Рецептор фузикокцина в плазматических мембранах высших растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук в форме науч. докл. Бабаков, Алексей Владимирович

• Бабаков, Алексей Владимирович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Бабаков, Алексей Владимирович

Актуальность проблемы. В настоящее время в исследованиях молекулярных механизмов гормональной регуляции в растениях проблема передачи регуляторного сигнала {signal transduction) начинает занимать одно из центральных мест. Определяется это двумя обстоятельствами, во-первых, для таких фитогормонов как ауксин, этилен, а также для фузикокцина обнаружены гормон-связываюище белки и установлена их локализация в мембранах, во-вторых, в растениях обнаружены G-белки, Са2т- зависимая протеинкиназа, фосфатидилинозитолтрифос-фат - все те компоненты, которые участвуют в передаче гормонального сигнала в клетках животных. Эти данные указывают на вероятную универсальность механизмов трансмембранного прохождения гормональных сигналов у животных и растений. Такое предположение подтверждается данными о механизме действия в растениях этилена, для которого в плазматических мембранах растений обнаружен рецептор, относящийся по своей структуре к двукомпо-нентным регуляторам и связанный функционально в клетке с цепочкой протеинкияаз (МАП-каскад), по которой сигнал с поверхности клетки достигает ядра. Однако, до сих пор для большинства из известных фитогормонов остается неясным, что происходит в растениях после взаимодействия фитогормонов со своим рецептором. Типичным соединением мембранного действия можно считать фузикокцин. Фузикокцин был выделен и очищен в 1964 году из культуральной жидкости гриба Fusicoccum amigdali Del. По своему строению (см.рис.1) он относится к терпеноидам - агликоном в виде своеобразной трициклической структуры, соединенным с глюкозой с изопреновой группой. Было установлено, что он стимулирует открывание устьиц, рост растяжением, прорастание семян, индуцирует корнеобразование, а также обладает антистрессовой активностью. На физиологическом уровне действие фузикокцина выражается в усилении транспорта ионов и метаболитов в клетки высших растений, связанном вероятно с активацией ИГ-АТФазы ческих мембран [Магге, 1979]. В растениях были обнаружены белки, специфически

7" зязщие фузикокцин с высоким сродством (Ко = 1-5 нМ), и показано, что они о р ~скусловных сокращении

2 | - фузикокцин; ФКР - рецептор фузикокцина; сМС - [3Н]дигидрофузикокцин; - максимальное количество центров связывания

О^ / « СНз

Т ас ч

V > О'" СНз н3с—( н,., "ОН - СНз

Рис. 1 Структурная формула локализованы в плазматических мембранах [Aducci, 1995]. Фузикокцин-связывающие бел присутствуют во всех растениях и составляют несколько процентов от общего белка плазма1 ческих мембран. Тем не менее, несмотря на их обилие и распространенность среди растен функции фузикокцин-связывающих белков оставались неясными. Параллельно с Ф связывающими белками в растениях были обнаружены фузикокцин А и вещества близкой к i му структуры, и возник вопрос, можно ли считать фузикокцин фитогормоном, и если да, то ч он регулирует и как это регулирование связано с онтогенезом растений [Муромцев, 1996].

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось установить структурн; организацию рецептора ФК, исследовать закономерности преобразования гормонального ci нала в растениях на примере рецепции фузикокцина и на основе полученных результат сделать выводы о роли рецепторов фузикокцина в онтогенезе растений.

Для реализации этой цели были выполнены следующие исследования:

1) проверка потенциальных эффекторов в плазматических мембранах для рецепторов фузикс цина;

2) сравнение биологической активности фузикокцина и его аналогов с параметрами их связна ния с рецепторами, локализованными на плазматических мембранах;

3) идентификация в растениях ГТФ-связывающих белков, локализация, очистка и выяснение участия в активации ТГ-АТФазы фузикокцином;

4) исследование участия протеинкиназ в механизме активации Н^АТФазы фузикокцином;

5) исследование организация рецептора фузикокцина;

6) изучение реакции рецепторов ФК на различные внешние воздействия.

Научная новизна. В плазматических мембранах высших растениях обнаружены ГТ< связывающие белки. Показано их разнообразие путем разделения солюбилизированного прег рата мембран на фракции и измерения их кинетических параметров связывания с негидрол зуемым аналогом ГТФ - Gpp(NH)p. Один из G-белков выделен и установлена его субъединичн структура. Исследовано участие G-белков, протеинкиназ и протеинфосфатаз при активации 4 зикокцином К'-АТФазы и полученные данные свидетельствуют в пользу прямого взаимодеж вия между ФКР и ЕГ-АТФазой при активации последней ФК без участия протеинкиназ, прот инфосфатаз и G-белков. Эти же данные позволили предположить, что во взаимодействии меж ФКР и ЕГ-АТФазой существенную роль играет их состояние фосфорилирования/ дефосфорил рования.

На плазматических мембранах из корней кукурузы, в протопластах из мезофилла и зам кающих клеток устьиц Vicia faba, а также из суспензионной культуры сахарной свеклы (Suf beet) обнаружено два типа ФК-связывающих сайтов, различающихся между собой по аффинв сти к ФК. Показано, что при делом ряде воздействий на протопласты из суспензионной культуры сахарной свеклы, моделирующих раневой, кислотный и осмотический стресс, происходит взаимопереход ФК-связывающих сайтов разной аффинности. На этом же объекте обнаружен новый тип рецепторов ФК -"молчащий", активируемый осмотическим стрессом, и показано, что существует равновесие в клетке между состояниями разной аффинности рецептора к ФК. На основе взаимодействия между ФК и его рецепторами в плазматических мембранах предложен и апробирован высокочувствительный метод измерения в экстрактах из растений эндогенных ФК-подобных лигандов.

Методом радиационной инактивации белков установлено, что ФКР низкой и высокой аффинности отличаются между собой по молекулярной массе. Этим методом удалось обнаружить "молчащие" рецепторы в изолированных микросомальных мембранах и показать, что их активация связана с деградацией комплекса с молекулярной массой 420 кДа. Показано также, что низко- и высокоаффинные ФКР инактивируются под действием гидролитических ферментов с наружной поверхности протопласта. Исходя из собственных и литературных данных, предложена схема организации ФКР в виде лабильного комплекса димера белков 14-3-3 с НГ-АТФазой и с другим белком мол. массы 60 кДа, имеющим гликозшшрованный домен на наружной поверхности плазматической мембраны.

Полученные экспериментальные данные позволили сформулировать предположение о возможной роли крупных молекулярных комплексов в плазматических мембранах с участием белков 14-3-3 в адаптации высших растений к абиотическому стрессу.

Практическая значимость. Разработанные методы могут быть применены в различных исследованиях, в частности при поиске новых и эффективных регуляторов роста растений, в исследовании первичных реакций растений на стрессовые воздействия и в разработке методов повышения устойчивости растений к неблагоприятным внешним условиям. Полученные в данной работе сведения о О-бешсах в высших растениях, об участии в адаптации к стрессу белков 14-3-3 делают более эффективным и целенаправленным уровень исследований по повышению устойчивости растений к неблагоприятным условиям.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных конференциях, включая Международные симпозиумы: "Регуляторы роста растений" (ГейдельбергД986), "Биохимические механизмы, вовлекаемые в регуляцию роста растений" (Милан, 1991), 6 конгресс Федерации Европейских обществ физиологов растений (Сплит, 1988), на Международном симпозиуме "Прием и передача сигналов растигельных гормонов" (Москва 1994), на симпозиумах "Физико-химические основы физиоло растений" (Пенза 1996; Москва 1997).

По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа; список работ приведе конце автореферата.

Работа выполнена в отделе гормональной регуляции онтогенеза растений, руководим акад. Г.С.Муромцевым. В экспериментах принимали участие Н.Ю-Абрамычева, С.В.Билу] Е.Э.Данилина, А.В.Драбкин, О.И.Клычников, М.С.Трофимова (ИФР РАН), А.Г.Шебунин и р гие коллеги. Всем им автор выражает глубокую благодарность. Автор благодарит также за стоянную поддержку и плодотворные дискуссии акад. Г.С.Муромцева.

Сопоставление величин биологически активных концентраций ФК и i раметров его связывания с плазматическими мембранами

Впервые высокоспецифичные сайты связывания ФК в растениях были обнаружены в м росомальных фракциях из проростков кукурузы и листьев шпината в 1977 году (Dorhman et; Константа диссоциации ФК с ФК-связывакшдами сайтами была равна несколько нМоль. Дат после совершенствования методов очистки плазматических мембран растений было показа что именно на плазматических мембранах локализованы ФК-связывающие сайты (Feyerabi and Weiler, 1988; De Boer et al., 1989). Были получены производные ФК и исследована корре ция между их физиологической активностью и способностью связываться с микросомальнн мембранами (Ballio et al.,1991; Feyerabend et al., 1988; Stout, 1988). Такая корреляция была ус новлена и ФК-связывающие сайты стали называть рецепторами ФК (Aducci et al., 1992). Одна в проведенных работах биологическую активность ФК и его производных измеряли при фик рованной концентрации 10"5М и затем сопоставляли ее с константой диссоциации ФК и фузикокцинов В, С, D, Н и J на отделенных отрезках кукур) и измерены константы диссоциации их комплексов с плазматическими мембранами, вы ленными из этого же объекта.

Объектом исследования служили корни 4-х дневных этиолированных проростков кукур;, сортов "Наднепрянская-50" и "Пионер". Вначале методом дифференциального центрифугиро нвд получали микросомалыще мембраны, а затем из них распределением в двуфазовой жида полимерной системе ПЭГ/Декстран (Albertsori, 1971) выделяли фракцию, обогащенную плаз! тическими мембранами. Чистоту полученных препаратов оценивали путем измерения актив] сти маркерных ферментов: НАДН-цитохром с редуктазы (тонопласт, наружная митохондриаль-ная мембрана, эндоплазматический ретикулум), НАДФН-цитохром с редуктазы (эндоплазматический ретжулум), сукцинат-цитохром с редуктазы (внутренняя митохондриаль-ная мембрана) и ингибиторов АТФаз различных клеточных мембран. Ориентацию изолированных мембранных везикул оценивали путем измерения АТФазной активности в присутствии и в отсутствие в среде измерения Тритона Х-100. Полученные результаты показали, что выделенная нами мембранная фракция состоит в основном из правильно ориентированных везикул плазматических мембран.

Анализ данных по связыванию dhFC с плазматическими мембранами (рис.2) с помощью компьютерной программы Enzfitter (RJ.Leathher-barrow, 1.05, Cambridge, UK) показал, что они хорошо описываются одноместной моделью связывания со следующими параметрами: константа диссоциации Ко = (1,7 ± 0,3) нМ и максимальное количество мест связывания Вшах = (6 25) пмоль/мг белка, На стационарный уровень связывание dhFC выходит за 60-^80 мин.

В качестве биологических тестов нами выбраны поглощение S6Rb отделенными корнями кукурузы и их удлинение. Активация поглощения S6Rb корнями под действием фузикокцина обусловлена, вероятно, гиперполяризацией плазматической мембраны за счет усиления оттока из клеток ионов водорода [Marre, 1979], а более быстрое удлинение - в соответствии с теорией кислого роста (Rayle and Cleland, 1977).

0,3 dpm o 1000 / o;¿ f

S3 мин sj. 0 0 40 ВО

В (моль/л

Рис. 2 Кинетика и концентрационная зависимость связывания с изолированными плазматическими мембранами [ЩС 100 - « О Связывание ФК f4« о—о—О—-о * Рост корней +

50 \\

4,5 5,5 в,5 7,5 8,5 9,5 10,

Концентрация ФК (-log М)

Рис.3. Сравнение связывания с плазма-леммой dhFC и влияние FC А на удлинение отделенных корней и поглощение ими 86 Rb+. За 100% приняты значения измеряемых параметров в отсутствие ФК. (Из: Бабаков и соавт. 1990, Биол. мемб. 7: 107-112; Abramycheva et al. 1991, Planta, 183: 315320).

Из рис.3 видно, что концентрационные зависимости биологической активности ФК А совг дают, тогда как насыщение связывания ШтРС с плазматическими мембранами происходит п] гораздо меньших концентрациях. В табл.1 показаны результаты подобных измерений для анал гов ФК.

Табл.1 Сравнение биологической активности фузикокцинов с их сродством к плазмат ческой мембране (Из Бабаков с соавт. 1990, Биол. мем., 7: 107-112)

Фузикокцин А(ВС) С J H

Ко, нМ 1,7 + 0,2 1,0 +0,1 2,5 + 0,2 20 +

Поглощение s6Rb, С50, нМ 310 + 60 140 ±20 730 + 90 3000 ±

Удлинение корней, С50, нМ 150 ±30 120 ±20 500 ± 80 1100 +

Примечание: Gso - концентрация, при которой наблюдается 50% ответ.

Из полученных результатов следует, что действительно биологическая активность ФК корр лирует с величиной Ко комплекса шшмалемма-фузикокцин. Так фузикокцин A,B,C,D,J, имеющие близкие значения Kd , проявляют приблизительно одинаковую биолог) ческую активность в наших тестах. В то же время концентрационные зависимости биол( гической активности фузикокцина H в соответствии с Ко сдвинуты в область более высоки концентраций. Однако, для всех исследованных нами фузикокцинов сохраняется одна и т же закономерность, а именно: их действующая концентрация примерно на два порядка выл той, которая должна быть эффективной в биологических тестах, исходя из значений Kd Этот результат, с одной стороны, подтверждает высокую специфичность ФК-связывающи сайтов фузикокцина, а с другой - указывает на расхождение эффективности действия ФК в си( теме in vivo и in vitro.

Одно из возможных объяснений наблюдаемому противоречию заключается в том, чт плазматические мембраны по мере их выделения претерпевают изменения, в результате кс торых меняется аффинность ФК-связывающих сайтов или происходит потеря ФК связывающиих сайтов низкого сродства. Поэтому представлялось целесообразным провеет исследование связывания ФК на таком объекте, который, с одной стороны, был бы боле приближен к системе in vivo, а с другой стороны, позволял бы также проводить и биологаче ские испытания. Поставленные задачи мы попробовали решить на протопластах. Протопла сты выделяли из мезофилла или замыкающих клеток листьев Vicia faba. Выбор источник протопластов был определен двумя обстоятельствами, во-первых, разработанностью метода ки получения протопластов из Vicia faba, во-вторых, известной уже к началу нашей работ! компетентностью протопластов из замыкающих клеток Vicia faba к ФК (стимуляция выхо да протонов и входа ионов калия) [Clint,1985; Lin et. al,1984]. Эти данные указывали на то, чп протопласты Vicia faba , по-видимому, имеют ФКР и подходят поэтому для поставленной задачи.

Протопласты существенно отличаются от используемых ранее объектов для изучения связывания меченых лигандов, поэтому прежде всего предстояло выяснить, какими структурами протопласта обусловлено его связывание ФК. Суммарное связывание (Btot) ФК с протопластами может складываться из связывания на плазмалемме, связывания на внутренних структурах протопластов , а также из накопления ФК во внутреннем объеме протопластов, что отражает следующее выражение:

Bto,=Bp + Bv + Bln ( 1 ), где

Вр - связывание ФК с плазматической мембраной; Bv - накопление ФК во внутреннем свободном объеме; Вщ- связывание ФК с внутренними структурами протопластов. Чтобы определить, какой из членов выражения (1) вносит существенный вклад в получаемые нами результаты, мы провели ряд специальных экспериментов. Для выяснения, происходит ли накопление ФК внутри протопластов во время их инкубации с dhFC, мы подвергали протопласты осмотическому шоку перед последней стадией отмывки от несвязавшейся метки. Теоретически, если бы протопласты накапливали ФК в своем объеме до концентраций фузи-кокцина наружного раствора, то, учитывая, что объем протопластов составляет 0,06-0,24 объема пробы (рассчитано из значения среднего диаметра протопластов - 38 мкм и количества протопластов в пробе - 2-i-8»104), значения величины Bv составили бы 15000-60000 распадов в минуту. Эта величина близка к тем, которые мы получаем в наших экспериментах по связыванию dhFC с протопластами. Однако, как следует из данных таблицы 2, осмотический шок не оказывает заметного влияния на величину Btot и, следовательно, в условиях нашего эксперимента величиной Bv можно пренебречь.

Табл. 2 Влияние осмотического шока и а-химотрипсина на связывание dhFC с протопластами мезофилла Vicia faba (Из Бабаков с соавт. 1990, Биол. мем. 7: 113-118, Бабаков и Данилина 1991, Биол. мем. 8: 134-139)

Связывание, 103 расп/мин

Протопласты суммарное неспецифическое специфическое

Нативные 8,2 ± 1,8 1,90 + 0,06 6,3 ± 0,

После осмотического шока 8,1 ±1,9 1,91 ±0,07 6,2 + 0,

После обработки а-химотршсином 3,1 ±0,6 1,80 ± 0,07 1,3 ± 0,

Примечание: концентрация dhFC - 0,2 мкМ, 25 млн расп/мин, 40 т. пр-в в пробе

Для того чтобы убедиться, что основным местом специфического связывания РС с протопластами является плазмалемма, мы подвергали протопласты действию а-химотрипсина в процессе их инкубации с ¿№0. Концентрацию а-химотрипсина подбирали таким образом, чтобы в течение часа инкубации с ферментом количество протопластов и их жизнеспособность : отличались от контроля. В наших экспериментах одновременная инкубация протопластов с I химотрипсином и (МС приводит к снижению связывания сМС на 80% (см. табл.2) Снижен: связывания <ЖРС с протопластами под действием а-химотрипсина варьировало от опыта опыту от 65 до 85%. Неполное разрушение РС-связывающих мест под действием < химотрипсина, возможно, связано с недоступностью части ФК-связывающих белков для проте лиза или со связыванием на внутренних структурах (Вш). Поскольку обработка химотрипсином вызывает существенное уменьшение связывания сШ1'С с протопластами, осмотический шок протопластов при их отмывании не сказывается на результатах измерений, • отсюда следует , что из трех величин Вр, Вш и Ву основной вклад в измеряемую нами величи вносит связывание ¿№0 с плазматической мембраной протопластов, и они, таким образо: могут быть использованы для изучения закономерностей связывания ФК с ФКР.

Рис.4. Концентрационные зависимости связываю dhFC с протопластами (2) и микросомальными мембр нами (2) Vicia faba. (Из: Бабаков и соавт. Биол. мембр ны. 1990. 7:113-118).

На рис.4 показаны концентрационные зависимое: связывания dhFC с протопластами и с микросомальш ми мембранами из мезофилла листьев Vicia faba. В о личие от фракции микросом, для которой насыщена связывания dhFC происходит при концентрации 10 нМ, в случае протопластов насыщение i наблюдалось даже при концентрации dhFC в 1 мкМ. Анализ полученных данных в координат* Скэтчарда показал, что микросомальные мембраны характеризуются одним типом мест св: зывания dhFC, а протопласты - двумя, отличающимися между собой сродством к dhFí Константа диссоциации для dhFC с микросомальными мембранами равна 2.5 ± 1,0 нМ и совп, дает по величине с константой диссоциации dhFC с плазматическими мембранами корне кукурузы.

В табл.3 приведены параметры связывания dhFC с протопластами, рассчитанные с помощь: компьютерной программы Enzfítter (RJ.Leatherbarrow, Elsevier-Biosoft, UK). Видно, что болыш часть ФК-связывающих сайтов у протопластов представлена низкоафщшыми сайтами, констш та диссоциации которых находится в области физиологически активных концентраций ФК. сожалению, на выделенных протопластах из клеток мезофилла мы не смогли зарегистрирован активацию протонного транспорта под действием ФК. Это удалось сделать на протопластах, выделенных нами из замыкающих клеток устьиц. Действующие концентрации ФК были в диапазоне 0,1 - 10 мкМ, однако получать регулярно протопласты из этого объекта и в достаточном для поставленных задач количестве нам не удалось. Более подходящей для наших целей оказалась суспензионная культура корнеплода сахарной свеклы. В предварительных экспериментах нами было установлено, что наиболее чувствительны к ФК клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Чувствительность клеток к ФК оценивали по его способности индуцировать транспорт Н1". Были подобраны условия получения протопластов (варьировали температуру, ионный состав среды, концентрацию гидролитических ферментов и время экспозиции), при которых протопласты после выделения сохраняли нативность в течение 4-5 часов и .отзывались на ФК активацией йГ-АТФазы плазматической мембраны. Активацию фермента оценивали, измеряя закисление среды инкубации протопластов и рН цитоплазмы. Для оценки рН цитоплазмы протопласты предварительно нагружали флуоресцеином и затем измеряли флуоресцентное отношение на 530 нм при возбуждении 490 и 440 нМ. Параметры связывания (МС с протопластами из этих клеток, равно как и концентрации ФК, вызывающие 50% физиологический эффект, приведены в табл.3.

Табл.3 Параметры связывания dhFC (Из: Бабаков и соавт. 1990, Биол.мемб. 2: 107-112; Abramycheva et al. 1991, Planta, 183: 315-320; Трофимова и соавт. 1996, Физиол. раст. 43: 519526)

Vicia faba Beta vulgaris протопласт мезофилл замыкающие клетки микросомальны е мембраны протопласт микросомальные мембраны

Высокоаффинный сайт Ко, нМ Вщах 2,0 ±1,5 3,0+1,7 0,15 ±0,08 0,13 ±0,09 10б/прот. 2,5 ± 1,0 0,7 + 0,3 пмоль/мг 0,85 + 0,12 0,12 ± 0,04 106/прот. 2,7 ±0,4 4,2 ±1,5 пмоль/мг

Низкоаффинный сайт KD, нМ Вщах 210 ±140 320 ±170 1,8 ± 1,2 3,2 ± 1,4 106/прот. 200 ± 90 2,7 + 0,3 10б/прот.

Табл.3 (продолжение) Физиологический эффект ФК

Активация Н+-транспорта (Beta vulgaris) закисление наружной среды клетками закисление наружной среды протопластами защелачивание цитоплазмы протопластов

Cso ФК, нМ 110 ±30 70+20 60 ±

Данные таблицы показывают, что, во-первых, параметры связывания dhFC с протопластами к разных объектов незначительно отличаются между собой, во-вторых, действующие концентр* ции ФК на протопластах по сравнению с клетками смещены немного в область меньших вел* чин и, в-третьих, при физиологически активных концентрациях ФК им заняты и высоконизко-аффинные ФК-связывающие сайты. Интересно отметить, что действие ФК на транспор протонов на протопластах начинается при концентрации ФК в среде 10 нМ. При этой концен трации ФК в соответствии с Ко занято 90% высокоаффинных сайтов и 9% низкоаффинньв Наиболее выражение действие ФК на транспорт Н"1" в протопластах проявлялось при концен трации ФК, близкой к Ко низкоаффинных сайтов. Таким образом на протопластах снимаете, противоречие между действующими концентрациями ФК и концентрациями, рассчитанными н; основе константы диссоциации, если учитывается Ко низкоаффинных сайтов. Иными словами данные, полученные на протопластах, позволяют предполагать, что обнаруженный в ню низкоаффинный ФК-связывающий сайт может играть существенную роль при ответе расте ний на действие ФК и тем самым, может рассматриваться в качестве возможного рецептор; ФК.

Основываясь на предположении, что низкоаффинные ФК-связывающие сайты плазмалеммь. играют определенную функциональную роль, нами была исследована конкуренция зг связывание с ними между различными фитогормонами и ФК. По нашим данным, подобная конкуренция отсутствует. Наблюдалось только слабое ингибирование связывания ФК с низкоаффинным сайтом при обработке протопластов 10"5 M абсцизовой кислотой, что может быть объяснено уменьшением эффективной площади протопласта, обусловленным выходом из них под действием абсцизовой кислоты осмотически активных ионов (Rachke, 1984).

Применение протопластов в качестве объекта исследования привело к двум неожиданным результатам, а именно к обнаружению расхождения между количествами ФК-связывающих сайтов в протопластах и в изолированных мембранах и к отсутствию, как правило, низкоаффинных ФК-связывающих сайтов на изолированных мембранах. Зная средний диаметр протопластов (30-40 мкм), толщину плазмалеммы, ее плотность и количество сайтов связывания на один протопласт, легко подсчитать, что плазматическая мембрана имеет примерно 90-150 пмоль ФК-связывающих сайтов на один мг общей массы. По данным Вайлера с соавт. (1989) и по нашим данным (Abramucheva et al., 1991,1993; Клычников с соавт. 1998) изолированные плазматические мембраны из корней кукурузы, клеток мезофилла Vicia faba и из суспензионной культуры сахарной свеклы содержат ФК-связывающих сайтов примерно 10-20 пмоль/мг белка, т.е. на изолированных мембранах ФКР приблизительно в 10 раз меньше, чем в протопластах.

Работая с протопластами, нам удалось показать, что ФК-связывающие сайты нестабильны и большая их часть видимо теряется при выделении мембран, причем особенно нестабильны низкоаффинные сайты (Трофимова с соавт. 1996). Скорость деградации ФК-связывающих сайтов уменьшается с падением температуры: по прошествии 120 мин после разрушения протопластов осмотическим шоком остается 10-20% от начального количества ФК-связывающих сайтов. Уменьшенная скорость деградации ФК-связывающих сайтов при пониженной температуре указывает на то, что она обусловлена, видимо, действием эндогенных ферментов (протеиназ, фос-фатаз, гликозидаз и т.д.), активирующихся при разрушении протопластов.

Низкоаффинные ФК-связывающие сайты плазматических мембран корней кукурузы

Для исследования процессов, развивающихся в плазматических мембранах после взаимодействия с ними фузикокцина, желательно иметь плазматические мембраны, которые бы несли на своей поверхности как высокоаффинные ФК-связывающие сайты, так и низкоаффинные. Исходя из повышенной чувствительности низкоаффинных ФК-связывающих сайтов к действию а-химотрипсина, наблюдаемой при связывании ФК с протопластами Vicia faba, и предположив, что в процессе выделения плазматических мембран благодаря протеолизу происходит потеря ФК-связывающих мест с низкой аффинностью, нами были внесены изменения в методику выделения плазматических мембран, направленные на сохранение в них низкоаффинных ФК-связывающих сайтов, причем особое внимание было обращено на блокирование эндогенных протеаз, освобождаемых в раствор после гомогенизации ткани.

При гомогенизации растительного материала для подавления протеолиза в среду добавляли препарат белковых ингибиторов протеиназ (БИП), выделенных из клубней картофеля. Смесь этих белков эффективно подавляет активность панкреатических сериновых протеиназ, субтилизина, протеиназ из Asp.oryzae и металлокарбоксипептидаз А и В из различных источников [Melvill and Ryan, 1972; Hass and Ryan, 1981]. В предварительных экспериментах было установлено, что протеиназная и карбоксипептвдазная активности в нашем гомогенате из корней кукурузы полностью подавлялись смесью белковых ингибиторов протеиназ, тогда как ингибирование протеиназной активности с помощью PMSF, используемого нами ранее, не наблюдалось вплоть до концентрации его 3 мМ.

Для сравнения характеристик (KD и BmiK) ФК-связывающих сайтов в мембранах, выделенных с применением БИП и без него, нами было проведено параллельное выделение плазма-леммы из одного растительного материала с добавлением PMSF или препарата БИП в среду гомогенизации.

Рис. 5. Концентрационные зависимости связывания dhFC с плазмалеммой корней кукурузы, выделенной с добавлением БИЛ в среду гомогенизации (•) и без добавления (А). (Из: Abramycheva et al. 1993. Planta. 189:301-305).

-11 -10

Из приведенных на рис.5 данных видно, что связывание ФК с плазмалеммой в обоих случаях определяется наличием на ней ФК-связывающих сайтов, обладающих разным сродством к ФК. Однако, выделение ппазмалеммы в присутствии БИЛ в гомогенизационной среде приводит к существенному увеличению количества ФК-связывающих сайтов с низкой аффинностью.

При дальнейшем изучении связывания плазмалеммой ФК было замечено, что при хранении плазмалеммы меняются характеристики связывания ФК, причем более чувствительными оказались ФК-связывающие места с низкой аффинностью. Нестабильность параметров связывания при хранении мембран могла быть обусловлена перекисным окислением липидов, поэтому во все среды при выделении и хранении мембран была введена ЭДТА, блокирующая этот процесс [Владимиров и Арчаков, 1972].

В результате проведенной работы установлено, что подавление протеолиза в среде гомогенизации приводит к резкому возрастанию (10 раз) количества низкоаффинных ФК-связывающих сайтов, а добавление ЭДТА в среды на всех стадиях выделения и хранения плазмалеммы стабилизирует параметры связывания ФК с плазмалеммой. Таким образом, удалось получить мембраны in vitro, которые по своим связывающим свойствам оказались максимально приближенными к мембранам in vivo. Большое количество низкоаффинных ФК-связывающих сайтов в изолированных нами плазматических мембранах и их стабильность позволили исследовать ряд их свойств.

Для исследования свойств ФК-связывающих сайтов с низкой аффинностью мы подобрали экспериментальные условия, при которых исключается связывание dhFC с высокоаффинными связывающими местами, воспользовавшись их свойством практически необратимо связывать ФК. Поэтому вначале фракцию плазмалеммы выдерживали в течение 1 часа в растворе с концентрацией ФК 100 нМ, а затем переносили в раствор dhFC. При такой процедуре 99% высокоаффинных ФК-связывающих мест плазмалеммы оказывается занятыми немеченым ФК, а основной вклад в измеряемую величину связывания dhFC плазмалеммой дают места с низким сродством к ФК.

Рис. 6. Временные зависимости связывания ФК с ФК-связываюхцими местами с высокой и низкой аффинностью. (Из: Abramycheva et al. 1993. Planta. 189:301305).

0 10 20 30 40 50 60 Время, мин

На рис. 6 показаны временные зависимости связывания (МС с ФК-связывающими местами плазмалеммы, обладающими как низким, так и высоким сродством к ФК. При аппроксимации с помощью компьютерной программы экспериментальных данных экспоненциальной кривой В=В(1-е"а') были получены следующие значения аьлг» (0,12 + 0,79 • 10"2 )/мин, аь^ь =(0>б8 • 10"1 ± 0,29 • 10"2) /мин. Если не учитывать диссоциацию комплекса между ФК и ФК-связывающими сайтами, тогда а -К] [ФК], где К1 есть константа скорости ассоциации между ФК и ФК-связывающими сайтами. Подставляя значения концентрации ФК при измерении временной зависимости связывания, получаем, что К1,™ =0,7 »106 /М» мин и = 0.5«108/М» мин. Из сопоставления величин констант скоростей реакции ассоциации с величинами констант диссоциации видно, что Крь : Кш » К{от • К?®*, т.е. можно сказать, что возрастание величины Ко для ФК-связывающих мест с низким сродством по сравнению с величиной К0ь обусловлено падением константы скорости ассоциации между ФК и ФК-связывающими местами.

Временная зависимость связывания ФК с ФК-связывающими сайтами низкой аффинности достаточно быстра: время полунасыщения равняется 5 минутам при концентрации ФК 0,18 мкМ. При бблыпих концентрациях ФК этот процесс будет идти быстрее, поэтому развитие во времени таких ответов растения на ФК как гиперполяризация плазмалеммы и активация транспорта протонов в большей мере, по-видимому, определяется диффузионными ограничениями для ФК, чем скоростью взаимодействия с ФК-связывающими сайгами.

Были измерены рН-зависимости связывания сШРС плазмалеммой для обоих типов ФК-связывающих мест. ФК-связывающие сайты с низким сродством имеют рН-оптимум при рН 5.5, однако, принципиальных различий в рН-зависимостях связывания ФК высоко- и низкоаффинными связывающими сайтами не наблюдалось.

Табл. 4 Сравнение конкуренции за связывание с низкоаффинными сайтами на плазмалемме между dhFC и фузикокцинами А, С, J и Н. {Из: Abramycheva et al. 1993. Planta. 189:301-305)

FC Вытеснение dhFC (25 нМ) фузикокцинами (0,5 мкМ) с низкоаффинного сайта, % К4/ ,нМ

А 60 + 8 1,7 + 0,

С 43 ± 12 1,0 ±0,

J 28 + 9 2,5 + 0,

Н 6 + 3 20 + 4,

В табл. 4 показаны результаты исследования конкурентного связывания между dhFC и фузикокцинами А, С, J и Н с ФК-связывакяцими местами низкой аффинности. Для сравнения в этой же таблице даны величины К^8* для этих же фузикокцинов. По эффективности конкурировать с dhFC за связывание с сайтами низкого сродства фузикокцины располагаются в следующем порядке: ФК А> ФК С> ФК J> ФК Н. Аналогичный ряд для ФК-связывающих мест высокого сродства - ФК С> ФК А> ФК J> ФК Н. Расхождение, наблюдаемое для фузикокцинов А и С, не столь принципиально, так как их эффективности в биологических тестах (см. таблицу 1 ), как и KD , мало отличаются между собой. Более существенно, что наблюдается соответствие между эффективностью в биологических тестах для фузикокцинов A, J и Н и их сродством к ФК-связывающим сайтами низкой аффинности, так как физиологически активные концентрации этих фузикокцинов значительно различаются мевду собой, и достоверность результатов, следовательно, более высокая.

Таким образом, проведенные исследования показали, что, во-первых, при соблюдении определенных условий выделения изолированные плазматические мембраны так же как и протопласты имеют на своей поверхности два типа ФК-связывающих сайтов, отличающихся между собой по сродству к ФК; во-вторых, количество низкоаффинных ФК-связывающих сайтов существенно превышает количество высокоаффинных ФК-связывающих сайтов; в-третьих, ряды сродства аналогов фузикокдина А к низкоаффинному ФК-связывающему сайту и их биологической активности совпадают между собой. Эти данные указывают на то, что взаимодействие ФК с низкоаффинным сайтом может быть существенным для проявления физиологической активности ФК.

Два типа ФК-связывающих сайтов в растениях может быть связано с тем, что в плазматических мембранах имеются разные ФК-связывающие белки или имеется один ФК-связывающий белок, но находящийся в разных конформационных состояниях. Литературные данные (De Boer et al. 1989; Feyrabend and Weiler 1989) указывали в большей мере на то, что ФК-связывающий белок в растениях один и представлен гетеротримером с молекулярными массами 31 и 30 кДа соответственно. В то же время из исследований свойств рецепторов гормонов животных было известно, что сродство рецептора к гормону зависит от окружения рецептора в мембране, в частности, от взаимодействия с ГТФ-связывающими белками, которые в клетках животных принимают самое непосредственное участие в передаче гормонального сигнала от рецептора к эффектору (Gilman 1987). Основываясь на вероятной универсальности молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала через плазматические мембраны (signal transduction) растений и животных, нами было предположено, что в мембранах растений рецептор фузикокцина находится в контакте с ГТФ-связывающим белком и что его аффинность зависит от этого взаимодействия. Однако в то время практически ничего не было известно о ГТФ-связывающих белках в растениях, поэтому вначале предстояло установить, действительно ли они имеются в растениях и насколько они по своей структуре и свойствам похожи на ГТФ-связывающие белки животных клеток.

ГТФ-связывающие белки в высших растениях

ГТФ-связывающие белки (G-белки) обладают рядом свойств, которые позволяют обнаруживать их в исследуемом образце уже на стадиях фракционирования клеточных органелл. Основное из них заключается в абсолютно избирательном связывании негидролизуемых аналогов

Рис. 7. Связывание [3H]Gpp(NH)p с плазмалеммой в присутствии различных нуклеотидов: 1 - Gpp(NH)p, 2-GTP, 3 - GDP, 4 - ATP, 5 - App(NH)p. Концентрация [3H]Gpp(NH)p -10"7 M. (Из: Бабаков и Абрамычева 1989, Биол. мемб. 6: 262-266)

На рис. 7 показаны результаты измерения конкуренции за связывание с плазматическими мембранами, выделенными из корней кукурузы , между негидролизуемым аналогом ГТФ [3H]Gpp(NH)p и GTP, GDP, АТР и App(NH)p. Все нуклеотиды, за исключением негидролизуемого аналога АТФ, уменьшают связывание [3H]Gpp(NH)p, однако эффективность их неодинакова. Обращает на себя внимание тот факт, что 50%-ное ингибирование связывания [3H]Gpp(NH)p наблюдается при концентрации АТФ (IC50), превышающей примерно на 2,5 порядка 1Сз0 для ГТФ. Действие АТФ, вероятно, связано с присутствием примесей ГТФ в препарате АТФ, так как негидролизуемый аналог

ГТФ по сравнению с АТФ (Gilmarn, 1987).

АТФ, получаемый, синтетическим путем, практически не влияет на связывание [3H]Gpp(NH)p. Таким образом, уже первые полученные данные свидетельствовали в пользу того, что плазматические мембраны высших растений содержат ГТФ-связывающие белки.

При очистке плазматических мембран с помощью распределения в двуфазовой полимерной системе ПЭГ/Декстран получают обычно правильно ориентированные везикулы. Ориентация везикул была использована нами для проверки локализация ГТФ-связывающего центра. Для этого измеряли связывание dhFC, для которого ориентация везикул не имеет значения, и АТ-Фазную активность (внутренняя поверхность) в присутствии и в отсутствие Тритона Х-100. Добавление к везикулам Тритона Х-100 в концентрации 0,02% приводило к параллельному увеличению АТФазной активности и связывания с ними [3H]Gpp(NH)p (в 6-7 раз), тогда как связывание dhFC при этом не изменялось. Отсюда следует, что как и ожидалось, центр связывания ГТФ находится на внутренней поверхности плазматической мембраны. Нами было показано, что насыщение связывания [3H]Gpp(NH)p с плазмалеммой происходит за 15 мин и в присутствие ионов Mg2+ оно практически необратимо (Абрамычева и Бабаков, 1989). Эта особенность взаимодействия [3H]Gpp(NH)p с ГТФ-связывающими белками плазматических мембран характерна для животных клеток (Higashijima et al. 1987).

Независимо от нас специфическая ГТФ-связывающая активность была обнаружена в ростках Arabidopsis thaliana (Blum et al. 1988) и в клетках мезофилла Vicia faba (Droback et al. 1988). Было показано также, что антитела против полипептидного фрагмента консервативной последовательности аминокислот из активного центра G-белков животных (G-common) взаимодействуют с полипептидами мембран растений (Jacobs et al., Blum et al. 1988). Все эти и наши данные позволяли предположить существование G-белков в мембранах растений, но структура их была неизвестна. Однако, прежде чем заниматься очисткой G-белков мы проверили их наличие в различных мембранных фракциях. Для этого изолированные микросомальные мембраны из ростков и корней кукурузы подвергали центрифугированию в градиенте плотности сахарозы и далее измеряли связывание с полученными фракциями dhFC и [3IT]Gpp(NH)p. В этих экспериментах связывание dhFC использовали для маркировки плазматических мембран. Проведенные исследования показали (Билуши с соавт. 1992), что для микросомальной фракции hîî ростков распределение обеих активностей совпадает. В микросомальной фракции корней распределение связывания dhFC и [3H]Gpp(NH)p не одинаковы: в области концентраций сахарозы 42-44%, характерной для мембран эндоплазматического ретикулума (Wienecke et al. 1982), наблюдается отчетливый пик связывания [3H]Gpp(NH)p, отсутствующий в микросомальной фракции ростков кукурузы. Ранее, Блюм с соавторами (1988), используя меченое производное фузикокцина в качестве маркера плазматических мембран, показали, что в микросомальной фракции, выделенной из ростков Arabidopsis thaliana G-белки локализованы, главным образом, на плазмалемме. Позднее Збелл с соавторами (1990), работая с ростками соевых бобов, обнаружил в-белки на плазматических мембранах и на мембранах эндоплазматиче-ского ретикулума. Все вышеприведенные данные указывают на то, что локализация в-белков внутри клеток растений может быть неодинаковой как для разных растений, так и для разных органов одного и того же растения.

Измерения концентрационных зависимостей связывания [3Н]Орр(ГШ)р с плазматическими мембранами, выделенными из ростков и корней кукурузы, показали (см. табл. 5), что, во-первых, параметры связывания [3Н]01рр(ЫН)р плазмалеммой корней и ростков кукурузы достаточно близки между собой; во-вторых, количество мест с низким сродством к Орр(КН)р существенно больше количества мест с более высоким сродством к Орр(ЫН)р и, в-третьих, на плазмалемме из ростков кукурузы больше Орр(ЫН)р-связывающих мест по сравнению с плазмалеммой из корней. Полученные данные позволяли предположить, что О-белки в мембранах растений, по-видимому, неоднородны по сродству к Орр(№Н)р.

Табл. 5 Параметры связывания fH]Gpp(NH)p плазматическими мембранами из ростков и

Мембраны Kdi.M Bmaxi, пмоль/мг KD2,M Вшах2, пмоль/мг

Ростков (1,5 + 0,4)» Ю~8 62+16 (4,9 + 2,9> 10"7 118 ±

Корней (3,2 + 2,7)» 10~9 1+0,4 (1,2 ±0,3)» 10"7 74 +

Чтобы проверить это предположение, нами была предпринята попытка выделить разные фракции G-белков, отличающиеся между собой по сродству к GTP. Для этото вначале G-белки были солюбилизированы из плазмалеммы ростков кукурузы тритоном Х-100, а затем подвергнуты быстрой ионообменной хроматографии на колонке Mono Q. Оказалось, что GTP-связывающая активность сходит с колонки не одним пиком, а распределена по градиенту концентрации NaCl. Сумма всех GTP-связывающих активностей, измеренных после ионообменной хроматографии, совпадает с суммарной GTP-связыващей активностью, нанесенной на колонку Mono Q. Это указывает на то, что в процессе хроматографии не происходит потери GTP-связыващей активности или ее инактивации.

Далее нами были собраны 5 фракций, отличающихся по времени удерживания на колонке: 1. 5-6 мин, 2. 8 мин, 3. 15-16 мин, 4. 22 мин, 5. 24-25 мин. Для каждой из собранных фракций были измерены концентрационные зависимости связывания [3H]GTP, специфичность связывания GTP по отношению к АТР и GTP-азцая активность, В табл.6 суммированы результаты для каждой из собранных фракций. Из представленных данных видно, что все фракции специфически связывают GTP. 2-ая и 3-я фракции проявляют GTP-азную активность, однако, как показали изглерения (данные не приводятся), она не специфична по отношению к GTP и, вероятно, обусловлена присутствием в этих фракциях фосфатаз. Видно также, что все выделенные фракцик отличаются между собой по сродству к GTP: 2-ая и 3-я имеют существенно меньшее Ко пс сравнению с Kd фракций 1,4 и 5.

Табл. 6 ГТФазная активность и параметры связывания f HJGTP фракциями, полученными после ионообменной хроматографии на колонке Mono Q (Из: Билуши и соавт. 1992, Биол мемб.9: 463- 472).

Фракция Ко, нМ ВШах, ПМОДЬ/МЛ Суммарное связываниеГ пмоль ГТФ ГТФ-азная активность фмоль/(мл- мин)

I 66 ±17 4,0 ±0,2 64 0,06 ± 0,

II 4,5 + 0,1 5,2 + 0,1 20 28 + 1,

III 12 ±6 6,7 + 0,3 53 17 + 0,

IV 63 ±31 7,2 + 0,7 30 н. о.

V 203 ± 95 13,8 ±1,2 168 0,5 + 0,

Примечание: на колонку нанесено 800 пмоль связывающей активности

Далее мы проверили, насколько сильно отличаются между собой по молекулярному весу G-белки в выделенных фракциях. Для этого 1 мл каждой фракции был сконцентрирован в 10 раз, инкубирован с [3H]GTP и нанесен на колонку Superóse 6. Для первых 3 фракций время удерживания было равно43 мин, для остальных - 42 мин.

Как следует из данных табл. 6, нам удалось разделить G-белки, которые отличаются между собой по сродству к GTP. Две из пяти фракций проявляют примерно на порядок более высокую аффинноеп> к GIP по сравнению с остальными. Отличаются они между собой и по ГТФазной активности. Судя по измерениям времени удерживания на колонке Superóse 6 G-белки во всех 5 фракциях должны быть достаточно близки между собой по молекулярному весу, а, следовательно, по субъединичному строению.

Гетерогенность G-белков в мембранах растений была подтверждена и другим способом. В процессе разработки метода выделения G-белков из плазматических мембран корней кукурузы мы обнаружили, что часть G-белков плазмалеммы можно солюбилизировать без применения детергентов, а именно путем простой процедуры размораживания-оттаивания. После двух стадий очистки с помощью быстрых ионообменной хроматографии на Mono Q и гель-фильтрации на Superóse 6 мы показали, что выделенный таким образом G-белок состоит по крайней мере из двух субъединиц 34 кДа и 27kD (Bilushi et al. 1991). Однако в процессе выделения наблюдались большие потери GTP-связывающей активности (особенно на стадии ионообменной хроматографии), что затрудняло исследовать подробно параметры связывания GTP очищенным G-белком. В то же время наши данные показывали, что при ионообменной хроматографии в присутствии тритона Х-100 не происходит инактивация вТР-связывающей активности. Поэтому мы попытались соединить преимущества солюбшшзации в-белков из мембран растений без детергента с последующей его добавкой при очистке для предотвращения инактивации.

В результате мы солюбилизировали в-белки из михросомальных мембран замораживанием-оттаиванием, а затем очищали ионообменной хроматографией и гель-фильтрацией с добавкой Тритона Х-100 в среду очистки.

Рис. 8. Ионообменная хроматография на колонке Mono Q в присутствие тритона X-100 G-белков, солюбилизированных из микросомальных фракций ростков (а) и корней (б) кукурузы: 1 - поглощение при 280 нМ, 2 - концентрации NaGl (градиент 0-0,4 М), связывание [3H]GTP. (Из: Билуши и Бабаков, 1992, Биол. мемб., 9:473-481).

Из представленных данных видно, что профили распределения GTP-связывающей активности после хроматографии имеют и сходство и различие. Как для G-белков микросом из ростков, так и из макросом корней GTP- связывающая активность сходит с колонки не одним пиком, а распределена по градиенту концентрации NaCl. В обоих случаях имеется четкий пик GTP-связывающей активности со временем удерживания, равном 8 мин., и совпадающий с узким пиком поглощения при 280 нм. Следует отметить, что этот пик поглощения обусловлен, по-видимому, низкомолекулярными компонентами , так как при концентрировании этого пика на ультрафильтрах, отсекающих белки менее 10kD, поглощение при 280 нм не возрастает.

Выше было отмечено, что в микросомальной фракции ростков кукурузы G-белки, в основном, локализованы на плазмалемме. Поэтому все три пика GTP-связывающей активности на рис.8а относятся к G-белкам плазмалеммы. Первый пик GTP-связывающей активности на рис.86 также является G-белком плазмалеммы, так как он четко проявляется, когда в качестве исходного материала для солюбшшзации брали плазматические мембраны корней кукурузы (данные не приведены). Остальные пики GTP-связывающей активности на рис. 86 в настоящее время мы не можем однозначно отнести к определенным компартментам клетки Из-за отсутствия достаточного количества данных.

Гель-фильтрация показала, что время удерживания на колонке Superóse 6 одно и то же для всех фракций и равняется 41-44 мин. Для каждой из собранных фракций из корней кукурузы после их очистки на колонке Superóse 6 была определена константа диссоциации (табл. 7). Видно, что как и при солюбшшзаций G-белков детергенгом удается разделить G-белки, солюбили-зированные замораживанием-оттаиванием, на фракции, отличающиеся по сродству к ГТФ.

Табл. 7 Параметры связывания /3Н]СТР фракциями Г—IV, полученными после ионообменной хроматографии на колонке Мопо ()НЯ. 10/1 (Из: Билуши и Бабаков, 1992, Биол. мемб., 9: 473-481).

Если не добавлять детергент после солюбгогизации G-белков, тогда при ионообменной хроматографии наблюдается полная потеря GTP-связывающей активности, соответствующей пикам 2,3,4 на рис.8. Далее, первые фракции при обеих хроматографиях со временем удерживания 8 мин были рехроматографированы на той же колонке, но при более плавном градиенте NaCl (0-0.15 М). Собранные активные фракции были объединены после каждой хроматографии, сконцентрированы ультрафильтрадией и нанесены на колонку Superóse 6. После нанесения на колонку ГТФ-связывающая активность выходила через 41-42 мин при скорости протока 0,4 мл/мин, что соответствовало по времени удерживания на колонке белку с молекулярной массой 60 Кда. На рис.9 показаны данные гель-электрофореза по фракциям (ростки кукурузы) и для смеси двух фракций со временем удерживания 41-42 мин. (корни кукурузы) так как, вероятно, из-за инактивации GTP-связывающей активности , только в этих фракциях удалось ее обнаружить. Инактивация GTP-связывающек активности происходит в основном на стадии ионообменной хроматографии, а не во времени так как солюбилизированный замораживанием-оттаиванием G-белок сохраняет GTP-связывающую активность, по крайней мере, в течение 8 часов. Этот факт вместе с защитным действием тритона указывает на то, что в данном случае основной причиной инактивацшг G-белков может быть делипидизация белка.

Из рис. 9 б видно, что в выделенном из микросом корней кукурузы препарате О-белк; присутствует два типа субъединиц с кажущимися молекулярными массами 36 кДа (а) и 27 кД* (р), и полоса в области 36 кДа раздвоена. Выше нами отмечалось, что по данным гель фильтрации молекулярная масса G-белка, выделенного после солюбилизации методом замо раживания-оттаивания плазматических мембран корней кукурузы, равна приблизительно

Фракция Кр,нМ Вшах, пмоль/мл

I 19 + 8 ,2,8 ± 0,

П 2,9+ 1,4 1,5 ±0,

Ш 8,2 + 5,2 5,2 ± 0, rv 46 +19 1,9 ±0,

Выделение G-белков без детергента.

60 кДа, поэтому нами был сделан вывод о том, что обе субъединицы а и (3 входят в состав молекулы в-белка.

Рис.9. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS белков фракций, собранных после гель-хроматографии на колонке Superóse 6 и обладающих GTP-связывающей активностью: а - из ростков, б - из корней кукурузы, М - маркеры (Из: Bilushi et al. 1991, FEBS Lett., 291: 219221; Билуши и Бабаков, 1992, Биол. мемб. 9: 473-481)

Оказалось также, что изменение интенсивности полос в области кажущихся молекулярных масс 36 кДа и 27 кДа коррелирует с изменением величины GTP-связывающей активности во фракциях после хроматографии на колонке Superóse 6, причем по мере увеличения времени удерживания на колонке наблюдается падение интенсивности окрашивания полосы с кажущейся молекулярной массой 37 кДа и возрастание интенсивности окрашивания полосы (35 кДа). Во фракциях с наибольшей GTP-связывающей активностью интенсивности окрашивания полос ai и а2 примерно равны. Поэтому можно думать, что, во-первых, в выделенном препарате присутствуют два G-белка, отличающихся между собой по a-субъединицам, но имеющих в своем составе одинаковую ß -субъединицу, и, во-вторых, что в a -субъединице локализован GTP-связывающий центр. Подтверждение этому можно найти из данных работы (Blum et al. 1988), в которой показано взаимодействие антител к консервативной последовательности аминокислот активного центра G-белков клеток животных (GçommoW) е полипеншдами мик-росомальной фракции клеток растений с кажущейся молекулярной массой 38 кДа и 34 кДа {Commelina communis), 37 кДа и 31 кДа (Vicia faba), 36 кДа и 31 кДа (Arabidopsis thialiana).

G-белок с молекулярной массой 60 кДа и субъединичной структурой выделен нами из мик-росомальных фракций корней и ростков кукурузы. Кроме этого он обнаруживается, когда в качестве исходного материала для выделения G-белков брали плазматические мембраны корней и ростков кукурузы. Белки из этих двух объектов сходят с колонки Mono Q при быстрой ионообменной хроматографии при одной и той же ионной силе. Поэтому мы полагаем, что в клетках корней и ростков кукурузы имеется один и тот же G-белок и локализован он в плазматической мембране.

Следует отметить, что установленная нами субъединичная структура для G-белка из высших растений не окончательная, и мы не исключаем возможности, что выделенный нами G-белок имеет гетеротримерную субъединичную структуру, характерную для многих G-белков клеток животных. В настоящее время мы не имеем пока данных по субъединичной структуре G-белков, сходящих с колонки Mono Q при относительно более высокой ионной силе, однако из совпадения времени удерживания для всех выделенных фракций G-белков следует, что их субъединичные структуры, по-видимому, не значительно отличаются между собой. Убедительные данные о существовании в растениях G-белков были получены, когда удалось проклонировать гены, кодирующие субъединицы Ga и G(3. Вначале был проклонирован ген Ga из Arabidopsis thaliana (GPA1) (Ма, 1991). GPA1 кодирует полипеппщ 44,6 кДа, который оказался близким по аминокислотной последовательности к бычьему трансдуцину. Далее гомологи GPA1 были обнаружены в томатах, рисе, кукурузе и сое (Ма, 1994). GPA1 экспрессируется во всех основных органах растения и на всех стадиях развития (Huang et al. 1994). Субъединица Gp была проклонирована из кукурузы и арабидопсиса.

Если в клетках животных известно более 250 разных мембраносвязанных рецепторов (Kolokovski, 1994),' управляемых G-белками, то в растениях имеются только данные о влиянии GTPyS на рецептор ауксина (Zaina et al. 1990; Milner et al. 1994) и на возможное участие G-белков в рецепции элиситеров из клеточной стенки грибов - олигосахаридов или фрагментов хитина (Legendre et al. 1992; Vera-Estrella et al. 1994). Есть также основание полагать, что в растениях G-белки участвуют в регуляции К+-выводящих каналов (Li and Assman, 1993). Несмотря на некотрые успехи в изучении G-белков в растениях, до сих пор остается неясной их роль в сигнальных путях плазматических мембран.

Основываясь на известном свойстве G-белков животных клеток, а именно отрицательной кооперативности между связыванием с G-белком ГТФ и связыванием с рецептором гормона (Michel and Lefkowitz, 1987), мы проверили на изолированных плазматических мембранах из корней кукурузы этот эффект для фузикокцина. Влияние ФК на связывание с мембранами [3H]Gpp(NH)p или влияние Gpp(NH)p. на связывание dMFC было не достаточно выраженным, чтобы делать какие-либо определенные выводы. Сравнительно недавно опубликованы данные (De Boer et al. 1996) о вхождении G-белков в ФК-рецептор, однако их роль в функционировании ФКР еще предстоит выяснить.

Участвует ли протеинкиназа в активации Н-АТФазы фузикокцином?

Действие фузикокцина на высшие растения обычно связывают с активацией Н -АТФазы плазматических мембран (Marre, 1979). Первое экспериментальное доказательство этому было получено в 1977 году на микросомальной фракции, выделенной из колеоптилей кукурузы (Beffagna et al., 1977). В 1985 году, используя для работы микросомальную фракцию из 24- часовых проростков редиса, Rasi-Caldogno с соавторами удалось повторить этот результат. Величина активации ФК ЕГ-АТФазной активности in vitro в этих экспериментах не превышала 30 %.

Большая величина активации ïT-АТФазной активное™ ФК (около 100 %) была получена этими же авторами на фракции плазматических мембран, очищенных из этого же объекта с помощью разделения в двуфазовой полимерной системе (De Michelis et al., 1991). Этот же эффект, но меньший по величине (40 %) , был получен ими же на плазматических мембранах, выделенных из проростков Arabidopsis thaliana (Olivan et al, 1993). На многих других объектах, которые обычно используют для изучения механизма действия ФК, а это корни кукурузы и овса, коле-оптили кукурузы, листья Commelina communis, Vicia faba, шпината и пр., этот эффект на изолированных мембранах не наблюдался. Тем не менее в настоящее время активация Н+-АТФазы плазматических мембран растений ФК не вызывает сомнений, так как этот эффект был подтвержден работами с использованием метода Пэч-клямп (Serrano et al., 1986; Loshe and Hedrich, 1992), измерением возросшей йГ-АТФазной активности in vitro на препаратах мембран, полученных из обработанных ФК растений in vivo (Shulz et al.,1990; Johanscon et al.,1993; Lanfermeiejer and Prins, 1994; Oecking et al., 1994), a также в реконструированной системе, состоящей из очищенного ФК-рецептора и Н'-АТФазы (Aducci et al., 1988, 1995). Тем не менее молекулярный механизм активации ФК ЕГ-АТФазы до сих пор остается неясным.

Действие ФК на высшие растения начинается с его взаимодействия с ФК-связывающими сайтами, локализованными в плазматической мембране. По разным оценкам количество ФК-связывающих белков составляет от нескольких десятых до нескольких процентов от белка плаз-малеммы. Такое значительное количество ФК-связывающего белка совпадает по порядку величины с количеством ЬГ-АТФаз плазмалеммы, поэтому между ними вполне возможно взаимодействие без каскада усиления сигнала по типу один рецептор - один эффектор (Бабаков и Аб-рамычева, 1988). Вопрос заключается в том, осуществляется ли взаимодействие между ФК-рецептором и Нт-АТФазой непосредственно или с помощью посредника, например, нротеинки-назы или протеинфосфатазы. Ответа на этот вопрос не было, хотя и имелись экспериментальные данные, как указывающие на вероятное конформационное взаимодействие без посредников между Н+-АТФазой и ФК-рецептором (Aducci et al., 1988, 1995), так и рассматривающие участие протеинкиназы в процессе активации Н-АТФазы фузикокцином (Van der Hoven,1995).

Мы попытались ответить на этот вопрос, исследуя совместное и по отдельности действие ФК и ингибиторов протеинкиназной и протеинфосфатазной активности на цитоплазматический рН протопластов, получаемых из суспензионной культуры сахарной свеклы, с параллельным измерением связывания с ними dhFC. Внутриклеточный рН оценивали, измеряя кинетику изменения интенсивности флуоресценции протопластов, нагруженных флуоресцеином, в ответ на добавление изобутирата, или путем измерения флуоресцентного отношения на 530 нМ при возбуждении на длинах волн 490 нм и 440 нМ (Трофимова и Молотковский, 1988). Стационарное значение pHcyt в протопластах соответствовало 6,80 + 0,05. В присутствии фузикокцина цитозоль этих протопластов защелачивался на 0,2 - 0,3 ед. и установление нового уровня рНСУ1 под действием ФК завершалось в течение 10 мин. В присутствии специфического ингибитора Н+-АТФазы-эритрозина В (Яа81-СаМо0ао е1 а1, 1989) внутриклеточный рН обработанных фузикокцином протопластов не смещался под действием фузикокцина. В отсутствие фузикокцина эршрозин В не оказывал влияния на стационарное значение рН контрольных протопластов. Таким образом наблюдаемые изменения рНсу1 обусловлены видимо активацией протонной АТФазы плазматической мембраны, имеющей место после связывания фузикокцина с рецепторами на плазмалемме.

Рис.10 Влияние стауроспорина (а) и окадаевой кислоты (б) на рН цитоплазмы протопластов в присутствии и в отсутствие эритрозина В. (Из: Tiofimova et al. 1997. Physiol. Plantarum. 98, 215221).

В качестве ингибиторов протеинкиназы и проте-инфосфатаз 1 и 2А использовали стауроспорин (Herbert et al., 1990) и окадаевую кислоту (Haystead et al., 1989). На рис. 10 представлены данные об изменении внутриклеточного рН в присутствии разных концентраций стауроспорина (а) и окадаевой кислоты (б), а также влияние на наблюдаемое защелачивание цитозоля эритрозина В. Тот факт, что специфический блокатор Н+-АТФазы плазмалеммы эритрозин В подавляет эффект стауроспорина, может свидетельствовать о том, что И -АТФаза является одной из мишеней активности протеинкиназ и ее дефосфо-рилирование (полное или частичное) приводит к ее стимуляции, выражающейся в активации трансмембранного протонного транспорта. Ингибитор протеинфосфатазной активности также вызывал защелачивание цитозоля, чувствительное к эритрозину В.

Исследуя действия стауроспорина и окадаевой кислоты на цитоплазматический рН протопластов, мы основывались на известных данных о том, что добавление к клеткам растений ингибиторов фосфорилирования или дефосфорилирования существенно смещает равновесие в фосфорилировании белков (Grosskopf et al., 1990; Raz and Fluhr,1993), поэтому мы ограничились короткими временами измерения, чтобы нарушения метаболизма протопластов не оказывали значительного влияния на измеряемые параметры. Из рис.10 видно, что и стауроспорин и окадаевая кислота индуцируют защелачивание цитоплазмы, сравнимое по величине с аналогичным изменением под действием ФК. Полученные данные подтверждают результаты других авторов, что активация Б^-АТФазы плазмалеммы высших растений может происходить как при ее фосфорилировании ( Suzuki et al., 1992) (в нашем случае при действии окадаевой кислоты), так и дефосфорилировании (Vera Estrella et al., 1994) (при действии стауроспорина). Из однонаправленности действия стауроспорина к окадаевой кислоты на цитоплазматический рН следует, что Н-АТФаза имеет несколько центров фосфорилировамет, что согласуется с прямыми дан-ньши о фосфорилировании Н^-АТФазы плазмалеммы высших растений по остаткам серина и треонина (Shaller and Sussman, 1988).

Отдельно было исследовано влияние этих же ингибиторов в оптимальных концентрациях, определенных в предыдущих физиологических экспериментах, на связывание dhPC с протопластами. Не было обнаружено достоверных различий в связывании по низко- и высокоаффинным сайтам с протопластами под действием ингибиторов.

На рис.11 показано влияние ингибиторов на вызываемое в присутствии фузикокцина защела-чивание цитозоля, а также влияние фузикокцина на защелачивание цитозоля, которое имеет место при ингибировании фосфатаз или киназ. Эффект фузикокцина подавляется в присутствии ингибитора фосфорилирования стауроспорина и не изменяется на фоне окадаевой кислоты. Стауроспорин и фузикокцин обнаруживают взаимный антагонизм.

Рис.11. Совместное действие ФК и ингибиторов фосфорилирования и дефосфорилирования белков на pHcyt. протопластов. За 100% (0,3 ед. рН) принято действие одного ФК на отношение F490/E

Из: Trofimova et al. 1997. Physiol. Plantarum. 98, 215-221).

Полученные нами данные по действию ФК на цитоплазматический рН протопластов в присутствии и в отсутствие ингибиторов фосфорилирования\дефосфорилирования показывают, что на одном объекте в ответ на добавление фузикокцина возможен целый спектр ответных реакций клетки по изменению рНсу1- Например, если ФК добавлять к протопластам до введения ингибиторов, то он вызывает защелачивание цитоплазмы, если его добавлять после стауроспорина, то он закисляет рН, а в присутствии окадаевой кислоты не влияет на рН цитоплазмы.

Из совместного действия ФК и стауроспорина и ФК и окадаевой кислоты следует, что действие ФК на рН цитоплазмы зависит от состояния фосфорилирования ее белков и белков плазмалеммы. Вполне возможно, что наблюдаемые эффекты обусловлены в основном состоянием фосфорилирования ЕГ-АТФазы: ФК ингибирует БГ^-АТФазу, когда она дефосфорилиравана, не влияет на ее активность, когда она фосфорилирована и активирует Н^-АТФазу, когда она находится в промежуточном состоянии фосфорилирования. При интерпретации наблюдаемых эффектов по совместному действию на рН цитоплазмы протопластов стауроспорина и ФК и ока-даевой кислоты и ФК мы не рассматриваем возможное изменение в статусе фосфорилирования ФК-рецепторов, так как не наблюдали достоверных изменений в связывании dhPC с высокоаффинным и низкоаффинным сайтами.

Обнаруженное ингибирование стауроспорином фузикокцинового эффекта по защелачиванию цитоплазмы и отсутствие подобного взаимовлияния между ФК и окадаевой кислотой хорошо согласуются с предположением о том, что в активации НГ-АТФазы плазмалеммы ФК принимает участие протеинкиназа, которая находится в цепи передачи сигнала между ФК-рецептором и протонным насосом, если не одно но, а именно: наблюдаемое нами в эксперименте закисление цитоплазмы под действием ФК после активации Н -АТФазы стауроспорином. Вполне возможно, что протеинкиназа, активируемая ФК, не чувствительна к стауроспорину. Однако, стауроспо-рин, являясь неспецифическим ингибитором протеинкиназ (Herbert et al., 1990), обладает широким спектром действия на различные протеинкиназы, поэтому представляется более оправданным дать другое объяснение полученных нами результатов, а именно, допустить прямое конформационяое взаимодействие между ФК-рецептором и FT-АТФазой, при котором результат такого взаимодействия - активация, ингибирование или отсутствие эффекта будет зависеть от состояния фосфорилирования Н- АТФазы. Такая интерпретация соответствует независимым данным других авторов о влиянии фосфорилирования белков-мишеней при взаимодействии с ними белков 14-3-3 (Muslin et al, 1996), составляющих структурную основу рецептора ФК

Убедительные данные в пользу прямого взаимодействия между рецептором ФК и йГ-АТФазой были получены ДеМичелис с соавт (1996). Воспользовавшись практически необратимым связыванием со своим рецептором ФК, они обрабатывали проростки редиса разными концентрациями ФК, затем выделяли из них плазматические мембраны и измеряли АТФазную активность и количество связавшегося с мембранами ФК. Оказалось, что активация йГ-АТФазы линейно зависит от количества связавшегося с изолированными плазматическими мембранами ФК. Показано также с использованием двугибридной системы в дрожжах, что димер белков 143-3 непосредственно взаимодействует с С-концевым доменом Н'-АТФазы (Oecking et al., 1997; Jahn et al., 1997; Aducci et al., 1998). После удаления протеолизом С-концевого домена ТГ- АТФазы комплекс между димером 14-3-3 и Н+-АТФазой распадается (Oecking et al. 1997). По-видимому, ФК, связываясь с димером белков 14-3-3, вызывает смещение С-концевого домена фермента, однако точный механизм этого процесса пока полностью неясен, и прежде всего это обусловлено сложной организацией рецептора фузикокцина.

Организация рецептора фузикокцина в плазматической мембране

Первые данные о структуре рецептора ФК в плазматических мембранах были получены независимо в двух лабораториях в 1989 году. Де Бур с соавт., используя аффинную хроматографию, выделили из плазматических мембран проростков овса ФК-рецептор. По их данным он имел молекулярную массу около 80-90 кДа и состоял из гетеротримера двух субъединиц с молекулярными массами 31 и 33 кДа. Другая группа (Weiler et al. 1989) синтезировала меченое фотоакти-вируемое производное ФК и показала, что оно специфически связывается в плазматических мембранах разных растений с полипептидами с мол. массой 31-35 кДа.

Методы очистки ФК-связывающих белков совершенствовали и в 1994 году были получены первые данные об их частичной аминокислотной последовательности из проростков овса (Korthout et al.), кукурузы (Marra et al) и Vicia faba (Oecking et al.). Оказалось, что эти полипептиды имеют высокую гомологию с белками 14-3-3, которые в последнее десятилетие выделены в отдельное суперсемейство. Эти белки очень консервативны, обнаруживаются в мажорных количествах в клетках насекомых, амфибий, млекопитающих и растений (Aitken, 1996,) и, по-видимому, выполняют роль адаптеров, соединяя между собой белки в крупные межмолекулярные комплексы. В растениях уже известно более 10 изоформ белков 14-3-3 и они обнаружены в цитоплазме, ядре и плазматических мембранах.(Рег1, 1996). В растворе они образуют гомо или гетеродимеры (Xiao et al. 1995; Liu et al. 1995), однако сам по себе димер белков 14-3-3 не связывает ФК (Korthout et al. 1994).

На сегодняшний день известно два типа рецепторов ФК, различающихся по сродству к ли-ганду и имеющие константы диссоциации 0,3-2,0 нМ и 30-300 нМ. Какие структуры образуют рецепторы, и чем определяется различие в их аффинности пока неизвестно. Рецепторы ФК нестабильны (DeMichellis et al. 1996; Трофимова и др. 1996,), и значительная их часть инактивиру-ется при выделении плазматических мембран. Молекулярная масса солюбилизированного высокоаффинного ФК-рецептора, связанного с ФК (ФК добавляют для стабилизации комплекса), была оценена методом гель-фильтрации и оказалась равной 70-80 кДа (Stout and Cleland 1980; Feyerabend and Weiler 1989; Oecking et al. 1994). Однако, при солюбилизации мембранных белковых комплексов детергентами и последующей их очистке может происходить диссоциация, что приводит к недооценке реальной молекулярной массы в мембране. Ранее также была сделана непрямая оценка молекулярной массы ФК-рецептора путем измерения радиационной инактивации ЕГ-АТФазы плазматических мембран из нативных и предобработанных ФК проростков редиса (DeMichelis et al. 1989). Авторы наблюдали, что после обработки ФК молекулярная масса Н+-АТФазы в изолированных плазматических мембранах возрастала на 50 кДа. Однако при такой оценке нет полной уверенности, что полученная добавка молекулярной массы АТФазы обусловлена именно ФК-рецептором и, при этом, всеми его компонентами.

Нами метод радиационной инактивации был применен именно к ФК-рецептору. Мы попытались получить прямые данные о его молекулярной массе в мембранах и ответить также на вопрос о сходстве или различии в структурной организации ФК-рецепторов разной аффинности.

Радиационная инактивация ФКР. Оценка молекулярной массы белка этим методой основана на теории мишеней (Lea, 1955). В соответствии с этой теорией попадание электрош высокой энергии в молекулу белка его разрушает и вероятность попадания равна (1 - е а1>), где с пропорциональна молекулярной массе, a D есть доза облучения. В этом методе обычно измеряется дозовая зависимость инактивации исследуемого белка, а затем по линейному участку это£ зависимости определяют дозу облучения D37, при которой инактивируется 63% исходной активности (Alper, 1979). Молекулярную массу находят по эмпирической формуле, в которой учитывается температура образца (Beliveau et al. 1988) log Mr= 5,89 - logD37 ~ 0,0028t, (2) где t (°C) - температура образца во время облучения.

Образцы облучали на линейном ускорителе электронов 5 МэВ (Институт физической химии РАН) при мощности дозы 1,2 Мрад/мин. Дозу облучения определяли с помощью стандартных образцов пленки с феназиновым красителем при комнатной температуре. Относительная предельная погрешность измерения дозы составляла не более 15%. Образцы во время облучения охлаждали (-90 °С) потоком газообразного азота.

Образцы представляли собой лиофилизованные микросомальные мембраны. Микросомаль-ные мембраны выделяли из 15-20 дневной суспензионной культуры сахарной свеклы методом дифференциального центрифугирования. 200-250 мкг микросомального белка помещали в полипропиленовую пробирку (0,8 мя), замораживали в жидком азоте, лиофильно высушивали и хранили при -70 °С в атмосфере аргона в эксикаторе над Р2О5. В качестве маркера с известной молекулярной массой использовали щелочную фосфатазу (140 кДа). После радиационной инактивации образцы микросом регидратировали в течение 1 мин при 4 °С и измеряли связывание с ними dhFC. Дозовую зависимость инактивации связывания dhPC с микросомальными мембранами измеряли при двух концентрациях метки - 0,3 нМ и 100 нМ. При 0,3 нМ связывание метки определяется только высокоаффинными сайтами, при 100 нМ - суммой низко- и высокоаффинных. Дозовые зависимости инактивации ФК-рецепторов (рис. 12) имели две особенности: расходятся между собой при увеличении дозы облучения и нелинейны. Первая, вероятно, связана с тем, что в образце действительно имеется небольшое количество низкоаффинных сайтов, их инактивация под действием облучения наступает при бдлыдих дозах, а это указывает на их меньшую, по сравнению с высокоаффинными, молекулярную массу (см. формулу 2). Вторая обусловлена, видимо, появлением в образце при малых дозах дополнительного количества центров связывания ФК. D37 для высокоаффинного ФК-связывающего сайта определена нами по линейному участку кривой радиационной инактивации в области 15 - 45 Мрад и оказалась равной 10,8± 1,6 Мрад. Для того чтобы учесть вклад высокоаффинных сайтов в связывание при ние dhFC только с низкоаффинными сайтами, мы воспользовались следующими соображениями. Если в образце имеются рецепторы одной аффинности и под действием облучения изменяется только их количество, то отношение величин связывания лиганда (Со), измеренное при 0,3 нМ (Bi) и 100 нМ (В2), должно оставаться постоянным и не зависеть от дозы облучения. При увеличении под действием облучения вклада низкоаффинных сайтов в связывание dhFC это отношение должно возрастать, ибо при малых концентрациях лиганда в связывании участвуют преимущественно высокоаффинные рецепторы, а при высоких концентрациях - и те и другие. Исходя из этого, мы определили величину связывания нвдкоаффинных рецепторов с dhFC по следующей формуле:

B10W-B2 - В1С0 (3) где Со есть отношение В2/В1 для необлученных мембран.

Рассчитанные по формуле 3 величины представлены на рис.12. D37 для низкоаффинных ФК-связывающих сайтов была определена по линейному участку дозовой зависимости инактивации в области 25-50 Мрад и оказалась равной 22 ± 5 Мрад. В результате подстановки величин D37 и температуры образцов (-90 0 С) в формулу 2 были получены следующие значения молекулярных масс: для низкоаффинного ФК-рецептора - 63 ± 7 кДа (п=5), для высокоаффинного - 130 ± 15 кДа (п=5).

Экстраполяция на рис.12 линейного участка кривой радиационной инактивации (0,3 нМ) в область нулевой дозы облучения дает сумму активных и активируемых ("молчащих") облучением ФК-рецепторов. Видно, что количество "молчащих" ФК-рецеиторов в 1,4 раза больше количества изначально активных. В пяти разных образцах микросомальных мембран, подвергнутых нами облучению, отношение количества "молчащих" рецепторов к количеству активных меня лось от 1,3 до 2,4.

Чтобы оценить молекулярную массу мишени, в составе которой находятся "молчащие" ре цепторы ФК, мы предположили, что такой рецептор находится в комплексе с молекулой ингибитором. При попадании электрона в ингибитор комплекс диссоциирует и рецептор акти вируется. Вероятность этого процесса выражается произведением:

1-е-0/°УП®0 (4) в котором первый сомножитель определяет вероятность попадания электрона в ингибитор, . второй - вероятность его непопадания в рецептор. В этом выражении Оо есть Озу для высокоаф финного рецептора, а О* - то же самое для ингибитора. Если вышеприведенные предположена верны, то количество ФК-связывающих сайтов будет меняться при облучении в соответствии с< следующим выражением:

В = + N5(1 - е-^е-0®0 (5) где N3 есть количество "молчащих" рецепторов в образце микросомальных мембран, а N0 количество активных. Единственной неизвестной величиной в этом выражении является доз; облучения для активации 63% молчащих рецепторов. Эта величина была найдена нами при оп тимизации параметра О, при помощи компьютерной программы и оказалась равной 3,5 ± 1,1 Мрад. По данным четырех независимых экспериментов значение молекулярной массы ингиби тора среднем было 290 ± 80 кДа. Общая молекулярная масса мишени с молчащим рецепторох равна 420 ± 90 кДа.

Для нас было абсолютно неожиданно определить в образце микросомальных мембра! "молчащие" рецепторы, не связывающие в обычных условиях ФК. Обработка результатов пята независимых экспериментов дала значительный разброс в молекулярной массе молекулы ингибитора ФК-рецептора. Поэтому приведенная нами средняя величина молекулярной массь "молчащего" рецептора 420 кДа весьма приблизительна. Имеются ли "молчащие" рецепторы ж только на изолированных мембранах, но и на целых клетках растений, при каких условиях ош активируются, - это те вопросы, на которые ответ будет дан ниже в разделе об изменчивости аффинности ФКР.

Роль внешней поверхности плазматической мембраны в рецепции ФК

Для получения данных о локализации сайтов связывания ФК на целых протопластах наш была исследована их чувствительность к действию протеаз с различной специфичностью и а-маннозидазы. Были протестированы глутаминовая протеаза из ВасШгк \ichemformis, расщепляющая полипептидную цепь по С-концевой части глутаминовой кислоты, и менее специфические протеазы: а-химотрипсин, субтилизин (Phe, Туг, Thr) и металлопротеаза из В. megaterium

1993).

Рис. 13 Влияние гидролитических ферментов на связывание с&РС с протопластами: открытые символы показывают связывание метки с высокоаффинными сайтами, закрытые - связывание с низкоаффинными. а: 1,2 - субтдащзин; 3,4 - глутаминовая протеа-за; б: 1,2- мегатерии; 3,4 - химотрипсин; с - а-маннозидаза

Из: Клычников с соанг. 1998, Биохимия 63: 1269-1278).

Результаты этих измерений изображены на рисунке 13. Видно, что оба типа сайтов связывания ФК инактивируются под действием исследованных протеолитических ферментов, однако скорости инактивации ФК-связывающих сайтов разной аффинности не одинаковы: высокоаффинные ФК-связывающие сайты" оказались гораздо более чувствительны к действию всех проверенных нами протеаз по сравнению с низкоаффинными. Большая их часть йнактивирует-ся за 30 мин протеолиза. В тоже время низкоаффинные ФК-связывающие сайты к этому времени еще сохраняют более 50% своей активности. В случае а-маннозидазы наоборот низкоаффинные сайты показывают большую чувствительность. Следует отметить, что максимальное уменьшение связывания [3Н]дигидроФК под действием а-маннозидазы составляет 50% и не возрастает как при повышении концентрации а-маннозидазы в инкубационной среде, так и при увеличении времени инкубации протопластов с ферментом.

Организация рецептора фузикокцина. Посмотрим, как соотносятся найденные нами молекулярные массы ФК-рецепторов с известными биохимическими данными об их структуре. Рецептор ФК нестабилен, что отмечается всеми авторами, проводившими его солюбилизацию и очистку (Aducci et al. 1995), поэтому либо до солюбилизации, либо после нее в среду добавляют меченый дигидроФК и далее ведут очистку комплекса, связанного с меткой. Молекулярный вес солюбилизированного ФКР по данным гель-филмрации равен 500-800 кДа (De Boer et al. 1996). мегатерии (Phe, Leu, Val, lie) (Морозова с соавт.

При дальнейшей очистке он, видимо, диссоциирует и после конечного этапа очистки из белко вого комплекса 800 кДа остается связанный с меченым ФК димер белков 14-3-3 (КогЙкий е1 а1 1994; Оесккщ ег а1 1994) с общей молекулярной массой 60-65 К. Однако сами по себе 14-3-1 белки в растворе не связывают ФК, не связывает ФК и солюбилизированный из плазматическо{ мембраны растений димер белков 14-3-3 (Оескк^ с1 а1. 1997). Если исходить из того, что белю 14-3-3 выполняют в клетках адаторную функцию, то можно предположить, что сайт связыва ния ФК образуется при взаимодействии димера белка 14-4-3 с каким-то другим (другими) бел ком плазматических мембран.

Наиболее известным эффектором для ФК-рецептора является Б^-АТФаза плазматически? мембран. Имеются данные, свидетельствующие в пользу прямого взаимодействия между ним* (Ре МсЬюИз е! а1. 1996; Оескищ е! а1. 1997), и совсем недавно бьшо показано взаимодействие между белком 14-3-3 и С-концевым участком ЕГ^-АТФазы ОаЬл еЬ а1. 1997, А&юсг е! а!. 1998) Кроме этого показано, что при экспрессии в дрожжах генов ЕГ-АТФазы арабидопсиса и разньв изоформ белков 14-3-3 плазматические мембраны дрожжей начинают связывать ФК с высоко?: аффинностью (Ваил^аагс! е1 а1. 1998).Тем не менее вопрос остается открытым: достаточно т взаимодействия в мембране между дилером 14-3-3 белка и ЕГ-АТФазой для образования функционально активного центра связывания ФК.

По данным радиационной инактивации молекулярная масса ЕГ-АТФазы равна 200 К (Впэкк е! а1. 1985). Полученное нами значение молекулярной массы высокоаффинного ФК-рецепторг равно 130 К, а молекулярная масса димера белков 14-3-3 - 65 К. Из этих цифр и выше приведенных данных следует, что в формировании центра связывания ФК помимо димера белков 14-3-3 должна участвовать не только Н+-А'ГФаза, но и белок с мол. массой около 60-70 К. В пользу этого утверждения говорят и следующие два факта. Во-первых, в очищенных препаратах ФК-рецептора нередко обнаруживают полипептиды с молекулярной массой 67 К (РеуегаЬепс! а1. 1989; КойЬои1 е) а1, 1994) и 58 кДа (Оескя^ е! а1, 1997). Во-вторых, нет данных относительно гликозилирования как белков 14 -3-3, так и Н*-АТФазы, поэтому обнаруженное нами ингиби-рующее действие а-маннозидазы ФК-рецептора с наружной поверхности плазмалеммы указывает на то, что в состав ФКР должен входить гликопротеин, имеющий гликознлированный домен на наружной поверхности плазматической мембраны. Таким образом, можно предположить, что в плазматической мембране присутствует вероятно тройной комплекс между димером белков 14-3-3, гликозилированным пошшептидом 60-70 К и йГ-АТФазой, и этот тройной комплекс входит в белковую структуру еще большего размера (500-800 К).

Данные по инактивации ФК-рецептора под действием протеаз показывают, что в формировании как высоко-, так и низкоаффинных сайтов участвуют белковые структуры, имеющие домены на наружной поверхности плазматической мембраны. До недавнего времени в научной литературе доминировала точка зрения, по которой ФК-связывающий центр локализован на наружной поверхности мембраны (Aducci et al. 1995), однако в самое недавнее время показано, что это не так. Во-первых, ФК в мембране связывает димер белков 14-3-3, белки 14-3-3 гидрофильны, не имеют гидрофобных доменов и, следовательно, не являются интегральными мембранными белками; во-вторых, оказалось, что ФК-рецептор более чувствителен к протеолизу с внутренней поверхности ллазмалеммы (Oecking et al. 1997), в-третьих, белки 14-3-3 взаимодействуют^, с С-концевым доменом Н^-АТФазы (Oecking et al. 1997; Jahn et al. 1997, Aducci et al. 1998), который локализован в цитоплазме (Serrano, 1989). Неполное блокирование связывания ФК с протопластами а-маннозидазой также находится в соответствии с предполагаемой в последнее время локализацией центра связывания ФК с внутренней поверхности плазматических мембран, а само ее действие и действие проверенных нами протеаз указывают на лабильность ФК-рецепторного комплекса.

Белки 14-3-3 узнают в своих белках-мишенях специфическую короткую аминокислотную последовательность с фосфорилированным серином RSXpSXP (Muslin et al, 1996), которая присутствует в 14-3-3 связывающих белках растений и животных (Aitken, 1996). Среди белков животных наиболее известны RAF-киназа, фосфатаза Cdc 25, тирозин и триптофан гидроксилазы и др. В растениях это нитрат редуктаза, аскорбат пероксидаза и калий выводящий канал KCOl. Дефосфорилирование серина приводит к ослаблению взаимодействия между димером белков 14-3-3 и белками-мишенями, что выражается в увеличении константы диссоциации этого комплекса (Muslin et al, 1966).

Молекулярная масса функциональной единицы (рецептор, фермент и т.д.), входящей в белковый комплекс, и измеряемая методом радиационной инактивации, зависит от ее взаимодействия с окружающими ее белками: если это взаимодействие сильное, то белковый комплекс ведет себя при радиационной инактивации как единая молекула. Поэтому, сопоставляя молекулярные массы высоко- и низкоаффинных рецепторов, измеренные в данной работе, с известными физико-химическими данными о свойствах белков 14-3-3, можно предполагать, что различие в аффинности ФКР обусловлено различной эффективностью взаимодействия белков 14-3-3 со своими мишенями. Например, высокая аффинность имеет место, когда серин в узнающем мотиве белка-мишени фосфорилировав, низкая аффинность - когда дефосфорилирован. В схеме, представленной на рис.14, учтены молекулярные массы рецепторов и доступность для гидролитических ферментов с наружной стороны протопластов. Различие во взаимодействии между димером 14-3-3 и гликопротеином отражено на схеме в виде разной площади контакта между ними. Чтобы не перегружать схему, на рис.14 не показана ВГ-АТФаза, которая, видимо, присутствует во всех типах рецепторов. Помимо ВГ-АТФазы или вместе с ней в рецепторе ФК может присутствовать и К+-выводящий канал. Недавно был сиквенирован этот белок, названный КС

Огетртвк! е* а1. 1997), и в его последовательности аминокислот имеется мотив КЗХрБХР, узнаваемый белками 14-3-3.

67 кДа 290 кДа

14-3-3 63 кДа i | низкоаффинный высокоаффинный "молчащий сайт сайт рецептор"

Рис.14. Гипотетическая схема организации ФК-рецепторов разной аффинности. (Из: Клычников с соавт,1998, Биохимия. 63: 1269-1278).

Известно, что при образовании комплекса между димером 14-3-3 и белком-мишенью активность последней меняется. Например, белки 14-3-3 ингибируют активность РАФ-киназы, Cdc 25 фосфатазы, нитрат редуктазы и др и активируют тирозин и триптофан гидроксилазы (Aitken 1996). Перенося это свойство белков 14-3-3 на белки-мишени в ФКР, можно полагать, что активность последних также меняется при взаимодействии с димером 14-3-3. Если и активность мишени и аффинность ФКР зависят от одного параметра - взаимодействия между димером 14-3-3 и белком-мишенью, то тогда активность белка-мишени, например, ЬГ-АТФазы или К+-канала может быть неодинакова в ФКР с разной аффинностью.

Далее, рецептор фузикокцина обладает одной уникальной особенностью. Он образован комплексом молекул, которые сами по себе не обладают способностью связывать ФК. Такая организация ФКР определяет его необычное свойство - лабильность, которая, как будет показано далее, проявляется в изменениях аффинности при различных воздействиях на протопласты.

Рецептор фузикокцина при абиотическом стрессе

В настоящее время нет устоявшейся точки зрения о роли крупных надмолекулярных белковых комплексов в плазматических мембранах растений с участием белков 14-3-3. Из общих соображений понятно, что каким-то образом они должны быть связаны с регуляцией активности входящих в эти структуры белков. Растения живут и развиваются в переменных условиях внешней среды, когда меняется температура, влажность, освещенность и т.д., поэтому естественно предполагать, что регуляция активности происходит в ответ на изменяющиеся внешние условия.

В пользу такого предположения говорит и антистрессовое действие ФК, заключающееся в индуцируемом им возрастании всхожести семян различных культур при неблагоприятных условиях (Леонова и др., 1994) и в повышении устойчивости при низких температурах проростков пшеницы, обработанных ФК (Вольнова и др. 1992).

Известно, что такие стрессовые воздействия, как низкие температуры (Yoshida, 1994), гипоксия (Xia et al. 1996), засуха (Vene Kamp, 1989) или засоление (Niu et al, 1995), сопровождаются закислением цитоплазмы. рН цитоплазмы 'фезвычайно важен для координированного протекания биохимических реакций, поэтому как в клетках животных, так и в клетках растений имеются специальные системы рН-статирования (Frelin et al, 1988). Одной из составляющих этой системы является íf-АТФаза плазматической мембраны, активируемая ФК. Мы предположили, что не сама Н+- АТФаза, а весь ФК-рецепторный комплекс является компонентом рН-стата клетки, и попытались выяснить как сказываются изменения цитоплазматического рН на функционировании ФК-рецептора.

Изменения аффинности ФКР в ответ на зачисление цитоплазмы.

В качестве объекта исследования мы выбрали протопласты, получаемые из суспензионной культуры сахарной свеклы. Ранее нами было показано, что плазматическая мембрана этих протопластов имеет значительное количество ФК-связывающих сайтов и что эти протопласты как и большинство тканей растений в ответ на добавление к ним ФК закисляют наружную среду. Цитоплазматический рН изменяли, добавляя к протопластам неметаболизируемую изомасляную кислоту, а его измерение выполняли методом, описанным выше (стр.23). На рис.15 показаны зависимости связывания dhFC с протопластами от наружного и цитоплазматического рН. Из представленных данных видно, что наружный рН практически не влияет на связывание dhFC с протопластами, тогда как связывание dhFC с протопластами оказалось очень чувствительным к рН цитоплазмы (рНс).

800 гj еоо

Рис.15. Влияние наружного и цитоплазматического рН на связывание dhFC с протопластами. (Из: Drabkin et al. 1997. FEBS Lett. 405,145-147).

X. 400

Видно также, что смещение рН цитоплазмы в щелочную сторону от 6.9 на 0.3 единицы слабо влияет на связывание с1Ы?С с протопластами. Смещение рН цитоплазмы на такую же величину I кислую сторону приводит к 6 - кратному возрастанию этого параметра.

Для того чтобы выяснить, что меняется при закислении цитоплазмы - количество ФК связывающих сайтов на протопласте или их аффинность, были проанализированы концентрационные зависимости связывания ¿№С с протопластами в координатах Скэтчарда при различных рНс (рис.16).

Рис.16. Концентрационные зависимости связывания меченого дигидроФК с протопластами при изменении рНс в координатах Скэтчарда;

Из: Трофимова и соавт. 1997. Физиология растений. 44, 652-657).

Из представленных данных видно, что при постепенном закислении цитоплазмы наблюдается переход низкоаффинных сайтов в высокоаффинные и при рНс=6.6 концентрационная зависимость соответствует одноместной модели связывания. Расчет показал, что величина константы диссоциации ФК с ФК-связывающими сайгами при закислении цитоплазмы занимает промежуточное значение 19 ± 3 нМ между Ко для низкоаффинных и высокоаффинных ФК-связывающих сайтов. Общее же количество ФК-связывающих сайтов при этом немного уменьшается. Возрастание аффинности имеет обратимый характер, поскольку после отмывки протопластов от изобутирата концентрационная зависимость связывания сШРС возвращается к первоначальному виду (рНс= 7.1). Меняется ли при этом сродство к ФК высокоаффинных ФК-связывающими сайтов остается неясным.

Полученные нами данные указывают на то, что в плазматических мембранах клеток растений в стандартных условиях имеется равновесие между разными формами аффинности ФКР. При закислении цитозоля это равновесие смещается в сторону высокоаффинной формы, смещение происходит в узком диапазоне физиологических значений рН и обратимо.

Действие осмотического стресса на ФКР.

После выделения протопласты инкубировали в среде, в которой осмолярность в основном обусловлена концентрацией сорбита. В предварительных экспериментах было проверено, что протопласты ведут себя как идеальные осмометры в диапазоне концентрации сорбита от 0.65 М до 0.25 М и что новый объем протопластов устанавливается в течение 3-5 мин после изменения осмолярности среды. При дальнейшем понижении осмотичноста раствора протопласты лопаются. Осмотический стресс создавали двумя способами: понижением концентрации сорбита или повышением его концентрации с последующим ее возвращением в изотонические условия. На рис.17 показано, что уменьшение осмолярности внеклеточной среды на 150 мосМ приводит к дополнительному связыванию dhFC с протопластами, которое превышает предыдущее примерно в четыре раза.

Рис.17 Кинетика изменений связывания сйРС с протопластами при гипоосмотическом шоке (0.25 М сорбита). На вставке показано изменение объема протопластов.

Из: Трофимова с соав.1999 Физиол.раст. 46). Измерения концентрационных зависимостей связывания показали, что основные изменения при гипоосмотическом шоке происходят в области высоких концентраций ФК. Перевод протопластов в раствор с повышенной тоничностью мало сказался на связывании, а возвращение их в изотонические условия привело к изменениям, аналогичным при гипоосмотическом набухании.

Табл. 8 Изменения параметров связывания йМ'С с протопластами при осмотическом стрессе (в левой колонке указаны концентрации сорбита в среде инкубации протопластов) (Из: Трофимова с соав.1999 Физиол.раст, 46 ) воздействие •V- high D ' \r low > ТЭ high max' Г) low нМ нМ фмоль/105 фмоль/ протопластов протопластов контроль 0.4 М 3±1 68±9 7+4 40±

0.4 0.25 М 2.0±0.5 65+8 12±5 200±

0.4 -» 0.8 М 1.0±0.5 60+7 5±3 42±

0.4-> 0.8-» 0.4 М 1.0±0.5 73+7 11±4 260± poly-L-lysine, 3+1 80+10 10±4 165±

0.1 mM

Примечание: К Jf1, В ^ и К , В - параметры высоко- и низкоаффинного ФКР

После осмотического стресса аффинность не изменяется, но возрастает общее количество ФК связывающих сайтов в протопластах (см.табл.8), причем этот рост обусловлен в большей мер низкоафинными сайтами. Открывшиеся новые ФК-связывающие центры через 10-15 мин внов исчезают (см.рис.18), а связавшейся с ними ФК не дает им вернуться в прежнее "молчащее" сс стояние (Рис.17).

Рис.18. Кинетика изменений в количестве ФК связывающих сайтов на протопластах: •- 0,4~>0,8; А 0,4-»0,8-»0,

По оси ординат дано отношение количеств связывающи сайтов в протопластах при осмотическом шоке (В) и стандартных условиях (Во). (Из: Из: Трофимова с соав.1999 Физиол.раст, 46:

Необратимость в связывании [3Н]дигидроФК был использована нами для проверки локализации появляющихся новых ФК связывающих центро) Для этого из протопластов, выдержанных с (ЬБС в стандартных и гипотонических средах, бь: ли выделены микросомальные мембраны и далее разделены центрифугированием в градиент плотности сахарозы. Распределение связавшейся с рецептором метки по градиенту совпадало ванадат-чувствительной АТФазной активностью, а связавшийся дигидроФК был расположен основном в той же части градиента, где и плазматические мембраны, очищенные распредели нием в двуфазовой полимерной системе ПЭГ/Декстран.

При уменьшении концентрации сорбита до 0.25 М площадь поверхности протопласте увеличивается примерно на 50% (вставка на рис.17), а количество центров связывания дигщ роФК (Втах) возрастает в несколько раз (см.табл.8). Втах также возрастает и при переводе прс топластов из раствора с повышенной осмолярностью в изотоническую среду, когда их обье: возвращается к исходной величине. В последнем случае площадь поверхности протопласта вт димо не меняется, поэтому увеличение плотности рецепторов ФК на плазматической мембран протопластов, вероятно, есть основная причина наблюдаемого возрастания связывания ФК.

Возможны принципиально два разных пути возрастания плотности рецепторов на плазмг тической мембране. Один - формирование в мембране новых рецепторов с участием белко цитоплазмы, другой - активация уже предсуществующих или как мы называем, - "молчащих' Не отрицая первую возможность, мы тем не менее, активацию "молчащих" рецепторов считав: более вероятной. На это указывают следующие факты. В изолированных плазматических мел бранах имеются белки 14-3-3, не принимающие участия в связывании ФК [Оескпщ е1 а1.,

О -,-,--,-1---,-ги таким образом в мембранах есть пул белков 14-3-3 для создания дополнительного количества ФК-связывающих сайтов. "Молчащие" рецепторы в мембранах обнаруживаются методом радиационной инактивации (см. выше) и, наконец, обратимость появления дополнительных центров связывания в протопластах также, на наш взгляд, свидетельствует против первого пути.

Активация "молчащих" рецепторов происходит быстро и совпадает по времени с изменением объема протопластов, поэтому мы полагаем, что механические изменения в поверхности протопласта являются основной причиной активации ФКР. Сканирующая электронная микроскопия показала, что протопласты имеют множество складок на своей поверхности и можно думать, что рост площади поверхности протопластов в условиях гипотонии обусловлен их рас-глаживанием. Вполне вероятно, что в плазматической мембране именно в области разглаживания складок и происходит активация "молчащих" рецепторов. Возможно, что их инактивация обусловлена химической модификацией ФКР, например, дефосфорилированием димера белков 14-3-3 или их белков-мишеней. Пока о структуре "молчащего" рецептора ФК ничего не известно, равно как и о его функции, тем не менее весьма вероятно предполагать участие "молчащего" ФКР в осморегуляции растительной клетки.

Раневой стресс.

Помимо кислотного и осмотического стрессов мы проверили действие реакции ФКР на раневой стресс. Раневой стресс моделировали, разрушая протопласты тремя способами: гипо-осмотическим шоком, замораживанием/ оттаиванием и инкубированием протопластов в среде с добавлением 1 мМ (по мономеру) полилизина с молекулярной массой 78 К. В первом случае происходит полное разрушение протопласта, во втором - протопласт еще немного сохраняет свою форму и размер, в третьем случае изменения затрагивают в основном плазматическую мембрану, что фиксируется по возрастанию проницаемости протопластов для красителя Эванса голубого. На рисунке 19 а,Ь,с в координатах Скэтчарда представлены концентрационные зависимости связывания (йРС с нативными протопластами и протопластами, подвергнутыми 3-м различным воздействиям. Видно, что все воздействия на протопласт приводят к спрямлению концентрационных зависимостей связывания, следовательно к преобладанию одного типа аффинности ФК-связывающих мест. Так же как и при закислении цитоплазмы, наблюдаемые изменения в связывании с1ЬРС с протопластами на рис.19 обусловлены в основном возрастанием сродства к ФК низкоаффинных сайтов. Однако, общее количество связывающих мест при нарушении структуры протопластов увеличивается на 35 %, а при закислении цитоплазмы немного уменьшается.

Рис. 19. Концентрационные зависимости связывания (НгРС с протопластами в координатах Скэтчарда: О- нативные протопласты, ■ - протопласты, подвергнутые различным воздействиями - осмотическому шоку; б - замораживанию/ оттаиванию; в - действию полилизина. (Из: Клычников с соавт.1998. Биохимия. 63: 1269-1278)

О возможной роли переходов аффинности ФКР

На рис. 20 суммированы все наблюдаемые нами изменения аффинности ФКР. Следует подчеркнуть, что за исключением активации "молчащих" рецепторов радиационной инактивацией все остальные переходы аффинности наблюдались нами на протопластах. Наши результаты показали, что в протопластах имеется равновесие между ФКР разной аффинности, которое смещается в ту или иную сторону при различных воздействиях. Это проявляется в изменении аффинности ФКР при закислении цитоплазмы и в активации "молчащих" рецепторов при осмотическом стрессе. попи-1-лизин < 0.1 мМ изотония —>гипотония гипертония —> изотония радиационная разрушение инактивация протопластов изотония —> гипертония

Рис. 20. Изменения аффинности ФКР при различных воздействиях.

При рассмотрении организации ФКР мы отмечали, что его аффинность отражает характер взаимодействия между дилером белков 14-3-3 и его окружением и что при изменении такого взаимодействия, видимо, меняется активность белков-мишеней для 14-3-3 в ФКР. Аффинность круто меняется от цитоплазматического pH, поэтому следует ожидать, что также круто изменяется от рНс и активность белков-мишеней в ФКР. В настоящее время в плазматических мембранах растений наиболее изучен рецептор фузикокцина, в состав которого входит ЕГ^-АТФаза. Вероятно имеется в плазмалемме еще один рецептор ФК с калий выводящим каналом. Проводимость этого канала очень резко падает при понижении pH цитоплазмы или при добавлении к клеткам ФК (Blattetal, 1989; 1993). стационарное состояние клетки

Низкие температуры Гипоксия Засуха

Солевой стресс защелачивание цитоплазмы поддержание концентрации внутриклеточного К+

Активация Н+-ЛТФазы изменение состояния ФК-рецептора |

Рис. 21 Гипотетическая схема участия ФК-связывающих белков в ответе растительной клетки на стресс

На рисунке 21 изображена гипотетическая схема функционирования ФК-рецентора в высших растениях, построенная на основе обнаруженных нами свойств ФКР и привлеченных литературных данных о влиянии ФК и рН цитоплазмы на К+-каналы. Итак, стрессовое воздействие приводит к изменению цитоплазматического рН. Далее предполагается, что закисление цитоплазмы или взаимодействие экзогенного ФК с димером белков 14-3-3 вызывают конформаци-онные изменения в ФКР, что приводит к активации Н^-АТФазы и закрыванию К+- каналов. В результате восстанавливается цитоплазматический рН, сохраняются в клетке ионы калия, и она возвращается в начальное состояние.

Возможно, что Н+-АТФаза и К+-выводящий канал входят в состав обоих типов ФКР -действующего и "молчащего". Тогда эти белки в плазматической мембране находятся в разных состояниях - в действующем ФКР Н+-АТФаза и калиевый канал регулируются цитоплазматическим рН, а в "молчащем" ФКР осмотическим давлением.

Благодаря значительному количеству белков 14-3-3 в плазматических мембранах и разнообразию мишеней для них в клетках эукариот (Айкеп, 1996), можно полагать, что Н*-АТФаза и калиевый канал далеко не единственные структурные блоки ФКР. Возможно ожидать открытия в плазматических мембранах растениий в ближайшее время новых функциональных единиц, образующих коплексы с белками 14-3-3, и также как и ФК-рецепторный комплекс с НГ-АТФазой меняющие свою активность при стрессовых воздействиях.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Бабаков, Алексей Владимирович

выводы

1. Обосновано и подтверждено предположение о наличии в плазматических мембранах растений рецепторов ФК различной аффинности: высокоаффинного с Ко « 1 нМ и низкоаффинного с Кс « 100 нМ, при этом общее количество рецепторов ФК равно 50 - 100 пмоль/мг мембранного белка; низкоаффинные рецепторы нестабильны и большая их часть теряется при выделении мембран.

2. Получены данные, показывающие что для физиологического действия ФК (активация ЕГ-транспорта) существенно его взаимодействие с низкоаффинными рецепторами.

3. Предложена структурная организация высокоаффинного и низкоаффинного рецепторов ФК, согласно которой рецептор в плазматических мембранах представляет собой надмолекулярный комплекс 500-700 К, компонентами в этом комплексе являются димер белков 143-3, гликопротеин с мол. массой 65 К, Н^-АТФаза или К+-выводящий канал; низко- и высокоаффинные рецепторы отличаются между собой эффективностью взаимодействия между димером белков 14-3-3 со своим окружением в мембране, что проявляется в различии молекулярных масс рецепторов, определенных методом радиационной инактивации: 130 К для высокоаффинного и 65 К для низкоаффинного.

4. На основании данных радиационной инактивации рецептора ФК в изолированных мембранах и действия осмотического шока на рецепторы ФК в протопластах выдвинуто представление о наличии в плазматических мембранах "молчащих" рецепторов, имеющих дополнительный компонент с мол. массой 290 К. Показано, что количество "молчащих" рецепторов ФК сопоставимо с количеством активных.

5. В связи с вопросом о возможном участии в-белков в механизме функционирования рецептора ФК было прежде всего исследовано наличие О-белков в растениях, при этом было установлено, что в растениях присутствуют в-белки и что значительная их часть локализована в плазматических мембранах; один из О-белков выделен и показано, что в его состав входят две субъединицы с мол. массами 36 и 28 К. Вероятно, он относится к гетерот-римерным О-белкам.

6. Путем солюбилизации плазматических мембран, фракционирования белков, измерения во фракциях ГТФазяой активности и параметров связывания изолированных белковых фракций с [3Н] Офр(Т№Н)р показано разнообразие О-белков в растениях и совпадение между собой в плазматических мембранах количеств О-белков с количеством рецепторов ФК, тем не менее нами представлены данные, свидетельствующие против непосредственного участия О-белков в рецепции ФК; нами представлены также данные против участия в рецепции ФК и протеинкиназ, при этом не исключается, однако, что и О-белга и протеинкиназы могут играть регуляторную роль в рецепторе ФК.

7. Сформулировано представление о рецепторе ФК в плазматических мембранах как о динамической системе, в котором возможны переходы рецептора из низкоаффинного в высокоаффинный и наоборот, а также переход молчащего рецептора в активный.

8. Охарактеризованы воздействия, приводящие к изменению аффинности рецептора: при понижении pH цитоплазмы и нарушении целостности плазматической мембраны низкоаффинный рецептор переходит в высокоаффинный, при понижении осмотичности наружной среды протопласта молчащий рецептор переходит в активный (преимущественно низкоаффинный), при радиационной инактивации молчащий рецептор переходит в высокоаффинный.

9. Основываясь на литературных данных об антистрессовой активности ФК и собственных данных об изменении аффинности рецептора при стрессовых воздействиях, выдвинуто предположение об участии рецептора ФК в адаптации растений к абиотическому стрессу.

10.Разработан и предложен для применения метод идентификации в экстрактах из растений ФК-подобных лигавдов, основанный на сродстве к ФК его рецепторов.