типа с двумя дополнительными координационными положениями для анионов /21,23/. Метод двойного электронно-ядерного резонанса (ДЭЯР) 14N также подтверждает наличие азотов имидазола в медьсодержащих белках /73/. Известно, что молекула воды, образуемая в процессе реокисления восстановленной лакказы, также имеет связь с Си2+ 2 типа /21/. Кроме того, ион меди 2 типа сильно взаимодействуют с анионами-ингибиторами .

Структура центров 3 типа в ЦП точно не известна, но из спектроскопических данных можно считать, что она, вероятно, близка к структуре биядерного центра гемоцианина

Структурное представление в пластоцианине (азурине) и некоторых лигандов с

медьсодержащего центра 1 типа и относительные энергии меди

су- и л-орбиталями /28, 70/

Л 2 2

ах _у

»ху

МО лигандов

Рис.1.7

и тирозиназы (рис.1.8) /21,53,65,67/. Наиболее возможными лигандами двух близко расположенных ионов меди с перекрывающимися ст-орбиталями являются атомы азота N и, может быть, кислорода О.

1.7. Каталитическая активность медьсодержащих белков

1.7.1. Связь между каталитической активностью белка и присутствием в нем иона меди

Медьсодержащие оксидазы в зависимости от их каталитической активности или функций, можно разделить на три группы:

1) "голубые" оксидазы (лакказа, ЦП, аскорбатоксидаза) , в которых всегда содержится не менее четырех атомов меди на одну молекулу белка, катализируют восстановление 02 до Н20 согласно реакции 02 + 4 е- + 4 Н+ =2 Н20. Каталитические, оксидазные и феррооксидазные свойства "голубых" ок-сидаз, по-видимому, определяются расположением ионов меди в их белковых молекулах;

2) "неголубые" оксидазы, в которых содержится по одному -двум атомам меди (центры 2 типа) на молекулу белка, катализируют восстановление 02 до Н202;

3) оксигеназы /21,27/.

До сих пор не обнаружено, чтобы "голубые" белки, содержащие один - два медных центра 1 типа, не подверженные аутоокислению, проявляли каталитическую активность /10, 27,74,75/.

Количество меди в различных медьсодержащих белках колеблется от 1 до 8 атомов меди на молекулу белка. Эти атомы, как правило, находятся в разном лигандном окружении и, вследствие этого, обладают отличающимися спектро-

Структурное представление центра 3 типа в оксигемоцианине /67/

'N

N

>

Cu

о

Си+

N-ч/

/

О

\

Рис. 1.8

скопическими и химическими свойствами. Медьсодержащие центры'1 типа встречаются или совместно с центрами 2 и 3 типов в "голубых" оксидазах, или только одни в "голубых" электрон-переносящих белках. Медьсодержащие центры 2 типа обычно встречаются в комбинации с центрами 1 и 3 типов. Медьсодержащие центры 3 типа встречаются только одновременно с двумя другими центрами.

Прямое доказательство наличия связи между каталитической активностью белка и присутствием в нем иона меди состоит в том, что при удалении иона меди из белка последний теряет свою активность, а при обратном введении данного иона в апо-белок каталитическая активность его возобновляется. Таким образом, была однозначно установлена необходимость присутствия медьсодержащего центра 2 типа в большинстве "неголубых" оксидаз. В случае Ро1урогиБ лак-казы удается избирательно удалить один ион меди из центра 2 типа, что сопровождается потерей каталитической активности, хотя в молекуле белка остается еще три атома меди /27/. При обратном введении недостающего иона меди активность белка восстанавливается. Аналогичное удаление и последующее встраивание меди в ходе реакции ЦП —> апо-ЦП приводит к обратимому исчезновению и появлению ферментативной активности /22/.

Оксидазную активность ЦП ингибируют многие вещества, но наиболее сильное воздействие оказывают анионы. Благодаря изучению оптических и ЭПР-спектров ЦП и лакказы, известно, что такие анионы, как цианиды СЫ", азиды фториды , в малых концентрациях избирательно связываются только с ионами меди 2 типа. Связывание только одной молекулы азида на четыре атома меди полностью тормозит оксидазную активность белка. Торможение цианидом требует две молекулы ингибитора. Такое различие, по-видимому,

«

объясняется валентным состоянием меди в молекуле ЦП. Все ингибиторы ЦП, независимо от их химической структуры, обратимо связываются с ЦП и легко удаляются при диализе или гель-фильтрации на сефадексах, при этом возвращается практически первоначальная активность ЦП. Отсюда непосредственно вытекает, что именно модификация медьсодержащего центра 2 типа обусловливает потерю белком каталитической активности.

1.7.2. Восстановительные реакции медьсодержащих белков

Попытки представить картину каталитической деятельности "голубых" оксидаз предпринимались не один раз. Но реакции восстановления и реокисления очень сложны даже в присутствии только восстановителя или окислителя. Для того чтобы упростить интерпретацию, необходимо использовать в каждый момент времени только один реагент. Хотя присутствие обоих субстратов отражало бы нормальную каталитическую картину, но и последовательное их участие находится в согласии с экспериментальными данными /22/. Для исследования в восстановительных реакциях редокс-поведения всех трех акцепторов электронов "голубых" оксидаз использовалась комбинация метода ЭПР с быстрым замораживанием методом остановленной струи. Изучение "голубых" оксидаз показало, что их активные центры ведут себя примерно одинаковым образом. Существует взаимодействие между всеми тремя медьсодержащими центрами. Первый электрон восстанавливает медь центра 1 типа. На то, что именно этот ион меди является первичным электронным акцептором, указывают исследования лакказы с удаленным центром 2 типа и ингибированных оксидаз. Когда центр 1 типа восстановлен, от следующей молекулы субстрата восстанавливается центр 2 типа. Когда же оба центра 1 и 2 типа восстановлены, они

последовательно отдают по электрону каждый на двухэлек-тронный акцептор электронов - центр 3 типа. Ниже приведена схема анаэробного восстановления Rhus лакказы при нейтральных рН (рис.1.9). Верхняя часть этой схемы посвящена реакциям восстановления. Центры 1 и 2 типов расположены соответственно в верхней левой и нижней левой частях прямоугольника, представляющего молекулу белка. Центр 3 типа представлен парой ионов меди Си2+ в средней части прямоугольника. Восстановление трех типов медных центров в Rhus лакказе сильно зависит от рН. Восстановление центра 1 типа при рН 7,4 идет почти в 10 раз быстрее, чем при рН 6,5. Центр 2 типа восстанавливается намного медленнее. Центр 3 типа восстанавливается в два приема.. При рН 6,5 около 50 % молекул белка восстанавливаются. Оставшиеся молекулы неактивны вследствие того, что при таком рН об-

Схема анаэробного восстановления Rhus лакказы

при нейтральных рН

Похожие диссертационные работы по специальности «Теплофизика и теоретическая теплотехника», 01.04.14 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Теплофизика и теоретическая теплотехника», Яковлева, Татьяна Юрьевна

Выводы диссертационной работы:

1. На основе выполненных спектроскопическими и ЭПР-методами экспериментов сделан вывод о том, что в ЦП имеется внутримолекулярная цепь переноса электронов, состав

2 4" ленная из пространственно сближенных ионов Си 1, 2 и 3 типов. Электроны от субстрата поступают на Cu2+ 1 типа, одновременно или вслед за этим восстанавливается Си2+ 2 типа. Затем происходит перенос электронов с ионов 1 и 2

2+ типов на двухэлектронный акцептор - пару ионов Си 3 типа .

2. Экспериментально подтверждена возможность переноса электрона с "голубого" иона Cu2+ 1 типа на ионы 3 типа. Как оказалось, цепь переносчиков электронов в ЦП может работать в полном составе и без участия иона меди 2 типа. Только один из двух "голубых" ионов меди ЦП участвует в реакциях переноса электронов. Второй ион, о котором известно, что он реокисляется медленнее, очевидно, не входит в состав цепи переноса электронов.

3. В результате облучения цельной крови in vitro излучением гелий-неонового лазера в дозах 0,9 - 1,8 Дж обнаружено достоверное снижение в плазме стационарного уровня первичных метаболитов ПОЛ - диеновых конъюгатов и одного из конечных продуктов - малонового диальдегида. Облучение цельной крови He-Ne лазером в указанных дозах снижает интенсивность протекания процессов ПОЛ.

4. Облучение цельной крови He-Ne лазером в указанных дозах увеличивает устойчивость липидов к индуцированному ионами Fe2+ их окислению. Установлена отрицательная корреляция между оксидазной активностью ЦП и интенсивностью протекания процессов ПОЛ, а также между СОД-ной активностью плазмы и интенсивностью протекания процессов ПОЛ после активирования плазмы ионами Ге2+ при дозах облучения 0,9 - 1,8 Дж.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Яковлева, Татьяна Юрьевна, 1999 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Holmberg C.G., Laurell С.В. Investigations in serum

copper, 2.Isolation of the copper-containing protein, and a description of some its properties // Acta Chem. Scand.-1948.-Vol.2.-P.550-556.

2. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigation in serum copper. 3. Ceruloplasmin as an enzyme // Acta Chem. Scand.-1951.-Vol.5.-P.476-480.

3. Scheinberg I.H., Morell A.G. Ceruloplasmin // Inorganic Biochemistry, Ed. by G.X.Bichhorn.- Elsevier, Amsterdam, Oxford, N.Y.-1975.-Vol.1.-P.306-319.

4. Шейнберг И.Г., Морелл А.Д. Церулоплазмин // Неорганическая биохимия.- М.: Мир.- 1978.-Т.1.-С.361-376.

5 о Morell A.G. et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin. 4. Preparation of radioactive, sialic acid-free ceruloplasmin labeled with tritium on terminal d-galactose residues / Morell A.G., Ven Den Hamer C.J.A., Scheinberg I.H. // J. Biol. Chem.-1966.-Vol.241.-P.3745-3749.

6. Magdoff-Fairchild В., Lovell F., Low B.W. An X-ray crystallographic study of ceruloplasmin (determination of molecular weight) // J. Biol. Chem.-1969.-Vol.244.-P.3497-3499.

7. Laurie S.H., Mohammed E.S. Caeruloplasmin: the enigmatic copper protein // Coord. Chem. Reviews.-1980,-Vol.33, N 3.- P.279-312.

8. Kasper C.G., Deutsch H.F. Physicochemical studies of human ceruloplasmin // J. Biol. Chem.-1963.-Vol.238, N 3.-P.2325-2337.

9. Endo M. et al. The structures and microheterogeneity of the carbohydrate chains of human plasma cerulo-

plasmin. A study employing 500-MHz 1H-NMR spectroscopy / Endo M., Susuki K., Schmid K., Mournet B. // J„ Biol. Chem.-1982.-Vol. 257, N 15.-P.8755-8760.

10. Fee J.A. Copper proteins - systems containing the "blue" copper centers // Structure and bonding 23.-Verlag Berlin, Heidelberg, N.Y.-1975.-Vol.23.-P.1-60.

11. Burnett D., Chandy K.G. Evidence for a single-chain structure of native human ceruloplasmin using sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide-crossed Immunoelectrophoresis // Anal. Biochem.-1983.-Vol.128, N 2.-P.317-322.

12. Blumberg W.E. et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin. l.The relation between blue color and the valence states of copper / Blumberg W.E., Eisinger J„, Aisen P., Morell A.G., Scheinberg I.H. // J. Biol. Chem.-1963.-Vol.238, N 5.-P.1675-1682.

13. Ryden L., Bjork I. Reinvestigation of some physico-chemical and chemical properties of human ceruloplasmin (ferroxidase) // Biochemistry.-1976.-Vol.15,

N 16.- P.3411-3417.

14. Naqui A., Vincent J.-C. An analysis of amino acid composition of a few oxidoreductases by different methods // Biosci. Repts.-1983.-Vol.3, N 3.-P.269-273.

15. Ortel T.L., Takahashi N., Putnam F.W. Structural model of human ceruloplasmin based on internal triplication, hydrophilic/hydrophobic character, and secondary structure of domains // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci.-1984.-Vol.81, N 15.-P.4761-4765.

16. Дамашун Г. Определение молекулярного веса церулоплаз-мина человека при помощи гидродинамических методов и рентгеновского рассеяния / Дамашун Г., Дамашун X.,

Каюшина Р.Л., Кребер Р. // Биофизика.-1976.-Т.21.-С.965-970.

17. Takahoshi N., Ortel T.L., Putnam F.W. Single-chain structure of himan ceruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Biol. Sci.-1984.-Vol.81, N 2.-P.390-394 .

18. Василец И.М. Определение размеров и формы молекулы церулоплазмина человека методом рентгеновского малоуглового рассеяния / Василец И.М., Каюшина Р.Л., Куранова И.П., Мошков К.А. и др.// Биофизика.-1973.-Т.18.-С.972-976.

19. Lindley P. et al. The structure of human ceruloplasmin at 3.0 A resolution: The beginning of the end of an enigma / Lindley P., Zaitseva I., Zaitsev V., Palph A., Card C. // Collec. Abstr. Int. Union Crys-tallogr. 17th Congr. and Gen. Assem., Seatle, Washington, August 8-17, 1996, Acta Crystallogr. A. 1996.-Vol.52.-P.69.

20. Malkin R., Malmstrom B.G. The state and function of copper in biological systems // Adv. Enzymol.-1970.-Vol.33.-P.177-244.

21. Reinhammar B. The copper-containing oxidases // Advances in inorganic biochemistry. Ed. by G.L.Eishhorn, L.G.Marzilli. Berlin: Elsevier-North Holland Inc. - 1979.-P.91-118.

22. Reinhammar B. Metal coordination and mechanism of blue copper-containing oxidases // Coord. Chem. Metalloenzymes. Proc. NATO Adv. Study Inst. San Miniato, Italy 1982.- Ed. by I.Bertini, R.S.Drago, С.Luchinat.-Milano; Borgiorno: D.Reidel Publ. Co.- 1983.-Vol.30.-P.177-200.

23» Dawson J.H. Spectroscopic studies of ceruloplasmin. Electronic structures of the copper sites / Dawson J.H., Dooley D.M., Clark R., Stephens P.J., Gray H.B. // J. Airier. Chem. Soc.-1979 . -Vol. 101, N 17.-P. 50465053.

24. Falk K.-E., Reinhammar B. Visible and near-infrared circular dichroism of some blue proteins // Biochim. Biophys. Acta.-1972.-Vol.285, N 1.-P.84-90.

25. Nerve M. et al. Ceruloplasmin-anion interaction a circular dichroism spectroscopic sdudy / Nerve M., Garnier A., Tosi L., Steinbuch M. // Biochim. Biophys. Acta.-1976.-Vol.439, N 2.- P.432-441.

26. Freeman S., Daniel E. A spectral study of human ceruloplasmin // Biochim. Biophys. Acta.-1978.-Vol.534, N 1.-P.132-140.

27. Малкин P. Медьсодержащие оксидазы // Неорганическая биохимия.- Под ред. Г.Эйхорна.- М.: Мир.-1978.-Т.2.-

C. 94-115 .

28. Dooley D.M. et al. Spectroscopic studies of Rhus vernicifera and Polyporus versicolor laccase. Electronic structures of the copper sites / Dooley

D.M., Rawlings J., Dawson J.H., Stephens P.J., Andreacson L.-E., Malmstrom W.G., Gray H.B. //

J. Amer. Chem. Soc.-1979.-Vol.101, N 17.-P.5038-5046.

29. Gray H.B., Solomon E.I. Copper proteins // Metal Ions in Biology series. Ed. by T.G.Spiro.- N.Y.-1981.-P.1-40.

30. Salvato В., Jori G. Fluorescence spectra from ceruloplasmin // Bull. Mol. Biol. Med.-1976.-Vol.1.-P.97-106.

31. Семисотнов Г.В. и др. Изучение структуры церулоплаз-мина человека методом ультрафиолетовой флуоресценции/

Семисотнов Г.В., Мошков К.А., Туроверов К.К., Павловский М.М. // Биоорганич. химия.- 1976.-Т.2, N3.-C. 413-421.

32. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. -М. '.Наука.-1965.-232 с.

33. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка. Природа и применение // Биофизика. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. М.-1977.-Т.7.

34. Туроверов К.К. и др. Ультрафиолетовая флуоресценция церулоплазмина человека. Спектральные и поляризационные характеристики / Туроверов К.К., Резункова О.П., Кузнецова И.М., Мошков К.А., Борисова О.П., Яковлев

A.С. // Биоорганич. химия.-1982.-Т.8, N 9.-С.1165-1172.

35. Bacci М. et al. Emission spectra from copper proteins containing type 3 centers / Bacci M., Baldecchi M. G., Fabeni P., Linari R., Passi G.P. 11 Biophys. Chem.-1983.-Vol.17.-N 2.-P.125-130.

36. Васильев В.Б. и др. Спектральные исследования механизма оксидазной активности церулоплазмина /Васильев

B.Б., Нейфах С. А., Русаков Д.В., Яковлева Т .Ю., Холмогоров В.Е. // Биохимия.-1988.-Т.53, Вып. 4 . -

C.620-625.

37. Gunnarsson Р.-О., Nylen U., Pettersson G. Effect of pH on Electron Paramagnetic Resonance spectra of ceruloplasmin // Eur. J. Biochem.-1973.-Vol.37, N 1.-P.47-50.

38. Vanngard T. Some properties of ceruloplasmin copper as studied by ESR spectroscopy // Magnetic Resonance in Biological Systems. Ed. by A.Ehrenberg, B.G.Malm-strom, T.Vanngard, Wenner-Green Center International Symposium Series.-Pergamon, Oxford.- 1967.-Vol.9.-

P.213-219.

39. Malmstrom B.G., Vanngard T. Electron Spin Resonance of copper proteins and some model complexes //J. Mol. Biol.-I960.-Vol.2, N 2.-P.118-124.

40. Vanngard T., Aasa R. ESR line shapes of polycrystal-line samples of S = 1/2 transition element ions // Paramagnetic Resonance. Ed. by W.Low, Academic Press, 1963.-Vol.2.-P.509-519.

41. Kasper С „В., Deutsch H.F., Beinert H. Studies on the state of copper in native and modified human cerulo-plasmin // J. Biol. Chem.-1963.-Vol.238, N 7.-P.2338-2342.

42. Guzzi R. et al. An EPR investigation on the structural heterogeneity in copper azurin and plastocyanin / Guzzi R„, Bizzarri A.R., Sportelli L., Cannistraro S. // Biophys. Chem.-1997.-Vol.63, N 2-3.-P.211-219.

43. Peisach J., Blumberg W.E. Structural implications derived from the analysis of electron paramagnetic resonance spectra of natural and artificial copper proteins // Arch. Biochem. Biophys.-1974.-Vol.165, N 2.-P.691-708.

44. Рыльков В.В., Тарасьев М.Ю., Мошков К.А. Новая форма медьсодержащих центров в церулоплазмине человека // Биохимия.-1990.-Т.55, Вып.8.-С.1367-137 4.

45. Frieden Е., Osaki S., Kobayahi Н. Copper protein and oxygen. Correlation between structure and function of tne copper oxidases // J. Gen. Physiol.-1965.-Vol.49, N 1.-P.213-252.

46. Andreasson L.-E., Vanngard T. Evidance of a specific copper (II) in human ceruloplasmin as a binding site for inhibitory anions//Biochim. Biophys. Acta.-1970.-Vol. 200.-P.247-257.

47. Morpurgo D., Desideri A., Rotilio G. Reactions of Rhus vernicifira laccase with aside and fluoride. Formation of a "half-Met-N3 -type" binding // Coordination Chemistry of Metalloenzymes.-1983.-P.207-213.

48. Cocco D. et al. Reduced anion binding and anion inhibition in Cu, Zn superoxide dismutase chemically modified at lysines without alteration of the rhombic distortion of the copper site / Cocco D., Mavelli I., Rossi L., Rotilio G. // Biophys.Biochem.Res.Commun.-1983.-Vol. Ill, N 3.-P.860-864.

49. Яковлева Т.Ю. Изучение спектральными методами переноса электронов церулоплазмином // Вестник ЛГУ.-N 631385.- Деп. от 2 6 августа 1985 г. ВИНИТИ, 7 С.

50. Dawson J.H., Dooley D.M., Gray Н.В. Coordination environment and fluoride binding of type 2 copper in the blue copper oxidase ceruloplasmin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1978.-Vol.75, N 9.- P.4078-4081.

51. Reinhammar B. et al. A new copper (II) Electron Paramagnetic Resonance signal in two laccases and in cytochome с oxidase / Reinhammar В., Maikin R., Jonson P., Karlsson B. Andreasson L.-E., Aasa R., Vanngard Т., Malmstrom B.G. // J. Biol. Chem.-1980.-Vol.255, N 11.-P.5000-5003.

52. Nakamura Т., Ogura X. Electron Spin Resonance studies on mushroom laccase // Magnetic resonance in biological systems.-Wenner-Green Center International Symposium Series, Ed. by A.Ehrenberg, В.G.Malmstrom,

T.Vanngard.- 1967.-Vol.9.-P.205-212.

53. Gatteschi D. Structural magnetic correlations in exchange coupled systems // Coordination Chemistry of Metalloenzymes.-1983.-P.215-228.

54. Мошков К.А., Яковлев А.С., Маслов В.Г. Фотохимическое

исследование медных хромофоров активных центров церу-лоплазмина человека // Биоорган,, химия.-1980.-Т.6.-С.413-425.

55. Bacci M. et al. Effect of UV laser radiation on copper-proteins / Bacci M., Fabeni P., Linari R., Pazzi G.P. // J.Mol.Struct.-1982.-Vol.79.-P.443-446.

56. Herve M. et al. The effect of laser radiations on human ceruloplasmin, absorption, circular dichroism and electron paramagnetic resonance study / Herve M., Gamier. A., Tosi L., Steinbuch M. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1978.- Vol.80, N 4.-P.797-804.

57. Zgirski A., Gasyna Z., Hilewcz-Grabska M. Primary electron-accepting sites and electron transport reaction in human ceruloplasmin // FEBS Lett.-1980.-Vol.113, N 2.-P.149-152.

58. Каюшин JI.П., Грибова З.П., Азизова О.А. Электронный парамагнитный резонанс фотопроцессов биологических соединений. М.: Наука.-1973.-304 С.

59. Gianquita G. et al. High temperature superconductivity in ceruloplasmin / Gianquita G., Falci G., Fazio R., Onori S., Cannistrato G. // Physica.-1988.-

Vol.C153-155,Ptl.-P.506-507.

60. Абрикосов A.A., Горьков Л.П. Спин-орбитальное взаимодействие и найтовский сдвиг в сверхпроводниках // Журн. Экспер. и Теор. Физики,- 1962.-Т.42, Вып.4.-

С.1088-1096.

61. Васильев В.В., Кононова C.B. Различия в каталитических свойствах фрагментов молекулы церулоплазмина // Биохимия.-1987.-Т.52, Вып.3.-С.387-395.

62. Calabrese L., Carbonaro M. An е.p.r. study of the non-equivalence of the copper sites of caeruloplasmin // Biochem. J.-198 6.-Vol.238.-P.2 91-295.

63o Walaas 0., Walaas E. Spin-labelling of ceruloplasmin by dymethyl-p-phenylenediamine // Magnetic resonance in biological systems, Wenner-Green Center International Symposium Series.-Ed. by A.Ehrenberg, B.G.Malm-strom, T.Vanngard, Pergamon, Oxford.-1967.-Vol.9.-P.337-339,

64. Deinum J., Vanngard T. The stoichiometry of the paramagnetic copper and the oxydation-reduction potentials of type 1 copper in human ceruloplasmin // Biochim. Biophys. Acta.-1973.-Vol.310.-P.321-330.

65. Amundsen A.R., Whelan J. Bosnich B. Biological Analogues. On the nature of the binding sites of copper-containing proteins //J. Amer. Chem. Soc.-1977.-Vol.99, N 20.-P.6730-6739.

66. Mc-Auliffe C.A. Inorganic analogues of biological molecules // Inorg. Biochem.-1982.-Vol.3.-P.1-32.

67. Solomon E.I., Penfield K.W., Wilcox D.E. Active sites in copper proteins. An electronic structure overview // Structure and Bonding 53.-Springer-Verlag, Berlin, N.Y.-1983.-P.1-57.

68. Freeman H.C. The nature of the Cu in "blue" copper proteins // Chem. Scr.-1983.-Vol.21.-P.81.

69. Cass A.E.G., Hill H.A.O. Copper proteins and copper enzymes //Biological roles of copper (Ciba Foundation Symposium 79) Excerpta Medica.-1980.-P.71-91.

70. Solomon E.I. et al. Spectroscopic studies of stella-cyanin, plastocyanin and asurin. Electronic structure of the blue copper sites / Solomon E.I., Hare J.W., Dooley D.M., Dawson J.H., Stephens P.J., Gray H.B. // J. Amer. Chem. Soc.-1980.-Vol.102, N 2.-P.168-178.

71. Solomon E.I., Hare J.W., Gray H.B. Spectroscopic studies and structural model for blue copper centers

in proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1976.-Vol.73.-P.1389.

72. Penfield K.W. et al. Spectroscopic studies of the monocrystalls of plastocyanine. Detail investigations of electronic structure of active sites of blue copper / Penfield K.W., Gay R.R., Himmelwright R.S., Rickman N.I., Norris V.A., Freeman H.G., Solomon E.I. // J. Amer. Chem. Soc.-1981.-Vol.103, N 15.-P.4382-4388.

73. Эмануэль H.M., Богданов Г.Н. ЭПР-исследования функциональной активности клеток при патологических состояниях // Магнитный резонанс в биологии и медицине. Всесоюзн.симпозиум. М.:Черноголовка. 19-22 марта 1981 г.-С.187-189.

74. Василец И.М. Церулоплазмины, их молекулярная структура и биологические функции // Успехи биологической химии.-1973.-Т.14.-С.172-201.

75. Frieden Е., Hsieh H.S. Ceruloplasmin: the copper transport protein with essential oxidase activity // Advances in enzymology.-1976.-Vol.44.-P.187-236.

76. Саенко E.JI. и др. Кинетическое исследование оксидаз-ной реакции церулоплазмина / Саенко E.J1., Сиверина 0.Б., Басевич В.В. // Биохимия.-198 6.-Т.51.-С.1017-1022.

77. Сиверина О.Б., Басевич В.В., Ярополов А.И. Влияние рН на оксидазную активность церулоплазмина // Биохимия.-1987.- Т.52.-С.232-238.

78. Ryden L. Copper proteins and enzymes // USA: CRC Press.-1984.-Vol.3.-P.37-100.

79. Варфоломеев С.Д. и др. Кинетика и механизм каталитического восстановления молекулярного кислорода в присутствии лакказы / Варфоломеев С.Д., Наки А.,

Ярополов А.И. // Биохимия.-1985.-Т.50.-С.1411-1420.

80. Сиверина О.Б. и др. Изучение предстационарной кинетики феррооксидазной реакции, катализируемой церуло-плазмином / Сиверина О.В., Саенко E.JI., Басевич В.В. // Биохимия.-1987.-Т.52.-С.1169-1173.

81. Тарасьев М.Ю. и др. О влиянии конформации церулоплаз-мина на его активность: значение для клинического анализа / Тарасьев М.Ю., Сабуренкова Е.П., Данциг М.И., Мошков К.А. Рыльков В.В. // Вопросы медицинской химии.-1991.-Т.37, N5.-С.43-46.

82. Эмануэль Н.М. Биофизические аспекты действия физических и химических факторов на живые организмы. Защитные свойства антиоксидантов // Биофизика.-1984.-

Т.29.-С.706-719.

83. Gutteridge M.C.J. Antioxidant properties of caerulo-plasmin toward iron- and copper-dependent oxygen radical formation // FEBS Lett.-1983.-Vol.157.-P.37-40.

84. Gutteridge J.M.C., Wilkins S. Copper salt-dependent hydroxyl radical formation damage to proteins acting as antioxidants // BBA.-1983.-Vol.759.-P.38-41.

85. Погосян Г.Г., Налбандян P.M. Ингибирование липидной пероксидации супероксиддисмутазой и церулоплазмином // Биохимия.-1983.-Т.48.-С.1129-1134.

86. Yamasshoji S., Kajimoto G. Antioxidant effect of caeruloplasmin on microsomal lipid peroxidation // FEBS Lett.-1983.-Vol.152.-P.168-17 0.

87. Механизм влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных / Под ред. Ганелиной И.Е., Самойловой К.А. - JI.: Наука, 1986. 264 с.

88. Самойлова К.А., Снопов С.А. Фотомодификация крови: Механизм быстрого, многообразного и безопасного ле-

чебного действия / Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине. I Междунар. конгресс. С.-Петербург, 16-19 июня 1997, С.32.

89. Иванов А.В., Захаров С.А. Идентификация первичного фотоакцептора, ответственного за биологические эффекты низкоэнергетического оптического излучения / Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине. I Междунар. конгресс. С.-Петербург, 16-19 июня 1997, С.35.

90. Горбатенкова Е.А. и др. Механизм фотореактивации су-пероксиддисмутазы светом гелий-неонового лазера / Горбатенкова Е.А., Азизова О.А., Парамонов Н.В., Владимиров Ю.А. // Докл. АН СССР.-1988,- Т.299, N 4.-С.995-1000.

91. Гаврилов В.В., Мишкорудная М.И. Спектрофотометричес-кое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело.-1983.-N3.-С.33-35.

92. Конюхова С.Г. и др. Роль активации перекисного окисления липидов в патогенезе экспериментального перитонита /Конюхова С.Г., Дубикайтис А.Ю. , Шабуневич Л.В., Страшнов В.И., Белоцерковский М.В. // Бюллетень эксп. биол. и мед. - 1989.-N 5.-С.557-559.

93. Glavind J. Antioxidants in animal tissue // Acta Chem. Scand.-1963.-Vol.17.-N 6.-P.1635-1640.

94. Ravin M. An inproved colorometric enzymatic assay of ceruloplasmin // J. Lab. Clin. Med.-1961.-Vol.58 .-P.161-165.

95. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochimie.-1975.-Vol.57.-N5.-P.657-660.

96. Lowry 0. et.al. Protein measurement with Folin phenol reagent / Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L.,

Randall R.J. // J. Biol. Chem.-1951.-Vol.193.-P.2 65275.

97. Rosner E., Mihok J. Egyszerli serum-res meghatarozas oxalildihidraziddal // Kiserl. orvostud.-1971.-Vol. 23.-Nl.-P.92-97.

98. Reinhammar B. // Copper proteins and copper enzymes / Ed.Lontie R. Florida: CRC Press Inc., Boca Raton, 1984.-Vol.3.-P.1-67.

99. Farragi M., Pecht I. // J.Biol.Chem.-1973.-Vol.248, N9.-P.3146-3149.

100.Malmstrom B.G. // New trends in bio-inorganic chemistry . -1978 . -P . 59-77 .

101.Ryden L. // Proc.Nat.Acad.Sci.USA.-1982.-Vol.79.-N 22.-P.6767-6771.

102.Takahashi N., Bauman R.A., Ortel T.L. et.al.// Proc.Nat.Acad.Sci.USA.-1983.-Vol.80.-Nl.-P.115-119.

ЮЗ.Березин Ю.Д. и др. Особенности регенерации слизистой оболочки рта и глотки при воздействии гелий-неонового лазера / Березин Ю.Д., Иванов B.C., Плужников М.С., Прочуханов Р.А., Самсонова И.Е. // Вестн.хир. им.И.И. Грекова.-1984.-N5.-С.64-65.

104.Гуща A.JI. Воздействие излучения гелий-неонового лазера на фибринолитическую активность крови / Гуща A. JI., Швальб П. Г., Семионкин Е.И., Васин В. А. // Хирургия.-1978.-N2.-С.106-107.

105.Черток В.А. Лазеры и медицина. 1989.

106.Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / М.: Наука, 1972, 252 с.

107.Васильев В.Б., Качурин A.M., Сорока Н.В. Дисмутиро-вание супероксидных радикалов церулоплазмином -детали механизма.// Биохимия.-1988.-Т.53, N 12.-

С.2051-2058.

108.Gutteridge J.M.C., Ouinlan G.J. Antioxidant protection against organic and inorganic oxygen radicals by normal human plasma: the important role for iron-binding and iron-oxidising proteins // Biochim.Biophis.Acta.-1993.-Vol.1156.-P.144-150.

109.Gutteridge J.M.C. Antioxidant properties of the proteins caeruloplasmin, albumin and transferrin //Biochim.Biophis.Acta.-198 6.-Vol.8 69(P33).-N2.-P.112-127.

110.Тинтерис (Шабуневич) JI.В. Изучение регуляции биосинтеза и активности церулоплазмина в эксперименте и механизмы гиперцерулоплазминемии при некоторых патологических состояниях человека // Автореф.дис... канд.биол.наук.-Л., 19 7 5.

111.Саенко Е.Л., Басевич В. В., Ярополов А.И. Особенности взаимодействия церулоплазмина со специфическим рецептором эритроцитов человека // Биохимия.-1988.-Т.53, N 2.-С.317-321.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.