Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Черкашин, Евгений Александрович

• Черкашин, Евгений Александрович
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Черкашин, Евгений Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Медьсодержащие оксидазы.

2.1.1. Аскорбатоксидаза.

2.1.2. Церулоплазмин.

2.1.3. Лакказа.'.'./.

2.2. Структура медных центров.

2.3. Спектральные свойства ионов меди.

2.3.1. Предполагаемый механизм катализа у лакказ.

2.4. Структурная организация медьсодержащих оксидаз.

2.4.1. Доменная организация медьсодержащих оксидаз.

2.4.2. Структуры лакказ.

2.5. Геномная организация лакказ.

2.5.1.Изоферменты лакказ.

2.5.2. Экзон-интронная организация гена лакказ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты.

3.1.2. Носители.

3.1.3. Реагенты.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Культивирование штаммов продуцентов лакказы.

3.2.2. Выделение хромосомной ДНК.

3.2.3. Проведение ПЦР.

3.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.5. Очистка ПЦР-продуктов.

3.2.6. Рестрикция ДНК.

3.2.7. Лигирование ДНК.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Математическая обработка данных секвенирования.

3.2.10. Компьютерное моделирование.

3.2.11. Визуализация белковых структур.

3.2.12. Выделение и очистка лакказы.

3.2.12.1. Очистка фермента методом ВЭЖХ.

3.2.12.2. Очистка фермента методом гаоэлектрофокусировапия.

3.2.12.3. Очистка фермента методом препаративного электрофореза.

3.2.13. Контроль гомогенности препаратов.

3.2.14. Определение активности лакказы.

3.2.15. Определение концентрации белка.

3.2.16. Выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей лакказ.

3.2.17. Получение кристаллов лакказы.

3.2.18. Сбор кристаллографических данных и их обработка.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Определение наличия гена лакказы в геноме базидиальных грибов.

4.2. Определение аминокислотной последовательности лакказы C.hirsutus клонированием гена с хромосомной ДНК.

4.2.1. Конструирование и синтез праймеров для клонирования лакказы из C.hirsutus

4.2.2. Оптимизация условий проведения ПЦР.

4.2.3. Оптимизация конструкций новых олигонуклеотидных праймеров для клонирования лакказы из C.hirsutus.

4.2.4. Получение полных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей лакказы C.hirsutus.

4.3. Определение полной аминокислотной последовательности высоко редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea.

4.4. Определение аминокислотной последовательности средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus.

4.5. Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea.

4.6. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ.

4.7. Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ.

4.8. Определение видовой принадлежности базидиальных грибов.

4.9. Структурные исследования лакказ.

4.9.1. Структуры лакказы C.hirsutus.

4.9.2. Структуры лакказ C.maxima, C.zonatus.

4.9.3. Моделирование структур лакказ P.ostreatus и C.fulvocinerea.

4.10. Анализ аминокислотного окружения Т1 центра лакказ.

4.13. Анализ второй координационной сферы иона меди Т1.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов»

Лакказа (я-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) принадлежит к семейству медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до воды, минуя стадию образования перекиси водорода.

Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году и к настоящему времени она насчитывает более чем столетнюю историю изучения[1]. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 лакказ из различных источников: грибы, растения, насекомые и бактерии. Большая часть изученных лакказ выделена из базидиальных грибов, в которых этот фермент играет ключевую роль в процессах биодеградации лигнина, образовании пигментов, детоксификации и т.д. Лакказа является полифункциональным ферментом, в растениях функция лакказы связана с процессом синтеза лигнина - биополимера, составляющего до 50% сухой массы древесины; в насекомых она участвует в процессах склеротизации [2] и детоксификации, в частности, при метаболических нарушениях, связанных с обменом железа [3]. Также было показано наличие лакказ или лакказоподобных ферментов в бактериях, однако, классификация и сам факт отнесения этих ферментов к лакказам все еще вызывает споры [4].

Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов, ароматических аминов и других соединений. Субстратную специфичность можно также расширить, используя различные редокс-медиаторы, в присутствии которых лакказы способны также окислять различные нефенольные соединения, такие как соли Мп2+ в составе хелатных комплексов [5].

Все эукариотические лакказы являются гликопротеинами с различной степенью гликозилирования (от 10 до 44%). Активный центр лакказы содержит четыре иона меди, организованных в моноядерный медный центр (Т1) и трехъядерный медный кластер (Т2/ТЗ). Лакказа является наиболее просто организованной медьсодержащей оксидазой, что позволяет использовать ее в качестве модели в фундаментальных исследованиях медьсодержащих белков [6].

Каталитические свойства фермента и его широкая субстратная специфичность, возможность использования в качестве субстрата акцептора электронов молекулярного кислорода, способность катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму и достаточно высокая стабильность обеспечивают широкое практическое применение лакказ. Первые попытки практического использования лакказы определялись ее способностью эффективно разлагать лигнин в присутствии редокс медиаторов [7]. Этот биополимер является одним из самых устойчивых к химической и микробиологической деградации отходом деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, поэтому альтернативные технологии на основе лакказы, позволяющие резко снизить техногенную нагрузку, вызывали и вызывают значительный интерес. Широкое использование этого фермента при создании различных типов биосенсоров, в первую очередь, связано с его способностью катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму. Возможности практического использования лакказы в биотехнологии и различных отраслях промышленности достаточно полно освещены в обзорах [6-8]. Однако, следует подчеркнуть, что все практические разработки выполнены только на лабораторном уровне.

Наиболее консервативной частью лакказы является активный центр, содержащий четыре иона меди и координирующие их аминокислотные лиганды, формирующие уникальную структуру, определяющую спектральные и каталитические характеристики фермента. Уникальный ансамбль из четырех ионов меди, организованных в моноядерный медный центр (Т1) и трехъядерный медный кластер (Т2/ТЗ) обеспечивает процесс катализа. Известно, что эффективность катализа у лакказ зависит от структурных особенностей субстрата - донора электронов и окислительно-восстановительного потенциала медного центра (Т1) фермента (ОВП). Следовательно, наибольший практический интерес представляют лакказы с высоким ОВП, поскольку они способны более эффективно разрушать лигнин и другие соединения как фенольной, так и нефенольной природы [9]. Тем не менее, ответить на вопрос, что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра, до сих пор не удалось. Структурный анализ лакказ из различных источников позволил выдвинуть ряд гипотез, ни одна из которых пока не получила экспериментального подтверждения. Несмотря на использование самых современных физико-химических методов, наличия большого количества данных по аминокислотной последовательности лакказ и структурных данных, однозначную взаимосвязь между структурой фермента и механизмом его действия установить не удается. Также не удается ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы, такие как: какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих Т1 центр, и что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях. Таким образом, изучение генетической организации лакказ и установление структурно-функциональных особенностей данных ферментов является актуальным как с фундаментальной (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (создание рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Черкашин, Евгений Александрович

5. ВЫВОДЫ

1. Определены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности пяти высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A.faginea(T.versicolor) и одной средне редокс-потенциальной из P.ostreatus.

2. Определена экзон-интронная структура генов лакказ. Показано, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 8-10 интронов, в то время как средне редокс-потенциальные более 10. Для всех базидиальных грибов обнаружено наличие трех интронов в положениях 80, 90 и 210. Установлены интроны, характерные только для высоко редокс-потенциальных лакказ (положения 160, 240, 330 и 370).

3. Определено филогенетическое положение исследуемых штаммов базидиомицетов.

4. Проведено сравнение центров Т1 высоко и средне редокс-потенциальных лакказ, структуры которых получены РСА и математическим моделированием. Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении 206 остатков Asn или Asp, а также наличие в структуре водородной связи между остатками Glu460 и Serl 13.

5. Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Черкашин, Евгений Александрович, 2009 год

1. Nitta, К., К. Kataoka, and Т. Sakurai, Primary structure of a Japanese lacquer tree laccase as a prototype enzyme of multicopper oxidases. J Inorg Biochem, 2002. 91(1): p. 125-31.

2. Hoegger, P.J., et al., Phylogenetic comparison and classification of laccase and related multicopper oxidase protein sequences. FEBS J, 2006. 273(10): p. 2308-26.

3. Valderrama, В., et al., Evolutionary and structural diversity of fungal laccases. Antonie Van Leeuwenhoek, 2003. 84(4): p. 289-99.

4. Claus, H., Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch Microbiol, 2003. 179(3): p. 145-50.

5. Ullrich, R. and M. Hofrichter, Enzymatic hydroxylation of aromatic compounds. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(3): p. 271-93.

6. Baldrian, P., Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiol Rev, 2006. 30(2): p. 215-42.

7. Kunamneni, A., et al., Laccases and their applications: a patent review. Recent Pat Biotechnol, 2008. 2(1): p. 10-24.

8. Mayer, A.M. and R.C. Staples, Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 2002. 60(6): p. 551-65.

9. Xu, F., et al., Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity andpHprofile. Biochem J, 1998. 334 ( Pt 1): p. 6370.

10. Nakamura, К. and N. Go, Function and molecular evolution of multicopper blue proteins. Cell Mol Life Sci, 2005. 62(18): p. 2050-66.

11. Suzuki, S., K. Kataoka, and K. Yamaguchi, Metal coordination and mechanism of multicopper nitrite reductase. Acc Chem Res, 2000. 33(10): p. 728-35.

12. Sakurai, T. and K. Kataoka, Structure and function of type I copper in multicopper oxidases. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(19-20): p. 2642-56.

13. Brissos, V., et al., Expression system of CotA-laccase for directed evolution and high-throughput screenings for the oxidation of high-redox potential dyes. Biotechnol J, 2009.

14. Enguita, F.J., et al., Subsfrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis. J Biol Chem, 2004. 279(22): p. 23472-6.

15. Tanaka, A., et al., Static and kinetic studies on the binding of Streptomyces trehalose inhibitor SGI with Rhizopus glucoamylase. Comparison with glucose and gluconolactone. J Biochem, 1982. 91(1): p. 1-9.

16. Askwith, C., et al., The FET3 gene of S. cerevisiae encodes a multicopper oxidase required for ferrous iron uptake. Cell, 1994. 76(2): p. 403-10.

17. Dancis, A., et al., Molecular characterization of a copper transport protein in S. cerevisiae: an unexpected role for copper in iron transport. Cell, 1994. 76(2): p. 393-402.

18. Rensing, С. and G. Grass, Escherichia coli mechanisms of copper homeostasis in a changing environment. FEMS Microbiol Rev, 2003. 27(2-3): p. 197-213.

19. Kosman, D.J., FET3P, ceruloplasmin, and the role of copper in iron metabolism. Adv Protein Chem, 2002. 60: p. 221-69.

20. Francis, C.A. and B.M. Tebo, cumA multicopper oxidase genes from diverse Mn (II)-oxidizing and non-Mn (II) -oxidizing Pseudomonas strains. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(9): p. 4272-8.

21. Wu, W.S., W.H. Li, and B.S. Chen, Computational reconstruction of transcriptional regulatory modules of the yeast cell cycle. BMC Bioinformatics, 2006. 7: p. 421.

22. Webb, S.M., et al., Evidence for the presence of Mn(III) intermediates in the bacterial oxidation of Mn(II). Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(15): p. 5558-63.

23. Silver, S. and G. Ji, Newer systems for bacterial resistances to toxic heavy metals. Environ Health Perspect, 1994. 102 Suppl 3: p. 107-13.

24. Sakurai, T. and K. Kataoka, Basic and applied features of multicopper oxidases, CueO, bilirubin oxidase, and laccase. Chem Rec, 2007. 7(4): p. 220-9.

25. Kataoka, K., et al., Structure and function of the engineered multicopper oxidase CueO from Escherichia coli—deletion of the methionine-rich helical region covering the substrate-binding site. J MolBiol, 2007. 373(1): p. 141-52.

26. Farver, О., et al., The effect of driving force on intramolecular electron transfer in proteins. Studies on single-site mutated azurins. Eur J Biochem, 1992. 210(2): p. 399-403.

27. Liso, R., et al., Localization of ascorbic acid, ascorbic acid oxidase, and glutathione in roots of Cucurbita maxima L. J Exp Bot, 2004. 55(408): p. 2589-97.

28. Messerschmidt, A. and R. Huber, The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationships. Eur J Biochem, 1990. 187(2): p. 341-52.

29. Pignocchi, C., et al., The function of ascorbate oxidase in tobacco. Plant Physiol, 2003. 132(3): p. 1631-41.

30. Wilson, J.X., Mechanism of action of vitamin С in sepsis: ascorbate modulates redox signaling in endothelium. Biofactors, 2009. 35(1): p. 5-13.

31. Messerschmidt, A., et al., X-ray crystal structure of the blue oxidase ascorbate oxidase from zucchini. Analysis of the polypeptide fold and a model of the copper sites and ligands. J Mol Biol, 1989. 206(3): p. 51329.

32. Santagostini, L., et al., Probing the location of the substrate binding site of ascorbate oxidase near type 1 copper: an investigation through spectroscopic, inhibition and docking studies. Int J Biochem Cell Biol, 2004. 36(5): p. 881-92.

33. Mei, G., et al., Role of quaternary structure in the stability of dimeric proteins: the case of ascorbate oxidase. Biochemistry, 1997. 36(36): p. 10917-22.

34. Holmberg, C.G., On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum. Acta Physiol. Scand, 1944. 8: p. 227-229.

35. Holmberg, C.G. and C.B. Laurell, Investigation in serum copper. Acta Chem. Scand., 1948. 2: p. 550-556. .

36. Osaki, S., Kinetic studies of ferrous ion oxidation with crystalline human ferrooxidase (ceruloplasmin). J. Biol. Chem., 1966. 241: p. 5053-5059.

37. Mukhopadhyay, C.K., et al., Identification of the prooxidant site of human ceruloplasmin: a model for oxidative damage by copper bound to protein surfaces. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(21): p. 1154651.

38. Vachette, P., et al., A key structural role for active site type 3 copper ions in human ceruloplasmin. J Biol Chem, 2002. 277(43): p. 40823-31.

39. Hellman, N.E. and J.D. Gitlin, Ceruloplasmin metabolism and function. Annu Rev Nutr, 2002. 22: p. 439-58.

40. Hellman, N.E., et al., Mechanisms of copper incorporation into human ceruloplasmin. J Biol Chem, 2002. 277(48): p. 46632-8.

41. Texel, S.J., X. Xu, and Z.L. Harris, Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases. Biochem Soc Trans, 2008. 36(Pt 6): p. 1277-81.

42. Healy, J. and K. Tipton, Ceruloplasmin and what it might do. J Neural Transm, 2007. 114(6): p. 777-81.

43. Vassiliev, V., Z.L. Harris, and P. Zatta, Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases. Brain Res Brain Res Rev, 2005. 49(3): p. 633-40.

44. Ryden, L., Human ceruloplasmin as a polymorphic glycoprotein. Tryptic glycopeptides from two forms of the protein. Int J Protein Res, 1971. 3(4): p. 191-200.

45. Magdoff-Fairchild, В., F.M. Lovell, and B.W. Low, An x-ray crystallographic study of ceruloplasmin. Determination of molecular weight. J Biol Chem, 1969. 244(13): p. 3497-9.

46. Broman, L., Separation and characterization of two coeruloplasmins from human serum. Nature, 1958. 182(4650): p. 1655-7.

47. Ortel, T.L., N. Takahashi, and F.W. Putnam, Structural model of human ceruloplasmin based on internal triplication, hydrophilic/hydrophobic character, and secondary structure of domains. Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(15): p. 4761-5.

48. Boivin, S., et al., Molecular characterization of human and bovine ceruloplasmin using MALDI-TOF mass spectrometry. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 288(4): p. 1006-10.

49. Ryan, T.P., T.A. Grover, and S.D. Aust, Rat ceruloplasmin: resistance to proteolysis and kinetic comparison with human ceruloplasmin. Arch Biochem Biophys, 1992. 293(1): p. 1-8.

50. Cappelli-Bigazzi, M., et al., Ceruloplasmin impairs endothelium-dependent relaxation of rabbit aorta. Am J Physiol, 1997. 273(6 Pt 2): p. H2843-9.

51. Bielli, P. and L. Calabrese, Structure to function relationships in ceruloplasmin: a 'moonlighting'protein. CellMol Life Sci, 2002. 59(9): p. 1413-27.

52. Grossmann, J.G., et al., X-ray absorption studies and homology modeling define the structural features that specify the nature of the copper site in rusticyanin. Biochemistry, 1995. 34(26): p. 8406-14.

53. Munoz, C., et al., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii: characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn2+ oxidation. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(6): p. 2166-74.

54. Guillen, F., et al., Quinone redox cycling in the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii leading to extracellular production of superoxide anion radical. Arch Biochem Biophys, 1997. 339(1): p. 190-9.

55. Munoz, C., et al., Induction and Characterization of Laccase in the Ligninolytic Fungus Pleurotus eryngii. Curr Microbiol, 1997. 34(1): p. 1-5.

56. Shleev, S.V., et al., Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie, 2004. 86(9-10): p. 693-703.

57. Slomczynski, D., J.P. Nakas, and S.W. Tanenbaum, Production and Characterization of Laccase from Botrytis cinerea 61-34. Appl Environ Microbiol, 1995. 61(3): p. 907-912.

58. Kawasaki, N., et al., The significance of glycosylation analysis in development of biopharmaceuticals. Biol Pharm Bull, 2009. 32(5): p. 796-800.

59. Cambria, M., et al., Production, purification, and properties of an extracellular laccase from Rigidoporus lignosus. Protein Expr Purif, 2000. 18(2): p. 141-7.

60. Palmieri, G., et al., Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(3): p. 920-4.

61. Fernandez-Larrea, J. and U. Stahl, Isolation and characterization of a laccase gene from Podospora anserina. Mol Gen Genet, 1996. 252(5): p. 539-51.

62. Bollag, J.M. and A. Leonowicz, Comparative Studies of Extracellular Fungal Laccases. Appl Environ Microbiol, 1984. 48(4): p. 849-854.

63. Morozova, O.V., et al., "Blue" laccases. Biochemistry (Mosc), 2007. 72(10): p. 1136-50.

64. Xu, F., et al., Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper. J Biol Chem, 1999. 274(18): p. 123725.

65. Bourbonnais, R., et al., Reactivities of Various Mediators and Laccases with Kraft Pulp and Lignin Model Compounds. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(12): p. 4627-4632.

66. Giardina, P., et al., Cloning and sequencing of a laccase gene from the lignin-degrading basidiomycete Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol, 1995. 61(6): p. 2408-13.

67. Giardina, P., et al., The gene, protein and glycan structures of laccase from Pleurotus ostreatus. Eur J Biochem, 1996. 235(3): p. 508-15.

68. Palmieri, G., et al., A novel white laccase from Pleurotus ostreatus. J Biol Chem, 1997. 272(50): p. 31301-7.

69. Giardina, P., et al., Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatusl. Biochem J, 1999. 341 ( Pt3): p. 655-63.

70. Zumarraga, M., et al., Altering the laccase functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra. Proteins, 2008. 71(1): p. 250-60.

71. Pezzella, C., et al., The Pleurotus ostreatus laccase multi-gene family: isolation and heterologous expression of new family members. Curr Genet, 2009. 55(1): p. 45-57.

72. Cullen, D., Recent advances on the molecular genetics of ligninolytic fungi. J Biotechnol, 1997. 53(2-3): p. 273-89.

73. Lomascolo, A., et al., Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry. Trends Biotechnol, 1999. 17(7): p. 282-9.

74. Eggert, C., U. Temp, and K.E. Eriksson, Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS Lett, 1997. 407(1): p. 89-92.

75. Bajpai, P., A. Anand, and P.K. Bajpai, Bleaching with lignin-oxidizing enzymes. Biotechnol AnnuRev, 2006. 12: p. 349-78.

76. Garrett, T.P., et al., The ciystal structure of poplar apoplastocyanin at 1.8-A resolution. The geometry of the copper-binding site is created by the polypeptide. J Biol Chem, 1984. 259(5): p. 2822-5.

77. Palmer, A.E., et al., Spectroscopic characterization and 02 reactivity of the trinuclear Си cluster of mutants of the multicopper oxidase Fet3p. Biochemistry, 2002. 41(20): p. 6438-48.

78. Palmer, A.E., et al., Spectroscopic characterization of the Leu513His variant offungal laccase: effect of increased axial ligand interaction on the geometric and electronic structure of the type 1 Си site. Inorg Chem, 2003. 42(13): p. 4006-17.

79. Solomon, E.I., et al., 02 and N20 activation by Bi-, Tri-, and teti-anuclear Си clusters in biology. Acc Chem Res, 2007. 40(7): p. 581-91.

80. Fraterrigo, T.L., et al., Which copper is paramagnetic in the type 2/type 3 cluster of laccase? J Biol Inorg Chem, 1999. 4(2): p. 183-7.

81. Adman, E.T., Copper protein structures. Adv Protein Chem, 1991. 42: p. 145-97.

82. Huang, H.W., et al., Magnetic studies of the trinuclear center in laccase and ascorbate oxidase approached by EPR spectroscopy and magnetic susceptibility measurements. Biochim Biophys Acta, 1998. 1384(1): p. 160-70.

83. Augustine, A.J., et al., Spectroscopic and kinetic studies of perturbed trinuclear copper clusters: the role of protons in reductive cleavage of the O-O bond in the multicopper oxidase Fet3p. J Am Chem Soc, 2007. 129(43): p. 13118-26.

84. Peyratout, C.S., et al., EPR studies of ligand binding to the type 2/type 3 cluster in tree laccase. Arch Biochem Biophys, 1994. 314(2): p. 40511.

85. Enguita, F.J., et al., Structural Characterization of a Bacterial Laccase Reaction Cycle. To be Published.

86. Lu, H., et al., Reversible translocation of glycoprotein lb in plasmin-treated platelets: consequences for platelet function. Eur J Clin Invest, 1993. 23(12): p. 785-93.

87. Dawson, K.A., M.C. Preziosi, and D.R. Caldwell, Some effects of uncouplers and inhibitors on growth and electron transport in rumen bacteria. J Bacterid, 1979. 139(2): p. 384-92.

88. Sakurai, Т., Kinetics of electron transfer between cytochrome с and laccase. Biochemistry, 1992. 31(40): p. 9844-7.

89. Sakurai, T. and J. Takahashi, EPR spectra of type 3 copper centers in Rhus vernicifera laccase and Cucumis sativus ascorbate oxidase. Biochim Biophys Acta, 1995. 1248(2): p. 143-8.

90. Quintanar, L., et al., Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner. Acc Chem Res, 2007. 40(6): p. 445-52.

91. Ducros, V., et al., Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Си-depleted' isoforms. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 2001. D57: p. 333-336.

92. Beratan, D.N., et al., Electron-tunneling pathways in proteins. Science, 1992. 258(5089): p. 1740-1.

93. Hakulinen, N., et al., A near atomic resolution structure of a Melanocarpus albomyces laccase. Journal of Structural Biology, 2008. 162(1): p. 29-39.

94. Bento, I., et al., Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalton Trans, 2005(21): p. 3507-13.

95. Castilho, F.J., et al., On the diversity of the laccase gene: a phylogenetic perspective from Botryosphaeria rhodina (Ascomycota: Fungi) and other related taxa. Biochem Genet, 2009. 47(1-2): p. 80-91.

96. Ducros, V., et al., Crystal structure of the type-2 Си depleted laccase from Coprinus cinereus at 2.2 A resolution. Nat Struct Biol, 1998. 5(4): p. 310-6.

97. Hakulinen, N., et al., Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Biol, 2002. 9(8): p. 601-5.

98. Ferraroni, M., et al., Crystal structure of a blue laccase from Lentinus tigrinus: evidences for intermediates in the molecular oxygen reductive splitting by multicopper oxidases. BMC Struct Biol, 2007. 7: p. 60.

99. Garavaglia, S., et al., The structure of Rigidoporus lignosus Laccase containing a full complement of copper ions, reveals an asymmetrical arrangement for the T3 copper pair. J Mol Biol, 2004. 342(5): p. 151931.

100. Piontek, К., M. Antorini, and Т. Choinowski, Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37663-9.

101. Ducros, V., et al., Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Си-depleted' isoforms. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001. 57(Pt 2): p. 333-6.

102. Lyashenko, A.V., et al., Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima. Acta Crystallogr SectF Struct Biol Cryst Commun, 2006. 62(Pt 10): p. 954-7.

103. Polyakov, K.M., et al., Structure of native laccase from Trametes hirsuta at 1.8 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 6): p. 611-7.

104. Enguita, F.J., et al., Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties. J Biol Chem, 2003. 278(21): p. 19416-25.

105. Skalova, Т., et al., The structure of the small laccase from Streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases. J Mol Biol, 2009. 385(4): p. 1165-78.

106. Hakulinen, N., et al., A crystallographic and spectroscopic study on the effect of X-ray radiation on the crystal structure of Melanocarpus albomyces laccase. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 350(4): p. 929-34.

107. Ong, E., W.B. Pollock, and M. Smith, Cloning and sequence analysis of two laccase complementary DNAs from the ligninolytic basidiomycete Trametes versicolor. Gene, 1997. 196(1-2): p. 113-9.

108. Yaver, D.S., et al., Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(3): p. 834-41.

109. Wahleithner, J. A., et al., The identification and characterization of four laccases from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani. Curr Genet, 1996. 29(4): p. 395-403.

110. Collins, P.J. and A. Dobson, Regulation of Laccase Gene Transcription in Trametes versicolor. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(9): p. 34443450.

111. Yaver, D.S. and E.J. Golightly, Cloning and characterization of three laccase genes from the white-rot basidiomycete Trametes villosa: genomic organization of the laccase gene family. Gene, 1996. 181(1-2): p. 95-102.

112. Hoegger, P. J., et al., The laccase gene family in Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus). Curr Genet, 2004. 45(1): p. 9-18.

113. Kiiskinen, L.L., M. Ratto, and K. Kruus, Screening for novel laccase-producing microbes. J Appl Microbiol, 2004. 97(3): p. 640-6.

114. Baralle, D. and M. Baralle, Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. J Med Genet, 2005. 42(10): p. 737-48.

115. Patthy, L., Intron-dependent evolution: preferred types of exons and introns. FEBS Lett, 1987. 214(1): p. 1-7.

116. Rogozin, I.B., et al., Analysis of evolution of exon-intron structure of eukaryotic genes. Brief Bioinform, 2005. 6(2): p. 118-34.

117. Ochman, H., A.S. Gerber, and D.L. Hartl, Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics, 1988. 120(3): p. 621-3.

118. Quaratino, D., et al., Production, purification and partial characterisation of a novel laccase from the white-rot fungus Panus tigrinus CBS 577.79. Antonie Van Leeuwenhoek, 2007. 91(1): p. 57-69.

119. D'Souza, T.M., K. Boominathan, and C.A. Reddy, Isolation of laccase gene-specific sequences from white rot and brown rot fungi by PCR. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(10): p. 3739-44.

120. Liu, W., et al., Molecular cloning and characterization of a laccase gene from the basidiomycete Fome lignosus and expression in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol, 2003. 63(2): p. 174-81.

121. Bonomo, R.P., et al., A comparative study of two isoforms of laccase secreted by the "white-rot" fungus Rigidoporus lignosus, exhibiting significant structural and functional differences. J Inorg Biochem, 1998. 71(3-4): p. 205-11.

122. Nicole, M., et al., Immunocytochemical localization of laccase LI in wood decayed by Rigidoporus lignosus. Appl Environ Microbiol, 1992. 58(5): p. 1727-39.

123. Heinzkill, M., et al., Characterization oflaccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl Environ Microbiol, 1998. 64(5): p. 1601-6.

124. Joo, S.S., et al., Molecular cloning and expression of a laccase from Ganoderma lucidum, and its antioxidative properties. Mol Cells, 2008. 25(1): p. 112-8.

125. Hellman, N.E., et al., Biochemical analysis of a missense mutation in aceruloplasminemia. J Biol Chem, 2002. 277(2): p. 1375-80.

126. Jasalavich, C.A., A. Ostrofsky, and J. Jellison, Detection and identification of decay fungi in spruce wood by restriction fragment length polymorphism analysis of amplified genes encoding rRNA. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(11): p. 4725-34.

127. Lyashenko, A.V., et al., X-ray structural studies of the fungal laccase from Cerrena maxima. J Biol Inorg Chem, 2006. 11(8): p. 963-73.1. БЛАГОДАРНОСТИ

128. Автор выражает глубокую признательность:

129. Полякову К.М. ст.н.с. Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН за оказанную помощь в проведении анализа структур лакказ.

130. Упорову И.В ст.н.с. кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова за помощь в проведении математического моделирования структур лакказ.

131. Рожковой A.M. н.с. Института биохимии имени А.Н. Баха РАН за оказанную помощь в проведении экспериментов по клонированию генов лакказ.