Экспрессия рекомбинантных антител к ферритину человека в растительных системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Семенюк, Екатерина Геннадиевна

• Семенюк, Екатерина Геннадиевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Семенюк, Екатерина Геннадиевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение молекул антител. Структура генов иммуноглобулинов

1.2 Проблемы экспрессии моноклональных антител в гетерологичных системах. Инженерия антител

1.3 Трансгенные растения как продуценты рекомбинантных белков

1.4 Внутриклеточная сортировка белков. Роль эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи в посттрансляционной модификации белков. Механизмы секреции белков

1.5 Получение антител в трансгенных растениях

1.5.1 Стратегии обеспечения экспрессии и сборки молекул полноразмерных антител в клетках растений

1.5.2 Экспрессия scFv - фрагментов антител в различных компартментах растительной клетки

1.5.3 Биотехнологические аспекты производства антител в растительных системах

1.6 Использование бактериальных белков барназы и барстара в молекулярной биологии и физиологии растений 54 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 62 2.1.1 Условия культивирования бактерий

2.2 Растения 63 2.22 Условия культивирования растений 63 2.3Растворы, использованные в работе

2.4 Ферменты, использованные в работе

2.5 Другие растворы и буферы

2.6 Другие реактивы и материалы

2.7 Основное обрудование

2.8 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК

2.9 Конструирование плазмид для трансформации растений

2.10 Введение метки в ДНК

2.11 Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах

2.12 Перенос ДНК на фильтры по Саузерну

2.13 Гибридизация на фильтрах по Саузерну

2.14 Трансформация листовых дисков табака

2.15 Выделение суммарной растительной ДНК

2.16 ПЦР-анализ трансгенных растений

2.17 Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола

2.18 РНК-ДНК гибридизация

2.19 Получение и анализ белковых экстрактов трансгенных растений и клеточных культур

2.20 Аффинная очистка scFvFl lbarstar

2.21 Определение функциональной активности рекомбинантных антител

2.22 Иммунофлуоресцентная микроскопия

2.23 Получение суспензионной клеточной культуры 82 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 84 3.1 Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFl lbarstar

3.1.1 Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFl lbarstar под контролем двойного промотора 35SCaMV

3.1.2 Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum конструкциями на основе гена scFvFl lbarstar

3.2 Молекулярно-генетический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена scFvFl lbarstar

3.3 Иммунохимический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена scFvFl lbarstar

3.4 Иммуновизуализация scFvFl lbarstar в тканях листа

3.5 Анализ поколения F1 растений, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFl lbarstar

3.6 Аффинная очистка scFvFl lbarstar из трансгенных растений и определение функциональной активности очищеных антител

3.7 Характеристика суспензионной клеточной культуры Nicotiana tabacco-продуцента мини-антител 117 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 123 ВЫВОДЫ 125 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВАР - безиламинопурин; NAA - нафтилуксусная кислота; 2.4 D - дихлорфеноксиуксусная кислота; PAAG - полиакриламид; SDS - додецилсульфат натрия; FITC - флуоресцеина изотиоцианат; BSA - бычий сывороточный альбумин; п.о. - пары нуклеотидных оснований; кДа - килодальтоны; ЭР - эндоплазматический ретикулум; scFv - вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела; ПЦР - полимеразная цепная реакция.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия рекомбинантных антител к ферритину человека в растительных системах»

Современные методы генетической инженерии растений позволяют экспрессировать рекомбинантные гены в клетках трансгенных растений и получать культуры, продуцирующие ценные для терапии и диагностики белки. Достижение высокого уровня продукции чужеродных белков в клетках растений зависит от многих факторов, главными из которых являются эффективность экспрессии перенесенных генов и стабильность полученного белка в клетке. Вместе с тем, работы по экспрессии таких молекул в растениях вносят существенный вклад в изучение физиологических аспектов функционирования трансгенной растительной клетки, поскольку условия получения чужеродных белков в клетках растений требуют оптимизации в каждом отдельном случае.

К настоящему времени накоплено много примеров успешного получения в клетках растений полноразмерных антител и их фрагментов (Fischer et al., 1999d). Было показано, что клетки растений способны к правильной трансляции и различным видам посттрансляционных модификаций полипептидных цепей иммуноглобулинов. Оказалось также, что использование растительных продуцентов позволяет преодолеть проблемы, возникающие при экспрессии генов антител в гетерологичных системах (гибридомных культурах и клетках прокариот). Использование эффективных генетических конструкций и систем экспрессии, а также последовательностей, обеспечивающих направление белка в различные клеточные компартменты, делают возможным достижение высокого уровня синтеза антител в растениях и позволяет решать многие задачи, такие как: защита растений от патогенов, регуляция метаболических реакций в самой растительной клетке, а также производить антитела для медицинского применения.

В качестве объекта для исследования условий экспрессии рекомбинантных антител в растительных клетках были выбраны мини-антитела к ферритину селезенки человека. Ферритин является раковоассоциированным антигеном чешуеклеточного рака головы и шеи, гепатоклеточного рака, лимфогрануломатоза и других злокачественных новообразований и представляет большую ценность для терапии и диагностики. Меченные изотопами антитела к ферритину применяются для лечения карциномы печени, а также при болезни Ходжкина (Беспалов и др., 1993). Однако использование для этих целей нативных моноклональных антител мыши ограничено из-за их иммуногенности для человека. Осуществление синтеза фрагментов антител (мини-антител), обладающих меньшей иммуногенностью, возможно в бактериальных клетках, однако это сопряжено с необходимостью проведения денатурации и ренатурации образующихся нерастворимых белковых телец включения. В этом случае использование для биосинтеза антител растительных продуцентов является оптимальным решением проблемы. Для экспрессии антител в растительных клетках были сконструированы три варианта генов слитого белка, составленного из двух доменов антиферритинового мини-антитела и бактериального белка барстара (Hartley, 1989). Введение в состав конструкций гена внутриклеточного ингибитора бактериальной рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens - белка барстара дает возможность использовать двухкомпонентную систему, включающую антитело, слитое с барстаром, и меченую барназу для целей медицинской диагностики.

Целью данного исследования являлось осуществление биосинтеза в растительных продуцентах вариабельных доменов антител (мини-антител), специфичных к ферритину селезенки человека.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- получение генетических конструкций для экспрессии мини-антител к ферритину в различных компартментах растительной клетки и трансформация растений Nicotiana tabacum;

- изучение физиологических характеристик трансгенных растений и накопления целевого белка в клетках трансгенных растений табака, суспензионных клеточных культур и растениях первого поколения;

- выделение мини-антител из растительного сырья при помощи аффинной хроматографии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Семенюк, Екатерина Геннадиевна

ВЫВОДЫ

1 .Осуществлена экспрессия генов рекомбинантных мини-антител к ферритину селезенки человека в виде слитого с барстаром белка под контролем двойного промотора 35ScaMV в трансгенных растениях и суспензионных культурах Nicotiana tabacum.

2.Присутствие рекомбинантного белка в клетках растений, трансформированных генетическими конструкциями, предназначенными для направления антител в различные клеточные компартменты (цитозоль, ЭР и апопласт), подтверждено при помощи иммуноблоттинга с антителами к барстару.

3.Уровень продукции мини-антител был одинаковым как в клетках растений родительских линий, так и растений первого поколения.

4.Мини-антител а стабильно синтезировались клетками суспензионной культуры. Показано, что в период активного роста культуры происходит увеличение уровня синтеза рекомбинантного белка.

5.Впервые на растительных объектах показано, что конъюгирование мини-антител с барстаром позволяет осуществлять иммунохимическое определение и эффективную очистку антител из растительного сырья, основанную на реакции аффинного взаимодействия барназы и барстара.

6.Сохранение функциональной активности антигенного фрагмента в составе слитого белка подтверждено при помощи реакции связывания очищенных антител с ферритином селезенки человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашей работы подтвердили возможность использования трансгенных растений и клеточных культур для биосинтеза рекомбинантных антител.

Было показано, что введение в состав генетических конструкций компартментспецифических сигналов позволяет направлять одноцепочечные антитела к ферритину, конъюгированные с барстаром, в эндомембранную систему растительных клеток, обеспечивая тем самым их стабильность и растворимость. Наряду с этим, выбранные антитела демонстрировали стабильность в восстанавливающей атмосфере цитозоля растительных клеток. Это является одним из немногих примеров накопления белков такого рода в цитоплазме и еще раз подтверждает тот факт, что эффективность экспрессии антител в клетках растений во многом зависит от индивидуальных свойств рекомбинантных молекул.

Количество целевого белка, синтезированного в растениях, трансформированных различными генетическими конструкциями на основе антител, оказалось примерно одинаковым. Кроме того, достаточно высокий уровень содержания белка сохранялся и в клетках растений первого поколения, полученного путем самоопыления исходных трансгенных линий, и в трансгенной суспензионной клеточной культуре, что свидетельствует о стабильности использованных генетических конструкций.

Предложенный метод очистки рекомбинантного белка, основанный на высокоспецифичном взаимодействии барназы и конъюгированного с антителами барстара, позволяет выделять из растительного сырья функциональные антитела в количествах, достаточных для их дальнейшего исследования и медицинского применения.

Таким образом, главным результатом проведенной работы явилось создание на основе трансгенных клеток растений модельной системы, позволяющей осуществлять эффективную экспрессию и очистку антител различной специфичности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Семенюк, Екатерина Геннадиевна, 2003 год

1. Беспалов И.А., Шиянов П.А., Лукашевич Л.В., Лунев В.Е., Трибуш С.С., Гапонова Г.И., Деев С.М. Получение одноцепочечных антител к ферритину человека в E.coli. Молекулярная биология. 1993. 27, 451-460.

2. Деев С.М., Поляновский О.Л. Трансфектомы продуценты искусственных антител. 1987. Биотехнология. Т.З. С. 796-801.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480с.

4. Метт В.Л., Метт В.А., Сонг Дж.Ч., Джонс В.Т., Рейнолдс П.Х. Экспрессия одиночной цепи антитела к аспартат-аминотрансферазе Р2 в трансгенных растениях табака. Физиология растений. 2000. Т. 47. N3. С. 397-401.

5. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. 1991. /Итоги науки и техники. Серия Морфология человека и животных. Т.15.

6. Alfthan К., Takkinen К., Sizmann D., Soderlund Н., Teeri Т.Т. Properties of a single-chain antibody containing different linker peptides. 1995. Protein Eng. V.8(7). P.725-731.

7. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors // Plant molecular biology Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Varma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. A3. P. 1-19.

8. Anthony J., Near R., Wong S.-L., Iida E., Ernst E., Wittekind M., Haber E., Ng S-C. Production of stable anti digoxin Fv in Escherichia coli. Mol. Immunol. 1992. V.29. P. 1237-1247.

9. Bagshawe K.D. Antibody-directed enzyme prodrug therapy for cancer: its theoretical basis and application. 1995. Mol Med Today. V.l(9) P.424-431.

10. Bayly A.M., Kortt A.A., Hudson P.J., Power B.E. Large-scale bacterial fermentation and isolation of scFv multimers using a heat-inducible bacterial expression vector. 2002. J Immunol Methods. V. 262(1-2). P.217-227.

11. Beachy R.N., Loesch-Fries S., Turner N.E. Coat protein -mediated resistance against virus infection. Ann. Rev. Phytopatol. 1990. V.28. P.451-457.

12. Beals Т., Goldberg R.B. A novel cell ablation strategy blocks tobacco anther dehiscence. 1997. The Plant Cell. V.9. P. 1527-1545.

13. Benvenuto E., Ordas R.J., Tavazza R., Ancora G., Biocca S., Cattaneo A., Gallefi P. "Phytoantibodies": a general vector for the expression of immunoglobulin domains in transgenic plants. 1991. Plant Mol. Biol.V.17. P.865-874.

14. Biocca S., Di Luzio A., Werge Т., Cattaneo A. Intracellular immunization: expression of antibody domains in the cytoplasm and in the nucleus of mammalian cells. 1991. Cytotechnology. V.5(l). P.49-50.

15. Biocca S., Ruberti F., Tafani M., Pierandrei-Amaldi P., CattaneoA. Redox state of single chain Fv fragments targeted to the endoplasmic reticulum, cytosol and mitochondria. 1995. Biotechnology. V. 13. P. 1110-1115.

16. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson K.D., Johnson J.W., Kaufman B.M., Lee S-M., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. Single-chain antigen-binding proteins. 1988. Science. V.242. P.423-426.

17. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513.

18. Bouquin Т., Thomsen M., Nielsen L.K., Green Т.Н., Mundy J., Dziegiel M.H. Human anti-Rhesus D IgGl antibody produced in transgenic plants. 2002. Transgenic Res. V.l 1. P.l 15-122.

19. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

20. Bruyns A.-M., De Jaeger G., De Neve M., De Wilde C., Van Montagu M., Depicker A. Bacterial and plant-produced scFv proteins have similar antigen-binding properties. 1996. FEBS Letters. V.386. P.5-10.

21. Bryuns A.M., de Jaeger G., De Neve M., DeWilde C., Van Montague M., Depicker A. Bacterial and plant-produced scFv -proteins have a similar antigen-binding properties. 1996. FEBS Letters. V.386. P.5-10.

22. Bullock W.O., Fernandez J.M., Short J.M. 1987. Biotechniques. V. 5. P. 376-378.

23. Cabanes-Macheteau M., Fitchette-Laine A.C., Loutelier-Bourhis C., Lange C., Vine N.D., Ma J.K., Lerouge P., Faye L. N-Glycosylation of a mouse IgG expressed in transgenic tobacco plants. 1999. Glycobiology. V. 19(4). P.365-372.

24. Capita N., Sabularse D., Montezinos D., Delmer D.P. Determination of pore size of cell walls of living plant cells. 1979. Science. V.205. P.l 144-1147.

25. Carlson J.R. A new means of inducibly inactivating a cellular protein. 1988. Mol. Cell. Biol. V.8(6). P.2638-2646.

26. Carter P. Bispecific human IgG by design. 2001. J. Immunol.Meth. V.248. P. 7-15.

27. Chargelegue D., Vine N.D., van Dolleweerd C.J., Drake P.M., Ma J.K A murine monoclonal antibody produced in transgenic plants with plant-specific glycans is not immunogenic in mice. 2000. Transgenic Res. V.9(3). P.187-194.

28. Chester KA, Hawkins RE. Clinical issues in antibody design. 1995. Trends Biotechnol. V.13. (8). P.294-300.

29. Cheung S.C., Dietzschold В., Koprowski H., Notkins A.L., Rando R.F. A recombinant human Fab expressed in E.coli neutralizes rabies virus. 1992. J. Virol. V. 11. P.6714-6720.

30. Coleman C.E., Lopes M.A., Gillikin I.W., Boston R.S., Larkius B.A. A defective signal peptide in the maize high-lysine mutant fluory -2. 1995. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. V.92. P.6828-6831.

31. Colombo L., Franken J., Van der Krol A.R., Wittich P.E., Dons H.J., Angenent G.C. Downregulation of ovule-specific MADS box genes from petunia results in maternally controlled defects in seed development. 1997. Plant Cell. V.9(5). P.703-715.

32. Cramer С., Boothe J.G., Oishi K.K. Transgenic plants for therapeutic proteins: linking upstream and downstream strategies. 1999. Curr. Topics Microbiol. Immunol. V. 240. P. 95-118.

33. Custers J.B, Oldenhof M.T., Schrauwen J.A., Cordewener J.H., Wullems G.J., van Lookeren., Campagne M.M. Analysis of microspore-specific promoters in transgenic tobacco. 1997. Plant Mol Biol. V. 35(6). P.689-699.

34. Diiring K., Hippe S., Kreuzaler F., Schell J. Synthesis and self- assembly of functional monoclonal antibody in transgenic Nicotiana tabacum . 1990. Plant Mol Biol. V.15. P.281-293.

35. De Loose M., Gheysen G., Tire C., Gielen J., Villarroel R., Genetello C., Van Montagu M., Depicker A. The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts. 1991. Gene. V.99. P.95-100.

36. De Neve M., De Loose M., Jacobs A., Van Houdt H., Kaluza В., Weidle U., Van Montagu M., Depicker A. Assembly of antibody and its derived antibody fragment in Nicotiana and Arabidopsis. 1993. Transgenic Research. V. 2. P.227-237.

37. De Neve M., DeBuck S., De Wilde C., Van Houdt H., Strobbe I., Jacobs A., Van Montagu M., Depicker A. Gene silencing results in instability of antibody production in transgenic plants. 1999. Mol Gen Genet. V. 260. P.582-592.

38. De Sutter K., Feys V., Van de Voode A., Fiers W. Production of functionally active murine and murine: human chimeric F(ab')2 fragments in COS -1 cells. 1992. Gene. V.113. P.223-230.

39. De Wilde C., De Rycke R., Beeckman Т., De Neve M., Van Montagu M., Engler G., Depicker A. Accumulation pattern of IgG antibodies and Fabfragments in transgenic Arabidopsis thaliana plants. Plant Cell Physiol. 1998. V.39(6). P.639-646.

40. De Wilde C, Van Houdt H, De Buck S, Angenon G, De Jaeger G., Depicker A. Plants as bioreactors for protein production: avoiding the problem of trnsgene silencing. 2000. Plant Mol. Biol. V.43. P.347-359.

41. Deneke J, Botterman J, Deblaere R. Protein secretion in plant cells can occur via default pathway. 1990. Plant Cell. V.2. P.51-59.

42. Denis M, Delourme R, Gourret J.P, Mariani C, Renard M. Expression of Engineered Nuclear Male Sterility in Brassica napus (Genetics, Morphology, Cytology, and Sensitivity to Temperature). 1993. Plant Physiol. V.101(4). P.1295-1304.

43. Doran P.M. Foreign protein production in plant tissue cultures. Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 199-204.

44. Dunsmuir P, Bond D, Lee K, Bond D, Lee K, Gidoni D, Townsend J. Stability of introduced genes and stability in expression.// Plant Mol. Biol. Manual. 1988. Eds Gelvin S.B, Schilperoopt R.A, Varma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. CI. P.9-10.

45. Edwards K., Johnston C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. 1991. Nucleic Acids Res. V. 19. P. 1349.

46. Fiedler U., Conrad U. High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds. 1995. Bio/technology. V.13(10). P.1090-1093.

47. Fiedler U., Phillips J., Artsaenko O., Conrad U. Optimization of scFv antibody production in transgenic plants. 1997. Immunotechnology. V.3. P.205-216.

48. Field H., Yarranton G.T., Rees A.R. Expression of mouse immunoglobulin light and heavy chain variable regions in Escherichia coli and reconstitution of antigen binding activity . 1989. Protein Eng. V.3. P. 641-647.

49. Freeling M., Walbot V. The maize handbook. Springer. 1994. P. 100.

50. Frigerio L., Vine N.D., Pedrazzini E., Hein M.B., Wang F., Ma J.K., Vitale A. Assembly, secretion, and vacuolar delivery of a hybrid immunoglobulin in plants. 2000. Plant Physiol. V. 123(4). P. 1483-1494.

51. Galili G., Sengupta-Gopalan C., Ceriotti A. The endoplasmatic reticulum of plant cells and its role in protein maturation and biogenesis of oil bodies. 1998. Plant Mol.Biol. V.38. P. 1-29.

52. Gething M.J., Sambrook J. Protein folding in cell. 1992. Nature. V.355. P.33-45.

53. Gillikin J.W., Zhang F., Coleman C.E., Bass H.W., Larkins B.A., Boston R.S. A defective signal peptide tethers the fluory -2 zein to the endoplasmatic reticulum membrane. 1997. Plant Physiol. V.l 14. P. 345-352.

54. Givol D. The minimal antigen-binding fragment of antibodies~Fv fragment. 1991. Mol Immunol. V. 28(12). P. 1379-86.

55. Glockshuber R., Malia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv fragment. Biochemistry. 1990. V.29. P. 613-615.

56. Glockshuber R., Schmidt Т., Pluckthun A. The disulfide bonds in antibody variable domains: effects on stability, folding in vitro, and functional expression in Escherichia coli. 1992. Biochemistry. V.31. P. 1270-1279.

57. Glockshuber R., Stadlmuller J., Pluckthun A. Mapping and modification of an antibody hapten binding site: a site-directed mutagenesis study of МсРСбОЗ. 1991. Biochemistry. V.30. P. 3049-3054.

58. Goddijn O.J.M., Pen J. Plants as bioreactors. 1995. Trends Biotech. V.13. P.379-387.

59. Goldman M.H., Goldberg R.B., Mariani C. Female sterile tobacco plants are produced by stigma-specific cell ablation. 1994. EMBO J. V. 13(13). P.2976-2984.

60. Gomord V., Faye L. Signals and mechanisms involved in intracellular transport of secreted proteins in plants. 1996. Plant Physiol. Biochem. V.34. P.165-182.

61. Guillet V., Lapthorn A., Hartley R., Mauguen Y. Recognition between a bacterial ribonuclease, barnase, and its natural inhibitor, barstar. 1993. Structure. V.l. P. 165-176.

62. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. 1995. Science. V. 268. P. 714-716.

63. Hartley R. A reversible thermal transition of extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens. Biochemistry. 1968. V.7. 2401-2408.

64. Hartley R. Barnase and barstar. Ribonucleases: Structure and functions. Eds. D' Alessio & Rigodan. Academic Press, 1997. P. 51-100.

65. Hartley R. Directed mutagenesis and barnase-barstar recognition. Biochemistry. 1993. V.32. 5978-5984.

66. Hartley R.W. Barnase and barstar. Expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. 1988. J Mol Biol. V.202(4). P.913-915.

67. Hartley R.W. Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together. 1989. TIBS. V. 14. P.450-454.

68. Hasemann C.A., Capra J.D. High-level production of a functional immunoglobulin heterodimer in a baculovirus expression system. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.87(10). P.3942-3946.

69. Hauson В., Engler D., Moy Y., Newman В., Ralston E., Gutterson N. A simple method to enrich an Agrobacterium transformed population for plants containing only T-DNA sequences. 1999.The Plant J. V. 19(6). P.727-734.

70. Hein M.B., Tang Y., McLeod D.A., Janda K.D., Hiatt A. Evaluation of immunolobulins from plant cells. 1991. Biotechnol. Prog. V.7. P.455-461.

71. Hendy S., Chen Z.C., Barker H., Santa Cruz S., Chapman S., Torrance L., Cockburn W., Whitelam G.C. Rapid production of single-chain Fv fragments in plants using a potato virus X vector. 1999. Journal of Immunological Methods. V.231. P.137-146.

72. Herbers K., Sonnewald U. Production of new/modified proteins in transgenic plants. 1999. Curr Opin. Biotech. V.10. P. 163-168.

73. Hiatt A. Antibody in transgenic plants. 1990. Nature. V. 344. P.469-470.

74. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. 1989. Nature. V. 342. P.76-78.

75. Holliger P., Prospero Т., Winter G. "Diabodies": small bivalent and bispecific single-chain antibody fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.90. P. 6444-6448.

76. Horwitz A.H., Chang C.P., Better M., Hellstrom K.E., Robinson R.R. Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.85. P.8678-82.

77. Hunt D.C., Chispeels M. L. The signal peptide of vacuolar protein is necessary and sufficient for the efficient secretion of cytosolic protein. 1991. Plant Physiol. V.96. P. 18-25.

78. Huston J., Levinson D., Mudgett-Hunter M., Tai M.-S., Novotny J., Margolies M., Ridge R., Bruccoleri R., Haber E., Crea R., Oppermann H.

79. James E.A., Wang C., Wang Z., Reeves R., Shin J.H., Magnuson N.S., Lee J.M. Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. 2000. Protein Expr. Purif. V.19. P. 131-138.

80. Jobling S.A., Jarman C., Holmberg N., Blake C., Verhoeyen M.E. Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antibody fragments. 2003. Nat Biotech. V. 21. P.77-80.

81. Jones P.T., Dear P.H., Foote J., Neuberger M.S. Winter G. Replacing the complementary -determining regions in a human antibody with those from a mouse . 1986. Nature V.321. P.522-525.

82. Kapila J., De Rycke R., Van Montagu M., Angenon G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. 1997. Plant Sci. V. 122. P. 101-108.

83. Khoudi H., Laberge S., Ferullo J-M., Bazil R., Darveau A., Castonguay Y., Allafd G., Lemieux R., Vezina L-P. Production of monoclonal diagnostic antibody in perennial alfalfa plants . 1999. Biotech. Bioengin. V.64(2). P.135-143.

84. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. 1970. Nature. V. 256. P. 495-497.

85. Kuvshinov V, Koivu К, Kanerva A, Pehu E. Molecular control of transgene escape from genetically modified plants. 2001. Plant Sci. V. 160(3). P.517-522.

86. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

87. Lerouge P, Cabanes-Macheteau M., Rayon C, Fischette-Laine A.-C, Gomord V. Faye L. N-Glycoprotein biosynthesis in plants: recent developments and future trends. 1998. Plant Mol. Biol. V.38. P. 31-48.

88. Liu S, Bugos R.C, Dharmasiri Su W.W. Green fluorescent protein as a secretory reporter and a tool for process optimization in transgenic plant cell cultures. 2000. J. Biotech. V.87. P. 1-16.

89. Lund P, Lee R.Y, Dunsmuir P. Bacterial chitinase is modified and secreted in transgenic tobacco. 1989. V.91. P. 130-135.

90. Ma J. K-C, Hein M.B. Antibody production and engineering in plants. 1996. Ann. N-Y. Acad.Sci. V.792. P.73-81.

91. Ma J. K-C., Hein M.B. Plant antibodies for immunotherapy. 1995. Plant Phhysiol. V.109. P.341-346.

92. Ma J. K-C., HiattA., Hein M., Vine N., Wang F., Stabila P., van Dolleweerd C., Mostov K., Lehner T. Generation and assembly of secretory antibodies in plants. 1995. Science. V. 268. P.716-719.

93. Ma J. K-C., Lehner Т., Stabila P., Fux C.I., Hiatt A. Assembly of monoclonal antibodies IgGl and IgA heavy chains domains in transgenic tobacco plants. 1994. Eur.J.Immunol. V.24. P.131-138.

94. Ma J.K.-C., Hikmat B.Y., Wycoff K, Vine N.D., Chargelegue D, Yu L., Hein M.B., Lehner T. Characterization of recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans. 1998. Nat Med. V.4(5). P.601-606.

95. Magnuson N.S., Linzmaier., Gao J.-W., Reeves R., An G., Lee G. Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells. 1996. Protein Expression and Purification. V.7. P.220-228.

96. Manohar V., Hoffman T. Monoclonal and engineered antibodies for human parenteral clinical use: regulatory considerations. 1992. Trends Biotechnol. V.10(9). P.305-309.

97. Mariani C., De Beuckeleer M., Truetter J., Leemans J., Goldberg R.B. Induction of male-sterility in plants by chimaeric ribonuclease gene. 1990. Nature. V.347. 737-741.

98. Mariani C., Gossele V., De Beuckeleer M., De Block M., Goldberg R.B., De Greef W., Leemans J. A chimaeric ribonuclease-ingibitor gene restores fertility to male sterile plants. 1992. Nature. V.357. P.384-387.

99. Martsev, S.P., Kravchuk, Z.I., Chumanevich, A.A., Vlasov A.P., Dubnovitsky A.P., Bespalov I.A., Arozio P., Deyev S.M. Antiferritin single-chain antibody: a functional protein with incomplete folding? 1998. FEBS Lett. V.441. P.458-462.

100. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. 1996. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 93. P. 5335-5340.

101. Mason H.S., Lam D.M.-K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis В surface antigen in transgenic plants. 1992. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 89. P. 11745-11749.

102. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes. 1995. Biotechnology. V.13. P. 1484-1487.

103. Moffat A.S. Exploring transgenic plants as a new vaccine source. 1995. Science. V.268. P.658-660.

104. Mogelsvang S., Simpson D.J. Protein folding and transport from the endoplasmic reticulum to the Goldgi apparatus in plants. 1998. J. Plant. Physiol. V. 153. P. 1-15.

105. Muntz K. Deposition of storage proteins. 1998. Plant. Mol. Biol. V. 38. P. 77-99.

106. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

107. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. 1980. Nucl. Acids Res. V.8. P.4321-4325.

108. Nagy F., Kays A., Chua N.-H. Analysis of gene expression in transgenic plants // Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Varma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. В 4. P. 1-29.

109. Nakai K., Kanehisa M. A knowledge base for predicting protein localization sites in eukaryotic cells. 1992.Genomics. V. 14. P. 897-911.

110. Natsoulis G., Boeke J.D. New antiviral strategy using capsid-nuclease fusion proteins. 1991. Nature. V.352(6336). P.632-635.

111. Neuberger M.S. Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. 1983. EMBO J. V.2. P. 13731378.

112. Nishimura S., Nomura M. Ribonuclease of Bacillus subtillus. J. Biochem.(Tokio) 1959. V. 46. P. 161-167.

113. Nuttall J., Vine N., Hadlington J.L., Drake P., Frigerio L., Ma J.K. ER-resident chaperone interactions with recombinant antibodies in transgenic plants. 2002. Eur J Biochem. V.269(24). P. 6042-6051.

114. Oi V.T., Morrison S.L., Herzenberg L.A., Berg P. Immunoglobulin gene expression in transformed lymphoid cells. 1983. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. V.80. P.825-829.

115. Owen M., Gandecha A., Cock burn В., Whitelam G. Synthesis of functional antiphytochrome single-chain Fv protein in transgenic tobacco plants. 1992. Bio/technology. V. 10. P.790-794.

116. Paddon C. J., Hartley R. W. Cloning, sequencing and transcription of an inactivated copy of Bacillus amiloliquefaciens extracellular ribonuclease (barnase).1985. Gene. V. 40. P. 231-239.

117. Pawlowski K., Kunze R., De Vries S., Bisseling T. Isolation of total, poly(A) and polysomal RNA from plant tissues. // Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1994. D 5. P. 1-13.

118. Peach J., Velten J. Transgene expression variability (position effect) of CAT and GUS reporter genes driven by linked divergent T-DNA promoters. Plant Mol. Biol. V. 17. P. 49-60.

119. Peeters К., De Wilde С., Depicker A. Highly efficient targeting and accumulation of a Fab fragment within the secretory parthway and apoplast of Arabidopsis thaliana. 2001. Eur. J. Biochem. V.268. P.4251-4260.

120. Pelham H.R.B. Sorting and retrieval between the endoplasmatic reticulum and Goldgi apparatus. 1995. Curr.Opin.Cell.Biol. V.7. P.530-535.

121. Pfitzner U.M, Goodman H.M. Isolation and characterization of cDNA clone encoding pathgenesis -related proteins from tobacco-mosaic virus infected tobacco plants. 1987. Nucl. Acids Res. V.15. P.4449-4465.

122. Phillips J., Artsaenko O., Fiedler U., Horstmann C., Mock H-P., Muntz K., Conrad U. Seed-specific immunomodulation of abscisic acid activity induces a developmental switch. 1997. The EMBO J. V. 16(15) P.4489-4496.

123. Pliickthun A. Antibody engineering. 1991. Curr Opin Biotechnol. V.2(2). P.238-46.

124. Polak J.M. , Van Noorden S. (Eds.) Immunocytochemistry. Modern Methods and Applications. Bristol: Wright, 1986.

125. Porath J. Immobilized metal afffinity chromatography . Protein Expression Purification. 1992. V. 3. P.263-281.

126. Porath J. Immobilized metal ion affinity chromatography. 1992. Prot. Express. Purif. V.3: P.263-281.

127. Porter R.R., The hydrolysis of rabbit y-globuline and antibodies with crystalline papain. Biochem.J. 1953. V.73. P. 119-126.

128. Prior T.I., FitzGerald D.J., Pastan I. Barnase toxin: a new chimeric toxin composed of Pseudomonas exotoxin A and barnase. 1991. Cell. V. 64(5). P. 1017-1023.

129. Prior T.I., FitzGerald D.J., Pastan I.Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. 1992. Biochemistry. V.31(14). P. 3555-3559.

130. Rademacher T.W., Howmans S.W., Parekh R.B., Dwek R.A. Immunoglobulin G as glycoprotein. 1986. Biochem. Soc. Symp. V.51. P.131-148.

131. Reiter Y., Pastan I. Recombinant Fv immunotoxins and Fv fragmants as novel agents for cancer therapy and diagnosis. 1998. Tibtech. V.16. P.513-520.

132. Robinson D., Hinz G., Holsten S.E.H. The molecular characterization of transport vesicles. 1998. Plant Mol. Biol. V.38. P. 49-76.

133. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. The 1996. FASEB Journal. V.10. P. 49-57.

134. Russel D.A. Feasibility of antibody production in plants for human therapeutic use. 2000. //Tous droits de properiete intellectuelle reserves. Reproduction, representation et diffusion interdites.P.120-138.

135. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. NY: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989.

136. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

137. Sasson A. Plant biotechnology derived products: market-value estimates and public acceptance// IX International congress on plant tissue and cell culture (International Association for Plant Tissue Culture, IAPTC, Jerusalem, Israel, 14-19 June, 1998).

138. Schmid M., Simpson D., Kalousek F., Gietl C. A cysteine endopeptidase with a C-terminal KDEL motif isolated from castor bean endosperm is a marker enzyme for the ricinosome, a putative lytic compartment. 1998. Planta. V.206. P. 466-475.

139. Schouten A., Roosien J., de Boer J.M., Wilmink A., Rosso M.N., Bosch D., Stiekema W.J., Gommers F.J., Bakker J., Schots A. Improving scFv antibody expression levels in the plant cytosol. 1997. FEBS Lett. V.415(2). P.235-41.

140. Sharp J. M., Doran P. M. Characterization of monoclonal antibody fragments produced by plant cells. 2001. Biotechnol. Bioengineer. V. 73(5). P.338-346.

141. Shimada N., Suzuki Y., Nakajima M., Conrad U., Murofushi N., Yamaguchi I. Expression of a functional single-chain antibody against GA24/19 in transgenic tobacco. 1999. Biosci. Biotechnol. Biochem. V.63 (4). P.779-783.

142. Sijmons P.C., Dekker B.M., Schrammeijer В., Verwoerd T.C., van den Elzen P.J., Hoekema A. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants. 1990. Bio/Technology. V. 8. P. 217-221.

143. Skerra A. Bacterial expression of immunoglobulin fragments. 1993.Curr.Opin. Immunol. V 2. P.250-262.

144. Smith M.D. Antibody production in plants. 1996. Biotech Advances. V.14 (3). P.267-281.

145. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

146. Spiegler H, Schillberg S, Sack M, Holzem A, Nahring J, Monecke M, Yu-Cai Liao, Fischer R. Accumulation of antibody fusion proteins in the cytoplasm and ER of plant cells. 1999. Plant Sci. V.149. P.63-71.

147. Steieger M, Neuhaus G, Momma T, Shell J, Kreuzaler F. Self assembly of immunoglobulins in the cytoplasm of the alga Acetabularia mediterranea. 1991. Plant Sci.V. 73. P. 181-190.

148. Stempfer G, Holl-Neugebauer B, Rudolph R. Impoved refolding of an immobilized fusion protein. 1996. Nature Biotechnol. V.14. P.329-334.

149. Stoeckle M, Guan L. Improved resolution and sensivity of Northern blots using polyacrilamide-urea gels. BioTechniques. 1993. V. 15. P. 227-231.

150. Stoger E, Vaquero C, Torres E, Sack M, Nicholson L, Drossard J, Williams S, Keen D, Perrin Y., Christou P, Fischer R. Cereal crops as viable production and storage system for pharmaceutical scFv antibodies. 2000. Plant Mol. Biol. V.42. P.583-590.

151. Strittmatter G, Janssens J, Opsomer C, Botteman J. Ingibitor of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death. 1995. Bio/technology. V.13. P. 1085-1089.

152. Tavladoraki P, Benvenuto E, Trinca S, De Martinis D, Cattaneo A, Galeffi Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody was specifically protected from virus attack. 1993. Nature. V. 366 (6454). P. 469-472.

153. Todorovska A., Roovers R.C., Dolezal O., Kortt A.A., Hoogenbom H.R., Hudson P.J. Desin and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. 2001. J. Immunol.Meth. V.248. P. 47-66.

154. Vandekerckhove J. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins. 1989. Bio/technology. V. 7. P. 929-932.

155. Verch Т., Yusibov V., Koprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. 1998. J. Immunol. Methods. V. 1220(1-2). P.69-75.

156. Voss A., Niersbach M., Hain R., Hirsch H.J., Liao Y. C., Kreuzaler F., Fischer R. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody. 1995. Mol. Breed. V.l. P.30-50.

157. Wahl M.F., An G.,Lee J.M. Effects of dimethylsulfoxide on heavy chain monoclonal antibody production from plant cell culture. 1995. Biotechnology Letters. V.17. (5)463-468.

158. Walkerpeach C.R., Velten J. Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binary vector systems. // Plant Mol. Biol. Manual. 1985. Eds Gelvin S.B., Schilperoopt R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. Bl. P.1-19.

159. Wall R., Kuehl M. Biosynthesis and regulation of immunoglobulins. 1983. Annu Rev Immunol. V.l. P.393-422.

160. Weidle U.H., Borgya A., Mattes R., Lenz H., Buckel P. Recognition of functionally active antibody directed against creatine kinase from separately expressed heavy and light chains in non-lymphoid cells. 1987. Gene. V.51. P.21-29.

161. Whitelam G.C., Cockburn W. Antibody expression in transgenic plants. 1996. Trends in Plant Science. V.l(8). P. 268-272.

162. Whitelam G.C., Cockburn W., Owen M.R.L. Antibody production in transgenic plants. 1994. Biochemical Society Transactions. V.22 (4). P. 940943.

163. Widholm J. The use of fluorescein diacetate and phenosafranine for determining viability of cultured plant cells. 1972. Stain Technol. V.47. P.189-194.

164. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. 1994. Annu.Rev. Immunol. V.12. P.433-455.

165. Wongsamuth R., Doran M.P. Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy root. 1997. Biotech Bioeng. V.154(5). P.402-414.

166. Yazynin S.A., Deyev S.M. Recombinant barnase as a lable in ELISA. 1996. FEBS Letters. V.388. P.99-102.

167. Yazynin S.A., Deyev S.M., Jukovic M., Hartley R.W. A plasmid vector with positive selection and directional cloning based on a conditionally lethal gene. 1996. Gene. V.169. P.131-133.

168. Yuan Q., Hu W., Pestka J.J., He S.Y., Hart L.P. Expression of a functional antizearalenone single-chain Fv antibody in transgenic arabidopsis plants. 2000. Appl Environ Microbiol. V.66(8). P.3499-3505.

169. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montague M., Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cell without alteration their normal regeneration caparcity. 1983. EMBO J. V.2. P. 2143-2150.