Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина C у Acremonium chrysogenum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Думина, Мария Владимировна

• Думина, Мария Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Думина, Мария Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цефалоспорин С: открытие, химическая структура, механизм действия антибиотика, продуцируемого Асгетотит chrysogenum

1.2 Краткая характеристика А сгетотит chrysogenum - продуцента цефалоспорина С

1.3 Биосинтез цефалоспорина С

1.3.1 Кластеры генов биосинтеза цефалоспорина С

1.3.2 «Ранние» стадии биосинтеза цефалоспорина С

1.3.3 «Поздние» стадии биосинтеза цефалоспорина С

1.4 Роль мембранных белков в биосинтезе Р-лактамов

1.4.1 Компартментализация реакций биосинтеза (3-лактамов

1.4.2 Роль мембранного транспортера CefP в биосинтезе цефалоспорина С у А. chrysogenum

1.4.3 Роль мембранного транспортера СеШ в биосинтезе цефалоспорина С у А. chrysogenum

1.4.4 Роль мембранного транспортера СеП^ в биосинтезе цефалоспорина С у А. скгуз^епит

1.5 Молекулярные основы функционирования белков мультилекарственной устойчивости Се1Т, СеШ, Се1Р

1.5.1 МБ8 МБЯ транспортеры

1.5.2 Создание градиента Н+ Н+-АТФазой РМА1

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Компьютерное моделирование

2.2 Штаммы и плазмиды

2.2.1 Штаммы, используемые в работе

2.2.2 Плазмиды

2.3 Микробиологические среды и условия культивирования штаммов

2.4 Генно-инженерные методики

2.4.1 Общие молекулярно-генетические методы

2.4.2 Выделение геномной ДНК

2.4.3 Проведение ПЦР

2.5 Конструирование плазмид

2.5.1 Создание кассет экспрессии CefT-TagCFP

2.5.2 Создание кассет экспрессии РМА1-Та§УРР

2.6 Получение рекомбинантных штаммов

2.6.1 Трансформация нативных клеток 5". сегеушае плазмидной ДНК

2.6.2 Приготовление и прямая трансформация компетентных клеток А. Ште/аЫет

2.6.3 Трансформация Л. chrysogenwn

2.7 Анализ рекомбинантных штаммов 8. сегеу1$1ае_СъТ1-ТщСТР, Я. сегеУ1ыае_РМА1-ТавУБР

2.7.1 Флуоресцентная микроскопия 5'. cerevisiae_CefT-TagCFP, сегеУ1Э1ае_РМА1-ТавУБР

2.7.2 Исследование функциональной активности 5. сегеушае_Се1Т-Та§УРР методом диффузии дисков в агар

2.7.3 Исследование функциональной активности 5". cerevшae_CefT-TagYFP методом спот-анализа

2.8 Анализ рекомбинантных штаммов А. chry.sogenum_CefT-Ta.gCFP, А. chrysogenum_PM.Al-Ta.gYFV

2.8.1 Молекулярный анализ клонов

2.8.2 ВЭЖХ-анализ

2.8.3 Определение содержания внутриклеточного АТФ

2.9 Молекулярное кариотипирование А. chrysogenum

2.10 Анализ экпрессии генов

2.10.1 Получение препаратов тотальной, матричной РНК

2.10.2 ПЦР-анализ в реальном времени

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Сравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов А. chrysogenum -штамма дикого типа АТСС 11550 и высокопродуктивного ВКМ Р-408Ш

3.1.1 Хромосомный полиморфизм штаммов А. chrysogenum АТСС 11550, ВКМ Р-408Ш

3.1.2 Хромосомная локализация генов биосинтеза цефалоспорина С

3.1.3 Анализ экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С в штаммах А. сЬгуь^епит АТСС 11550, ВКМ Р-408Ш

3.2 Создание систем экспрессии мембранных транспортеров Се1Т-Та£СРР, РМА1-TagYFP для модельного объекта 5. сегст/бше

3.3 Исследование субклеточной локализации РМА1-ТадУРР, СеГГ-ТавСРР в модельном объекте 5. сегеушае

3.4 Разработка системы функционального анализа белка-транспортера цефалоспорина С СеГГ-Та§СРР в 5. сегеушае

3.5 Создание систем экспрессии мембранных транспортеров Се:ГГ-Та§СРР, РМА1-Та§УРР для А. chrysogenum

3.6 Получение рекомбинантных штаммов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP,

A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP

3.7 Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ F-408lD_CefT-TagCFP, A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP

3.8 Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера РМА1-TagYFP в регуляции продукции цефалоспорина С

3.9 Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера CefT-TagCFP в регуляции продукции цефалоспорина С

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина C у Acremonium chrysogenum»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цефалоспорины - обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием, низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном. Субстанцией для получения более 30 наименований полусинтетических цефалоспоринов 5 поколений является природный (3-лактамный антибиотик цефалоспорин С (цефС), продуцируемый аскомицетом Acremonium chrysogenum.

На протяжении последних тридцати лет был достигнут значительный прогресс в селекции промышленных штаммов A. chrysogenum — суперпродуцентов данного антибиотика, идентификации генов, контролирующих биосинтез цефС и исследовании характера их регуляции.

Путь биосинтеза цефС хорошо изучен, насчитывает 6 ферментативных стадий, катализируемых продуктами генов «раннего» - pcbAB, pcbC, cefDl, cefD2 — и «позднего» - cefEF, cefG - кластеров биосинтеза антибиотика.

На внутриклеточном уровне биосинтез цефС строго компартментализован. Эффективность процессов внутриклеточного транспорта интермедиатов и экспорта цефС из клетки вносит существенный вклад в общий уровень продукции антибиотика, соотношение выхода конечного продукта и его промежуточных форм в процессе ферментации.

Гены мембранных транспортеров, вовлеченных в процессы транспорта цефС и его интермедиатов, являются перспективными мишенями для создания рекомбинантных штаммов A. chrysogenum с улучшенными производственными характеристиками. Особый интерес представляет белок CefT, относящийся к обширному классу MFS транспортеров. CefT осуществляет перенос (3-лактамов через плазматическую мембрану продуцента по принципу Н+-антипортера.

Другой перспективной мишенью генетических манипуляций, направленных на улучшение биосинтеза цефС, является НГ^-АТФаза плазмалеммы РМА. Функцией белка является формирование на плазмалемме электрохимического градиента

протонов, используемого для всех процессов транспорта метаболитов посредством Н+ -симпортного, н+ -антипортного механизмов. Таким образом, Н -АТФаза должна играть существенную роль в энергообеспечении процессов синтеза и транспорта цефС.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли мембранных транспортеров - КГ-АТФазы плазмалеммы РМА1 и предполагаемого транспортера цефалоспорина С Се1Т в регуляции продукции (3-лактамов у Асгетотит chrysogenum.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Определить хромосомную локализацию и характер экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С у высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш и штамма дикого типа АТСС 11550.

2. Создать системы экспрессии Се1Т из А. chrysogenum, РМА1 из БасскаготусеБ сегеу^ягае в виде их гибридов с флуоресцентными белками, изучить функциональную активность и субклеточную локализацию CefT-TagCFP и PMAl-TagYFP в модельном объекте & сегеугБгае.

3. Создать системы экспрессии CefГ-TagCFP и PMAl-TagYFP для А. chrysogenum, оптимизировать процедуру агробактериального переноса кассет экспрессии в штамм ВКМ Р-408Ш.

4. Получить рекомбинантные се/Г-клоны А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Изучить влияние экспрессии CefT-TagCFP на биосинтез цефалоспорина С.

5. Получить рекомбинантные рта1 -клоны А. chrysogenum ВКМ Б-408Ш, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Исследовать функциональную активность PMAl-TagYFP, изучить влияние экспрессии РМА1 на биосинтез цефалоспорина С.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы был определен характер хромосомного полиморфизма и выявлены закономерности экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефС для штаммов А. chrysogenum, различающихся в 100 раз и более по уровню продукции антибиотика. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах регуляции биосинтеза (3-лактамных антибиотиков у А. chrysogenum, молекулярно-генетических отличиях промышленных штаммов А. chrysogenum, определяющих их способность к суперпродукции цефС.

Разработан подход для изучения функциональной активности и особенностей субклеточной локализации мембранного белка Се1Т в гетерологичной модельной системе б1. сегеушае. Метод универсален и может быть использован для структурно-функционального анализа других МБ 8 транспортеров грибов, участвующих в процессах экспорта биологически-активных вторичных метаболитов.

Разработана и оптимизирована процедура трансформации высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш методом агробактериального переноса (АТМТ). С помощью АТМТ впервые получены трансформанты высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш с конститутивной экспрессией функционально-активных гибридов мембранных транспортных белков СеГГ и РМА1, слитых с флуоресцентными белками TagCFP,

Показано, что дополнительная экспрессия CefT-TagCFP в высокопродуктивном штамме А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш приводит к изменению профиля биосинтеза цефС: повышению содержания в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов интермедиатов биосинтеза цефалоспорина и снижению выхода конечного продукта, подтверждая тем самым данные о широкой субстратной специфичности СеГГ, установленные на модельной системе дрожжей-сахаромицетов.

В процессе экспериментальной работы были сконструированы новые универсальные экспрессионные вектора, позволяющие осуществлять

агробактериальный перенос и конститутивную экспрессию целевых генов в клетках A. chrysogenum, а также других видов нитчатых грибов.

A. chrysogenum - перспективный объект исследований, как с прикладной, так и фундаментальной точки зрения. Описанные в данной работе подходы по изучению продуцента цефС могут быть использованы в экспериментах по улучшению продуктивности, стабильности и иных производственных характеристик промышленных штаммов других видов грибов - продуцентов широкого класса ферментов и соединений для нужд пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность и сердечную признательность за чуткое наставничество, всестороннюю помощь в работе над диссертацией, ценные замечания, терпение и поддержку своим научным руководителям -Эльдарову Михаилу Анатольевичу и Жгуну Александру Александровичу, а также коллективу лаборатории биоинженерии антибиотиков - Бартошевичу Юрию Эдуардовичу, Новак Марине Иоганновне, Домрачевой Алле Георгиевне, Чумаленко Ноэмии Львовне.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цефалоспорин С: открытие, химическая структура, механизм действия антибиотика, продуцируемого Acremonium chrysogenum

Культура A. chrysogenum была выделена из вод Сардинии (Италия) Джузеппе Бротзу [1,2] в 1945 году. Было установлено, что гриб продуцирует соединение, эффективно действующее на грамотрицательные бактерии (включая Salmonella typhi). Это объясняло феномен отсутствия вспышек брюшного тифа у населения, купающегося в море в месте сброса сточных вод. Однако структура антибиотического агента - цефалоспорина С - была впервые описана Абрахамом и Ньютоном лишь в 1961 году [3,4].

Цефалоспорин представляет собой бициклическое соединение, состоящее из ß-лактамного и дигидротиазинового колец (Рисунок 1). Оба кольца составляют 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК) - общее ядро молекулы цефалоспоринов. 7-АЦК близка по строению ядру пенициллинов — 6-аминопенициллановой кислоте (6-АПК) [5], которая также содержит ß-лактамное кольцо. В 7-АЦК могут быть замещены две боковые цепи, в 6-АПК — только одна, в связи с чем, на основе 7-АЦК можно получить значительно больше полусинтетических производных.

s

А - беталакт¡тпос колмм» В - дигисрфтнллнноьо^ клзьш»

R

¿4, ^ -s-^ "" Т V- 7&Д*

nosiiCJCHH«' dicmsmocH воатмсшекни^

Рисунок 1. Цефалоспорины: связь между химической структурой и эффектом. Воспроизводится по [6].

Антимикробная активность природных цефалоспоринов низкая, однако присоединение различных радикалов в положение 7 и в положение 3 резко усиливает их биологическую активность и устойчивость к Р-лактамазам. Таким образом, модификация химической структуры 7-АЦК приводит к существенным изменениям свойств соответствующего соединения - антибактериальной активности, параметров фармакокинетики и пр.

Удаление остатка аминоадипиновой кислоты и высвобождение 7-АЦК, удобной для последующего получения производных цефС путем химических превращений, представляет собой проблему, решаемую с помощью химических и энзиматических технологий [7,8].

Богатые возможности для получения производных цефалоспорина реакцией аллильного нуклеофильного замещения открываются за счет высокой подвижности ацетильной группы при СЗ. Таким образом, общая схема получения полусинтетических производных цефалоспоринов включает следующие стадии (Рисунок 2 А) [9]:

1) гидролиз с использованием силильной защиты;

2) нуклеофильное замещение (Ми-Н — нуклеофильный реагент);

3) электрофильное замещение (11-Х — электрофильный реагент).

Еще один способ химической модификации цефалоспоринов - перевод их в дезацетоксипроизводные — также открывает дополнительные возможности варьирования их структур [9] (Рисунок 2 Б).

Рисунок 2. Схемы получения полу синтетических производных цефалоспорина С. Воспроизводится по [9].

Антибактериальная активность цефалоспоринов, как и других Р-лактамных антибиотиков, обусловлена торможением синтеза пептидогликана, полимера, состоящего из повторяющихся дисахаридных групп, в образовании которых участвуют N-ацетилглюкозамин (NAG) и N-ацетилмурамовая кислота (NAM). Перекрестное связывание пептидогликана заключается в образовании пептидной связи между терминальным остатком боковой пептидной цепи (обычно D-аланином) с предпоследним остатком примыкающей боковой цепи (L-лизином или диаминопимелиновой кислотой) [10].

NAG- и NAM-пентапептидные остатки пептидогликанов синтезируются в цитоплазме микробной клетки и транспортируются через плазматическую мембрану. Далее эти остатки встраиваются в существующую пептидогликанную сеть (в процессе роста и деления клетки) с участием транспептидаз, карбоксипептидаз, эндопептидаз - пенициллинсвязывающих белков (РВР), являющихся мишенями (3-лактамных антибиотиков. В результате образования ковалентной связи (3-лактамов и РВР последние инактивируются, нарушается образование поперечных сшивок, происходит ослабление клеточных стенок и их разрыв в результате высокого осмотического давления.

По спектру антимикробного действия выделяют пять поколений цефалоспоринов: I поколение характеризуется большой активностью к грамположительной микрофлоре, меньшей - к грамотрицательной; II - проявляет активность в отношении грамотрицательных бактерий, устойчиво к (3-лактамазам; III - обладает повышенной активностью к грамотрицательным бактериям; IV -воздействует на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, имеет повышенную устойчивость к гидролизу (3-лактамазами; V - проявляет бактерицидную активность в отношении широкого спектра патогенов — грамположительных возбудителей, обладает уникальной для [3-лактамов активностью в отношении метициллинорезистентных штаммов Staphylococcus aureus [11—15].

На настоящий момент получено свыше 50 наименований соединений цефалоспоринового ряда, обладающих мощным бактерицидным действием,

низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном и занимающих прочные лидирующие позиции на рынке системных антибиотиков [16,17].

1.2 Краткая характеристика Acremonium chrysogenum - продуцента

цефалоспорина С

Способность синтезировать |3-лактамные антибиотики широко распространена в природе [18]. Она обнаружена у некоторых грибов, у грамположительных с высоким G-C содержанием {Streptomyces, Amycolatopsis)

[19] и грамотрицательных бактерий (Flavobacterium, Xanthomonas, Lysobacter)

[20]. Среди нитчатых грибов способностью к биосинтезу цефалоспоринов обладают представители родов Acremonium (Cephalosporium), Anixiopsis, Arachnomyces, Spiroidium, Scopulariopsis, Diheterospora, Paecilomyces.

Микробиологически доступным соединением цефалоспоринового ряда является цефалоспорин С, который продуцируется грибами A. chrysogenum [21] (Рисунок 3): Царство - Fungi Подцарство - Dikarya Отдел — Ascomycota Подотдел — Pezizomycotina Класс — Sordariomycetes Подкласс - Hypocreomycetidae Порядок - Hypocreales Род — Acremonium Вид — Acremonium chrysogenum

Рисунок 3. Микрофотография А. chrysogenum в условиях глубинного культивирования. Воспроизводится по [16].

Гриб можно морфологически дифференцировать на длинные вегетативные гифы, гифальные фрагменты, цепочки артроспор, одиночные артроспоры, конидии, а также дрожжеподобные формы (Рисунок 4) [22].

Рисунок 4. Жизненный цикл А. chтysogenum. Воспроизводится с изменениями по [22].

Морфологические свойства выступают одной из основных характеристик мицелиального микроорганизма А. chrysogenum. Они отражают физиологическое состояние продуцента [23,24]. Значимость морфологических изменений А. chrysogenum доказывается работами по селекции определенных форм, неизменно сопровождающие как раунды мутанегенеза, так и современные генетические манипуляции с продуцентом.

Предполагается, что существует корреляция между морфологией продуцента и его способностью синтезировать антибиотик. Так, штаммы дикого типа с продукцией цефС, не превышающей 0.05 г/л, формируют конидии, в то время как средне- и высокопродуктивные дифференцируются в дрожжеподобные формы [25]. Однако, вопрос остается спорным, поскольку исследования дифференциации мутантов, не способных синтезировать цефС, не выявили отличий от контроля [26]; и наоборот, разрушение дисульфидных связей клеточной стенки, интенсифицирующее фрагментацию, не приводило к изменению выхода цефалоспорина [27]. Тем не менее, для ряда штаммов процесс фрагментации выступает необходимым условием высокого антибиотикообразования [22].

Фрагментация и биосинтез могут быть взаимосвязаны, но более корректно рассматривать эти процессы как ответную реакцию продуцента на более фундаментальные физиологические изменения, обусловленные снижением доступности источника углерода [28]. При этом морфологические параметры А. chrysogenum были и остаются наиболее чувствительным индикатором протекающих процессов и состояния продуцента.

Эволюционно сложившаяся способность А. chrysogenwn синтезировать спектр соединений, обладающих антибиотической активностью, включая конечный продукт — цефалоспорин С, сделало мицелиальный гриб чрезвычайно интересным объектом. Однако, сложность организации продуцента, отсутствие полового процесса, чередование нескольких морфоформ, медленная скорость роста и развития создает значительные трудности в изучении и анализе единственного промышленного продуцента цефС — А. chrysogenum.

1.3 Биосинтез цефалоспорина С 1.3.1 Кластеры генов биосинтеза цефалоспорина С

Для всех организмов, способных синтезировать |3-лактамные антибиотики (нитчатых грибов, грамположительных, грамотрицательных бактерий) гены, кодирующие белки данного биосинтетического пути, кластеризованы. На основании данных анализа промежуточных соединений биосинтеза, характеристики функционирующих ферментов, выравнивания прокариотических и эукариотических гомологичных белков, отсутствия интронов в ряде генов биосинтеза (к примеру, рсЬАВ, несмотря на размер гена 11.5 т.п.н), полагают, что произошел горизонтальный перенос предкового кластера бактериального происхождения порядка 370 миллионов лет назад [29-32]. Однако в эукариотическом предке исходный кластер был разбит на «ранние» и «поздние» гены, расположенные на разных хромосомах. Дальнейшая дивергенция Aspergillus nidulans, Pénicillium chrysogenum от A. chrysogenum привела к утрате второго кластера, отвечающего за поздние стадии биосинтеза цефС, который сохранился только у A. chrysogenum [33].

Таким образом, гены A. chrysogenum, вовлеченные в биосинтез цефалоспорина, организованы в два отдельных кластера [34,35]:

- кластер «ранних генов», локализованный на хромосоме VII (4.6 м.п.н.), объединяет гены биосинтеза pcbAB, pcbC, cefDl, cefD2, транспорта cefP, cefM, cefT, а также регуляции cefR [36];

- «поздний» кластер содержит биосинтетические гены cefEF и cefG и расположен на хромосоме I (2.2 м.п.н.) (Рисунок 5).

хромосома VI!

сеЯ? cefP сеГГ ОЯРЗ рсЬАВ рсЬС сеГ02 сеГП1 сеШ

хромосома I

сеГЕЯ cefG

2 кЬ

Рисунок 5. Организация генов биосинтеза цефалоспорина С в А. chrysogenum. Воспроизводится с изменениями по [36].

Оба кластера генов биосинтеза цефС присутствуют в виде отдельной копии в геномах всех проанализированных штаммов А. chrysogenum. Формирование кластера генов во многих антибиотических организмах дает основание гипотезе, что совместная локализация появилась в процессе отбора признаков, дававших экологические преимущества [37]. Кроме того, организация генов биосинтеза в большие опероны, которыми управляет единый промотор, может позволить скоординировать их регуляцию (как это происходит во многих прокариотических организмах). Однако, в грибах, таких как А. chrysogenum) транскрипция генов биосинтеза (3-лактамов находится под контролем отдельных промоторов [18].

1.3.2 «Ранние» стадии биосинтеза цефалоспорина С

Все пенициллины и цефалоспорины образованы тремя аминокислотами: Ь-а-аминоадипиновой кислотой (Ь-а-ААА), Ь-цистеином, Ь-валином [38] (Рисунок 6).

и-о-атитоасИри;

н соон

(.-узлпе

&4*иа-ат1поа(Иру1)>и<еуг(с1пу1*[>*уа1тс ЦШАСУ)

рсЬС | |&орвп1С|Шп N вупШзБв

н

(|>"В&Паг)

соон

соон

рел0Е

1а0рсп1с"||)!п N асуйпт^егаве

спг^.-^

соон

Ввпгу1рвпи;П1т

СООН 6-АРА

РетсНИит сЬгузодепит

<

сеЮ1 свЮ2

1РЫ-СоА 51п1в1ава

1РЫ-СоА ер1тагаза

ОАОС

соон

соон РепИНп N (0«®оте*)

се/ЕЯ I ОоассЮхуссрЬаЮаропп IС (ОАОС) вулйаза

О И

соон

ШЕР

I !

I

! „„„ 0АС н- •

Н СООН

по

соон

Оаасе1у1серЬа1оаропп С (ОАС) ауЩНазе

О

ГЛГкЧ у

! ° « н,м

соон

саЮ | ВАС-асв1уИгаг1бГога8в н

эсосн,

боон

СврИа1о5ропл С

н соон 0 ^^Д^ос

Асгетопшт сЬгуэодепит

Рисунок 6. Биосинтез (3-лактамов в А. chrysogenum и Р. chrysogenum. Воспроизводится по [39].

В грибах, включая А. chrysogenum, неканоническая Ь-а-ААА синтезируется по аминоадипатному пути как промежуточное звено в биосинтезе Ь-лизина [40,41] (Рисунок 7). Реакции конденсации а-кетоглутарата и ацетил-коэнзима А (КоА), формирующих гомоцитрат, с последующей изомеризацией, окислительным декарбоксилированием и аминированием приводят к образованию

Ь-а-ААА, вовлекаемой в дальнейшем в биосинтез |3-лактамов. Однако, известно, что к образованию Ь-а-ААА в Р. chrysogenum может также привести:

- катаболизм конечного продукта лизина под действием со-аминотрансферазы (ЬАТ), кодируемой геном оМ1 и индуцируемой лизином. ЬАТ - фермент вторичного метаболизма, крайне чувствительный к регуляции аммонием, наряду со многими ферментами, вовлеченными в биосинтез вторичных метаболитов [42,43];

- реакции «сахаропинового пути» (обратные биосинтезу лизина, катализируемому сахаропин-дегидрогеназой/сахаропин редуктазой) за счет активности лизин кетоглутарат редуктазы (ЬКК.) [44]. Под действием ЬКЯ, фермента первичного метаболизма, происходит образование сахаропина из лизина, однако, при этом Ь-а-ААА образуется в крайне малых количествах [44].

2-KETOGLUTARATE +ACETYL-COÄ

iys1

Homofitrßte synthase

HOMOCITRATE

Homoaconr.ase j

HOMOISOCITRATE

Homoisocitrate dehydrogenase

2-KETOADIPATE

Aminoadipate i aminotransferase

AC V synthetase pcMB

2-AA-CysAfel

Isopenicillin N synmase petС

ISOPENICILLIN N

6-APA

PENICILLIN G

Lysine aminotransferese (LAT)

LYSINE

2-ketoadipate

Рисунок 7. Связь между биосинтезом лизина и пенициллина в Р. chrysogenum. Воспроизводится по [44].

Приведенные данные говорят о том, что пул Ь-а-ААА может быть обеспечен как реакциями анаболизма, так и катаболизма лизина. При этом реакции, связанные с функционированием ЬКЯ менее эффективны в

Р. chrysogenum по сравнению с указанными альтернативными путями, которые, как предполагается, и поставляют большую часть данного предшественника в биосинтез (3-лактамов [44].

При этом известно, что высокие концентрации Ь-лизина ингибируют синтез цефС в А. chrysogenum. Внутриклеточный пул Ь-а-ААА регулируется Ь-лизином посредством ингибирования по принципу обратной связи, репрессии ряда генов и ферментов биосинтетического пути [45,46].

Критическим фактором в синтезе 5-(Ь-а-аминоадипил)-Ь-цистенил-В-валин (АСУ) трипептида, первого соединения вторичного метаболического пути, выступает также Ь-валин. Валин образуется в результате четырех ферментативных реакций с пируватом в качестве предшественника [47]. В настоящее время нет никаких дополнительных данных относительно регулирования путей биосинтеза Ь-валина и его конкурирующего эффекта на продукцию цефС.

Продуценты (3-лактамов используют различные пути биосинтеза последнего предшественника - Ь-цистеина: прямое сульфгидрилирование (Р. chrysogenum, А. тс1и1ат) [48,49], транс-сульфурилирование, обратное транс-сульфурилирование [50]. Несмотря на то, что А. chrysogenum способен синтезировать цистеин по любому из путей, продуцент в биосинтезе цефС использует превращение метионина в цистеин посредством обратного транс-сульфурилирования, что объясняет регуляторную функцию метионина (один из аспектов) на процесс биосинтеза антибиотика в А. chrysogenum [18].

Ь-а-ААА, Ь-цистеин, Ь-валин конденсируются в трипептид - АСУ под действием Ь-а-аминоадипил-Ь-цистенил-О-валин-синтетазы (АСУЭ) [51,52]. АСУ8 - мультифункциональный фермент 420 кДа, отвечающий за специфическое узнавание аминокислот, их активацию посредством образования аминоациладенилатов, образование пептидной связи [53-55]. Таким образом, фермент последовательно активирует три субстрата АТФ, образуя аминоацил— аденилаты, связывает их как тиоэфиры, эпимеризует Ь-валин в Б-валин, соединяет аминокислоты и освобождает образованный трипептид за счет

тиоэстеразной активности. ACVS имеет три консервативных домена, каждый из которых активирует одну из трех аминокислот [53].

Белок кодируется геном pcbAB (penicillin cephalosporin biosynthesis) размером 11.136 т.п.н. [18,56], входящим в кластер «ранних генов». Его открытая рамка считывания (ORF) не содержит последовательностей интронов [34]. Клонирование и секвенирование гена pcbAB прокариотических и эукариотических продуцентов [3-лактамов показало высокую степень идентичности pcbAB для грибных и бактериальных продуцентов: 71 % для грибных, 48 % для грибных и бактериальных [34].

Вторая реакция биосинтетического пути - циклизация линейного трипептида с формированием бициклической структуры изопенициллина N (IPN), первого биологически активного промежуточного соединения биосинтеза. Конденсации 4-членного (3-лактамного кольца с 5-членным тиазолидиновым кольцом катализируется изопенициллин N-синтетазой (IPNS, циклазой) 38 к Да [57-60]. IPNS - диоксигеназа, для работы которой необходимы Fe , молекулярный кислород и аскорбат. Фермент удаляет четыре атома водорода из ACV-трипептида, образуя бициклическую структуру [61].

IPNS кодирует второй структурный ген «раннего кластера» генов биосинтеза цефС -рсЬС 1014 п.н., не имеющий интронов и связанный межгенно с промоторной областью гена pcbAB, размер области 1233 п.н [62,63]. Известно, что в промышленных штаммах A. chrysogenum экспрессия гена pcbAB намного слабее по сравнению с рсЪС. Сравнение последовательностей рсЬС A. chrysogenum, P. chrysogenum, A. nidulans, S. clavuligerus выявило степень идентичности свыше 60 % [18].

IPN определяет точку разветвления биосинтеза пенициллинов и цефалоспоринов.

Первой специфичной для биосинтеза цефалоспорина реакцией является изомеризация L-a-AAA боковой цепи IPN до D-энантиомера, в результате чего образуется пенициллин N (PenN) [64]. Изомеризация катализируется двойной ферментной системой CefDl-CefD2 - ГР1ЧГ-КоА-синтетазой-1Р№КоА-эпимеразой.

Предполагается, что реакция осуществляется в три этапа: СеЮ1 превращает субстрат в 1РМ-КоА, затем СеЮ2 изомеризует соединение в Реп1Ч-КоА, который высвобождается третьим ферментом - тиоэстеразой (Рисунок 8). Последовательность реакции изомеризации в А. chrysogenum существенно отличается от бактериальных продуцентов, где 1РЫ превращается в РепГчГ напрямую с помощью фермента 1Р1ЧГ-эпимеразы [65].

Fungal "epimerase system"

ATP

I PN-Aoyl-CoA synthetase сч'/DI

tass у

SKftUl JT

I' "pp, ® "> 1 .Í]

-i',4 О .¿¿.СОХГоА' Q"

I PN-CoA epimerase

к/т

cixih

Isopcnxillin N

Bacterial epimerase

I'oiicilliit N

coon

Рисунок 8. Модель изомеризации IPN в PenN. Воспроизводится по [65].

Двойную ферментную систему 1РМ-КоА-синтетазу-1Р1чГ-КоА-эпимеразу кодируют гены cefl)l, cefD2 кластера «ранних генов» биосинтеза цефалоспорина. CeflDl, cefl)2, расположенны близко к гену рсЬС, экспрессируются в противоположной ориентации от двунаправленной области промотора размером 1515 п.н. Первый ген ceflDl 2193 п.н. содержит четыре интрона и кодирует белок 71 кДа, содержащий характерные мотивы ацил-КоА лигаз, вовлеченных в активацию (обычно посредством аденилирования) карбоксильной группы жирных либо аминокислот. Второй ген cefD2 последовательностью 1146 п.н., прерванной одним интроном, кодирует белок 41.4 кДа, гомологичный а-метил-ацил-КоА рацемазам эукариотического происхождения. Функциональная роль CefDl и

CefD2 была установлена путем инактивации кодирующих их генов. Результатом эксперимента стало получение штаммов, накапливающих IPN в культуре и неспособных к синтезу цефС.

1.3.3 «Поздние» стадии биосинтеза цефалоспорина С

Пенициллин N, образованный за счет функционирования ферментов, кодируемых кластёром «ранних генов», далее под действием дезацетоксицефалоспорин С-синтетазы превращается в

дезацетоксицефалоспорин С (DAOC) [66,67]. При этом происходит окислительный разрыв тиазолидиного кольца и последующая циклизация в 6-членное дигидротиазиновое кольцо, характерное для всех цефалоспоринов (Рисунок 6).

2+

DAOC-синтаза является диоксигеназой, которая в присутствии Fe , молекулярного кислорода и а-кетоглутарата образует DAOC и янтарную кислоту. Фермент не узнает (либо очень плохо) изомер IPN, пенициллин G, 6-АПК, однако его субстратом могут быть адипил-, глутарил-6-АПК производные [68].

CefEF катализирует и следующую реакцию биосинтеза: метальная группа при С-3 DAOC гидроксилируется и окисляется с образованием дезацетилцефалоспорина С (DAC). Таким образом, для A. chrysogenum обе реакции катализирует один фермент ОАОС-синтетаза/ОАС-гидроксилаза, кодируемый ce/EF-геном, тогда как для S. clavuligerus фермент, участвующий в обеих реакциях, кодируется двумя - cefE и cefF-генами [69,70].

Ген cefEF A. chrysogenum, кодирующий ВАОС-синтетазу/ОАС-гидроксилазу, - один из двух генов, организованных в «позднем» кластере генов биосинтеза цефалоспоринов. Одна ORF размером 996 п.н. не имеет последовательностей интронов, что предполагает прокариотическое происхождение гена [18].

Последняя реакция биосинтеза цефС является наиболее изученной для А. chrysogenum: СН3СО-группа АсКоА замещает ОН-группу DAC под действием

ацетил-КоА-ОАС-ацетилтрансферазы (БАС-ацетилтрансферазы) 49 кДа, продукта гена се/О.

Се/О А. chrysogenum - «поздний ген» кластера биосинтеза, 1301 п.н., содержит 2 интрона. Се/О связан с се/ЕЕ межгенной областью размером 938 п.н., содержащей двунаправленный промотор. Транскрипция се/О осуществляется в противоположном от се/ЕЕ направлении.

1.4Роль мембранных белков в биосинтезе Р-лактамов 1.4.1 Компартментализация реакций биосинтеза Р-лактамов

Биосинтез цефалоспорина, как и пенициллина, - пример сложного комплексного пути вторичного метаболизма. Оба продуцента - А. chrysogenum и Р. chrysogenum — представляют огромный промышленный интерес.

Однако, путь биосинтеза пенициллина, ферментные системы, задействованные в реакциях, для Р. chrysogenum изучены более подробно по сравнению с А. chrysogenum: данные по полногеномному секвенированию [71], протеомной карте белков растворимой фракции [72] существенно дополнили многолетние молекулярные исследования продуцента.

Так, для Р. chrysogenum давно известно, что биосинтез пенициллина протекает в различных клеточных компартментах, что позволяет пространственно разграничивать потоки предшественников и ферменты, а также осуществлять более тонкую регуляцию и оптимизацию протекающих процессов. Такая организация имеет очевидные преимущества: разграничение пула, каждый фермент работает в оптимальном «окружении». Но в то же время, такая система должна предусматривать транспорт ферментов, предшественников, промежуточных соединений, а также продуктов между компартментами.

Так, биосинтез пенициллина запускается с транспорта к вакуолярно заякоренной АСУ-синтазе Ь-цистеина, Ь-валина, накапливающихся в вакуолях, посредством вакуолярного мембранного белка РепУ [73]. Поступление третьего

предшественника на настоящий момент неясно: Ь-а-ААА может содержаться в вакуолях [74], либо накапливаться в цитозоле [75]. Таким образом, подтверждается гипотеза по разграничению пула аминокислот, участвующих в биосинтезе |3-лактамов, от главного пула аминокислот. Кроме того, рН, оптимальный для активности АСУ8 (рН=8.4, что выше вакуолярного рН), наличие необходимых кофакторов, говорит в пользу цитозольной локализации фермента, которое и было позже доказано электронной микроскопией [56].

Однако уже следующий фермент, участвующий в биосинтезе пенициллина, изопенициллин >Т-ацилтрансфераза (1АТ), имеет пероксисомальную локализацию. Пероксисомы Р. chrysogenum имеют слабощелочной рН=7.0-7.5, что оптимально для активности 1АТ [76].

Пероксисома (микротельце) - ключевой компартмент биосинтеза {3-лактамов, органелла диаметром 200-800 нм, окруженная одинарной мембраной. Пероксисомы вовлечены в ряд метаболических процессов, включая [3-окисление жирных кислот, желчных кислот, ряда токсичных соединений. Важность этих органелл была показана для биосинтеза пенициллина в Р. chrysogenum: сверхэкспрессия пероксина Рс-Рех11р в продуценте приводила к увеличению количества микротелец и двукратному увеличению уровня биосинтеза антибиотика [77].

Указанные принципы справедливы и для биосинтеза цефС в А. chrysogenum. Несмотря на отсутствие информации по геному, протеому продуцента, в последнее время получены данные, позволяющие реконструировать и предложить модель компартментализации биосинтеза цефС для рассматриваемой культуры.

В А. chrysogenum ферменты АСУ8, 1Р№, ОАОС-синтетазаЛЭАС-гидроксилаза, БАС-ацетилтрансфераза имеют цитозольную локализацию [78].

Первоначально считалось, что для А. chrysogenum все этапы биосинтеза антибиотика локализованы в цитозоле. Однако позже было доказано, что недостаточно изученная центральная реакция эпимеризации 1РЫ в РепЫ катализируется пероксисомальными ферментами 1РМ-КоА-синтетазой и 1РЫ-КоА-эпимеразой, кодируемыми се/01, сеА)2.

Анализ последовательностей CefDl, CefD2 показал наличие пероксисомальных сигнальных последовательностей (PTS), характерных для белков пероксисомального матрикса. CefDl на С-конце содержит пероксисомальную сигнальную последовательность PTS1 (последовательность SKL), CefD2 - 2 пероксисомальных сигнала PTS1, а также PTS2 на N-конце (с последовательностью [îl/L)(L/V/I)-X5-(H/Q)(L/A)]) [39]. Кроме того, изучение in vitro оптимальных условий реакции превращения IPN в PenN в бесклеточном экстракте показало, что оптимум наблюдается при рН=7.0, такое же значение рН в пероксисомальном матриксе.

Таким образом, согласно имеющимся на настоящий момент данным, первые реакции - образование трипептида и его циклизация в IPN - осуществляются в цитозоле. Далее IPN изомеризуется в пероксисомах под действием двойной ферментной системы CefDl-СеЮ2, после чего PenN поступает в цитозоль, где подвергается превращению в цефС под действием последних трех ферментов биосинтетической цепи (Рисунок 6).

Компартментализация, создавая различное микроокружение с оптимальными условиями для протекания ферментативных реакций, в свою очередь требует специфической мембранной транспортной системы, посредством которой осуществлялся бы перенос интермедиатов между ними. В частности, для A. chrysogenum возникает проблема транспорта промежуточных соединений через мембраны пероксисом. Данный вопрос решается при помощи белков мультилекарственной устойчивости (MDR - multidrug resistance), кодируемых генами cefP, ce/M, входящими наряду со структурными генами в состав «раннего» кластера генов биосинтеза цефС. Однако, в данный кластер входит также еще один ген cefT, кодирующий мембранный белок, осуществляющий транспорт [3-лактамов через плазматическую мембрану, тем самым играя важную роль в регулировании потока интермедиатов и в целом в биосинтезе цефС.

1.4.2 Роль мембранного транспортера CefP в биосинтезе цефалоспорина С у

A. chrysogenum

Согласно имеющимся данным, реакция изомеризации IPN в PenN катализируется пероксисомальными ферментами IPN-КоА-синтетазой и IPN-KoA-эпимеразой. При этом не было никаких сведений относительно того, каким образом синтезирующийся в цитозоле субстрат IPN поступает в пероксисомы для дальнейших превращений. Открытие cefP в составе кластера «ранних» генов биосинтеза цефС, кодирующего транспортный белок пероксисомальной локализации, позволило дополнить общее понимание последовательности биосинтетического пути и потоков интермедиатов между компартментами.

Обнаруженная в кластере ORF 2769 п.н., содержащая три интрона, была названа cefP (peroxisomal protein). Ген кодирует белок размером в 866 а.о. с молекулярной массой 99.2 кДа.

Сравнение аминокислотной последовательности CefP показало сходство с мембранными белками Nectria haematococca (63 %), Gibberella zeae (60 %), Podospora anserina (52 %), Chaetomium globosum (50 %), Neurospora crassa (49 %), Coccidioides immitis (41 %). Кроме того было выявлено наличие в белках характерного мотива DUF221.

Пероксисомальная локализация CefP была предсказана по наличию сайта связывания с пероксином Рех19, расположенному между 460-469 а.о. [79]. Локализация изучаемого белка была подтверждена в опытах по конфокальной микроскопии гибридного CefPDsRed.

Нокаут cefP показал, что кодируемый им белок играет важную роль в биосинтезе цефС: в полученных клонах наблюдалось снижение уровня продукции цефалоспоринов (DAC и цефС) до 8 % от его содержания в контрольном штамме A. chrysogenum СЮ, а также накопление пенициллинов (IPN, PenN). Дальнейшее изучение выявило, что клоны, нокаутные по cefP синтезируют DAC с крайне низким выходом, накапливают IPN и неспособны к биосинтезу конечного продукта цефС (Рисунок 9).

А

Б

Л боо

О»

3 500

О 400

о 300

| 200

К ЮО

{L,

£ 0 О

В

сю

-О- TDP-115

-Г- ТСР-12

TCR-45

TCPR-27

24

48 72 96 TIME (h)

120

»800 I -♦- сю

а 600 -О- TDP-11S

-Г- ТСР-12

Z -V- TCR-4S

р 400 TCPR-27

О О 200 О ее а. Q о < о

24

48 72 96 TIME (h)

120

Г

z 2

о э

Q

О

К Е о>

S 3 J

а

z ш а.

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 О

EXTRACELLULAR

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Думина, Мария Владимировна

выводы

1. Хромосомный полиморфизм у высокоактивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш не связан с изменением локализации и копийности генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С.

2. Уровень транскрипции генов биосинтеза цефалоспорина С для А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш повышен в 2-370 раз относительно штамма дикого типа А. chrysogenum АТСС 11550.

3. Транспортный белок CefГ-TagCFP при экспрессии в модельной системе & сегеуише локализуется в районах плазмалеммы диаметром 200-1000 нм и способен комплементировать функции ортологичных МБ 8 транспортеров сахаромицетов.

4. Оптимизирован метод агробактериальной трансформации в высокоактивный штамм А. chrysogenum. Получена коллекция рекомбинантных штаммов ВКМ Р-408Ш с CefT-TagCFP из А. chrysogenum и PMAl-TagYFP из & cerevisiae.

5. PMAl-TagYFP локализуется в плазматической мембране А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш, повышение уровня экспрессии РМА1 в трансформантах негативно коррелирует с уровнями внутриклеточного АТФ и продукцией цефалоспорина С.

6. Конститутивная экспрессия CefT-TagCFP в А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш приводит к увеличению экспорта интермедиатов цефалоспорина С при сохранении базового уровня продукции бета-лактамов.

114

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Думина, Мария Владимировна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Во G. Giuseppe Brotzu and the discovery of cephalosporins. // Clinical microbiology and infection the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. European Association For Health Information and Libraries, 2000. Vol. 6 Suppl 3. P. 6-9.

2. Brotzu G. Richerche su di un nuovo antibiotico. // Lav. 1st. d'lgiene Cagliari. 1948. P. 1-11.

3. Abraham E.P., Newton G.G.F. The structure of cephalosporin С // Biochem. J. 1961. Vol. 79. P. 393-402.

4. Hodgkin D.C., Maslen E.N. The X-ray analysis of the structure of cephalosporin С // Biochem. J. 1961. Vol. 79. P. 393-402.

5. Batchelor F.R., Chain E.B., Rolinson G.N. 6-Aminopenicillanic acid. I. 6-Aminopenicillanic acid in penicillin fermentations. // Proceedings of the Royal Society of London Series В Containing papers of a Biological character Royal Society Great Britain. 1961. Vol. 154, № 957. p. 478^89.

6. Graninger W. Цефалоспорины: связь между химической структурой и эффектом [Online]. 1994. URL: http://www.infectology.ru/ruk/Cefalosp/z2_ris.aspx.

7. Таранцева К.Р., Яхкинг М.И. Анализ технологий синтеза 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) и выбор оптимальной безопасной промышленной технологии. Москва: Научный мир, 2009. Р. 216.

8. Ныс П.С., Бартошевич Ю.Э. Основы разработки биокаталитических процессов трансформации и синтеза беталактамных антибиотиков // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Vol. 44, № 12. Р. 19 - 36.

9. Племенков В.. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001. Р. 376.

10. Van Bambeke F. et al. Mechanisms of action // Cohen and Powderly: Infectious Diseases. 2nd ed. St. Louis, 2004.

11. Livermore D.M. Mechanisms of resistance to cephalosporin antibiotics. // Drugs.

1987. Vol. 34 Suppl 2. P. 64-88.

12. Jacqueline C., Tattevin P. Ceftaroline, a cephalosporin with activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Experimental and clinical data, therapeutic applications // Journal Des Antilnfectieux. 2012. Vol. 14, № l.P. 310 ST - Ceftaroline, a cephalosporin with activ.

13. Stan C., Dumitrache M., Diaconu D.. Means of purification of cephalexin with a view to therapeutic use // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. 2004. Vol. 108. P. 718-720.

14. Gaurav K., Kundu K., Kundu S. Microbial production of 7-amino-cephalosporanic acid and new generation cephalosporins (cephalothin) by different processing strategies. // Artificial cells blood substitutes and immobilization biotechnology. 2007. Vol. 35, № 4. P. 345-358.

15. Neu H.C. Cephalosporins—cefotaxime 10 years later, a major drug with continued use. // Infection. 1991. Vol. 19 Suppl 6. P. S309-S315.

16. Barber M. et al. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams // Adv Biochem Eng Biotechnol. 2004. Vol. 88. P. 179-215.

17. Elander R.P. Industrial production of beta-lactam antibiotics. // Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Berlin / Heidelberg, 2003. Vol. 61, № 5-6. P. 385-392.

18. Brakhage A.A. Molecular Regulation of (3-Lactam Biosynthesis in Filamentous Fungi // Microbiology and Molecular Biology Reviews. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 62, № 3. p. 547-585.

19. Shiffman D. et al. Cloning and comparative sequence analysis of the gene coding for isopenicillin N synthase in Streptomyces. // Molecular general genetics MGG.

1988. Vol. 214, № 3. P. 562-569.

20. Aharonowitz Y., Cohen G., Martin J.F. Penicillin and cephalosporin biosynthetic genes: structure, organization, regulation, and evolution. // Annual Review of Microbiology. 1992. Vol. 46. P. 461^95.

21. Gams W. Cephalosporium-Artige Schimmelpilze (Hyphomycetes). G. Fischer, 1971. P. 262.

22. Bartoshevich YuE et al. Acremonium chrysogenum differentiation and biosynthesis of cephalosporin. // Journal of Basic Microbiology. 1990. Vol. 30, № 5. P. 313-320.

23. Mclntyre M., McNeil B. Morphogenetic and biochemical effects of dissolved carbon dioxide on filamentous fungi in submerged cultivation. // Applied Microbiology and Biotechnology. 1998. Vol. 50, № 3. P. 291-298.

24. Harvey L.M. et al. Autolysis in batch cultures of Penicillium chrysogenum at varying agitation rates // Enzyme Microb. Technol. 1998. Vol. 22. P. 446^158.

25. Karaffa L. Cephalosporin C production, morphology and respiration of Acremonium chrysogenum in glucose limited chemostat. // Biotechnology letters. 1996. Vol. 18, № 6. P. 701-706.

26. Queener S.W., Ellis L.F. Differentition of mutants of Cephalosporium acremonium in complex medium: the formation of unicellular arthrospores and their germination. // Canadian Journal of Microbiology. 1975. Vol. 21, № 12. P. 1981-1996.

27. Crabbe M.J. The effect of thiols and the Ca2+ ionophore A23817 on growth and antibiotic production in Cephalosporium acremonium. // FEMS Microbiol. Lett. 1988. Vol. 56. P. 71-78.

28. Sandor E. et al. Analysis of the relationship between growth, cephalosporin C production, and fragmentation in Acremonium chrysogenum. // Canadian Journal of Microbiology. 2001. Vol. 47, № 9. P. 801-806.

29. Liras P., Martin J.F. Gene clusters for beta-lactam antibiotics and control of their expression: why have clusters evolved, and from where did they originate? //

International microbiology the official journal of the Spanish Society for Microbiology, scieloes, 2006. Vol. 9, № 1. P. 9-19.

30. Weigel B.J. et al. Cloning and expression in Escherichia coli of isopenicillin N synthetase genes from Streptomyces lipmanii and Aspergillus nidulans. // Journal Of Bacteriology. 1988. Vol. 170, № 9. P. 3817-3826.

31. Landan G. et al. Evolution of isopenicillin N synthase genes may have involved horizontal gene transfer. // Mol. Biol. Evol.. 1990. Vol. 7. P. 399-406.

32. Peñalva M.A. et al. Sequences of isopenicillin N synthetase genes suggest horizontal gene transfer from prokaryotes to eukaryotes. // Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 1990. Vol. 241, № 1302. P. 164-169.

33. Skatrud P.L. 1991. Molecular biology of the b-lactam-producing fungi, p.364-395. In J. W. Bennett and L. L. Lasure (ed.), More gene manipulations in fungi. // More gene manipulations in fungi / ed. Bennett J.W., Lasure L.L. NY: Academic Press, Inc., 1991. P. 364-395.

34. Gutiérrez S. et al. Characterization of the Cephalosporium acremonium pcbAB gene encoding alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase, a large multidomain peptide synthetase: linkage to the pcbC gene as a cluster of early cephalosporin biosynthetic genes and evidence of mu // J Bacteriol. 1991. Vol.

173, №7. P. 2354-2365.

35. Gutiérrez S. et al. The cefG gene of Cephalosporium acremonium is linked to the cefEF gene and encodes a deacetylcephalosporin C acetyltransferase closely related to homoserine O-acetyltransferase. // Journal Of Bacteriology. 1992. Vol.

174, №9. P. 3056-3064.

36. Teijeira F. et al. CefR modulates transporters of beta-lactam intermediates preventing the loss of penicillins to the broth and increases cephalosporin production in Acremonium chrysogenum. // Metabolic Engineering. 2011. Vol. 13, № 5. P. 532-543.

37. Martin J.F., Liras P. Organization and expression of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites // Annu. Rev. Microbiol. 1989. Vol. 43. P. 173-206.

38. Demain A.L. Biosynthesis of b-lactam antibiotics. // Antibiotics containing the b-lactam structure / ed. Demain A.L., Solomon N.A. New York: Springer-Verlag, 1983. P. 189-228.

39. Martín J.F., Ullán R. V, García-Estrada C. Regulation and compartmentalization of (3-lactam biosynthesis. // Microbial biotechnology. WILEY-BLACKWELL, 2010. Vol.3, №3. P. 285-299.

40. Bhattacharjee J.K. Evolution of a-aminoadipate pathway for the synthesis of lysine in fungi // The evolution of metabolic function. / ed. Mortlock R.P. Boca Raton: CRC Press, 1992. P. 47-80.

41. Vogel H.J. Two modes of lysine synthesis among lower fungi: evolutionary significance // Biochim. Biophys. Acta. 1960. Vol. 41. P. 172-173.

42. Novak J., Kopecky J., Vanek Z. Nitrogen source regulates expression of alanine dehydrogenase isoenzymes in Streptomyces avermitilis in a chemically defined medium // Canadian Journal Of Microbiology. 1997. Vol. 43, № 2. P. 189-193.

43. Shapiro S. Nitrogen assimilation in actinomycetes and the influence of nitrogen nutrition on actinomycete secondary metabolism. // Regulation of secondary metabolism in actinoycetes. / ed. Shapiro S. Boca Raton: CRCPress, 1989. P. 135-211.

44. Valmaseda E.M.M. De et al. Lysine is catabolized to 2-aminoadipic acid in Pénicillium chrysogenum by an omega-aminotransferase and to saccharopine by a lysine 2-ketoglutarate reductase. Characterization of the omega-aminotransferase. // Molecular genetics and genomics MGG. 2005. Vol. 274, № 3. P. 272-282.

45. Affenzeller K. et al. Lysine biosynthesis in Pénicillium chrysogenum is regulated by feedback inhibition of alpha-aminoadipate reductase. // FEMS Microbiology Letters. 1989. Vol. 49, № 2-3. P. 293-297.

46. Weidner G., Steffan B., Brakhage A.A. The Aspergillus nidulans lysF gene encodes homoaconitase, an enzyme involved in the fungus-specific lysine biosynthesis pathway. // Molecular general genetics MGG. 1997. Vol. 255, № 3. P. 237-247.

47. Nuesch J., Heim J., Treichler H. The biosynthesis of sulfur containing b-lactam antibiotics. // Annu Rev Microbiol. . 1987. Vol. 41. P. 51-75.

48. Pieniazek N.P., Stepien P., Paszewski A. An Aspergillus nidulans mutant lacking cystathionine-synthase: identity of L-serine sulfhydrylase with cystathionine-synthase and its distinctness from O-acetyl-L-serine sulfhydrylase. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. Vol. 297. P. 37^7.

49. Treichler H.J. et al. Role of sulfur metabolism in cephalosporin C and penicillin biosynthesis // Genetics of industrial microorganisms / ed. Sebeck O.K., Laskin A.I. Washington: American Society for Microbiology,, 1979. P. 97-104.

50. Martin J.F., Aharonowitz Y. Regulation of biosynthesis of b-lactam antibiotics. // Antibiotics containing the b-lactam structure / ed. Demain A.L., Solomon N.A. Berlin: Springer-Verlag, 1983. P. 229-254.

51. Banko G., Wolfe S., Demain A.L. Cell-free synthesis of delta-(L-alpha-aminoadipyl)-L-cysteine, the first intermediate of penicillin and cephalosporin biosynthesis. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1986. Vol. 137, № l.P. 528-535.

52. Kleinkauf H. et al. Biosynthesis of peptides: a non-ribosomal system // Die Naturwissenschaften. 1992. Vol. 79, № 4. P. 153-162.

53. Zhang J., Demain A.L. ACV synthetase. // Critical Reviews in Biotechnology. 1992. Vol. 12, № 3. P. 245-260.

54. Zhang J.Y., Demain A.L. Purification from Cephalosporium acremonium of the initial enzyme unique to the biosynthesis of penicillins and cephalosporins. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1990. Vol. 169, № 3. P. 1145-1152.

55. Baldwin J.E. et al. Isolation and partial characterisation of ACV synthetase from Cephalosporium acremonium and Streptomyces clavuligerus. Evidence for the presence of phosphopantothenate in ACV synthetase. // The Journal of antibiotics. 1991. Vol. 44, № 2. P. 241-248.

56. Van Der Lende T.R. et al. delta-(L-alpha-Aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase, that mediates the first committed step in penicillin biosynthesis, is a cytosolic enzyme. // Fungal genetics and biology FG B. 2002. Vol. 37, № l.P. 49-55.

57. White R.L. et al. Stoichiometry of oxygen consumption in the biosynthesis of isopenicillin from a tripeptide. // The Biochemical journal. 1982. Vol. 203, № 3. P.791-793.

58. O'Sullivan J. et al. Incorporation of 3H from delta-(L-alpha-amino (4,5-3H)adipyl)-L-cysteinyl-D-(4,4-3H)valine into isopenicillin N. // The Biochemical journal. 1979. Vol. 184, № 2. P. 421-426.

59. Konomi T. et al. Cell-free conversion of delta-(L-alpha-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine into an antibiotic with the properties of isopenicillin N in Cephalosporium acremonium. // The Biochemical journal. 1979. Vol. 184, № 2. P. 427-430.

60. Fawcett P.A. et al. Synthesis of delta-(alpha-aminoadipyl)cysteinylvaline and its role in penicillin biosynthesis. // The Biochemical journal. 1976. Vol. 157, № 3. P. 651-660.

61. Roach P.L. et al. Structure of isopenicillin N synthase complexed with substrate and the mechanism of penicillin formation. // Nature. MACMILLAN MAGAZINES LTD, 1995. Vol. 375, № 6635. P. 700-704.

62. Brakhage A.A., Turner G. Biotechnical genetics of antibiotic biosynthesis. // The Mycota. II. Genetics and biotechnology. / ed. Kuck U. Berlin: Springer-Verlag KG, 1995. P. 263-285.

63. Samson S.M. et al. Isolation, sequence determination and expression in Escherichia coli of the isopenicillin N synthetase gene from Cephalosporium acremonium. //Nature. 1985. Vol. 318, № 6042. P. 191-194.

64. Jayatilake G.S., Huddleston J.A., Abraham E.P. Conversion of isopenicillin N into penicillin N in cell-free extracts of Cephalosporium acremonium. // The Biochemical journal. 1981. Vol. 194, № 2. P. 645-647.

65. Martín J.F., Ullán R. V, Casqueiro J. Novel genes involved in cephalosporin biosynthesis: the three-component isopenicillin N epimerase system. // Advances in biochemical engineeringbiotechnology. 2004. Vol. 88. P. 91-109.

66. Scheidegger A., Küenzi M.T., Nüesch J. Partial purification and catalytic properties of a bifunctional enzyme in the biosynthetic pathway of beta-lactams in Cephalosporium acremonium. // The Journal of antibiotics. 1984. Vol. 37, № 5. P. 522-531.

67. Dotzlaf J.E., Yeh W.K. Copurification and characterization of deacetoxycephalosporin C synthase/hydroxylase from Cephalosporium acremonium. //J. Bacteriol. 1987. Vol. 169. P. 1611-1618.

68. Wu X.-B. et al. C-terminus mutations of Acremonium chrysogenum deacetoxy/deacetylcephalosporin C synthase with improved activity toward penicillin analogs. // FEMS Microbiology Letters. 2005. Vol. 246, № l.P. 103110.

69. Chen H., Han H., Xu G.Z. Cloning, sequence analysis of deacetoxycephalosporin C synthetase/hydroxylase gene cefEF // Sheng wu gong cheng xue bao Chinese journal of biotechnology. 2001. Vol. 17, № 3. P. 297-299.

70. Samson S.M. et al. Cloning and expression of the fungal expandase/hydroxylase gene involved in cephalosporin biosynthesis. // Biotechnology. 1987. Vol. 5. P. 1207-1214.

71. Van Den Berg M.A. et al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. // Nature Biotechnology. Nature Publishing Group, 2008. Vol. 26, № 10. P. 1161-1168.

72. Jami M.-S. et al. Proteome analysis of the penicillin producer Penicillium chrysogenum: characterization of protein changes during the industrial strain improvement. // Molecular cellular proteomics MCP. 2010. Vol. 9, № 6. P. 1182— 1198.

73. Fernández-Aguado M. et al. A vacuolar membrane protein affects drastically the biosynthesis of the ACV tripeptide and the beta-lactam pathway of Penicillium chrysogenum. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2012.

74. Klionsky D.J., Herman P.K., Emr S.D. The fungal vacuole: composition, function, and biogenesis. // Microbiological reviews. 1990. Vol. 54, № 3. P. 266-292.

75. Honlinger C., Kubicek C.P. Regulation of delta-(L-alpha-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine and isopenicillin N biosynthesis in Penicillium chrysogenum by the alpha-aminoadipate pool size. // FEMS Microbiology Letters. 1989. Vol. 53, № 1-2. P. 71-75.

76. Alvarez E. et al. The isopenicillin-N acyltransferase of Penicillium chrysogenum has isopenicillin-N amidohydrolase, 6-aminopenicillanic acid acyltransferase and penicillin amidase activities, all of which are encoded by the single penDE gene. // The Federation of European Biochemical Societies Journal. 1993. Vol. 215, № 2. P. 323-332.

77. Kiel J.A.K.W. et al. Overproduction of a single protein, Pc-Pexllp, results in 2fold enhanced penicillin production by Penicillium chrysogenum. // Fungal genetics and biology FG B. 2005. Vol. 42, № 2. P. 154-164.

78. Evers M.E. et al. Compartmentalization and transport in beta-lactam antibiotics biosynthesis. // Advances in biochemical engineeringbiotechnology. 2004. Vol. 88. P. 111-135.

79. Heiland I., Erdmann R. Biogenesis of peroxisomes. Topogenesis of the peroxisomal membrane and matrix proteins. // The FEBS journal. 2005. Vol. 272, № 10. P. 2362-2372.

80. Ullan R. V et al. Characterization of a novel peroxisome membrane protein essential for conversion of isopenicillin N into cephalosporin C. // The Biochemical journal. 2010. Vol. 432, № 2. P. 227-236.

81. Teijeira F. et al. The transporter CefM involved in translocation of biosynthetic intermediates is essential for cephalosporin production. // The Biochemical journal. 2009. Vol. 418, № l.P. 113-124.

82. Andrade A.C. et al. The role of ABC transporters from Aspergillus nidulans in protection against cytotoxic agents and in antibiotic production. // Molecular general genetics MGG. 2000. Vol. 263, № 6. P. 966-977.

83. Ullân R. V et al. The cefT gene of Acremonium chrysogenum CIO encodes a putative multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production. // Molecular genetics and genomics MGG. 2002. Vol. 267, № 5. P. 673-683.

84. Nijland J.G. et al. Expression of the transporter encoded by the cefT gene of Acremonium chrysogenum increases cephalosporin production in Pénicillium chrysogenum. // Fungal genetics and biology FG B. Elsevier Inc., 2008. Vol. 45, № 10. P. 1415-1421.

85. Ullân R. V et al. Deacetylcephalosporin C production in Pénicillium chrysogenum by expression of the isopenicillin N epimerization, ring expansion, and acetylation genes. // Chemistry & Biology. 2007. Vol. 14, № 3. P. 329-339.

86. Ullân R. V, Teijeira F., Martin J.F. Expression of the Acremonium chrysogenum cefT gene in Penicillum chrysogenum indicates that it encodes an hydrophilic beta-lactam transporter. // Current Genetics. 2008. Vol. 54, № 3. P. 153-161.

87. Velasco J. et al. Cloning and characterization of the gene cahB encoding a cephalosporin C acetylhydrolase from Acremonium chrysogenum. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2001. Vol. 57, № 3. P. 350-356.

88. Liu Y. et al. Improvement of cephalosporin C production by recombinant DNA integration in Acremonium chrysogenum. // Molecular Biotechnology. 2010. Vol. 44, №2. P. 101-109.

89. Saier M.H. et al. The major facilitator superfamily. // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 1999. Vol. 1, № 2. P. 257-279.

90. Neu H.. The crisis in antibiotic resistance. // Science. 1992. Vol. 257. P. 10641073.

91. Saier M.H. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane solute transporters. // Microbiology and molecular biology reviews MMBR. 2000. Vol. 64, №2. P. 354^111.

92. Pao S.S., Paulsen I.T., Saier M.H. Major facilitator superfamily. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 62, № 1. P. 1-34.

93. Hirai T. et al. Structural Model for 12-Helix Transporters Belonging to the Major Facilitator Superfamily // Journal Of Bacteriology. American Society for Microbiology, 2003. Vol. 185, № 5. P. 1712-1718.

94. Reddy V.S. et al. The Major Facilitator Superfamily (MFS) Revisited. // The FEBS journal. 2012. Vol. 279, № 11. P. 2022-2035.

95. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. Proton-dependent multidrug efflux systems. // Microbiological reviews. American Society for Microbiology (ASM), 1996. Vol. 60, № 4. P. 575-608.

96. Paulsen I.T., Sliwinski M.K., Saier M.H. Microbial genome analyses: global comparisons of transport capabilities based on phylogenies, bioenergetics and substrate specificities. // Journal of Molecular Biology. ACADEMIC PRESS LTD, 1998. Vol. 277, № 3. P. 573-592.

97. De Rossi E. et al. mmr, a Mycobacterium tuberculosis Gene Conferring Resistance to Small Cationic Dyes and Inhibitors // Journal Of Bacteriology. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 180, № 22. P. 6068-6071.

98. Sa-Correia I. et al. Drug:H+ antiporters in chemical stress response in yeast. // Trends in Microbiology. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 17, № 1. P. 22-31.

99. Guan L., Kaback H.R. Lessons from lactose permease. // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. NIH Public Access, 2006. Vol. 35, № 1. P. 67-91.

100. Law C.J., Maloney P.C., Wang D.-N. Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters. // Annual review of microbiology. 2008. Vol. 62. P. 289-305.

101. Kaback H.R. et al. Site-directed alkylation and the alternating access model for LacY. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. National Acad Sciences, 2007. Vol. 104, № 2. P. 491^194.

102. Murray D.S., Schumacher M.A., Brennan R.G. Crystal structures of QacR-diamidine complexes reveal additional multidrug-binding modes and a novel mechanism of drug charge neutralization. // The Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279, № 14. P. 14365-14371.

103. Zheleznova E.E. et al. Structural basis of multidrug recognition by BmrR, a transcription activator of a multidrug transporter. // Cell. 1999. Vol. 96, № 3. P. 353-362.

104. Schumacher M.A. et al. Structural mechanisms of QacR induction and multidrug recognition // Science. 2001. Vol. 294, № 5549. P. 2158-2163.

105. Abramson J. et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. // Science. AAAS, 2003. Vol. 301, № 5633. P. 610-615.

106. Inoue H. et al. Essential aspartic acid residues, Asp-133, Asp-163 and Asp-164, in the transmembrane helices of a Na+/H+ antiporter (NhaA) from Escherichia coli. // FEBS Letters. 1995. Vol. 363, № 3. P. 264-268.

107. Muth T.R., Schuldiner S. A membrane-embedded glutamate is required for ligand binding to the multidrug transporter EmrE // the The European Molecular Biology Organization Journal. Oxford University Press, 2000. Vol. 19, № 2. P. 234-240.

108. Hunte C. et al. Structure of a Na+/H+ antiporter and insights into mechanism of action and regulation by pH. //Nature. 2005. Vol. 435, № 7046. P. 1197-1202.

109. Rouch D.A. et al. Efflux-mediated antiseptic resistance gene qacA from Staphylococcus aureus: common ancestry with tetracycline- and sugar-transport proteins. // Molecular Microbiology. 1990. Vol. 4, № 12. P. 2051-2062.

110. Paulsen I.T., Skurray R.A. Topology, structure and evolution of two families of proteins involved in antibiotic and antiseptic resistance in eukaryotes and prokaryotes—an analysis. // Gene. 1993. Vol. 124, № 1. P. 1-11.

111. Marger M.D., Saier M.H. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport. // Trends in Biochemical Sciences . 1993. Vol. 18, № l.P. 13-20.

112. Griffith J.K. et al. Membrane transport proteins: implications of sequence comparisons. // Current Opinion in Cell Biology. Elsevier, 1992. Vol. 4, № 4. P. 684-695.

113. Levy S. Active efflux mechanisms for antibiotic resistance // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. Vol. 36. P. 695-703.

114. Yamaguchi A., et al. Metal-tetracycline/H+ antiporter of Escherichia coli encoded by transposon TnlO; the structural resemblance and functional difference in the role of the duplicated sequence motif between hydrophobic segments 2 and 3 and segments 8 and 9 // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 6496-6504.

115. Rubin R.A. et al. Gene duplication in the evolution of the two complementing domains of gram-negative bacterial tetracycline efflux proteins. // Gene. 1990. Vol. 87, № l.P. 7-13.

116. Paulsen I.T. et al. The SMR family: a novel family of multidrug efflux proteins involved with the efflux of lipophilic drugs. // Molecular Microbiology. 1996. Vol. 19, №6. P. 1167-1175.

117. Jessen-Marshall A.E., Paul N.J., Brooker R.J. The conserved motif, GXXX(D/E)(R/K)XG[X](R/K)(R/K), in hydrophilic loop 2/3 of the lactose permease. // The Journal of Biological Chemistry. 1995. Vol. 270, № 27. P. 16251-16257.

118. Kimura T. et al. Roles of conserved arginine residues in the metal-tetracycline/H+ antiporter of Escherichia coli // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 16. P. 5475-5480.

119. Varela M.F., Sansom C.E., Griffith J.K. Mutational analysis and molecular modelling of an amino acid sequence motif conserved in antiporters but not symporters in a transporter superfamily. // Molecular Membrane Biology. Taylor & Francis Ltd London, 1995. Vol. 12, № 4. P. 313-319.

120. Mazurkiewicz P., Driessen A.J.M., Konings W.N. Energetics of wild-type and mutant multidrug resistance secondary transporter LmrP of Lactococcus lactis. // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. Vol. 1658, № 3. P. 252-261.

121. Adler J., Lewinson O., Bibi E. Role of a conserved membrane-embedded acidic residue in the multidrug transporter MdfA. // Biochemistry. 2004. Vol. 43, № 2. P. 518-525.

122. Mitchell B.A. et al. Bioenergetics of the staphylococcal multidrug export protein QacA. Identification of distinct binding sites for monovalent and divalent cations. // The Journal of Biological Chemistry. 1994. Vol. 269, № 45. P. 3541-3548.

123. Fluman N., Bibi E. Bacterial multidrug transport through the lens of the major facilitator superfamily. // Biochimica et Biophysica Acta. Elsevier B.V., 2009. Vol. 1794, №5. P. 738-747.

124. Lewinson O. et al. The Escherichia coli multidrug transporter MdfA catalyzes both electrogenic and electroneutral transport reactions. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. The National Academy of Sciences, 2003. Vol. 100, № 4. P. 1667-1672.

125. Rotem D., Schuldiner S. EmrE, a multidrug transporter from Escherichia coli, transports monovalent and divalent substrates with the same stoichiometry. // The Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279, № 47. P. 48787-48793.

126. Ueda K., Taguchi Y., Morishima M. How does P-glycoprotein recognize its substrates? // Seminars in Cancer Biology. Elsevier, 1997. Vol. 8, № 3. P. 151159.

127. Paulsen I.T. et al. Multidrug resistance proteins QacA and QacB from Staphylococcus aureus: membrane topology and identification of residues involved in substrate specificity. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996. Vol. 93, № 8. P. 3630-3635.

128. Higgins C., Gottesman M. Is the multidrug transporter a flippase? // Trends Biochem Sci. . 1992. Vol. 17, № 1. P. 18-21.

129. Altenberg G.A. et al. Unidirectional fluxes of rhodamine 123 in multidrug-resistant cells: evidence against direct drug extrusion from the plasma membrane. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994. Vol. 91, № 11. P. 4654-4657.

130. Bolhuis H. et al. Multidrug resistance in Lactococcus lactis: evidence for ATP-dependent drug extrusion from the inner leaflet of the cytoplasmic membrane. // the The European Molecular Biology Organization Journal. 1996. Vol. 15, № 16. P. 4239-4245.

131. Bolhuis H. et al. Energetics and mechanism of drug transport mediated by the lactococcal multidrug transporter LmrP // Journal of Biological Chemistry. ASBMB, 1996. Vol. 271, № 39. P. 24123-24128.

132. Bohn C., Bouloc P. The Escherichia coli cmlA gene encodes the multidrug efflux pump Cmr/MdfA and is responsible for isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside exclusion and spectinomycin sensitivity. // Journal Of Bacteriology. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 180, № 22. P. 6072-6075.

133. Yin Y. et al. Structure of the multidrug transporter EmrD from Escherichia coli. // Science. 2006. Vol. 312, № 5774. P. 741-744.

134. Langton KP, Henderson PJ, Herbert RB. Antibiotic resistance: multidrug efflux proteins, a common transport mechanism // Nat Prod Rep. 2005. Vol. 22, № 4. P. 439-451.

135. Bapna A. et al. Two proton translocation pathways in a secondary active multidrug transporter. // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2007. Vol. 12, № 3-4. P. 197-209.

136. Sigal N., Molshanski-Mor S., Bibi E. No Single Irreplaceable Acidic Residues in the Escherichia coli Secondary Multidrug Transporter MdfA // Journal Of Bacteriology. American Society for Microbiology, 2006. Vol. 188, № 15. P. 5635-5639.

137. Yerushalmi H., Lebendiker M., Schuldiner S. EmrE, an Escherichia coli 12-kDa multidrug transporter, exchanges toxic cations and H+ and is soluble in organic solvents // The Journal of Biological Chemistry. 1995. Vol. 270, № 12. P. 68566863.

138. Brown M.H., Skurray R.A. Staphylococcal multidrug efflux protein QacA. // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2001. Vol. 3, № 2. P. 163-170.

139. Neyfakh A.A. Natural functions of bacterial multidrug transporters. // Trends in Microbiology. 1997. Vol. 5, № 8. P. 309-313.

140. Lewinson O., Padan E., Bibi E. Alkalitolerance: a biological function for a multidrug transporter in pH homeostasis. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. Vol. 101, № 39. P. 1407314078.

141. Padan E. et al. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new insights. // Biochimica et Biophysica Acta. Elsevier, 2005. Vol. 1717, № 2. P. 67-88.

142. Sa-Correia I., Tenreiro S. The multidrug resistance transporters of the major facilitator superfamily, 6 years after disclosure of Saccharomyces cerevisiae genome sequence. // Journal of Biotechnology. 2002. Vol. 98, № 2-3. P. 215-226.

143. Ambesi A. et al. Biogenesis and function of the yeast plasma-membrane H(+)-ATPase. // Journal of Experimental Biology. 2000. Vol. 203, № Pt 1. P. 155-160.

144. Ferreira T, Mason AB, Slayman CW. The yeast Pmal proton pump: a model for understanding the biogenesis of plasma membrane proteins. // J Biol Chem. . 2001. Vol. 276, № 32. P. 29613-29616.

145. Scarborough G.A. Crystallization, structure and dynamics of the proton-translocating P-type ATPase. // Journal of Experimental Biology. 2000. Vol. 203, №Pt 1. P. 147-154.

146. Portillo F., De Larrinoa I.F., Serrano R. Deletion analysis of yeast plasma membrane H+-ATPase and identification of a regulatory domain at the carboxyl-terminus. // FEBS Letters. 1989. Vol. 247, № 2. P. 381-385.

147. Morth J.P. et al. REVIEWS A structural overview of the plasma membrane Na + , K + -ATPase and H + -ATPase ion pumps // Nature Reviews Molecular Cell Biology. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 12, № 1. P. 60-70.

148. Jorgensen P.L., Andersen J.P. Structural basis for E 1-E 2 conformational transitions in Na, K-pump and Ca-pump proteins // Journal of Membrane Biology. 1988.

149. Zolotarjova N. et al. Functional coupling of phosphorylation and nucleotide binding sites in the proteolytic fragments of Na+/K(+)-ATPase. // The Journal of Biological Chemistry. 2001. Vol. 276, № 24. P. 3989-3995.

150. Buch-Pedersen M.J., Palmgren M.G. Mechanism of proton transport by plant plasma membrane proton ATPases. // Journal of Plant Research. 2003. Vol. 116, №6. P. 507-515.

151. Post RL, Hegyvary C, Kume S. Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. // J Biol Chem. . 1972. Vol. 247, № 20. P. 6530-6540.

152. Olesen C. et al. The structural basis of calcium transport by the calcium pump. // Nature. 2007. Vol. 450, № 7172. P. 1036-1042.

153. Olesen C. et al. Dephosphorylation of the calcium pump coupled to counterion occlusion // Science. 2004. Vol. 306, № 5705. P. 2251-2255.

154. Toyoshima C., Mizutani T. Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP analogue. //Nature. 2004. Vol. 430, № 6999. P. 529-535.

155. Miranda M., Pardo J.P., Petrov V. V. Structure-function relationships in membrane segment 6 of the yeast plasma membrane Pmal H(+)-ATPase. // Biochimica et Biophysica Acta. 2011. Vol. 1808, № 7. P. 1781-1789.

156. Serrano R. In vivo glucose activation of the yeast plasma membrane ATPase. // FEBS Letters. 1983. Vol. 156, № 1. P. 11-14.

157. Eraso P., Gancedo C. Activation of yeast plasma membrane ATPase by acid pH during growth. // FEBS Letters. 1987. Vol. 224, № 1. P. 187-192.

158. Rao R., Drummond-Barbosa D., Slayman C.W. Transcriptional regulation by glucose of the yeast PMA1 gene encoding the plasma membrane H(+)-ATPase. // Yeast Chichester England. 1993. Vol. 9, № 10. P. 1075-1084.

159. Garcia-Arranz M. et al. Transcriptional control of yeast plasma membrane H(+)-ATPase by glucose. Cloning and characterization of a new gene involved in this

regulation. // The Journal of Biological Chemistry. 1994. Vol. 269, № 27. P. 18076-18082.

160. Arst H.N., Bignell E., Tilburn J. Two new genes involved in signalling ambient pH in Aspergillus nidulans. // Molecular general genetics MGG. 1994. Vol. 245, № 6. P. 787-790.

161. Tilburn J. et al. The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid- and alkaline-expressed genes by ambient pH. // the The European Molecular Biology Organization Journal. 1995. Vol. 14, № 4. P. 779790.

162. Orejas M. et al. Activation of the Aspergillus PacC transcription factor in response to alkaline ambient pH requires proteolysis of the carboxy-terminal moiety. // Genes & Development. 1995. Vol. 9, № 13. p. 1622-1632.

163. Reoyo E. et al. The essential Aspergillus nidulans gene pmaA encodes an homologue of fungal plasma membrane H(+)-ATPases. // Fungal genetics and biology FG B. 1998. Vol. 23, № 3. P. 288-299.

164. Lecchi S. et al. Tandem phosphorylation of Ser-911 and Thr-912 at the C terminus of yeast plasma membrane H+-ATPase leads to glucose-dependent activation. // The Journal of Biological Chemistry. 2007. Vol. 282, № 49. P. 35471-35481.

165. Romero I., Maldonado A.M., Eraso P. Glucose-independent inhibition of yeast plasma-membrane H+-ATPase by calmodulin antagonists. // The Biochemical journal. 1997. Vol. 322 (Pt 3, № pt 3. P. 823-828.

166. Brandäo R.L. et al. Glucose-induced activation of the plasma membrane H(+)-ATPase in Fusarium oxysporum. // Journal of General Microbiology. 1992. Vol. 138 Pt 8. P. 1579-1586.

167. Campetelli A.N. et al. Activation of H(+)-ATPase by glucose in Saccharomyces cerevisiae involves a membrane serine protease // Biochim Biophys Acta. . 2013. Vol. 1830, № 6. P. 3593-3603.

168. Campetelli A.N. et al. Activation of the plasma membrane H-ATPase of Saccharomyces cerevisiae by glucose is mediated by dissociation of the H(+)-

ATPase-acetylated tubulin complex. // The FEBS journal. Wiley Online Library, 2005. Vol. 272, № 22. P. 5742-5752.

169. Monk B.C., Niimi M., Shepherd M.G. The Candida albicans plasma membrane and H(+)-ATPase during yeast growth and germ tube formation. // Journal Of Bacteriology. 1993. Vol. 175, № 17. P. 5566-5574.

170. Keniya M. V et al. Heterologous expression of Candida albicans Pmalp in Saccharomyces cerevisiae. // FEMS yeast research. 2013. Vol. 13, № 3. P. 302311.

171. Lu G., Moriyama E.N. Software review Vector NTI , a balanced all-in-one sequence analysis suite // Software Review. 2004. Vol. 5, № 4. P. 378-388.

172. Newton G., Abraham E. Isolation of cephalosporin C, a penicillin-like antibiotic containing D-alpha-aminoadipic acid // Biochem J. . 1956. Vol. 62, № 4. P. 651658.

173. Бартошевич Юрий Эдуардович (RU) et al. СПОСОБ БИОСИНТЕЗА ЦЕФАЛОСПОРИНА С С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО ШТАММА ACREMONIUM CHRYSOGENUM ВКМ F-4081D: letter 2426793 USA. Russia, 2009. P. 1-8.

174. Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. // Biotechnology Nature Publishing Company. Nature Publishing Company, 1991. Vol. 9, № 10. P. 963967.

175. Spencer F. et al. Yeast karl mutants provide an effective method for YAC transfer to new hosts. // Genomics. 1994. Vol. 22, № 1. P. 118-126.

176. Nakamoto R.K., Rao R., Slayman C.W. Expression of the yeast plasma membrane [H+]ATPase in secretory vesicles. A new strategy for directed mutagenesis. // The Journal of Biological Chemistry. 1991. Vol. 266, № 12. P. 7940-7949.

177. Decottignies A. et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yorlp. // The Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273, № 20. P. 12612-12622.

178. Mortimer R.K., Johnston J.R. Genealogy of Principal Strains of the Yeast Genetic Stock Center // Genetics. Genetics Soc America, 1986. Vol. 113, № 1. P. 35-43.

179. Carroll A.M., Sweigard J.A., Valent B. Improved vectors for selecting resistance to hygromycin // Fungal Genetics Newsletter. 1994. Vol. 41. P. 22.

180. Pall M.L., Brunelli J.P. A series of six compact fungal transformation vectors containing polylinkers with multiple unique restriction sites. Fungal Genet. Newslett. 40: 59-62 // Fungal Genet. Newslett. .1993. Vol. 40. P. 59-62.

181. Hajdukiewicz P., Svab Z., Maliga P. The small, versatile Ppzp family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation // Plant Molecular Biology. 1994. Vol. 25, № 6. P. 989-994.

182. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor laboratory press // New York. Cold Spring Harbor, 1989. P. 931-957.

183. Harju S., Fedosyuk H., Peterson K.R. Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab // BMC Biotechnology. BioMed Central, 2004. Vol. 4, № 1. P. 8.

184. Al-Samarrai Т.Н., Schmid J. A simple method for extraction of fungal genomic DNA. // Letters in Applied Microbiology. 2000. Vol. 30, № 1. P. 53-56.

185. Gietz R.D., Schiestl R.H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. // Nature Protocols. Nature Publishing Group, 2007. Vol. 2, № 1. P. 31-34.

186. Holsters M. et al. Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens. // Molecular general genetics MGG. 1978. Vol. 163, № 2. P. 181-187.

187. Khang C.H. et al. Filamentous Fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). // Methods In Molecular Biology Clifton Nj. 2006. Vol. 344, № 1. P. 403-420.

188. Жгун A.A. et al. Генетическая трансформация мицелиальных грибов Acremonium chrysogenum // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Vol. 44, № 6. Р. 663-670.

189. Smriti, Krishnamurthy S.S., Prasad R. Membrane fluidity affects functions of Cdrlp, a multidrug ABC transporter of Candida albicans. // FEMS Microbiology Letters. 1999. Vol. 173, № 2. P. 475-481.

190. Nelissen В., De Wachter R., Goffeau A. Classification of all putative permeases and other membrane plurispanners of the major facilitator superfamily encoded by the complete genome of Saccharomyces cerevisiae. // FEMS Microbiology Reviews. 1997. Vol. 21, № 2. P. 113-134.

191. Puchkov E.O. et al. Cytoplasmic membrane of a sensitive yeast is a primary target for Cryptococcus humicola mycocidal compound (microcin). // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. Vol. 1512, № 2. P. 239-250.

192. Thykaer J., Nielsen J. Metabolic engineering of |3-lactam production // Metabolic Engineering. 2003. Vol. 5, № 1. P. 56-69.

193. Sokolovsky V. et al. Fast and reliable mini-prep RNA extraction from Neurospora crassa // Fungal Genet Newsl. 1990. Vol. 37. P. 41—43.

194. Diez В. et al. The gene encoding gamma-actin from the cephalosporin producer Acremonium chrysogenum. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2000. Vol. 54, №6. P. 786-791.

195. Калебина T.C. et al. Особенности структуры клеточных стенок Acremonium chrysogenum - продуцента цефалоспорина С // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Vol. 46, № 6. Р. 666-671.

196. Walz М., Kück U. Polymorphic karyotypes in related Acremonium strains. // Current Genetics. 1991. Vol. 19, № 2. P. 73-76.

197. Skatrud P.L., Queener S.W. An electrophoretic molecular karyotype for an industrial strain of Cephalosporium acremonium. // Gene. 1989. Vol. 78, № 2. P. 331-338.

198. Gutiérrez S. et al. Gene organization and plasticity of the beta-lactam genes in different filamentous fungi. // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. Vol. 75, № 1-2. P. 81-94.

199. Smith A.W. et al. Chromosome rearrangements in improved cephalosporin C-producing strains of Acremonium chrysogenum. // Current Genetics. 1991. Vol. 19, №3. P. 235-237.

200. Gutiérrez S. et al. Expression of the cefG gene is limiting for cephalosporin biosynthesis in Acremonium chrysogenum. // Applied Microbiology and Biotechnology. 1997. Vol. 48, № 5. P. 606-614.

201. Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes // Nature. 1997. Vol. 387, №6633. P. 569-72.

202. Jacobson K., Dietrich C. Looking at lipid rafts? // Trends in Cell Biology. 1999. Vol. 9, № 3. P. 87-91.

203. Bagnat M. et al. Lipid rafts function in biosynthetic delivery of proteins to the cell surface in yeast // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. The National Academy of Sciences, 2000. Vol. 97, № 7. P. 3254-3259.

204. Lee M.C.S., Hamamoto S., Schekman R. Ceramide biosynthesis is required for the formation of the oligomeric H+-ATPase Pmalp in the yeast endoplasmic reticulum. // The Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 277, № 25. P. 22395-22401.

205. Malínská K. et al. Visualization of protein compartmentation within the plasma membrane of living yeast cells. // Molecular Biology of the Cell / ed. Riezman H. The American Society for Cell Biology, 2003. Vol. 14, № 11. P. 4427^1436.

206. Jidenko M. et al. Crystallization of a mammalian membrane protein overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. National Academy of Sciences, 2005. Vol. 102, №33. P. 11687-11691.

207. Steffensen L., Pedersen P. A. Heterologous Expression of Membrane and Soluble Proteins Derepresses GCN4 mRNA Translation in the Yeast Saccharomyces cerevisiae // Society. 2006. Vol. 5, № 2. P. 248-261.

208. Salcedo-Sora J.E., Ward S.A., Biagini G.A. A yeast expression system for functional and pharmacological studies of the malaria parasite Ca2+/H+ antiporter. // Malaria journal. 2012. Vol. 11. P. 254.

209. Joubert O. et al. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. // Methods In Molecular Biology Clifton Nj / ed. Mus-Veteau I. Humana Press, 2010. Vol. 601. P. 87-103.

210. Froissard M. et al. Heterologous expression of a plant uracil transporter in yeast: improvement of plasma membrane targeting in mutants of the Rsp5p ubiquitin protein ligase. // Biotechnology Journal. 2006. Vol. 1, № 3. P. 308-320.

211. Jungwirth H., Kuchler K. Yeast ABC transporters— a tale of sex, stress, drugs and aging. //FEBS Letters. 2006. Vol. 580, № 4. p. 1131-1138.

212. Tomitori H. et al. Multiple polyamine transport systems on the vacuolar membrane in yeast. // The Biochemical journal. 2001. Vol. 353, № Pt 3. P. 681688.

213. Tenreiro S. et al. The yeast multidrug transporter Qdr3 (Ybr043c): localization and role as a determinant of resistance to quinidine, barban, cisplatin, and bleomycin. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. Vol. 327, №3. P. 952-959.

214. Uemura T. et al. Characteristics of the polyamine transporter TPOl and regulation of its activity and cellular localization by phosphorylation. // The Journal of biological chemistry. 2005. Vol. 280, № 10. P. 9646-9652.

215. Gwynne D., Devchand M. Expression of foreign proteins in the genus Aspergillus //Biotechnology. 1992. Vol. 23. P. 203-214.

216. Olmedo-Monfil V., Cortés-Penagos C., Herrera-Estrella A. Three decades of fungal transformation: key concepts and applications. // Methods In Molecular Biology Clifton Nj. 2004. Vol. 267, № 3. P. 297-313.

217. Casas-Flores S., Rosales-Saavedra T., Herrera-Estrella A. Three decades of fungal transformation: novel technologies. // Methods In Molecular Biology Clifton Nj. Springer, 2004. Vol. 267, № Key Concepts and Applications. P. 315-325.

218. Rodriguez-Saiz M. et al. Strain improvement for cephalosporin production by Acremonium chrysogenum using geneticin as a suitable transformation marker. // FEMS Microbiology Letters. 2004. Vol. 235, № 1. P. 43-49.

219. Velasco J. et al. Environmentally safe production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) using recombinant strains of Acremonium chrysogenum. // Nature Biotechnology. Nature America Inc., 2000. Vol. 18, № 8. P. 857-861.

220. Kallow W., Von Dohren H., Kleinkauf H. Penicillin biosynthesis: energy requirement for tripeptide precursor formation by delta-(L-alpha-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Acremonium chrysogenum. // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 17. P. 5947-5952.

221. Валиахметов А.Я. et al. Динамика содержания неорганических полифосфатов при синтезе цефалоспорина с у Acremonium chrysogenum // Прикладная биохимия и микробиология .2010. Vol. 46, № 2. Р. 198-204.