Роль поазмалеммы в регуляции ионного состава протоплазмы у галофильных водорослей Dunaliella тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Медведев, Александр Владимирович

• Медведев, Александр Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Медведев, Александр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Влияние солей на активность ферментов in vitro у растений галофитов и гликофитов

1.2. Концентрации Na+ и К+ в протоплазме растительных клеток.

1.3. Транспорт катионов через плазмалемму растительной клетки.

Глава П. ОБЪЕКТЫ-И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава HI. ДЕЙСТВИЕ FaCl НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

ВОДОРОСЛЕЙ DUWALIELLA IN VIVO И IN VITRO

Глава 1У. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ На+И К+ МЕЖДУ КЛЕТКАМИ И ВНЕШНЕЙ СРЕДОЙ.

Глава У. ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ (К+, Na+, Н+) ЧЕРЕЗ ПЛАЗМА

ЛЕММУ ВОДОРОСЛЕЙ DMALIELLA

5.1. Поглощение ионов калия и эффект валиномицина.

5.2. Выведение Na+ из протоплазмы и транспорт

5.3. Влияние ингибиторов мембранных АТФаз (уабаин, ДЦКД, п-ХМБ), протонофора КЦХФ и pH на транспорт катионов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль поазмалеммы в регуляции ионного состава протоплазмы у галофильных водорослей Dunaliella»

Проблема устойчивости растений к высокому содержанию солей в среде является одной из актуальных проблем современной фитофизиологии; Малопригодные для возделывания культурных растений засоленные почва занимают значительную часть нашей планеты. (Строгонов,1962,1973). Современные гидромелиоративные методы далеко не всегда позволяют в достаточной степени снизить засоленность почвы. Вследствие этого особое значение приобретает изучение механизмов солеустойчивости. Знание этих механизмов позволит разработать эффективные агротехнические приемы, и применять, их для повышения урожайности в условиях засоления, а также целенаправленно проводить селекцию для выведения новых солеустойчивых сортов;

Первые систематические исследования в области солеустойчивости были проведены- Баталиным (1875), который исследовал анатомо-морфологические изменения, возникающие в растениях при засолении.

Измерения содержания ионов в тканях показали, что различные растения по-разному реагируют на увеличение концентрации соли в среде. Растения одной: группы при засолении поглощают значительные количества ионов. Другие поддерживают низ-кии уровень засоляющих ионов в тканях. И, наконец, существуют растения» способные выделять избыток солей, поступающих из-почвы, цри помощи специальных желез , выводить их через корни или сбрасывать листья, нагруженные солями (Рихтер, 1927 ; Келлер,1951 ; Генкель,1954 ; Строгонов,1962 и. др.). Строгоновым (1962,1973) было установлено, что соли оказывают не только осмотическое, но и токсическое действие на растения. Поступление ионов из почвы, и: накопление их в тканях до высоких концентраций может щ)ивесш к нарушении метаболизма и гибели, растений. Это явилось важным этаном в- исследованиях по физиологии соле-устойчивости и дало начало новому направлению, — изучению нарушений метаболизма, а также выяснению биохимических механизмов солеустойчивости (Строгонов,1962,1973 ; Строгонов и др.,1970 ; Flowers et al., 1977 ; Шевякова, 1979 ; Greenway, Munns, 1980; Jefferies, 1981)» Наряду о токсическим эффектом была дрка-зана специфичность действия различных ионов на растения (Строгонов Д962,1973 ; Строгонов & др; ,1970); Вопросы же, связанные со способностью растений выводить избыток солей во внешнюю среду (то есть с ионным транспортом) и поддерживать содержание засоляющих ионов в тканях на низком уровне, стали привлекать внимание исследователей лишь в самое последнее время; Работы, выг-полненные в. этой области, свидетельствуют о важной роли ионно-транспортных процессов в защите растений от действия засоляющих ионов (Воробьев и др. ,1974; Захарин, 1980Д985);

Большое число работ, же связанных непосредственно с изучением солеустойчивости, но касающихся мембранных ионно-транспортных цроцессов, служит убедительным свидетельством в пользу необходимости исследования функций клеточных мембран при засолении; Данные,, полученные в. основном на гликофилышх растениях, показали, что ионный состав протоплазмы контролируется, плазма-лемма является в высшей степени чувствительной к внешним воздействиям и создает регулируемый барьер для поступления в протоплазму различных веществ; Мембраны, контролируют постоянный обмен энергией и веществом и осуществляют генерирование ионных градиентов за счет энергии метаболизма (Нобел,

1973 ; Вахмистров,Мазель,1973 ; Кларкеон,1978 ; Люттге, Хигинбо-« тамД984);

Особый интерес представляют механизмы, ионного транспорта у галофильных растений; Работ в этой области выполнено немного. Согласно имеющимся сообщениям, параметры активного транспорта ионов у гликофитов и галофитов различаются (Karlson, Kylin, 1974; Hull, Epstein, 1978 ; Мишустина и' др. Д979), давая возможность предположить более высокую эффективность поддержания ионного гомеостаза в клетках последних;

Уникальным объектом для изучения механизмов устойчивости к высокому содержанию солей, в среде являютс® одноклеточные зеленые водоросли рода Dunaliella V В число видов, этого рода входят морские водоросли, и крайние галофилы. Отсутствие у них клеточной стенки, и центральной вакуоли значительно облегчает измерение ионных потоков через плазмалемму и концентраций ионов в. протоплазме.

В связж с вышеизложенным в работе были поставлены следующие задачи; а) сравнительное изучение метаболической активности in vivo п in vitro у различающихся по солеустойчивости видов

Dunaliella salina и D.maritima при различных концентрациях Nací в. среде (в качестве показателя метаболической активности in vivo использовали интенсивность фотосинтеза; in vitro - скорость реакции Хидла) б) исследование зависимости концентраций ионов Иа+ и к+ в протоплазме у этих же водорослей от концентрации Nací во внешней среде ; в) изучение ионно-транспортных. функций плазматической мембраны Dunaliella (измерение потоков ïïa+ , К* и Б* ж ие~ ч следование действия различных факторов, и ингибиторов на транспорт этих ионов);

В результате проведенной работы показано, что солеустой-чивость галофильных водорослей в значительной степени определяется свойствами плазмалеммы. Регуляторная роль этой мембраны состоит в поддержании концентрации ионов Жа+ в протоплазме на относительно низком уровне. Это осуществляется путем выведения На+ из протоплазмы во внешнюю среду против градиента электрохимического потенциала при функционировании протонного насоса; н!"-насос генерирует градиент электрохимического потенциала протонов, на плазмалемме С дучН^*) и На+ выводится из протоплазмы через плазмалемму путем, ионно-обменной диффузии • СЫТ- Яа антипортер) за счет энергии Эффективность поддержания ионного гомеостаза у растений, отличающихся по солеустойчивости, различна.

Г JE А В А I

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I.I. Влияние солей на активность ферментов in vitro у, растений галофитов и гликофитов

Хорошо известно, что многие галофиты. при увеличении содержания соли в среде накапливают значительные количества ионов в тканях. При этом реакции обмена веществ и физиологические функции поддерживаются на высоком уровне. Не наблюдается также снижение роста и развития. Более того, у некоторых из них присутствие солей во внешней среде стимулирует эти процессы. (Рихтер,1927 ; Генкель,1954 ; Строгонов, 1962,1973).

Такого рода исследования стаж отправным пунктом для поиска биохимических адаптации в клетках галофитов. Ожидалось, что макромолекулы, (белки, нуклеиновые кислоты: и прочие), осуществляющие процессы метаболизма и являющиеся его участниками, должны быть специфическим образом модифицированы и приспособлены. к высокому содержанию ионов в протоплазме» которое предполагалось для клеток галофитов; Это означало, что соле-устойчивость галофитов определялась бы биохимическими адапта-циями, то есть способностью модифицированных макромолекул эффективно осуществлять, функции в условиях окружения с высоким содержанием ионов. Ярким примером таких адаптации являются белки: галобактерии, характеризующиеся высоким содержанием глкь таминовой и аспарагиновой аминокислот и вследствие этого несущие отрицательный заряд. Эти белки могут нормально функционировать только в присутствии высоких концентраций солеи (Brown, 1964 ; Lara en, 1967 ; Хочачка,Самеро,1977 ; КашнерД981);

Одним из подходов к исследованию биохимических механизмов устойчивости является сравнительное изучение влияния солей на активность ферментов in vitro , выделенных из различающихся по солеустойчивости растений. Для многих ферментов галофи-тов показано, что in vitro они обладают такой же чувствительностью к ионам, как к аналогичные ферменты гликофильных растений, Ашшвности малат дегидрогеназы, аспарат трансамина-зы, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы: и изоцитрат дегидрогеназы, выделенных из галофитов. Atriplex spongiosa и Salicornia australis , а также из гликофита Phaseolus vulgaris , в одинаковой степени снижались при концентрациях КаОХ в реакционной среде свыше 100 мМ ( Greenway, Osmond, 1972). В дальнейшем подобные результат были получены для многих других ферментов, выделенных- из различающихся по солеустойчивости растений С Flowers, 1972а,Ъ ; Flowers, Hall, 1973 ;Flowers et al., 1976,1977).

В. некоторых случаях чувствительность ферментов, выделенных из гликофитов, была более высокой, чем у аналогичных ферментов галофитов. Так, активность in vitro пероксисомной гликолат оксидазы. из солеустойчивого растения Salicornia europeau снижалась в несколько меньшей степени в присутствии NaCl , чем ИЗ неустойчивого Pisum sativum (Austerfeld, 1976) ; активность малат дегидрогеназы. из более солеустойчивого Spartina aiterniflora слабее подавлялась под влиянием ЖаС1 , чем из менее солеустойчивого Spartina patens ( Get-tys et al., 1980). Однако, следует отметить, что эти различия не были существенными.

В ряде работ было исследовано влияние Na+ на функции выделенных ферментов прж концентрациях, близких к содержанию этих- ионов в среде культивирования или клеточном соке. Активности in vitro глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и малат де~ гидрогеназЫ: из галофита Suaeda maritima с содержанием в клеточном соке 800 мМ, выращенном при концентрации NaOl в среде 340 мМ, подавлялась на 60-70% в присутствии 333 мМ NaCl в реакционной среде ( Flowers, 1972а). Снижение активности различных ферментов галофитов в, опытах in vitro при концентрациях. UaCl , близких к содержанию этой соли в среде культивирования, отмечается и во многих других работах ( Flowers, 1972b,1974; Flowers, Hall, 1973 ; Flowers et al.,X977; Greenway, Osmond, 1972 ; Greenway, Sims, X974; Ben-Amotz, Avron, 1972 ; Kalir, Polijakoff-Meyber, 1975 ; Austerfeld, 1976); Результаты, полученные на ферментах, выделенных из листьев, галофильных растений (см,обзор Flowers et al., 1977), свидетельствуют, что активность in vitro большинства из них снижается приблизительно на 50% в присутствии üaGl в концентрации, соответствующей средней концентрации ионов Иа+ в листьях. Однако, ряд ферментов оказался "устойчивым" к NaCl i их активность не снижалась, либо снижалась лишь незначительно, при увеличении концентрации соли до 1,0-2,0 М. Примером могут служить пероксидаза и лейцинами-нопептидаза из галофитов Spartina alterniflora и s.patens ( Gettys et al., 1980) и пероксидаза из галофита Halimione portucaloides ( Polijakoff-МеуЪег,1982 ; Kalir,Polijakoff-Meyber, 1983), но сравнение с аналогичными ферментами, выделенными из гликофильных растений не проводилось. В отличие от ферментов галофильных растений, "солеустойчивые" ферменты растений являются лишь "устойчивыми"» на не нуждающимися в соли» Они могут проявлять высокую активность in vitro и цри достаточно низких концентрациях: ионов С^ ЮО мМ), оптимальных или. близких к оптимальным концентрациям для функционирования подавляющего большинства ферментов у растений (Flowers et al., 1977 ; Greenway, Munns, 1980).

В ряде экспериментов in vitro установлено увеличение активности ферментов растений щж внесении ионов в реакционную. среду". Скорость ферментативной реакции с участием малат дегидрогеназы. из Suae da maritima возрастала при увеличении концентрации UaCl в среде, достигая максимума при 50 мМ. Такими же свойствами обладала малат дегидрогеназа из Pisum sativum (Flowers et al., 1976); Аналогичный эффект наблю* дался й: на других ферментах, изолированных из растений с различной степенью солеустойчивости С Greenway, Osmond, 1972 ; Borowitzka, Brown, 1974; Kalir, Polijakoff-Meyber, 1975).

Результат приведенных исследований in vitro свидетельствуют о различной чувствительности разных ферментов к NaCi ; Активность многих из них: начинала снижаться при внесении в. среду соли уже в миллимоларных концентрациях (Evans, Sorger, 1966), другая группа ферментов имела максимум активность в. области 50-Ю0 мМ HaCl (малат дегидрогеназа, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа и. др.), третьи проявляли высокую активность даже в присутствии 1-2 М цаС1(пероксидаза и др.). Однако, не было установлено существенных различий в чувствительности к соли ни в одной из этих, групп в том случае, если сравнивались аналогичные ферменты, выделенные из различающихся по солеустойчивости растений. Ферменты; выделенные из галофитов и гликофитов, сход

- IXHEIM образом реагировали на внесение соли в среду. Эти данные тем не менее не сложат свидетельством против наличия у гало-фит ов: биохимических адаптации, реализующихся на уровне внутриклеточных макромолекул» Во-первых» в опытах in vitro невозможно смоделировать с достаточной степенью приближенности то сложное окружение, в условиях которого функционируют белки в клетках'» Во-вторых, низкой скорости некоторых ферментативных реакций, наблюдающейся в присутствии солей in vitro , может оказаться достаточной для осуществления интегральных функций растения — нормального роста и развития; Специфические биохи- , мические адаптации у галофитов, по-видимому, имеют место и вероятно могут быть обнаружены; цри использовании других подходов. В чем они проявляются? На сегодняшний день невозможно дать определенный ответ. Во всяком случае, маловероятно, что они заключаются в пониженной солечувствительности внутриклеточных белков;

Методом выявления адаптации на биохимическом уровне может служить исследование функций органелл in vitro в присутствии NaCl : органеллы- представляют собой сложные ферментативные комплексы, осуществляющие, интегральные биохимические функции на уровне клетки. К сожалению, число таких данных крайне ограничено. Скорости поглощения кислорода и фосфорили— рования митохондриями, выделенными из галофита Suae da maritima и гликофита Pisum sativum t в одинаковой степени подавлялись при концентрациях Па01 свыше 100 мМ ( Flowers et al.,1976). Включение лейцина, в белок в экстракте разрушенных клеток Suaeda maritima , выращенных в присутствии 340 мМ NaCl , снижалась, на 80% при внесении в инкубационный раствор

200 мМ HaCl ш KCI ( Hall, Flowers, 1973). На основании этих результатов можно предположить, что в клетках, накапливающих соли галофитов, ионы компартментализованьи Это позволяет внутриклеточным биохимическим механизмам галофитов функционировать в. сходных условиях с аналогичными механизмами у гликофитов"*'

Г.2. Концентрации Ка+ и ff в протоплазме растительных клеток

Измерения содержания ионов в клетках показали, что пресноводные водоросли (табл.1) и высшие растения — гликофиты (табл.2) обладают способностью контролировать ионный состав: протоплазмы.

При культивировании водорослей и выращивании растений в условиях, близких к естественным, содержание ионов, в протоплазме у разных видов, составляет величины» лежащие в пределах от I до 80 мМ для На+ и от 80 до 200 мМ для К+; Исключением является водоросль Chlamydomonas moeawusii (20 мМ К*) . Концентрация На в протоплазме у цресноводных водорослей и высших растений - гликофитов как правило на 1-2, a К* - на 2-3 порядка выше, чем во внешней среде.

0 способности растений регулировать ионный состав црото-плазмы свидетельствуют измерения концентраций в клетках пресноводных водорослей при различных концентрациях соли в наружном растворе»1 Содержание На+ в протоплазме Scenedesmus Obtusiuseulus (табл.1) поддерживается на уровне 30-35 мМ при изменении содержания этого иона во внешней среде; Однако, постоянство концентрации На+ в протоплазме поддерживается в относительно узком интервале наружных, концентраций На+ : приблизительно от 0,1 до Ю мМ. Аналогичный результат был получен на Anacystis midulana (табл.1);

Таблица 1

Концентрации: Na+ и К4" в цротоплазме пресноводных. водорослей

Объект

Концентрация f Концентрация в среде, мМ г в протоплазме мМ

КГ I т+

I к+ Т

Источник

На"1 I

Г !

Nitella trans-lucena

Héflexilis

H.mucronata

N.opaca U.pulchella

Chara corra-lina

Hydrodictyon africanum

Anacystis nidulans

Chlamydomonas moeswusii o,i 1,0 120 54 MacRobbie,1962

0,1 1,0 119 14 Spanswick,

Williams,1964

0Д 1,0 93 37 Spanswick et al.,1567

0,075 0,2 93—125 0-18 KisÜimoto, Tazawa,19o5

0,075 0,5 80 3 Tazawa,1972

0,070,09 0,70,9 78 2 Tazawa et al*, 1974

0,096й 88* Хитjob t Воробьев,

0,096K 78*

0,070,09 0,20*9 101 9 Tazawa et al., 1974

0,096я 115* Vorobiev,1967

0,075 0,5 128 10 Tazawa, 1972

0,070*09 0,70,9 112 28 Tazawa et al., 1974 o,r 1,0 93 51 Raven,1967

21 1,3 149 1Д Dewar,Barber, 1973

6,6 0,4 20 1,4 Ronkin,Bure t z, продолжение таблица I

I T 2 ~T~ ! 1 3 Í • 4 i • 5 !. 6

Tolypella 0,4 1,0 87-97 4-22 Larkum.1968 intricata

Chlorella 6,5 1,0 HO 1,1 Barber, 19б8а pyrenoidosa ^^ JP

Soenedesmus 0,1 6,09 20 40 Erdei,Cseh, obtusiuseulus 6,09 o,r 65 30 1971

6,09 6,09 70 35

Chlorella 0,0 7,0 28 98 Shleh, Barber, pyrenoidosa * 9 1971 o,i 6,9 76 51

1,0 6,0 163 4,1

3,0 4,0 173 3;2

10,0 4,0 162 3,2

• 50,0 4,0 174 4^2

100,0 4,0 172 2,4

Anacystis 0,0 40,0 73 Г? De war, nidulans 5,0 35,0 8 Barber,1973

97

15,0 25,0 125 15

25,;0 15; 0 121 5

40,0 0,0 123 2 ж активность ионов. KÍ", измеренная Ks-cелективным микроэлектродом

Повышение концентрации Nad в питательном растворе от I до 30 мМ приводило к. накоплению 1Та+ в протоплазме клеток корней кукурузы. С Zea mays ) от 15 до 50 мМ (табл*2). По-видимому, значение 30 мМ лежит за пределами концентрационного диапазона líaGl , в котором поддерживается постоянство концентраций На+ в протоплазме этих клеток»

Таблица 2

Концентрации. ш+ ж KÍ" в протоплазме высших растений т—-----------т--------------J: Концентрация { Концентрация |

• 4-, n^otro */гМ • т-> гтлтлппоочо •

Объект в среде, мМ }в протоплазме, , источник }-1-1-Ш-? к+ Ца+ к+ На+ |

Beta vulgaris (корнеплод)

Bordeim vulgare корни)

Pisum sativum (апикотиль)

Avena sativa Гколеоптиль)

I 10

10 L

58-86

2,5 7,5 102

10

169

170

150-205 99—108

Pitman,1963 Pitman. i

70 Saddler,1967

Macklon,Higin-botham,1968

Pierce,Higin-12-76 botham,1970

Davis,Higin-botham,1976

Zea mays (корни) lErianea bogo

ЙИЙЬе корневые 0,1 волоски) вакуолизж-рованные корневые волоски) 0,1

1,0 10,0 30,0

97:

Э£Э£

I093SS

15,0 35,6 50,8

Davis, ¿Га vors -ki,1979

Мельников и ДР1., 1974

Злотникова, Вахмистров, 1982 х

- значения концентраций вычислены. Пирсом и Хигинботамом (1970) по экспериментальным данным указанных авторов, ш- активность ионов К4", измеренная К^-селективным микро-электродом1;

О регуляции ионного состава протоплазмы свидетельствуют также эксперименты* в которых: варьировали содержание в среде К+, переносу которого через мембраны часто сопутствует транспорт Na+ . Изменение содержания К* в среде у Chlorella руге-noidoaa от I ДО 100 мМ И у Scenedesmus obtusiuseulus ОТ 0,1 до 6,1 мМ практически: не влияло на содержание На+ в протоплазме» Однако при исключении К* из среды внутриклеточный Kj у этих: водорослей частично замещался На+ (табл.1). Многократное повышение концентрации К* в наружном растворе практически: не влияло на концентрацию этого иона в протоплазме у

Chlorella pyrenoidosa (табл.1) и клеток эпикотиля гороха (табл.2);

Таким образом, высшие растения - гликофиты, и пресноводные водоросли способны: поддерживать концентрации Na+ ж К^ В- цротоплазме на некотором постоянном уровне (обычно более высоком, чем во внешней среде) , при изменении концентрации солей в. наружном растворе; Эти изменения, однако, не должны выходить за некоторые пределы; Верхней границей для некоторых пресноводных водорослей является концентрация ПаС1 порядка 10 мМ;

При более высоком содержании. UaCl в среде наблюдается увеличь чение содержания Na в протоплазме. Для разных растений значения, определяющие эту верхнюю границу внешних концентраций солей, по-видимому, могут в значительной степени различаться» Данных по содержанию ионов в протоплазме морских водорослей сравнительно немного .(табл.3); Существенным их отличием от высших растений - гликофитов и пресноводных, водорослей является способность поддерживать, более низкую концентрацию ионов Иа+ в протоплазме (25-82 мМ), чем во внешней, среде (300-500мМ).

Концентрация к!" у них в протоплазме в десятки, раз выше, чем снаружи» У некоторых морских водорослей. (I группа - Ьатрго-Шатпз-ит , &г1ГГЗЛаМ.а ) она практически такая же,как у пресноводных водорослей и высших растений - гликофитов (120170 мМ), у других (П группа - Рогрйуга , Chaвtomorpha , Уа1от.а , AcetaЪularia ) намного выше (400-500 мМ).

Таблица 3

Концентрации На* и К+ в протоплазме, морских водорослей

------—г---------—----г--------------Т"

Концентрация \ Концентрация } рв среде,. мМ ;в протоплазме,; , д. ' мМ г

Объект

Источник

Na+ } к! I Па+ [

Porphyra perforata 12 500 482 51 Eppley,1958

Chaetomorpha darwinii 13 500 541 25 Dodd et al., 1966

Valonia ventricosa II 485 434 40 Gutknecht, 1966

Acetabularia mediterranea 10 470 400 57 Saddler,1970a

Lamprothamnium suecincturn 6 289 II9-I69 40-82 Kishimoto, Tazawa,1965

Griffitshia 6,8s 470 153й Yorobiev,1967 х - активность ионов К*, измеренная К^-селективным микроэлектродом

Данные о способности этих водорослей поддерживать кон + центрации ионов в протоплазме На и. К- на постоянном уровне практически отсутствуют;

Вследствие высокого содержания солей в среде важное значение для морских водорослей приобретает осморегуляция - процессг имеющий в. ряде случаев прямую связь с регуляцией ионного состава клеток; Исследования указывают на два типа веществ., за счет изменения концентрации которых регулируется внутреннее осмотическое давление, у галофильных растений; с помощью неорганических ионов или органических соединений - продуктов метаболизма (Рихтер,1927 ; Генкель,1954 ; Строгонов,1962 ; Спек-торов,Строгонов,1979). В связи с этим отметим, что у морских водорослей первой группы сумма концентраций Иа+ и К+ в протоплазме намного, ниже, чем во внешней среде; у водорослей второй группы [1Та++ К+Э в протоплазме и в среде приблизительно равны, как. это наблюдается у галофильных бактерий (табл.4)V Можно предположить, что у первых' осмотический баланс поддерживается соединениями органической природы, у вторых - ионами.

В соответствии с этим могут существовать два пути адаптации растений к высокому содержанию Nací Б среде обитания. В первом случае осморегуляция с помощью соединений органической природы, позволяет поддерживать концентрацию ионов в протоплазме на низком уровне, сходным с содержанием ионов в. протоплазме гликофитов. Солеустойчивость таких растений в. первую очередь, должна определяться функцией плазмалеммы. и других мембран клетки. Мембраны создают барьер для поступления ионов в протоплазму и/или обеспечивают выведение из протоплазмы избытка ионов;

Во втором случае, вероятно, концентрация ионов, в протоплазме растет с увеличением содержания соли во внешней среде, при атом, сохраняется ассиметрия распределения ионов: концентрация на в протоплазме постоянно ниже, чем в среде, а К* -выше; Солеустойчивость в таком случае будет связана со способностыо клетки осуществлять реакции метаболизма в условиях высокого содержания ионов в протоплазме, как это наблюдается j галофилъыых бактерий (см.1.1);

Таблица 4

Внутриклеточные концентрации ионов у различных бактерии С Christian, Walhto, 1962)

Организм т Концентрация в среде} Внутриклеточная кон-мМ f центрация, мМ

Негалофиты

Staphylococcus aureus

Salmonella oranienburg

Умеренные галофиты

KCI

25 25

HaCl

T" ! г

150 150

680 239

Г" т

Ка"1

98 131

Micrococcus 4 halоdenitrifi cans

Vibrio costicolus ^

1000 1000

474 221

311 684

Крайние галофиты

Sarcina 32 morehuae

Halobacterium 32 salinarium

4000 4000

2030 4570

3170 1370

В отношении водорослей — крайних галофитов, способных существовать при гораздо более высоких концентрациях солей, чем в морской воде, данные по содержанию и регуляции ионов в протоплазме немногочисленны и противоречивы. Согласно Ван

Аукену и МакНильти, концентрация Па+ в протоплазме гало-фильного штамма chlamydomonas sp. увеличивалась от 100 до 800 мМ при изменении концентрации НаС1 в среде от 1,0 до 5,0 М» тогда как Окамото и Сузуки нашли, что этот вид обладает способностью поддерживать содержание На* в протоплазме на уровне приблизительно 100 мМ при изменении наружной концентрации Nad от 0,3 до 2,5 М (табл.5);

Таблица 5

Концентрации ионов На+ и К+ в клетках водорослей

- крайних галофнтов

1 Водоросль Концентрация в среде, мМ ¡Внутриклеточная } j концентрация,мМ \ • • Источник

KÍ 1 На+ • I KÍ у

Chlamydomonag ар. 2,2 2,2 1000 5000 70 ПО 100 800 Van Anken, McíTulty, 19б9

- 5002500 40 80-170 Okamoto, Suzuki,19б4

Dunalieila parva - 750 45 260-340 Gimmler, S chirling,19 78

1400 94 590-800

I 1581 40 516-760

1501 81 492 25-27

До данным Латорелла и Вадаса, содержание ионов Па+ в клетках: Dunalieila tertiolecta не зависело от концентрации Nací в среде культивирования, изменявшейся в диапазоне 0,53,5 М ( Latorella, Vadas, 1973). В то же время, согласно Гиммлеру ж Ширлингу, внутриклеточная концентрация На+ у Dunaliella parva росла с увеличением наружной концентрации NaCl (табл.5). Различие в результатах, полученных разными авторами, могут быть отнесены к погрешностям измерений, возникающих вследствие методических трудностей, связанных с высоким содержанием HaGl в. среде. Эти различия, по-видимому, связанные с особенностями использованных разными авторами методов, обсуждаются в главе 1У;

Таким образом, вопрос о внутриклеточных концентрациях ионов и их. регуляции у водорослей — крайних галофитов остается открытым. Имеющиеся данные свидетельствуют как в пользу, так и против Способности галофитов поддерживать концентрации ионов в. протоплазме на постоянном уровне при изменении концентрации соли в среде.

• Транспорт катионов через плазмалешу растительной клетки.

При исследовании механизмов солеустойчивости одно из первостепенных значений приобретает вопрос о существовании ионно-транспортных систем, участвующих в переносе ионов через клеточные мембраны. Наличие таких систем может быть определено с помощью критерия Нернста. Для этого измеряют активности иона по разные стороны, мембраны А? и А* , снаружи и ввутри соответственно, и вычисляют равновесный потенциал Нернста по формуле: о Л1 L . о* яг о А*

А, где и - газовая постоянная, I - температура по шкале Кельвина, р - постоянная Фарадея, 2,3 ит/Р ~ 58,2 мВ при 20°С или 59,2 мВ при 25°С, заряд Zj - +1 для одновалентных катионов. Полученная величина сравнивается со значением трансмембранного электрического потенциала, которое определяется экспериментальным путем! при. помощи микроэлектродной техники С Spans-wick et al., 1964,1967 ; Spanswick, 1970 ;Kishimoto et al., 1965; Gutknecht, 1966 ; Vorobiev, 1967 ; Raven, 1967 Harber, 1968a ; Macklon, Higinbotham, 1968 ; Saddler, 1970Ь ; Хит-ров,Воробьев,1971; Pindlay et ai.t 1971; Вахмистров и др;, 1974 ; Мельников и др.,1974; Mertz, Higinbotham, 1976 и др;),' по распределению проникающих ионов С Komor, Tanner, 1976 ; Reed, Collins, 1981a) или по распределению калия после индуцирования К^-проницаемости плазмалеммы валиномицином С Dewar, Barber, 1973)". Измерение потенциала вышеперечисленными методами дает значения Е^ на плазмалемме, которые колеблятся для разных: растений в пределах от -40 до -200 мВ (минус внутри клетки). и

При равенстве Е^ = делается: вывод, что ион 3 находится в. равновесии (то есть распределен диффузионно). Если Е^. о более отрицателен, чем то электрохимический градиент, для катионов направлен из протоплазмы в среду, в случае Ew. боо лее положительного, чем — в противоположном направлении; Неравновесное распределение ионов в стационарном состоянии (то есть в отсутствии чистых: потоков ионов через мембрану) является основанием, для предположения о наличии транспортной системы, переносящей данные ионы, против, градиента электрохимического потенциала за счет энергии метаболизма (Dainty, 1962 ; Gutknecht, 1970 ; Нобел,1973 ; Кларксон,1978 ; Люттге,Хигинботам,1984) .

Так как измерение активности ионов, в протоплазме сопряжено со значительными техническими трудностями, и большинство применявшт методов дает величину концентрации ионов, то вместо активностей в формулу (1.1) обычно подставляют значения концентраций в протоплазме о^ и среде С°1 ; предполагая, что разлио , А чие между отношением концентраций с . / о1. и отношением i J D активностей /А ^ незначительно;

Такие оценки были проведены для многих, пресноводных и некоторых морских водорослей,, а также высших, растений. Было показано, что в большинстве случаев ионы натрия активно выводятся из протоплазмы в. среду и в вакуоль и никогда не транспортируются активно, в. противоположном направлении ( MacRobbie, 1962 ; 1974; Spanswick, Williams, 1964; Spanswick et ali9ß7 ; Gutknecht, 1966 ; Dodd et al., 1966 ; Pitman, Saddler, 1967 ; Raven, 1967 ; Barber, 1968a; Pierce, Higinbotham, 1970 « Higinbotham, 1973 ; Dewar, Barber, 1973 ; lefferies, 1973 ; Poole, 1978; Pennarum et al., 1978 ; Reed, Collins, I98lb ; Tefferies, Reid, 1984).

ENk чаще всего незначительно отличается от то есть ионы KÎ* находятся в состоянии, близком к равновесному (Poole, 1966,1974Д976 ; Vorobiev, 1967 ; Pitman et al., 1969 ; Хитров, ВоробьевД971 ; Higinbotham, 1970 ; MacRobbie, 1971Д974 ; Spanswick,1972 ; Красавина,Выскребенцева,1972 ; Dewar,Barber, 1973 ; Вахмистров и др. Д974 ; Davis, Higinbotham, Х976 ; Pennarum et al, 1978; Barabanshikov, Mazel, 1983); Незначительный градиент электрохимического потенциала К+ может быть направлен как из протоплазмы, в, среду ( MacRobbie, 1962 Д971, 1974; Spanswick, Williams, 1964 ; Spanswick et al., 1967 «Dodd et al., 1966 ; Gutknecht, 1966 ; Raven, 1967 ; Pitman,Sadd~ 1er, 1967 ; Barber, 1968a ; Macklon, Higinbotham, 1970 ;

Pierce, Higinbotham, 1970 ; Красавина,ВыскребенцеваД972 ;

- 24 ~

Gol- jqoxv . Barabanshikov, Mazel, 1983), так и в про-тивопшюкнсм направлений С Foole, I9Q6,I9?4,I976 ; saddler, 1970а; Higinbotham, 1973 ; Новак,Иванкина,1378 ; Contardi, Davis, 1978 ; Воробьев,1979,1980 ; Barabanshikov, Mazel, 1983 ; 2Tefferies, Reid, 1984)v В первом случае К+ поступает из среды: в протоплазму активно, во втором — по градиенту электрохимического потенциала; Плазмалемма более проницаема для К^чем для других ионов ( Walker, Норе, 1969 - Higinbotham, 1973 ; Raven, 1976 ; Pitman, 1976 V Юрин ж др. ,1977) и. К"!", таким образом, является основным потенциал-определяющим ионом. Это

ТЛ+ и означает, что даже в отсутствии равновесия для ионов КГ Е k лишь незначительно отличается от í^ (Воробьев ,1979,1980)v

Изучение механизмов ионного транспорта указывает на существование в растительных клетках электрогенных насосов,осуществляющих обмен одновалентными катионами, и генерацию мембранного электрического потенциала за счет энергии метаболизма: различные воздействия, тормозящие процессы обмена веществ (длительная затемненность, темнота, в отсутствие 0g, различные ингибиторы);, могут снижать скорость обмена, ионов между растительной клеткой и внешней средой и приводить, к деполяризации пдазмалеммк ( Higinbotham, 1970 ; Raven, i976 ; Кларксон, 1978; ЛюттгеДигинботам, 1984). При этом наблюдалась корреляция между скоростью транспорта ионов и ион-стимулируемой ШФазной активностью плазматических мембран ( Lai, Thompson, 1972-; Leigh, Wyn Jones, 1975 ; Maori, Vianello, 1981; O'Heill, Spanswick, 1984) , а также эндогенным уровнем ЖФ ( Lüttge, Ball, 1976 ; Tazawa et al., 1979 ; Shimmen, Tazawa, 1980);

Транспорт Na+ из протоплазмы во внешнюю среду часто сопряжен с поглощением К^ растительной клеткой:, исключение К+ из среды, культивирования приводит к накоплению На+ в протоплазме С Barber, I96Öb ; Shieh, Barber, 1971 ; Dewar, Barber, 1973 ; Erdei, Oseh, 1971) , внесение К* в инкубационную среду вызывает поглощение его растениями и индуцирует отток Па как из нормальных. (Barber, 1968b ; Raven, 1967 ; íeschke, 1972, 1977), так и нагруженных iía+ клеток ( Shieh,Barber, 1971; Barber, Shieh, I972,I973a,I973b ; Jeschke, 1977,1979,1980), действие ряда факторов в одинаковой степени тормозит оба потока — КГ?" в протоплазму ц На из протоплазмы, в среду (Raven, 1967 ; Shieh, Barber, 1971 ; Barber, Shieh, 1972 ; Ehrenfeld, Cousin, 1982),

Приведенные данные побудили исследователей искать у растений ионный насос, аналогичный Иа+-К+ транспортной Al Фазе животных клеток. Этот транспортный механизм, локализованный в плазмалемме, осуществляет перенос К* из среды, в протоплазму и одновременно иа+~ в противоположном направлении за счет энергии АТФ. Сердечный гликозид уабаин блокирует его работу.

Для функционирования этого насоса необходимо наличие экзоген

2+ ного К+, эндогеншшГа+ , Mg И АТФ ( Whittarn, 1962 ; Lowe, 1968) # При наличии такого насоса в клетках, растений одновременно решалась бы задача выведения На4* и поглощения К*.

Исследования, проведенные на выделенных из высших: растений мембранных фракциях, обогащенных плазмалеммой, показали, что Mg2+ —зависшая.АтФазная активность увеличивается при внесении в реакционную среду К* и на* ( Kylin, Gee, 1970 ; Lai,

Thompson, 1972; Leonard, Hodges, 1973; Leonard, Hotchkis, 1976,1978; Karlson, Kylin, 1974; Sillivan, Volcani, 1974 ; Leigh, Wyn Tones, 1975 ; Тихая и др.,1976 ; Hodges, 1976 ;

Sze, Hodges, 1977 ; McNulty, 1978 ; Мишустина ж да ,1978; Богданова,МоскалюкД 979 ; Lurie, Hendrix, 1979 ; Kasamo, 1979 ; TiKhaJa et al., 1983; Batov, Tikhaja, 1983 ; O'Neill, Spanswick, 1984 ; Вахмистров и др. ,1964 ; Imbrie, Murphy, 1984) . В некоторых экспериментах- активация этой .АТФазы ионами К* и На+ была синергической ( Karlson, Kylin,x974; Sullivan, Volcani, 1974 ; Тихая к др; ,1976 ; McWulty, 1978 ; Митустина и др. ,1979 ; Богданова,Москашок, 1979). Фермент обладал высокой специфичностью к ЖФ С Karlson, Kylin, 1974; Kasamo, 1979 ; Hodges, 1976 ; McNulty, . 1978; Sullivan, Volcani, 1974; Вахмистров и др*Д984; Imbrie, Murphy, 1984)V Уабаин в. ряде опытов снижал величину потоков на плазмалемме: KÎ в клетку и На+ из клетки ( MacRobbie, 1962; Raven, 1967 ; Cram, 1968 ; Красавина,Выскребенцева, 1972) и. подавлял Na+ f Kj-активируемую AT Фазу препаратов плазмалеммы (Боулинг и. др. ,1972 ; Тихая и др., 1976 ; Мишустина и др.Д979 ; Tikhaja et al., 1983). Однако в большинстве случаев, уабаин был неэффективен, либо его влияние было незначительным как. на ионные потоки ( Dodd et al., 1966 ; Pitman, Saddler, 1967 ; Raven, 1971a ; Rylova et al, 1972; Jeschke, 1973 ; Pitman, 1976 ; Pennarum et al., 1978 ; Davis, Javorski, 1979), так и на Ж Фазную, активность плазматических мембран (Leonard, Hodges, 1973; Sullivan, Volcani, 1974; Hodges, 1976 ; Левченко,Палладина,1979 ; Богданова,Москашок, 1979 ; Tikhaja et al., 1983; Batov, Tikhaja, 1983 ; Вахмистров и др. ,1984); Величина мембранного электрического потенциала под действием уабаина изменялась несущественно (contardi, Davis, 1978)'.

Мишустина с соавт.(1979) и Тихая с coaBT.(Tikhaja et al.,

- - 27

1983) провели сравнительные исследования действия уабаина на ион-зависимую AT Фазную активность мембранных, фракций, выделенных из различающихся по солеустойчивости растений: галофита Haiocnemum Strobilaceum ж гликофитов Hordeum vulgare (более солеустойчивый) и Zea mays {менее солеустойчивый). Авторы пришли, к заключению, что Na+ -К+ AI Фаза тем активнее, чем выше солеустойчивость растений. Пул ( Poole, 1978) и Палладина, Левченко (1979) выдвинули предположение за Na+-Kt AI Фазе, как о ферменте, функционирующем только в клетках галофитов;

Работы* выполненные в последние годы показали, что в ионном транспорте у растений существенную роль играет протонный насос, выводящий if-ионы из протоплазмы, во внешнюю среду ( Pitman, 1970,1976 ; Spanswick, 1972 ; Raven, Smith, 1974 ; Smith, Raven, 1976,1979; Poole, 1978; Pitman et al., 1975 ; Лялин, 1979 ; Воробьев, 1979,1980 ; Полевой,Саламатова, 1979,1980 ; Бобров И др.,1979 ; Holland, Barr, 1982 ; O'Neill, Spanswick, 1983,

1984), для работы которого требуется наличие эндогенного АТФ ( Tazawa et al., 1979 ; Калинин и Дф*,1979 ; Stammen, Tazawa, 1980) ПИОНОВ Mg+ ( Stout, Cleland, 1981 ; O'Neill,Spanswick, 1983,1984). ïïf-насос активируется шд действием одновалентных катионов,, в наибольшей степени К* ( Pitman, 1970 ; Pitman et aL, 1975 ; Калинин и др.,1979)]; Stout, Cleland, 1981 ; Glass, Siddiqi, 1982 ; Palladina, 1У83 ; ïunes et al., 1983; O'Neill, Spanswick, 1984) и подавляется некоторыми ингибиторами мембранных А1Фаз, в частности ДЦКД (Калинин, и др. ,1979 ; stout,

Cleland, 1981 ; DuPont et al., I9SL ; O'Neill, Spanswick, 1984) И ортованадатом ( stout, Cleland, 1981 ; O'Neill,Spanswick, 1983,1984)♦ Функционирование HÎ-помпы. приводит к гиперполщшзации мембраны: (мембранный электрический потенциал становится более отрицательным, по сравнению с диффузионным) ( Pallarghy, Luttge, 1970 ; Pitman, 1970 ; Spanswick, 1972 ;

Poole, 1976,1978; Smith, Raven, 1979 ; Stout, Cleland, 1981) и генерируется цротонный электрохимический градиент ¿yü Б* на мембране ( Smith, Raven, 1979 ; Калинин и др. Д979; Stout, Oleland, 1981). Транспорт других ионов, а также незаряженных веществ может осуществляться за счет энергии электрического потенциала или концентрационного* градиента протонов ( Raven, Smith, 1974; Smith, Raven, 1976,1979 ; Воробьев, 1979,1980); Вследствие гиперполяризации плазмалеммы, вызванной транспортом Н* из протоплазмы во внешнюю среду, создается движущая сила для поглощения ионов ; при гиперполяризации возникает электрохимический градиент этого иона, направленный из среды в клетку ( Роо1еД976Д978;В©робьевД979Д980; Colombo et al., 1981).

В отношении связи транспорта На с работой протонного насоса, число исследований крайне ограничено; Следует отметить работы» выполненные на корнях ячменя ( Ratner, Jacoby, 1976 ; Jeaohke, 1980) и на бактериях ( banyi, 1982). Эти авторы выдвинули предположение, что На+ может выводиться из протоплазмы. в среду сопряженно с потоком Н* в клетку путем ионно-обменной диффузии (Н*- На+ антипортер);

0 связи работы. н!"-насоса с другими ионно-транспортными процессами свидетельствуют эксперименты с фузикокцином. Это соединение активирует работу, if-помпы ( Marre, 1979); вызывая повышение кислотности внешней среды С Lado et al.,' 1976а, b ) и гиперполяризацию плазмалеммы С Coccuci et al,, 1976 ; Bates, Goldsmith, 1983; Bates et al.t 1981); не влияя при этом на электрическую проводимость мембраны ( Bates,Goldsmith, 1983). Внесение фузикокцина в среду усиливает поглощение Н* (pitman et al., 1975 ; Lado et al., 1976,а,Ъ ; Bates et al., I98I.; Kaiser et al., 1982), выведение Ha+ в среду из протоплазмы ( Lado et al., 1976b),активирует «ВДКД.чувствительную АТФазу в мембранной фракции, обогащенной плазмалеммой (Marre, 1979)'.'

Таким образом, несмотря на широко проводимые исследования в области ионного транспорта, механизмы, трансмембранного переноса катионов остаются в значительной степени неизученными. Наибольший интерес представляет изучение транспортных систем Иа+ , играющих, по-видимому^ важную роль в солеустойчи-вости растений.

Наличие Н^-насоса, генерирующего дуй if на плазмалемме, можно считать доказанным для гликофитов, однако остается неясным существование его в. клетках галофитов. Наряду с Bf-пом-пой (или вместо нее) у галофильных растений может функционировать ш+-К+ АТФаза. Следует учитывать, что на+ может транспортироваться через мембраны, не только посредством АТФаз, на и путем ионно-обменной диффузии. Не исключено также, что у галофитов ионы !Га+ распределены равновесно между клетками и внешней средой, то есть активные транспортные системы, переносящие эти ионы, через клеточные мембраны, отсутствуют-.

ГЛАВА П ОБЪЕКТЫ К ШОДЫ ИССЛЕЩОВАНИй

Род Dunaliella характеризуется широкой экологической распространенностью и включает виды:, различающиеся по солеус-тойчивости, обитающие в морских: и континентальных водоемах (Масюк,1973); Многие из них известны как обитатели гиперга-линных водоемов:, в которых концентрация солей близка к насыщающей'» Примером могут служить солесадочные бассейны, соляных промыслов. Особенностью водорослей Dunaliella является приспособленность к нестабильному солевому режиму в; среде, то есть, способность существовать в широком диапазоне концентраций солей и выдерживать резкие колебания, внешнего осмотического давления (Масюк,1973). D.salina , например, выживает и размножается в растворах, содержащих UaCl в концентрациях от 0,5 до 5,0 М, характеризуется интенсивным ростом при 1,0-3,0 М iraci и выдерживает 4г-кратные изменения осмотического давления В: среде (1,25 =¡fc 5,0 М UaCl , 55 220 атм.) ( Marre et al., 1958). Опыты, по культивированию, водорослей Dunaliella показали, что они хорошо- растут при высоких концентрациях не только NaCl f Но ж других натриевых солей (Na2so4, мго3 )» Замена солей натрия в культуральной среде солями других металлов, в. значительной, степени подавляет рост ЭТИХ водорослей ( McLachlan, I960 ; Johnson et al., 1968);

Электронно-микроскопические исследования показали, что морские ж крайне галофильные виды Dunaliella структурно организованы подобно большинству эукариотических растительных клеток; Значительную часть передней половины клетки занимает ядро; В клетках содержатся также аппарат Гольда, митоховдрии, зндоплазматический ретшкулум, разнообразные включения: капли масла* различные глобулы и др. Как у всех фотосинтезирующих эукариотов, у водорослей Dunaliella имеются хлоропласт о двумя фотосистемами. В каждой клетке содержится один чашевидный хлоропласт, занимающий до 50$ объема всей клетки ( Trezzi et ai., 1964а ; Масюк, 1973 ; ВладимироваД978). Отличительной чертой водорослей является отсутствие деллюлозно-пектиновой клеточной стенки и центральной вакуоли. Эти особенности делают их удобным объектом для исследования функций плазмалеммы, связанных со способность© выживать в условиях высокого содержания солей в среде; Отсутствие клеточной стенки и тонопласта. упрощает методические подходы и исследования транспорта ионов через плазмалемму.

Клетки Dunaliella обладают набором ферментов и в них протекают реакции метаболизма, типичные для основного обмена веществ у растений (Johnson et al., 1968; Know, Grant, 1971 ; Ben-Amotz, Avron, 1972 ; Haimer, 1973 ; Borowitzka, Brown, 1974 ; МасюкД973 ; Alyoshina, Balnokin, J983 . Адеш^ на,БаянокинДу84; Gimmler et al., 1984). Необходимо однако отметить особенность,, связанную с нестабильным осмотическим давлением в среде обитания;. I этих водорослей эффективно функционирует осморегуляторный механизм, основанный на ферментных реакциях, которые осуществляют синтез и деградацию глицерина; При изменении, осмолярности внешнего раствора клетки быстро изменяют свой объем - сокращаются при увеличении концентрации солей в среде и набухают при ее уменьшении, а затем медленно восстанавливают свои исходные размеры; Первая фаза изменения объема завершается за десятки секунд, вторая длится до трех часов ( Rabinowioh et al., 1975 ; Gimmler et al.t 1977); В первой фазе происходит быстрое поглощение или потеря воды клеткой,. что вызвано изменением водного потенциала внешней среды, во второй ~ обратное медленное, движение воды в ответ на изменение содержания осмотически активных веществ в. клетке. Основным веществом, вносящим вклад в осмотическое давление протоплазмы у Dunaliella , является глицерин. За счет синтеза или. удаления глицерина из внутриклеточного пространства происходит восстановление клеточного объема ( Ben-Amotz, Avron, 1973, 1981 ; Borowitzka, Brown, 1974 ; Ben-Amotz, 1975).

Несмотря на особенности в структуре клеток Dunaliella , облегчающие изучение регуляции ионного состава протоплазмы и механизмов ионного транспорта, число исследований такого рода крайне ограничено. Имеющиеся данные противоречивы и далеко недостаточны для расшифровки механизма солеустойчивости;

Относительно регуляции содержания ионов в протоплазме Dunaliella высказываются две точки зрения» Некоторые исследователи на основании косвенных данных пришли к выводу, что эти водоросли в ответ на увеличение содержания солей в среде накапливают ионы, во внутриклеточном пространстве до нескольких молей ( Marre et al., 1958; Marre, Sarvettaz, 1959 ; Ginzburg, 1969 ; Trezzi et al., 1965). Согласно другому взгляду,, в протоплазме водорослей Dunaliella поддерживаются относительно низкие концентрации ионов. Эта точка зрения подкрепляется экспериментами с выделенными из клеток фрагментами. Растворимые ферменты цитозоля ( Johnson et al., х968; Ben-Amotz, Avron, 1972 ; Haimer, 1973 ; Borowitzka, Brown, 1974) и стромы хлоропластов. ( Ben-Amotz, Avron, 1972), мембрашше фрагменты, хлоропластов С Ben-Amotz, Avron, 1372) и митохондриальные ферменты. С Alyoshina, Balnokin, 1983 ; Алешина, Балнокин,1984) Dunaliella в опытах in vitro проявляли высокую чувствительность к Nad , близкую к чувствительности аналогичных ферментов у гликофитов.

Не внесли ясности в. этот вопрос и измерения содержания ионов ш+ в клетках при различных: концентрациях Nací в. среде ( Latorella, Vadaa, 1973 ; Gimmler, Schirling, X978) подробнее см.1.2).

В соответствии, с этими двумя точками зрения Mappe и др.,

Гинзбург,Трэззи и. др., Гиммлер и Ширлинг постулировали ди$фу зионное распределение Na между средой и клеткой, у Dunaliе-Иа , тогда как Дкоксон и. др; г Боровитска и. Браун, Латорелла и Вадас предположили наличие насоса, с затратой энергии выводящего Na+ из клетки;

Транспорт ионов через плазмалемму Dunaliella практик чески не изучался; Некоторые публикации появились лишь в саше последние годы — после выполнения данной работы. Они будут обсуждены в. экспериментальной части работы;

В наших исследованиях были использованы два различающихся ПО. солеустойчивости вида:: морской -Dunaliella maritima Massjuk и крайне галофильный — Dunaliella salina Те od. Эти виды, значатся В; коллекции Института ботаники Ж УССР как штаммы. 18 и 10, соответственно;

Водоросли выращивали при 20°С в 2-литровых круглодонных колбах, наполовину заполненных средой,или в. I-литровых плоских, сосудах с толщиной слоя суспензии: 6 см;

Для культивирования использовали среды, следующих составов:

10 мМ KHgPO^ 200 мМ MgSO4.7E20, 50 мМ KN03 , 0,01 мМ PeS04, 0,125 мМ ЭДГА,. раствор микроэлементов (Абдуллаев,Семененко, 1974) в количестве I мл/л, 50 мМ трис-SO^ , буфер рН 7,2 (среда I) ;

100 мМ MgS04 , 5о мМ На1Т03 , 5 мМ KHgPO^ 0,01 мМ Peso^ , 0,125 мМ ЭДГА, раствор микроэлементов; (Абдуллаев,Се-мененко,1974) I мл/л, 50 мМ трис-CI буфер, рН 7,2 (среда 2) ;

2 мМ MgS04 , 4 MM MgCl2 „ 1,5 мМ Са(Н03)2 , 5 мМ КЕ^РО^, 10 мМ НаЖ>3 , 0,01 мМ PeS04 , 0,125 Mil ЭДЕА, раствор микроэлементов (Абдуллаев,Семеневко, 1974) I мл/л, 50 мМ трис-GI буфер, рН 7,2 (среда 3)»

Все среды, кроме того, содержали: для D.oafeirfcima 0,5 М, а для: D.salina 2,0 М Had .

Культуру непрерывно продували воздухом с 1,5% COg и освещали белым светом люминесцентных ламп (15000 лк) 16 часов; в сутки.

При исследовании зависимостей, скорости фотосинтеза и внутриклеточных концентраций На+ и К^ от концентрации Had в, среде водоросли культивировали, на среде I.

Для изучения влияния Had , KGI и Mgd2 на скорость выделения кислорода в. реакции Хилла водоросли выращивали на среде I или 2;

В остальных случаях была использована среда 3.

Дня сравнения действия солей на перенос электронов в хло-ропластах различающихся по солеустойчивости растений, наряду с Бодоросляли Dunaliella были использованы растения гликофита «- фасоли Phaseolus vulgaris (сорт Сакса); Их выращивали в теплице при естественном освещении в ящиках с почвой.

Для изучения влияния Had на скорость фотосинтеза, клетки осаждали центрифугированием (1000 g , 5 мин) и суспендировали в. средах, отличающихся от культуральной только концентрациями NaOl . После 4нминутной инкубации в темноте или 3-часовой на свету (для завершения осморегуляторного процесса) в средах с различными концентрациями НаС1 измеряли скорость выделения О2, освещая суспензию белым светом насыщающей интенсивности (450 тыс.эрг/см^.с).

Хлоропласт из клеток водорослей выделяли при. помощи ги-поосмотического шока. Клетки осавдали центрифугированием (1000 g , 5 мин.), один раз промывали культуральной средой и суспендировали в дистиллированной воде. Через 10 мин. инкубации в гипотонических: условиях клетки D.mari tima и через 6 мин. клетки D. salina переносили на среды:, содержащие глицерин; 3,0 M для D.salina и 1,25 M для D.maritima # Остальные компоненты, в одинаковых концентрациях для обоих видов: 1% декстран (м.в. II0000), 0,01$ бычий сывороточный альбумин (БСА), 20 мМ трис-CI буфер, рН 7,2. Хлоропласты осаждали центрифугированием (4000 g , 10 мин) ж один раз промывали в, этой же среде'» В некоторых экспериментах: для выделения, промывки ж конечного суспендировать хлоропластов D.maritima использовали среду следующего состава: 0,5 M сахароза, 1% декстран (м.в; 110000), 0,01$ БСА, 20 мМ трис-CI буфер, рН 7,2. Хлоропласты. листьев фасоли выделяли из растений 4-5-недельного возраста. Листья разрушали в гомогенизаторе в. среде, содержащей 0,5 M сахарозу, 1% декстран, 0,01$ БСА, 20 мМ трис-CI буфер, рН 7,2. Гомогенат процеживали через полотно, центрифугировали (1000 g , 2 мин) и из надосадрчной жидкости осаждали хлоропласты. (4000 g , 10 мин) . Осадок один раз цромывали и суспендировали в той. же среде. Все операции по выделению хлоропластов проводили при 2-4°С.

Влияние солей на скорость выделения кислорода в реакции Хилла изучали в средах,, содержащих I мМ K^FeCCïDg в качестве акцептора электронов, 20 мМ трис-CI буфер, рЕ 7,2, соли

HaCl , KCl, MgCl2 в концентрациях указанных на рисунках. Кроме того, реакционные среда содержали глицерин или сахарозу. В случае, если хлоропласты. выделяли- в глицериновую среду, реакционная среда содержала глицерин в концентрации 1,25 M для хлоропластов D.mari tima или 3,0 M ДЛЯ хлоропластов. D.salina . В отдельных экспериментах, что оговорено особое применяли среды. с пониженным содержанием глицерина - 1,5 M для хлоропластов. D. salina или 0,63 M для хлоропластов D .maritima . Для хлоропластов фасоли и D.maritima t выделенных в. сахарозную среду, реакционная среда содержала сахарозу в. концентрации 0,5 Mv После 20 мин. инкубации s реакционных, средах при различных концентрациях соли суспензию выделенных хлоропластов освещали белым светом насыщающей интенсивности (450 тыс;эрг/см^.с) и измеряли скорость выделения кислорода;:

Влияние глицерина на, скорость реакции Хилла исследовали в суспензии разрушенных, клеток. Клетки осаждали центрифугированием (1000 g , 5 мин) , один раз промывали средой культивирования и суспендировали в холодной (+2°С) дистиллированной воде; а

Через Ю мин. инкубации в гипотонических условиях клетки D.maritima и через 6 мин» клетки D.salina переносили на среда. с различными концентрациями глицерина, содержащими остальные компоненты в одинаковых концентрациях для обоих видов:

100 мМ НаС1 , I MM К3Ре(СН)б , 20 мМ трис-CI буфер, рН 7,2. После 20 мин, инкубации включали белый свет (450 тыс'.эрг/см^.с) и измеряли скорость выделения О2.

Содержание хлорофилла в ячейке определяли методом Арнона ( Arnon, Х949);

Измерение скорости выделения кислорода проводили амперо-метрическим методом (Балнокин, Фохт, 1977) .

Содержание На+ и К* в клетках рассчитывали по результатам измерений содержания этих-ионов в- среде и в суспензии водорослей с помощью пламенного фотометра ( Okamoto, Suzuki, 1964), Для вычисления внутриклеточных концентраций На+ и К* полученные выше величины; относили к клеточному объему.

Объем клеток определяли, по разности электропроводности суспензии и среды ( Okamoto» Suzuki, 1964).

К*-дефицитные клетки получали путем культивирования на среде 3, в которой KHgPO^ был заменен эквимолярным количеством НаН2Р0^ (среда без К+)Для этого клетки культуры с нормальным содержанием калия, отобранные на линейной фазе роста, два раза промывали средой без К* и переносили на среду без К*. В остальном К^-дефицитные клетки выращивали при таких же условиях, как и клетки с нормальным содержанием калия.

Поглощение калия водорослями измеряли двумя способами:

1) по изменению, внутриклеточных концентраций, определяемых методом Окамото и Сузуки (см.выше) ;

2) регистрируя изменение концентрации Н* в среде о помощью К^-с елективного электрода, изготовленного по шетоду Никольского и. др; (1974). Сигнал от Kf—селективного электрода по отношению к стандартному хлор-серебряному электроду подавали на вход высокоомного потенциометра ЛПУ-01 и записывался с помощью самописца TZ -21 (чсср)» Зависимость потенциала от логарифма концентрации Kt в растворе была линейной в области -1СГ1 М KCl. функция была близка к теоретической, составляя для разных, изготовленных в процессе работы, электродов, 50-58 мБ.

При изучении действия ингибиторов AT Фаз Н.и* —дицикло-гексижарбодиимида (ДЩД) и п~хлормеркурибензоата (п-ХМБ) на транспорт калия К*-дефицитные клетки дважды промывали также не содержащими К* средами, варьируя их ионный состав С NaCl заменяли на biCl и Nairo^) и суспендировали также в этих же средах;

Для индуцирования действия валиномицина на плазмалемму проводили обработку клеток. ЭДСА по методу Узста и Митчела ( West, Mitchel, 1972).

Кинетику изменения pH суспензии исследовали с помощью стеклянного электрода. ЭСЛ-63-07, рН-метра рН-121 и самописца ez -2 (чсср);

Потоки На+и К+ через плазмалемму Dunaliella maritima оценивали по содержанию этих ионов в. клетках» применяя метод быстрой отмывки изотоническим раствором, маннита (16 г/100 мл) . Для этого через определенные, интервалы времени после внесения KCl в суспензию К+~дефицитных клеток отбирали пробы, наслаивали их на раствор маннита в. центрифужной пробирке и центрифугировали (3500 g r I глин); Осадок отмытых клеток лизировали в дистиллированной воде. В полученной суспензии клеточных: фрагментов определяли содержание Иа ж К+ с помощью пламенного фотометра, которое относили к общему объему клеток в пробе;

При изучении зависимости потоков На+п К* от jp К*-дефи~ цитные клетки, выращенные на среде без К* при pH 7,2, перенос сили на среду» также не содержащие К*, но с различным pH, ис-шшьзуя 20 мМ трис- MES (морфолиноэтансульфоновая кислота) буфер. До и через 20 мин. после внесения KCl из суспензии отбирали пробы и методом быстрой отмывки определяли внутриклеточные концентрации ионов.

Содержание АИФ в клетках определяли методом, основанном на использовании А1Ф в реакции фосфорилирования З-фосфоглице-риновой кислоты (З-оЭТК) с последущим восстановлением 1,3 ШС шшотиншлидадениндинуклеатидом ) и регистрацией образовавшегося НАД по изменению оптической плотности раствора цри 365 нм С Bücher, 1947)* При этом использовали стандартные наборы. реактивов фирмы Берингер (ФЕТ); Для расчета внутриклеточных концентраций абсолютные значения А1Ф в клетках относили к клеточному объему.

ГЛАВА Ш

ДЕЙСТВИЕ НАСЪ НА ФСТОСИВТЖШЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ВОДОРОСЛЕЙ. DUUALIELLA IN VIVO И ^ VITRO

Солеустойчивость растений может определяться биохимическими адаптациями- метаболизма к высокому содержанию соли в среде обитания (см.Введение и I.I). Эффективное осуществление функций обмена веществ, при высоких концентрациях соли в клетке за счет биохимических адаптаций будет компенсировать низкий уровень регуляции, внутреннего ионного состава» Это может достигаться несколькими путями: устойчивостью структуры, макромолекул, участвующих в обмене, веществ, включением альтернативных путей в цепях метаболических реакций, синтезом защитных соединений. В противном случае в клетках галофильных растений следует ожидать, наличие мембранных, механизмов, поддерживающих ионный гомеостаз.

Идеальной моделью для исследования биохимических механизмов. устойчивости к ПаС1 могут являться клетки с интактной протоплазмой, но с модифицированными или поврежденными клеточными мембранами, в результате чего ионы иа внешней среды относительно свободно проникали бы во внутриклеточные компартменты. Сравнение действия солей на такие клетки из различающихся по с олеус т оичиьос ти растении дало бы ответ на вопрос о наличии адаптации на биохимическом уровне. В настоящее время проведение таких экспериментов не представляется возможным;

Некоторым приближением к идеальной модели являются выделенные из клеток органеллы, действие líaGl на функцию которых in vitro сравнивается с действием соли, на аналогичную функ

ЦИЮ in vivo .

В качестве такой модели в наших-.экспериментах были использованы хлороплаеты, как. ©рганеллы, осуществляющие важнейшую функцию зеленого растения ~ фотосинтез. При этом имеется возможность, сравнить, действие NaGl не только на реакцию Хилла хлоропластов. из различающихся по солеустойчивости растений, но и сопоставить, влияние соли на фотосинтетическую активность интактных клеток и выделенных хлоропластов.

Рассмотрим сначала функцию хлоропластов при действии ïïaGl на интактные клетки. Водоросли двух различающихся по солеустойчивости видов D.maritima и D.salina из своих культу-ральных сред, переносили на растворы, отличающиеся от среды культивирования только концентрациями НаС1 ; После 4-минутной инкубации в этих растворах в. темноте (завершение первой фазы осморегуляторного процесса) или трехчасовой инкубации на свету (завершение второй фазы) измеряли интенсивность фотосинтеза. Скорость фотосинтетического выделения 02, как функция концентрации ETaCl в среде, представлена на рис.1. Отличающиеся по солеустойчивости виды проявили, различное отношение к Nací . Максимумы- на кривых: при 4-минутных экспозициях показали наибольшую скорость фотосинтеза у D.salina в области 2,5-2,75 M ïïaCl » а у D.mari tima « при 0,9 M. Увеличение концентрации Nací от 0 до указанных значений ускоряло выделение кислорода. Монотонное снижение интенсивности фотосинтеза при дальнейшем увеличении содержания соли в. среде цроисходило у d.salina в интервале 3,0-5,0 M, а у D .mari tima — в интервале 1,3-2,0 М. Интенсивность, фотосинтеза у d.salina при концентрации 5,0 M составляла 33$ от максимальной, в то время как у D.maritima равнялась нулю уже при 2,0 M (рис.LA.). По данным

Гесулгс"'-"-" j

ЕПБЛПОГСЬ'Д I с с с г- « им. С. И.Яамки" Д V,.Vi* ' I * • ■. ■ . . ,

Рис;Т. Зависимость скорости фотосинтеза интактншг \ клеток водорослей ©т кощентрацш жаС1 в среде. :

А « после. 4-шнутной, инкубации клеток в: средах. с разлшним содержанием ШаС1 в темноте3, !

Б - после. З-часовоЁ инкубации клеток в средах с^а&личнш содержанием жаС1 на свету

I - Б.заИпа 2 — В.таг1^1ша ■ .

Реакционная: смесь: шс! в указанных кощент-рацщях, остальные компоненты раствора как в среде культивированш. Содержание хлорофилла О, 03-0,04 мг/млг Белый свет нас&щащей интенсивности ;

450 тыс;зрг/см^.сек)в

Бен-Амотца и Аврона (Ben-Amotz, Avron, 1972) максимальная скорость фотосинтеза у. D. parva , выделенной из Мертвого моря и культивировавшейся в среде, содержащей 1,5 M Nací , наблюдалась при концентрации Nací 2 M.

3-часовая инкубация водорослей в наших опытах привела к сглаживанию максимумов. Клетки обоих видов выделяли Og с максимальной скоростью в широких интервалах концентраций HaOl во внешней среде, сохраняя тем не менее видовую специфичность. Наибольшая скорость фотосинтеза у D.salina наблюдалась в интервале концентраций NaCl 1,5-3,5 M, а у D.maritima 0,4-1,1 M (рис.1Б). За Еремя, достаточное для завершения второй фазы,происходит изменение внутриклеточного содержания глицерина, в результате чего клетки восстанавливают исходные размеры. Можно предположить, что восстановление клеточного объема способствует поддержанию оптимальных условий внутри клетки для работы фотосинтетического аппарата в. широких интервалах концентраций ïïaCl во внешней среде.

Как показывают представленные данные (рис.ГБ) для эффективного функционирования фотосинтетического аппарата интакт-ных клеток необходимо некоторое количество соли в среде инкубации. При концентрации NaCl ниже 0,4 M у D.maritima и 1,0 M у D. salina интенсивность фотосинтеза снижалась;

Так. же, как и при 4-минутной темновой экспозиции, опыты с 3-часовой инкубацией на свету показывают более высокую солеуо-тойчивость d. salina , по сравнению с d.maritima Монотонное снижение интенсивности фотосинтеза наблюдалось у d.salina по мере увеличения наружной концентрации соли в области 4,0-5,0 M, а у D.maritima - 1,5-2,5 M* Она составляла 21% от. максимальной при 5,0 M у D.salina и равнялась нулю при 2,5 M у- D. raari tima .

Таким образом, зависимость скорости, фотосинтеза от концентрации Had в среде может служить показателем солеус-тойчивости исследуемых водорослей* Полученный результат свидетельствует, в соответствии с ранними работами (см.Масюк, 1973), что D. salina , являющаяся обитателем водоемов соляных промыслов, адаптирована к более высоким концентрациям Nad в среде, чем морская водоросль D.maritima . d.salina поддерживает скорость фотосинтеза на высоком уровне в более широком интервале наружных концентраций Had , чем d .maritima . Максимальная скорость фотосинтетичеекого выделения Og у D.salina наблюдалась при более высоких концентрациях: Had в среде, чем У D.maritima .

Перейдем теперь к рассмотрению влияния Uaci на функцию фотосинтетического аппарата in vitro V Известно, что выделенные из. клеток органеллы чувствительны к осмотическому давлению среды'* Поэтому при изучении влияния соли на реакцию Хил-ла J хлоропластов необходимо создать оптимальное осмотическое давление инкубационного растворам Хлоропласты обнаружили высокую чувствительность к осмотическому давлению среды, В качестве нейтрального осмотика использовали традиционно применяемую при выделении органелл сахарозу или. глицерин. Применение в наших опытах" глицерина было обусловлено, во-первых, ограниченной растворимостью сахарозы, что не давало возможности фомощью этого соединения создать необходимое осмотическое давление для хлоропластов. D.salina ; во-вторых, тем фактом, что глицерин является природным метаболитом водорослей Dunaliella и содер l s

60

§ 50 о si.

§r §1 gr I

10

12 3 4

Концентрации глицерина в сръЭе, И

Зависимость скорости реакции Хилла в сусшнзии разрушенных клеток от концентрации глицерина в среде

I « ©, salina .2 ~ D .mari tima . смесь i глицерин в указ анных кон* ЦШТрШИЯХ, ОД М NaCl , 10-5 М K3Fe(OU)6, 2» м трис-CI буфер, Ш Содержание хлорофилла 0,03-0,04 ш?/шг. Белый свет насыщающей интенсивности (450 тыс.эрг/сь/р-сек) жится в их клетках в больших количествах (Ben-Amotz, Avron, 1973,1961 ; Gimmler, Sohirling, 1978 На рис,2 представлена зависимость скорости: реакции Хилла от концентрации глицерина в. суспензии разрушенных клеток D. salina и D.maritima ; Скорости реакции возрастают с увеличением концентрации нейтрального осмотика в среде, затем кривые выходят на плато. Насыщение наступает при 1,25 M глицерина у хлоропластов. D.mari-tima и 3,0 M - у d.salina ♦ Возможно, внутриклеточные кон-, центрации глицерина у Dunaliella близки к. указанным значениям. Концентрация глицерина в клетках D.parva , выращенных в средах С 1,5 M HaGl , составляла 2,1 M (Ben-Amotz, Avron, 19750.

Влияние сахарозы, на скорость реакции Хилла было сходным с влиянием глицерина. На хлоропластах D. mari tima была получена зависимость с выходом на плато, максимальная скорость реакции в случае использования сахарозы: достигалась при более низкой концентрации, чем при использовании глицерина, - 0,5 М. Скорость реакции Хилла в хлоропластах. D.salina также увеличивалась с увеличением концентрации сахарозы, в среде, однако максимальная, скорость не была достигнута даже в. насыщенном растворе сахарозы1» Для выхода на плато, по-видимому, требовалось осмотическое давление, которое могло быть создано при концентрации сахарозы, превышающей предел ее растворимости.

На рис,3 представлены, зависимости скорости переноса электронов в: реакции Хилла от концентрации Nací в среде инкубации для хлоропластов различающихся по солеустойчивости растений, Так как внесение соли увеличивает осмотическое давление реакционной среды, следует использовать концентрации осмоo,so 075 i.oo Концентрация hJaCl, M

Рис^-З. Зависимость скорости реакции Хилла в суспензии ч выделенных хлороплас тов от. концентрации: j Nací 1,

I т хлоропласты; D.salina - при концентрации глицерина в: среде 3,0 I ; 2,3 ^ хлорсшласты? D.marítima при кон** центрацшглицерина в среде 1,25 М или сахарозы 0,5 М соответственно;; 4 хлороплас ты листьев фасоли при кош центрациж сахарозы; в среде 0„5 М;5 ^хлоропласт

D; salina при концентрации глицерина. В; среде 1,5 М ; 6 хлоропласты D.raaritimá при концентрации глицерина в среде 0,,63М. трис-CI буфер, рН"7,;2. Содержание хлорофилла 0,03-0, 04 мг/мл;5Белы1 свет насыщающей интенсивности (450. тыс'^ эрг/см^ .сек) ••. тика; при которых: исследуемая реакция достигает насыщения по скорости, то есть 1,25 M и 3,0 M глицерина для хлоропластов

D«maritima ж D.salina ; соответственно, и 0,5 M сахароза для хлоропластов D.maritima .

Внесение возрастающих количеств NaCl в суспензию на фоне указанных концентраций глицерина ускоряло перенос электронов в хлоропластах обоих видов Dunaliella (рис.3 - 1,2). Скорость реакции Хилла достигала максимума как в хлоропластах D.maritima , так и D.salina в области 0,2 M NaCl . При дальнейшем увеличении концентрации соли скорость переноса электронов резко снижалась. Локализация максимумов на подобных кривых для хлоропластов. D.maritima & листьев фасоли при использовании в. качестве нейтрального осмотика 0,5 M сахарозы также была одинаковой. Пики располагались В; той же области значений концентраций Had (рис;3 — 3,4); Сравнительное исследование влияния HaGl на скорость переноса электронов в хлоропластах трех ВИДРВ:. D.maritima , D.salina И Phaseo-lus vulgaris с использованием одного и того же осмотика -глицерина не представлялось возможным, так как хлоропласты листьев фасоли быстро теряли: активность в растворах, глицерина; Вследствие этого сопоставление действия Had на хлоропласты различающихся по солеустойчивости объектов проводили попарно: D.salina - D.maritima в глицериновых средах И D.maritima - Phaseolus vulgaris в традиционных сахарозных средах. При сравнении, локализации максимумов кривых I и 2 (хлоропласты. D.salina и D.maritima в глицериновой среде), а также 3 и 4 (хлоропласты D.maritima и фасоли в сахарозной среде); можно заключить, что максимальная стимуляция транспорта электронов- у трех исследуемых объектов происходит практически при одной и той se концентрации, соли. Таким образом, в отличие от интактных клеток выделенные из разных организмов хлоропласты практически одинаково реагируют на наличие HaCl в реакционной среде; максимальная фотосинтетическая активность in vitro хлоропластов различающихся по солеустойчивости водорослей, а также взятого для сравнения гликофита фасоли, наблюдалась при одинаковых и относительно низких концентрациях NaCl Из этого следует, что хлоропласта отличающихся по солеустойчивости растений слабо различаются по чувствительности к Nací ; Действие соли, проявляющееся в. форме кривых с максимумом при некоторой, концентрации nací * определяется ионным эффектом, а не осмотическим давлением среды. Об этом свидетельствует тот факт, что уменьшение концентрации глицерина в два раза (до 0,63 M для D.maritima и 1,5 M для D.salina ) тормозило реакцию Хилла, но не изменяло локализацию максимумов активности (рис.З — 5,6); Снижение активности хлоропластов при снижении концентрации глицерина связано, вероятно, не только с осмотическим эффектом последнего, но также с его защитными свойствами ( Borowitzka, Brown, 1974 ; Gimmler et al., 1984). Фиксированное положение, максимумов при различных концентрациях глицерина (рис.З - 1,2,5,6) означает, что Had не может служить заменителем этого соединения. Ионы Ua+ и С Г" не оказывают стимулирующего влияния подобно глицерину".

Следующий эксперимент показал, что эффект ïïaCl на реакцию Хилла у всех исследуемых объектов не является специфическим; любая соль (lad , KCl, MgCl2 ) была эффективна в достижениж максимума реакции (зависимости скорости реакции от концентрации KCl ж MgCl2 подобны зависимостям от. концентрации NaCl , см"»рис;3)» Если в. реакционную, среду вносилась одна из солей в оптимальной концентрации и на ее фоне добавлялась другая, то аффект двух солей, оказывался аналогичным тому, который вызывала бы только первая соль при дальнейшем увеличении ее концентрации. Вместо одновершинной кривой можно было наблюдать монотонное снижение скорости реакции. Такой характер зависимости транспорта, электронов от концентрации соли на фоне другой соли, добавленной в. оптимальной концентрации, у трех исследуемых объектов наблюдался прж любой комбинации солей; Исследовали влияние KCl на фоне MgCl2 , MgCl2 на фоне TTaCl, HaCl на фоне KCl. Одна из полученных зависимостей (KCl на фоне MgCl2) изображена на рис.4.

В настоящее время сложно интерпретировать наличие максимума в зависимости: скорости реакции Хилла от концентрации соли в инкубационной среде. Отсутствие ярко выраженной специфичности! в действии ионов позволяет предположить эффект,связанный с электростатическими взаимодействиями между ионами и поверх** ностными зарядами тшшковдов ( Barber et al., 1977 ; Itoh, 1978); Блокирование отрицательных, зарядов на поверхности тилакоидов катионами при внесении соли в среду может увеличить до3ступность Fe(CN)g к первичному акцептору электронов. Не исключено также, что концентрации ионов, при которой наблюдается наибольшая скорость реакции, являются оптимальными для поддержания необходимой структуры белков, хлоропластов. Другие известные жон-зависимые процессы в мембранах тилакоидов, связанные с транспортом электронов, требуют ионы в гораздо более o,as о,ff otis 4,0

Концентрация KC¿ > м

Рисв.4. Зависимость реакции Хиллав суспензии выделеншх: хдотплас тов от концентрации KCl нафоне 0,"Ш5 I. MgCl2 ж глипери-новых средах: для хлоропластов D. salina (I), D.mari tima (2) И на фоне ОД M - MgClg в сахарозной среде для хлоропластов листьев фасоли (В). смесь-1 KCl ж ЖаС1 в занныж концентрациях, 3,0 М ж 1,25 М глицерин ДЛЯ D .salina ж D »maritima соответственно, 0;5 М сахароза для хлоропла-* стов листьев: фасош ; остальные компоненты среды:, содержание хлорофилла и' интенсив^ ность света как указана на рисЖ низких концентрациях, чем те, которые давали максимум реакции Хилла в. наших экспериментах. К таким процессам следует отнести: транспорт катионов из тилакоидов наружу, сопряженный с поглощением Н* при генерации протонного градиента (Молотков-скии,дзюбенко,1970 ; Barber et al., 1974 ; Ben-Hayyim, 1978 ; Молотковскиж,Яковлева,1983) , фотофосфорилирование (Мо-лотковский,Дзюбенко,1970), СГ~-чувствительную реакцию в механизме разложения воды С Kelley, izawa, 1978), структурные перестройки тилакоидных мембран, сопряженные с транспортом электронов ( Izawa, Good, 1966); В отношении торможения транспорта электронов, в реакции Хилла в присутствии высоких концентраций солей следует отметить, что этот эффект может быть обусловлен несколькими причинами, среди которых электростатические взаимодействия и высаливание тилакоидных белков, могут играть существенную роль.

По-видимому, влияние соли на выделенные хлоропласты растений связано с несколькими точками воздействий. Молекулярные механизмы, этих воздействий остаются в значительной степени неясными. Однако существенно, что влияние солей на транспорт электронов в хлоропластах различающихся по солеустойчи-вости объектов носит сходный характер - оно описывается одновершинными кривыми с одинаково локализованными, максимумами;

Проведенные эксперименты, не выявили у Dunali ella ярко выраженных биохимических механизмов устойчивости в хлоропластах к высокому содержанию Nací в среде. Сравнительные исследования влияния соли на фотосинтетическую активность in vivo и in vitro . указывают на существенную роль защитной функции мембран в солеустойчивости изучаемых водорослей. Защитная роль мембран состоит в поддержании относительно низких, концентрации ионов в компартментах: протоплазмы, что дает возможность растению эффективно осуществлять обмен веществ при: высоких, концентрациях ионов, в. наружной, среде.

Отсутствие у хлоропластов Dunaliella собственной устойчивости свидетельствует о защитной роли мембран. Эти данные, однако, не исключают других путей адаптации на биохимическом уровне-. Примером может, служить накопление в клетках защитных: веществ- ( Flowers et al., 1977 ; Greenway, Munns, 1980; Tefferies, 1981) (в. частности глицерина у Dunaliella (Haimer, 1973 ; Borowitzka, Brown, 1974);

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Медведев, Александр Владимирович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование, на водорослях Dunaliella указывает на существенную роль плазмалеммы в солеустойчивости галофитов. функция этой мембраны состоит в регуляции ионного состава протоплазмы. Поддержание концентраций ионов в клетках на определенном уровне необходимо для протекания эндогенных метаболических процессов» в частности, фотосинтеза, в. оптимальных условиях. Одна из важнейших функций плазмалеммы. состоит в сохранении низкого содержания Nati в. протоплазме при условиях, когда концентрация HaCl в среде возрастает. У более солеустойливого вида D. salina эта функция осуществляется более аффективно, чем у морского1 — D. mari tima : низ кий уровень внутриклеточного содержания На поддерживается у D.salina в более широком интервале наружных концентраций. НаС1 (1,0-3,0 M) (рис.&-1), по сравнению о d.maritima (0,35-1,3 M) (рис;5-2). При этих же концентрациях соли у D.salina и D.mari tima наблюдается максимальная скорость фотосинтеза (рис;1). Торможение фотосинтеза, у интактных клеток Dunaliella при высоких концентрациях Nací в. среде, выходящих за пределы указанных концентраций (рис;1), является, вероятно', следствием увеличения внутриклеточной концентрации ионов (рис;5). Ширина, интервала внешних концентраций Had „ в котором поддерживается ионный гомеостаз, может определяться как проницаемостью плазмалеимы, так и максимальной скоростью, активного транспорта ионов На4* наружу на единицу поверхности этой мембраны;

Исследования in vitro также свидетельствуют в. пользу поддерживания относительно низкой концентрации ионов в протоплазме галофилышх растений» Опыты; проведенные на ферментах, выделенных из. многих, галофитов (см.Литературный обзор), в частности из водорослей Dunaliella (см"»гл.Д), показали,что активность большинства иа них в. значительной степени подавляется при концентрациях Had гораздо более низких,- чем в среде культивирования. По чувствительности отдельных ферментов к соли трудно судить о биохимических механизмах солеустой-чивости. Жсследования, проведенные в самое последнее время на большом количества ферментов, выделенных из; D.parva ( Gimm-ler et al., 1984),, подтвердили, что многие из. них обладают высокой чувствительностью к соли. Однако, наряду с чувствительными ферментами j Dunaliella ; как. и у других галофитов (ем.Литературный обзор) „ имеются, устойчивые. Так, каталаза и пероксидаза из D.parva сохраняли высокую активность даже при концентрациях Had , превышающих I М ( Gimmler et al., 1984); Следует особо отметить, что ряд ферментов: Dunaliella (Алешина,Балнокин, 1984), как и ферментов многих галофилъных растений (см;Литературный обзор), проявил, in vitro такую же чувствительность к Had , как и аналогичные ферменты: гликофитов, в отличие от экспериментов, проведенных на бактериях ( Evans, Sorger, 1966); Для изучения биохимических механизмов солеустойчивости более информативным является исследование действия ЖаС1 на выделенные органеллы.

Экспериментами in vitro » представленными в главе 1, показано, что транспорт электронов в хлоропластах, выделенных из экстремального галофита D.salina f морского галофита D.maritima и ЛИСТЬев гликофита Phaseolus vulgaris > практически одинаково чувствителен к Haci , то есть, органеллы., ответственные за важнейшую функцию растений. - фотосинтез у галофильных водорослей и гликофита в целом заметно не отличаются по чувствительности к. ИаС1 v Этот результат подчеркивает важную роль плазмалеглмы в сохранении низких концентраций ионов в протоплазме; В связи с этим следует упомянуть работы; выполненные на выделенных органеллах из галофита — высшего растения, Поглощение Og и окислительное фосфорилирование в митохондриях ( Flowers et al., 1976) и включение *4С-лейцина рибосомами Suaeda maritima ( Hall, Flowers, 1973) в значительной степени подавлялись при концентрациях НаС1 , близких к содержанию его в среде культивирования; В соответствии с этим измерения, сделанные о помощью метки ( Yeo, 1981) и трансмиссионного аналитического микроскопа (Hasvey et al., 1981) показали, что концентрация На+ в протоплазме этого галофита является гораздо более низкой, чем в культуральной среде;

На основании недавних исследований можно также заключить;-что постоянство концентраций ионов в протоплазме свойственно не только галофитам эукариотам, но и галофитам » прокариотам» Следует отметить, что концентрации ионов в протоплазме у первых поддерживаются на уровне приблизительно в 10-100 раз более жзком, чем у вторых (КашнерД981);

Приведенные в гл.Ш. и 1У данные и цитированные работы не исключают возможности адаптаций растений к засолению на биохимическом. уровне4; Примеры адаптаций такого рода широко известны (Строгонов и др;,1970 ; Borowitzka, Brown, 1974 ; Flowers et al., 1977 ; Шевякова, 1979 ; Чуковская и др. Д979 ; Greenway,Munns, 1980 ; Jefferies, 1981).0ни могут играть, важную роль в. условиях:,, при которых концентрации засоляющих ионов в протоплазме др-стигают высоких значений (например I М у Dunaliella (рис;5) . Однако функции, плазмалеммы. в. реализации, солеустойчивости на клеточном уровне у галофитов следует отвести одно из центральных мест. Приведенные данные являются аргументом в пользу поддержания относительно низких концентраций засоляющих ионов в протоплазме галофитов^ в широком интервале внешних концентраций Жа01 ж свидетельствуют о- том, что регуляция ионного состава клетки в значительной степени обеспечивается функциями плазмалеммы;. Высокое содержание засоляющих ионов в тканях ряда галофильных растений,, вероятно;,, отражает накопление их в вакуолях ( Raven, 1976).

Механизмы; транспорта шн<шв через плазмаленму галофиль-ных растений в настоящее время практически не изучены. Исследование ионного, транспорта у галофильнож водоросли Dunaliella являются одними из: немногих в этой области. Они показали, что ее плазмалемма включает в. себя механизмы, осуществляющие перенос ионов против градиента, электрохимического потенциала. Опираясь на результаты, опытов по изучению влияния валиномицина на транспорт К+ мы, предположили относительно высокую проницаемость плазмалеммы: для этого иона и его равновесное распределение при отсутствии чистого потока. Высокая проницаемость, плазмалеммы для Kt, по- сравнению с другими ионами, свойственна многим растениям (см.Литературный обзор) . Принимая, что К* находится в равновесном состоянии и используя уравнение Нернета, па значениям концентраций. К+- в среде ж клетке оценили электрический, потенциал на плазмалемме; При полученном значении Ем (В89 мВ) и внутриклеточных концентрациях. табл.6) нетрудно' определить, что градиент электрохимического потенциала На+ направлен из среды: в клетку. Это означает, что для поддержания концентрации этого, иона на установленном уровне необходим механизм, выводящий его наружу против градиента электрохимического потенциала за счет энергии метаболизма. Равновесное состояние К* также показывает, что для его переноса также необходима затрата энергии.

Молекулярными механизмами* осуществляющими, перенос ионов и потребляющим: для этого энергию, являются транспортные il Фазы .'

Прямой îia+-KÎ обмен и наличие Na-K^ Al Фазы в клетках Dunalieiia не. нашли подтверждения в проведенных экспериментах-. Так, перенесение водорослей на среду без К* не приводило к. накоплению, клетками натрия, хотя уровень: внутриклеточного калия при этом снижался (табл.6); Увеличение внутриклеточной концентрации Па путем повышения содержания ЦаС1 во внешней: среде до 2,0 M (рис; 5) не активировало, поглощения К* клетками D.maritima (рис.Ю). Уабаин « ингибитор Iía+-Kt AI Фазы не подавлял как. поглощения К*1, так и выведения Иа+ иа клеток (табл'*8„9);

Представленные в главе У результаты: свидетельствуют в пользу наличия Н*"-насоса в. плазмалемме галофильных водорослей D.mari~ tima if-насосу в. последнее время отводится ведущая роль в процессах ионного транспорта у растений — гликофитов. Он осуществляет перенос Н* против градиента электрохимического потенциала из цитоплазмы, во внешнюю среду и активируется: одновалентными катионами (см.Литературный обзор), В наших эксперт ментах внесение К+ в К*-дефицитную культуру водорослей D*mari-tima^ вызывало в слабо забуференной среде смещение рН в кислую, область,, указывая на стимулированным К* выход, Н* из клеток (рис; 14); Перенос Б* влечен за собой ряд процессов» Во-первых, согласно существующим представлениям (см;£итературный обзор)- транспорт протонов Ef-помпой является электрогенным, приводя- к гиперполариз ации мембраны : и поглощению Транспорт калия, по-видимому, зависит от величины, на плазмалемме; Факторы, влияющие на величину мембранного электрического* потенциала , влияли на скорость поглощения. К+ у D.maritima ; Перенос К* у этих водорослей стимулировался светом (рис;8-П, табл.6) и подавлялся высокими концентрациями Had в среде (рис; 10) , так же как и у других растений ( jazawa, Nagai, 1966 ; Raven, 1967 ,

Barber, 1968b,1968c ; Barber, Shieh, 1972,1973a; Shieh, Barber, 1971 ; Rybowa et al., 1972 ; Findlay et al., 1971 ; Dewar, Barber, 1973 ; Johansen, Luttge, 1975 ; Oontardi, Davis, 1981 ; Kaiser et al., 1982 ; Lynch, Läuchli, 1984); У растений - гликофитов поглощение К* активируется высокими кощентраццями Kt в среде (Epstein et al., 1968; büttge, Laties, 1966 ; Torii, bâties, 1966 ; Raven, 1967 ; Leigh, Wyn ffones, 1973 ; johansen, Luttge, 1975 ; Glass,Dunlop, 1978 ; Воробьев,1980 ; Kaiser et al., 1982) и НИЗКИМИ в клетке (Leigh,

Wyn ¡Tones, 1973 ; Glass, 1976,1983 ; Glass, Dunlop, 1978; Воробьев,1980). В соответствии с этим в наших экспериментах функционировал механизм поглощения калия в К*-дефицитных клетках (рис; 7-12,16 Д7, табл;7-П) и активировался при повышении концентрации К"!" в раотворе (рис.II). 0 сходстве транспорта К* в клетках D.maritima с этим процессом у других растений свидетельствует также полученная зависимость скорости поглощения калия от концентрацди KCl в; среде (рис;II). Фазовый характер зависимости соответствует результатам работ, выполненных на многих гликофитах С Epstein et al,, 1963 ; Epstein, 1966, 1976 ; Torii, Laties, 1966; Luttge, Laties, 1966 ; Laties, 1969 ; Rains, 1972 ; Anderson, 1972 ; beigh, Wyn Iones,1973, 1975; Glass, Dunlop, 1978).

Во-вторых, результатом работы; Ht-насоса является генерация дул Ht на плазмалемме, что в свою очередь приводит к усилению пассивного потока Ht в клетку. Последнее обстоятельство подтверждается сравнением величин чистых штоков Ht, с одной стороны, и К*, На+ с другой; Начальный поток Ef был почти в 10 раз меньше, чем ионов ца+ и К*. При сопряжении потоков жК+ с потоком Н^ это можно, объяснить циклическим переносом Hjt активным из клетки, и пассивным по градиенту электрохимического потенциала в клетку. О том, что выведение ïïa+ во внеш-шою среду зависит от дуй Ht и, по-видимому, сопряжено, с пассивным входом Ht, свидетельствует эффект протонофора КЦХФ; Даже в низкой "^разобщающей" концентрации он приводит к. значительному подавлению транспорта т+ . Это подтверждают данные об увеличении потока Иа+ при закислении среды; от pH 7,2 до pH 6,2 Стабл;И);

Ингибитор мембранных протонных АТФаз «ВДКД, по-видимому, действует на Е^-ДОФазу,. влияя на генерацию Б^ и дуд Bf у D.maritima , что приводит к подавлению поглощения Kt» Транспорт катионов у Dunaliella может зависеть также от работы других насосов, вносящих вклад в генерацию. Одним из таких, насосов, может быть электрогенная СДГ-транспортная система, чувствительная к JiTTK-Д ж п-ХМБ (рис; 16 и 17)> Ht-АГФазе следует отвести одну из главных, ролей в транспорте катионов у галофишов;

На основании полученных данных может быть предложен следующий механизм транспорта катионов в клетках Dunaliella (см. схему на рис;18);. Первичным цроцессом является работа чувствительного- к ДЩД протонного насоса, который переносит Н* против, градиента электрохимического потенциала из протоплазмы в среду. При атом градиент электрохимического потенциала ца+ направлен из среды, в клетку, а К* находится ь состоянии близком к электрохимическому равновесию. Внесение. К* в среду активирует Ef-насос; В результате переноса внутриклеточного в среду возрастает дуйН* (рН и Б^) на плазмапем-ме. Электрохимическое равновесие ддяК^, исходно имевшее место в системе среда-клетка, в результате гжперполяризациж мембраны смещается ж К+ поступаем внутрь; Б** входя в клетку по градиенту электрохимического потенциала, обменивается на + — , +

Na череа механизм ионно-обменной диффузии. (Ну-На антипортер); ца+ движется против градиента электрохимического потенциала за счет энергии градиента дуй Б* .

Водоросли Dunaliella адаптированы к высоким концентрациям иа+ в среде обитания. Они должны транспортировать из клетки наружу против значительных градиентов электрохимического потенциала этого иона. Б^-АГФаза ж Н1"- т* диффузионный. обменник. могут рассматриваться как механизмы системы, ответственной за выведение Жа+ из протоплазм! ж поддерживающей его содержание в клетке на относительно низком уровне;

Наиболее веррятно, что Н* на антипортер эффективно функционирует только цри достаточно высоких концентрациях. Б* в среде. По мере снижения концентрации Kf во внешнем раствоi 1

Н+-АТФа3а I l>

Н+ Н+ i Ña Ñai

Еис.18. Схема тражспорта катшщов ( Жа+, Kf ж водаослж Dunaliella ■ ре способность к выведению На+ из клеток должна снижаться, что ж наблюдалось при переходе от рН 6,2 к рН 7,2. Однако, прж рН 8,5 происходило увеличение потока на+ во внешнюю среду (табл;11); Этот результат может быть интерпретирован исходя из предположения, что в плазматической мембране галобильных водорослей БипаНеНа ; помимо В*- На+ антипортера функ ционирует также другой, механизм выведения на иа клеток; эффективный прж щелочных значениях рН среда (на схеме обозначен пунктиром).

Сходство ряда характеристик ионного транспорта у Шпа-ИеНа и некоторых, других солеустойчивых водорослей и высших растений позволяет предположить функционирование механизма транспорта катионов, подобного предложенному на рис; 18, у других растений - галофитов;

Токсические эффекты, наблюдаемые прж засолении ж подробно исследованные Строгоновым и сотр. (1970,1973), по-видимому', являются следствием нарушения ионного гомеостаза в протоплазме; Можно предположить, что в этих случаях (когда величина градиента электрохимического потенциала. Жа на плазмалемме превышает его критическое значение) производительность системы1, транспортирующей На+ . , является недостаточной для удалесЛОНа, ния этого из протоплазмы; куда он поступает с высокой скоростью, В конечном итоге такой разбаланс потоков 1Та+ приводит ионов к увеличению содержания в этом компартменте (рис;5), что вызывает нарушение метаболических- функций и структурной организации растений;