Регуляция функциональных свойств белков за счет сайт-специфичного убиквитилирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Чернорудский, Александр Леонидович

• Чернорудский, Александр Леонидович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чернорудский, Александр Леонидович

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Компоненты системы убиквитина

1.1.1 Убиквитин — структура и свойства

1.1.2 Строение мультиубиквитиновых цепей и убиквитин- 8 белковых конъюгатов

1.1.3 Убиквитиноподобные белки

1.1.4 Убиквитин-связывающие домены

1.2 Механизм убиквитилирования и его регуляция

1.2.1 Организация ферментативного каскада 14 убиквитилирования

1.2.2 Узнавание субстратов убиквитин - лигазами

1.2.3 Деубиквитилирующие ферменты

1.2.4 Автоубиквитилирование

1.3 Клеточные функции убиквитилирования

1.3.1 Убиквитин - протеасомная система деградации белка

1.3.2 Непротеолитические функции убиквитилирования

1.4 Роль убиквитина в патологии

1.4.1 Нейродегенеративные заболевания

1.4.2 Гипоксия / ишемия

1.4.3 Злокачественные образования

1.5 Применение масс-спектрометрии для исследования 30 системы убиквитина

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Реакция убиквитилирования in vitro

2.2.2 Культивирование клеточных линий

2.2.3 Стимуляция эндоцитоза по схеме с 36 предварительным связыванием лиганда

2.2.4 Иммунопреципитация

2.2.5 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в 37 присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ГТААГ)

2.2.6 Иммуноблоттинг

2.2.7 Трипсинолиз и экстракция пептидов

2.2.8 Масс-спектрометрия с MALDI-ионизацией

2.2.9 Масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса

2.2.10 Биоинформатический анализ убиквитилирования 40 белков

3. Результаты и их обсуждение 42 3.1 In vivo исследование убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста

3.1.1 Функции EGFR и пути его внутриклеточной сортировки

3.1.2 Идентификация сайтов убиквитилирования EGFR

3.1.3 Влияние подавления тирозинкиназной активности 5 О EGFR на его убиквитилирование

3.1.4 Влияние С-концевого домена молекулы рецептора на 53 убиквитилирование EGFR

3.1.5 Обсуждение

3.2 Изучение механизма автоубиквитилирования 59 дрожжевого убиквитин-конъюгирующего фермента

Ubc 13 in vitro

3.2.1 Ubc 13 - функции и механизмы

3.2.2 Оптимизация реакции автоубиквитилирования Ubc

3.2.3 Идентификация сайтов убиквитилирования Ubc 13 с 67 помощью масс-спектрометрии

3.2.4 Обсуждение

3.3 In silico исследование влияния убиквитилирования на 73 функциональную активность белков мишеней

3.3.1 Создание базы данных убиквитилированных белков 73 UbiProt

3.3.2 Убиквитилирование оротидин 5'-фосфат 77 декарбоксилазы (ODC)

3.3.3 Убиквитилирование пероксисомальной цитрат синтазы 79 (PCS)

3.3.4 Убиквитилирование кальмодулина (СаМ)

3.3.5 Убиквитилирование Х-связанного ингибитора апоптоза 83 (XIAP)

3.3.6 Обсуждение

Выводы

Цитированная литература

Список основных сокращений и обозначений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция функциональных свойств белков за счет сайт-специфичного убиквитилирования»

Убиквитилирование представляет собой ковалентное присоединение небольшого белка убиквитина к акцепторному лизину, экспонированному на поверхности белка-мишени. Модифицированный таким образом лизин принято называть сайтом убиквитилирования. Молекула убиквитина содержит 7 остатков лизина, которые также могут служить сайтами убиквитилирования. В результате полимеризации нескольких молекул убиквитина формируются так называемые мультиубиквитиновые цепи, структура которых может варьировать. Показана множественность форм модификации белков убиквитином.

Процесс убиквитилирования катализируется иерархическим каскадом из 3-х ферментов: убиквитин-активирующего фермента Е1, убиквитин-конъюгирующего фермента Е2 и убиквитинлигазы ЕЗ. Следует отметить, что убиквитилирование обратимо, так как разнообразные деубиквитилирующие ферменты (DUBs) способны отщеплять убиквитин от субстратов, а также расщеплять мультиубиквитиновые цепи.

Механизмы убиквитин-зависимой регуляции контролируют большинство клеточных процессов эукариот. За счет модификации разнообразных белков-мишеней убиквитилирование участвует в регуляции таких важнейших клеточных процессов, как пролиферация и дифференцировка, реакция на стресс и патогены, репарация ДНК, передача внутриклеточного сигнала, апоптоз и иммунный ответ. Естественно, что любой сбой в системе убиквитина ведет к развитию разного рода патологий, в том числе злокачественных новообразований и нейродегенеративных заболеваний. Регуляторное значение убиквитилирования для физиологии клетки вполне сопоставимо со значением фосфорилирования, а по разнообразию осуществляемых через него функций намного превосходит все известные посттрансляционные модификации. Все это определяет актуальность исследований в данной области.

При этом далеко не все убиквитин-зависимые механизмы на сегодняшний день полно охарактеризованы. Это связано с тем, что кодируемый убиквитилированием сигнал гетерогенен и определяется как типом модификации (присоединение одного остатка убиквитина или мультиубиквитиновых цепей различного строения), так и специфичностью сайтов убиквитилирования. Изучение механизмов и молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования невозможно без определения специфических сайтов модификации, так как присоединение убиквитина по разным остаткам лизина различным образом влияет на судьбу белка-мишени и может давать старт различным клеточным процессам.

Применение масс-спектрометрии к исследованию системы убиквитина позволяет не только идентифицировать белки-мишени убиквитилирования, но и определять сайты модификации и архитектуру мультиубиквитиновых цепей. В свою очередь, прямая идентификация сайтов убиквитилирования открывает возможности для анализа пространственного расположения присоединенного остатка убиквитина по отношению к функционально важным участкам поверхности белка-мишени. Это позволяет в ряде случаев спрогнозировать прямые эффекты убиквитилирования, реализующиеся на уровне индивидуального белка-мишени и непосредственно затрагивающие его функциональную активность.

Цель работы — идентифицировать сайты убиквитилирования ряда белков и определить функциональное значение данных сайтов в регуляторном контексте. В качестве объектов исследования были выбраны 2 различных клеточных процесса:

1) Убиквитин-зависимая внутриклеточная передача сигнала с участием рецептора эпидермального фактора роста;

2) Убиквитин-зависимый механизм репарации ДНК у дрожжей, опосредованный ферментативным комплексом Ubcl3/Mms2.

В соответствии с целью и выбором объектов исследования были поставлены следующие задачи:

1) Проанализировать механизм убиквитилирования рецептора ЭФР и определить сайты модификации в процессе эндоцитоза с помощью методов масс-спектрометрии;

2) Идентифицировать сайты модификации в процессе аутоубиквитилирования фермента Ubcl3 in vitro;

3) Проанализировать функциональное значение обнаруженных сайтов модификации с точки зрения молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования;

4) На основании полученных данных и in silico анализа выявить возможный механизм прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белков-мишеней.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Чернорудский, Александр Леонидович

Выводы:

1. Идентифицирован ряд новых сайтов убиквитилирования рецепторного белка EGFR на поздней стадии эндоцитоза. Обнаруженные сайты локализованы в тирозинкиназном (Lys704 и Lys715) и внеклеточном (Lys430) доменах рецептора. Установлено, что С-концевой домен и активность тирозинкиназного домена рецептора необходимы для достижения высокой степени убиквитилирования молекулы EGFR.

2. Показано, что дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubc 13 имеет дополнительный, ранее неизвестный сайт автоубиквитилирования - Lysl4. Модификация по данному сайту не ведет к протеасомальной деградации белка, а имеет регуляторное значение.

3. Продемонстрировано влияние специфичности сайтов модификации на молекулярно-физиологические последствия убиквитилирования белков Ubcl3, ODC, PCShXIAP.

4. Предложен новый механизм регуляции функциональных свойств белков-мишеней за счет убиквитилирования. Данный механизм реализуется за счет стерических эффектов, вызванных перекрыванием молекулой убиквитина функционально важных зон на поверхности субстрата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чернорудский, Александр Леонидович, 2008 год

1. Абрамова Е.В., Шарова Н.П., Карпов В.Л. Протеасома: разрушать, чтобы жить // Молекулярная биология. 2002. Т. 36, № 5. С. 761-776.

2. Бунеева О.А., Медведев А.Е. Убиквитин-протеинлигаза Паркин: роль в развитии болезни Паркинсона // Биохимия. 2006. Т. 71, № 8. С. 10501061.

3. Гайнуллин М.Р., Гарсия А. Роль системы убиквитина в патогенезе злокачественных новообразований // Нижегородский медицинский журнал. 2005. № 1. с. 128-134.

4. Говорун В.М., Арчаков А.И. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке // Биохимия. 2002. Т. 67, № 10. С. 1341-1359.

5. Горшков М.В., Харыбин О.Н., Вилков А.Н., Дривен В.В., Попов И.А., Даштиев М.И., Николаев Е.Н. Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса для биохимических исследований // Химическая физика. 2002. Т. 21, № 4. С. 32-38.

6. Ивахно С., Корнелюк А. Количественная протеомика и ее применение в системной биологии // Биохимия. 2006. Т. 71, № 10. С. 1312-1327.

7. Йенниссен Г.П., Хватова Е.М., Гайнуллин М.Р. Убиквитин фактор деградации белков клетки и регуляции ее функций. Роль в патологии // Нижегородский медицинский журнал. 2000. № 4. С. 104-109.

8. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431 // Цитология. 1987. Т. 29. С. 904-910.

9. Нолтинг Р. Новейшие методы исследования биосистем. М., «Техносфера», 2005. 256 с.

10. A1-Hakim A. K., Zagorska A., Chapman L., Deak M., Peggie M., Alessi D. R. Control of AMPK-related kinases by USP9X and atypical Lys(29)/Lys(33)-linked polyubiquitin chains // Biochem J. 2008. Vol.411, №2. P. 249-260.

11. Alves-Rodrigues A., Gregori L., Figueiredo-Pereira M.E. Ubiquitin, cellular inclusions and their role in neurodegeneration // Trends Neurosci. 1998. Vol. 21. P. 512-520.

12. Amerik A. Y., Li S. J., Hochstrasser M. Analysis of the deubiquitinating enzymes of the yeast Saccharomyces cerevisiae // Biol. Chem. 2000a. Vol.381, №9-10. P. 981-992.

13. Amerik A. Y., Nowak J., Swaminathan S., Hochstrasser M. The Doa4 Deubiquitinating Enzyme Is Functionally Linked to the Vacuolar Protein-sorting and Endocytic Pathways // Mol. Biol. Cell. 2000b. Vol.11, №10. P. 3365-3380.

14. Arnold J.E., Gevers W. Auto-ubiquitination of ubiquitin-activating enzymes from chicken breast muscle // Biochem. J. 1990. Vol.267. P. 751-757.

15. Ashley C., Pastushok L., McKenna S., Ellison M. J., Xiao W. Roles of mouse UBC 13 in DNA postreplication repair and Lys63-linked ubiquitination // Gene. 2002. Vol.285, №1-2. P. 183-191.

16. Bachmair A., Varshavsky A. The degradation signal in a short-lived protein // Cell. 1989. Vol.56, №6. P. 1019-1032.

17. Bairoch A. The ENZYME data bank // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 27. P. 3155-3156.

18. Banerjee A., Gregori L., Xu Y., Chau V. The bacterially expressed yeast CDC34 gene product can undergo autoubiquitination to form a multiubiquitin chain-linked protein // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, No. 8. P. 5668-5675.

19. Banerjee A., Kocarek T. A., Novak R. F. Identification of a ubiquitination-Target/Substrate-interaction domain of cytochrome P-450 (CYP) 2E1 // Drug Metab Dispos. 2000. Vol.28, №2. P. 118-124.

20. Banerjee A., Wade R. C. Elusive recognition determinants for ubiquitination //J. Mol. Recognit. 2002. Vol.15, №1. P. 3-5.

21. Bardag-Gorce F., van Leeuwen F. W., Nguyen V., French B. A., Li J., Riley N., McPhaul L. W., Lue Y. H., French S. W. The role of the ubiquitin-proteasome pathway in the formation of mallory bodies // Exp. Mol. Pathol. 2002. Vol.73, №2. P. 75-83.

22. Baska К. M., Manandhar G., Feng D., Agca Y., Tengowski M. W., Sutovsky M., Yi Y. J., Sutovsky P. Mechanism of extracellular ubiquitination in the mammalian epididymis // J. Cell Physiol. 2008. Vol.215, №3. P. 684-696.

23. Bender А. Т., Demady D. R., Osawa Y. Ubiquitination of neuronal nitric-oxide synthase in vitro and in vivo // J. Biol. Chem. 2000. Vol.275, №23. P. 17407-17411.

24. Berman H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T. N., Weissig H., Shindyalov I. N., Bourne P. E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. Vol.28, №1. P. 235-242.

25. Bonifacino J. S., Weissman A. M. Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. Vol.14. P. 19-57.

26. Brusky J., Zhu Y., Xiao W. UBC13, a DNA-damage-inducible gene, is a member of the error-free postreplication repair pathway in Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet. 2000. Vol.37, №3. P. 168-174.

27. Camus S., Higgins M., Lane D. P., Lain S. Differences in the ubiquitination of p53 by Mdm2 and the HPV protein E6 // FEBS Lett. 2003. Vol.536, №13. P. 220-224.

28. Chan N. L., Hill C. P. Defining polyubiquitin chain topology // Nat. Struct. Biol. 2001. Vol.8, №8. P. 650-652.

29. Chen A., Kleiman F. E., Manley J. L., Ouchi Т., Pan Z. Q. Autoubiquitination of the BRCA1*BARD1 RING ubiquitin ligase // J. Biol. Chem. 2002. Vol.277, №24. P. 22085-22092.

30. Chiu Y. H., Sun Q., Chen Z. J. E1-L2 activates both ubiquitin and FAT 10 // Mol. Cell. 2007. Vol.27, №6. P. 1014-1023.

31. Clague M. J. Membrane transport: a coat for ubiquitin // Curr. Biol. 2002. Vol.12, №15. P. R529-R531.

32. Clague M. J., Urbe S. Endocytosis: the DUB version // Trends Cell Biol. 2006. Vol.16, №11. P. 551-559.

33. Cooper H. J., Heath J. K., Jaffray E., Hay R. Т., Lam Т. Т., Marshall A. G. Identification of sites of ubiquitination in proteins: a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry approach // Anal. Chem. 2004. Vol.76, №23. P. 6982-6988.

34. Denis N. J., Vasilescu J., Lambert J. P., Smith J. C., Figeys D. Tryptic digestion of ubiquitin standards reveals an improved strategy for identifyingubiquitinated proteins by mass spectrometry // Proteomics. 2007. Vol.7, №6. P. 868-874.

35. Denison C., Kirkpatrick D. S., Gygi S. P. Proteomic insights into ubiquitin and ubiquitin-like proteins // Curr. Opin. Chem. Biol. 2005. Vol.9, №1. P. 69-75.

36. Dewar D., Graham D.I., Teasdale G.M., McCulloch J. Cerebral ischemia induces alterations in tau and ubiquitin proteins // Dementia. 1994. Vol. 5. P. 168-173.

37. Doskeland A. P. A method for simple identification of signature peptides derived from polyUb-K48 and K63 by MALDI-TOF MS and chemically assisted MS/MS fragmentation // Amino Acids. 2006. Vol.30, №1. P. 99103.

38. Fang S., Jensen J. P., Ludwig R. L., Vousden К. H., Weissman A. M. Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53 // J. Biol. Chem. 2000. Vol.275, №12. P. 8945-8951.

39. Finley D., Bartel В., Varshavsky A.The tails of ubiquitin precursors are ribosomal proteins whose fusion to ubiquitin facilitates ribosome biogenesis //Nature. 1989. Vol.338, №6214. P. 394-401.

40. Frampton J., Irmisch A., Green С. M., Neiss A., Trickey M., Ulrich H. D., Furuya K., Watts F. Z., Carr A. M., Lehmann A. R. Postreplication repair and PCNA modification in Schizosaccharomyces pombe // Mol. Biol. Cell. 2006. Vol.17, №7. P. 2976-2985.

41. Galcheva-Gargova Z., Theroux S.J., Davis R.J. The epidermal growth factor receptor is covalently linked to ubiquitin // Oncogene. 1995. Vol. 11. P. 2649-2655.

42. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis //Nucleic Acids Res. 2003. Vol.31, №13. P.3784-3788.

43. Gazit A., Osherov N., Gilon C., Levitzki A. Tyrphostins. 6. Dimeric benzylidenemalononitrile tyrphostins: potent inhibitors of EGF receptor tyrosine kinase in vitro И J. Med. Chem. 1996. Vol.39. P. 4905-4911.

44. Glickman M. H., Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction // Physiol Rev. 2002. Vol.82, №2. P. 373-428.

45. Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. Vol.18, №15. P. 2714-2723.

46. Haglund 1С., Dikic I. Ubiquitylation and cell signaling // EMBO J. 2005. Vol.24, №19. P. 3353-3359.

47. Haglund K., Sigismund S., Polo S., Szymkiewicz I., Di Fiore P. P., Dikic I. Multiple monoubiquitination of RTKs is sufficient for their endocytosis and degradation // Nat. Cell Biol. 2003. Vol.5, №5. P. 461-466.

48. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999. Vol.41. P. 95-98.

49. Haracska L., Unlc I., Prakash L., Prakash S. Ubiquitylation of yeast proliferating cell nuclear antigen and its implications for translesion DNA synthesis //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol.103, №17. P. 64776482.

50. Hatakeyama S., Jensen J. P., Weissman A. M. Subcellular localization and ubiquitin-conjugating enzyme (E2) interactions of mammalian HECT family ubiquitin protein ligases // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272, №24. P. 1508515092.

51. Hatakeyama S., Nakayama К. I. U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol.302, №4. P. 635-645.

52. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol.67. P. 425-479.

53. Hicke L., Schubert H. L., Hill C. P. Ubiquitin-binding domains //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol.6, №8. P. 610-621.

54. Hoeller D., Hecker С. M., Wagner S., Rogov V., Dotsch V., Dikic I. E3-independent monoubiquitination of ubiquitin-binding proteins // Mol. Cell. 2007. Vol.26, №6. P. 891-898.

55. Hofmann R. M., Pickart С. M. Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repair// Cell. 1999. Vol.96, №5. P. 645-653.

56. Hofrnann R. M., Pickart С. M. In vitro assembly and recognition of Lys-63 polyubiquitin chains // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276, №30. P. 27936-27943.

57. Holler D., Dikic I. Receptor endocytosis via ubiquitin-dependent and -independent pathways // Biochem. Pharmacol. 2004. Vol.67, №6. P. 10131017.

58. Huang F., Kirkpatrick D., Jiang X., Gygi S., Sorkin A. Differential regulation of EGF receptor internalization and degradation by multiubiquitination within the kinase domain // Mol. Cell. 2006. Vol.21, №6. P. 737-748.

59. Jariel-Encontre I., Salvat C., Steff A. M., Pariat M., Acquaviva C., Furstoss O., Piechaczyk M. Complex mechanisms for c-fos and c-jun degradation // Mol. Biol. Rep. 1997. Vol.24, №1-2. P. 51-56.

60. Jennissen H.P. Ubiquitin and the enigma of intracellular protein degradation // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 231. P. 1-30.

61. Jentsch S., Pyrowolakis G. Ubiquitin and its kin: how close are the family ties? // Trends Cell Biol. 2000. Vol.10, №8. P. 335-342.

62. Jiang X., Huang F., Marusyk A., Sorkin A. Grb2 regulates internalization of EGF receptors through clathrin-coated pits // Mol. Biol. Cell. 2003. Vol.14, №3. P. 858-870.

63. Joazeiro C. A., Weissman A. M. RING finger proteins: mediators of ubiquitin ligase activity // Cell. 2000. Vol.102, №5. P. 549-552.

64. Johnston S. C., Riddle S. M., Cohen R. E., Hill C. P. Structural basis for the specificity of ubiquitin C-terminal hydrolases // EMBO J. 1999. Vol.18, №14. P. 3877-3887.

65. Jones S., Thornton J. M. Principles of protein-protein interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol.93, №1. P. 13-20.

66. Kakhniashvili D. G., Chaudhary Т., Zimmer W. E., Bencsath F. A., Jardine I., Goodman S. R. Erythrocyte spectrin is an E2 ubiquitin conjugating enzyme // Biochemistry. 2001. Vol.40, №38. P. 11630-11642.

67. Kirkpatrick D. S., Denison C., Gygi S. P. Weighing in on ubiquitin: the expanding role of mass-spectrometry-based proteomics // Nat. Cell Biol.2005. Vol.7, №8. P. 750-757.

68. Kumar S., Kao W. H., Howley P. M. Physical interaction between specific E2 and Hect E3 enzymes determines functional cooperativity // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272, №21. P. 13548-13554.

69. Laemmli U. K. Clevage of structural proteins during assembly of head of bacteriofage T4 //Nature. 1970. Vol. 227, №. 5259. P. 680-685.

70. Laine A., Ronai Z. Ubiquitin chains in the ladder of МАРК signaling // Sci. STKE. 2005. Vol.2005, №281. P. re5.

71. Laine A., Topisirovic I., Zhai D., Reed J. C., Borden K. L., Ronai Z. Regulation of p53 localization and activity by Ubc 13 // Mol. Cell Biol.2006. Vol.26, №23. P. 8901-8913.

72. Layfield R., Alban A., Mayer R. J., Lowe J. The ubiquitin protein catabolic disorders //Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2001. Vol.27, №3. P. 171-179.

73. Levkowitz G., Waterman H., Zamir E., Kam Z., Oved S., Langdon W. Y., Beguinot L., Geiger В., Yarden Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor // Genes Dev. 1998. Vol.12, №23. P. 3663-3674.

74. Li M., Brooks C. L., Wu-Baer F., Chen D., Baer R., Gu W. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2 // Science. 2003. Vol.302, №5652. P. 1972-1975.

75. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. Vol.193, №1. P. 265-275.

76. Mattila Р. M., Roytta M., Torikka H., Dickson D. W., Rinne J. O. Cortical Lewy bodies and Alzheimer-type changes in patients with Parkinson's disease // Acta Neuropathol. 1998. Vol.95, №6. P. 576-582.

77. Mayer R. J. The meteoric rise of regulated intracellular proteolysis // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. Vol.1, №2. P. 145-148.

78. McKenna S., Spyracopoulos L., Moraes Т., Pastushok L., Ptalc C., Xiao W., Ellison M. J. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human

79. DNA repair protein Mms2 is required for Ubc 13-mediated polyubiquitination // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276, №43. P. 40120-40126.

80. Meek D. W., Knippschild U. Posttranslational modification of MDM2 // Mol. Cancer Res. 2003. Vol.1, №14. P. 1017-1026.

81. Melikova M. S., Kondratov K. A., Kornilova E. S. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG132 // Cell Biol. Int. 2006. Vol.30, №1. P. 31-43.

82. Moraes T. F., Edwards R. A., McKenna S., Pastushok L., Xiao W., Glover J. N., Ellison M. J. Crystal structure of the human ubiquitin conjugating enzyme complex, hMms2-hUbcl3 //Nat. Struct. Biol. 2001. Vol.8, №8. P. 669-673.

83. Moms J. R., Solomon E. BRCA1 : BARD1 induces the formation of conjugated ubiquitin structures, dependent on K6 of ubiquitin, in cells during DNA replication and repair // Hum. Mol. Genet. 2004. Vol.13, №8. P. 807-817.

84. Nuber U., Schwarz S. E., Scheffner M. The ubiquitin-protein ligase E6-associated protein (E6-AP) serves as its own substrate // Eur. J. Biochem. 1998. Vol.254, №3. P. 643-649.

85. Okubo K., Yamano K., Qin Q., Aoyagi K., Ototake M., Nakanishi Т., Fukuda H., Dijkstra J. M. Ubiquitin genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) //Fish Shellfish Immunol. 2002. Vol.12, №4. P. 335-351.

86. Osley M. A. Transcription RINGs in repair // Nat. Cell Biol. 2005. Vol.7, №6. P. 553-555.

87. Ozkaynak E., Finley D., Solomon M. J., Varshavsky A. The yeast ubiquitin genes: a family of natural gene fusions // EMBO J. 1987. Vol.6, №5. P. 1429-1439.

88. Ozkaynak E., Finley D., Varshavsky A. The yeast ubiquitin gene: head-to-tail repeats encoding a polyubiquitin precursor protein // Nature. 1984. Vol.312, №5995. P. 663-666.

89. Passmore L. A., Barford D. Getting into position: the catalytic mechanisms of protein ubiquitylation // Biochem. J. 2004. Vol.379, №Pt 3. P. 513-525.

90. Pastushok L., Spyracopoulos L., Xiao W. Two Mms2 residues cooperatively interact with ubiquitin and are critical for Lys63poly ubiquitination in vitro and in vivo // FEBS Lett. 2007. Vol.581, №28. P. 5343-5348.

91. Peng J., Schwartz D., Elias J. E., Thoreen С. C., Cheng D., Marsischky G., Roelofs J., Finley D., Gygi S. P. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination // Nat. Biotechnol. 2003. Vol.21, №8. P. 921-926.

92. Pichler A., Knipscheer P., Oberhofer E., van Dijk W. J., Korner R., Olsen J. V., Jentsch S., Melchior F., Sixma Т. K. SUMO modification of the ubiquitin-conjugating enzyme E2-25K//Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol.12, №3. P. 264-269.

93. Pickart С. M. Targeting of substrates to the 26S proteasome // FASEB J. 1997. Vol.11, №13. P. 1055-1066.

94. Polo S., Sigismund S., Faretta M., Guidi M., Capua M. R., Bossi G., Chen H., De C. P., Di Fiore P. P. A single motif responsible for ubiquitinrecognition and monoubiquitination in endocytic proteins // Nature. 2002. Vol.416, №6879. P. 451-455.

95. Sakai N., Sawada H., Yokosawa H. Extracellular ubiquitin system implicated in fertilization of the ascidian, Halocynthia roretzi: isolation and characterization // Dev. Biol. 2003. Vol.264, №1. P. 299-307.

96. Sakai N., Sawada M. Т., Sawada H. Non-traditional roles of ubiquitin-proteasome system in fertilization and gametogenesis // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol.36, №5. P. 776-784.

97. Schmidt M. H., Dikic I. Ubiquitin and NEDD8: brothers in arms // Sci. STKE. 2006. Vol.2006, №362. P. e50.

98. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Res. 2003. Vol.31, №13. P. 3381-3385.

99. Shih S. C., Prag G., Francis S. A., Sutanto M. A., Hurley J. H., Hicke L. A ubiquitin-binding motif required for intramolecular monoubiquitylation, the CUE domain // EMBO J. 2003. Vol.22, №6. P. 1273-1281.

100. Shih S. C., Sloper-Mould К. E., Hicke L. Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors // The EMBO Journal. 2000. Vol.19, №2. P. 187-198.

101. Shin H., Okada K., Wilkinson J. C., Solomon К. M., Duckett C. S., Reed J. C., Salvesen G. S. Identification of ubiquitination sites on the X-linked inhibitor of apoptosis protein // Biochem. J. 2003. Vol.373, №Pt 3. P. 965-971.

102. Shindyalov I. N., Bourne P. E. Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path // Protein Eng. 1998. Vol.11, №9. P. 739-747.

103. Sigismund S., Polo S., Di Fiore P. P. Signaling through monoubiquitination // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2004. Vol.286. P. 149-185.

104. Smiley J. A., Jones M. E. A unique catalytic and inhibitor-binding role for Lys93 of yeast orotidylate decarboxylase // Biochemistry. 1992. Vol.31, №48. P. 12162-12168.

105. Stelter P., Ulrich H. D. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation // Nature. 2003. Vol.425, №6954. P. 188-191.

106. Strous G. J., Govers R. The ubiquitin-proteasome system and endocytosis//J. Cell Sci. 1999. Vol.112 ( Pt 10). P. 1417-1423.

107. Swaminathan S., Amerik A. Y., Hochstrasser M. The Doa4 Deubiquitinating Enzyme Is Required for Ubiquitin Homeostasis in Yeast // Mol. Biol. Cell. 1999. Vol.10, №8. P. 2583-2594.

108. Swanson K. A., Kang R. S., Stamenova S. D., Hicke L., Radhakrishnan I. Solution structure of Vps27 UIM-ubiquitin complex important for endosomal sorting and receptor downregulation // EMBO J. 2003. Vol.22, №18. P. 4597-4606.

109. Swerdlow P. S., Finley D., Varshavsky A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters // Anal. Biochem. 1986. Vol. 156. P. 147-153.

110. Terrell J., Shih S., Dunn R., Hicke L. A function for monoubiquitination in the internalization of a G protein-coupled receptor // Mol. Cell. 1998. Vol.1, №2. P. 193-202.

111. Torres-Ramos C. A., Prakash S., Prakash L. Requirement of RAD5 and MMS2 for postreplication repair of UV-damaged DNA in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell Biol. 2002. Vol.22, №7. P. 24192426.

112. Ullrich A., Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity // Cell. 1990. Vol.61, №2. P. 203-212.

113. Ulrich H. D. Natural substrates of the proteasome and their recognition by the ubiquitin system // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002a. Vol.268. P. 137-174.

114. Ulrich H. D. Protein-protein interactions within an E2-RING finger complex. Implications for ubiquitin-dependent DNA damage repair // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278, №9. P. 7051-7058.

115. Ulrich H. D., Jentsch S. Two RING finger proteins mediate cooperation between ubiquitin-conjugating enzymes in DNA repair // EMBO J. 2000. Vol.19, №13. P. 3388-3397.

116. Ulrich H. D. Degradation or maintenance: actions of the ubiquitin system on eukaryotic chromatin // Eukaryotic Cell. 2002b. Vol.1, №1. P. 110.

117. Urbe S., McCullough J., Row P., Prior I. A., Welchman R., Clague M. J. Control of growth factor receptor dynamics by reversible ubiquitination // Biochem. Soc. Trans. 2006. Vol.34, №Pt 5. P. 754-756.

118. Varadan R., Assfalg M., Haririnia A., Raasi S., Pickart C., Fushman D. Solution conformation of Lys63-linked di-ubiquitin chain provides clues to functional diversity of polyubiquitin signaling // J. Biol. Chem. 2004. Vol.279, №8. P. 7055-7063.

119. Varadan R., Walker O., Pickart C., Fushman D. Structural properties of polyubiquitin chains in solution // J. Mol. Biol. 2002. Vol.324, №4. P. 637-647.

120. Varshavsky A. The N-end rule pathway of protein degradation // Genes Cells. 1997a. Vol.2, №1. P. 13-28.

121. Varshavsky A. The ubiquitin system // Trends Biochem. Sci. 1997b. Vol.22, №10. P. 383-387.

122. Wang H., Wang L., Erdjument-Bromage H., Vidal M., Tempst P., Jones R. S., Zhang Y. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing//Nature. 2004. Vol.431, №7010. P. 873-878.

123. Waterman H., Levkowitz G., Alroy I., Yarden Y. The RING finger of c-Cbl mediates desensitization of the epidermal growth factor receptor // J. Biol. Chem. 1999. Vol.274, №32. P. 22151-22154.

124. Weekes J., Morrison K., Mullen A., Wait R., Barton P., Dunn M. J. Hyperubiquitination of proteins in dilated cardiomyopathy // Proteomics. 2003. Vol.3, №2. P. 208-216.

125. Weissman A. M. Themes and variations on ubiquitylation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. Vol.2, №3. P. 169-178.

126. Welchman R. L., Gordon C., Mayer R. J. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol.6, №8. P. 599-609.

127. Wen R., Newton L., Li G., Wang H., Xiao W. Arabidopsis thaliana UBC13: implication of error-free DNA damage tolerance and Lys63-linked polyubiquitylation in plants // Plant Mol. Biol. 2006. Vol.61, №1-2. P. 241253.

128. Wen R., Torres-Acosta J. A., Pastushok L., Lai X., Pelzer L., Wang H., Xiao W. Arabidopsis UEV1D promotes Lysine-63-linked polyubiquitination and is involved in DNA damage response // Plant Cell. 2008. Vol.20, №1. P. 213-227.

129. Winkler G. S., Albert Т. K., Dominguez C., Legtenberg Y. I., Boelens R., Timmers H. T. An altered-specificity ubiquitin-conjugating enzyme/ubiquitin-protein ligase pair // J. Mol. Biol. 2004. Vol.337, №1. P. 157-165.

130. Xia Y., Pao G. M., Chen H. W., Verma I. M., Hunter T. Enhancement of BRCA1 E3 ubiquitin ligase activity through direct interaction with the BARD1 protein // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278, №7. P. 5255-5263.

131. Xu P., Peng J. Dissecting the ubiquitin pathway by mass spectrometry // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol.1764, №12. P. 1940-1947.

132. Yaish P., Gazit A., Gilon C., Levitzki A. Blocking of EGF-dependent cell proliferation by EGF receptor kinase inhibitors // Science. 1988. Vol. 242. P. 933-935.

133. Yamashita Т., Nakahata T. Current knowledge on the pathophysiology of Fanconi anemia: from genes to phenotypes // Int. J. Hematol. 2001. Vol. 74. P. 33-41.

134. Yamakami M., Yoshimori Т., Yokosawa H. Toml, a VHS domain-containing protein, interacts with tollip, ubiquitin, and clathrin // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278, №52. P. 52865-52872.

135. Yamamoto M., Sato S., Saitoh Т., Sakurai H., Uematsu S., Kawai Т., Ishii K. J., Takeuchi O., Akira S. Cutting Edge: Pivotal function of Ubc 13 in thymocyte TCR signaling // J. Immunol. 2006b. Vol.177, №11. P. 75207524.

136. Yang Y., Yu X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way // FASEB J. 2003. Vol.17, №8. P. 790-799.

137. Yarden Y., Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases // Annu. Rev. Biochem. 1988. Vol. 57. P. 443-478.

138. Zheng N., Wang P., Jeffrey P. D., Pavletich N. P. Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex: RING domain function in ubiquitin-protein ligases // Cell. 2000. Vol.102, №4. P. 533-539.

139. Zhou H., Wertz I., O'Rourke K, Ultsch M., Seshagiri S., Eby M., Xiao W., Dixit V. M. Bel 10 activates the NF-kappaB pathway through ubiquitination of NEMO //Nature. 2004. Vol.427, №6970. P. 167-171.

140. Zhu В., Zheng Y., Pham A. D., Mandal S. S., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Reinberg D. Monoubiquitination of human histone H2B: the factors involved and their roles in HOX gene regulation // Mol. Cell. 2005. Vol.20, №4. P. 601-611.

141. СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

142. Е1- убиквитин-активирующий фермент

143. Е2 убиквитин-конъюгирующий фермент

144. ЕЗ (УПЛ) убиквитин-протеин лигаза

145. УПЛК убиквитин-протеин лигазный комплекс1. АТФ аденозинтрифосфат

146. ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

147. ЭФР — эпидермальный фактор роста

148. EGFR рецептор эпидермального фактора роста

149. РТК рецепторные тирозинкиназы

150. DUB — деубиквитилирующий фермент

151. SDS-PAGE — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

152. MALDI матричная лазерная десорбция/ионизация

153. ESI ионизация электроспреем

154. ODC — оротидин 5'-фосфат декарбоксилаза

155. PCS пероксисомальная цитрат синтаза

156. MCS митохондриальная цитрат синтаза1. СаМ кальмодулин

157. XIAP Х-связанный ингибитор апоптоза АЦ - активный центр БД - база данных

158. УПБ — убиквитиноподобные белки AG1478 4-(3-Хлороанилино)-6,7-диметоксихиназолин а.м.е. — абсолютные массовые единицы а. к. - аминокислотный остаток

159. Названия аминокислот представлены в виде международного трехбуквенного латинского кода, в составе пептидов — в виде однобуквенного латинского кода