Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Пучко, Елена Николаевна

• Пучко, Елена Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пучко, Елена Николаевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Использование трансгенных растений в качестве продуцентов антител, вакцин и терапевтически ценных белков.

1.1.1. Синтез биофармацевтических белков в трансгенных растениях.

1.1.2. Производство антител с помощью трансгенных растений

1.1.3. Вакцины на основе трансгенных растений.

1.2. Синтез гена поверхностного антигена вируса гепатита В в различных растительных системах.

1.2.1. Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты.

1.2.2. Вакцины против гепатита В на основе растений.

1.2.3. Выбор растительных систем экспрессии и методов трансформации.

1.2.4. Оптимизация экспрессии HBsAg в рекомбинантных растительных системах.

1.2.5. Структурная характеристика НВзА£, синтезированного в трансгенных растениях.

1.2.6. Исследования иммуногенности НВэАд, синтезируемого трансгенными растениями.

1.3. Повышение биологической безопасности трансгенных растений.

1.3.1 .Получение безмаркерных трансгенных растений.

1.3.1.1. Использование трансформации растений без селективных маркеров устойчивости.

1.3.1.2. Метод котрансформации.

1.3.1.3. Сайт-специфическая рекомбинация.

1.3.1.4. Метод получения безмаркерных растений с использованием транспозонов.

1.3.1.5. Использование векторной системы МАТ для получения безмаркерных растений.

1.3.1.6.Удаление маркерных генов из хлоропластов растений.

1.4.3аключение.

2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Штаммы бактерий и плазмиды.

2.3. Микр обиологические среды.

2.4. Среды для культивирования растений.

2.5. Растворы и буферы.

2.6. Ферменты, использованные в работе.

2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК.

2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений.

2.9. Введение метки в ДНК.

2.10. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах.

2.11. Гибридизация на фильтрах по Саузерну.

2.12. Трансформация листовых эксплантов табака.

2.13. Трансформация семян табака и томата с помощью вакуумной инфильтрации.

2.14. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР-анализа.

2.15. Электрофорез в агарозном геле.

2.16. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений.

2.17. Выделение белка из тканей растений.

2.18. Определение белка в растительных экстрактах.

2.19. Иммуноферментный анализ

2.20. Оральная иммунизация мышей клубнями трансгенного картофеля.

2.21. Измерение количества антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных мышей.

3. Результаты и обсуждение.

3.1.Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген HBsAg под контролем комбинированных агробактериальных промоторов.

3.2.0птимизация экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях.

3.3. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном

HBsAg.

3.4. Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растений»

В настоящее время для производства гетерологичных белков используют бактерии, грибы, клеточные культуры насекомых и млекопитающих, трансгенные животные и растения. Во многих системах уровень экспрессии эукариотических белков нативной структуры ограничен неспособностью к формированию дисульфидных связей, а также отсутствием у прокариотических организмов энзиматических систем постсинтетической модификации. Другой причиной, лимитирующей использование многих систем экспрессии, является высокая стоимость производства из-за использования трудоемких методов выращивания, многокомпонентных стерильных питательных сред. При использовании культур клеток млекопитающих или трансгенных животных возможно присутствие в конечном белковом продукте патогенных вирусов и прионов.

В связи с вышесказанным, трансгенные растения имеют большой технологический потенциал для высокоэффективного производства безопасных гетерологичных белков в промышленном масштабе. Растения обладают рядом важных преимуществ, поскольку наращивание растительной биомассы при применении разработанных агротехнических приемов является достаточно простым и недорогим процессом, требующим небольших энергетических затрат. Кроме того, растительные объекты обладают необходимыми механизмами энзиматической постсинтетической модификации эукариотических белков. При использовании растений в качестве продуцентов отсутствует вероятность их заражения патогенными вирусами млекопитающих. Получение трансгенных растений с тканеспецифической экспрессией позволяет упростить процесс выделения и очистки белков, либо вовсе его исключить при синтезе рекомбинантных белков в составе съедобных вакцинных препаратов.

Несмотря на существование рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний, многие из них, например, гепатит В, до сих пор 7 является причиной стойкой виремии у людей. В мире насчитывается около 350 миллионов хронических носителей вируса гепатита В, что составляет 5% от общей численности населения Земли. От 75 до 100 миллионов из них погибают от цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциономы (Sunil Kumar et al., 2007). Рекомбинантные вакцины против гепатита В на основе дрожжей-продуцентов дорогостоящи, что ограничивает их применение в массовых программах иммунизации в развивающихся странах. Вакцины на основе растений могут стать экономически выгодной альтернативой. В 1992 году Мэйсон с соавторами впервые создали трансгенные растения табака, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg, HBs-антиген) (Mason et al., 1992). Показано, что HBs-антиген подвергается необходимому гликозилированию в растениях, собирается в вирусоподобные частицы и сохраняет иммуногенные свойства. Однако коммерческие вакцины против вируса гепатита В на основе трансгенных растений до сих пор не созданы.

Для создания коммерческих растительных вакцинных препаратов против гепатита В необходимо увеличение уровня экспрессии HBs-антигена, а также получение растений, не содержащих селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам с целью повышения биологической безопасности растений-продуцентов.

Цель данной работы — создать био безопасные трансгенные растения, синтезирующие поверхностный антиген вируса гепатита В в количестве, достаточном для проведения доклинических испытаний, и исследовать иммуногенность полученных растений-продуцентов в экспериментах на лабораторных животных.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Получить трансгенные растения, содержащие ген HBsAg под контролем различных промоторов.

2. Повысить уровень синтеза НВз-антигена в трансгенных растениях.

3. Создать биобезопасные безмаркерные растения, синтезирующие НВв-антиген.

4. Провести анализ иммуногенности на лабораторных мышах съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пучко, Елена Николаевна

выводы

1. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (НВбА£) под контролем различных промоторов.

2. Показана тканеспецифическая экспрессия НВз-антигена под контролем комбинированных агробактериальных промоторов генов маннопин- и октопинсинтазы в корнях и культуре тканей растений.

3. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем промотора СаМУ 35Б с четырьмя энхансерами. Количество НВв-антигена достигало 0,1% от общего растворимого белка клеток растений.

4. С целью повышения биобезопасности вакцины против гепатита В созданы безмаркерные растения, синтезирующие НВв-антиген.

5. Проведен анализ иммуногенности съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений картофеля. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации.

6. Полученные данные показывают перспективность использования безмаркерных трансгенных растений в качестве эффективной субстанции для производства съедобной вакцины против гепатита В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние годы в растениях синтезировано множество ценных белков - белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ (Mason а. Arntzen, 1995). Интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу. При этом отпадает потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима для создания вакцин с парентеральным способом введения (Walmsley a. Amtzen, 2000). Антигены, экспрессируемые в растениях при прохождении пищеварительного тракта и могут быть доставлены к клеткам слизистой оболочки, ответственным за мукозную систему иммунитета.

Синтезированный в растениях поверхностный антиген вируса гепатита В по своим физико-химическим и иммунологическим свойствам не отличается от антигена, полученного из клеток дрожжей и при введении в организм стимулирует образование специфичных антител (Thanavala et al., 1995). Поскольку HBs-антиген собирается в растительных клетках в мультимерные частицы, которые накапливаются внутри мембранных везикул, то такая естественная "биоинкапсуляция" в растительной клетке защищает антиген от агрессивного воздействия в пищеварительном тракте до тех пор, пока он не вступит в контакт с эффекторами иммунной системы на слизистой поверхности кишечника (Kong et al., 2001).

Результаты данной работы подтвердили возможность использования трансгенных растений в качестве продуцентов вакцины против гепатита В, в том числе и съедобной.

Нами получены трансгенные растения, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Для осуществления тканеспецифической экспрессии НВз-антигена сконструированы плазмиды, содержащие ген HBsAg под контролем модифицированных промоторов генов маннопин- и октопинсинтазы агробактерий (Аос8)ЗАшаБРша8. Наибольшее содержание НВэ-антигена обнаружено в корнях растений, что подтверждает тканеспецифичность используемых промоторов. На основе нескольких линий растений получены культуры «косматых» корней и каллусные культуры с уровнем синтезированного НВБ-антигена до 0,01% от общего растворимого белка.

Увеличить синтез НВв-антигена в трансгенных растениях удалось, используя промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты СаМУ 358 с четырьмя энхансерами. Количество ИВБ-антигена в полученных растениях достигало 0,1% от общего растворимого белка клеток растений, что является уровнем, достаточным для проведения доклинических испытаний.

С целью повышения биобезопасности трансгенных растений нами получена векторная конструкция рВМ-А§, не содержащая селективного гена устойчивости к канамицину. Разработан метод отбора регенерантов трансгенных растений, основанный на использовании иммуноферментного анализа. В результате получены безмаркерные растения табака и томата. Показан стабильный синтез НВБ-антигена в растениях поколения

Проведены длительные испытания иммуногенности съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений картофеля. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации. До настоящего времени не существовало данных о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой продолжительности при использовании

87 трансгенных растений в качестве съедобной вакцины.

Полученные данные подтверждают перспективность использования безмаркерных трансгенных растений в качестве эффективной субстанции для производства съедобной вакцины против гепатита В.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пучко, Елена Николаевна, 2011 год

1. Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита: Практическое руководство. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 432 с.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480 с.

3. Михайлов М.И. В третье тысячелетие без гепатитов // Медицина для всех. 1999. №2. С. 1-3.

4. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. 2000. 592 с.

5. Ростовцева Л.И., Андронова Т.М., Малькова В.П., Сорокина И.Б., Иванов В.Т. Синтез и противоопухолевое действие гликопептидов, содержащих N-ацетилглюкозаминил-(р1—>4)-1^-ацетилмурамил-дисахаридное звено // Биоорганическая химия. 1981. Т. 7. С. 1843-1858.

6. Рукавцова Е.Б., Абрамихина Т.В., Шульга Н.Я. и др. Тканеспецифическая экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках трансгенных растений и культуры тканей // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 864-869.

7. Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Золова О.Э. и др. Комбинированное использование регулируемых промоторов и прививок в генноинженерной биотехнологии растений // Биотехнология. 1996. № 9. С. 24-28.

8. Ю.Рукавцова Е.Б., Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н., Бурьянов Я.И. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2009а. Т. 45. С. 1055-1060.

9. П.Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева С.В. и др. Получение безмаркерных трансгенных растений // Доклады РАИ. 20096. Т. 426. С. 261264.

10. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я. и др. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В //Генетика. 2003. Т. 39. С. 51-56.

11. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А. и др. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1422-1430.

12. Эмонд Р., Роуланд X., Уэлсби Ф. Инфекционные болезни. М.: Практика. 1998. 439 с.

13. Agraz A., Duarte С.A., Costa L., Fontirrochi G. Immunoaffinity purification of recombinant hepatitis В surface antigen from yeast using a monoclonal antibody // J. Chromatogr. A. 1994. V. 672. P. 25-33.

14. Almquist K.C., McLean M.D., Niu Y. et al. Expression of an anti-botulinum toxin 1 A neutralizing single-chain Fv recombinant antibody in transgenic tobacco // Vaccine. 2006. V. 24. P. 2079-2086.

15. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Crisantes J.D. et al. Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice // Vaccine. 2006. V. 24. P. 2477-2490.

16. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Topal E., Cardineau G.A. P19-dependent and P19-independent reversion of Fl-V gene silencing in tomato // Plant Mol. Biol. 2008. V. 68. P. 61-79.

17. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors // Plant Molecular Biology Manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. A3. P. 1-19.

18. Arakawa T., Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 292-297.

19. Arakawa T., Chong D.K.X., Lawrence M., Langridge W.H.R. Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.

20. Araki H., Jearnpipatkul A., Tatsumi H. et al. Molecular and functional organization of yeast plasmid pSRl // J. Mol. Biol. 1985. V. 182. P. 191-203.

21. Arntzen C.J., Mahoney R.T. Plant-derived vaccines: a new approach to international public health // J. Food Sci. 2004. V. 69. P. 8-15.

22. Barta A., Sommergruber K., Thompson D. et al. The expression of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant Mol. Biol. 1986. V. 6. P. 347-357.

23. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513.

24. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

25. Brown J.L., Carman W.F., Thomas H.C. The hepatitis B virus // Clin. Gastroenterol. 1990. V. 4. P. 721-746.

26. Castañón S., Marin M.S., Martín-Alonso J.M. et al. Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus // J. Virol. 1999. V. 73. P. 4452-4455.

27. Cheon B.Y., Kim H.J., Oh K.H. et al. Overexpression of human erythropoietin (EPO) affects plant morphologies: retarded vegetative growth in tobacco and male sterility in tobacco and Arabidopsis II Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 541-549.

28. Chikwamba R.K., Scott M.P., Mejia L.B. et al. Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11127-11132.

29. Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 71-78.

30. Crawley M.J., Hails R.S., Rees M., Kohn D., Buxton J. Ecology of transgenic oilseed rape in natural habitats //Nature. 1993. V. 363. P. 620-623.

31. Dale E.C., Ow D.W. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10558-10562.

32. Dale P.J. Spread of engineered genes to wild relatives // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 30-32.

33. Daley M., Knauf V.C., Summerfelt K.R., Turner J.C. Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants // Plant Cell Rep. 1998. V. 17. P. 489496.

34. Daniell H., Lee S.B., Panchal T., Weibe P.O. Expression of native cholera toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts //J. Mol. Biol. 2001a. V. 311. P. 1001-1009.

35. Daniell H., Mathukumar B., Lee S. B. Marker free transgenic plants: engineering the chloroplast genome with the use of antibiotic selection // Curr. Genet. 2001b. V. 39. P. 109-116.

36. Daniell H., Singh N., Mason H., Streatfield S. Plant-made vaccine antigens and biopharmaceuticals // Trends Plant Sci. 2009. V. 14. P. 669-679.

37. Depicker A., Herman L., Jacobs A., Schell J., Van Montagu M. Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the

38. Agrobacterium plant cell interaction I I Mol. Gen. Genet. 1985. V. 201. P. 477484.

39. De Rocher E.J., Vargo-Gogola T.C., Diehn S.H., Green P.J. Direct evidence for rapid degradation of Bacillus thuringiensis toxin mRNA as a cause of poor expression in plants // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 1445-1461.

40. De Vetten N., Wolters A. M.5 Raemakers K. et al. A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 439-442.

41. DeWilde C., Peeters K., Jacobs A., Peck I., Depicker A. Expression of antibodies and Fab fragments in transgenic potato plants: a case study for bulk production in crop plants //Mol. Breed. 2002. V. 9. P. 271-282.

42. De Zoeten G.A., Penswick J.R., Horisberger M.A. et al. The expression, localization, and effect of a human interferon in plants // Virology. 1994. V. 172. P. 213-222.

43. Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco//Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.

44. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. 1987. V.19. P. 11-15.

45. Draper J., Scott R., Hamil J. Transformation of dicotyledonous plant cells using the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens and the Ri plasmid of A. rhizogenes II Plant Genetic Transformation and Gene Expression. 1988. P. 69-160.

46. Ebinuma H., Komamine A. MAT (Multi-Auto-Transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants // In Vitro Cell. Dev. Biol. 2001. V. 37. P. 103-113.

47. Edwards K., Johnstone C., Thomson C.A. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

48. Ehsani P., Khabiri A., Domansky N.N. Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato // Gene. 1997. V. 190. P. 107-111.

49. Etchberger J.F., Hobert O. Vector-free DNA constructs improve transgene expression in C. elegans //Nat. Methods. 2008. V. 5. P. 3.

50. Ewen S.W., Pusztai A. Effects of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus nivalis lectin on rat small intestine // Lancet. 1999. V. 354. P. 1726-1727.

51. Fernandez-San Millan A., Mingo-Castel A., Miller M., Daniell H. A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation // Plant Biotechnol. 2003. V. l.P. 77-79.

52. Fiedler U., Phillips J., Artsaenko O., Conrad U. Optimization of scFv antibody production in transgenic plants // Immunotechnology. 1997. V. 3. P. 205-216.

53. Fischer R., Schumann D., Zimmermann S. et al. Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants // Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. P. 810-816.

54. Freytag L.C., Clements J.D. Mucosal adjuvants // Vaccine. 2004. V. 23. P. 18041813.

55. Frisch D.A., Harris-Haller L.W., Yokubaitis N.T. et al. Complete sequence of the binary vector Bin 19 //PlantMol. Biol. 1995. V. 27. P. 405-409.

56. Galeffi P., Lombardi A., Pietraforte I. et al. Functional expression of a single-chain antibody to ErbB-2 in plants and cell-free systems // J. Translational Medicine. 2006. V. 4. P. 1-13.

57. Gallie D.R., Kado C.I. A translational enhancer derived from tobacco mosaic virus is functionally equivalent to a Shine-Dalgarno sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 129-132.

58. Gao Y., Ma Y., Li M. et al. Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg // World J. Gastroenterol. 2003. V. 9. P. 996-1002.

59. Gelvin S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 16-37.

60. Gomez N., Carillo C., Salinas J. et al. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants // Virology. 1998. V. 249. P. 352-358.

61. Guy B. The perfect mix: recent progress in adjuvant research // Nat. Rev. Microbiol. 2007. V. 5. P. 505-517.

62. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

63. Hernould M., Suharsono S., Litvak S., Araya A., Mouras A. Male-sterility induction in transgenic tobacco plants with an unedited atp9 mitochondrial gene from wheat//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2370-2374.

64. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

65. Hobbs S.L., Warkentin T.D., DeLong C.M. Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 17-26.

66. Hoekema A., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. Transfer of octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumour- or root-inducing plasmids: generality of virulence systems // J. Bacteriol. 1984. V. 158. P. 383-385.

67. Hoess R.H., Abremski K. Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre-lox site-specific recombination system // J. Mol. Biol. 1985 V. 181. P. 351-362.

68. Holger P. Marker-free transgenic plants // Plant Cell, Tissue a. Organ Culture. 2003. V. 74. P. 123-134.

69. Kang T.J., Loc N.H., Jang M.O. et al. Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization // Transgenic Res. 2003. V. 12. P. 683-691.

70. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.

71. Khoudi H., Laberge S., Ferullo J.-M. et al. Production of diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants // Biotechnol. Bioengin. 1999. V. 64. P. 135143.

72. Ko K., Tekoah Y., Rudd P.M. et al. Function and glycosylation of plant-derived antiviral monoclonal antibody // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 8013-8018.

73. Komari T., Hiei Y., Saito Y. et al. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers // Plant J. 1996. V. 10. P. 165-174.

74. Koncz C., Martini N., Szabados L. et al. Specialized vectors for gene tagging and expression studies // Plant Mol. Biol. Manual. / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1994. B. 2. P. 1-22.

75. Koncz C., Shell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector//Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

76. Kong Q., Richter L. Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. V. 98. P. 11539-11544.

77. Lacks S., Greenberg B. Complementary specificity of restriction endonucleases of Diplococcus pneumoniae with respect to DNA methylation // J. Mol. Biol. 1977. V. 114. P. 153-168.

78. Langridge W.H.R., Fitzgerald K.J., Koncz C., Schell J., Szalay A.A. Dual promoter of Agrobacterium tnmefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormones //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P. 3219-3223.

79. Larrick J.W., Yu L., Naftzger C. et al. Production of secretory IgA antibodies in plants // Biomol. Eng. 2001. V. 18. P. 87-94.

80. Lau J.M., Korban S.S. Analysis and stability of the respiratory syncytial virus antigen in a T3 generation of transgenic tomato plants // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2009. V. 96. P. 335-342.

81. Lau JM, Korban SS. Transgenic apple expressing an antigenic protein of the human respiratory syncytial virus // J. Plant Physiol. 2010. V. 167. 920-927.

82. Lee J.S., Choi S.J., Kang H.S. et al. Establishment of a transgenic tobacco cellsuspension culture system for producing murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor // Mol. Cell. 1997. V. 7. P. 783-787.

83. Leite A., Kemper E.L., da Silva M.J. et al. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 47-53.

84. Liu Y.L., Wang J.F., Qiu B.S. et al. Expression of human hepatitis B virus surface antigen gene in transgenic tobacco // Sci. China (Series B). 1994. V. 37. P. 37-41.

85. Lodish H., Berk A., Zipursky L.S. et al. Molecular Cell Biology. N.Y.: W.F. Freeman. 2000. 294 pp.

86. Lutz K.A., Bosacchi M.H., Maliga P. Plastid marker-gene excision by transiently expressed CRE recombinase //Plant J. 2006. V. 45. P. 447-456.

87. Ma J.K.C., Hiatt A., Hain M. et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants // Science. 1995. V. 268. P. 716-719.

88. Ma J.K.C., Hikmat B.Y., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 601-606.

89. Magnuson N.S., Linzmaier P.M., Reeves R. et al. Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture // Protein Exp. Purif. 1998. V. 13. P. 43-52

90. Maliga P. Progress towards commercialization of plastid transformation technology // Trends Biotechnol. 2003. V. 21. P. 20-28.

91. Mason H.S., Arntzen C.J. Transgenic plants as vaccine production systems // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P. 388-392.

92. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 5335-5340.

93. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against E. coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene// Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

94. Mason H.S., Lam D.M.-K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1174511749.

95. Masterson R.V., Furtek D.B., Grevelding C., Schell J. A maize Ds transposable element containing a dihydrofolate reductase gene transposes in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana //Mol. Gen. Genet. 1989. V. 219. P. 461-466.

96. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 1163-1172.

97. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Mittelsten-Scheid O. Inactivation of repeated genes: DNA-DNA interaction? // Homologous Recombination in Plants. / Ed. Paszkowski J. Amsterdam: Kluwer Acad. Publ. 1994. P. 271-307.

98. Michel M.L. Towards immunotherapy for chronic hepatitis B virus infections // Vaccine. 2002. V. 20. P. 83-88.

99. McCormick A.A., Kumagai M.H., Hanley K. et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor derived single chain Fv epitopes in tobacco plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 703708.

100. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotechnology. 1995. V. 13. P. 14841487.

101. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

102. Murray C., Sutherland P.W., Phung M.M. et al. Expression of biotin-binding proteins, avidin and streptavidin, in plant tissues using plant vacuolar targeting sequences // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 199-214.

103. Murray K. A molecular biologist's view of viral hepatitis // Proc. R. Soc. London. 1987. V. 230. P. 107-146.

104. Ni M., Cui D., Einstein J., Narasimhulu S., Vergara C.E., Gelvin S.B. Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopine and mannopine synthase genes // Plant J. 1995. V. 7. P. 661-676.

105. Nykiforuk C.L., Boothe J.G., Murray E.W. et al. Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds // Plant Biotechnol. J. 2006. V. 4. P. 77-85.

106. Ohya K., Matsumura T., Ohashi K. et al. Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato plants // J. Interferon Cytokine Res. 2001. V. 21. P. 595-602.

107. Ow D.W. GM maize from site-specific recombination technology, what next? // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. P. 115-120.

108. Panahi M., Cheng X., Alii Z. et al. Plant-derived human insulin-like growth factor precursor prohormone IGF-IB caused differentiation of human neuroblastoma cell lines SH-SY5Y //Mol. Breed. 2003. V. 12. P. 21-31.

109. Parmenter D.L., Boothe J.G., van Rooijen G.J.H. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 1167-1180.

110. Patzer E.J., Nakamura G.R., Simonsen C.C., Levinson A.D., Brands R. Intracellular assembly and packaging of hepatitis B surface antigen particles occur in the endoplasmic reticulum // J. Virol. 1986. V. 58. P. 884-892.

111. Peterson D.L. Paul D.A. Lam J. Tribby I. Achord D.T. Antigenic structure of hepatitis B surface antigen: identification of "d" subtype determinant by chemical modification and use of monoclonal antibodies // J. Immunol. 1984. V. 132 P. 920-927.

112. Pniewski T., Kapusta J., Plucienniczak A. Agrobacterium-mediated transformation of yellow lupin to generate callus tissue producing HBV surface antigen in a long-term culture II J. Appl. Genet. 2006. V. 47. P. 309-318.

113. Qin M., Bayley C., Stockton T., Ow D.W. Cre recombinase-mediated site-specific recombination between plant chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 1706-1710.

114. Ranee I., Norre F., Gruber V., Theisen M. Combination of viral promoter sequences to generate highly active promoters for heterologous therapeutic protein over-expression in plants // Plant Sci. 2002.V. 162. P. 833-842.

115. Revenkova E.Y., Kraev A.S., Skryabin K.G. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542 // Plant Biotechnology and Molecular Biology / Ed. Skiyabin K.G. Moscow. 1993. P. 67-76.

116. Richter L., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

117. Rigano M.M., Alvarez M.L., Pinkhasov J. et al. Production of a fusion protein consisting of the enterotoxigenic Escherichia coli heat-labile toxin B subunit and a tuberculosis antigen in Arabidopsis thaliana II Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 502-508.

118. Rigano M.M., Dreitz S., Kipnis A.-P. et al. Oral immunogenicity of a plant-made, subunit, tuberculosis vaccine //Vaccine. 2006. V. 24. P. 691-695.

119. Rigano M.M., Walmsley A.M. Expression systems and developments in plant-made vaccines // Immunology and cell biology. 2005. V. 83. P. 271-277.

120. Rommens C.M., Humara J.M., Ye J. et al. Crop improvement through modification of the plant's own genome // Plant Physiol. 2004. V.135. P. 421-431.

121. Rose A.B. The effect of intron location on intron-mediated enhancement of gene expression in Arabidopsis II Plant J. 2004. V. 40. P. 744-751.

122. Ruf S., Hermann M., Berger I.J., Carrer H., Bock R. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of foreign protein in fruit // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 870-875.

123. Santi L., Giritch A., Roy C.J. et al. Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens produced by a rapid and highly scalable plant expression system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 861-866.

124. Sawahel W.A. The production of transgenic potato plants expressing human ainterferon using lipofectin-mediated transformation // Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. P. 19-29.

125. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silkelastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation // Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 51-57.

126. Scutt C.P., Zubko E., Meyer P. Techniques for the removal of marker genes from transgenic plants // Biochimie. 2002. V. 20. P.383-392

127. Sekar V. A rapid screening procedure for the identification of recombinant bacterial clones // BioTechniques. 1987. V. 5. P. 11-13.

128. Semenyuk E.G., Stremovskiy O.A., Edelweiss E.F. et al. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants // Biochimie. 2007. V. 89. P. 31-38.

129. Sidorov V.A., Kasten D., Pang S.-Z. et al. Stable chloroplast transformation in potato: use of green fluorescent protein as plastid marker // Plant J. 1999.V. 19. P.209-216.

130. Smith M.L. Mason H.S., Shuler M.L. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: kinetics of antigen accumulation in bath culture and its intracellular form //Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 812-822.

131. Smith M.L. Richter L., Arntzen C.J., Shuler M.L., Mason H.S. Structural characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral immunization studies // Vaccines. 2003. V. 21. P. 4011-4021.

132. Sojikul P., Buehner N. Mason H.S. A plant signal peptide-hepatitis B surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 2209-2214.

133. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

134. Staub J.M., Garcia B., Graves J. et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts //Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 333338.

135. Sternberg N., Hamilton D. Bacteriophage PI site-specific recombination between loxP sites // J. Mol. Biol. 1981. V. 150. P. 467-486.

136. Stibbe W., Gerlich W.H. Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis B surface antigen// J. Virol. 1983. V. 46. P. 626-629.

137. Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 583-590.

138. Streatfield S.J. Oral hepatitis B vaccines candidates produced and delivered in plant material // Immunol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 219-226.

139. Streatfield S.J., Jilka J.M., Hood E.E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine. 2001. V. 21. P. 2742-2748.

140. Streatfield S.J., Lane J.R., Brooks C.A. et al. Corn as a production system for human and animal vaccines // Vaccine. 2003. V. 21. P. 812-815.

141. Strizhov N., Keller M., Mathur J. et al. A synthetic crylC gene, encoding a Bacillus thuringiensis 8-endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 15012-15017.

142. Sugita K., Kasahara T., Matsunaga E., Ebinuma H.A. Transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency // Plant J. 2000. V. 22. P. 461-469.

143. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Production of hepatitis B surface antigen in recombinant plant systems: an update // Biotechnol. Prog. 2007. V. 23. P. 532-539.

144. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J., Prasad K.S.N., Bapat V.A. Expression of hepatitis B surface antigen B in tobacco cell suspension cultures // Protein Expr. Purif. 2003. V. 32. P. 10-17.

145. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J., Srinivas L., Bapat V.A. Expression of hepatitis B surface antigen B in transgenic banana plants // Planta. 2005. V. 222. P. 484-493.

146. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Srinivas L. et al. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots // Plant Sci. 2006a. V. 170. P. 918-925.

147. Sunil Kumar G.B., Srinivas L., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Hepatitis B surface antigen expression in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants using for different expression cassettes // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2006b. V.84. P. 315-323.

148. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. 2000 V. 182. P. 302-305.

149. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 607-609.

150. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes. Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype // Cell. 1984. V. 37. P. 959-967.

151. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 3378-3382.

152. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P., Mason H.S., Arntzen C J. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

153. Tiollais P., Cameron P., Briggs M. Virus like particles in serum of patients with Australia antigen associated hepatitis // Lancet. 1970. V. 1. P. 695-698.

154. Tiollais P., Pourcel C., Dejean A. The hepatitis B virus // Nature. 1985. V. 317. P. 489-495.

155. Torres E., Vaquero C., Nicholson L. et al. Rice cell culture as an alternative production system for functional diagnostic and therapeutic antibodies // Transgenic Res. 1999. V. 8. P. 441-449.

156. Tregoning J.S., Nixon P., Kuroda H. et al. Expression of tetanus toxin fragment C in tobacco chloroplasts // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1174-1179.

157. Trieu-Cuot P., Courvalin P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5'-aminoglycoside phosphotransferase type III // Gene. 1983. V. 23. P. 331-334.

158. Tuboly T., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

159. Van Aarssen R., Soetaert P., Stam M. et al. CryIA(b) transcript formation in tobacco is inefficient//PlantMol. Biol. 1995. V. 28. P. 513-524.

160. Verch T., Yusibov V., Koprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector // J. Immunol. Methods. 1998. V. 220. P. 69-75.

161. Voss A., Niersbach M., Hain R. et al. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody // Mol. Breed. 1995. V. 1. P. 39-50.

162. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

163. Yin J., Li G., Ren X., Herrler G. Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes // J. Biotechnol. 2007. V. 127. P. 335-347.

164. Yoder J.I., Goldsbrough A.P. Transformation system for generation markerfree transgenic plants // Biotechnology. 1994. V. 12. P.263-267.

165. Yoder J.I., Palys J., Alpert K., Lassner M. Ac transposition in transgenic tomato plants // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 213. P. 291-296.

166. Youm J.W., Jeon J.H., Kim H. et al. Transgenic tomatoes expressing human beta-amyloid for use as a vaccine against Alzheimer's disease // Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 1839-1845.

167. Zeitlin L., Olmsted S.S., Moench T.R. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immnoprotection of the vagina against genital herpes //Nat. Biotechnol. 1998. V.16. P. 1361-1364.

168. Zhang C.L., Chen D.F., McCormac A.C. et al. Use of the GFP reporter as vital marker for Agrobacterium-mQdiated transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.) //Mol. Biotechnol. 2001. V. 17. P. 109-117.

169. Zhang H., Liu M., Li Y. et al. Oral immunogenicity and protective efficacy in mice of a carrot-derived vaccine candidate expressing UreB subunit against Helicobacter pylori II Protein Exp. Purif. 2010. V. 69. P. 127-131.

170. Zheng G.-G., Yang Y.-H., Rao Q. et al. Expression of bioactive human M-CSF soluble receptor in transgenic tobacco plants // Protein Expr. Purif. 2006. V. 46. P. 367-373.

171. Zhong G.-Y., Peterson D., Delaney D.E. et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breed. 1999. V. 5. P. 345-356.

172. Zhu Z., Hughes K., Huang L. et al. Expression of human a-interferon cDNA in transgenic rice plants // Plant Cell, Tissue a. Organ Culture. 1994. V. 36. P. 197204.

173. Zuo J.R., Nui Q.W., Moller S.G., Chua N.H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 157-161.1. Благодарности