Синтез и свойства химерных мембрано-активных пептидов на основе грамицидина А тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Стоилова, Татьяна Борисовна

• Стоилова, Татьяна Борисовна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Стоилова, Татьяна Борисовна

Список сокращений

Введение

Часть I. Литературный обзор

Глава 1. Грамицидин А

1.1 Биосинтез и биологическая роль грамицидина А

1.2 Пространственная структура грамицидина А

1.2.1 Многообразие структур грамицидина А в растворах

1.2.2 Структура грамицидина А в фосфолипидной мембране

1.3 Ионофорные свойства грамицидина А

1.4 Применение грамицидина А в качестве антибиотика

Глава 2. Пептиды, способные пересекать плазматическую мембрану

2.1 Краткая характеристика основных известных СРР

2.1.1 HIV-1 Tat

2.1.2 Пенетратин

2.1.3 HSV-VP

2.1.4 Транспортан

2.1.5 Поликатионные пептиды и другие СРР

2.1.6 Антимикробные пептиды

2.2 Перспективы практического использования СРР

2.2.1 Лечение онкологических заболеваний

2.2.2 Лечение сердечно-сосудистых заболеваний

2.3 Механизм проникновения пептидов в клетку 35 Часть II. Результаты и обсуждения.

Глава 3. Синтез химерных пептидов

Глава 4. Ионофорные свойства химерных пептидов.

4.1 Образование одиночных каналов

4.2 Макроскопический ток через мембрану

4.3 Исследование свойств ионных каналов, образованных пептидами Р4С и PI ОС, методом фотодинамической инактивации

Глава 5. Взаимодействие флуоресцентного производного пептида Р1 ОС с мембранами клеток

Глава 6. Доставка белков в клетки с помощью химерных пептидов

6.1 Трансдукция (З-галактозидазы

6.2 Трансдукция пероксидазы хрена

6.3 Трансдукция флуоресцентных белков

Глава 7. Образование комплексов с белками

7.1 Метод электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях

7.2 Изменение ферментативной активности (3-галактозидазы

Глава 8. Цитотоксическое действие химерных пептидов

Глава 9. Материалы и методы

9.1 Материалы

9.2 Методы

9.2.1. Синтез пептидов

9.2.2. Ионная проводимость бислойных мембран 88 9.2.3 Клетки и клеточные культуры

9.2.4. Трансдукция белков

9.2.5. Взаимодействие РЮС-Пи с клеточной мембраной

9.2.6 Цитотоксический эффект

9.2.7 Связывание пептидов с белками 96 Выводы 97 Литература

Список сокращений

БЛМ - бислойная липидная мембрана

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

ДС1 -параллельная левозакрученная двойная спираль с симметричным выравниванием мономеров

ДС2 - параллельная левозакрученная двойная спираль с несимметричным выравниванием мономеров

ДСЗ - антипараллельная левозакрученная двойная спираль

ДС4 - параллельная правозакрученная двойная спираль

ДМСО - диметисульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИК - инфракрасная спектроскопия

КД - круговой дихроизм

РНК - рибонуклеиновая кислота

СД - спиральный димер

ЯМР - спектроскопия ядерного магнитного резонанса ß-Gal - ß-галактозидаза

BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)

СРР - cell penetrating peptide (пептид, способный проникать в клетку)

СМЕ - клатрин-опосредованный эндоцитоз (clathrin-mediated endocytosis)

DAB - диаминобензидин

DCM - дихлорметан

DIC - 1чГ,М-диизопропил-карбодиимид

DIPEA - N-этилдиизопропиламин

DMEM - питательная среда (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)

DMF - диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DTT - дитиотреитол

EtOH - этанол

GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein) FBS - фетальная бычья сыворотка (fetal bovine serum) Fmoc - флуоренилметоксикарбонил

HIV - вирус иммунодефицита человека (human immunodeficiency virus)

HOBt -1 -гидрокси-бензтриазол

HRP - пероксидаза хрена (horse radish peroxidase)

HSV - вирус герпеса (herpes simplex virus)

LDH - лактатдегидрогеназа

MTT - (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиум бромид) Mtt - 4-метилтритил

NLS - сигнал ядерной локализации (nuclear localization sequence)

THF - тетрагидрофуран

TFA - трифторуксусная кислота

ТМВ - 3,3\5,5'-тетраметилбензидин

X-Gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-0-галакгозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и свойства химерных мембрано-активных пептидов на основе грамицидина А»

Гидрофобная природа мембран делает их непроницаемыми для большинства гидрофильных молекул в отсутствие дополнительных внешних факторов. В последние десятилетия был разработан ряд подходов и методов, таких как микроинъекция, электр опорация, липосомальные и вирусные системы доставки, позволяющих транспортировать подобные соединения через клеточную мембрану, как в исследовательских целях, так и для терапевтического применения. Однако на данный момент методология белковой трансдукции разработана в гораздо меньшей степени, чем, например, доставка нуклеиновых кислот. Среди прочих методов получило широкое распространение ковалентное присоединение белков к пептидам, способным самопроизвольно пересекать клеточную мембрану, в основном с использованием генно-инженерных подходов. Основным недостатком этой системы является сложность получения подобных конъюгатов. В последние годы была найдена возможность доставки белков в составе нековалентных комплексов с пептидами-транспортерами, что значительно упрощает методику белковой трансдукции. Подобное свойство показано для пептидов, обладающих амфипатичной структурой. При этом полагают, что гидрофобная последовательность обладает не только способностью взаимодействовать с мембраной, но также может принимать участие в процессе образования комплексов с белком за счет гидрофобных взаимодействий.

В связи с вышесказанным, актуальной задачей является оптимизация векторов для внутриклеточной доставки белков в составе нековалентных комплексов, направленная на повышение эффективности переноса и снижения токсичности для клеток-мишеней.

Целью данной работы являлся синтез и исследование свойств серии пептидов на основе грамицидина А и сигнала ядерной локализации вируса обезьян 8У40. Предполагалось, что полученные пептиды, обладающие амфипатичной структурой, будут способны доставлять функционально-активные белки в эукариотические клетки в составе нековалентных комплексов. Кроме того, предполагалось исследовать каналообразующие свойства полученных производных на модельных липидных бислоях.

Таким образом, первой задачей данной работы являлся синтез серии химерных пептидов. Грамицидиновая последовательность была выбрана в качестве гидрофобного домена в силу ее высокого сродства к мембране. Кроме того, предполагалось, участие грамицидинового фрагмента в образовании нековалентных комплексов с белками засчет гидрофобных взаимодействий [1]. Вторым компонентом полученных производных был положительно заряженный пептидный сегмент с аминокислотной последовательностью сигнала ядерной локализации вируса SV40 (NLS SV-40), присоединенный как по N-, так и по С-концу. Высокое содержание основных аминокислот в составе NLS SV-40 предположительно способствует первоначальному взаимдоействию пептида с клеточной мембраной и накоплению его на поверхности бислоя, что ранее было показано как для антимикробного пептида меллитина, так и для пептидов, способных проникать в клетку (cell penetrating peptide, СРР), пенетратина и Рер-1 [1-3]. Кроме того, не исключено участие положительно заряженной последовательности в процессе комплексообразования с белками за счет ионных взаимодействий. Наряду с катионными производными был получен анионный аналог, а также производные с модифицированным N-концом последовательности грамицидина А с целью изучения влияния подобных изменений на способность транспортировать белки в клетку. Для изучения взаимодействия пептида с клеточной мембраной был синтезирован флуоресцентно-меченный положительно заряженный аналог.

Во второй части были исследованы инофорные свойства новых производных грамицидина А и формирование положительно заряженными Cys-содержащими производными олигомерных трансмембранных проводящих структур, отличающихся от классических димеров голова-к-голове, характерных для природного грамицидина А.

В заключительной части была изучена способность полученных аналогов транспортировать функционально активные белки через клеточную мембрану. В качестве модельных белков были использованы как флуоресцентные (GFP, родамин-меченный BSA), так и белки, обладающие ферментативной активностью (р-галактозидаза, пероксидаза). На основе количественной оценки трансдукции р-галактозидазы из всего ряда производных грамицидина А был выбран один из наиболее активных аналогов (Р10С) и проведено его сравнение с известным из литературных данных пептидом Рер-1. Был также исследован токсический эффект, оказываемый на клетки несколькими химерными пептидами и показано, что Р10С нетоксичен в интервале концентраций, применяемых для трансмембранного переноса белков. Для наиболее активных аналогов было исследовано также взаимодействие пептид/белок, приводящее к комплексообразованию.

Часть /. Литературный обзор Глава 1. Грамицидин А

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Стоилова, Татьяна Борисовна

Выводы

1) Синтезирована серия химерных пептидов на основе антибиотика грамицидина А и сигнала ядерной локализации вируса БУ40.

2) Показана способность полученных пептидов образовывать проводящие структуры в модельных липидных бислоях.

3) Показана способность химерных пептидов образовывать комплексы с различными белками за счет нековалентных взаимодействий. На примере белка р-галактозидазы продемонстрировано сохранение функциональной (ферментативной) активности белка при образовании нековалентных комплексов с пептидом.

4) На ряде белков показана способность химерных пептидов доставлять белки внутрь эукариотических клеток в составе нековалентных комплексов, с сохранением при этом функциональной активности белков.

5) Исследовано влияние на трансдукцию таких факторов, как наличие в последовательности пептида положительно заряженного домена, сульфгидрильной группы, И-концевых модификаций, а также инвертирование последовательности N1^. Для одного из наиболее активных пептидов полученной серии подобраны оптимальные условия трансдукции на различных линиях эукариотических клеток, показано отсутствие токсичности в диапазоне рабочих концентраций, а также показана его более высокая эффективность по сравнению с описанным в литературе пептидным вектором Рер-1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Стоилова, Татьяна Борисовна, 2008 год

1. Weller, K., Lauber, S., Lerch, M., Renaud, A., Merkle, H.P., Zerbe, O. (2005) Biophysical and biological studies of end-group-modified derivatives of Pep-1. Biochemistry. 44, 15799-15811.

2. Mozsolits, H., Wirth, H.J., Werkmeister, J., Aquilar, M.I. (2001) Analysis of antimicrobial peptide interactions with hybrid bylayer membrane systems using surface plasmon resonance, Biochim. Biophys. Acta. 1512, 64-76.

3. Wallace, B.A. (1990) Gramicidin channels and pores. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 127-157.

4. Myers, V.B., Haydon, D.A. (1972) Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. II. The ion selectivity. Biochim. Biophys. Acta. 274, 313-322.

5. Doebler, J.A. (1999) Gramicidin toxicity in NG108-15 cells: protective effects of acetamidine and guanidine. Cell Biology and Toxicology. 15, 279-289.

6. Mukherjee, P.K., Paulus, H. (1977) Biological function of gramicidin: studies on gramicidin-negative mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 780-784.

7. Sarkar, N., Langley, D., Paulus, H. (1977) Biological function of gramicidin: Selective inhibition of RNA polymerase. PNAS. 74, 1478-1482.

8. Veatch, W.R., Fossel, E.T., Blout, E.R. (1974) The Conformation of Gramicidin A. Biochemistry.13, 5249-5256.

9. Duax, W.L., Pletnev, V., Burkhart, B. M. (2003) Mechanism of ion transport and gating in gramicidin nanotubes. J.Mol.Struc. 647, 97-111.

10. Veatch, W. R., Blout, E.R. (1974) The aggregation of gramicidin A in solution. Biochemistry. 13, 5257-5263.

11. Wallace, B.A. (1986) Structure of Gramicidin A. Biophys. J. 49, 295-306.

12. Mondal, S., Ghosh, S. (2001) Gramicidin A and its complexes with Cs+ and T1+ ions in organic solvents A study by steady state and time resolved emission spectroscopy. J.Photochem. Photobiol. B. 60, 12-24.

13. Fossel, E.T., Veatch, W.R., Ovchinnikov, Y.A., Blout, E.R. (1974) A 13C Nuclear Magnetic Resonance study of gramicidin A in monomer and Dimer Forms. Biochemistry. 13, 5264-5275.

14. Galbraith, T.P., Wallace, B.A. (1998) Phospholipid chain length alters the equilibrium between pore and channel forms of gramicidin. Faraday Discuss. Ill, 159-164.

15. Braco, L., Abad, C., Campos, A., Figueruelo, J.E. (1986) Time-Dependent monomerization of gramicidin A, enhanced by phosphatidylcholine in non-polar solvents. A HPLC and spectro-fluorometric study. J.Chromatogr. 353,181-192.

16. Salom, D., Abad, C (1996) Chromatographic purification and characterization of the synthetic tryptophan-substituted gramicidin A analogs. J. Chromatogr. A. 725,315-322.

17. Chen, Y., Wallace, B.A. (1997) The effects of calcium ions on double helical forms of gramicidin. Eur.Biophys.J. 26, 299-306.

18. Nekrasov, A.N., Stepanov, A.V., Timofeev, V.P. (1995) The features of the spatial structure of the gramicidin A-cesium complex. FEBS Lett. 371, 35-38.

19. Sychev, S.V., Sukhanov, S.V., Barsukov, L.I., Ivanov, V.T. (1996) Structural

20. Polymorphism of Gramicidin A Channels: Ion Conductivity and Spectral

21. Studies. J.Pept.Sci. 2, 141-156.

22. Burkhart, B.M., Li, N., Langs, D.A., Pangborn, W.A., Duax, W.L. (1998) The conducting form of gramicidin A is a right-handed double-straned double helix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 12950-12955.

23. Pascal SM, Cross TA. (1992) Structure of an isolated gramicidin A double helical species by high-resolution nuclear magnetic resonance. J Mol Biol. 226, 1101-1109.

24. Pascal SM, Cross TA. (1993) High-resolution structure and dynamic implications for a double-helical gramicidin A conformer. J Biomol NMR. 3, 495-513.

25. Urry, D.W. (1971) The gramicidin A transmembrane channel: a proposed <L,D) helix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68, 672-676.

26. Arseniev, A.S., Barsukov, I.L., Bystrov, V.F., Lomize, A.L., Ovchinnikov Yu.A. (1985) H-NMR study of gramicidin A transmembrane ion channel. FEBS Lett. 186, 168-174.

27. Ketchem, R.R., Hu, W., Cross, T.A. (1993) High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid state NMR. Science. 261, 1457-1460.

28. Nachliel, E., Gutman, M., Even Zohar, L. (1995) Time resolved measurements of a single proton diffusing in the Gramicidin A channel. Solid State Ionics. 77, 79-83.

29. Suchyna, T.M., Tape, S.E., Koeppe, R.E., Andersen, O.S., Sachs, F., Gottlieb, P.A. (2004) Bilayer-dependent inhibition of mechanosensitive channels by neuroactive peptide enantiomers. Nature. 430, 235-240.

30. Sychev, S.V., Barsukov, L.I., Ivanov, V.T. (1993) The double 7i7i5,6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes. Eur Biophys J. 22, 279-288.

31. Kota, Z., Pali, T., Marsh, D. (2004) Orientation and lipid-peptide interactions of gramicidin A in lipid membranes: polarized attenuated total reflection infrared spectroscopy and spin-label electron spin resonance. Biophys. J. 86, 1521-1531.

32. Greathouse, D.V., Hinton, J.F., Kim, K.S., Koeppe, R.E. (1994) II Gramicidin A/Short-chain phospholipids dispersions: chain length dependence of gramicidin conformation and lipid organization. Biochemistry. 33, 4291-4299.

33. Salom, D., Perez-Paya, E., Pascal, J., Abad C. (1998) Environment- and sequence-dependent modulation of the double-stranded to single-stranded confonnational transition of gramicidin A in membranes. Biochemistry. 37, 14279-14291.

34. Killian, J. A., de Kruijff, B. (1985) Thermodynamic, motional, and structural aspects of gramicidin-induced hexagonal HII phase formation in phosphatidyletanolamine. Biochemistry. 24, 7881-7890.

35. Killian, J.A., Timmermans, J.W., Keur, S., de Kruijff, B. (1985) The tryptophans of gramicidin are essential for the lipid structure modulating effect of the peptide. Biochim Biophys Acta. 820, 154-156.

36. Hladky, S.B., Haydon, D.A. (1972) Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. I. Studies of the unit conductance channel.Biochim Biophys Acta. 274, 294-312.

37. Woolley, G.A., Wallace, B.A. (1992) Model ion channels: gramicidin and alamethicin. J Membr Biol. 129, 109-136.

38. Allen, T.W., Andersen, O.S., Roux, B. (2004) On the importance of atomic fluctuations, protein flexibility, and solvent in ion permeation. J Gen Physiol. 124, 679-690.

39. Andersen, O.S. (1983) Ion movement through gramicidin A channels. Interfacial polarization effects on single-channel current measurements. Biophys J. 41, 135-146.

40. Bechinger, B. (1997) Structure and functions of channel-forming peptides: Magainins, Cecropins, Melittin and Alamethicin. J. Membrane Biol. 156, 197211.

41. Bamberg, E., Lauger, P. (1973) Channel formation kinetics of gramicidin A in lipid bilayer membranes. J Membr Biol. 11,177-194.

42. Bamberg, E., Lauger, P. (1974) Temperature-dependent properties of gramicidin A channels. Biochim Biophys Acta. 367, 127-133.

43. Andersen, O.S., Koeppe, R.E. (2007) Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 107130.

44. Rudnev, V.S., Ermishkin, L.N., Fonina, L.A., Rovin, Yu.G. (1981) The dependence of the conductance and lifetime of gramicidin channels on the thickness and tension of lipid bilayers. Biochim Biophys Acta. 642, 196-202.

45. Mobashery, N., Nielsen, C., Andersen, O.S. (1997) The conformational preference of gramicidin channels is a function of lipid bilayer thickness .FEBS Lett. 412, 15-20.

46. Purrucker, O., Hillebrandt, H., Adlkofer, K.} Tanaka, M. (2001) Deposition of highly resistive lipid bilayer on silicon-silicon dioxide electrode and incorporation of gramicidin studied by an impedance spectroscopy. Electrochim. Acta. 47, 791-798.

47. Bosscha, M.I., van Dissel, J.T., Kuijper, E.J., Swart, W., Jager, M.J. (2004) The efficacy and safety of topical polymyxin B, neomycin and gramicidin for treatment of presumed bacterial corneal ulceration Br. J. Ophthalmol. 88, 25-28.

48. Couzos, S., Lea, T., Mueller, R., Murray, R., Culbong, M. (2003) Effectiveness of ototopical antibiotics for chronic suppurative otitis media in Aboriginal children: a community-based, multicentre, double-randomised controlled trial. MJA. 179,185-190

49. Bourinbaiar, A.S., Coleman, C.F. (1997) The effect of gramicidin, a topical contraceptive and antimicrobial agent with anti-HIV activity, against herpes simplex viruses type 1 and 2 in vitro. Arch. Virol. 142, 2225-2235.

50. Vives, E. (2005) Present and future of cell-penetrating peptide mediated deliveiy systems: "is the Trojan horse too wild to go only to Troj?" J.Control.Release. 109, 77-85.

51. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J.Biol.Chem. 272, 16010-16017.

52. Derossi, D, Joliot, A.H., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444 10450.

53. Elliott, G., O'Hare P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by a herpes virus structural protein. Cell. 88, 223-233.

54. Elmquist, A., Lindgren, M., Bartfai, T., Langel, U. (2001) VE-cadherinderived cell-penetrating peptide, pVEC, with carrier functions. Exp.Cell Res. 269, 237244.

55. Pooga, M., Hallbrink, M., Zorko, M., Langel, U. (1998) Cell penetration by transportan. FASEB J. 15, 1451-1453.

56. Wyman, T.B., Nicol, F., Zelphati, O., caria, P.V., Plank, C., Szoka, F.C.J. (1997) Design, synthesis and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers. Biochemistry. 36, 3008-3017.

57. Morris, M.C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. (2001) A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nature Biotechn. 19, 1173-1176.

58. Rousselle, C., Clair, P., Temsamani, J., Scherrmann, J.M. (2002) Improved brain delivery of benzylpenicillin with a peptide-vector-mediated strategy. J. Drug Targeting. 10, 309-315.

59. Mazel, M., Clair, P., Rousselle, C., Vidal, P., Scherrmann, J.M., Mathieu, D., Temsamani, J. (2001) Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anticancer Drugs. 12, 107-116.

60. Morris, M.C., Vidal, P., Chaloin, L., Heitz, F., Divita, G. (1997) A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 25, 2730-2736.

61. Chaloin, L., Morris, M.C., Van Mau, N., Mery, J., Divita, G., Heitz, F. (1999) Synthetic primary amphipathic peptides as tools for the cellular import of drugs and nucleic acids. Curr.Topics Pept. Protein Res. 3, 153-162.

62. Soomets, U., Lindgren, M., Gallet, X., Hallbrink, M., Elmquist, A., Balaspiri, L., Zorko, M., Pooga, M., Brasseur, R., Langel, U. (2000) Deletion analogues of transportan. Biochim.Biophys. Acta. 1467, 165-176.

63. Rittner, K., Benavente, A., Bompard-Sorlet, A., Heitz, F., Divita, G., Brasseur, R. (2002) New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in-vitro and in-vivo. Mol.Ther. 5, 104-114.

64. Sheldon, K., Liu, D., Ferguson, J., Gariepy, J. (1995) Loligomers: design of de novo peptide-based intracellular vehicles. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 92, 20562060.

65. Fernandez-Carneado, J., Kogan, M.J., Castel, S., Giralt, E. (2004) Potential peptide carriers: amphipathic proline-rich peptides derived from the N-terminal domain of gamma-zein. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 43, 1811-1814.

66. Takeshima, K., Chikushi, A., Lee, K-K., Yonehara, S., Matsuzaki, K. (2003) Translocation of analogues of the antimicrobial peptides Magainin and Buforin across human cell membranes. J.Biol.Chem. 278, 1310-1315.

67. Lindgren, M, Hallbrink, M, Prochiantz, A., Langel, U. (2000) Cell-penetrating peptides. Trends Pharmacol Sci. 21, 99-103.

68. Deshayes, S., Morris, M.C., Divita, G., Heitz, F. (2005) Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell.Mol.Life Sci. 62, 1839-1849.

69. Dietz, G.P.H., Bahr, M. (2004) Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach. Mol. Cell. Neurosci. 27, 85-131.

70. Frankel, A., Pabo, C. (1988) Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193.

71. Green, M., Loewenstein, P. (1988) Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat trans-activator protein. Cell. 55, 1179-1188.

72. Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore, C., Chen, L.L., Pepinsky, B., Barsoum, J. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc.Natl.Acad.Sci. 91, 664-668.

73. Torchilin, V.P., Levchenko, T.S., Rammohan, R., Volodina, N., Papahadjopoulos-Sternberg, B., D'Souza, G.G.M. (2003) Cell transfection in vitro and in vivo with nontoxic TAT peptide-liposome-DNA complexes. PNAS. 100, 1972-1977.

74. Jo Hot, A.H., Triller, A., Volovitch, M., Pernelle, C., Prochiantz, A. (1991) Alpha-2,8-polysialic acid is the neuronal surface receptor of antennapedia homeobox peptide. New Biol. 3, 1121-1134.

75. Prochiantz, A. (1999) Homeodomain-derived peptides. Ann. N Y Acad. Sci. 886, 172-179.

76. Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J.Biol.Chem. 271, 18188-18193.

77. Derossi, D., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1998) Trojan peptides: The penetratin system for intracellular delivery. Trends Cell Biol. 8, 84-87.

78. Allinquant, B., Hantraye, P., Mailleux, P., Moya, K., Bouillot, C., Prochiantz, A. (1995) Down regulation of amyloid precursor protein inhibits neurite outgrowth in vitro. J.Cell.Biol. 128, 919-927.

79. Pooga, M., Soomets, U., Hallbrink, M., Valkna, A., Saar, K., Rezaei, K. ect. (1998) Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo. Nat.Biotechnol. 16, 857-861.

80. Villa, R., Folini, M., Lualdi, S., Veronese, S., Daidone, M.G., Zaffaroni, N.2000) Inhibition of telomerase activity by a cell-penetrating peptide nucleic acid construct in human melanoma cells. FEBS Lett. 473, 241-248.

81. Ford, K., Darling, D., Souberbielle, B., Farzaneh, F. (2000) Protein transduction: a new tool for the study of cellular ageing and sequence. Mech. Ageing Dev. 121, 113-121.

82. Phelan, A., Elliot, G., O'Hare, P. (1998) Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22. Nat.Biotech. 16, 440-443.

83. Dilber, M.S., Phelan, A., Aints, A., Mohamed, AJ., Elliot, G., Smith, C.I., O'Hare, P. (1999) Intercellular delivery of thymidine kinase prodrug activating enzyme by the herpes simplex virus protein, VP22. Gene Ther. 6, 12-21.

84. Liu, X.H., Castelli, J.C., Youle, R.J. (1999) Receptor-mediated uptake of an extracellular Bcl-x(L) fusion protein inhibits apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 9563-9567.

85. Ye, D., Xu, D., Singer, A.U. Juliano, R.L. (2002) Evaluation for the intracellular delivery of proteins. Pharm.Res. 19, 1302-1309.

86. Richard, J.P., Melikov, K., Vives, E., Ramos, C., Verbeure, B., Gait, M.J., Chernomordik, L.V., Lebleu, B. (2003) Cell-penetrating peptides. J.Biol.Chem. 278, 585-590.

87. Lindgren, M.E., Hallbrink, M., Elmquist, A.M., Langel, U. (2003) Passage of cell-penetrating peptides across a human epithelial cell layer in vitro. Biochem.J. 377, 69-76.

88. Hallbrink, M., Floren, A., Elmquist, A., Pooga, M., Bartfai, T., Langel, U.2001) Cargo delivery kinetics of cell-penetrating peptides. Biochim.Biophys.Acta. 1515, 101-109.

89. Pooga, M., Kut, C., Kihlmark, M., Hallbrink, M., Fernaeus, S., Raid, R., Land, T., Hallberg, E., Bartfai, T., Langel, U. (2001) Cellular translocation of proteins by transportan. FASEB J. 15, 1451-1453.

90. Ryser, H.J., Shen, W.C. (1980) Conjugation of methotrexate to poly (Llysine) as a potential way to overcome drug resistance. Cancer. 45, 1207-1211.

91. Wolfert, M.A., Seymour, L.W. (1996) Atomic force microscopic analysis of the influence of the molecular weight of poly(L)lysine on the size of poly electrolyte complexes formed with DNA. Gene Ther. 3, 269-273.

92. Shen, W.C., Ryser, H.J. (1978) Conjugation of poly-L-lysine to albumin and horseradish peroxidase: a novel method of enhancing the cellular uptake of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1872-1876.

93. Midoux, P., Mendes, C., Legrand, A., Raimond, J., Mayer, R., Monsigny, M., Roche, A.C. (1993) Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells. Nucleic Acids Res. 21, 871-878.

94. Mitchell, D.J., Kim, D., Steinman, L., Fathman, C.G., Rotbard, J.B. (2000) Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers. J.Pep.Res. 56,318-325.

95. Suzuki, T., Futaki, S., Niwa, M., Tanaka, S., Ueda, K., Sugiura, Y. (2002) Possible existence of common internalization mechanisms among arginine-rich peptides. J.Biol.Chem. 277, 2437-2443.

96. Emi, N., Kidoaki, S., Yoshikawa, K., Saito H. (1997) Gene transfer mediated by polyarginine requires a formation of big carrier-complex of DNA aggregate. Biochem.Biophys.Res.Commun. 231, 421-424.

97. Singh D., Bisland S. K., Kawamura K. and Gariepy J. (1999) Peptide-based intracellular shuttle able to facilitate gene transfer in mammalian cells. Bioconjug. Chem. 10, 745-754.

98. Fischer, R., Fotin-Mleczek, M., Hu&agel, H., Brock, R. (2005) Break on through to the other side biophysics and cell biology shed light on cell penetrating peptides. ChemBioChem. 6, 2126-2142.

99. Borghouts, C., Kunz, C., Groner, B. (2005) Current strategies for the development of peptide-based anti-cancer therapeutics. J.Pept.Sci. 11, 713-726.

100. Schwarze, SR., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S.F. (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285, 1569-1572.

101. Harada, H., Kizaka-Kondoh, S., Hiraoka, M. (2006) Antitumor protein therapy; application of the protein transduction domain to the development of a protein drug for cancer treatment. Breast Cancer. 13, 16-26.

102. Harbour, J.W., Worley, L., Ma, D., Cohen, M. (2002) Transducible peptide therapy for uveal melanoma and retinoblastoma. Arch.Ophtalmol. 120, 713-720.

103. Phelan, A., Elliot, G., O'Hare, P. (1998) Intracellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22. Nat.Biotechnol. 16, 440-443.

104. Datta, K., Sundberg, C., Karumanchi, S.A., Mukhopadhyay, D. (2001) The 104-123 amino acid sequence of the beta-domain of von Hippel-Lindau gene product is sufficient to inhibit renal tumor growth and invasion. Cancer Res. 61, 1768-1775.

105. Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L., Wang, X. (2000) Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-depepndent casapase activation by eliminating IAP inhibition. Cell. 102, 33-42.

106. Snyder, E.L., Dowdy, S.F. (2004) Cell penetrating peptides in drug delivery. Pharm.Res. 21,389-393.

107. Fluda, S., Wick, W., Weller, M., Debatin, K.M. (2002) Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL- or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo. Nat.Med. 8, 808-815.

108. Mai, J.C., Mi, Z., Kim, S-H., Ng, B., Robbins, P.D. (2001) A pro-apoptotic peptide for the treatment of solid tumors. Cancer Res. 61, 7709-7712.

109. Hareda, H., Hiraoka, M., Kizaka-Kondoh, S. (2002) Antitumor effectof TAT-oxigen-dependent degradation-caspase-3 fusion protein specifically stabilized and activated in hypoxic tumor cells. Cancer Res. 62, 2013-2018.

110. Kilic, E., Dietz, G.P.H., Hermann, D.M., Bhr, M. (2002) Intravenous TAT-Bcl-xL is protective after middle cerebral artery occlusion in mice. Ann.Neurol. 52,617-622.

111. Asoh, S., Ohtsu, T., Ohta, S. (2000) The super anti-apoptotic factor BclxFNK constructed by disturbing intramolecular polar interactions in rat Bcl-xL. J.Biol.Chem. 275, 37240-37245.

112. Aarts, M., Liu, Y., Liu, L., Besshoh, S., Arundine, M., Gurd, J.W., Wang, Y.T., Salter, M.W., Tymianski, M. (2002) Treatment of ischemic brain damage by perturbing NMDA receptor-PSD-95 protein interactions. Science. 298, 846850.

113. Kilic, U., Kilic, E., Dietz, G.P.H., Bahr, M. (2003) Intravenous TAT-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in mice. Stroke. 34, 1304-1310.

114. El-Andaloussi, S., Holm, T., Langel, U. (2005) Cell-penetrating peptides: mechanisms and applications. Current Pharm. Design. 11, 3697-3611.

115. Futaki S, Suzuki T, Ohashi W, Yagami T, Tanaka S, Ueda K, Sugiura Y. (2001) Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem. 276, 5836-5840.

116. Oren, Z., Shai, Y. (1998) Mode of action of linear amphipaphic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers. 47, 451-463.

117. Matsuzaki, K., Yoneyama, S., Miyajima, K. (1997) Pore formation and translocation of melittin. Biophys. J. 73, 831-838.

118. Zhang, W., Smith, S.O. (2005) Mechanism of penetration of Antp(43-58) into membrane bilayers. Biochemistry. 44, 10110-10118.

119. Fotin-Mleczek, M., Fischer, R., Brock, R. (2005) Endocytosis and Cationic Cell-Penetrating Peptides A Merger of Concepts and Methods. Current Pharmaceutical Design. 11, 3613-3628.

120. Ferrari, A., Pellegrini, V., Arcangeli, C., Fittipaldi, A., Giacca, M., Beltram, F. (2003) Caveolae-mediated internalization of extracellular HIV-1 tat fusion proteins visualized in real time. Mol.Ther. 8, 284-294.

121. Waida, J. S., Stan, R. V., Dowdy, S. F. (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-iusion proteins after lipidraft macropinocytosis. Nat. Med. 10, 310-315.

122. Drin, G., Cottin, S., Blanc, E., Rees, A.R., Temsamani, J. (2003) Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides. J.Biol.Chem. 278,31192-31201.

123. Fittipaldi, A., Ferrari, A., Zoppe, M., Arcangeli, C., Pellegrini, V., Beltram, F., Giacca, M. (2003) Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J.Biol.Chem. 275, 34141-34149.

124. Orlandi, P.A., Fishman, P.H. (1998) Filipin-dependent inhibition of cholera toxin: evidence for toxin internalization and activation through caveolae-like domains. J.Cell.Biol. 141, 905-915.

125. Wang, L. H., Rothberg, K. G., Anderson, R. G. (1993) Miss-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals a regulatory switch for coated pit formation. J. Cell. Biol. 123,1107-1117.

126. Clague MJ, Urbe S, Aniento F, Gruenberg J. (1994) Vacuolar ATPase activity is required for endosomal carrier vesicle formation. J.Biol.Chem. 269,21-4.

127. Araki, N., Johnson, M.T., Swanson, J.A. (1996) A role for phosphoinositide 3-kinasein the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. J.Cell Biol. 135, 1249-1260.

128. West, M.A., Bretscher, M.S., Watts, C. (1989) Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. J.Cell.Biol. 109, 2731-2739.

129. Silhol, M., Tyagi, M., Giacca, M., Lebleu, B., Vives, E. (2002) Different mechanisms for cellular internalization of the HIV-1 Tat-derived cell penetrating peptide and recombinant proteins fused to Tat. Eur.J.Biochem. 269, 494-501.

130. Tyagi, M., Rusnati, M., Presta, M, Gíacca, M. (2001) Internalization of HIV-1 Tat requires cell surface heparin sulfate proteoglicans. J.Biol.Chem. 276, 32543261.

131. Deshayes, S„ Heitz, A., Morris, M. C., Charnet, P., Divita, G., Heitz, F. (2004) Insight into the mechanism of internalization of the cell-penetrating carrier peptide Pep-1 through conformational analysis. Biochemistry. 43, 1449-1457.

132. Henriques S.T., Castanho, M.A.R.B. (2004) Consequences of nonlytic membrane perturbation to the translocation of the cell penetrating peptide Pep-1 in lipidie vesicles. Biochemistry. 43, 9716-9724.

133. Rothbard, J.B., Jessop, T.C., Lewis, R.S., Murray, B.A., Wender, P.A. (2004) Role of membrane potential and hydrogen bonding in the mechanism of translocation of guanidinium-rich peptides into cells. J.Am.Chem.Soc. 126, 9506-9507.

134. Herce, H.D., Garcia, A.E. (2007) Molecular dynamics simulation suggest a mechanism for translocation of the HIV-1 TAT peptide across lipid membranes. PNAS. 104, 20805-20810.

135. Henriques, S. T., Meló, M. N., Castagnho, M. A. R. B. (2006) Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399, 17.

136. Palm, C., Netzereab, S. and Hallbrink, M. (2006) Quantitatively determined uptake of cell-penetrating peptides in non-mammalian cells with an evaluation of degradation and antimicrobial effects. Peptides. 27, 1710-1716

137. Davies, M.J. (2004) Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochem. Photobiol. Sci. 3, 17-25.

138. Szabo, G., Urry, D.W. (1979) N-acetyl gramicidin: single-channel properties and implications for channel structure. Science. 203, 55-57.

139. Pujáis, S., Fernandez-Carneado, J., Lopez-Iglesias, C., Kogan, M.J., Giralt, E. (2006) Mechanistic aspects of CPP-mediated intracellular drug delivery: relevance of CPP self-assembly. Biochim. Biophys. Acta. 1758, 264-279.

140. Apell, H.J., Bamberg, E., Alpes, H., Lauger, P. (1977) Formation of ion channels by a negatively charged analog of gramicidin A. J. Membr. Biol. 31, 171-188.

141. Rokitskaya, T.I., Kotova, E.A., Antonenko, Y.N. (2003) Tandem gramicidin channels cross-linked by streptavidin. J. Gen. Physiol. 121, 463-476.

142. Antonenko, A.Y., Rokitskaya, T.I., Kotova, E.A., Reznik, G.O., Sano, Т., Cantor, C.R. (2004) Effect of streptavidins with varying biotin binding affinities on the properties of biotinylated gramicidin channels. Biochemistry. 43, 45754582.

143. Hladky, S.B., Haydon, D.A. (1984) Ion movements in gramicidin channels. Curr. Top. Membr. Transport. 21, 327-372.

144. Антоненко, Ю.Н., Котова, E.A., Рокицкая, Т.Н. (2005) Фотодинамическое воздействие как основа релаксационного метода изучения грамицидиновых каналов. Биол. Мембраны. 22, 275-289.

145. Vives, Е., Richard, J.-P., Rispal, С., Lebleu, В. (2003) Tat peptide internalization: seeking the mechanism of entry. Current Prot. Pept. Sci. 4,1-8.

146. Henriques, S.T., Costa, J., Castanho M.A.R.B. (2005) Translocation of galactosides mediated by the cell-penetrating peptide Pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44, 10189-10198.

147. Carey, J. (1991) Gel retardation. Methods Enzymol. 208, 103-117.

148. Park, S., Raines, R.T. (1997) Green fluorescent protein as a signal for proteinprotein interactions. Prorein Science. 6, 2344-2349.

149. Wagstaff, K.M., Dias, M.M., Alvisi, G., Jans, D.A. (2005) Quantitative Analysis of protein-protein interactions by native Page/Fluorimaging. J. Fluoresc. 15, 469-73.

150. Muller, P., Rudin, D.O., Tien, H.T., Wescott, W.C. (1963) Methods for the formation of single biomolecular lipid membranes in aqueous solution. J.Phys.Chem. 67, 534-535.

151. Huamin, J., Ci, Z., Hui, S.,Yong, L., Huijun, Q., Bingyan, Z. (2002) Determination of pretransplant viability of leydig cells by MTT colorimetric assay. Transplantation Proceedings. 34, 3419-3421.

152. Abe, K., Matsuki, N. (2000) Measurement of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction activity and lactate dehydrogenase release using MTT. Neurosci.Res. 38, 325-329.