«Создание и характеристика иммуногена на основе белков VP6 и VP8 ротавируса группы А» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Богомолова Елена Григорьевна

• Богомолова Елена Григорьевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Богомолова Елена Григорьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика ротавируса

1.2 Эпидемиология ротавирусной инфекции

1.3 Патогенез ротавирусной инфекции

1.4 Профилактика ротавирусной инфекции

1.4.1 Живые аттенуированные противоротавирусные вакцины

1.4.2 Кандидатные вакцины на основе инактивированных ротавирусов

1.4.3 Кандидатные противоротавирусные вакцины на основе рекомбинантных белков

1.5 Белковые адъюванты

1.5.1 Флагеллин бактерии рода Salmonella

1.5.2 CRM197 - нетоксичный вариант дифтерийного токсина

1.6 Гибридные белки, содержащие фрагменты белков капсида VP6, VP8 ротавируса группы А в качестве активного агента кандидатной вакцины для профилактики ротавирусной инфекции ........................................................................................................................................... 52!

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Плазмидная ДНК pET-28a(+)

2.2 Бактериальные штаммы

2.3 Штаммы вируса

2.4 Лабораторные животные

2.5 Реакции ферментативной модификации ДНК

2.5.1 Синтез последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8

2.5.2 Амплификация генов vp6vp8 и flicvp6vp8

2.5.3 Рестрикция плазмидной ДНК

2.5.4 Лигирование фрагментов плазмидной ДНК

2.6 Микробиологические методы ................................................................................................... 60!

2.6.1 Приготовление компетентных клеток E.coli для трансформации

2.6.2 Трансформация бактериальных клеток

2.6.3 Скрининг рекомбинантных клонов на наличие требуемой плазмидной ДНК

2.6.4 Индукция экспрессии генов, кодирующих гибридные рекомбинантные белки, в штамме-продуценте ИПТГ

2.6.5 Автоиндукция экспрессии 0,2% лактозой по методу Штудиера

2.7 Анализ и очистка нуклеиновых кислот

2.7.1 Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле

2.7.2 Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля

2.7.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli

2.7.4 Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК по методу Сенджера

2.8 Анализ и очистка рекомбинантных белков

2.8.1 Электрофорез белков в денатурирующих условиях по Леммли

2.8.2 Определение концентрации белка по методу Лоури

2.8.3 Получение и отмывка телец включения

2.8.4 Иммобилизованная металлоаффинная хроматография

2.8.5 Гель-фильтрация

2.8.6 Определение остаточных белков штамма-продуцента

2.8.7 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента

2.8.8 Определение остаточных эндотоксинов

2.8.9 Расчет алифатического индекса

2.8.10 Western-blotting

2.8.11 Масс-спектрометрический анализ

2.9 Иммунологические методы

2.9.1 Определение иммуногенных свойств рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

2.9.2 Определение титра антител в сыворотках иммунизированных животных

2.9.3 Определение титра антител к антигенам ротавируса в сыворотках крови иммунизированных животных

2.9.4 Реакция нейтрализации вируса в культуре клеток

2.9.5 Исследование иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197

2.9.6 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo

2.9.7 Определение ротавирусного антигена методом иммуноферментного анализа

2.9.8 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo

2.10 Статистический анализ полученных результатов

2.11 Компьютерные методы анализа данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Получение белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.1 Моделирование белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.2 Создание нуклеотидных последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8

3.1.3 Создание и анализ плазмидных ДНКpET-28a(+)-vp6vp8 и pET-28a(+)-flicvp6vp8 и штаммов E.coli для их амплификации

3.1.4 Создание штаммов-продуцентов гибридных белковVP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.5 Индукция экспрессии гибридных генов vp6vp8 и flicvp6vp8 и оценка локализации гибридных белков в клетках штаммов-продуцентов

3.1.6 Очистка гибридных рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.7 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.9 Определение остаточного белка штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.1.10 Определение остаточных эндотоксинов штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.2 Получение и характеристика рекомбинантного белка CRM197

3.2.1 Расчет алифатического индекса и индекса GRAVY для рекомбинантного белка CRM197

3.2.2 Индукция экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный CRM97

3.2.3 Очистка рекомбинантного белка CRM197 с использованием металлоаффинной хроматографии

3.2.4 Диализ препарата высокоочищенного белка CRM197

3.2.5 Определение подлинности рекомбинантного белка CRM197

3.2.6 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного белка CRM197

3.2.7 Определение остаточных белков штамма-продуцента

3.2.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента

3.2.9 Определение содержания бактериального липополисахарида

3.3 Результаты исследования рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro

3.3.1 Иммуногенная активность рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.3.2 Определение титра антител кротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.3.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8

3.3.4 Определение иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197

3.3.5 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo

3.3.6 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Введение

4.2 Получение рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8

4.2.1 Молекулярный дизайн и клонирование последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 в плазмиде pET-28a(+)

4.2.2 Динамика биосинтеза рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 в клетках E.coli

4.2.3 Очистка гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 с помощью металлоаффинной хроматографии и гель-фильтрации

4.2.4 Контроль качества полученных образцов рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

4.3 Получение и характеристика рекомбинантного белка-адъюванта CRM197

4.4 Анализ результатов, полученных при изучении рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro

4.4.1 Иммуногенные свойства гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8

4.4.2 Титр антител кротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8

4.4.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8

4.4.4 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo

4.4.5 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Создание и характеристика иммуногена на основе белков VP6 и VP8 ротавируса группы А»»

Актуальность темы исследования

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ротавирусы являются одной из ведущих причин возникновения тяжелой диареи, приводящей к дегидратации организма у детей младшего возраста. Большинство детей инфицируется до достижения возраста 5 лет. Ротавирусы человека являются причиной более 150000 смертей младенцев и маленьких детей ежегодно, особенно в развивающихся странах [189]. В России заболеваемость ротавирусной инфекцией постоянно растет, что объясняется как увеличением числа случаев инфицирования, так и совершенствованием способов диагностики данного заболевания.

Ротавирус был открыт начале 70х годов прошлого века [29, 62]. Ротавирусы включают в семейство Reoviridae, род Rotavirus. Ротавирион представляет собой безоболочечный, сложно организованный трехслойный капсид, который окружает геном, представленный 11 сегментами двуцепочечной РНК [163].

Род ротавирус подразделяют на серологические группы А-F. Все эти группы инфицируют животных, но лишь группы А-С - человека. Ротавирусы повреждают энтероциты, расположенные на микроворсинках тонкого кишечника, что приводит к снижению абсорбции и диарее. Широкий спектр клинических проявлений колеблется от легкой диареи до тяжелой диареи и рвоты, вызывающих дегидратацию, нарушение электролитного баланса, шок и при отсутствии лечения смерть.

Иммунитет к ротавирусной инфекции в большинстве случаев возникает в раннем детстве после перенесенного заболевания. Иммунитет нестойкий, поэтому у взрослых с низким уровнем антител заболевание может повториться.

В рамках "Десятилетия детства» стартовавшего на основании Указа Президента Российской Федерации от 29 мая 2017 года № 240 "Об объявлении в Российской Федерации Десятилетия детства», в плане мероприятий поставлена

задача включить в национальный календарь профилактических прививок иммунизацию от ротавирусной инфекции с 2020 года и предложить в связи с этим отечественный аналог зарубежным вакцинным препаратам [5]. На данный момент отсутствуют препараты для профилактики ротавирусной инфекции российского производства.

Степень разработанности темы исследования

На данный момент на мировом рынке отсутствуют препараты с прямым противоротавирусным действием. Терапия ротавирусной инфекции сводится к минимизации последствий дегидратации организма, возникающей в процессе инфицирования. Наиболее эффективным способом профилактики ротавирусного гастроэнтерита считается вакцинация. Вплоть до широкого внедрения вакцинации против ротавирусной инфекции в 2006 году более 65% детей младше пяти лет как минимум однократно переносили данное заболевание. На данный момент две живые аттенуированные вакцины рекомендованы к применению более чем в 100 странах мира. Данные вакцины основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого либо животного происхождения, которые размножаются в кишечнике человека. Постлицензионные исследования данных препаратов показали их эффективность на уровне более 90% в предотвращении тяжелого ротавирусного гастроэнтерита. Однако при их использовании у 1-6 на 100000 вакцинированных младенцев регистрируются случаи вакцин-ассоциированной инвагинации кишечника, тяжелого осложнения, которое при отсутствии своевременного лечения приводит к летальному исходу [37].

Существует ряд подходов к разработке вакцин для профилактики ротавирусного гастроэнтерита с улучшенными свойствами, среди которых разработка аттенуированных реассортантов наиболее часто встречающихся штаммов ротавируса, использование естественно аттенуированных линий ротавируса (неонатальных) - выделенных у пациентов, характеризующихся

бессимптомной ротавирусной инфекцией, а также разработка рекомбинантных вакцин на основе полноразмерных ротавирусных белков, а также их частей.

Среди капсидных белков ротавируса группы А наиболее важными иммуногенами служат белки VP6 и VP8. Белок VP8 является N-концевым триптическим фрагментом белка наружного капсида VP4. Данный белок (VP8) является высокоиммуногенным полипептидом и индуцирует эффективную гомотипическую защиту против заболевания. В экспериментах на лабораторных мышах эффект наблюдали у детенышей, привитых данным полипептидом самок. Белок VP8 содержит пять нейтрализуемых эпитопов. Полипептид внутреннего капсида VP6 является мажорным белком вириона и обеспечивает защиту новорожденных животных за счет индукции выработки нейтрализующих секреторных антител, главным образом присутствующих в молоке кормящей самки мыши [67]. Таким образом, защиту ребенка от ротавирусной инфекции возможно обеспечить вакцинацией белками VP6 и VP8. В связи с этим представляется целесообразным использовать данные вирусные белки для конструирования генно-инженерных вакцинных препаратов.

При разработке рекомбинантных вакцинных препаратов важным аспектом является подбор адъюванта, увеличивающего эффективность вакцинации. Примерами широко используемых в настоящее время адъювантов являются флагеллин Salmonella и мутант дифтерийного токсина - CRM197. Данные белковые адъюванты имеют разные механизмы действия и активируют различные звенья иммунного ответа. Флагеллин, связываясь с Толл-рецептором-5, активирует механизмы врожденного иммунитета, тогда как CRM197 вызывает активацию Т-клеточного ответа, а именно - Т-хелперов. Выбор подходящего адъюванта повысит эффективность вакцинации и обеспечит более стойкий иммунитет к возбудителю заболевания.

Использование вакцин на основе рекомбинантных белков позволяет избежать побочных эффектов, связанных с введением вируса в организм. Кроме того их можно четко стандартизировать благодаря известным химическим свойствам и отсутствию дополнительных молекул в составе. Производство

рекомбинантных вакцин более выгодно по сравнению с вакцинами на основе вирусов, поскольку не требует работы с патогеном, наработка вакцинных препаратов требует меньшего времени, себестоимость препаратов ниже.

Несмотря на то, что существует ряд кандидатных вариантов иммуногенов для разработки вакцины для профилактики ротавирусной инфекции, ни один из них не вошел в клиническую практику. Кроме того, вследствие высокой изменчивости ротавирусов, существует проблема создания универсальной вакцины против данного заболевания. Настоящая работа направлена на решение данного вопроса.

Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования заключалась в создании и биохимической характеристике иммуногена на основе белков VP6 и VP8 ротавируса группы А.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Моделирование структуры гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 и кодирующих их генов на основе капсидных белков VP6 и VP8 ротавируса группы А.

2. Создание штаммов-продуцентов гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 на основе клеток E.coli.

3. Разработка технологии выделения и очистки гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8.

4. Биохимическая характеристика свойств полученных гибридных белков.

5. Изучение иммуногенных свойств гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 у лабораторных животных.

6. Анализ вируснейтрализующей активности антител in vitro, образующихся при иммунизации лабораторных животных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8.

Научная новизна работы

Разработанные гибридные белки VP6VP8 и FliCVP6VP8 являются оригинальными и не имеют природных и синтетических аналогов. Созданы продуценты оригинальных гибридных белков, разработан протокол наработки и очистки в клетках E. coli, изучены биохимические свойства полученных белков. Изучены иммуногенные свойства белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 при иммунизации лабораторных мышей линии Balb/c с адъювантом (гидроксидом алюминия). Изучены иммуногенные свойства белка FliCVP6VP8 при внутримышечной иммунизации с белком CRM197 в качестве адъюванта. Впервые показано адъювантное действие рекомбинантного белка CRM197 при внутримышечном введении с противоротавирусным иммуногеном. Изучены протективные свойства специфичных к белкам VP6VP8 и FliCVP6VP8 поликлональных антител в экспериментах in vitro на культуре клеток. Показано наличие нейтрализующей активности антител сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8. Изучены протективные свойства белка FliCVP6VP8 в экспериментах in vivo на лабораторной модели ротавирусной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют позиционировать гибридные белки VP6VP8 и FliCVP6VP8 как перспективные иммуногены для создания кандидатной отечественной рекомбинантной вакцины против ротавирусной инфекции, а рекомбинантный белок CRM197 - как перспективный адъювант в составе кандидатной вакцины.

Полученные результаты позволяют предположить, что вакцина на основе белка FliCVP6VP8 будет обеспечивать универсальную защиту против ротавирусов за счет того, что фрагмент белка VP6 в составе гибридного белка имеет общие и гомологичные участки с фрагментом белка VP6 ротавируса С, а также гомологичные участки с фрагментом белка VP6 ротавируса В. После

введения данной вакцины у человека будет вырабатываться иммунитет к ротавирусам.

Результаты исследования создают возможность организации производства отечественной вакцины для профилактики ротавирусной инфекции, а также внедрения ее в клиническую практику здравоохранения.

Методология и методы исследования

Моделирование гибридных белков проводили с использованием алгоритма I-Tasser. Для анализа наличия В-клеточных эпитопов использовали пакет программ Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0. Анализ наличия Т клеточных эпитопов осуществлялся с помощью IEDB Analysis Resource. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью персонального компьютера с использованием программ Chromas, BioEdit v.5.0.9 и ProtParam (http://au. expasy. org/tools/protparam.html).

Для экспрессии гибридных генов vp6vp8 и flicvp6vp8 в клетках E.coli использовали коммерческий вектор pET-28a(+) (Invitrogen, США), содержащий ориджин репликации, промотор для полимеразы фага Т7, lac-оператор, ген устойчивости к канамицину, старт-кодон для трансляции клонированных фрагментов, фрагмент, кодирующий полигистидин, находящийся в рамке трансляции, на N-конце последовательности. Таким образом, любая клонированная в векторе нуклеотидная последовательность экспрессируется в виде белка, слитого с полигистидином, для удобства его дальнейшей очистки с использованием иммобилизованной металлоаффинной хроматографии. Для обеспечения работы lac-оперона плазмида содержит фрагмент, кодирующий лактозный репрессор - lacI. Клонирование гибридных генов в векторе осуществляли по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.

Для амплификации векторной ДНК использовали клетки E.coli DH10B/R (Gibko BRL, США) с генотипом F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) q»80dlacZAM 15 AlacX74 deoR recAl endAl araD139 A(ara,leu)769 galUgalKX- rpsLnupG.

Для экспрессии гибридных генов vp6vp8 и flicvp6vp8 использовали клетки E.coli BL21 Star (DE3), с генотипом F- ompThsdSB (rB-шБ-) galdcm rne131 (DE3), содержащие в геноме XDe3 лизоген и мутацию rne131.

Для получения препарата высокоочищенного рекомбинантного белка CRM197, используемого в качестве адъюванта, использовали штамм-продуцент на основе клеток E. coli BL21 (DE3), полученный в ООО «РД-Биотех» и предоставленный для исследования.

Синтез последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 осуществляли методом ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов [121], синтезированных химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800 (БИОССЕТ, Россия). Наработку фрагментов ДНК для клонирования проводили методом ПЦР. Дизайн и анализ праймеров осуществлялся с помощью программы FastPCRv.4.0.27 (PCRTeam, Финляндия). Реакцию лигирования использовали для клонирования очищенных ПЦР-продуктов с «липкими» концами в векторе pET-28а(+) (Invitrogen, США).

Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили по методу Сэнджера [161] с использованием набора Applied Biosystems BigDye® Terminator (BDT) v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США).

Индукцию экспрессии генов, кодирующих рекомбинантные белки, осуществляли в штаммах-продуцентах (E.coli BL21(DE3)) с использованием ИПТГ (Invitrogen, США) в конечной концентрации 0,1 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ, а также по методу Штудиера [176]. Результаты анализировали с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Леммли [107]. Анализ ПААГ гелей проводили с помощью программы ImageJ.

Очистку рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 осуществляли с помощью металлоаффинной хроматографии с последующей гель-фильтрацией. Рекомбинантный CRM197 получали с использованием металлоаффинной хроматографии с последующим диализом. Производили контроль качества полученных образцов белков. Подлинность рекомбинантного CRM197 подтверждали с помощью вестерн-блоттинга с использованием коммерческих

антител к CRM197 (каталожный номер ab151222, Abcam, США). Концентрацию целевого белка в образце измеряли спектрофотометрическим методом Лоури. Анализ остаточных белков штамма продуцента осуществляли методом твердофазного ИФА с использованием коммерческого набора E. coli host cell protein ELISA kit (Cygnus technologies, США). Измерение остаточной ДНК штамма-продуцента проводили методом молекулярной гибридизации с помощью набора E.coli Host Cell DNA in tubes (Cygnus technologies, США). Остаточные эндотоксины в образцах определяли с помощью гель-тромб варианта ЛАЛ-теста. Масс-спектрометрический анализ проводили в ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН» (ФИЦ Биотехнологии РАН).

Изучение иммуногенных свойств гибридных рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 проводили с использованием самок мышей линии Balb/c возраста 6-8 недель. Иммунизацию проводили внутримышечно с интервалом в 2 недели. По прошествии 2 недель после каждой иммунизации забирали кровь и в сыворотках измеряли титр специфических антител IgG методом твердофазного ИФА.

На базе инновационной лаборатории Республиканского научно-практического центра эпидемиологии и микробиологии (г. Минск, Белоруссия) было проведено изучение вирус-нейтрализующей активности сывороток животных, иммунизированных рекомбинантными белками VP6VP8 и FliCVP6VP8. Изучение проводили с использованием штамма ротавируса человека Минск-86 на перевиваемой культуре клеток МА-104 почки эмбриона макаки резус. Кроме того, были определены антитела к ротавирусам в сыворотках иммунизированных животных с использованием тест-системы Рота-АГ (Белоруссия).

Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при совместном внутримышечном введении с белковым адъювантом -рекомбинантным CRM197 проводили на самках мышей линии Balb/c возраста 6-8 недель. После двукратной внутримышечной иммунизации с интервалом в 2

недели были определены титры специфических антител субизотипов IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3.

Совместно с ООО «Инновабио» на базе ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» МО РФ (г. Санкт-Петербург) было проведено изучение протективной активности иммуногена FliCVP6VP8 на модели ротавирусной инфекции. Исследование было выполнено на 6-8-недельных мышах-самцах линии Balb/c. В экспериментах использовали штамм ротавируса мыши EDI. В качестве препарата сравнения служила коммерческая вакцина Rotarix (GlaxoSmithKline), в качестве отрицательного контроля - физиологический раствор. Препараты вводили однократно, либо двукратно с интервалом в две недели. Коммерческую вакцину, согласно инструкции по применению, вводили животным перорально, физиологический раствор - внутримышечно. Белок FliCVP6VP8 вводили лабораторным животным либо внутримышечно, либо интраназально. В ходе экспериментов были изучены выделение ротавирусного антигена с фекалиями иммунизированных и затем зараженных животных, а также уровень специфических и общих антител классов IgG и IgA в смывах кишечника и сыворотках крови испытуемых животных.

Положения, выносимые на защиту

1. Смоделированы и созданы гибридные белки VP6VP8 и FliCVP6VP8.

2. Разработана технология очистки гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 с использованием хроматографических методов.

3. Разработанные гибридные белки VP6VP8 и FliCVP6VP8 являются высокоиммуногенными и индуцируют выработку высокого титра специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных. Антитела взаимодействуют с антигенами ротавируса и обладают вируснейтрализующей активностью.

4. Гибридный белок FliCVP6VP8 обеспечивает защиту от ротавирусной инфекции, блокируя размножение вируса.

5. Гибридные белки VP6VP8 и FliCVP6VP8 являются перспективными иммуногенами для разработки кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции.

6. Белок CRM197 является перспективным адъювантом для разработки кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов подтверждается выполненными наблюдениями, иллюстрированными множественным фактическим материалом -52 рисунками, а именно электрофореграммами, столбчатыми диаграммами, а также 23 таблицами, 4 последовательностями аминокислот и нуклеотидов, комплексным анализом полученных результатов с привлечением современных методов, в том числе статистической обработки данных.

Материалы диссертационного исследования были представлены на двенадцати конференциях: I международная конференция молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов, г. Новосибирск, 2014; международная конференция «ГМО: история, достижения, социальные и экологические риски», г. Санкт-Петербург, 2014 г.; 18-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, 2014 г.; 19-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, 2015 г.; VII Российский симпозиум «Белки и пептиды», г. Новосибирск, 2015 г.; «Трансляционная биомедицина: современные методы междисциплинарных исследований в аспекте внедрения в практическую медицину», г. Санкт-Петербург, 2015 г.; 20-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века», г. Пущино, 2016 г.; III Всероссийская научная конференция молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», г.

Санкт-Петербург, 2016 г.; ЬХХ1 Международная научно-практическая конференция студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы современной медицины и фармации 2017», г. Минск, Белоруссия, 2017 г; Тринадцатая Евразийская научная конференция «Донозология-2017», г. Санкт-Петербург, 2017 г.; XXV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», г. Москва, 2018 г.; Научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные вопросы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики инфекционных и онкологических заболеваний», г. Москва, 2018 г. По теме диссертации опубликованы 7 статей, 1 патент на изобретение, 1 заявка на изобретение и 12 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 228 страницах машинописного текста, содержит 4 приложения. Список литературы содержит 207 литературных источника.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Характеристика ротавируса

Ротавирус был открыт в 1973 г. Рут Бишоп при исследовании биопсии двенадцатиперстной кишки младенца с острым гастроэнтеритом . Название вирус получил благодаря своей форме (от латинского «rota» - колесо).

Ротавирусы включают в семейство Reoviridae, род Rotavirus. Ротавирион (Рисунок 1) представляет собой безоболочечный, сложноорганизованный, трехслойный капсид размером около 70 нм, который окружает геном, представленный 11 сегментами двуцепочечной РНК [163]. Шесть структурных и шесть неструктурных белков закодированы в отдельных генных сегментах, за исключением неструктурных белков 5 и 6 (NSP5 и NSP6), которые являются продуктами одного сегмента.

/х-

Рисунок 1 - Строение ротавириона [70]. Функции белков ротавируса представлены в таблице 1.

Таблица 1- Характеристика белков ротавируса [15]

Белок Функция

VP1 РНК-зависимая РНК-полимераза.

Связывает однонитевую РНК. Совместно с белком VP3 формирует транскрипционный комплекс.

VP2 Структурный белок внутреннего капсида. Обеспечивает сиквенс-неспецифическое связывание РНК, необходим для репликазной активности белка VP1.

VP3 Гуанилилтрансфераза, метилтрансфераза. Совместно с белком VP1 формирует транскрипционный комплекс.

VP4 Гемагглютинин, белок клеточной адгезии, Р-антиген, детерминанта вирулентности. Тримеры VP4 формируют шипы на внешнем капсиде, расщепляется трипсином на VP5 и VP8.

VP6 Главный вирусный белок, структурный белок среднего капсида, необходим для транскрипции генетического материала вирусной частицы. Образует гомотримеры, определяет антигенные субгруппы.

VP7 Структурный гликопротеин внешнего капсида, гликозилирование происходит ко-трансляционно по N-концу аминокислотной последовательности, в зараженной клетке имеет функцию трансмембранного кальций-связывающего белка шероховатого эндоплазматического ретикулума , G-антиген.

NSP1 Связывается с цитоскелетом, участвует в подавлении иммунного ответа, опосредованного ИНФа. Различен в зависимости от линии вируса, в некоторых линиях отсутствует.

NSP2 НТФ-аза, геликаза, обеспечивает сиквенс-неспецифическое связывание РНК, участвует в формировании вироплазмы,

связывается с белками VP1 и КБР5, необходим для синтеза двунитевой РНК.

ШР3 Специфично связывается с 3'-концом ротавирусной мРНК, связывается с фактором элонгации еШ401, участвует в регуляции трансляции. Представляет собой гомодимер.

ШР4 Вирусный энтеротоксин, гликопротеин, рецептор транспорта двумембранных частиц через мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭПР), изменяет уровень внутриклеточного кальция и репликацию РНК. Продукт расщепления секретируется.

ШР5 Взаимодействует с белками КБР2 и КБР6. О-гликозилируется, гиперфосфорилируется, связывается с однонитевой РНК, является компонентом вироплазмы, необходим для репликации вируса. Формирует гомомультимеры.

ШР6 Взаимодействует с белком КБР5. Является продуктом, образующимся путем сдвига рамки считывания генного сегмента II, локализован в вироплазме.

Род ротавирус подразделяется на серологические группы А-Б. Классификация основана на генотипическом и серологическом анализе. Главные группы определяют по группоспецифическому капсидному антигену VP6. Все эти группы инфицируют животных, но лишь группы А-С - человека. Группа А включает ротавирусы, патогенные для человека и других видов животных; В -вирусы, патогенные только для человека; С и Е включают вирусы, патогенные для свиней; Б и Б - вирусы, патогенные для птиц. Следует отметить, что ротавирусы группы А являются наиболее распространенной причиной диарей у человека, поэтому их изучение особенно актуально.

Идентификацию вирусов внутри серотипа проводят, используя антитела к наружным типоспецифическим капсидным белкам ^Р4 и VP7). Например, в группе А по антигену VP7 (также обозначаемому как О-антиген) выявлено 15 типов, а по антигену VP4 (Р - антиген) — 26 типов. В мире циркулируют преимущественно пять штаммов, О1, О3, О4, О9 в комбинации с Р[8] и О2Р[4] [172].

Благодаря сегментированному геному для ротавируса характерно явление реассортации при инфицировании несколькими штаммами [66]. В результате появляются новые штаммы патогена, также на данном явлении основывается стратегия создания живых противоротавирусных вакцин.

1.2 Эпидемиология ротавирусной инфекции

Диарея является одной из ведущих причин смертности детей до пяти лет во всем мире, ротавирусная инфекция до сих пор является основной причиной возникновения диареи, ведущей к тяжелой дегидратации организма [65].

Обычно ротавирусная инфекция проявляется в виде диареи, сопровождающейся рвотой, повышенной температурой, симптомы длятся 3-7 дней. Диагностика ротавирусной инфекции проводится редко, хотя на сегодняшний момент на рынке имеется большое количество коммерческих тестов, в основе которых лежит иммунологический анализ биологического материала больного. По статистике, по сравнению с другими гастроэнтеритами, ротавирусная инфекция чаще сопровождается дегидратацией организма [156].

Долгое время считалось, что ротавирусная инфекция ограничена желудочно-кишечным трактом, однако последние исследования показали возможность циркуляции ротавируса в крови [146]. Также имеется исследование, в котором зарегистрированы редкие случаи тяжелой ротавирусной инфекции, при которой антигены ротавируса обнаруживаются в цереброспинальной жидкости [118]. У детей с наличием иммунодефицита циркуляция вируса в организме

может продолжаться вплоть до года и более, и эти случаи могут рассматриваться как потенциальный источник инфекции [140].

В странах с умеренным климатом ротавирусная инфекция имеет четкую сезонность - пик заболеваемости регистрируется в период зимних месяцев, и небольшое количество случаев - летом и осенью. В странах с жарким климатом такой картины не наблюдается - заболеваемость ротавирусным гастроэнтеритом регистрируется весь год. Большинство случаев тяжелого ротавирусного гастроэнтерита, требующего госпитализации, приходится на детей в возрасте 6-24 месяцев.

Также следует отметить, что в развитых странах дети инфицируются небольшой группой серотипов ротавируса, редко наблюдается смешанная инфекция двумя и более штаммами, тогда как в развивающихся странах обнаружено огромное разнообразие серотипов вируса, и практически треть пациентов инфицируется двумя и более штаммами [49, 100].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Богомолова Елена Григорьевна, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Государственная Фармакопея Российской Федерации Х111. - Москва: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2015. - 1470 с.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук, Москва: Мир, 1984. - 480 с.

3. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Иммуногены и вакцины нового поколения / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, Москва: ГЭОТАР Медиа, 2011. - 608 с.

4. Российская газета Правила лабораторной практики [Электронный ресурс]. URL: https://rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html.

5. Российская газета Указ Президента Российской Федерации от 29 мая 2017 года № 240 «Об объявлении в Российской Федерации Десятилетия детства» [Электронный ресурс]. URL: https://rg.ru/2017/05/29/prezident-ukaz240-site-dok.html.

6. Хаитов Р.М. Разработка вакцин нового поколения на основе структурного объединения антигенов и синтетических полимерных иммуномодуляторов / Р.М. Хаитов // Биомедицинская химия - 1997. - Вып. 43, № 5. - C. 390-401.

7. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований / В.И. Юнкеров, С.Г. Григорьев. - СПб: ВМедА, 2002. -266 с.

8. Aalberse R.C. et al. IgG4 as a blocking antibody / R.C. Aalberse, P.H. Dieges, V. Knul-Bretlova, P. Vooren, M. Aalbers, van J. Leeuwen // Clinical Reviews in Allergy. -1983. - V. 1, № 2. - P. 289-302.

9. Aalberse R.C. et al. Immunoglobulin G4: an odd antibody / R.C. Aalberse, S.O. Stapel, J. Schuurman, T. Rispens // Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. - 2009. - V. 39, № 4. - P. 469477.

10. Aalberse R.C., Gaag R. van der, Leeuwen J. van Serologic aspects of IgG4 antibodies. I. Prolonged immunization results in an IgG4-restricted response / R.C.

Aalberse, van der R. Gaag, van J. Leeuwen // Journal of Immunology. - 1983. - V. 130, № 2. - P. 722-726.

11. Adjobimey T., Hoerauf A. Induction of immunoglobulin G4 in human filariasis: an indicator of immunoregulation / T. Adjobimey, A. Hoerauf // Annals of Tropical Medicine and Parasitology. - 2010. - V. 104, № 6. - P. 455-464.

12. Aiyegbo M.S. et al. Human rotavirus VP6-specific antibodies mediate intracellular neutralization by binding to a quaternary structure in the transcriptional pore / M.S. Aiyegbo, G. Sapparapu, B.W. Spiller, I.M. Eli, D.R. Williams, R. Kim, D.E. Lee, T. Liu, S. Li, V.L. Jr. Woods, D.P. Nannemann, J. Meiler, P.L. Stewart, J.E. Jr.Crowe // PloS One. - 2013. - V. 8, № 5. - P. e61101.

13. Ali S.A. et al. Impact of Different Dosing Schedules on the Immunogenicity of the Human Rotavirus Vaccine in Infants in Pakistan: A Randomized Trial / S.A. Ali, A.M. Kazi, M.M. Cortese, J.A. Fleming, U.D. Parashar, B. Jiang, M.M. McNeal, D. Steele, Z. Bhutta, A. Zaidi // Journal of Infectious Diseases. 2014. Vol. 210. № 11. P. 1772-1779.

14. Andrews P. Molecular-sieve chromatography // British Medical Bulletin. - 1966. -V. 22, № 2. - P. 109-114.

15. Angel J., Franco M.A., Greenberg H.B. Rotavirus vaccines: recent developments and future considerations / J. Angel, M.A. Franco, H.B. Greenberg // Nature Reviews. Microbiology. - 2007. - V. 5, № 7. - P. 529-539.

16. Angel J., Franco M.A., Greenberg H.B. Rotavirus immune responses and correlates of protection / J. Angel, M.A. Franco, H.B. Greenberg // Current Opinion in Virology. -2012. - V. 2, № 4. - P. 419-425.

17. Angel J., Steele A.D., Franco M.A. Correlates of protection for rotavirus vaccines: Possible alternative trial endpoints, opportunities, and challenges / J. Angel, A.D. Steele, M.A. Franco // Human Vaccines & Immunotherapeutics. - 2014. - V. 10, № 12. -P. 3659-3671.

18. Arnold M.M., Patton J.T. Diversity of Interferon Antagonist Activities Mediated by NSP1 Proteins of Different Rotavirus Strains / M.M. Arnold, J.T. Patton // Journal of Virology. - 2011. - V. 85, № 5. - P. 1970-1979.

19. Balaram P., Kien P.K., Ismail A. Toll-like receptors and cytokines in immune

responses to persistent mycobacterial and Salmonella infections / P. Balaram, P.K. Kien, A. Ismail // International journal of medical microbiology: IJMM. - 2009. - V. 299, № 3. - P. 177-185.

20. Ball J.M. et al. Age-dependent diarrhea induced by a rotaviral nonstructural glycoprotein / J.M. Ball, P. Tian, C.Q. Zeng, A.P. Morris, M.K. Estes // Science (New York, N.Y.). - 1996. - V. 272, № 5258. - P. 101-104.

21. Barnes G.L. et al. Early phase II trial of human rotavirus vaccine candidate RV3 / G.L. Barnes, J.S. Lund, S.V. Mitchell, L. De Bruyn, L. Piggford, A.L. Smith, J. Furmedge, P.J. Masendycz, H.C. Bugg, N. Bogdanovic-Sakran, J.B. Carlin, R.F. Bishop // Vaccine. - 2002. - V. 20, № 23-24. - P. 2950-2956.

22. Bates J.T. et al. Mucosal adjuvant activity of flagellin in aged mice / J.T. Bates, A.N. Honko, A.H. Graff, N.D. Kock, S.B. Mizel // Mechanisms of Ageing and Development. - 2008. - V. 129, № 5. - P. 271-281.

23. Beckwith J. Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology Biology / J. Beckwith, Washington: American Society for Microbiology, 1987. - 1654 p.

24. Ben-Yedidia T. et al. Intranasal administration of synthetic recombinant peptide-based vaccine protects mice from infection by Schistosoma mansoni / T. Ben-Yedidia, R. Tarrab-Hazdai, D. Schechtman, R. Arnon // Infection and Immunity. - 1999. - V. 67, № 9. - P. 4360-4366.

25. Ben-Yedidia T., Arnon R. Effect of pre-existing carrier immunity on the efficacy of synthetic influenza vaccine / T. Ben-Yedidia, R. Arnon // Immunology Letters. - 1998. -V. 64, № 1. - P. 9-15.

26. Berkowska M.A. et al. Human memory B cells originate from three distinct germinal center-dependent and -independent maturation pathways / M.A. Berkowska, G.J. Driessen, V. Bikos, C. Grosserichter-Wagener, K. Stamatopoulos, A. Cerutti, B. He, K. Biermann, J.F. Lange, van der M. Burg, van J.J. Dongen, van M.C. Zelm // Blood. - 2011. - V. 118, № 8. - P. 2150-2158.

27. Bernstein D.I. et al. Efficacy of live, attenuated, human rotavirus vaccine 89-12 in infants: a randomised placebo-controlled trial / D.I. Bernstein, D.A. Sack, E. Rothstein,

K. Reisinger, V.E. Smith, D. O'Sullivan, D.R. Spriggs, R.L.Ward // Lancet. - 1999. -V. 354, № 9175. - P. 287-290.

28. Biggelaar A.H.J. van den et al. Pneumococcal conjugate vaccination at birth in a high-risk setting: No evidence for neonatal T-cell tolerance / van den A.H. Biggelaar, W. Pomat, A. Bosco, S. Phuanukoonnon, C.J. Devitt, M.A. Nadal-Sims, P.M. Siba, P.C. Richmond, D. Lehmann, P.G. Holt // Vaccine. - 2011. - V. 29, № 33. - P. 5414-5420.

29. Bishop R.F. et al. Virus particles in epithelial cells of duodenal mucosa from children with acute non-bacterial gastroenteritis / R.F. Bishop, G.P. Davidson, I.H. Holmes, B.J. Ruck // Lancet. - 1973. - V. 2, № 7841. - P. 1281-1283.

30. Blanchard-Rohner G. et al. The B-cell response to a primary and booster course of MenACWY-CRMi97 vaccine administered at 2, 4 and 12 months of age / G. Blanchard-Rohner, M.D. Snape, D.F. Kelly, D. O'Connor, T. John, E.A. Clutterbuck, B. Ohene-Kena, C.L. Klinger, T. Odrljin, A.J. Pollard // Vaccine. - 2013. - V. 31, № 20. -P. 2441-2448.

31. Boom J.A. et al. Symptomatic infection and detection of vaccine and vaccine-reassortant rotavirus strains in 5 children: a case series / J.A. Boom, L.C. Sahni, D.C. Payne, R. Gautam, F. Lyde, S. Mijatovic-Rustempasic, M.D. Bowen, J.E. Tate, M.A. Rench, J.R. Gentsch, U.D. Parashar, C.J. Baker // The Journal of Infectious Diseases. -2012. - V. 206, № 8. - P. 1275-1279.

32. Borrow R. et al. Glycoconjugate vaccines and immune interactions, and implications for vaccination schedules / R. Borrow, R. Dagan, F. Zepp, H. Hallander, J. Poolman // Expert Review of Vaccines. - 2011. - V. 10, № 11. - P. 1621-1631.

33. Bresee J.S. et al. The etiology of severe acute gastroenteritis among adults visiting emergency departments in the United States / J.S. Bresee, R. Marcus, R.A. Venezia, W.E. Keene, D. Morse, M. Thanassi, P. Brunett, S. Bulens, R.S. Beard, L.A. Dauphin, L. Slutsker, C. Bopp, M. Eberhard, A. Hall, J. Vinje, S.S. Monroe, R.I. Glass, US Acute Gastroenteritis Etiology Study Team // The Journal of Infectious Diseases. - 2012. - V. 205, № 9. - P. 1374-1381.

34. Bromuro P. et al. Beta-glucan-CRM197 conjugates as candidates antifungal vaccines / C. Bromuro, M. Romano, P. Chiani, F. Berti, M. Tontini, D. Proietti, E. Mori,

A. Torosantucci, P. Costantino, R. Rappuoli, A.Cassone // Vaccine. - 2010. - V. 28, № 14. - P. 2615-2623.

35. Broome R.L. et al. Murine rotavirus genes encoding outer capsid proteins VP4 and VP7 are not major determinants of host range restriction and virulence / R.L. Broome, P.T. Vo, R.L. Ward, H.F. Clark, H.B.Greenberg // Journal of Virology. - 1993. - V. 67, № 5. - P. 2448-2455.

36. Bruijning-Verhagen P. et al. Targeted rotavirus vaccination of high-risk infants; a low cost and highly cost-effective alternative to universal vaccination / P. Bruijning-Verhagen, M.J. Mangen, M. Felderhof, N.G. Hartwig, van M. Houten, L. Winkel, de W.J. Waal, M.J. Bonten // BMC medicine. - 2013. - V. 11. - P. 112.

37. Burnett E., Parashar U., Tate J. Rotavirus Vaccines: Effectiveness, Safety, and Future Directions / E. Burnett, U. Parashar, J. Tate // Pediatric Drugs. - 2018. - V. 20, № 3. - P. 223-233.

38. Burtnick M.N. et al. Development of novel O-polysaccharide based glycoconjugates for immunization against glanders / M.N. Burtnick, C. Heiss, A.M. Schuler, P. Azadi, P.J. Brett // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 2012. - V. 2. - P. 148.

39. Chandola T.R. et al. ROTAVAC(®) does not interfere with the immune response to childhood vaccines in Indian infants: A randomized placebo controlled trial // Heliyon. -2017. - V. 3, № 5. - P. e00302.

40. Chauhan N. et al. Immunogenicity of cholera toxin B epitope inserted in Salmonella flagellin expressed on bacteria and administered as DNA vaccine / T.R. Chandola, S. Taneja, N. Goyal, K. Antony, K. Bhatia, D. More, N. Bhandari, I. Cho, K. Mohan, S. Prasad, G. Harshavardhan, T.S. Rao, S. Vrati, M.K. Bhan // Molecular and Cellular Biochemistry. - 2005. - V. 276, № 1-2. - P. 1-6.

41. Chevance F.F.V., Hughes K.T. Coordinating assembly of a bacterial macromolecular machine / F.F.V. Chevance, K.T. Hughes // Nature Reviews. Microbiology. - 2008. - V. 6, № 6. - P. 455-465.

42. Chiba S. et al. Protective effect of naturally acquired homotypic and heterotypic rotavirus antibodies / S. Chiba, T. Yokoyama, S. Nakata, Y. Morita, T. Urasawa, K. Taniguchi, S. Urasawa, T.Nakao // Lancet. - 1986. - V. 2, № 8504. - P. 417-421.

43. Chrystie I.L., Totterdell B.M., Banatvala J.E. Asymptomatic endemic rotavirus infections in the newborn / I.L. Chrystie, B.M. Totterdell, J.E. Banatvala // Lancet. -1978. - V. 1, № 8075. - P. 1176-1178.

44. Ciacci-Woolwine F. et al. Salmonella flagellin induces tumor necrosis factor alpha in a human promonocytic cell line / F. Ciacci-Woolwine, I.C. Blomfield, S.H. Richardson, S.B. Mizel // Infection and Immunity. - 1998. - V. 66, № 3. - P. 1127-1134.

45. Conner M.E. et al. Rotavirus subunit vaccines / M.E. Conner, S.E. Crawford, C. Barone, C. O'Neal, Y.J. Zhou, F. Fernandez, A. Parwani, L.J. Saif, J. Cohen, M.K. Estes // Archives of Virology. Supplementum. - 1996. - V. 12. - P. 199-206.

46. Conner M.E., Ramig R.F. Viral enteric diseases / M.E. Conner, R.F. Ramig, Philadelphia, Pa: Lippincott-Raven Publishers, P. 713-743.

47. Council of Europe Carrier proteins for the production of conjugated polysaccharide vaccines for human use // European Pharmacopoeia: supplement 9.6. 9th ed. 2018. - P. 626-627.

48. Crawford S.E. et al. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-ß signaling is required for rotavirus replication / S.E. Crawford, J.M. Hyser, B. Utama, M.K. Estes // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2012. - V. 109, № 50.

- P. 3405-3413.

49. Cunliffe N.A. et al. Epidemiology of rotavirus diarrhoea in Africa: a review to assess the need for rotavirus immunization / N.A. Cunliffe, P.E. Kilgore, J.S. Bresee, A.D. Steele, N. Luo, C.A. Hart, R.I. Glass // Bulletin of the World Health Organization.

- 1998. - V. 76, № 5. - P. 525-537.

50. Dagan R., Poolman J., Siegrist C.-A. Glycoconjugate vaccines and immune interference: A review / R. Dagan, J. Poolman, C.-A. Siegrist // Vaccine. - 2010. - V. 28, № 34. - P. 5513-5523.

51. Daneshian M. et al. In vitro pyrogen test for toxic or immunomodulatory drugs / M. Daneshian, A. Guenther, A. Wendel, T. Hartung, von S. Aulock // Journal of Immunological Methods. - 2006. -V. 313, № 1-2. - P. 169-175.

52. Dang D.A. et al. A dose-escalation safety and immunogenicity study of a new live

attenuated human rotavirus vaccine (Rotavin-M1) in Vietnamese children / D.A. Dang, V.T. Nguyen, D.T. Vu, T.H. Nguyen, D.M. Nguyen, W. Yuhuan, J. Baoming, D.H. Nguyen, T.L. Le; Rotavin-M1 Vaccine Trial Group // Vaccine. - 2012. - V. 30. - P. 114-121.

53. Danieli E. et al. Synthesis of Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide repeating unit using novel L-FucNAc and D-FucNAc synthons and immunochemical evaluation / E. Danieli, D. Proietti, G. Brogioni, M.R. Romano, E. Cappelletti, M. Tontini, F. Berti, L. Lay, P. Costantino, R. Adamo // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2012. - V. 20, № 21. - P. 6403-6415.

54. Dateoka S., Ohnishi Y., Kakudo K. Effects of CRM197, a specific inhibitor of HB-EGF, in oral cancer / S. Dateoka, Y. Ohnishi, K. Kakudo // Medical Molecular Morphology. - 2012. - V. 45, № 2. - P. 91-97.

55. Davis K.A., Morelli M., Patton J.T. Rotavirus NSP1 Requires Casein Kinase II-Mediated Phosphorylation for Hijacking of Cullin-RING Ligases / K.A. Davis, M. Morelli, J.T. Patton // mBio. - 2017. - V. 8, № 4. - P. e01213-17.

56. Dennehy P.H. Treatment and prevention of rotavirus infection in children/ P.H. Dennehy // Current Infectious Disease Reports. - 2013. - V. 15, № 3. - P. 242-250.

57. Edwards E.A. Intussusception: past, present and future / E.A. Edwards // Pediatric Radiology. - 2017. - V. 47, № 9. - P. 1101-1108.

58. Erridge C., Bennett-Guerrero E., Poxton I.R. Structure and function of lipopolysaccharides / C. Erridge, E. Bennett-Guerrero, I.R. Poxton // Microbes and Infection. - 2002.- V. 4, № 8. - P. 837-851.

59. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose / P.L. Ey, S.J. Prowse, C.R. Jenkin // Immunochemistry. - 1978. - V. 15, № 7. - P. 429-436.

60. Ferrante A., Beard L.J., Feldman R.G. IgG subclass distribution of antibodies to bacterial and viral antigens / A. Ferrante, L.J. Beard, R.G. Feldman // The Pediatric Infectious Disease Journal. - 1990. - V. 9, № 8. - P. S16-24.

61. Fiske M.J. Method for reducing endotoxin in Moraxella catarrhalis UspA2 protein preparations / M.J. Fiske // Journal of Chromatography. B, Biomedical Sciences and

Applications. - 2001. - V. 753, № 2. - P. 269-278.

62. Flewett T.H., Bryden A.S., Davies H.A. Virus particles in gastroenteritis / T.H. Flewett, A.S. Bryden, H.A. Davies // Lancet. - 1973. - V. 7844, № 2. - P. 1497.

63. Flores J. et al. Conservation of the Fourth Gene among Rotaviruses Recovered from Asymptomatic Newborn Infants and Its Possible Role in Attenuation / J. Flores, K. Midthun, Y. Hoshino, K. Green, M. Gorziglia, A.Z. Kapikian, R.M. Chanock // Journal of virology - 1986. - V. 60, № 3 - P. 972-979.

64. Fu C. et al. Effectiveness of the Lanzhou lamb rotavirus vaccine against gastroenteritis among children / C. Fu, Q. He, J. Xu, H. Xie, P. Ding, W. Hu, Z. Dong, X. Liu, M. Wang // Vaccine. 2012. - V. 31, .№ 1. - P. 154-158.

65. GBD Diarrhoeal Diseases Collaborators / GBD // Estimates of global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of diarrhoeal diseases: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. - 2017. - № 17. - P. 909-948.

66. Gentsch J.R. et al. Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs / J.R. Gentsch, A.R. Laird,

B. Bielfelt, D.D. Griffin, K. Banyai, M. Ramachandran, V. Jain, N.A. Cunliffe, O. Nakagomi, C.D. Kirkwood, T.K. Fischer, U.D. Parashar, J.S. Bresee, B. Jiang, R.I. Glass // The Journal of Infectious Diseases. - 2005. - V. 192. - P. S146-159.

67. Gil M.T. et al. Homotypic protection against rotavirus-induced diarrhea in infant mice breast-fed by dams immunized with the recombinant VP8* subunit of the VP4 capsid protein / M.T. Gil, C.O. de Souza, M. Asensi, J. Buesa // Viral Immunology. -2000. - V. 13, № 2. - P. 187-200.

68. Gill C.J. et al. Persistence of immune responses after a single dose of Novartis meningococcal serogroup A, C, W-135 and Y CRM-197 conjugate vaccine (Menveo®) or Menactra® among healthy adolescents / C.J. Gill, R. Baxter, A. Anemona, G. Ciavarro, P. Dull // Human Vaccines. - 2010. - V. 6, № 11. - P. 881-887.

69. Glass R.I. et al. Development of candidate rotavirus vaccines derived from neonatal strains in India / R.I. Glass, M.K. Bhan, P. Ray, R. Bahl, U.D. Parashar, H. Greenberg,

C.D. Rao, N. Bhandari, Y. Maldonado, R.L. Ward, D.I. Bernstein, J.R. Gentsch // The Journal of Infectious Diseases. - 2005. - V. 192.- P. S30-35.

70. Glass R.I. New Hope For Defeating Rotavirus / R.I. Glass // Scientific American. -2006. - V. 294, № 4. - P. 46-55.

71. Graham D.Y., Estes M.K. Viral infections of the intestine / D.Y. Graham, M.K. Estes, N.Y.: Medical Examination Publishing Company, 1988. - P. 566-578.

72. Graham D.Y., Sackman J.W., Estes M.K. Pathogenesis of rotavirus-induced diarrhea. Preliminary studies in miniature swine piglet / D.Y. Graham, J.W. Sackman, M.K. Estes // Digestive Diseases and Sciences. - 1984. - V. 29, № 11. - P. 1028-1035.

73. Greenberg H.B. Rotavirus vaccination and intussusception--act two / H.B. Greenberg // The New England Journal of Medicine. - 2011. - V. 364, № 24. - P. 23542355.

74. Greenberg H.B., Clark H.F., Offit P.A. Rotavirus pathology and pathophysiology / H.B. Greenberg, H.F. Clark, P.A. Offit // Current Topics in Microbiology and Immunology. - 1994. - V. 185. - P. 255-283.

75. Groome M.J. et al. Effect of breastfeeding on immunogenicity of oral live-attenuated human rotavirus vaccine: a randomized trial in HIV-uninfected infants in Soweto, South Africa / M.J. Groome, S.-S. Moon, D. Velasquez, S. Jones, A. Koen, N. van Niekerk, B. Jiang, U.D. Parashar, S.A. Madhi // Bulletin of the World Health Organization. - 2014. - V. 92, № 4. - P. 238-245.

76. Hajam I.A. et al. Bacterial flagellin-a potent immunomodulatory agent / I.A. Hajam, P.A. Dar, I. Shahnawaz, J.C. Jaume, J.H. Lee. // Experimental & Molecular Medicine. -2017. - V. 49, № 9. - P. e373.

77. Hall G.A. et al. Variation in rotavirus virulence: a comparison of pathogenesis in calves between two rotaviruses of different virulence / G.A. Hall, J.C. Bridger, K.R. Parsons, R. Cook // Veterinary Pathology. - 1993. - V. 30, № 3. - P. 223-233.

78. Hashim A.S.M., Aboshanab K.M.A., El-Sayed A.F.M. Developing an Inactivated Rotavirus Vaccine and Evaluating the Immunogenicity Against a Commercially Available Attenuated Rotavirus Vaccine Using a Mice Animal Model / A.S.M. Hashim, K.M.A. Aboshanab, A.F.M. El-Sayed // Viral Immunology. - 2016. - V. 29, № 10. - P. 565-571.

79. Hayashi F. et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by

Toll-like receptor 5 / F. Hayashi, K.D. Smith, A. Ozinsky, T.R. Hawn, E.C. Yi, D.R. Goodlett, J.K. Eng, S. Akira, D.M. Underhill, A. Aderem // Nature. - 2001. - V. 410, № 6832. - P. 1099-1103.

80. Hinz M., Arslan S.£., Scheidereit C. It takes two to tango: IxBs, the multifunctional partners of NF-kB: Biological roles of IkB family proteins / M. Hinz, S.£. Arslan, C. Scheidereit // Immunological Reviews. - 2012. - V. 246, № 1. - P. 59-76.

81. Honko A.N. et al. Flagellin is an effective adjuvant for immunization against lethal respiratory challenge with Yersinia pestis / A.N. Honko, N. Sriranganathan, C.J. Lees,

5.B. Mizel // Infection and Immunity. - 2006.- V. 74, № 2. - P. 1113-1120.

82. Honko A.N., Mizel S.B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung / A.N. Honko, S.B. Mizel // Infection and Immunity. -2004. - V. 72, № 11. - P. 6676-6679.

83. Hoshino Y., Kapikian A.Z. Rotavirus vaccine development for the prevention of severe diarrhea in infants and young children / Y. Hoshino, A.Z. Kapikian // Trends in Microbiology. - 1994. - V. 2, № 7. - P. 242-249.

84. Huber R.E., Kurz G., Wallenfels K. A quantitation of the factors which affect the hydrolase and transgalactosylase activities of beta-galactosidase (E. coli) on lactose / R.E. Huber, G. Kurz, K. Wallenfels // Biochemistry. - 1976. - V. 15, № 9. - P. 19942001.

85. Hussain R. et al. Selective increases in antibody isotypes and immunoglobulin G subclass responses to secreted antigens in tuberculosis patients and healthy household contacts of the patients / R. Hussain, G. Dawoo, N. Abrar, Z. Toossi, A. Minai, M. Dojki, J.J. Ellner // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. - 1995. -V. 2, №

6. - P. 726-732.

86. Hwang K.W. Haemophilus influenza type b (Hib) vaccine and its carrier proteins / K.W. Hwang // Archives of Pharmacal Research. - 2010. - V. 33, № 6. - P. 793-795.

87. Hyser J.M. et al. Activation of the endoplasmic reticulum calcium sensor STIM1 and store-operated calcium entry by rotavirus requires NSP4 viroporin activity // Journal of Virology. 2013. № 24 (87). P. 13579-13588.

88. Ilyina N. et al. Safety and immunogenicity of meningococcal ACWY CRM197-

conjugate vaccine in children, adolescents and adults in Russia / N. Ilyina, S. Kharit, L. Namazova-Baranova, A. Asatryan, M. Benashvili, E. Tkhostova, C. Bhusal, A. Arora // Human Vaccines & Immunotherapeutics. - 2014. -V. 10, № 8. - P. 2471-2481.

89. Inada T., Kimata K., Aiba H. Mechanism responsible for glucose-lactose diauxie in Escherichia coli: challenge to the cAMP model / T. Inada, K. Kimata, H. Aiba // Genes to Cells: Devoted to Molecular & Cellular Mechanisms. -1996. -V. 1, № 3. - P. 293301.

90. Invitrogen Ni-NTA purification system. / Invitrogen // User manual. Catalog nos. K950-01, K951-01, K952-01, K953-01, K954-01, R901-01, R901-10, R 901-15. Version P. 25-0496. - 2006.

91. Isanaka S. et al. Efficacy of a Low-Cost, Heat-Stable Oral Rotavirus Vaccine in Niger / S. Isanaka, O. Guindo, C. Langendorf, A. Matar Seck, B.D. Plikaytis, N. Sayinzoga-Makombe, M.M. McNeal, N. Meyer, E. Adehossi, A. Djibo, B. Jochum, R.F. Grais // The New England Journal of Medicine. - 2017. - V. 376, № 12. - P. 11211130.

92. Jain S., Vashistt J., Changotra H. Rotaviruses: is their surveillance needed? / S. Jain, J. Vashistt, H. Changotra // Vaccine. - 2014. - V. 32, № 27. - P. 3367-3378.

93. Jiang B. et al. Immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine in mice / B. Jiang, Y. Wang, J.F. Saluzzo, K. Bargeron, M.J. Frachette, R.I. Glass // Human Vaccines. - 2008. - V. 4, № 2. - P. 143-147.

94. Jiang B., Gentsch J.R., Glass R.I. The role of serum antibodies in the protection against rotavirus disease: an overview / B. Jiang, J.R. Gentsch, R.I. Glass // Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2002. - V. 34, № 10. - P. 1351-1361.

95. Jiang J. et al. Childhood intussusception: a literature review / J. Jiang, B. Jiang, U. Parashar, T. Nguyen, J .Bines, M.M. Patel // PloS One. - 2013. -V. 8, № 7. - P. e68482.

96. Jiang V. et al. Performance of rotavirus vaccines in developed and developing countries / V. Jiang, B. Jiang, J. Tate, U.D. Parashar, M.M. Patel // Human Vaccines. -2010. - V. 6, № 7. - P. 532-542.

97. Jiskoot W. et al. Mouse Models for Assessing Protein Immunogenicity: Lessons and

Challenges / W. Jiskoot, G. Kijanka, T.W. Randolph, J.F. Carpenter, A.V. Koulov, H.C. Mahler, M.K. Joubert, V. Jawa, L.O. Narhi // Journal of Pharmaceutical Sciences. -2016. - V. 105, № 5. - P. 1567-1575.

98. John B.M., Devgan A., Mitra B. Prevalence of rotavirus infection in children below two years presenting with diarrhea / B.M. John, A. Devgan, B. Mitra // Medical Journal, Armed Forces India. - 2014. - V. 70, № 2. - P. 116-119.

99. Kabanova A. et al. Evaluation of a Group A Streptococcus synthetic oligosaccharide as vaccine candidate / A. Kabanova, I. Margarit, F. Berti, M.R. Romano, G. Grandi, G. Bensi, E. Chiarot, D. Proietti, E. Swennen, E. Cappelletti, P. Fontani, D. Casini, R. Adamo, V. Pinto, D. Skibinski, S. Capo, G. Buffi, M. Gallotta, W.J. Christ, A.S. Campbell, J. Pena, P.H. Seeberger, R. Rappuoli, P. Costantino // Vaccine. - 2010. - V. 29, № 1. - P. 104-114.

100. Kang G. et al. Epidemiological profile of rotaviral infection in India: challenges for the 21st century / G. Kang, S.D. Kelkar, S.D. Chitambar, P. Ray, T. Naik // The Journal of Infectious Diseases. - 2005. - V. 192. - P. S120-126.

101. Kido M. et al. RNase E polypeptides lacking a carboxyl-terminal half suppress a mukB mutation in Escherichia coli / M. Kido, K. Yamanaka, T. Mitani, H. Niki, T. Ogura, S. Hiraga // Journal of Bacteriology. - 1996. -V. 178, № 13. - P. 3917-3925.

102. Kimata K. et al. cAMP receptor protein-cAMP plays a crucial role in glucose-lactose diauxie by activating the major glucose transporter gene in Escherichia coli // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -1997. - V. 94, № 24. - P. 12914-12919.

103. Kompithra R.Z. et al. Immunogenicity of a three dose and five dose oral human rotavirus vaccine (RIX4414) schedule in south Indian infants / R.Z. Kompithra, A. Paul, D. Manoharan, S. Babji, R. Sarkar, L.G. Mathew, G. Kang // Vaccine. - 2014. - V. 32. -P. A129-A133.

104. Kuo Y.-C., Chung C.-Y. Transcytosis of CRM197-grafted polybutylcyanoacrylate nanoparticles for delivering zidovudine across human brain-microvascular endothelial cells / Y.-C. Kuo, C.-Y. Chung // Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. - 2012. - V. 91. - P. 242-249.

105. Kurniawan A. et al. Differential expression of IgE and IgG4 specific antibody responses in asymptomatic and chronic human filariasis / A. Kurniawan, M. Yazdanbakhsh, R. van Ree, R. Aalberse, M.E. Selkirk, F. Partono, R.M. Maizels // Journal of Immunology. - 1993. - V. 150, № 9. - P. 3941-3950.

106. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F. Doolittle // Journal of Molecular Biology. - 1982. - V. 157, № 1.

- P. 105-132.

107. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli// Nature. - 1970. - V. 227, № 5259 . - P. 680-685.

108. Lappalainen S. et al. Immune responses elicited against rotavirus middle layer protein VP6 inhibit viral replication in vitro and in vivo / S. Lappalainen, A.R. Pastor, K. Tamminen, V. López-Guerrero, F. Esquivel-Guadarrama, L.A. Palomares, T. Vesikari, V. Blazevic // Human Vaccines & Immunotherapeutics. - 2014. - V. 10, № 7.

- P. 2039-2047.

109. Lee S. et al. Development of a Bacillus subtilis-based rotavirus vaccine / S. Lee, B.R. Belitsky, J.P. Brinker, K.O. Kerstein, D.W. Brown, J.D. Clements, G.T. Keusch, S. Tzipori, A.L. Sonenshein, J.E. Herrmann // Clinical and vaccine immunology: CVI. -2010. - V. 17, № 11. - P. 1647-1655.

110. Levin Y., Kochba E., Kenney R. Clinical evaluation of a novel microneedle device for intradermal delivery of an influenza vaccine: are all delivery methods the same? / Y. Levin, E. Kochba, R. Kenney // Vaccine. - 2014. - V. 32, № 34. - P. 4249-4252.

111. Liew F.Y. New aspects of vaccine development / F.Y. Liew // Clinical and Experimental Immunology. - 1985. - V. 62, № 2. - P. 225-241.

112. Ling-Qiao Z. A rotavirus vaccine licensed in China / Z.A. Ling-Qiao // Health News. - 2001. - V. 31. - P. 1.

113. Little A.M., Parham P. Polymorphism and evolution of HLA class I and II genes and molecules / A.M. Little, P. Parham // Reviews in Immunogenetics. - 1999. - V. 1, № 1. - P. 105-123.

114. Lopman B.A. et al. Infant rotavirus vaccination may provide indirect protection to older children and adults in the United States / B.A. Lopman, A.T. Curns, C. Yen, U.D.

Parashar // The Journal of Infectious Diseases. - 2011. - V. 204, № 7. - P. 980-986.

115. Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall // The Journal of Biological Chemistry. - 1951. - V. 193, № 1. - P. 265-275.

116. Lundgren O., Svensson L. Pathogenesis of rotavirus diarrhea / O. Lundgren, L. Svensson // Microbes and Infection. - 2001. - V. 3, № 13. - P. 1145-1156.

117. Lundgren O., Svensson L. The enteric nervous system and infectious diarrhea / O. Lundgren, L. Svensson, Amsterdam: Elsevier Science BV, 2003. - P. 51-68.

118. Lynch M. et al. Rotavirus and central nervous system symptoms: cause or contaminant? Case reports and review / M. Lynch, B. Lee, P. Azimi, J. Gentsch, C. Glaser, S. Gilliam, H.G. Chang, R. Ward, R.I. Glass // Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2001. - V. 33, № 7. - P. 932-938.

119. Madhi S.A. et al. Effect of Human Rotavirus Vaccine on Severe Diarrhea in African Infants / S.A. Madhi, N.A. Cunliffe, D. Steele, D. Witte, M. Kirsten, C. Louw, B. Ngwira, J.C. Victor, P.H. Gillard, B.B. Cheuvart, H.H. Han, K.M. Neuzil // New England Journal of Medicine. - 2010. - V. 362, № 4. - P. 289-298.

120. Magalhaes P.O. et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review / P.O. Magalhaes, A.M. Lopes, P.G. Mazzola, C. Rangel-Yagui, T.C. Penna, A.Jr. Pessoa // Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences: A Publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe Canadienne Des Sciences Pharmaceutiques. - 2007. - V. 10, № 3. - P. 388-404.

121. Majumder K. Ligation-free gene synthesis by PCR: synthesis and mutagenesis at multiple loci of a chimeric gene encoding OmpA signal peptide and hirudin / K. Majumder // Gene. -1992. - V. 110, № 1. - P. 89-94.

122. Marsh S.G.E. et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2010 / S.G. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, R.E. Bontrop, B. Dupont, H.A. Erlich, M. Fernández-Viña, D.E. Geraghty, R. Holdsworth, C.K. Hurley, M. Lau, K.W. Lee, B. Mach, M. Maiers, W.R. Mayr, C.R. Müller, P. Parham, E.W. Petersdorf, T. Sasazuki, J.L. Strominger, A. Svejgaard, P.I. Terasaki, J.M. Tiercy, J. Trowsdale // Tissue

Antigens. - 2010. - V. 75, № 4. - P. 291-455.

123. McDonald W.F. et al. A West Nile virus recombinant protein vaccine that coactivates innate and adaptive immunity / W.F. McDonald, J.W. Huleatt, H.G. Foellmer, D. Hewitt, J. Tang, P. Desai, A. Price, A. Jacobs, V.N. Takahashi, Y. Huang, V. Nakaar, L. Alexopoulou, E. Fikrig, T.J. Powell // The Journal of Infectious Diseases. - 2007. - V. 195, № 11. - P. 1607-1617.

124. Meadow N.D., Fox D.K., Roseman S. The bacterial phosphoenolpyruvate: glycose phosphotransferase system / N.D. Meadow, D.K. Fox, S. Roseman // Annual Review of Biochemistry. - 1990. - V. 59. - P. 497-542.

125. Mestas J., Hughes C.C.W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology / J. Mestas, C.C.W.Hughes // The Journal of Immunology. - 2004. -V. 172, № 5. - P. 2731-2738.

126. Meyts I. et al. Isolated IgG3 deficiency in children: to treat or not to treat? Case presentation and review of the literature / I. Meyts, X. Bossuyt, M. Proesmans, B. De // Pediatric Allergy and Immunology. - 2006. - V. 17, № 7. - P. 544-550.

127. Micoli F. et al. Production of a conjugate vaccine for Salmonella enterica serovar Typhi from Citrobacter Vi / F. Micoli, S. Rondini, I. Pisoni, C. Giannelli, V. Di Cioccio, P . Costantino, A. Saul, L.B. Martin // Vaccine. - 2012. - V. 30, № 5. - P. 853861.

128. Mizel S.B., Bates J.T. Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential / S.B. Mizel, J.T. Bates // Journal of Immunology. - 2010. -V. 185, № 10. - P. 56775682.

129. Mizel S.B., Snipes J.A. Gram-negative flagellin-induced self-tolerance is associated with a block in interleukin-1 receptor-associated kinase release from toll-like receptor 5 / S.B. Mizel, J.A. Snipes // The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - V. 277, № 25. - P. 22414-22420.

130. Moon H.W. Pathophysiology of viral diarrhea / H.W. Moon, N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 1994. - P. 27-52.

131. Moors M.A., Li L., Mizel S.B. Activation of interleukin-1 receptor-associated kinase by gram-negative flagellin / M.A. Moors, L. Li, S.B. Mizel // Infection and

Immunity. - 2001. -VV. 69, № 7.- P. 4424-4429.

132. Morelli M., Dennis A.F., Patton J.T. Putative E3 ubiquitin ligase of human rotavirus inhibits NF-kB activation by using molecular mimicry to target ß-TrCP / M. Morelli, A.F. Dennis, J.T. Patton // mBio. - 2015. - V. 6, № 1. - P. e02490-14.

133. Morelli M., Ogden K.M., Patton J.T. Silencing the alarms: Innate immune antagonism by rotavirus NSP1 and VP3 / M. Morelli, K.M. Ogden, J.T. Patton // Virology. - 2015. - V. 479-480. - P. 75-84.

134. Morokata T., Ishikawa J., Yamada T. Antigen dose defines T helper 1 and T helper 2 responses in the lungs of C57BL/6 and BALB/c mice independently of splenic responses / T. Morokata, J. Ishikawa, T. Yamada // Immunology Letters. - 2000. - V. 72, № 2. - P. 119-126.

135. Naik S.P. et al. Stability of heat stable, live attenuated Rotavirus vaccine (ROTASIIL®) / S.P. Naik, J.K. Zade, R.N. Sabale, S.S. Pisal, R. Menon, S.G. Bankar, S. Gairola, R.M. Dhere // Vaccine. - 2017. - V. 35, № 22. - P. 2962-2969.

136. Nascimento D.V. et al. Expression and purification of the immunogenically active fragment B of the Park Williams 8 Corynebacterium diphtheriae strain toxin / D.V. Nascimento, E.M.B. Lemes, J.L.S. Queiroz, J.G. Silva Jr., H.J. Nascimento, E.D. Silva, R. Hirata Jr., A.A.S.O. Dias, C.S. Santos, G.M.B. Pereira, A.L. Mattos-Guaraldi and

G.R.G. Armoa // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2010. - V. 43, № 5. - P. 460-466.

137. Natarajan K. et al. MHC class I molecules, structure and function / K. Natarajan,

H. Li, R.A. Mariuzza, D.H. Margulies // Reviews in Immunogenetics. - 1999. - V. 1, №

I. - P. 32-46.

138. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Antibody-mediated modulation of immune responses / F. Nimmerjahn, J.V. Ravetch // Immunological Reviews. - 2010. - V. 236. - P. 265275.

139. Oberli M.A. et al. A possible oligosaccharide-conjugate vaccine candidate for Clostridium difficile is antigenic and immunogenic / M.A. Oberli, M.L. Hecht, P. Bindschädler, A. Adibekian, T. Adam, P.H. Seeberger // Chemistry & Biology. - 2011. -V. 18, № 5. - P. 580-588.

140. Oishi I. et al. Serial observations of chronic rotavirus infection in an immunodeficient child / I. Oishi, T. Kimura, T. Murakami, K. Haruki, K. Yamazaki, Y. Seto, Y. Minekawa, H. Funamo // Microbiology and Immunology. - 1991. - V. 35, № 11. - P. 953-961.

141. Osborne M.P. et al. An electron microscopic investigation of time-related changes in the intestine of neonatal mice infected with murine rotavirus / M.P. Osborne, S.J. Haddon, A.J. Spencer, J. Collins, W.G. Starkey, T.S. Wallis, G.J. Clarke, K.J. Worton, D.C. Candy, J. Stephen // Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. - 1988. -V. 7, № 2. - P. 236-248.

142. Ottesen E.A. et al. Prominence of IgG4 in the IgG antibody response to human filariasis / E.A. Ottesen, F. Skvaril, S.P. Tripathy, R.W. Poindexter, R. Hussain // Journal of Immunology. - 1985. - V. 134, № 4. - P. 2707-2712.

143. Parashar U.D., Nelson E.A.S., Kang G. Diagnosis, management, and prevention of rotavirus gastroenteritis in children / U.D. Parashar, E.A.S. Nelson, G. Kang // BMJ. -2013. - V. 347. - P. f7204.

144. Park K. Targeted delivery to monocytes / K. Park // Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. - 2012. - V. 158, № 1. - P. 1.

145. Patel M. et al. Oral rotavirus vaccines: how well will they work where they are needed most? / M. Patel, A.L. Shane, U.D. Parashar, B. Jian, J.R. Gentsch, R.I. Glass // The Journal of Infectious Diseases. - 2009. - V. 200. - P. S39-48.

146. Patel M. et al. Detection of rotavirus antigenemia in routinely obtained serum specimens to augment surveillance and vaccine effectiveness evaluations / M. Patel, M.A. Rench, J.A. Boom, J.E. Tate, L.C. Sahni, J.A. Hull, J.R. Gentsch, U.D. Parashar, C.J. Baker // The Pediatric Infectious Disease Journal. - 2010. - V. 29, № 9. - P. 836839.

147. Peri F. Clustered carbohydrates in synthetic vaccines / F. Peri // Chemical Society Reviews. - 2013. - V. 42, № 11. - P. 4543-4556.

148. Pham T. et al. The Rotavirus NSP4 Viroporin Domain is a Calcium-conducting Ion Channel / T. Pham, J.L. Perry, T.L. Dosey, A.H. Delcour, J.M. Hyser // Scientific Reports. - 2017. - V. 7. - P. 43487.

149. Pollard A.J., Perrett K.P., Beverley P.C. Maintaining protection against invasive bacteria with protein-polysaccharide conjugate vaccines / A.J. Pollard, K.P. Perrett, P.C. Beverley // Nature Reviews. Immunology. - 2009. - V. 9, № 3. - P. 213-220.

150. Pone E.J. et al. Toll-like receptors and B-cell receptors synergize to induce immunoglobulin class-switch DNA recombination: relevance to microbial antibody responses / E.J. Pone, H. Zan, J. Zhang, A. Al-Qahtani, Z. Xu, P. Casali // Critical Reviews in Immunology. - 2010. - V. 30, № 1. - P. 1-29.

151. Porath J. et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation / J. Porath, J. Carlsson, I.Olsso, G. Belfrage // Nature. - 1975. - V. 258, № 5536. - P. 598-599.

152. Prameela K.K., Vijaya L.R. The importance of breastfeeding in rotaviral diarrhoeas / K.K. Prameela, L.R. Vijaya // Malaysian Journal of Nutrition. - 2012. - V. 18, № 1. - P. 103-111.

153. Premkumar P. et al. Association of serum antibodies with protection against rotavirus infection and disease in South Indian children / P. Premkumar, B. Lopman, S. Ramani, A. Paul, B. Gladstone, J. Muliyil, I. Mukhopadhya, U. Parashar, G. Kang // Vaccine. - 2014. - V. 32 Suppl 1. - P. 55-61.

154. Retallack D.M., Jin H., Chew L. Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system / D.M. Retallack, H. Jin, L. Chew // Protein Expression and Purification. - 2012. - V. 81, № 2. - P. 157-165.

155. Rivetti S. et al. Gene expression profile of human colon cancer cells treated with cross-reacting material 197, a diphtheria toxin non-toxic mutant / S. Rivetti, M. Lauriola, M. Voltattorni, M. Bianchini, D. Martini, C. Ceccarelli, A. Palmieri, G. Mattei, M. Franchi, G. Ugolini, G. Rosati, I. Montron, M. Taffurelli, R Solmi. // International Journal of Immunopathology and Pharmacology. - 2011. - V. 24, № 3. - P. 639-649.

156. Rodriguez W.J. et al. Clinical features of acute gastroenteritis associated with human reovirus-like agent in infants and young children / W.J. Rodriguez, H.W. Kim, J.O. Arrobio, C.D. Brandt, R.M. Chanock, A.Z. Kapikian, R.G. Wyatt, R.H. Parrott // The Journal of Pediatrics. - 1977. -V. 91, № 2. - P. 188-193.

157. Rongsen-Chandola T. et al. Effect of withholding breastfeeding on the immune response to a live oral rotavirus vaccine in North Indian infants / T. Rongsen-Chandola, T.A. Strand, N. Goyal, E. Flem, S.S. Rathore, A. Arya, B.A. Winje, R. Lazarus, E. Shanmugasundaram, S. Babji, H. Sommerfelt, K. Vainio, G. Kang, N. Bhandari // Vaccine. - 2014. - V. 32. - P. A134-A139.

158. Roy A., Yang J., Zhang Y. COFACTOR: an accurate comparative algorithm for structure-based protein function annotation/ A. Roy, J. Yang, Y. Zhang // Nucleic Acids Research. - 2012. - V. 40. - P. 471-477.

159. Ruuls S.R. et al. Novel human antibody therapeutics: the age of the Umabs / S.R. Ruuls, Lammerts J.J. van Bueren, J.G. van de Winkel, P.W. Parren // Biotechnology Journal. - 2008. - V. 3, № 9-10. - P. 1157-1171.

160. Saier M.H., Crasnier M. Inducer exclusion and the regulation of sugar / M.H. Saier, M. Crasnier // Research in Microbiology. - 1996. - V. 147, № 6-7. - P. 482-489.

161. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1977. -V. 74, № 12. - P. 5463-5467.

162. Sastri N.P., Crawford S.E., Estes M.K. Pleiotropic Properties of Rotavirus Nonstructrual Protein 4 (NSP4) and their Effects on Viral Replication and Pathogenesis in Viral Gastroenteritis: Molecular Epidemiology and Pathogenesis, 2016. - P. 145-174.

163. Schnagl R.D., Holmes I.H. Characteristics of the genome of human infantile enteritis virus (Rotavirus) / R.D. Schnagl, I.H. Holmes // Journal of Virology. - 1976. -V.19, № 1. - P. 267-270.

164. Schur P.H. IgG subclasses. A historical perspective / P.H. Schur // Monographs in Allergy. - 1988. - V. 23. - P. 1-11.

165. Sela M. From synthetic antigens to synthetic vaccines / M. Sela // Biopolymers. -1983. - № 22. - P. 415-424.

166. Sen A., Sen N., Mackow E.R. The formation of viroplasm-like structures by the rotavirus NSP5 protein is calcium regulated and directed by a C-terminal helical domain / A. Sen, N. Sen, E.R. Mackow // Journal of Virology. - 2007. - V. 81, № 21. - P. 11758-11767.

167. Shen J. et al. No direct correlation between rotavirus diarrhea and breast feeding: A meta-analysis / J. Shen, B.M. Zhang, S.G. Zhu, J.J. Chen // Pediatrics and Neonatology.

- 2018. - V. 2, № 53. - P. 129-135

168. Shinefield H.R. Overview of the development and current use of CRM(197) conjugate vaccines for pediatric use / H.R. Shinefield // Vaccine. - 2010. - V. 28, № 27.

- P. 4335-4339.

169. Shinnick T.M. et al. Synthetic peptide immunogens as vaccines / T.M. Shinnick, J.G. Sutcliffe, N. Green, R.A. Lerner // Annual Review of Microbiology. - 1983. - V. 37. - P. 425-446.

170. Siber G.R. et al. Correlation between serum IgG-2 concentrations and the antibody response to bacterial polysaccharide antigens / G.R. Siber, P.H. Schur, A.C. Aisenberg, S.A. Weitzman, G. Schiffman // The New England Journal of Medicine. -1980. - V. 303, № 4. - P. 178-182.

171. Sixt M. et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cellsin the T cell area of the lymph node / M. Sixt, N. Kanazawa, M. Selg, T. Samson, G. Roos, D.P. Reinhardt, R. Pabst, M.B. Lutz, L. Sorokin // Immunity. - 2005. - V. 1, № 22. - P. 19-29.

172. Soares-Weiser K. et al. Vaccines for preventing rotavirus diarrhoea: vaccines in use / K. Soares-Weiser, H. Maclehose, H. Bergman, I. Ben-Aharon, S. Nagpal, E. Goldberg, F. Pitan, N.Cunliffe // The Cochrane Database of Systematic Reviews. -2012. - V. 11. - P. CD008521.

173. Spilsberg B., Sandvig K., Wälchli S. Reconstitution of active diphtheria toxin based on a hexahistidine tagged version of the B-fragment produced to high yields in bacteria / B. Spilsberg, K. Sandvig, S. Wälchli // Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. - 2005. - V. 46, № 8. - P. 900-906.

174. Steel R.B., Torres-Medina A. Effects of environmental and dietary factors on human rotavirus infection in gnotobiotic piglets / R.B. Steel, A. Torres-Medina // Infection and Immunity. - 1984. - V. 43, № 3. - P. 906-911.

175. Stefan A. et al. Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli / A. Stefan, M. Conti, D. Rubboli, L.

Ravagli, E. Presta, A. Hochkoeppler // Journal of Biotechnology. - 2011. - V. 156, № 4.

- P. 245-252.

176. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures / F.W. Studier // Protein Expression and Purification. - 2005. - V. 41, № 1. - P. 207234.

177. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes / F.W. Studier, B.A. Moffatt // Journal of Molecular Biology. - 1986. - V. 189, № 1. - P. 113-130.

178. Szu S.C. Development of Vi conjugate - a new generation of typhoid vaccine / S.C. Szu // Expert Review of Vaccines. - 2013. - V. 12, № 11. - P. 1273-1286.

179. Troy S.B. et al. Comparison of the Immunogenicity of Various Booster Doses of Inactivated Polio Vaccine Delivered Intradermally Versus Intramuscularly to HIV-Infected Adults / S.B. Troy, D. Kouiavskaia, J. Siik, E. Kochba, H. Beydoun, O. Mirochnitchenko, Y. Levin, N. Khardori, K. Chumakov, Y. Maldonado // The Journal of Infectious Diseases. - 2015. - V. 211, № 12. - P. 1969-1976.

180. Uchida T., Pappenheimer A.M., Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin / T. Uchida, A.M. Pappenheimer, R. Greany // The Journal of Biological Chemistry. - 1973.

- V. 248, № 11. - P. 3838-3844.

181. Velazquez F.R. et al. Serum antibody as a marker of protection against natural rotavirus infection and disease / F.R.Velazquez, D.O. Matson, M.L. Guerrero, J. Shults, J.J. Calva, A.L. Morrow, R.I. Glass, L.K. Pickering, G.M. Ruiz-Palacios // The Journal of Infectious Diseases. - 2000. - V. 182, № 6. - P. 1602-1609.

182. Vesikari T. et al. Evaluation of the M37 human rotavirus vaccine in 2- to 6-month-old infants / T. Vesikari, T. Ruuska, H.P. Koivu, K.Y. Green, J. Flores, A.Z. Kapikian // The Pediatric Infectious Disease Journal. - 1991. - V. 10, № 12. - P. 912-917.

183. Wang Y. et al. Inactivated rotavirus vaccine induces protective immunity in gnotobiotic piglets / Y. Wang, M. Azevedo, L.J. Saif, J.R. Gentsch, R.I. Glass, B. Jiang // Vaccine. - 2010. - V. 28, № 33. - P. 5432-5436.

184. Wang Y. et al. Skin Vaccination against Rotavirus Using Microneedles: Proof of

Concept in Gnotobiotic Piglets / Y. Wang, A. Vlasova, D.E. Velasquez, L.J. Saif, S. Kandasamy, E. Kochba, Y. Levin, B. Jiang // PloS One. - 2016. - V. 11, № 11. - P. e0166038.

185. Ward R.L. Possible mechanisms of protection elicited by candidate rotavirus vaccines as determined with the adult mouse model / R.L. Ward // Viral Immunology. -2003. - V. 16, № 1. - P. 17-24.

186. Weimer E.T. et al. Immunization of young African green monkeys with OprF epitope 8-OprI-type A- and B-flagellin fusion proteins promotes the production of protective antibodies against nonmucoid Pseudomonas aeruginosa / E.T. Weimer, S.E. Ervin, D.J. Wozniak, S.B. Mizel // Vaccine. - 2009. - V. 27, № 48. - P. 6762-6769.

187. Westerman L.E. et al. Serum IgG mediates mucosal immunity against rotavirus infection / L.E. Westerman, H.M. McClure, B. Jiang, J.W. Almond, R.I. Glass // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2005. - V. 102, № 20. - P. 7268-7273.

188. WHO Acute intussusception in infants and children. Incidence, clinical presentation and management: a global perspective / WHO // Geneva: World Health Organization. Document. - 2002. - V.2, № 19. - P. 1-98.

189. WHO Rotavirus vaccines / WHO // WHO position paper. - 2013. - V. 88, № 5. - P. 49-64.

190. Wu G. et al. Structure of a ß-TrCP1-Skp1-ß-Catenin Complex / G. Wu, G. Xu, B.A. Schulman, P.D. Jeffrey, J.W. Harper, N.P. Pavletich // Molecular Cell. - 2003. - V. 11, № 6. - P. 1445-1456.

191. Yang J., Wang Y., Zhang Y. ResQ: An Approach to Unified Estimation of B-Factor and Residue-Specific Error in Protein Structure Prediction / J. Yang, Y. Wang, Y. Zhang // Journal of Molecular Biology. - 2016. - V. 428, № 4. - P. 693-701.

192. Yang J., Zhang Y. I-TASSER server: new development for protein structure and function predictions / J. Yang, Y. Zhang // Nucleic Acids Research. - 2015. - V. 43, № W1. - P. W174-181.

193. Yotsumoto F. et al. HB-EGF orchestrates the complex signals involved in triple-negative and trastuzumab-resistant breast cancer / F. Yotsumoto, E. Oki, E. Tokunaga,

Y. Maehara, M. Kuroki, S. Miyamoto // International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. - 2010. - V. 127, № 11. - P. 2707-2717.

194. Zhang H.-L. et al. A novel combined conjugate vaccine: enhanced immunogenicity of bFGF with CRM197 as a carrier protein / H.L. Zhang, C .Yuan, D.M. Zhang, H.S. Shi, M. Li, Z.C. Luo, Y. Wan, L. Lu, S.T. Luo, L. Yang // Molecular Medicine Reports. - 2011. - V. 4, № 5. - P. 857-863.

195. Zhang M. et al. A functional NSP4 enterotoxin peptide secreted from rotavirus-infected cells / M. Zhang, C.Q. Zeng, A.P. Morris, M.K. Estes // Journal of Virology. -2000. - V. 74, № 24. - P. 11663-11670.

196. Zhang Y. I-TASSER: fully automated protein structure prediction in CASP8 / Y. Zhang // Proteins. - 2009. - V. 77 Suppl 9. - P. 100-113.

197. Zhou J., Petracca R. Secretory expression of recombinant diphtheria toxin mutants in B. Subtilis / J. Zhou, R. Petracca // Journal of Tongji Medical University = Tong Ji Yi Ke Da Xue Xue Bao. - 1999. - V. 19, № 4. - P. 253-256.

198. Zijlstra R.T. et al. Protein-energy malnutrition delays small-intestinal recovery in neonatal pigs infected with rotavirus / R.T. Zijlstra, S.M. Donovan, J. Odle, H.B. Gelberg, B.W. Petschow, H.R. Gaskins // The Journal of Nutrition. - 1997. - V. 127, № 6. - P. 1118-1127.

199. Zijlstra R.T. et al. Malnutrition modified pig small intestinal inflammatory responses to rotavirus / R.T. Zijlstra, B.A. McCracken, J. Odle, S.M. Donovan, H.B. Gelberg, B.W. Petschow, F.A. Zuckermann, H.R. Gaskins // J. Nutr. - 1999. - V. 4, № 129. - P. 838-843.

200. Zissis G. et al. Protection studies in colostrum-deprived piglets of a bovine rotavirus vaccine candidate using human rotavirus strains for challenge / G. Zissis, J.P. Lambert, P. Marbehant, D. Marissens, M. Lobmann, P. Charlier, A .Delem, N. Zygraich // The Journal of Infectious Diseases. - 1983. -V. 148, № 6. - P. 1061-1068.

201. Пат. US6589529 (B1) Соединенные Штаты Америки, МПК A61K35/76; A61K38/00; A61K39/15; A61K39/39; A61P1/00; A61P1/04; A61P31/14; C07K14/14; C07K19/00; C12N1/15; C12N1/19; C12N1/21; C12N15/09; C12N15/46; C12N5/10; C12P21/02; A61K39/00; C12R1/19; (IPC1-7): A61K39/00; A61K39/12; A61K39/15.

Rotavirus subunit vaccine /CHOI ANTHONY (США); WARD RICHARD L (США), заявитель и патентообладатель CHILDRENS HOSP MEDICAL CENTER (США). -№ 19990429801 ;заявл.29.10.1999 ;опубл. 08.07.2003. - 37 с.

202. Пат. KR20120066559 ^)Корея, МПК A61K39/12; C12N15/46; C12N15/50; C12N15/63. TRANSFORMANTS EXPRESSING EPITOPE OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS AND ROTAVIRUS AND VACCINE COMPOSITION CONTAINING THE SAME / HWANG CHEOL HO (Корея), заявитель и патентообладатель UNIV DANKOOK IACF (Корея). -№20100127972 ;заявл. 14.12.2010; опубл. 22.06.2012. - 29 с.

203. Пат.^100625334 (B1) Корея, МПК C12N15/82.PLANT EXPRESSION VECTOR CONTAINING BCTV REPLICON /CHUNG IN SIK(Корея); KIM KYUNG ЩКорея); CHUNG HO YONG (Корея); KIM YU CHUNG(Корея); CHUNG HA YOUNG (Корея) ; SUNTER GARRY (США), заявитель и патентообладатель CHUNG IN SIK (Корея). -№20040061757 ;заявл.05.08.2004;опубл.09.02.2006. - 12 с.

204. Пат.Ш102643335 ^Китай, МПКC07K14/14; C12N15/46; C12N15/70. Recombinant rotavirus VP6 carrier protein and preparation thereof / YUANDING CHEN (Китай), заявитель и патентообладатель CHINESE ACAD MED SCIENCE (Китай). - №20121112598 ;заявл.17.04.2012;опубл. 22.08.2012. -19 с.

205. Пат. CN102643348 ^Китай, МПК C07K19/00; C12N15/70; C12R1/19. Recombinant chimeric protein carrying rotavirus antigen epitope and preparation thereof / YUANDING CHEN (Китай), заявитель и патентообладатель CHINESE ACAD MED SCIENCE (Китай). - №20121112596 ; заявл. 17.04.2012 ; опубл. 22.08.2012. - 44 с.

206. Пат. US6130082 (A) Соединенные Штаты Америки, МПКC07K14/02; C07K14/14; C07K14/24; C07K14/445; C12N1/21; A61K38/00; A61K39/00; (IPC1-7): A61K39/116; C12N1/21; C12N15/00; C12N15/62. Recombinant flagellin vaccines /MAJARIAN WILLIAM R (США); STOCKER BRUCE A D (США); NEWTON SALETE M C (США),заявитель и патентообладатель AMERICAN CYANAMID CO

(США); UNIV LELAND STANFORD JUNIOR (США). - №19920837668; заявл. 14.02.1992; опубл. 10.10.2000. - 40 с.

207. Пат. CA2698413 (A1) Канада, МПК A61K39/15; C07K14/14; C07K19/00. ROTAVIRUS VACCINE / ARCHAMBAULT DENIS (Канада); GIRARD AURELIE (Канада); ST-LOUIS MARIE-CLAUDE (Канада), заявитель и патентообладатель ARCHAMBAULT DENIS (Канада); GIRARD AURELIE (Канада); ST-LOUIS MARIE-CLAUDE (Канада). - № 20102698413 ; заявл. 06.04.2010 ; опубл. 06.10.2011. - 37 с.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

А485/525 значения абсорбции при длинах волн 485 и 525 нм.

а.о. аминокислотные остатки

БОЕ бляшкообразующие единицы

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ДДС-Ыа додецилсульфат натрия

едЭ единицы эндотоксина

ИЛ-1 интерлейкин-1

ИЛ-4 интерлейкин-4

ИЛ-5 интерлейкин-5

ИНФа интерферон а

ИПТГ изопропил-в-Б-1 -тиогалактопиранозид

ИФА иммуноферментный анализ

ЛД летальная доза

ЛПС липополисахариды

об./мин обороты в минуту

о.е. оптические единицы

ОП оптическая плотность

ПААГ полиакриламидный гель

ПАМП патоген-ассоциированные молекулярные паттерны

п.о. пары оснований

ПЦР полимеразная цепная реакция

ТМБ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

ТЦД50 тканевая цитопатическая доза

ЭПР эндоплазматический ретикулум

CRMs ENS

cross-reacting materials, «кросс-реактивные» формы дифтерийного токсина

enteric nervous system, нервная система кишечника

GRAVY grand average of hydropathicity

HB-EGF гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста

Ni-НТУ Ni-нитрилотриуксусная кислота

PEDV эпизоотическая диарея свиней

RV1 моновалентная проворотавирусная вакцина

RV5 пентовалентная проворотавирусная вакцина

TLR Toll-like receptor (Толл-подобный рецептор)

Нуклеотидная последовательность гена vp6vp8

catatggacgttctgttctctctgtctaaaaccctgaaagacgctcgtgacaaaatcgttgaaggtaccctgtactctaacgtttct

gacctgatccagcagttcaaccagatgatcatcaccatgaacggtaacgacttccagaccggtggtatcggtaacctgccgat

ccgtaactggaacttcgacttcggtctgctgggtaccaccctgctgaacctggacgctaactacgttgaaaccgctcgtaccac

catcgactacttcatcgacttcgttgacaacgtttgcatggacgaaatggctcgtgaatctcagcgtaacggtatcgctggcggt

ggctccggtggtggttctaccatcaacaacgacaactctaacgtttcttctgacgctgaattctacctgatcccgcagtctcagac

cgctatgtgcacccagtacatcaacaacggtctgccgccgatccagaacacccgtaacatcgttccggttaacatcacctctcg

tcagatcaaagacatccgttaactcgag

Нуклеотидная последовательность гена /Неурбурв

catatggctcaggttatcaacacgaactccctttctctgctgacccagaacaacctgaacaaatctcagtctgctctgggtaccg

ctatcgaacgtctgtcttctggtctgcgtatcaactctgctaaagacgacgctgctggtcaggctatcgctaaccgtttcaccgct

aacatcaaaggtctgacccaggcttctcgtaacgctaacgacggtatctctatcgctcagaccaccgaaggtgctctgaacga

aatcaacaacaacctgcagcgtgttcgtgaactggctgttcagtctgctaactctaccaactctcagtctgacctggactctatcc

aggctgaaatcacccagcgtctgaacgaaatcgaccgtgtttctggtcagacccagttcaacggtgttaaagttctggctcagg

acaacaccctgaccatccaggttggtgctaacgacggtgaaaccatcgacatcgacctgaaacagatcaactctcagaccctg

ggtctgggtggcggctctggtggtggttccggcggtggttctgctgctaccaccaccgaaaacccgctgcagaaaatcgacg

ctgctctggctcaggttgacaccctgcgttctgacctgggtgctgttcagaaccgtttcaactctgctatcaccaacctgggtaac

accgttaacaacctgacctctgctcgttctcgtatcgaagactctgactacgctaccgaagtttctaacatgtctcgtgctcagatc

ctgcagcaggctggtacctctgttctggctcaggctaaccaggttccgcagaacgttctgtctctgctgcgtggtggtggttctg

gcggcggctctgacgttctgttctctctgtctaaaaccctgaaagacgctcgtgacaaaatcgttgaaggtaccctgtactctaac

gtttctgacctgatccagcagttcaaccagatgatcatcaccatgaacggtaacgacttccagaccggtggtatcggtaacctg

ccgatccgtaactggaacttcgacttcggtctgctgggtaccaccctgctgaacctggacgctaactacgttgaaaccgctcgt

accaccatcgactacttcatcgacttcgttgacaacgtttgcatggacgaaatggctcgtgaatctcagcgtaacggtatcgctg

gcggtggctccggtggtggttctaccatcaacaacgacaactctaacgtttcttctgacgctgaattctacctgatcccgcagtct

cagaccgctatgtgcacccagtacatcaacaacggtctgccgccgatccagaacacccgtaacatcgttccggttaacatcac

ctctcgtcagatcaaagacatccgttaactcgag

Выравнивание нуклеотидной последовательности гена vp6vp8, полученной в результате секвенирования, относительно рассчитанной после оптимизации по кодонному составу для экспрессии в клетках E.coli

(референсной)

10 20 30 40 50 60 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardGGACCCCGGCAATACTTCTGCGACATCGTATAACGTACTGTTTCACATCACCACCTGAAT

70 80 90 100 110 120 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardGACTCTCTCGGGCGCTATTCATGCATACGCGAAAGTTTTGCGCATCGATGGTGTCGGGAT

130 140 150 160 170 180 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCAGTAGTAGTTGAGGCCG

190 200 210 220 230 240 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCG

250 260 270 280 290 300 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGA

310 320 330 340 350 360 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCG

370 380 390 400 410 420 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAAT

430 440 450 460 470 480 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT

490 500 510 520 530 540 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------------------------------------------

ForwardTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGC

550 560 570 580 590 600 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)------------------------CATATGGACGTTCTGTTCTCTCTGTCTAAAACCCTG

ForwardAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGC....................................

610 620 630 640 650 660 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)AAAGACGCTCGTGACAAAATCGTTGAAGGTACCCTGTACTCTAACGTTTCTGACCTGATC Forward............................................................

670 680 690 700 710 720 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)CAGCAGTTCAACCAGATGATCATCACCATGAACGGTAACGACTTCCAGACCGGTGGTATC Forward............................................................

730 740 750 760 770 780 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)GGTAACCTGCCGATCCGTAACTGGAACTTCGACTTCGGTCTGCTGGGTACCACCCTGCTG Forward............................................................

790 800 810 820 830 840

----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)AACCTGGACGCTAACTACGTTGAAACCGCTCGTACCACCATCGACTACTTCATCGACTTC Forward............................................................

850 860 870 880 890 900 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)GTTGACAACGTTTGCATGGACGAAATGGCTCGTGAATCTCAGCGTAACGGTATCGCTGGC Forward............................................................

910 920 930 940 950 960 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)GGTGGCTCCGGTGGTGGTTCTACCATCAACAACGACAACTCTAACGTTTCTTCTGACGCT Forward............................................................

970 980 990 1000 1010 1020 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)GAATTCTACCTGATCCCGCAGTCTCAGACCGCTATGTGCACCCAGTACATCAACAACGGT Forward............................................................

1030 1040 1050 1060 1070 1080 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)CTGCCGCCGATCCAGAACACCCGTAACATCGTTCCGGTTAACATCACCTCTCGTCAGATC Forward............................................................

1090 1100 1110 1120 1130 1140 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)AAAGACATCCGTTAACTCGAG---------------------------------------

Forward.....................CACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAA

1150 1160 ----|----|----|----|----|

VP6VP8 (Ref.)-------------------------

ForwardGCCCGAAAGAAGCTAGGAAGCCGGG

Точками отмечены нуклеотиды, совпадающие с референсной нуклеотидной

последовательностью.

Выравнивание нуклеотидной последовательности гена flicvp6vp8, полученной в результате секвенирования,относительно рассчитанной после оптимизации по кодонному составу для экспрессии в клетках E.coli

(референсной)

10 20 30 40 50

FliCVP6VP8 (ге^)--------------------------------------------------

ForwardCCGAGTTGAGCGGAACATTCCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAG Reverse--------------------------------------------------

60 70 80 90 100

FliCVP6VP8 (ге^)--------------------------------------------------

ForwardAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCG Reverse--------------------------------------------------

110 120 130 140 150

FliCVP6VP8 (ге^)--------------------------GCTCAGGTTATCAACACGAACTCC

ForwardGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATG........................

Reverse--------------------------------------------------

160 170 180 190 200

FliCVP6VP8 (ref.)CTTTCTCTGCTGACCCAGAACAACCTGAACAAATCTCAGTCTGCTCTGGG

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

210 220 230 240 250

FliCVP6VP8 (ref.)TACCGCTATCGAACGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACTCTGCTAAAG

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

260 270 280 290 300

FliCVP6VP8 (ref.)ACGACGCTGCTGGTCAGGCTATCGCTAACCGTTTCACCGCTAACATCAAA

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

310 320 330 340 350

FliCVP6VP8 (ref.)GGTCTGACCCAGGCTTCTCGTAACGCTAACGACGGTATCTCTATCGCTCA

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

360 370 380 390 400

FliCVP6VP8 (ref.)GACCACCGAAGGTGCTCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTTC

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

410 420 430 440 450

FliCVP6VP8 (ref.)GTGAACTGGCTGTTCAGTCTGCTAACTCTACCAACTCTCAGTCTGACCTG

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

460 470 480 490 500

FliCVP6VP8 (ref.)GACTCTATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGTCTGAACGAAATCGACCGTGT

Forward..................................................

Reverse--------------------------------------------------

510 520 530 540 550

FliCVP6VP8 (ref.)TTCTGGTCAGACCCAGTTCAACGGTGTTAAAGTTCTGGCTCAGGACAACA