Влияние веществ изопреноидного пути биосинтеза (стеринов и цитокининов) на устойчивость растений к патогенам рода Phytophthora и солям тяжелых металлов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Андреева, Елена Александровна

• Андреева, Елена Александровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андреева, Елена Александровна

Введение

Глава 1. Характеристика растительных защитных ответов

1.1. Механизмы вертикальной устойчивости

1.1.1. Гены авирулентности

1.1.2. Гены устойчивости растений

1.1.3. Характеристика основных защитных ответов

1.2. Участие цитокинина в защитных реакциях

1.3. Биология патогенов р. РкуШрЫкога.

1.3.1. Механизмы инфицирования растений

1.3.1.1. Гены РкуЮрЫкога, принимающие участие в патогенезе

1.3.1.2. Расо-специфичные Я- и ауг-гены

1.3.1.3. Элиситоры Рку^рЫкога

1.3.2. Зависимость патогенов рода РЬу^рЫкога от стеринов

1.4. Мутанты растений по биосинтезу стеринов 38 Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

2.2. Агробактериальные штаммы

2.3. Изоляты Р. т/ез1ат

2.4. Изолят Р. ЪгаББкае

2.5. Метод агробактериальной трансформации растений картофеля

2.6. Подтверждение трансгенной природы полученных 49 растенийметодом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.7. Анализ экспрессии бактериального гена ipt в трансгенных 50 растениях картофеля

2.8. Тестирование трансгенных растений картофеля при заражении 51 вирулентным изолятом P. infestons

2.8.1. Методика заражения изолированных листьев

2.8.2. Отбор вирулентного изолята P. infestans

2.9. Оценка реакции эксплантов растений картофеля на ионы 52 металлов

2.9.1. Подбор условий для проведения теста с ионами меди (сульфат 52 меди)

2.9.2. Подбор условий для проведения теста с ионами никеля 52 (хлорид никеля)

2.10. Получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому 53 антибиотику нистатину

2.10.1. Культивация растений арабидопсиса в асептических условиях

2.10.2. Получение каллусных тканей арабидопсиса

2.10.3. Подбор сублетальной концентрации нистатина для 53 микрокаллусов арабидопсиса

2.10.4. Регенерация растений арабидопсиса из устойчивых к 53 нистатину каллусных линий

2.11. Проверка сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 54 полученных растений

2.11.1. Анализ устойчивости к нистатину у растений-регенерантов 54 при вегетативном размножении

2.11.2. Анализ устойчивости к нистатину у растений-регенерантов 54 при половом размножении

2.12. Оценка восприимчивости растений арабидопсиса к расе Р. 54 brassicae

2.13. Анализ влияния стеринов на рост мицелия и образование 55 конидий у P. brassicae, P. infestons

Глава 3. Результаты.

3.1. Реакция трансгенных растений картофеля с геном ipt на 56 биотический стресс - заражение вирулентным изолятом P. infestans 3.1.1 .Получение трансгенных растений с геном синтеза цитокининов 5 6 ipt методами агробактериальной трансформации

3.1.1.1. Агробактериальная трансформация междоузлий растений 56 картофеля

3.1.1.2. Подтверждение трансгенной природы полученных 58 регенерантов с применением метода ПЦР с праймерами к гену nptll

3.1.2. Изучение экспрессии гена ipt в трансгенных растениях 58 картофеля

3.1.3. Изучение реакции трансгенных ipt растений картофеля на 65 абиотический стресс - соли металлов

3.1.3.1. Подбор концентраций солей меди и никеля для проведения 65 теста

3.1.3.2. Анализ реакции эксплантов трансгенных растений картофеля 68 на среде с солями меди и никеля

3.1.4. Отбор вирулентного изолята P. infestans 1Ъ

3.1.5. Результаты заражения изолятом №5 P. infestans трансгенных 75 растений картофеля

3.2. Изучение влияния различных доз стеринов на скорость роста 77 мицелия P. infestans и P. brassicae в условиях in vitro и in vivo

3.2.1. Влияние стеринов, содержащихся в среде для культивации, на 78 эффективность развития Р. infestans и Р. brassicae

3.2.2. Получение растений арабидопсиса, устойчивых к нистатину, 81 методом клеточной селекции

3.2.2.1. Подбор условий для селекции микрокаллусов арабидопсиса 83 на устойчивость к нистатину

3.2.2.2. Получение каллусных линий, устойчивых к нистатину

3.2.2.3. Регенерация побегов и их укоренение

3.2.2.4. Анализ сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 87 регенерированных растений при вегетативном размножении

3.2.2.5. Анализ сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 89 потомков устойчивых растений Яо от самоопыления

3.2.3. Изучение реакции на заражение патогеном Р. Ьгазякае 92 растений, полученных методом клеточной селекции

3.2.4. Изучение реакции на заражение патогеном Р. Ьгаязгсае у 93 растений - Т-ДНК инсерционных мутантов по генам синтеза стеринов

3.2.4.1. Отбор гомозиготных по вставке Т-ДНК растений

3.2.4.2. Заражение мутантов dwfl патогеном P. brassicae

Глава 4. Обсуждение 96 Заключение 104 Выводы 107 Список сокращений 109 Приложение 111 Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние веществ изопреноидного пути биосинтеза (стеринов и цитокининов) на устойчивость растений к патогенам рода Phytophthora и солям тяжелых металлов»

Проблема получения устойчивых к различного рода патогенам растений по-прежнему остро стоит перед исследователями, несмотря на успехи, достигнутые в последние годы. В частности, патогены рода Phytophthora (например, Р. infestans) ежегодно наносят ощутимый ущерб сельскому хозяйству. Помимо традиционных приемов селекции для отбора устойчивых к тому или иному патогену растений, перспективным является использование биотехнологических методов. Как правило, в отношении поражаемых Р. infestans растений (картофеля, томатов) селекционные методы работы направлены на интродукцию в культурные растения генов устойчивости к заболеванию (R-генов) от диких форм растений. R-гены являются необходимыми для развития т.н. вертикальной устойчивости, которая, однако, сравнительно быстро преодолевается патогеном за 1-2 сезона. Более надежной представляется получение форм растений с горизонтальным типом устойчивости, однако, генетические механизмы данного типа устойчивости до сих пор неизвестны. Показано, что на устойчивость растений к патогенам (а также, абиотическим факторам среды) влияет физиологический статус растения, например, гормональный баланс, содержание вторичных метаболитов, фитостеринов и т.д. Так, в ряде модельных систем (авокадо Persea americana - патоген Colletotrichum gloeosporoides; растения табака Nicotiana tabaccum - гусеницы Manduca sexta) показано, что повышенный уровень одного из растительный гормонов - цитокининов, повышает устойчивость растений к различного рода стрессам (абиотическим и биотическим - заражению грибами, вирусами, вредителям), но для; взаимодействия с патогенами рода Phytophthora это явление не изучено. Изучение влияния цитокинина in vivo возможно, повышая его уровень добавлением экзогенно, на мутантах со сверхпродукцией цитокининов, в том числе, растениях, экспрессирующих ген синтеза цитокининов ipt

А&оЪаМепит Ште/аЫет. Также, известен факт зависимости роста и размножения патогенов родов РкуШрЫкога и РуШит от экзогенных стеринов, однако, степень их зависимости и корреляция между уровнем устойчивости растений и содержанием стеринов - открытый вопрос. В нашей лаборатории с помощью методов клеточной селекции на устойчивость к полиеновым антибиотикам, были получены растения картофеля и томатов, с повышенным уровнем сопротивляемости к фитофторозу. Однако, взаимосвязь этих событий (устойчивость к полиеновому антибиотику - измененный состав стеринов -устойчивость к патогену) не была подтверждена в ряду поколений в связи со сложностью генетического анализа на упомянутых объектах. Решить эту проблему возможно с использованием хорошо изученного модельного растения АгаЫЛорягз ЛаИапа, для которого описан патоген из рода Рку^рЫкога - Р. Ъгаьзгсае. Таким образом, целью нашей работы являлось изучение влияния измененного состава цитокининов у растений картофеля с бактериальным геном синтеза цитокининов на устойчивость к заражению вирулентой расой Рку^рЫкога т/е81ат и солям никеля и меди, а также, измененного состава стеринов А. ЖаНапа на устойчивость к Р. Ъгаззжае. Соответственно, задачами работы являлось:

1) получение трансгенных растений картофеля с бактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt и анализ его экспрессии;

2) анализ полученных растений на устойчивость к заражению Р. ш/еу^ту;

3) подбор условий для анализа устойчивости растений картофеля к абиотическому стрессу - солям меди и никеля, и оценка устойчивости полученных трансгенных растений;

4) получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину, и проверка стабильности признака в морфогенетическом цикле «каллус-растение-каллус», а также, в . ряду половых поколений при самоопылении;

5) оценка устойчивости полученных растений арабидопсиса и Т-ДНК инсерционных мутантов арабидопсиса по генам биосинтеза стеринов из коллекции Arabidopsis Stock Research Institute к патогену P. brassicae.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Андреева, Елена Александровна

Выводы.

1. На основе сорта Адретта создана коллекция трансгенных растений с бактериальными генами ipt и nptll, контролирующими синтез изопентилтрансферазы и неомицинтрансферазы, соответственно. Трансгенность растений доказана методом ПЦР.

2. Среди трансгенных растений проведен опосредованный анализ экспрессии гена ipt методами in vitro с использованием экзогенных цитокининов и ауксинов. Выявлены трансгенные растения, у которых экспланты характеризовались измененной чувствительностью к обоим гормонам или одному из них. Полученные результаты свидетельствуют, что у трансгенных растений с геном ipt изменен уровень гомрона/ов.

3. Среди природной популяции P. infestans проведен отбор наиболее вирулентного изолята, содержащего 4 гена вирулентности, который был использован для заражения растений картофеля методом изолированных листьев. Тест с патогеном P. infestans не выявил различий по степени поражения между трансгенными и контрольными растениями.

4. Подобраны условия (концентрация соли, тип экспланта) для оценки устойчивости эксплантов растений картофеля сорта Адретта к солям тяжелых металлов - никеля и меди. Среди трансгенных растений выявлены формы, которые характеризуются повышенной, по сравнению с контролем, устойчивостью к обеим солям одновременно, или одной из них.

5. С использованием модельной системы - трансгенные растения картофеля с геном ipt, показано, что повышение эндогенного уровня цитокинина в растении увеличивает уровень устойчивости последних к абиотическим стрессам (солям тяжелых металлов), но не влияет на устойчивость к патогену P. infestans.

6. Методом опосредованной клеточной селекции проведен отбор клеточных линий арабидопсиса, устойчивых к нистатину. Показано, что устойчивость к нистатину у клеточных линий теряется частично при формировании растений-регенерантов и полностью - при самоопылении в поколениях - 114. Низкая вероятность получения нистатин-устойчивых мутантов и неспецифичность действия нистатина как селективного агента указывет на нецелесообразность его использования в экспериментах по клеточной селекции на устойчивость арабидопсиса к Р. ЬгаББкае.

7. Использование Т-ДНК инсерционного мутанта ИИ^Г!, характеризующегося измененным биосинтезом стеринов, показано, что уменьшение ситостерина и кампестерина в тканях не повышает устойчивость растений арабидопсиса к Р. ЬгазБжае.

Заключение.

Проблема зависимости развития реакций устойчивости к различным стрессам от физиологического состояния растения, например, уровня гормонов, не решена окончательно. Несмотря на имеющиеся свидетельства о повышенной устойчивости к различным факторам растений с увеличенным содержанием цитокининов, до сих пор не проводился анализ этой зависимости для растений - хозяев какого-либо из видов Phytophthora. Нами был проведен анализ на модельной системе «трансгенные растения картофеля, содержащие бактериальный ген синтеза цитокининов - ipt, - патоген Р. infestans». Кроме того, была изучена устойчивость трансгенных растений к абиотическим факторам - солям металлов (сульфату меди и хлориду никеля). Отсутствие различий в симптомах заражения у трансгенных растений картофеля с геном синтеза цитокининов ipt по сравнению с исходным сортом, неустойчивым к фитофторозу, не подтверждает значимую роль цитокининов в развитии устойчивости, по крайней мере, в случае описанной модельной системы. Наличие устойчивости у эксплантов трансгенных растений картофеля к солям металлов (одной из них, или обеим), а также измененная чувствительность большей части форм к экзогенным гормонам, позволяют говорить о позитивном влиянии цитокининов на устойчивость к различным стрессам у растений картофеля.

По поводу степени зависимости патогенов рода Phytophthora от стеринов (в частности, от стеринов хозяйских растений) в литературе также ведутся споры. Несмотря на имеющиеся данные о влиянии стеринов (и особенно, ситостерина) на рост мицелия и процессы полового и бесполого размножения у этих патогенов в условиях in vitro, изучение этой зависимости, проведенное у растений арабидопсиса - мутанта по гену биосинтеза стеринов DWF1, не позволяет подтвердить эту корреляцию in vivo. В нашей лаборатории ранее были получены растения картофеля и томатов, устойчивые к полиеновым антибиотикам (филипину и нистатину). Часть из полученных растений демонстрировали повышенную устойчивость к поражению фитофторозом. Рабочая гипотеза: устойчивые к антибиотику растения приобрели устойчивость за счет изменения в составе стеринов, что, в свою очередь, привело к формированию устойчивости к фитостерин-зависимой Р. infestans. Однако не было показано, что устойчивость к антибиотику и устойчивость к патогену наследуются совместно.

Нами была проведена работа по получению растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину. Из отобранных на селективной среде каллусных линий были получены растения, для которых анализ признака устойчивости показал его сохранение у 27 растений из 50 при прохождении морфогенетического цикла «каллус - растение - каллус». Эти данные свидетельствуют о том, что у части растений изменения, приводящие к антибитикоустойчивости, связаны с генетическими, а не эпигенетическими изменениями. Однако анализ наследования признака в потомстве от самоопыления этих растений показал потерю признака в ряду поколений. По-видимому, поскольку нистатин является неспецифическим агентом, на уровне каллусных тканей происходил отбор линий с эпигенетическими изменениями. Кроме того, среди отобранных растений не было выявлено форм с повышенной устойчивостью к поражению патогеном Р. Ъга$81сае. Полученные данные позволяют рассматривать нистатин как неспецифический агент, устойчивость к которому может быть связана с эпигенетическими изменениями в растительных клетках, в дальнейшей практике, по-видимому, его использование нецелесообразно.

Анализ Т-ДНК инсерционных мутантов с помощью ПЦР и по фенотипу позволил выявить гомозиготные формы по гену синтеза стеринов 1: растения представляют собой карлики с редуцированными листьями и сильно сниженной фертильностью. Тест с заражением патогеном карликовых растений <1м?/1/сЫ>/1 не выявил отличий в степени поражения этих растений по сравнению с контролем. По-видимому, устойчивость к фитофторозу может быть связана не с качественным отсутствием какого-либо класса стеринов, а с измененным соотношением стеринов в растении. Полученные данные позволяют предложить дальнейший план работ, связанный с анализом фитофтороустойчивости не у точковых мутантов по генам синтеза стеринов, а у растений с измененным соотношением стеринов, полученных в результате трансформации конструкциями, содержащими гены синтеза стеринов. Положительным моментом является также то, что подобные растения, описанные в литературе, во многих случаях имеют нормальный фенотип, в отличие от точковых мутантов.

Таким образом, нами не подтверждена роль цитокининов в развитии устойчивости у растений картофеля к биотическому (Р. infestans) стрессу; показана корреляция между измененным уровнем цитокининов и повышенной устойчивостью к тяжелым металлам (медь, никель); не удалось получить формы арабидопсиса, устойчивые к нистатину, что связано с неспецифическим характером этого антибиотика; дальнейшая работа будет посвящена поиску устойчивых к фитофторозу форм среди трансгенных растений с измененным соотношением стеринов.