Создание модели для изучения опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. с использованием трансгенных растений по гену IPT тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Фролова, Надежда Владимировна

• Фролова, Надежда Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фролова, Надежда Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЦИТОКИНИНОВ В МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ У РАСТЕНИЙ.

2.1. ЦИТОКИНИНЫ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ В РАСТЕНИИ.

2.2. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ МЕТАБОЛИЗМА ЦИТОКИНИНОВ: БИОСИНТЕЗ И ДЕГРАДАЦИЯ.

2.2.1. АДЕНИЛАТНЫЕ И Т-РНК ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗЫ - ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА ЦИТОКИНИНОВ У РАСТЕНИЙ.

2.2.2. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗ IN VITRO.

2.2.3. ЦИТОКИНИНОКСИДАЗЫ - ФЕРМЕНТЫ ДЕГРАДАЦИИ ЦИТОКИНИНОВ, ИХ ВКЛАД В РЕГУЛЯЦИЮ МЕТАБОЛИЗМА ЦИТОКИНИНОВ В РАСТЕНИИ.

2.3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ЦИТОКИНИНОВ В ЖИЗНИ РАСТЕНИЯ.

2.3.1. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД: ВЫЯВЛЕНИЕ «ЦИТОКИНИНОВЫХ» МУТАНТОВ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ.

2.3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ЦИТОКИНИНОВ В МОРФОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ.

2.4. МНОГООБРАЗИЕ ТИПОВ НЕОПЛАСТИЧЕСКОГО РОСТА У РАСТЕНИЙ.

2.4.1. КОРОНЧАТЫЕ ГАЛЛЫ - ОПУХОЛИ РАСТЕНИЙ, ИНДУЦИРУЕМЫЕ Agrobacterium tumefaciens.

2.4.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОПУХОЛИ РАСТЕНИЙ.

2.4.3. МЕЖВИДОВЫЕ ГИБРИДЫ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИЯ. НАСЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОПУХОЛЕЙ У

МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ РОДА Nicotiana.

2. 5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ

РЕДИСА - МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ГОРМОНОВ В ОПУХОЛЕБРАЗОВАНИИ.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.1.1. РАСТИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ.

3.1.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ.

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. МЕТОД АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ IN VIVO.

3.2.2. ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИИ НА ЭКЗОГЕННЫЕ ФИТОГОРМОНЫ

IN VITRO.

3.2.3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНИНОВ И ИУК В РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТАХ.

3.2.5. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ СО ВСТАВКОЙ ГЕНА БИОСИНТЕЗА ЦИТОКИНИНА ИЗОПЕНТЕНИЛТРАНСФЕРАЗЫ (IPT) И НЕОМИЦИНФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ (NPTII) МЕТОДОМ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ БЕЗОПУХОЛЕВОЙ ЛИНИИ №30 IN VIVO.

4.1.1. Получение растений редиса, трансгенных по генам биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы ipt и неомицинфосфотрансферазы nptll.

4.1.2. Получение растений редиса, трансгенных по гену неомицинфосфотрансферазы nptll.

4.2. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА IPT У ОПУХОЛЕОБРАЗУЮЩИХ И БЕЗОПУХОЛЕВЫХ ТРАНСФОРМАНТОВ.

4.3. ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ФИТОГОРМОНАМ IN VITRO

ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ВСТАВКУ ГЕНА IPT.

4. 3. 1. Исследование чувствительности трансгенных растений редиса линии №30 к цитокинину in vitro.

4.3.2. Изучение реакии на цитокинин БАП (6-бензиламинопурин) трансгенных по гену ipt растений редиса.

4.3.3. Оценка чувствительности эксплантов к ауксинам in vitro.

4.3.3.1. Изучение реакции на ауксин 2,4 Д (10 мг/л).

4.3.3.2. Анализ реакции на ауксины: НУ К в концентрации 2 мг/л и ИУК в концентрации

1 мг/л.

4.4.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНИНОВ И ИУК В ТКАНЯХ ОПУХОЛЕВЫХ И БЕЗОПУХОЛЕВЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПО ГЕНУ IPT.

4.4.1. Количественное определение эндогенного уровня ИУК у некоторых трансгенных по гену ipt растений.

4.4.2. Количественное определение эндогенного уровня основных групп цитокининов у некоторых семей трансгенных по гену ipt растений.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание модели для изучения опухолеобразования у редиса Raphanus sativus L. с использованием трансгенных растений по гену IPT»

Гормональная система растений является важнейшим регуляторным механизмом, осуществляющим координацию всех морфогенетических процессов. Во-первых, это способность воспринимать гормональный, либо другой сигнал и генерировать быстрый ответ, изменяя концентрацию отдельного гормона или его уровень но отношению к другим гормонам в отдельных клетках. Во-вторых, это способность поддерживать гормональный гомеостаз на определенных стадиях развития растения. Контроль дифференцировки у высщих растений представляет собой сложный многоэтапный процесс, а характер и направление дифференцировки клеток в растении определяется балансом основных гормонов ауксинов и цитокининов. Выход из-под системного контроля, нарущения на разных этапах онтогенетического развития, могут вызвать переход к недифференцированному росту. Одной из таких моделей, позволяющей детально исследовать процессы роста и развития, являются растения с нарушениями морфогенетического развития, в частности, онухолеобразующие растения своеобразные «гормональные» мутанты. Феномен опухолеобразования бьш описан у многих видов и межвидовых гибридов растений (Байдербек, 1981). Традиционно различают индуцированные опухоли и опухоли генетической природы. Индуцированные опухоли вызываются факторами внешней среды, в том числе фитопатогенными организмами (вирусами, бактериями, грибами, нематодами и другими возбудителями). Из этой группы наиболее подробно изучены корончатые галлы, индуцируемые Agrobacterium (Weiler and Schroeder, 1987; Zambryski et al., 1983) Другая разновидность опухолей генетические опухоли возникают спонтанно у растений, имеющих определенный генотип. Все генетические опухоли растений, как и опухоли, индуцированные Agrobacterium, характеризуются сходным гистологаческим строением, неорганизованным ростом, способностью к гормоннезависимому росту in vitro (Байдербек, 1981). Для большинства генетических и индуцированных опухолей характерно также изменение уровня фитогормонов, в частности изменение баланса ауксинов и цитокининов. Наиболее хорошо изученным классическим примером генетических опухолей у растений является опухолеобразование у межвидовых гибридов табака (Ahuja, 1968; Smith, 1988; Bayer, 1982). Однако в связи с полиплоидностью и стерильностью гибридов возникают сложности в использовании их в качестве модельного обьекта. В данной диссертации работа проведена на уникальной генетической коллекции инбредных линий редиса Raphanus sativus L, которая бьша создана в 60-е гг. XX века и поддерживается до настоящего времени (Нарбут, 1966). Генетическая коллекция инбредньк линий редиса представляет собой ценный материал для изучения фундаментальных проблем дифференцировки, т.к. является источником гормональных мутантов и аномалий морфогенетического развития, в том числе опухолеобразуюпщх форм. В отличие от гибридов рода Nicotiana, R. sativus удобный модельный обьект, это диплоидный вид, который может быть легко вовлечен в генетический анализ. В ранних экспериментах по изучению природы опухолеобразования бьшо установлено, что ткани опухолеобразующих линий характеризуются гормоннезависимым ростом и чувствительностью к основным фитогормонам in vitro (Бузовкина, 1993; Бузовкина* и др., 1993). Генетический анализ при скрещивании форм с альтернативным проявлением признака «опухолеобразование» свидетельствует о том, что этот признак рецессивен и контролируется, по крайней мере, одним геном tur (Нарбут и др., 1985). При анализе гибридов между опухолеобразующими линиями отмечена неполная пенетрантность способности к опухолеобразованию, а также роль генетического фона в контроле проявления этого признака (Нарбут и др., 1985; Матвеева и др., 2000). Показано, что опухолеобразование у инбредных линий редиса сопряжено с изменением гормонального баланса, однако механизм возникновения таких нарушений остается невыясненным до сих пор. Ряд исследователей связьшает изменение гормонального баланса с мутациями растительньк генов, контролирующих гормональный метаболизм. Другие с наличием в геноме растений последовательностей, гомологичных агробактериальным онкогенам (Intrieri and Buiatti, 2001). Несмотря на то, что уже многие годы коллекция используется для проведения биохимических и молекулярногенетических исследований, механизмы образования опухолей до сих пор окончательно не ясны. Целью данной работы является создание модели для изучения опухолеобразования у редиса с использованием растений, трансгенных по гену биосинтеза цитокинина ipt (изопентенилтрансферазы), и сравнение полученных трансгенных растений с опухолеобразующими линиями по ряду физиологических признаков. Мы считаем, что использование данной модели будет также способствовать изучению роли цитокинина в процесс опухолевого роста у редиса. В задачи работы входило: 1. Разработка метода агробактериальиой трансформации редиса in vivo. 2. Получение коллекции трансгенньк растений редиса, содержащих вставку гена биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (ipt). 3. Анализ морфологических и физиологических (чувствительность к гормонам in vitro) признаков трансгенных растений, содержащих вставку гена ipt. 4. Изучение экспрессии гена ipt у трансгенных растений редиса. 5. Определение эндогенного уровня цитокининов и индолилуксусной кислоты.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Фролова, Надежда Владимировна

выводы.

1. Модифицирован и апробирован в лабораторных исследованиях метод агробактериальной трансформации завязи редиса Raphanus sativus L in vivo и получено 63 трансгенных по генам nptll и ipt растений редиса.

2. Создана модель, позволяющая с помощью трансформации редиса in vivo геном ipt получать растения с измененным фенотипом: опухолеобразованием и изменением антоциановой окраски корнеплода и лепестков венчика.

3. Показана связь между экспрессией гена ipt и опухолеобразованием у трансгенных растений. Изменение уровня экспрессии гена ipt приводит к появлению или отсутствию опухолевого фенотипа.

4. Показано, что опухолеобразующие трансгенные растения редиса, содержащие ген ipt, характеризуются повышенной чувствительностью к гормонам: кинетину (10 мг/л); 2,4 Д (10 мг/л); НУК (2 мг/л) и ИУК (1 мг/л), что проявляется в некротизации и измененной реакции корнеобразования у эксплантов in vitro.

5. По аналогии с опухолеобразующими растениями редиса у трансгенных растений с геном ipt, формирующими опухоль in vivo, с помощью цитокинина (БАП 2 мг/л) смоделировано формирование вторичных опухолей in vitro, которые характеризуются способностью к гормоннезависимому росту.

6. Показано, что у опухолеобразующих трансгенных растений, содержащих ген ipt, увеличен уровень цитокининов (на примере зеатина) и ИУК по сравнению с растениями контрольной безопухолевой линии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, цитокинины играют важную роль на многих этапах развития растений и индуцируют различные направления морфогенеза. Инбридинг высокогетерозиготных растений, к которым можно отнести перекрестноопыляемые виды (в том числе редис), приводит к выявлению форм с изменениями и нарушениями в гормональной системе, в частности - по цитокинину. Ярким примером таких форм с нарушениями в морфогенетическом развитая являются опухолеобразующие инбредные линии. Морфофизиологические исследования опухолевых линий показали, что у них нарушен гормональный баланс. В данной работе нами смоделирован процесс опухолеобразования in vivo с помощью трансформации безопухолевой линии конструкцией, содержащей ген биосинтеза цитокинина ipt. Прямое привнесение гена биосинтеза цитокинина позволило подтвердить гипотезу о том, что опухолевый рост является нарушением гормонального баланса, в частности, повышенного уровня цитокининов. Механизмом такого явления, по-видимому, являются мутации растительных генов, вовлеченных в гормональный метаболизм. В данном случае, скорее всего это мутации гена фермента биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (ipt). Подтверждением данному факту можно считать проводимые в нашей лаборатории эксперименты по трансформации опухолеобразующей линии генетической конструкцией, содержащей ген ipt. Так, при трансформации растений опухолевой инбредной линии геном ipt нами отмечена супрессия опухолевого фенотипа (Власенко, личное сообщение). Известно, что у ряда растений существуют гомологи генов изопентенилтрансферазы ipt (Kakimoto, 2001; Kakimoto, 2003). Не исключено, что подобные гомологи содержатся и в геноме редиса. Результаты данной работы позволяют утверждать, что следующим этапом в изучении механизмов опухолеобразования, должно стать клонирование генов изопентенилтрансферазы у опухолеобразующих и безопухолевых линий и выявление отличий между анализируемыми формами.

Итак, для доказательства роли цитокининов в процессе опухолеобразования у редиса нами была разработана модельная система на базе безопухолевой линии из уникальной генетической коллекции редиса. Разработанная методика трансформации редиса in vivo была успешно апробирована в нашей лаборатории (Додуева и др., 2005). Так, с помощью данного метода были получены фенокопии опухолевого роста у безопухолевых линий редиса при трансформации другими агробактериальными генами, в частности rol Виго! С (Ильина и др., 2006).

Таким образом, в ходе работы мы получили убедительные доказательства того, что, изменение гормонального статуса растения, влечет за собой изменение его морфогенеза. Иными словами, манипулируя уровнем гормонов, в ходе трансформации мы можем моделировать и подробно изучать процесс опухолеобразования у растений.

Созданная нами модель, ее тщательный физиологический и генетический анализ, способны помочь в изучении роли и механизма действия цитокинина в опухолеобразовании у редиса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фролова, Надежда Владимировна, 2006 год

1. Байдербек Р. Опухоли растений. // М.: Колос. 1981. - 303 с.

2. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Генетические, биохимические и физиологические аспекты опухолеобразования у инбредных линий редиса. // Вестник Ленинградского Университета. -1991. Т. 10. - с. 102-107.

3. Бузовкина И.С. Выделение и изучение гормональных мутантов редиса Raphanus sativus L. // Дисс. на соискание учёной степени кандидата биол. наук. Санкт-Петербург, 1993.

4. Бузовкина3 И.С., Кнешке И., Лутова Л.А. Генетический анализ признака "чувствительность к цитокинину in vitro". И Генетика. 1993. - Т. 29. - № 6. -с. 995-1001.

5. Бузовкина И.С., Кнешке И., Лутова Л.А. Моделирование опухолеобразования in vitro у линий и гибридов редиса. // Генетика. 1993. -Т. 29.-с. 1002-1008.

6. Дейнеко Е.В Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений (на примере Nicotiana tabacum L.). II Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Новосибирск. -2004.

7. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филиппенко М.Л. Изменение уровня экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака // Докл. РАН. -1995. Т.344. - №3. - с.407-411

8. Дейнеко Е.В., Новоселя Е.А., Загорская Ю.В., Филипенко В.К., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака. // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - № 3. - с. 446-452

9. Дрейпер Дж., Скотг Р., Армитидж Ф. Генная инженерия растений. // М.: Мир, 1991.-408 с.

10. Кислин Е.Н. Определение природных фитогормонов с помощью хроматографических методов: учеб.-метод. пособие // СПб: Изд-во Санкт-Петербургского Университета. 2004. - 32 с.

11. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. // М.: Наука. 1982. - 84 с.

12. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. // М.: Наука. 1973. -246 с.

13. Лакин Г.Ф. Биометрия. // М.:Высшая школа. 1990. - 352 с.

14. Лутова Л.А., Верзина И.И. Наследование способности к каллусо- и корнеобразованию у изолированных семядолей редиса в условиях асептической культуры. // Генетика. 1993. - Т. 29. - с. 995-1001.

15. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. // Санкт-Петербург: Наука. -2000.-538 с.

16. Матвеева Т.В., Додуева И.Е., Бузовкина И.С., Вуд Д., Лутова Л.А., Нестер Е. Роль фитогормонов в опухолеобразовании у редиса. // Генетика. 2000. - Т. 36.-№2.-с. 37-42.

17. Нарбут С. И. Генетическая коллекция инбредных линий редиса. // Генетика. 1966.-№5.-с. 89-100.

18. Нарбут С.И. Генетическая опухоль у редиса, полученная при инбридинге. // Вестник ЛГУ. 1967. -№ 15.-е. 144-149.

19. Нарбут С.И., Войлоков А.В., Кириллова Г.А. Генетическая характеристика линий редиса Raphanus sativus L. var. radicola Pers. II Вестник ЛГУ. 1985. -№24.-с. 75-78.

20. Полевой В.В. Фитогормоны. // Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та. 1982. 248 с.

21. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. // Киев, Наукова думка. -1985. -132 с.

22. Тютерев С.Л., Евстигнеева Т.А. Биохимические методы исследования индуцированной болезнеустойчивости растений. // СПб: изд-во ВИЗР РАН. -2001.-68 с.

23. Фадеева Т.С., Нарбут С.И., Лутова Л.А. Изменчивость по признаку корне- и каллусообразование у изолированных семядолей редиса иморфобиологические особенности растений. // Исследования по генетике. -1975.-№6.-с. 125-135.

24. Фролова Н.В., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Использование метода агробактериальной трансформации in vivo для получения фенокопий опухолеобразования у безопухолевой линии редиса (Raphanus sativus L) II Биотехнология. 2004. - Т.4. - с. 3-7.

25. Шишкова С.О. Изучение спонтанного и индуцированного опухолеобразования у табака Nicotiana tabacum L. и редиса Raphanus sativus L II Дисс. на сосикание ученой степени кандидата биол. наук. Санкт-Петербург, 1991.

26. Ahuja M.R. Genetic control of phuytohormones in tumor and non-tumor genotypes in Nicotiana. И Indian journal of experimental biology. -1971. V. 9. -p. 60-68.

27. Ahuja M.R. A hypothesis and evidence concerning the genetic components controlling tumor formation in Nicotiana. // MGG. 1968. - V. 103. - pp. 176184.

28. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon M.P. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. -V. 81. - pp. 5994-5998.

29. Astot C., Dolezal K., Nordstrom A., Wang Q., Kunkel Т., Moritz Т., Chua N.-H., Sandberg G. An alternative cytokinin biosynthesis pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - № 26. - pp. 14778-14783.

30. Auer C.A. Cytokinin conjugation: recent advances and patterns in plant evolution. // Jornal of Plant Growth Regul. 1997. - V. 23. - pp. 17-32

31. Auer C.A. Discoveries and dilemmas concerning cytokinin metabolism // Journal of Plant Growth Regulation. 2002. - V. 21. - №1. - pp. 24-31

32. Auer C.A., Cohen J.D., Laloue M., Cooke T.J. Comparison of benzyl adenine metabolism in two Petunia hybrida lines differing in shoot organogenesis. // Plant Physiol. 1992. - V. 98. - № 3. - pp. 1035-1041.

33. Azmi A., Dewitte W,, Van Onckelen H., Chriqui D. In situ localization of endogenous cytokinins during shooty tumor development on Eucalyptus globulus Labill. II Planta 2001. - V. 213. - pp. 29-36

34. Barry G.F., Rogers S.G., Fraley R.T., Brand L. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - pp. 4776-4780.

35. Bayer M. Genetic tumors: Physiological aspects of tumor formation in interspecies hybrids. In: Bayer M, Molecular biology of plant tumors. // Eds Kahl G., Schell J. New York: Academic. -1982. pp. 33-67.

36. Beinsberger S.E.I., Vajcke R.L.M., Clijsters H.M.M., De Greef J.A. and Van Onckelen H.A. Effect of enchancedcytokinin levels in ipt transgenic tobacco. // In:

37. Kaminek М., Мок D.W.S. and Zazimalova E. (Eds). Phisiology and biochemistry of cytokinins in plants. -1992. pp. 77-82.

38. Binns A.N., Black R.C., Labiola J. Initiation of auxin autonomy in Nicotiana glutinosa cells by the cytokinin byosynthesis gene from Agrobacterium tumefaciens. II Planta. - 1987. - V. 171. - pp. 539-548.

39. Blackwell J.R. and Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. // FEBS Lett. -1991. V. 295. -pp. 10-12.

40. Boeijan W., Den Boer В., Van Montagu M. Molecular genetic approaches to plant development. //J. Devel. Biol. 1992. - V.36. - p.59-66.

41. Brandstatter I., Kieber J.J. Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis II Planta. 1998. - V.14. - pp. 337-344.

42. Brinegar A.S., Fox J.E. The developmental expression and molecular cloning of the gene for a wheat embryo cytokinin binding protein. // Plant Genetics. 1985. -pp. 147-155.

43. Brinegar A.S., Stevens A., Fox J.E. Biosynthesis and degradation of a wheat embryo cytokinin binding protein during embryogenesis and germination // Plant Physiol. 1985. - V.79. - p.706-710.

44. Brzbohaty В., Moore I., Palme K. Cytokinin metabolism implications for regulation of plant growth and development. // Plant Mol. Biol. 1994. - V. 26. -p. 1483-1497.

45. Bukhov N.G., Bondar V.V., Drozdova I.S., Kara A.N., Kotov A.A., Maevskaya S.N., Vasil'ev A.A., Voevudskaya S.Yu., Voronin P.Yu., Mokronosov A.T.

46. Development of Storage Roots in Radish (Raphanus sativus) Plants as Affected by Light Quality. // J. Plant Physiol. 1996. - V. 149. pp. 405^12.

47. Burch LR, Horgan R. The purification of cytokinin oxidase from Zea mays kernels. // Phytochemistiy. -1989. V. 28. - pp. 1313-1319.

48. Chang H., Jones M.L., Banowetz G.M. and Clark D.G. Overproduction of cytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG Y1-1PT delays corolla senescence and decreases sensitivity to ethylene. // Plant Physiology. 2003. - V. 132.- pp. 2174-2183.

49. Chaudhary A.M., Letham S., Craig S., Dennis E. S. AMP I a mutant with high cytokinin levels and altered embryonic pattern, faster vegetative growth, constitutive photomorphogenesis and precocious flowering. // Plant. - 1993. -V.4 -pp.907-916.

50. Chory J., Reinecke D., Sim S., Washburn Т., Brenner M. A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis II Plant. Physiol.- 1994. V. 104. - pp.339-347.

51. Curtis I.S. and Num H.G. Transgenic radish (.Raphanus sativus L Var. Longipinnatus Bailey) by floral-deep method plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency. // Transgenic Res. - 2001. -V. 10.-pp. 363-371.

52. Curtis I.S. The noble radish: past, present and future. // Trends in plant science. -2003. V. 8 - №7. - pp. 305-306.

53. Deikman J. and Hammer P.E. Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in Arabidopsis thaliana. II Plant Physiol. 1995. - V. 108. - № 1. - pp. 47-57.

54. Deikman J., Ulrich M. A novel cytokinin resistant mutant of Arabidopsis with abbreviated shoot development. // Planta. - 1995. - V.195. - №3. - pp. 440-449.

55. Dietrich M.A., Shumaker K.S. Hormone induced signalling during moss development. // Plant Mol. Biol. - 1998. - V. 49. - pp. 501-523.

56. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E. and Yamakado M. Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyltransferase gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. V. 94. - pp. 2117-2121.

57. Emery R.J., Ma Q., Atkins C.A. The forms and sources of cytokinins in developing white lupine seeds and fruits. // Plant Physiol. 2000 - V. 123. - pp. 1593-1604.

58. Estele M. Cytokinin action: two receptors better than one? // Plant Cell. 1998. -pp. 1009-1019.

59. Faiss M., Zalubilova J., Strnad M., Schmuelling T. Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants. I I Plant J. 1997. - V. 12. - pp. 291-300.

60. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: Plants fight back! // Bio/Technology. -1994. V. 12. - pp. 883-888.

61. Frank, M. and Schmtilling, T. Cytokinin Cycles Cells. // Trends Plant Res. 1999. -V. 4.-pp. 243-244.

62. Frolova N.V., Matveeva T.V., Lutova L.A. Tumor formation in radish and role of cytokinins in this process. // In: 7 th International Congress of Plant Molecular Biology (ISPMB). Barcelona, Spain. 2003. - June 23-28. - p.201. (Abstract)

63. Frundt C., Meyer A.D., Ichikawa T. et al. A tobacco homologue of the Ri -plasmid ORF 13 gene causes cell proliferation in carrot root discs // Mol Gen Genet. 1998. -V.259. - №6. - pp. 559-568.

64. Fujita T, Ichikawa T, Syono К Changes in morphology, levels of endogenous IAA and protein composition in relation to the development of tobacco genetic tumor induced in the dark. // Plant Cell Physiol. -1991. V.32 - №2. - pp. 169-177

65. Gailet J. and Droogmans L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. // J. Bacterid. 1988. - V. 170. - V.9. - pp. 4147-4152.

66. Gatz C., Frohberg C., Wendenburg R. Stringent repression and homogeneous derepression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants. // Plant J. -1992. V. 2. - №3. - pp.397-404

67. Golovko A., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. Identification of tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. // Plant Mol. Biol. 2002. - V. 49. - pp. 161-169.

68. Haberer G., Kieber J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone. // Plant Physiol. 2002. - V. 128, pp. 354-362

69. Heidekamp F., Dirkse W. G., Hille J., van Ormondt H. Nucleotide sequence of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid-encoded tmr gene // J Nucleic Acids Res. 1983. - V.l 1. - №18. - pp. 6211-6223.

70. Hemerly A.S., Ferreira P., de Almeida Engler J., Van Montagu M., Engler G., Inze D. cdc2a expression in Arabidopsis is linked with competence for cell division. // Plant Cell. -1993. V. 5. -№ 12. - pp. 1711-23.

71. Hobbie L., Timpte S., Estelle M. Molecular genetics of auxin and cytokinin. // Plant Mol. Biol. 1994. - V. 26. - pp. 1499-1519.

72. Hooley R. Plant hormone perception and action: a role for G protein signal transduction?//Biol. Science. - 1998. -V.353. - pp.1499 - 1519.

73. Horgan R. 1984. Cytokinins. In: Advanced Plant Physiology // Wilkins, M.B., ed., London: Longman. pp. 89-101.

74. Hutchison C.E. and Kieber J. Cytokinin signaling in Arabidopsis // The Plant Cell. 2002. - pp.47-59

75. Ichikawa Т., Ozeki Y., Syono K. Evidence for the expression of the rol genes of N. glauca *N. langsdorffii. II Mol Gen Genet. 1990. - V.220. - №2. - pp. 177180.

76. Ichikawa Т., Syono K. Tobacco genetic tumors. // Plant Cell Physiology. -1991. -V.32.- №8.-pp. 1123-1128.

77. Intrieri M.C. and Buiatti M. The Horizontal Transfer of Agrobacterium rhizogenes Genes and the Evolution of the Genus Nicotiana. // Mol. Phyl. Evol. 2001. - V.20.-pp. 100-110.

78. Jameson P.E. Cytokinin metabolism and compartmentation. // In D.W.S. Мок and M.C. Мок (Eds) Cytokinins: Chemistry, activity and function. 1994. - CRC Press, An Arbor, MI. - pp. 113-128.

79. Kakimoto Т. CKI1, a histidin kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. // Science. 1996. - V. 274. - pp. 982-985.

80. Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases. // Plant Cell Physiol. 2001. - V. 42. pp. 677-685.

81. Kakimoto T. Biosynthesis of cytokinins. // J. Plant Res. 2003. - V. 116. - pp. 233-239.

82. Kaminek M., Motyka V., Vankova R. Regulation of cytokinin content in plant cells. // Physiologia plantarium. -1997. V. 101. - pp. 689-700.

83. Kende H., Zeevaart J.A.D. The five "classical" plant hormones // Plant Cell. -1997.-V.9.-pp. 1197-1210.

84. Klee J. H., Romano C. P. The roles of phytohormones in development as studied in transgenic plants // Crit. Rev. Plant Sci. 1994. - V. 13. - pp. 311-324.

85. Letham D.S. Cytokinins as phytohormones-sites of biosynthesis, translocation, and function of translocated cytokinin. // In: D.W.S. Мок, and M.C. Мок (Eds) Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. 1994. - CRC Press, Ann Arbor, MI.-pp. 129-134.

86. Li Y., Hagen G., Guilfoyle T.J. Altered morphology in transgenic tobacco plants that overproduce cytokinins in specific tissues and organs. // J. Dev. Biol. 1992. -V. 153.-№2.-pp. 386-395.

87. Ma Mi G.S., He-chun Y., Guo-Feng L. Anther-specific expression of ipt gene in transgenic tobacco and its effect on plant development. 11 Transgenic research. -2002.-V. 11.-pp. 269-278.

88. Maniatis Т., Fritch F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. // Cold Spring Harbor 1989,- New York: Cold Spring Harbor Lab.

89. Mannerlof M., Tenning P. Variability of gene expression in transgenic tobacco. // Euphytica. 1997. - V. 98. - pp. 133-139.

90. Matveeva® T.V., Lutova L.A., Wood D., Nester E.W. Search for the sequences homologous to Agrobacterium T-DNA in different plant genomes. // Biology of Plant Microbe Interaction. - 2004. - V.4. - p. 526-529.

91. Matveevab T.V., Frolova N.V., Dodueva I.E. Buzovkina I.S., Lutova L.A., van Onckelen H., Hormonal control of tumor formation in radish. // J. Plant Growth Regul. 2004. - V. 23. - pp. 37-43.

92. Matzke A.G., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes. // Curr. Opin. Plant Biol. 1998. - V. 1 - № 2. - pp. 142-148.

93. Mc Cabe M.S., Garrat L.C., Schepers F. Effect of PSAG12-IPT gene expression on development and senescence in transgenic lettuce. // Plant Physiol. -2001. -V. 127.-pp. 505-516.

94. Mc Kenzie M.J., Mett V., Reynolds P.H.S., Jameson P.E. Controlled cytokinin production in transgenic tobacco using a copper-inducible promoter. // Plant Physiol. -1994. V. 116. - pp. 969 - 977.

95. McGaw В.A., Burch L.R. Cytokinin biosynthesis and metabolism. // In: P.J. Davies (Ed) Plant Hormones. 2nd ed. Kluwer Academic, Dordrecht. - 1995. -pp. 98-117.

96. Medford J., Horgan R., El-Sawi Z., Klee H.J. Alteretions of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenil transferase gene. // Plant Cell. 1989. - V. 1. - pp. 403-413.

97. Meins F., Foster R. A cytokinin mutant derived from cultured tobacco cells // Developmental genetics. 1986. - V.7. - №3. - pp. 159-165.

98. Meins F., Foster R., Lutz J.P. Evidence for a Mendelian factor controlling the cytokinin requirement of cultured tobacco cells. // Developmental genetics. -1983.-V. 4.-№2.-pp. 129-141.

99. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokin and nitrate. // The Plant Journal. 2004. - V. 37. -pp. 128-138.

100. Moffat В., Somerville C. Positive selection for male sterile mutantsmutants of Arabidopsis lacking adenine phosphoribosyltranspherase gene. // Plant Cell. -1989. -V.l. - pp. 403-413.

101. Мок D.W.S. and Martin R.C. Cytokinin metabolic enzymes. // In: D.W.S. Мок, and M.C. Мок (Eds). Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Ann Arbor, MI. 1994. - pp. 129-134.

102. Мок D.W.S. and Мок M.C. Cytokinin metabolism and action. // Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 2001. -V. 52. - pp. 89-118.

103. Nooden L.D., Singh S., Letham D.S. Correlation of xylem sap cytokinin levels with macrocarpic senescence in soybean. // Plant Physiol. 1990. - V. 93. - pp. 3339.

104. Oakenfiill E.A., Riou-Khamlichi C., Murray J.A. Plant D-type cyclins and the control of G1 progression. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2002. -V. 357.-№1422.- pp. 749-760.

105. Prols F., Meyer P. The methylation patterns of chromosomal integration regions influence gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida. II Plant J. -1992. V. 2. - № 4. - pp. 465-475.

106. Ramirez-Parra E., Desvoyes В., Gutierrez C. Balance between cell division and differentiation during plant development. // Int J Dev Biol. 2005. - V. 49. -№5-6.-pp. 467-477.

107. Redig P., Schmuelling Т., Van Onckelen H. Analysis of cytokinin metabolism in ipt transgenic tobacco by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // Plant Physiol. 1996.-V. 112.-pp. 141-148.

108. Redig P. Regulation of cytokinin oxidase activity in tobacco callus expressing the T-DNA ipt gene. // Physiol. Plant. -1997. V. 99. - pp. 89-96.

109. Sakakibara H. and Takei K. Identification of cytokinin biosynthesis genes in Arabidopsis: a breakthrough for understanding the metabolic pathway and theregulation in higher plants // Journal of Plant Growth Regul. 2002. - V.21. - №1 -pp. 17-23

110. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K. A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize // Plant J. 1998.-V.14 (3). - pp. 337-344.

111. Schell J. and Van Montagu M. The Ti Plasmids as Natural and as Practical Gene Vectors for Plants // Biotechnology. -1983. V. 1. - pp. 175 -180

112. Schmuelling T. New insights into the functions of cytokinins in plant development. // Journal of Plant Growth Regul. 2002. - V. 21 - № 1. - pp. 40-49

113. Schmuelling Т., Beinsberger S., De Greef J., Schell J., Van Onckelen H. Spena A. Construction of heat-inducible chimeric gene to increase the cytokinin content in transgenic plant tissue. // FEBS Lett. -1989. V. 249. - pp. 401-406.

114. Schmuelling Т., Dehio C., Grossmann K., Schell J. Phenotype and hormonal status of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes T-DNA. // Plant Mol.Biol. -1993. V. 23. - № 6. - pp. 1199-1210.

115. Scott M. Plant hormone response mutants. // Physiologia plantarum. 1990. -V. 78.-№l.-pp. 147-152.

116. Smart N. Delayed leaf senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin production in Agrobacterium. II Plant Cell. -1991. V. 3. - pp. 647-656.

117. Smigocki, А. С. Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene // Plant Mol. Biol. -1991.-V. 16.-pp. 105-115.

118. Smith H.H. The inheritance of genetic tumor in Nicotiana Hybrids // Journal of Heredity. 1988. - V. 79. - pp. 277-283.

119. Spena A. The idoleacetic acid-lysine synthetase gene of Pseudomonas syringae subsp. savastanoi induces developmental alterations in transgenic tobacco and potato plants. // Mol. Gen. Genet. -1991. V. 227. - pp. 205-212.

120. Su W., Howell S. A single genetic locus, CKR1, defines Arabidopsis mutants in which root growth. I I Plant Physiology. 1992. - V. 99. - pp. 1569-1574.

121. Sun J., Niu Q.W., Tarkowski P., Zhang В., Tarkowska D., Sandberg G., Chua N.H., Zuo J. The Arabidopsis AtIPT8/PGA gene encodes an isopentenyltransferase that involved in de novo cytokinin biosynthesis. // Plant Physiol. 2003 -V. 131. - pp. 167-176.

122. Swarup R., Parry G., Graham N., Allen Т., Bennett M. Auxin cross-talk: integration of signalling pathways to control plant development. // Plant Mol. Biol. 2002. - V. 49. - V. 3. - № 4. - pp. 411-426.

123. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. II J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - pp. 26405-26410.

124. Takei K., Takahashi Т., Sugiyama Т., Yamaya Т., Sakakibara H. Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin. // J. Exp. Bot. 2002. - V. 53. - pp. 971-977.

125. Taller В.J. Distribution, biosynthesis, and function of cytokinins in tRNA. // In: D.W.S. Мок, and M.C. Мок (Eds). Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function. - CRC Press, Boca Raton, FL. - 1994. - pp. 101-112.

126. Taniguchi M., Kiba Т., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. Expression of response regulator homologs is induced by cytokinins and nitrate. // FEBS Letters. 1998. - V. 429. - № 3. - pp. 259-262

127. Ullrich C.I., Aloni R. Vascularization is a general requirement for growth of plant and animal tumours. // Journal of Experimental Botany. 2000. - V. 51. - № 353.-pp. 1951-1960.

128. Van Loven K., Beinsberger S.E.I., Valcke R.L.M., Van Onckelen H.A., Clijsters H.M.M. Morphometry analysis of the growth of Phsp70-ipt transgenic tobaco plants. // J Exp.Bot. 1993. - V. 44. - pp. 101-109.

129. Van Staden J., Cook E.L., Nooden L.D. Cytokinins and senescence. // In: Senescence and Aging Plants (Leopold, A.C., Eds.). London. Academic Press. -1998.-pp. 282-328.

130. Vaucheret H., Kronenberger J., Lepingle A., Vilaine F., Boutin J.P., Caboche M. Inhibition of tobacco nitrite reductase activity by expression of antisense RNA.// Plant J. -1994. V.2. - № 4. - pp. 559-569.

131. VlasSk J., Ondrej M. Construction and use of Agrobacterium tumefaciens binary vectors with A. tumefaciens C58 T-DNA genes. // Folia Microbiol. 1992. -V. 37.-№3.-pp. 227-230.

132. Vogel J.P., Schuerman P., Woeste K. Brandstatter I., Kieber J. J. Isolation and characterization of Arabidopsis mutants defective in the induction of ethylene biosynthesis by cytokinin. // Genetics. 1998. - V. 149. - № 1. - p. 417-427.

133. Weiler E.W. and Schroeder J. Hormone genes and crown gall disease. // Trends Biochem. Sci. 1987. - V.12. - pp. 271-275.

134. Werner Т., Motyka V., Strnad M., Schmuelling T. Regulation of plant growth by cytokinin // Proc Natl Acad Sci USA 2001. - V. 98. - № 18. - pp. 1048710492

135. White F.F., Garfinkel D.J., Huffman G.A., Gordon M.P., Nester E.W. Sequence homologous to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genomes of uninfected plants. // Nature. 1983. - V. 301. - № 5898. - pp. 348-350.

136. Yamada H., Hanaki N., Imamura A. Ueguchi C., Mizuno T. An Arabidopsis protein that interacts with the cytokinin-inducible response regulator, ARR4, implicated in His-Asp phosphorilay signal. // FEBS Lett. 1998. - V.436. - №1. -pp.76-80.

137. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alterationof their normal regeneration capacity. I I EMBO J. 1983. - V. 2. - pp. 2143— 2150.

138. Zhang R., Zhang X., Wang J., Letham D.S., McKinney S.A., Higgins T.J. The effect of auxin on cytokinin levels and metabolism in transgenic tobacco tissue expressing an ipt gene. // Planta. -1995. V. 196. - pp. 84-94.