Регуляция экспрессии белков-предшественников нейропептидов пищевого и оборонительного поведения виноградной улитки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Богуславский, Дмитрий Викторович

• Богуславский, Дмитрий Викторович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Богуславский, Дмитрий Викторович

А) Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Положения, выносимые на защиту

Б) Литературный обзор

1. Вводная часть

2. Биосинтез и процессинг нейропептидов

3. Нейропептиды беспозвоночных

4. Кальцийсвязывающие белки с EF-hand доменом

5. Белки-предшественники в командных нейронах виноградной улитки

6. Интерференция РНК. Морфолино олигонуклеотиды.

В) Материалы и методы

1. Микроэлектродная регистрация внутриклеточной активности

2. Получение и очистка поликлональных антител

2.1. Иммунизация

2.2. Получение и очистка антисыворотки

2.3. Иммуноаффинная хроматография

2.4. Двойная иммунопреципитация в геле (метод Оухтерлони)

2.5. Преципитация по Гейдельбергу

2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ

3. Методы иммунохимии и работы с белком

3.1. Равновесный микродиализ

3.2. Метод "overlay-blotting"

3.3. Метод "shift assay mobility"

3.4. Иммуноблотгинг растворов белков и пептидов

3.5. Окрашивание антителами whole-mount препаратов

4. Электронная микроскопия

5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами

5.1. Полимеразная цепная реакция (PCR)

5.2. Рестрикция

5.3. Очистка ДНК через легкоплавкую агарозу

5.4. Цитирование

5.5. Приготовление компетентных клеток

5.6. Трансформация

5.7. Выделение плазмид

5.8. PCR с колоний

5.9. Приготовление зонда к мРНК

5.10. Гибридизация in situ на whole-mount препаратах

Г) Цель и задачи работы

Д) Результаты

1. Исследование паттерна транскрипции гена preHelixSFamid

1.1. Картирование транскрипции

1.2. Паттерн транскрипции при пищевой депривации

1.3. Изменение паттерна транскрипции в онтогенезе

2. Транскрипция HCS

3. Ультраструктура командных нейронов

4. HCS

4.1. Кальцийсвязывающие свойства HCS

4.2. Получение и проверка специфичности антител

4.3. Процессинг HCS

4.4. Гомология HCS2 с другими белками

5. Селективная блокада генной экспрессии в одиночных идентифицированных нейронах виноградной улитки

Е) Обсуждение

Ж) Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция экспрессии белков-предшественников нейропептидов пищевого и оборонительного поведения виноградной улитки»

Одной из важнейших проблем современной физиологии является изучение функции генов, которые в большом количестве описаны у животных и человека. Надежды, связанные с появлением нокаутных животных с дефицитом по одному гену оправдались, когда изучались гены с известной на молекулярном уровне функцией, и контроль выключения этой функции проводился на субклеточном уровне. Однако попытки проанализировать роль генов в поведении и обучении столкнулись с тем, что нокаут отдельных генов часто приводит к включению компенсаторных механизмов, которые могут скрыть, изменения, вызванные отсутствием экспрессии изучаемого гена (Crusio, 1996; Gerlai, 1996; Lathe, 1996; Wagner, 1994). Новые методы избирательного блокирования трансляции отдельных генов сейчас интенсивно развиваются и уже внесли свой вклад в развитие некоторых областей биологии. Возможность успешного использования одного из этих методов - метода инъекции морфолино олигонуклеотидов показана нами на идентифицированных нейронах оборонительного поведения. Третий подход -корреляционный. Он успешно использовался при изучении сенсорной регуляции ранней генной экспрессии в зрительной коре млекопитающих (Kaczmarek, Chaudhuri, 1997). Исследовался общий уровень экспрессии ранних генов в области коры, включающей миллионы нейронов, большая часть которых не идентифицирована по выполняемым ими функциям. Что касается генов, локально экспрессирующихся в ЦНС в физиологически идентифицированных нейронах, изучение их экспрессии впервые начато в нашей лаборатории (Bogdanov et al., 1994). Была обнаружена экспрессия отдельных генов в группах нейронов, участвующих в реализации определенного типа поведения.

Физиологические воздействия на молекулярные механизмы экспрессии генов должны быть особенно важны в нервной системе, в которой экспрессируется наибольшее количество генов, и где такие воздействия оказывают существенное влияние на пластичность нервных клеток и синапсов. Довольно подробно изучено влияние отдельных генов на формирование нервной системы в эмбриогенезе, экспрессия ранних генов fos и jun семейств в нейронах (Anokhin K.V., Sudakov К.V., 2003). С другой стороны, остается почти не изученным вопрос об экспрессии генов, кодирующих белки, принимающих непосредственное участие в организации поведенческого акта, таких как предшественники нейропептидов и нейрогормонов. Почти ничего не известно о влиянии физиологических факторов на транскрипцию, трансляцию и белковый процессинг таких предшественников, а также об их экспрессии в эмбриогенезе. Можно предположить, что экспрессия большинства таких генов не постоянна, и, скорее всего, зависит от влияния факторов, связанных с определенным типом поведения, в организации которого принимают участие данные молекулы. Проверить правильность данного утверждения можно лишь на объекте с хорошо исследованной на клеточном уровне физиологией поведения. При этом изучаемые нейроны должны отвечать следующим условиям: описано их участие в определенном типе поведения; крупные размеры таких нейронов и высокий уровень экспрессии белков-предшественников должны сделать возможным использование биохимических и молекулярно-биологических методов, параллельно с физиологическими исследованиями. Существенным является условие отсутствия экспрессии изучаемых генов в большинстве других клеток нервной системы. Всем этим требованиям отвечают отдельные группы идентифицированных нейронов виноградной улитки, с найденными в них продуктами экспрессии нескольких генов, кодирующих предшественники нейропептидов. Это гигантские командные интернейроны париетального ганглия, принимающие участие в оборонительном поведении, и экспрессирующие-белки-предшественники HCS1 и HCS2 (helix command neuron-specific). Отдельные нейроны педального, буккального и церебрального ганглиев, участвующие в пищевом поведении улитки и экспрессирующие предшественник preHelixSFamid.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе нами использован корреляционный подход для исследования изменения экспрессии отдельных генов при физиологических воздействиях, вызывающих пищевое/оборонительное поведение виноградной улитки. Впервые детально охарактеризован паттерн экспрессии генов, кодирующих белки-предшественники нейропептидов - preHelixSFamid и HCS1. Исследовано изменение экспрессии гена preHelixSFamid в эмбриогенезе.

Обнаружено сходство между изменениями в паттерне экспрессии ргеНеИх8Раппс1 у взрослых животных, находящихся в различном функциональном состоянии и началом экспрессии этого гена в отдельных группах нейронов в эмбриогенезе.

Подробно изучена ультраструктура командных нейронов оборонительного поведения ЬРа2, РРа2, ЬРаЗ, РРаЗ, и показана внутриклеточная локализация продуктов экспрессии нейроспецифичного гена НС82.

Мы впервые применили корреляционный подход при исследовании трансляции и процессинга продукта экспрессии одного гена (НС82) в одном типе нейронов, ранее идентифицированных по выполняемой функции (командные нейроны оборонительного поведения). Обнаружена взаимосвязь между синтезом отдельных нейропептидов, кодируемых геном НС82, и воздействиями, изменяющими концентрацию цитоплазматического кальция в командных нейронах. Исследована экспрессия гомолога НС82 - белка-предшественника, синтезируемого группой нейронов плеврального ганглия моллюска апплизии.

Нам первыми удалось заблокировать в одном нейроне взрослого животного экспрессию одного гена. Была изучена временная динамика уменьшения количества белка при использовании инъекции антисмысловых морфолино олигонуклеотидов. Применение клеточно проницаемых морфолино позволит специфически ингибировать экспрессию отдельных генов во всех клетках ЦНС взрослых животных. Отсутствие компенсаторных механизмов, часто проявляющихся при нокауте, даст возможность прямого изучения роли отдельных генов в нервной системе.

Исходя из того, что молекулярные механизмы работы нервной системы едины у всех животных, данная работа может быть полезной в будущих исследованиях биосинтеза нейропептидов, как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных.

Положения, выносимые на защиту

1) Количество нейронов, транскрибирующих предполагаемый белок-предшественник пептидов пищевого поведения ргеНеНх8Рапи<1, увеличивается при пищевой депривации взрослой улитки, а также у ювенильной улитки к началу активного питания.

2) Физиологические воздействия, вызывающие оборонительное поведение, увеличивают экспрессию генов HCS1 и HCS2, как в отдельных нейронах, так и во всей ЦНС, изменяя паттерн экспрессии.

3) Ген HCS2 кодирует белок-предшественник с высокой кальцийсвязывающей активностью. Изменение внутриклеточной концентрации кальция в командных нейронах прямо влияет на интенсивность процессинга HCS2.

4) Командные нейроны париетального ганглия имеют ультраструктуру, свойственную нейросекреторным клеткам с высоким уровнем синтеза нейропептидов и нейрогормонов: сильное развитие гранулярного эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи в цитоплазме этих клеток; при повышении концентрации кальция наблюдается транспорт из сомы нейрона в аксонную терминаль накопленных ранее электронноплотных везикул с продуктом экспрессии гена HCS2.

5) Иммунопозитивные к антителам против CNP пептидов клетки существуют у отдельных представителей кольчатых червей, насекомых и моллюсков.

6) Внутриклеточная инъекция специфических морфолино олигонуклеотидов избирательно блокирует экспрессию гена HCS2 в гигантских командных нейронах виноградной улитки.

Литературный обзор Вводная часть

Нервная система виноградной улитки Helix lucorum — удобный объект для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе пластичности нервной системы. Простота строения нервной системы улитки, ее исследованность, большое количество морфологически и функционально идентифицированных и картированных нейронов (Balaban P.M., 1983, 1993, 2002), а также разнообразие форм поведения, вместе с возможностью экспериментального использования большинства методов современной нейробиологии и биохимии делает улитку наиболее подходящим видом, для изучения молекулярных основ поведения.

В нашей лаборатории были найдены гены, специфически экспрессирующиеся в ограниченном количестве клеток нервной системы (Bogdanov et al., 1994, 1998). Последующая физиологическая идентификация таких нейронов обнаружила удивительно высокую корреляцию между паттернами экспрессии этих генов и распределением нейронов, входящих в рефлекторные дуги отдельных поведенческих актов. Были обнаружены гены локально экспрессирующиеся в нейронах, обеспечивающих пищевое, половое, оборонительное и исследовательское поведение виноградной улитки. Два из этих генов, HCS1 и HCS2 (helix command neuron-specific), были найдены преимущественно экспрессирующимися в четырех (HCS2) или в двух (HCS1) легко идентифицируемых гигантских премоторных интернейронах, локализованных в париетальном ганглии. Эти нейроны - ключевой элемент в сети, управляющей оборонительным поведением Helix lucorum, они вовлечены в габитуацию, сенситизацию, и аверсивное обуславливание (Balaban P.M., 1983, 2002; Balaban P.M. et al., 1987).

В отдельных нейронах сети пищевого поведения (в буккальных и в церебральных ганглиях), а также в группе неидентифицированных серотонинергических нейронах, специфически экспрессируется ген, названный preHelixSFamid. Он кодирует белок-предшественник нескольких пептидов, относящихся к семейству педальных пептидов. Также в нашей лаборатории был изучен ген preproGFAD (GFAD precursor protein), кодирующий физиологически активный пептид GFAD (Gly-Phe-Ala-Asp) и экспрессирующийся в отдельных нейронах мезоцеребрума, вовлеченных в организацию полового поведения (Poteryaev et al., 1998). В данное время мы изучаем несколько ранее неизвестных генов, по-видимому, вовлеченных в организацию исследовательского поведения.

Наиболее подробно нами изучен ген и кодируемый им белок HCS2. Он обладает несколькими особенностями, делающими его удобным объектом изучения транскрипции, трансляции и посттрансляционного процессинга в нервных клетках. Во-первых, данный ген экспрессируется в четырех гигантских командных интернейронах париетального ганглия, имеющих диаметр около 200 мкм. Крупные размеры этих клеток позволяют использовать почти все богатство методов молекулярной биологии, биохимии и клеточной биологии для исследований экспрессии HCS2. Во-вторых, экспрессия этого гена практически полностью определяется активацией командных нейронов а, следовательно, прямо коррелирует с активностью большого количества нейронов, посылающих свои коллатерали к гигантским интернейронам. Воздействие серотонина на мембрану командных нейронов увеличивает в десятки раз концентрацию внутриклеточного кальция, что в свою очередь приводит к резкому усилению транскрипции HCS2 (Balaban P.M. et al., 2001). Можно предположить, что физиологически адекватные воздействия на командные нейроны, также влияют на трансляцию HCS2. В-третьих, высокая экспрессия изучаемого белка и зависимость ее от физиологических воздействий, делает удобным исследование селективного блокирования экспрессии in vivo лишь одного гена, а также влияние физиологически значимых воздействий на молекулярные механизмы нейрональной активности. В-четвертых, необычна первичная структура белка, кодируемого геном HCS2. Он состоит из трех различных доменов: гидрофобного лидера, предшественника четырех нейропептидов и кальцийсвязывающего участка EF-hand. Наличие первых двух доменов типично для секретируемых белков, гидрофобный участок служит сигналом синтеза таких молекул на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума, определяя, таким образом, дальнейшую судьбу белка в клетке. EF-hand домен обычно присутствует в молекулах кальцийсвязывающих белков. Присутствие его в белке-предшественнике не типично. Вероятно это отобранное в процессе эволюции наследственное изменение, давшее организму определенные преимущества на уровне молекулярной организации оборонительного поведения. Особенно учитывая важную роль, которую играет внутриклеточный кальций в гигантских командных нейронах. В этих клетках кальций - основной вторичный мессенджер, обеспечивающий как быстрый ответ данных нейронов на синаптическую активацию, так и долговременные изменения в функционировании этих клеток. Возможно, взаимодействие ионов кальция с HCS2 изменяет посттрансляционный процессинг последнего. В-пятых, ген гомологичный HCS2, обнаружен у представителя подкласса заднежаберных (виноградная улитка относится к подклассу легочных) — моллюска аплизии. Он кодирует белок-предшественник трех нейропептидов с аминокислотной последовательностью подобной пептидам

НСБ2. В С-концевой части белка аплизии расположен ЕР-Ьапс! домен. Этот факт свидетельствует в пользу гипотезы о не случайном слиянии кальцийсвязывающего и пептидного доменов НС82 в данных нейронах в процессе эволюции, подтверждая функциональную значимость присутствия ЕР-Ьапс! домена в исследуемом белке. Можно предполагать существование белков, гомологичных НСБ2 в других классах беспозвоночных. И в-шестых, начало экспрессии гена НС82 в онтогенезе совпадает с появлением у зародыша виноградной улитки оборонительной реакции. Это может служить дополнительным доказательством участия продуктов экспрессии данного гена в организации оборонительного поведения. Представленные выше факты, говорят о целесообразности подробного исследования экспрессии НСБ2 для более глубокого понимания молекулярных основ поведения.

Изучению взаимосвязи экспрессии отдельно взятого гена и проявления определенного типа поведения посвящена работа по исследованию паттерна экспрессии гена ргеНеИхБРаппс!, который относится к большому семейству педальных пептидов. Продукты постгрансляционного процессинга белков этого семейства играют важную роль в регуляции функций нервной системы. Сравнение экспрессии одного гена в онтогенезе и при различных функциональных состояниях животного никем не выполнялось. Такое сравнение, во-первых, может помочь в поиске нейронов, участвующих в организации определенного типа поведения, а во-вторых, обнаружить взаимосвязь между экспрессией гена при появлении данного типа поведения в онтогенезе и при изменении функционального состояния у взрослого животного.

Изучение неизвестных ранее особенностей транскрипции, трансляции и пострансляционного процессинга белков-предшественников виноградной улитки интересно не только в силу их определенной уникальности, также это в некоторой степени является экспериментальным обоснованием необходимости подробного изучения отдельных генов, которые могут быть вовлечены в организацию отдельных поведенческих актов.

Биосинтез и процессинг нейропептидов

Что такое нейропептиды? Очевидное определение нейропептидов было бы -пептиды, обнаруживаемые в нервной системе. Это включило бы очень большое количество пептидов и коротких белковых последовательностей с различными функциями. Однако в литературе этому слову обычно придают более ограниченное значение: нейропептид - это пептид, который может быть высвобожден из нейрона как сигнальная молекула. Эта сигнальная молекула будет иметь трансмиттерный или модуляторный эффект в другой возбудимой клетке, а иногда и в собственной. Нейропептид является всегда пептидом с низким молекулярным весом, то есть состоит из сравнительно небольшого числа аминокислотных остатков, обычно между 4 и 30, и редко больше чем 40 остатков. Нейропептиды представлены в центральной и в периферической нервной системе позвоночных, и в ганглиях беспозвоночных. Они встречаются во всех группах животных, обладающих нервной системой, даже в такой простой, как у Coelenterates (Thorndyke et al., 1988; Holmgren et al., 1994).

Нейротрансмитгерное действие нейропептидов было обнаружено намного раньше, чем таковое большинства других типов нейромедиаторов. Нейропептиды встречаются во всех типах нервов, включая сенсорные нервы (вещество Р), болевые нервы (эндорфины), нервы автономной нервной системы (нейрокинин А, гастрин-высвобождающий пептид, VIP, РАСАР), соматомоторные нервы (например, проктолин беспозвоночных). По-видимому, в отдельном нейроне каждый нейропептид всегда сосуществует с другим нейротрансмиттером. Им может быть один из классических медиаторов, или другой нейропептид. Нейропептиды обычно функционируют через медленные метаботропные рецепторы, связанные с G-белками и часто выполняют модуляторные функции в постсинаптической клетке. Молекулы нейропептидов присутствуют не только в нервной системе. Сходные молекулы часто присутствуют в эндокринных клетках и выбрасываются оттуда, действуя как гормоны (Solcia et al., 1989). Примером такого «регуляторного пептида» является холецистокинин (ССК). В этом случае, один из продуктов альтернативного сплайсинга, молекула предшественника ССК8, экспрессируется и высвобождается в нейронах, в то время как другой, ССКЗЗ, преобладает в эндокринных клетках (Dockray et al.y 1980).

А В

Signal Spacer Neuropeptide molecule peptide transcription and splicing

С RNA )

4 translation

PreProPEPTIDE)

4 signal peptide cleaved oft ф0Щ I У/////Л

Шi||

С PROPEPTIDE ) p05№ans/, processing peptide )

1 V////M 1 шшшту У/////Ж'//////Л

Рисунок 1. Синтез нейропептидов.

A) Основные стадии синтеза нейропептидов от транскрипции ДНК до формирования зрелых пептидов.

B) Типы белков-предшественников нейропептидов.

Нейропептиды синтезируются так же, как все другие пептиды и белки. ДНК в ядре кодирует матричную РНК, которая оставляет ядро, и транспортируется в цитоплазму, где служит матрицей при биосинтезе полипептида на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Этот полипептид — предшественник активного пептида, назван препропептидом. Часть препропептида отщепляется от формирующегося пропептида, а часть пропептида расщепляется, формируя активные нейропептиды (Рис.1 А). В случае нейропептида это происходит в аппарате Гольджи, и активные пептиды упаковываются в секреторные гранулы, отпочковывающиеся от аппарата Гольджи и транспортируемые аксональным транспортом в терминаль аксона. Предшественник пептида (препропептид) часто имеет три компонента: сигнальную последовательность приблизительно из 16-30 аминокислотных остатков на И-конце, одну или больше последовательностей нейропептида, и одну или несколько спейсерных частей (также называемых фланкирующими частями) (Рис.1 В). Присутствие сигнального пептида позволяет препропептиду проходить в эндоплазматический ретикулум в течение синтеза. Спейсерные части удлиняют синтезирующийся пептид так, чтобы его длина была достаточна для того, чтобы пройти через мембраны, и продвигаться внутри эндоплазматического ретикулума

Dores et al., 1996). Они могут увеличивать длину молекулы от нескольких аминокислот до 10 раз конечного активного продукта. Спейсерные части отщепляются от конечного активного пептида в специфических местах основных одиночных остатков (аргинин, лизин) или в двух смежных основных остатков аминокислот.

Гидрофобный лидер - один из самых распространенных типов сигнального пептида. Такие пептиды, как и сигнальные участки белковой молекулы, служат сигналами сортировки белков в клетке. Центральная часть сигнального пептида, обычно образована 5-10 гидрофобными аминокислотными остатками. Данная структура позволяет белку пройти через мембрану ЭПР и обычно сразу отщепляется протеазами, как только белок окажется в ЭПР (Andrews et al., 1987). Сигнальный пептид не всегда располагается в N-концевой части, у белков-предшественников FMRF-амида, интерлейкина 1, последовательность гидрофобных аминокислот расположена в центральной части белковой молекулы (Schaefer et al., 1985). Дальнейшая судьба белка в ЭПР зависит уже от другого сигнального пептида, который может находиться в С-концевой части молекулы. Такой пептид состоит всего из четырех аминокислот, обычно это -Lys-Asp-Glu-Leu-COO". Если данный пептид присутствует в белковой молекуле, белок остается в ЭПР. Если такого пептида нет, белок транспортируется в аппарат Гольджи. (Blobel, 1980; Garoff, 1985).

Мутации в генах ведут к изменениям в аминокислотной последовательности, и объясняют различия в структуре нейропептидов у различных видов животных. Чем больше отдалены два вида, тем большее количество замен может быть найдено в одном и том же нейропептиде. Биологически активная часть нейропептида обычно наиболее сохранная часть. Нейропептиды также формируют семейства из близко связанных пептидов, где несколько членов могли произойти из одной разновидности. Пептиды одного семейства обладают высоким сходством первичной структуры, схожими или близкими функциональными особенностями. (Holmgren et al., 2001).

Известно уже более тысячи нейропептидов, а количество ежегодно открываемых постоянно растет. Такое огромное разнообразие пептидов нервной системы, возникшее в процессе эволюции не случайно. Оно связано со сложностью организации и количеством функций, выполняемых нервной системой. Нейропептиды имеют особое значение в межклеточной сигнализации, лежащей в основе пластичности нервной системы. Функционально они занимают место между классическими медиаторами для малых нейропептидов и нейрогормонами для крупных пептидов. Для первых характерно малое время воздействия и небольшие расстояния до клеток-мишеней. Вторые характеризуются длительным воздействием и часто довольно длинными путями распространения.

Нейропептиды беспозвоночных Пирокинины и малые кардиоактивные пептиды

Пирокинины (пирокинины/феромонный биосинтез активирующие нейропептиды (PBAN)) - семейство пептидов, впервые найденных у насекомых, характеризуются С-концевой пяти-аминокислотной последовательностью — Phe-X-Рго-Arg-Leu (FXPRL, где X - Ser, Thr или Val). Это минимальная последовательность, необходимая для проявления физиологической активности данными пептидами. Этот пентапептид является активным ядром, которое требуется для реализации разнообразных физиологических функций, таких как стимуляция биосинтеза феромона у самок чешуекрылых, активация сокращения мышц, индукция эмбриональной диапаузы, стимуляция меланизации у некоторых личинок чешуекрылых, также это семейство пептидов вовлечено в ускорение формирования куколки двукрылых.

Пирокинин (лейкопирокинин) из таракана, Leucophaea maderae, был впервые идентифицирован, как миотропин, то есть как пептид, обладающий миотропной активностью (Holman et al., 1986). Феромонотропная активность представителей семейства PBAN была продемонстрирована у бабочки Helicoverpa zea (Raina et al., 1993). Меланотропная активность показана у личинок тутового шелкопряда, Bombyx morí (Matsumotu et al., 1990), эту активность вызывал тот же самый пептид, что и ранее открытый нейропептид, активирующий феромонный биосинтез (Kitamura et al., 1989). Данное семейство также содержит пептид, который стимулирует эмбриональную диапаузу у Bombyx morí (Imai et al., 1991). Показана акселерация формирования куколки у мясных мух пептидами этого семейства (Zdarek et al., 1997). Члены семейства кроссреактивны, каждый пептид семейства может быть активен во всех физиологических функциях (Kuniyoshi et al., 1992; Nachman et al., 1993a, 1993b; Raina et al, 1992). Функциональный эпитоп FXPRLamide широко распространен среди насекомых. Представители семейства обнаружены как у взрослых, так и у ювенильных двукрылых, тараканов, бабочек.

Иммуноцитохимическая локализация некоторых членов пирокинин/РВAN пептидов была проведена в нескольких отрядах насекомых. У чешуекрылых, субэзофагиальный ганглий (SEG) содержит три группы нейронов, которые продуцируют PBAN (Kingan et al, 1992; Ma et al., 1994; Sato et al., 1994). Вентральный ганглий, также содержат PBAN-подобную активность (Ma et al., 1996; Teal et al., 1997). Субэзофагиальный и вентральный ганглий представителей отрядов прямокрылых и двукрылых содержат пептиды, которые принадлежат пирокинин/РВ AN семейству пептидов (Predel et al., 2000; Schoofs et al., 1993; Tips et al., 1993).

Недавно были обнаружены два гена у мухи Drosophila, кодирующие рецепторы к пирокинину-2 SVPFKPRLamide (Rosenkilde et al., 2003). Первый рецептор состоит из 658 аминокислотных остатков, второй - из 595. Гомологичные им молекулы обнаружены у комара. Anopheles (388 и 493 а.о.) (Holt et al., 2002). Все четыре рецептора содержат несколько доменов гомологичных рецептору из Drosophila (CG9918), связанному с G-белком, что указывает на их метаботропную природу.

По своей первичной структуре и миотропной активности к PBAN семейству очень близки представители семейства малых кардиоактивных пептидов (SCP), выделенные из моллюсков: Aplysia californica (Morris et al., 1982; Lloyd et al., 1987), улитки (Price et al., 1990) и мидии Mytilus edulis (Fujisawa et al., 1993). Они имеют следующую первичную структуру:

Aplysia SCPA:

H-Ala-Arg-Pro-Gly-Tyr-Leu-Ala-Phe-Pro-Arg-Met-NH2

Aplysia SCPb:

H-Met-Asn-Tyr-Leu-Ala-Phe-Pro-Arg-Met-NH2

Helix SCP:

H-Met-Asn-Tyr-Leu-Ala-Phe-Pro-Arg-Met-NH2 H-Ser-Gly-Tyr-Leu-Ala-Phe-Pro-Arg-Met-NH2

Mytilus SCP:

H-Ala-Pro-Asn-Phe-Leu-Ala-Tyr-Pro-Arg-Leu-NH2

Последний из представленных пептидов по своему эффекту на нейроны Helix подобен форсколину (активатор G-белков), что указывает на существование SCP метаботропных рецепторов (Chen et al., 1995). Минимальный С-концевой фрагмент, активирующий такие рецепторы, состоит из шести аминокислот (LAYPRLamide). С-концевая часть пептида Mytilus SCP идентична пептиду CNP2 белка HCS2 виноградной улитки.

Холецистокинины/гастрины

Холецистокинин (ХЦК) и гастрин принадлежат к семейству пептидов, которые долго характеризовали как гастроинтестинальные пептидные гормоны. Кишечные ХЦК и гастрин функционируют как гормональные регуляторы разнообразных пищеварительных процессов и пищевого поведения. Эти функции включают индукцию желудочной секреции, стимуляцию гладкомышечных сокращений и панкреатической секреции, активацию циркуляции крови и секреции воды в желудке и кишечнике.

Несмотря на то, что ХЦК и гастрин изначально были определены как гастроинтестинальные гормоны, их также выделили и секвенировали в различных частях нервной системы (Vanderhaagen et al., 1985). Холецистокинин является одним из самых распространенных мозговых пептидов. Было обнаружено участие ХЦК и гастрина во многих процессах, протекающих в головном мозге. Например, показана способность тетрапептида ХЦК-4 вызывать состояния тревоги, страха и паники (Нейрохимия, 1996), что связано со способностью ХЦК-4 активировать часть дофаминергической системы мозга (напротив, ХЦК-8 тормозит дофаминергическую передачу).

ХЦК и гастрин структурно и функционально родственны, они имеют одинаковые С-концевые пентапептидные последовательности (Gly-Trp-Met-Asp

Phe-NH2), которые обуславливают биологическую активность молекулы (Dockray, 1976). Кроме того, описанные биологически активные молекулы ХЦК несут сульфатированный остаток тирозина (сложный эфир), которому предшествует один или несколько кислых аминокислотных остатков, например, -Asp-Tyr. Холецистокинин, так же как и гастрин, представляет собой набор гетерогенных пептидов, образующихся из единого предшественника в результате посттрансляционного протеолитического расщепления и модификации аминокислот (Deschenes, 1984; Yoo, 1982). Протеолитический процессинг по внутренним сайтам расщепления приводит к продукции отдельных пептидов, содержащих идентичный С-концевой пентапептид. N-концевые различия служат для модификации физиологической активности и определяют сходные эффекты действия для разных мишеней (Dockray, 1976).

Многие биологически активные пептиды, исходно выделенные из позвоночных животных, также присутствуют и у беспозвоночных. Наличие ХЦК-гастриноподобной иммунореактивности было показано у мясной мухи Calliphora (Duve et al., 1981), плодовой мушки Drosophila (White et al., 1986) и мотылька Manduca (El-Salhy et al., 1980). Два ХЦК-подобных пептида, названных лейкосульфакинин (J1CK) и лейкосульфакинин II (JICK-II) были выделены из головы таракана (Nachman et al., 1986а; Nachman et al., 1986b).

Описаны клоны ДНК, кодирующие белки-предшественники беспозвоночных с гомологией к ХЦК-гастриновому семейству пептидов. ХЦК-подобный ген Drosophila и соответствующая кДНК были выделены, описаны и секвенированы. Гомолог Drosophila был назван дросульфакинин, или ДСК (.Drosophila-сульфатированный тирозин-кинин) (Nichols et al., 1988).

Всестороннее изучение гомологов ХЦК и других семейств нейропептидов у беспозвоночных может обеспечить основу для понимания организации и регуляции генов белков-предшественников, разнообразия и физиологической роли пептидов в нервной системе. Такая информация поможет постичь основные свойства и эволюцию семейств нейропептидов.

Педальные пептиды

Впервые нейропептид, отнесенный позже к новому семейству педальных пептидов, был обнаружен в центральной нервной системе (ЦНС) Aplysia californica

Lloyd, Connoly, 1989). Из-за того, что его синтез протекает в педальных ганглиях хотя сам пептид обнаруживается и в других частях нервной системы моллюска), он был назван педальным пептидом (Pedal peptide, Pep). Позднее нейропептиды, подобные педальному пептиду Aplysia californica, были обнаружены и описаны в нервных системах таких моллюсков как Tritonia diomedea (Beck et al., 2000; Lloyd et al., 1996; Willows et al., 1997), Clione limacina (Malyshev et al, 1999), Phestilla sibogae (Croll et al., 2001), наземных улиток Helix lucorum и Helix aspersa (Poteryaev et al., 1997). Эти пептиды были объединены в семейство педальных пептидов.

Известно несколько функций представителей данного семейства: регуляция биения ресничек эпителия ноги, что, по-видимому, связано с педальной локомоцией

Willows et al., 1997); активация сердечных сокращений (Malyshev et al, 1999); участие в пространственной ориентации (Poteryaev et al, 1997). Сейчас известны аминокислотные последовательности педальных пептидов нескольких моллюсков

Рис.2).

Aplysia Pep TPep-PLS TPep-NLS TPep-PAR Helix L-Pep Helix M-Pep HelixSFamid 1 HelixSFamid 2 HelixSFamid 3 HelixSFamid 4 HelixSFamid 5 LymnaDFamid 1 LymnaDFamid 2 LymnaDFamid 3 LymnaDFamid 4 LymnaDFamid 5

Рисунок 2. Аминокислотные последовательности педальных пептидов различных моллюсков (Трер - Tritonia pedal peptide).

PLDSVYGTHGMSGFA PYDQITGLHGLSGFA NYDQITGLHGLSGFA PYDQITGAHGLRGFA PFDSISGSHGLSGFA PFDSISGSHGMSGFA FDSISGHSSFGS F-amid FDSISGLSSFGS F-amid FDAISGLSSFGS F-amid FDSISGHSSFGS Y-amid FDSIYGLSSFGS F-amid PYDRISN-SAFSD F-amid PYDRISS-SAFSD F-amid PYDRISG-SAFSD F-amid PFDRISN-SAFSD F-amid PFDRISS-SAFSD F-amid

Педальные ганглии Aplysia californica осуществляют центральную иннервацию обширных областей ноги и стенки тела (Hening et al., 1979). Почти каждый периферический нерв, выходящий из педальных ганглиев, содержит иммунореактивные к Pep аксоны. Установлено, что Pep транспортируются из педальных ганглиев на периферию. Также показано, что Pep транспортируются через педальный нерв в стенку тела. Иммуноцитохимия поперечных срезов стенки тела тегумента и ноги выявила интенсивную Рер-иммунореактивность в равномерно распределенных фибриллах и в варикозоподобных образованиях, расположенных сразу под поверхностью кожи. Иммунореактивные фибриллы также прослеживаются во многих мелких выпячиваниях на внешней поверхности кожи и вблизи больших клеток, похожих на железистые. Самый верхний слой кожи также содержит Pep (Pearson, Lloyd, 1989). В других центральных ганглиях идентифицированы тела Рер-иммунореактивных клеток, но это небольшие нейроны, встречающиеся значительно реже; меньше всего их обнаружено в плевральных ганглиях.

Центральное и периферическое распространение Pep наводит на мысль, что они вовлечены в широкий круг функций. Одной из них может являться сердечнососудистый или гемодинамический контроль, который особенно важен для Aplysia, так как гидростатический скелет, обеспечивает поддержание формы тела моллюска и передвижение. По-видимому, основной функцией педального пептида является модуляция мышечных сокращений ноги (Hall, Lloyd, 1990). Периферические Рер-иммунореактивные варикозоподобные образования ассоциированы с просветами сосудов, а также окружают мышечные фибриллы (Pearson, Lloyd, 1989). Кроме того, иммунореактивная сеть обнаружена на некоторых телах клеток в левом верхнем квадранте нейронов L2-6, одной из функций которых является регуляция просвета ренальной поры (Koester, Koch, 1987). Сходные сети существуют на нейронах в области абдоминальных ганглиев (Mayen et al., 1974).

Из нейронных экстрактов Tritonia diomedea выделены и просеквенированы три пептида, каждый из которых состоит из 15 аминокислотных остатков и более чем на 40% идентичен Pep Aplysia. Также выделен пептид из 25 аминокислотных остатков, судя по всему, содержащий несколько копий ТРер. Возможно, это фрагмент предшественника, подвергающийся созреванию с образованием TPeps (Lloyd et al., 1996).

Нейроны педальных ганглиев Trifonía diomedea участвуют в регуляции и осуществлении локомоторных и ориентационных движений, связанных с ногой моллюска. Как и другие опистожаберные моллюски, Tritonia имеет две пары необычно больших (свыше 500 мкм в диаметре) педальных нейронов 5 и 6 (pedal neurons 5,6; Pd5,6), синтезирующих аналоги педального пептида Aplysia, названные TPeps: TPep-PLS, TPep-PAR, TPep-NLS (Lloyd et al., 1996). От этих нейронов отходят аксоны в периферические левый и правый педальные нервы в ноге животного (Willows, 1985; Willows et al., 1997). Pd5,6 и некоторые другие пары нейронов (Pd21) могут вызывать увеличение частоты биения ресничек; также Pd5,6 проявляют электрофизиологическую активность при осуществлении поведенческих реакций на токи воды и геомагнитные поля (Lohmann et al., 1991; Cain, Foerstmann, 1996).

Большинство ТРер-иммунореактивных клеток также проявляют иммунореактивность к SCPb. Существует всего две пары больших нейронов, положительных на SCPb, но отрицательных на TPeps: нейроны В11 и Gel.

TPeps могут представлять собой нейромодуляторы в ЦНС Tritonia diomedea. Иммунореактивность к TPeps обнаруживается в нейронах, вовлеченных в пищевое поведение, reo- и реотаксис; обнаружены иммунореактивные пути, ведущие в статоцисты. Возможно, TPeps регулируют биение ресничек статоциста, а, следовательно, и его сенсорную работу. Также существует вероятность того, что TPeps являются нейротрансмитгерами, передающими сенсорный сигнал из статоциста в ЦНС. Также TPeps присутствуют в нейронах, которые могут быть задействованы в оборонительном поведении (Beck et al., 2000). TPeps увеличивают частоту биения ресничек Tritonia diomedea. Серотонин, обеспечивающий биение ресничек у других видов моллюсков, действует на ресничный эпителий Tritonia аналогичным образом при сходных концентрациях. Другие пептиды моллюсков (Pep, SCPb, FMRFamide) и морская вода не изменяют биения ресничек (Willows et al., 1997). Исследования влияния серотонина на ресничные клетки других моллюсков показали, что возбуждение и увеличение частоты биения достигается за счет гиперполяризации мембраны (Eckert, 1972), поэтому можно предположить, что TPeps и серотонин через рецепторы эндогенно действуют на мембраны ресничных клеток, вызывая изменения мембранного потенциала, что приводит к увеличению частоты биения ресничек. Ответы на серотонин сходны с ответами на TPeps, но неясно, одинаковые ли механизмы лежат в их основе.

Из Helix lucorum был выделен и охарактеризован клон кДНК, кодирующей множественные копии родственных Рер-семейству пептидов. С использованием дифференциального скрининга в серотонинергических нейронах педальных ганглиев были идентифицированы несколько идентичных клонов с желаемым паттерном экспрессии, среди них - клон S21. Секвенирование клона S21-9, несущего самую большую вставку (около 1,6 kb), выявило открытую рамку считывания, кодирующую белок из 442 аминокислотных остатков (Poteryaev et al., 1997).

MEI$ftIVAI X TW 1С V С А А Я E ET NEIIAtJEDSRAEKRSNVLlEKIDDNSE 50 IHASELDKL Г S DSEXEAE DVEDVDKR PFDSISG3HGLSGFA К R P FPS I S G 100 SHGLSOFAKRPFDSISGSHGISGFAKRPFDSISGSHGI.SGPAKRPFDSIS 150 G S H G L S G F Д К R ? F D S I S G S H G N S G г А К R P Г D S I S G S H G L S G г А К R ? F D S I 200 S G S В G L S G f А К R P Г 3 S I S G S H G L S G f А К R P f 0 S I 5 G S H G L S G f А К R ? ? ) 3 250 ISGSHSLSGFA X R P Г С S I S3 SHGLSGFA К R PFDSISGSHGLSGFÄ JR PJJ 300 5ISGSHGLSGFA t R PFDSISGSHGLSGFA К R PFDSISG3HGLS С FA К R PF 350 DSISGSHGL$CE>AKR?F03l3GSflGH3SFAKRE'FDSISGSHGI.3GFAKR? 400 FPS ISGSHGHSGFAKREDALEDCRAFTITGEEEDDVLENLK " W

Рисунок 3. Аминокислотная последовательность предшественника НРер Helix lucorum', предполагаемая сигнальная последовательность показана наклонным шрифтом, Lys-Arg-сайты расщепления выделены жирным, предсказанные копии НРер подчеркнуты (Poteryaev et al., 1997).

Белок-предшественник был назван ргергоНРер; семнадцать идентичных пептидов, названных L-HPep, несут остаток лейцина в одиннадцатом положении, а в трех других пептидах (М-НРер) этот лейцин замещен на метионин. За расположенным на карбоксильном конце Lys-Arg-сайтом процессинга последнего НРер-пептида следует кислотный участок длиной в 25 аминокислотных остатков (Poteryaev et al., 1997).

Места локализации нейронов, иммунореактивных к HPeps частично совпадают с серотонинергическими нейронами педальных и церебральных ганглиев. Возможно, HPeps могут служить как котрансмитгеры в определенных серотонинергических нейронах. Появление транскриптов HPeps в эмбриогенезе совпадает с началом обширных процессов нейронной дифференциации. Весьма вероятно, что HPeps играют морфогенетическую роль у эмбрионов. Также существует вероятность того, что HPeps необходимы для модуляции биения эмбриональных ресничек (Poteryaev et ai, 1997).

У Tritonia, Aplysia и Helix карбоксильные участки педальных пептидов отличаются высокой степенью схожести; возможно, они необходимы для связывания с Рер-рецептором. Однако N-концевые области также могут быть важны для взаимодействия с рецептором, так как ресничный эпителий Tritonia сходным образом реагирует на все TPeps, но нечувствителен к Pep Aplysia.

Определенное сходство (45-53%) существует между HPeps и представителями двух других семейств нейропептидов моллюсков, LymnaDFamid, выделенных из Lymnaea (Johnsen, Rehfeld, 1993) и preHelixSFamid, выделенных из Helix (см. результаты). Возможно, семейства педальных пептидов, LymnaDFamid и preHelixSFamid структурно родственны и могут быть объединены в одно пептидное надсемейство.

Кальцийсвязывающие белки с EF-hand доменом

Одним из важнейших внутриклеточных посредников в нервной системе, как позвоночных, так и беспозвоночных является ион кальция. Его свободная концентрация в покоящейся клетке очень низка и составляет около 10"8 М. При изменении мембранного потенциала, концентрация цитоплазматического кальция в нейроне может достигать более 10"5 М, т.е. увеличивается в тысячи раз. Это служит необходимым условием начала многих биохимических процессов. В нервной системе существует большая группа белковых молекул, отличающихся от остальных белков высоким сродством к Са2+, т.е. имеющих высокую константу связывания ионов кальция. Часть этих белков регулирует концентрацию Са2+ в клетке, выполняя функции внутриклеточного депо кальция вместе с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) и митохондриями. Другая часть кальцийсвязывающих белков, способна изменять свою конформацию и активность при связывании кальция. Найдено участие некоторых кальцийсвязывающих белков в нейрональной пластичности, в таких ее проявлениях, как долговременная потенциация, научение, память (ОегЫ ег а!., 1994, МоПпап ег а!., 1996).

По особенностям структуры белковой молекулы все кальцийсвязывающие белки можно разделить на два класса. Первый класс белков — так называемые аннексии ы, содержат длинные консервативные последовательности преимущественно дикарбоновых аминокислот. К ним относится и первый открытый иейроспепнфичный белок 5100 (Мур и Мак-Грегор, 1965). Второй класс - калыдийсвязывающие белки, обладающие так называемым ЕР-Ьапс1 доменом. Название ЕР-Иапк! было придумано Кретсинджером и Ноколдсом в 1973 году при исследовании кальцийсвязывающего мотива, наблюдаемого в парвальбумине. Данный термин наглядно описывает не только изгиб полипептида, но также и возможное изменение конформации ЕР-Ьапё домена, которое может происходить при связывании кальция (Рис.4а). Этот широко распространенный мотив, найден в большом количестве белковых семейств, в том числе и у прокариот, он может связывать как ионы кальция, так и магния. ЕИ-Ианё состоит из бета-складки (включающей 12-14 аминокислотных остатков), фланкированной двумя альфа-спиралями (Рис.4). Бета-складка образует как бы гнездо для ионов кальция.

Рисунок 4. EF-hand домен (Lewit-Bentley A. and Rety S., 2000). (а) символическое представление EF-hand домена. Спираль Е свернута в указательном пальце, а спираль F занимает большой палец правой руки. Когда связывается ион кальция, спираль F движется от закрытой (апопротеин, серый) к открытой (холопротеин, темно-серый) конформации.

Ь) геометрия лигандов кальция. В позициях X и Y обычно находится аспарагиновая кислота или аспарагин. Серин, аспарагиновая кислота или аспарагин занимают позицию Z, a -Y - карбоксильная группа пептида. В -X - обычно находится молекула воды, а в -Z - глютаминовая или аспарагиновая кислота.

Большинство белков второго класса содержат два и более EF-hand домена. Четыре EF-hand домена содержит один из самых распространенных белков -кальмодулин. Он найден у большинства животных, присутствуя почти во всех клетках. Кальмодулин является активатором многих протеинкиназ и некоторых других ферментов. Мембранная кальцийзависимая протеиназа - калпаин, содержит пять EF-hand доменов в С-концевой части большой субъединицы. Известны белки и с единственным EF-hand доменом (S100A7, SPARC, HCS2).

У многих кальцийсвязывающих белков, связывание кальция индуцирует конформационные изменения, приводящие к активации или инактивации других белков. У кальмодулина и тропонина С, это описано, как изменение от закрытого конформационного состояния в отсутствие кальция, к открытому конформационному состоянию в его присутствии. Теперь известно, что такой конформационный переход — не единственный ответ на связывание кальция для EF-hand белков. Более сложные конформационные изменения наблюдаются в EF-hand белках, которые взаимодействуют с ковалентно прикрепленной ациловой группой (например, рековерин) и в белках, состоящих из нескольких субъединиц (например, S100B, калпаин). Вообще, EF-hand белки обладают множеством уникальных конформационных состояний, вместе образующих конформационный континуум (Yap et al., 1999).

Различные кальцийсвязывающие белки характерны для клеток нервной системы аплизии. Они гомологичны многим известным кальцийсвязывающим белкам - кальмодулину, кальбайндину, нейрокальцину и др. (Hermann et al., 1991; Dyer et al., 1996). Методом оверлэй-блоттинга в эндоплазматическом ретикулуме обнаружена целая группа белков, обладающих высоким сродством к ионам кальция. Молекулярный вес этих белков находится в пределах 13-20 кД. Вполне вероятно, что один из детектируемых этим методом белков - гомологичный HCS2 белок, с молекулярной массой 17 кД.

Белки-предшественники в командных нейронах виноградной улитки

В нашей лаборатории методом гибридизационного вычитания, был выполнен поиск генов, дифференциально экспрессирующихся в командных нейронах париетальных ганглиев (Bogdanov et al., 1994). Несколько клонов были изолированы, среди них HCS1 и HCS2. Чтобы проверить экспрессионный паттерн этих генов, была поставлена Саузерн гибридизация фрагментов их кДНК с PCR-амплифицированными пробами кДНК, выделенных из разных отдельных нейронов и нейрональных групп улитки. Экспрессия гена HCS2 была обнаружена в LPA3/RPA3 и LPA2/RPA2 нейронах, a HCS1 экспрессировался только в LPA3/RPA3 нейронах.

Вставка кДНК HCS2 изолированного клона длиной 897-пар оснований была полностью секвенирована и найдена открытая рамка считывания длиной в 172 аминокислоты. Последовательность этого белка представлена на рисунке 5.

Met Gin His Gin Ile Arg Ala Leu Leu Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ser Ala Cys Ala Met Phe Tyr Pro Arg Pro Lis Asp Туг Pro Arg Leu Gly Lis Arg Ser Phe Phe Thr Thr Val Asn Gly Asn His Туг Pro Arg Ile Gly Arg Arg Asp Ala Thr Gly Ser Ser Leu Val Leu Pro Glu Ala Asp Туг Thr Asp Leu Gly Asp Leu Thr Lis Arg Gly Val Phe Thr Gin Gly Ala His Gly Ser Туг Pro Arg Val Gly Arg Gly Gly Ala Val Leu Ser Arg Asp Туг Leu Asn Glu Arg Ser Lis Asn Leu Glu Lis Met Ser Gly Asp Lis Asp Asp Asp Leu Glu Val Asp Asn Gly Asp Gly Ser Arg Arg Leu Gin Ala Gly His Ser Gly Ile Pro Leu Glu Ile Leu Phe Ile Ala Туг Asp Ser Asp Asn Asp Gly Lis Leu Ser Lis Glu Glu Phe Val Thr Gly Leu Ala Gin Tyr Gin Met Gin Cys Pro Leu Tyr

Рис.5. Первичная структура белка кодируемого геном HCS2 (Helix Command Specific 2). Курсивом выделены пептиды CNP1-CNP4 и кальцийсвязывающий EF-hand домен, жирным шрифтом - места протеолиза, подчеркнут гидрофобный лидер в N-концевой части белковой молекулы.

Присутствие в рамке нескольких стоп-кодонов вверх по цепи от инициаторного метионина указывало на то, что вся открытая рамка считывания

ORF) была представлена в клоне. Предсказанная последовательность белка предполагает, что он мог бы быть предшественником нейропептидов. Об этом свидетельствует несколько аргументов, полученных из анализа его первичной структуры:

1) присутствие в N-концевой части препротеина гидрофобного лидера — структуры характерной для большинства предшественников секретируемых белков и пептидов;

2) препротеин HCS2 содержит три предполагаемых амидированных и один неамидированный пептид, несущие на С-конце консервативный мотив Туг-Pro-Arg-X (YPRX, где X - амидированная или неамидированная форма Leu, lie, Val или Pro). Вероятно, что ген HCS2 кодирует нейропептиды, принадлежащие к новому подсемейству нейропептидов. Как было сказано выше, существует два семейства нейропептидов, имеющих некоторое подобие YPRX последовательности - семейство миоактивных пептидов насекомых (пирокинины) и малые кардиоактивные пептиды моллюсков (SCP). Возможно, что кодируемые HCS2 пептиды могут иметь косвенное миоактивное действие, регулируя активность мотонейронов, так как было показано, что командные нейроны LPA2/RPA2 и LPA3/RPA3 иннервируют мускулатуру пневмостома. Некоторое подобие последовательностей и механизмов действия между HCS2, и семействами пирокининов и SCP делают вероятным их принадлежность к одному большому суперсемейству нейропептидов;

3) препротеин HCS2 содержит две дополнительные пептидные последовательности (области 52-72 и 90-126) со значительным числом кислых аминокислотных остатков. Такие последовательности часто наблюдаются в спейсерных областях, отделяющих функциональные пептиды в нейропептид-содержащих белках как у предшественников FMRFamide и миомодулина. (Nachman et al., 1991; Nachman et al., 1993; Kellett et al., 1996).

4) в последовательности HCS2 имеется три места (-Arg- и -Arg-Arg-) распознавания для прогормональной конвертазы, фермента, который, расщепляя, белки-предшественники гормонов и пептидов, приводит к образованию зрелых форм этих сигнальных молекул (Barr, 1991). Кроме того, также имеется несколько мест распознавания для других трипсиноподобных протеаз (-Lys- и -Arg-) (Eipper et al1992);

5) три из четырех CNP пептидов содержат на С-конце остаток аминокислоты глицина, по которому может происходить амидирование после образования отдельных пептидов (Nakayama et al., 1992). Показано, что С-концевая часть нейропептидов ответственна за активацию рецептора, а её амидирование увеличивает физиологическую активность нейропептидов (Nakayama et al., 1992).

С-концевая область белка HCS2, от 129 до 172 аминокислотного остатка в нативных условиях способна образовывать третичную структуру, именуемую EF-hand. На N-концевой части EF-hand домена присутствует сайт протеолиза - ArgArg-, что предполагает возможное отщепление кальцийсвязывающего пептида при пострансляционном протеолизе. Как было сказано выше, кальцийсвязывающие белки играют важную роль в нейрональной пластичности (Gerlai et al., 1994; Molinari et al., 1996).

Ген HCS2 представляет собой первый пример сосуществования нейропептидов и кальцийсвязывающей структуры внутри одного белка предшественника. Хотя EF-hand белки обычно содержат два или более EF-hand мотива, известны белки с одиночным EF-hand доменом, например S100A7 или

SPARC. Область препротеина HCS2 между остатками Leu 129 и Туг 172 обладает

2 + всеми признаками EF-hand Ca связывающего домена. Следовательно, вероятно, что возможная физиологическая функция Leu 129 - Туг 172 пептида связана со связыванием кальция. Кроме того, должно быть отмечено, что область, размещенная между мотивом EF-hand и нейропептидами богата кислыми остатками и может, следовательно, представлять дополнительный низкоаффинный кальцийсвязывающий участок. Такое свойство найдено, например, в кальретикулине, кальцийсвязывающем белке эндоплазматического ретикулума. С-концевая область этого белка богата кислыми остатками и может связывать ионы кальция с низкой аффинностью, хотя и не содержит EF-hand мотив. Точно так же белок SPARC содержит, в дополнение к EF-hand мотиву, очень кислую область, способную связывать ионы кальция с низкой аффинностью.

Не известно, высвобождается ли EF-hand-содержащий пептид совместно с нейропептидами HCS2. Если это имеет место, то результатом высокочастотной импульсации гигантского интернейрона (до 20 Гц) при оборонительном поведении будет увеличение высвобождения пептида с возможным эффектом связывания ионов кальция в синаптической щели. Это в свою очередь вело бы к ингибированию синаптической передачи, которая опосредована входом ионов кальция в пресинаптическую терминаль. EF-hand домен, мог бы функционировать в нерасщепленном пропептиде, маскируя или демаскируя сайты процессинга эндопептидаз. Это регулировало бы абсолютную эффективность процессинга и (или) относительную интенсивность высвобождения зрелых пептидов.

Морфологически и функционально сходные нейроны LPa/PPa 2 и LPa/PPa 3 отличаются по экспрессии другого гена, впервые изученного в нашей лаборатории. Он получил название HCS1 (Богданов и др., 1994; Bogdanov et al., 1994). Полноразмерный клон данного гена имел длину 1412 пар нуклеотидов, в полученной нуклеотидной последовательности обнаружена открытая рамка считывания длиной в 100 аминокислотных остатков (Рис.6).

Met Lys Ile Thr Asp Val Leu Leu Leu Ala Thr Leu Ala Val Leu Val Leu Val Leu Ala Туг Thr Gin Gly Glu His Ala Ser Asp Ser Asp Arg Туг Asp Asp Asn Ser Glu Arg Val Val Ala Lys Trp Val Leu Glu His Ile Asn Asn Leu Asn Arg Glu Arg Arg Asn Arg Phe Asp Ala Gly Phe Met Ala Arg His Ser Ala Ser Gly Thr Ser Tip Ile Pro Met Thr Gin Ala Gly Lys Leu Gin lie Leu Met Asp Gin Ala Ala Gly Ser Asn Thr Phe Asn Asp Asn

Рисунок 6. Первичная структура белка кодируемого геном HCS1 (Helix Command Specific 1). Жирным шрифтом выделено место протеолиза, черным подчеркнут гидрофобный лидер в N-концевой части белковой молекулы.

Первые двадцать аминокислотных остатков образуют гидрофобный лидер, что свидетельствует о секреции данного белка командными нейронами. Предполагаемый участок расщепления пептидазой находится между двумя аргининами в положении 56 и 57. Предположительно образуемые пептиды являются нейрогормонами и/или факторами роста. Белков гомологичных HCS1 у других организмов пока не обнаружено.

Интерференция РНК. Морфолино олигонуклеотиды.

Большое внимание в современной биологии уделяется поиску новых методов селективной блокады генной экспрессии у взрослых животных, так как стало очевидно, что использование существующих методов нокаута отдельных генов для исследования функций кодируемых ими белков, имеет один существенный недостаток. Часто в процессе эмбриогенеза происходит перестройка биохимических путей в клетке, и функции исследуемого белка частично берут на себя другие белки клетки. Особенно это актуально для нервной системы, учитывая ее высокую пластичность. Поэтому при изучении функции генов в нервной системе большое значение приобретают способы ингибирования экспрессии отдельных генов у взрослых животных. При этом клетки нервной системы не успевают компенсировать отсутствие изучаемых белков, что позволяет более полно исследовать их роль.

На сегодняшний день на разных организмах испытано множество методов селективной блокады генной экспрессии. Не каждый из этих методов работает на отдельно взятом организме, это критически зависит от специфических и вероятно сложных клеточных механизмов. Наиболее эффективны следующие методы: использование антисмысловой мРНК, двухцепочечной мРНК и фосфорилированных олигонуклеотидов морфолино. Из-за возможности получить необычайно эффективный набор инструментов для избирательного вмешательства в работу генов, эти методы вызвали новые исследования механизмов РНК-выключаемого генетического контроля и его биологической роли.

Чем шире распространялись методы пересадки генов, тем у большего числа организмов обнаруживались мощные и неожиданные реакции на чужеродные нуклеиновые кислоты. Способность некоторых трансгенных организмов к подавлению экспрессии гомологичных хромосомных локусов впервые наблюдалась у растений (Vaucheret Н. et al., 1998), а в последствии - у нематод (Fire А. et al., 1991), грибов (Romano N., Macino G., 1992), насекомых (Pal-Bhadra M. et al., 1997) и простейших (Ruiz F. et al., 1998). Такие эффекты были разделены на две группы, по природе их действия на ген-мишень. В первой группе транскрипция гена не затронута, но резко сокращается время жизни транскрибируемой РНК (de Carvalho F. et al., 1992). Такие процессы получили название ПТМГ (постранскрипционное молчание гена). Процессы, относящиеся ко второй группе, действуют на хроматиновую матрицу (Matzke М.А. et al., 1989); они были названы ТМГ (транскрипционное молчание гена). Поразительной особенностью ПТМГ и некоторых ТМГ случаев оказалось наличие РНК-триггерных молекул, ответственных за влияние трансгенного локуса на эндогенный ген.

Понимание биологической роли РНК-зависимых процессов селективной блокады экспрессии впервые пришло при изучении их у растений (Vaucheret Н. et al., 1998). Серии наблюдений, над которыми позволили предположить, что ПТМГ является противовирусным механизмом. Вириальные РНК могут быть мишенями для ПТМГ. Межклеточное распространение эффектов ПТМГ дает растению возможность быстрого ответа на атаку вируса. Сходное распространение эффекта ПТМГ также наблюдалось у Caenorhabditis elegans после внеклеточного введения двухцепочечной ДНК (Fire A. et al., 1998). Кроме участия ПТМГ в антивирусном ответе, также предполагается его роль в контроле над другими генными паразитами, а также в процессах регуляции активности отдельных генов.

Механизм интерференции РНК пока не известен. Существует две основные модели постранскрипционного ингибирования гена (Fire А., 1999). Первая модель предполагает амплификацию двухцепочечной РНК (триггерная РНК) путем синтеза копий РНК с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы. Вторая модель предполагает активность фермента, который может запускать деградацию отдельных молекул РНК. При этом не происходит прямой амплификации РНК, а исходная молекула РНК непосредственно участвует в узнавании молекул-мишеней.

Двухцепочечная РНК может вызывать специфическое ингибирование отдельных последовательностей генов у многих организмов, включая нематод, растения, трипаносом, плодовых мушек и планарий. Было показано, что dsRNA способна индуцировать метилирование ДНК в некоторых растительных системах. Есть один опубликованный пример успешного использования интерференции РНК (RNAi) в моллюсках (Lee et al2001).

Кроме РНК интерференции существуют другие методы блокирования трансляции исследуемых генов. Из них наиболее эффективен метод блокирования экспрессии с помощью антисмысловых морфолино олигонуклеотидов. Эта технология блокирования гена, которая, в отличие от других методов использования антисмысловых олигомеров, основана на блокировании трансляции комплементарной РНК, предотвращая ее связывание с рибосомами (Summerton, 1999). За короткое время, морфолино олигомеры утвердились как эффективный и надежный инструмент для изучения функций гена, а также взаимодействия между генами. В настоящее время они широко используются в биологии развития (Heasman, 2002). Например, инъекция антисмысловых морфолино олигомеров приводит к исчезновению белка GDNF в эмбрионах Zebraßsh (Shepherd et al., 2001).

Фосфодиамидированные морфолино олигомеры (РМО) — растворимые в воде, незаряженные антисмысловые молекулы, которые связывая комплементарные последовательности РНК, ингибируют генную экспрессию, предотвращая трансляцию или, вмешиваясь в сплайсинг пре-мРНК. РМО высоко стойкие к энзиматическому расщеплению (Hudziak et al., 1996) и имеют низкую токсичность (Arora et al., 2002). РМО демонстрирует высокую антисмысловую специфичность и эффективность в клетках in vivo (Stein et al., 1997) и в культуральных клетках (Taylor et al., 1996, 1997; Summerton et al., 1997; Hudziak et al., 2000; Stein et al., 2001). РМО использовались для изучения функции отдельных генов в Zebraßsh, лягушке, эмбрионах морского пострела (Nasevicius и Ekker, 2000; Heasman et al., 2000; Howard et al., 2001).

Методы переноса РМО в клетки, являются главным образом механическими. Эти методы имеют определенные ограничения. Невозможно инъецировать РМО во все клетки, количество инъецированной РМО не постоянно, животные могут пострадать, при инъекции. Низкая мембранная проницаемость РМО препятствует их использованию на взрослых животных.

Дальнейший прогресс в разработке методов селективной блокады генной экспрессии, по-видимому, будет связан с повышением мембранной проницаемости морфолино. Уже известны короткие катионные пептиды, которые способны доставить макромолекулы в цитозоль и ядро (Fawell et al., 1994; Derossi et al., 1994; Vives et al., 1997; Pooga et al., 1998). HIV Tat пептид - один из таких пептидов, который успешно использовался при доставке биологически активных пептидов и белков в культуральные клетки и in vivo (Fawell et al., 1994; Schwarze et al., 1999; Chellaiah et al., 2000; Chen et al., 2001). Tat пептид использовался для увеличения мембранной проницаемости антисмысловых олигонуклеотидов, типа фосфоротиоат и 2'-0-метилфосфоротиат олигонуклеотидов (ODN) (Astriab-Fisher et al., 2000, 2002) и пептидных нуклеиновых кислот (PNA) (Koppelhus et al., 2002) в культуральные клетки. Показана способность HIV Tat пептидов и других катионных пептидов, к переносу РМО в культуральные клетки (Moulton et al., 2003).

Материалы и методы

Заключение диссертации по теме «Физиология», Богуславский, Дмитрий Викторович

Выводы

1) Исследована экспрессия предполагаемого белка-предшественника пептидов пищевого поведения preHelSFamida в норме; обнаружены физиологические условия регуляции его экспрессии. Показано достоверное увеличение количества нейронов, транскрибирующих preHelSFamid при пищевой депривации взрослой улитки, а также у ювенильной улитки до начала активного питания.

2) Ультрамикроскопическое исследование структуры командных нейронов париетального ганглия показало сильное развитие гранулярного эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи в цитоплазме этих клеток, что свойственно нейросекреторным клеткам с высоким уровнем синтеза нейропептидов и нейрогормонов. При воздействиях, увеличивающих концентрацию цитоплазматического кальция, наблюдается транспорт из сомы нейрона в аксонную терминаль накопленных ранее электронноплотных везикул.

3) Показана высокая кальцийсвязывающая активность С-концевого фрагмента белка HCS2. Обнаружено влияние изменения концентрации кальция на процессинг HCS2. Найдены иммунопозитивные к антителам против CNP пептидов белки у отдельных представителей кольчатых червей, насекомых и моллюсков.

4) Разработан метод специфической блокады экспрессии одного гена HCS2 в отдельных гигантских командных нейронах путем инъекции морфолино олигонуклеотидов.

5) Картирование экспрессии гена HCS1 показало, что физиологические воздействия, вызывающие оборонительное поведение увеличивают его экспрессию в командных нейронах париетального ганглия и в отдельных нейронах церебрального, плеврального и педального ганглия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Богуславский, Дмитрий Викторович, 2004 год

1. Балабан П.М., Захаров И.С., Мац В.Н. Прижизненно избирательное окрашивание серотонинергических нервных клеток 5,7-диокситриптамином. Доклады Академии наук (1985), том 283, №3, с. 735-738.

2. Балабан П.М., Захаров И.С. Обучение и подкрепление: общая основа двух феноменов. Москва. Наука. 1992.

3. Боровягин В.Л., Сахаров Д.А. Ультраструктура гигантских нейронов тритонии. Атлас. (1968); Москва. Наука.

4. Захаров И.С. Оборонительное поведение виноградной улитки. Журнал высшей нервной деятельности (1992), том 42, выпуск 6, с. 1156-1169.

5. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С., Палихова Т.А., Балабан П.М. Нервная система и картирование нейронов оборонительного поведения брюхоногого моллюска Helix lucorum L. Журнал высшей нервной деятельности, (1992), том 42, выпуск 6, с. 1075-1089.

6. Коршунова Т.А., А.Ю. Малышев, И.С. Захаров, В.Н. Иерусалимский, П. М. Балабан. Функции пептида CNP4 кодируемого геном HCS2 в нервной системе Helix lucorum. Журнал Высшей нервной деятельности. 2005 (в печати).

7. Краснов М.С., Григорян E.H., Ямскова В.П., Богуславский Д.В., Ямсков И.А. Регуляторные белки глаза позвоночных. Радиационная биология и радиоэкология (2003); 43(3):265-268.

8. Кэндел Э. Клеточные основы поведения. М: Мир, 1980.

9. Максимова O.A., Балабан П.М. Взаимоотношения между командными нейронами пищевого и оборонительного поведения виноградной улитки. Журнал Высшей нервной деятельности (1979). Том XXIX. Выпуск 5. 978-983.

10. Мещеряков В.Н. Прудовик (Lymnaea stagnalisy/Объекты биологии развития- М, 1975,53-94.

11. Нейрохимия (под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В.). М. 1996.

12. Сахаров Д.А. Генеалогия нейронов. М.: Наука. 1974.

13. Alexanian AR, Bamburg JR, Hidaka H, Mornet D. (2001) Calcium-dependent regulation of interactions of caldesmon with calcium-binding proteins found in growth cones of chick forebrain neurons. Cell Mol Neurobiol. Oct; 21(5):437-51.

14. Andrews, P. C.; Brayton, K.; Dixon, J. E. (1987) Precursors to regulatory peptides: Their proteolytic processing. Experientia; 43:784-790.

15. Anokhin K.V., Sudakov K.V. (2003) Genome of brain in organization of systemic mechanism behavior. Bull Exp Biol Med. Feb; 135 (2), 107-113.

16. Arora V, Cate ML, Ghosh C, Iversen PL. (2002) Phosphorodiamidate morpholino antisense oligomers inhibit expression of human cytochrome P450 3A4 and alter selected drug metabolism. DrugMetab Dispos. Jul; 30 (7):757-62.

17. Astriab-Fisher A, Sergueev DS, Fisher M, Shaw BR, Juliano RL. (2000) Antisense inhibition of P-glycoprotein expression using peptide-oligonucleotide conjugates. Biochem Pharmacol. Jul 1; 60 (l):83-90.

18. Balaban PM. (1983) Postsynaptic mechanism of withdrawal reflex sensitization in the snail. J Neurobiol. Sep; 14(5):365-75.

19. Balaban PM, Vehovszky A, Maximova OA, Zakharov IS. (1987) Effect of 5,7-dihydroxytryptamine on the food-aversive conditioning in the snail Helix lucorum L. Brain Res. Feb 24;404(1-2):201-10.

20. Balaban P.M. (1991) Command neurones, command function and decision making. In Simple Nervous System (eds Sakharov D.A. and Winlow W., Manchester University Press, Manchester, UK); 360-374.

21. Balaban P.M. (1993) Behavioral neurobiology of learning in terrestrial snails. Prog Neurobiol. Jul; 41(1): 1-19.

22. Balaban PM, Poteryaev DA, Zakharov IS, Uvarov P, Malyshev A, Belyavsky AV. (2001) Up- and down-regulation of Helix command-specific 2 (HCS2) gene expression in the nervous system of terrestrial snail Helix lucorum. Neuroscience', 103(2):551-9.

23. Balaban P.M. (2002) Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci Biobehav Rev. Aug; 26(5):597-630. Review.

24. Barr P.J. (1991) Mammalian subtilisins: The long-sought dibasic processing endopeptidases. Cell 66,1-3.

25. Beck J.C., Cooper M.S., Willows A. (2000) Immunocytochemical Localization of Pedal Peptide in the Central Nervous System of the Gastropod Mollusc Tritonia diomedea. The Journal of Comparative Neurology 425: 1-9.

26. Blobel G. (1980) Intracellular protein topogenesis. PNAS USA, 77,. 1496-1500.

27. Bogdanov YD, Ovchinnikov DA, Balaban PM, Belyavsky AV. (1994) Novel gene HCS1 is specifically expressed in the giant interneurones of the terrestrial snail. Neuroreport. Jan 31; 5(5): 589-92.

28. Bogdanov YuD, Balaban PM, Zakharov IS, Poteryaev DA, Belyavsky AV. (1996) Identification of two novel genes specifically expressed in the D-group neurons of the terrestrial snail CNS. Invert Neurosci. Jun; 2(1): 61-9.

29. Bogdanov YD, Balaban PM, Poteryaev DA, Zakharov IS, Belyavsky AV. (1998) Putative neuropeptides and an EF-hand motif region are encoded by a novel gene expressed in the four giant interneurons of the terrestrial snail. Neuroscience. Jul; 85(2): 637-47.

30. Cain S., Foerstmann: K. (1996) The Actions of TPep Containing Neurons in Modulation of Pedal Locomotion in Tritonia diomedea. Molecular Neurobiology Course Reports. Friday Harbor Laboratories: University of Washington.

31. Calegari F, Coco S, Taverna E, Bassetti M, Verderio C, Corradi N, Matteoli M, Rosa P. (1999) A regulated secretory pathway in cultured hippocampal astrocytes. J Biol Chem. Aug 6; 274(32):22539-47.

32. Chellaiah MA, Soga N, Swanson S, McAllister S, Alvarez U, Wang D, Dowdy SF, Hruska KA. (2000) Rho-A is critical for osteoclast podosome organization, motility, and bone resorption. J Biol Chem. Apr 21; 275(16):11993-2002.

33. Chen M.L., Muneoka Y., Walker RJ. (1995) Actions of a Small Cardioactive Peptide from Mytilus, APNFLAYPRLamide, on Central Neurones of Helix aspersa. Gen. Pharmac. Vol. 26, No. 2, pp. 273-283.

34. Critz S.D., Baxter D.A., Byrne J.H. (1991) Modulatory effects of serotonin, FMRFamide, and myomodulin on the duration of action potentials, excitability, and membrane currents in tail sensory neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 66: 1912- 1926.

35. Croll, R. P., Boudko, D. Y., and Hadfield, M. G. (2001) Histochemical Survey of Transmitters in the Central Ganglia of the Gastropod Mollusc Phestilla sibogae. Cell Tissue Res 305: 417-432.

36. Crusio W. (1996) Gene-targeting studies: new methods, old problems. Trends Neuroscience, 19, 186-188.

37. Derossi D, Calvet S, Trembleau A, Brunissen A, Chassaing G, Prochiantz A. (1994) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J Biol Chem. Jul 26; 271(30): 18188-93.

38. Deschenes R.J., Lorenz L.J., Haun R.S., Roos B.A., Collier K.C., Dixon J.E. (1984) Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat preprocholecystokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 726-730.

39. Dockray G.J. (1976) Immunochemical evidence of cholecystokinin-like peptides in brain. Nature 264, 568-570.

40. Dockray G., Gregory F. (1980) Relations between neuropeptides and gut hormones. Proc. R. Soc. Lond. B 210: 151-164.

41. Doherty P., Williams G., Williams EJ. (2000) CAMs and axonal growth: a critical evaluation of the role of calcium and the MAPK cascade. Mol Cell Neurosci. Oct; 16(4): 283-95.

42. Dores R.M.; Rubin D.A.; Quinn T.W. (1996) Is it possible to construct phylogenetic trees using polypeptide hormone sequences? Gen. Comp. Endocrinol. 103: 1-12.

43. Duve H., Thorpe A. (1981) Gastrin/cholecystokinin (CCK)-like immunoreactive neurones in the brain of the blowfly, Calliphora erythrocephala (Diptera). Gen Comp Endocrinol. Mar; 43 (3):381-91. Gen. Comp. Endocrinol. 43, 381-391.

44. Dyer JR, Sossin WS, Klein M. (1996) Cloning and characterization of aplycalcin and Aplysia neurocalcin, two new members of the calmodulin superfamily of small calcium-binding proteins. JNeurochem. Sep; 67 (3): 932-42.

45. Eckert R. (1972) Bioelectric control of ciliary activity. Science 176, 473-481.

46. Eipper B.A., Staffers D.A. and Mains R.E. (1992) The biosynthesis of neuropeptides: peptide a-amidation. Ann. Rev. Neurosci. 15, 57-85.

47. Elekes K., Nassel D.R. (1990) Distribution of FMRFamide-like immunoreactive neurons in the central nervous system of the snail Helix pomatia II Cell Tissue Res. V. 262. P. 177-190.

48. Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LL, Pepinsky B, Barsoum J. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci USA. Jan 18; 91(2):664-8.

49. Fire A, Albertson D, Harrison SW, Moerman DG. (1991) Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle. Development 113, 503-514.

50. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

51. Fire A. (1999) RNA triggered gene silencing. Trends Genetic, September, V15,9,358-363.

52. Y. Fujisawa, T. Kubota, T. Ikeda, H. Minakata, Y. Muneoka. (1991) Avariety of Mytilus inhibitory peptides in the ABRM of Mytilus edulis: isolation and characterization. Comp. Biochem. Physiol. C 100: 1525-1531.

53. Furuya S, Hiroe T, Ogiso N, Ozaki T, Hori S. (2000) Localization of endothelin-A and -B receptors during the postnatal development of rat cerebellum. Cell Tissue Res. Sep; 305(3): 307-24.

54. Garoff H. (1985) Using recombinant DNA techniques to study protein targeting in the eukaryotic cell. Annu. Rev. Cell Biol., 1,403-445.

55. Gerlai R., Marks A., Roder J. (1994) T-maze spontaneous alternation rate is decreased in SI00 beta transgenic mice. Behav.Neurosci. 108,100-106.

56. Gerlai R. (1996) Gene-targeting studies of mammalian behavior — is it the mutation or the background genotype, Trends Neurosci., 19. 177-181.

57. Guidebook to the calcium-binding proteins (eds. Celio M. R., Pauls T. L. and Schwaller B.), 1996, pp. 169-172, Oxford University Press, Oxford.

58. Halban PA, Irminger JC. (1994) Sorting and processing of secretory proteins. Biochem J. Apr 1; 299 (Pt 1): 1-18.

59. Hall JD, Lloyd PE. (1990) Involvement of pedal peptide in locomotion in Aplysiar modulation of foot muscle contractions. J. Neurobiol.; 21: 858-868.

60. Heasman J, Kofron M, Wylie C. (2000) Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. Jun 1; 222(1): 124-34.

61. Heasman J. (2002) Morpholino oligos: making sense of antisense? Dev Biol Mar 15; 243(2): 209-14.

62. Hening W.A., Walters E.T., Carew T.J., Kandel E.R. (1979) Motoneuronal Control of Locomotion in Aplysia. Brain Res 179: 231-253.

63. Hermann A, Pauls TL, Heizmann CW. (1991) Calcium-binding proteins in Aplysia neurons. Cell Mol Neurobiol. Aug; 11 (4): 371 -86.

64. Holman G.M., Cook B.J., Nachman R.J. (1986) Primary structure and synthesis of a blocked myotropic neuropeptide isolated from the cockroach, Leucophaea maderae. Comparative Biochemistry and Physiology; 85C, 219-224.

65. Holmgren S., Jensen J. (2001) Evolution of vertebrate neuropeptides. Brain Research Bulletin, Vol. 55, No. 6, pp. 723—735.

66. Holt R et al. (2002) The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science 298, 129-149.

67. Howard EW, Newman LA, Oleksyn DW, Angerer RC, Angerer LM. (2001) SpKrl: a direct target of beta-catenin regulation required for endoderm differentiation in sea urchin embryos. Development. Feb; 128(3):365-75.

68. Hudziak RM, Barofsky E, Barofsky DF, Weller DL, Huang SB, Weller DD. (1996) Resistance of morpholino phosphorodiamidate oligomers to enzymatic degradation. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Winter; 6(4): 267-72.

69. Hudziak RM, Summerton J, Weller DD, Iversen PL. (2000) Antiproliferative effects of steric blocking phosphorodiamidate morpholino antisense agents directed against c-myc. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Jun; 10(3): 163-76.

70. Kaczmarek L., Chaudhuri A. (1997) Sensory regulation of immediate-early gene expression in mammalian visual cortex: implications for functional mapping and neural plasticity. Brain Research Reviews, 23, 237-256.

71. Kellett E., Perry S.J., Santama N., Worster B., Benjamin P.R., Burke J.F. (1996) Myomodulin gene of Lymnaea: structure, expression, and analysis of neuropeptides. J.Neurosci. 15,4949-4957.

72. Kimura T., Suzuki H., Kono E., Sekiguchi T. (1998) Mapping of interneurons that contribute to food aversive conditioning in the slug brain. Learn. Mem A: 376-388.

73. Kimura T., Toda S., Sekiguchi T., Kawahara S., Kirino Y. (1998) Optical recording analysis of olfactory response of the procerebral lobe in the slug brain. Learn. Mem. 4: 389-400.

74. Kimura T., Toda S., Sekiguchi T., Kirino Y. (1998) Behavioral modulation induced by food odor aversive conditioning and its influence on the olfactory responses of an oscillatory brain network in the slug Limax marginatus. Learn. Mem. 4: 365-375.

75. Kingan T.G., Blackburn M.B., Raina A.K. (1992) The distributionof pheromone-biosynthesis-activating neuropeptide (PBAN) immunoreactivityin the central nervous system of the corn earworm moth, Helicoverpa zea. Cell Tissue Res. 270, 229-240.

76. T. Kiss, T. Elekes, Y. Fujisawa, Y. Muneoka. (1999) Ionic mechanism mediating Mytilus inhibitory peptides elicited membrane currents in identified Helix neurons. Brain Res. 830,258- 267.

77. Kitamura A, Nagasawa H, Kataoka H, Inoue T, Matsumoto S, Ando T, Suzuki A. (1989) Amino acid sequence of pheromone-biosynthesis-activating neuropeptide (PBAN) of the silkworm, Bombyx mori. Biochem Biophys Res Commun. Aug 30; 163(1): 520-6.

78. Koester, J. and Koch, U. T. (1987) Neural Control of the Circulatory System of Aplysia. Experimentia 42: 972-980.

79. Koppelhus U, Awasthi SK, Zachar V, Hoist HU, Ebbesen P, Nielsen PE. (2002) Cell-dependent differential cellular uptake of PNA, peptides, and PNA-peptide conjugates. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Apr; 12(2):51-63.

80. Kuniyoshi, H., Nagasawa, R.A., Suzuki, A., Nachman, R.J., Holman, G.M. (1992) Cross-activity between pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) and myotropic pyrokinin insect peptides? Bioscience, Biotechnology and Biochemistry; 56, 167-168.

81. Larsson LI. (1977) Ultra structural localization of a new neuronal peptide (VIP). Histochemistry. Oct 22; 54(2): 173-6.

82. Lathe R. (1996) Mice, gene targeting and behavior-than just genetic. Trends Neurosci. 19,186-187.

83. Lessmann V, Gottmann K, Malcangio M. (2003) Neurotrophin secretion: current facts and future prospects. Prog Neurobiol. Apr; 69(5):341-74.

84. Lewit-Bentley A., Rety S. (2000) EF-hand calcium-binding proteins. Current Opinion in Structural Biology, 10: 637-643

85. Lloyd P.E., Kupfermann I., Weiss K.R. (1987) Sequence of small cardioactive peptide A: a second member of a class of neuropeptides in Aplysia. Peptides. Jan-Feb; 8(1): 179-84.

86. Lloyd PE, Connolly CM. (1989) Sequence of pedal peptide: a novel neuropeptide from the central nervous system of Aplysia. J Neurosci; 9: 312-317.

87. Lloyd P.E., Phares G.A., Phillips N.E., Willows A.O.D. (1996). Purification and Sequencing of Neuropeptides from Identified Neurons in the Marine Mollusc, Tritonia. Peptides, Vol. 17, No. 1, pp. 17-23.

88. Lohmann, K., Willows, A., Pinter, R. (1991). Identifiable Molluscan Neurons Responds to Changes in Earth-Strength Magnetic Fields. J Exp Biol 161, 1-24.

89. Ma PW, Knipple DC, Roelofs WL. (1994) Structural organization of the Helicoverpa zea gene encoding the precursor protein for pheromone biosynthesis-activating neuropeptide and other neuropeptides. Proc Natl Acad Sci U SA. Jul 5; 91(14): 6506-10.

90. Ma PW, Davis TR, Wood HA, Knipple DC, Roelofs WL. (1998) Baculovirus expression of an insect gene that encodes multiple neuropeptides. Insect BiochemMol Biol. Apr; 28(4): 239-49.

91. Malyshev AY, Norekian TP, Willows AO. (1999) Differential effects of serotonergic cardioexcitatory neurons on the heart activity in the pteropod mollusc, Clione limacine. J Comp Physiol A. Dec; 185(6): 551-60.

92. Martone ME, Edelmann VM, Ellisman MH, Nef P. (1999) Cellular and subcellular distribution of the calcium-binding protein NCS-1 in the central nervous system of the rat. Cell Tissue Res. Mar; 295(3):395-407.

93. Mattson MP, LaFerla FM, Chan SL, Leissring MA, Shepel PN, Geiger JD. (2000) Calcium signaling in the ER: its role in neuronal plasticity and neurodegenerative disorders. Trends Neurosci. May; 23(5): 222-9.

94. Matzke M.A. et al. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants. EMBO J. 8,643-649.

95. Mayeri, R., Koester, J., Kupfermann, I., Liebeswar, G., and Kandel, E. R. (1974). Neural Control of Circulation in Aplysia. J Neurophysiol 37:458-475

96. McDearmid J.R., Brezina V., Weiss K.R. (2002) AMRJP peptides modulate a novel K+ current in pleural sensory neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 88,323-332.

97. Morris H.P., Panico M., Karplus A., Lloyd P.E., Riniker B. (1982) Elucidation by FAB-MS of the structure of a new cardioactive peptide from Aplysia. Nature. Dec 16; 300 (5893): 643-5.

98. Moulton H., Hase M., Smith K., Iversen P. (2003) HIV Tat peptide enhances cellular delivery of antisense morpholino oligomers. Antisens and nucleic acid drug development 13:31—43.

99. Muller L, Barret A, Picart R, Tougard C. (1997) Proteolytic processing of sulfated secretogranin II in the trans-Golgi network of GH3B6 prolactin cells. J Biol Chem. Feb 7; 272(6):3669-73.

100. Nachman R.J., Holman G.M., Cook B J. (1986) Active fragments and analogs of the insect neuropeptide leucopyrokinin: structure-function studies. Biochemical and Biophysical Research Communications', 137, 936-942.

101. Nachman R.J., Holman G.M., Haddon W.F., Ling N. (1986) Leucosulfakinin, a sulfated insect neuropeptide with homology to gastrin and cholecystokinin. Science', 234, 71-73.

102. Nachman RJ, Roberts VA, Dyson HJ, Holman GM, Tainer JA. (1991) Active conformation of an insect neuropeptide family. Proc Natl Acad Sci USA May 15; 88(10): 4518-22.

103. Nachman RJ, Kuniyoshi H, Roberts VA, Holman GM, Suzuki A. (1993) Active conformation of the pyrokinin/PBAN neuropeptide family for pheromone biosynthesis in the silkworm. Biochem Biophys Res Commun. Jun 15; 193(2):661-6.

104. Nachman R.J., Holman G.M., Schoofs L., Yamashita O. (1993) Silkworm diapause induction of myotropic pyrokinin (FXPRLamide) insect neuropeptides. Peptides', 14,1043-1048.

105. Nasevicius A., Ekker S.C. (2000) Effective targeted gene Taiockdown' in zebrafish. Nat Genet. Oct; 26(2): 216-20.

106. R. Nichols, Stephan A. Schneuwlyf, Jack E. Dixon. (1988) Identification and Characterization of a Drosophila Homologue to the Vertebrate Neuropeptide Cholecystokinin Vol. 263, No. 25, Issue of September 5, pp. 1216712170, J. Biol. Chem.

107. Nolte A., Breucker H, Kuhlmann D. (1965) Cytosome inclusions and neurosecretion in the nervous tissue of Gastropoda. Studies on the faucal ring of Crepidula fornicata L. (Prosobranchia, Gastropoda) Z Zellforsch Mikrosk Anat. Sep 24; 68(1): 1-27.

108. Pal-Bhadra M, Bhadra U, Birchler JA. (1997) Cosuppression in Drosophila. gene silencing of alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is polycomb dependent. Cell 90,479-490.

109. Pearson WL, Lloyd PE. (1989) Immunocytological localization of pedal peptide in the central nervous system and periphery of Aplysia. J Neurosci Jan; 9(1): 318-25.

110. Pooga M, Hallbrink M, Zorko M, Langel U. (1998) Cell penetration by transportan. FASEBJ. Jan; 12(1): 67-77.

111. Poteryaev DA, Zakharov IS, Balaban PM, Uvarov PN, Belyavsky AV. (1997) Characterization of a cDNA clone encoding pedal peptide in the terrestrial snail. Neuroreport Nov 10; 8(16):3631-5.

112. Poteryaev DA, Zakharov IS, Balaban PM, Belyavsky AV. (1998) A novel neuropeptide precursor gene is expressed in the terrestrial snail central nervous system by a group of neurons that control mating behavior. J Neurobiol. May; 35(2): 183-97.

113. Predel, R., Eckert, M. (2000) Tagma-specific distribution of FXPRLamides in the nervous system of the American cockroach. Journal of Comparative Neurology Apr 10; 419(3):352-363.

114. Predel R, Eckert M. (2000) Neurosecretion: peptidergic systems in insects. Naturwissenschaften Aug; 87(8):343-50.

115. Price D.A., Lesser W., Lee T.D., Doble K.E., Greenberg M.J. (1990) Seven TMRFamide-related and two SCP-related cardioactive peptides from Helix. J. exp. Biol.; 154,421-437.

116. Raina A, Datta A. (1992) Molecular cloning of a gene encoding a seed-specific protein with nutritionally balanced amino acid composition from Amaranthus. Proc Natl Acad Sci USA. Dec 15; 89(24): 11774-8.

117. Raina A.K. (1993) Neuroendocrine control of sex pheromone biosynthesis in lepidoptera. Annual Review of Entomology; 38, 329-349.

118. Romano N, Macino G. (1992) Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6,3343-3353.

119. Ruiz F, Vayssie L, Klotz C, Sperling L, Madeddu L. (1998) Homology-dependent gene silencing in Paramecium. Mol. Biol. Cell 9,931-943.

120. Schaefer M, Picciotto MR, Kreiner T, Kaldany RR, Taussig R, Scheller RH. (1985)Aplysia neurons express a gene encoding multiple FMRFamide neuropeptides. Cell. Jun; 41(2): 457-67.

121. Schoofs L., Vanden Broeck J., De Loof A. (1993) The myotropic peptides of Locusta migratoria—structures, distribution, functions and receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology; 23, 859-881.

122. Schulze-Bonhage A, Wiemann M, Altrup U, Wittkowski W, Speckmann EJ. (1995) Epileptic disscharges induced by pentylenetetrazole: ultrastructural alteration in identified neurons and glial cells {Helix pomatia). Epilepsy Res; 22(1): 23-34.

123. Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A, Dowdy SF. (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. Sep 3; 285(5433): 1569-72.

124. Shepherd IT, Beattie CE, Raible DW. (2001) Functional analysis of. zebrafish GDNF. Dev Biol. Mar 15; 231(2): 420-35.

125. Simson IW. (1963) Polyploid, aneuploid and multinucleate cells in the human liver. J Pathol Bacteriol. Jan; 85:35-9.

126. Spira ME, Oren R, Dormann A., Ilouz N, Lev S. (2001) Calcium, protease activation, and cytoskeleton remodeling underlie growth cone formation and neuronal regeneration. Cell Mol Neurobiol. Dec; 21(6): 591-604.

127. Stein D, Foster E, Huang SB, Weller D, Summerton J. (1997) A specificity comparison of four antisense types: morpholino, 2'-0-methyl RNA, DNA, and phosphorothioate DNA. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Jun; 7(3): 151-7.

128. Stein DA, Skilling DE, Iversen PL, Smith AW. (2001) Inhibition of Vesivirus infections in mammalian tissue culture with antisense morpholino oligomers. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Oct; 11(5): 317-25.

129. Summerton J, Stein D, Huang SB, Matthews P, Weller D, Partridge M. (1997) Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell-free and in-cell systems. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Apr; 7(2): 63-70.

130. Summerton J. (1999) Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. Biochim Biophys Acta. Dec 10; 1489(1): 14158.

131. Taylor MF, Paulauskis JD, Weller DD, Kobzik L. (1996) In vitro efficacy of morpholino-modified antisense oligomers directed against tumor necrosis factor-alpha mRNA. J Biol Chem. Jul 19; 271(29): 17445-52.

132. Taylor MF, Paulauskis JD, Weller DD, Kobzik L. (1997) Comparison of efficacy of antisense oligomers directed toward TNF-alpha in helper T and macrophage cell lines. Cytokine. Sep; 9(9): 672-81.

133. Teal PE, Nachman RJ. (1997) Prolonged pheromonotropic activity of pseudopeptide mimics of insect pyrokinin neuropeptides after topical application or injection into a moth. Regul Pept.; Oct 31; 72(2-3): 161-7.

134. Thorndyke, M. C.; Goldsworthy, G. J. Neurohormones in invertebrates. Cambridge: Cambridge University Press; 1988.

135. Uehara M, Yaoi Y, Suzuki M, Takata K, Tanaka S. (2001) Differential localization of prohormone convertases PCI and PC2 in two distinct types of secretory granules in rat pituitary gonadotrophs. Cell Tissue Res. Apr; 304(1): 43-9.

136. Urbe S, Dittie AS, Tooze SA. (1997) pH-dependent processing of secretogranin II by the endopeptidase PC2 in isolated immature secretory granules. Biochem J. Jan 1; 321 (Pt 1): 65-74.

137. Urbe S, Tooze SA, Barr FA. Formation of secretory vesicles in the biosynthetic pathway. Biochim Biophys Acta. 1997 Aug 21; 1358(1): 6-22.

138. Vanderhaagen J. J., Crawley J. N. (eds) (1985) Ann. N. Y. Acad. Sci.;448.

139. Vaucheret H, Beclin C, Elmayan T, Feuerbach F, Godon C, Morel JB, Mourrain P, Palauqui JC, Vernhettes S. (1998) Transgene-induced gene silencing in plants. Plant J. 16,651-659.

140. Vives E, Brodin P, Lebleu B. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. Jun 20; 272 (25): 16010-7.

141. Wadia J.S., Stan R.V., Dowdy S.F. (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nature. Published online 8 February.

142. Wagner, R.W. (1994) Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature, 372, 333-335.

143. Walters E.T., Byrne J.H., Carew T.J., Kandel E.R. (1983) Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia: I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50, 1522- 1542.

144. White K., Hurteau T., Punsal P. (1986) Neuropeptide-FMRFamide-like immunoreactivity in Drosophila: development and distribution. J. Comp. Neurol. 22,247,430-438.

145. Willows A.O. (1985) Neural control of behavioral responses in the nudibranch mollusc Phestilla sibogae. JNeurobiol. May; 16(3): 157-70.

146. Willows A.O.D., Pavlova G.A., Phillips, N.E. (1997) Modulation of Ciliary Beat Frequency by Neuropeptides from Identified Molluscan Neurons. The Journal of Experimental Biology 200, 1433-1439.

147. Yap K.L., Ames J.B., Swindells M.B., Ikura M. (1999) Diversity of conformational states and changes within the EF-hand protein superfamily. PROTEINS: Structure, Function, and Genetics. 37: 499-507.

148. Yoo O.J., Powell C.T., Agarwall K.L. (1982) Molecular cloning and nucleotide sequence of full-length of cDNA coding for porcine gastrin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 79, 1049-1053

149. Zdarek J, Nachman RJ, Hayes TK. (1997) Insect neuropeptides of the pyrokinin/PBAN family accelerate pupariation in the fleshfly (Sarcophaga bullata) larvae. Ann N YAcad Sci. Apr 24; 814: 67-72.

150. Публикации по теме диссертации

151. Boguslavsky D, Ierusalimsky V, Malyshev A, Balaban Р, Belyavsky A. Selective blockade of gene expression in a single identified snail neuron. Neuroscience. 2003; 119 (1):15-18.

152. Ierusalimsky VN, Boguslavsky DV, Belyavsky AV, Balaban PM. Helix peptide immunoreactivity pattern in the nervous system of juvenile aplysia. Molecular Brain Research. 2003 Dec 12; 120 (1): 84-89.

153. Иванова Ю.Л., Леонова О.Г., Попенко В.И., Иерусалимский В.Н., Богуславский Д.В., Балабан П.М., Белявский А.В. Иммуноцитохимическое изучение локализации продуктов гена HCS2 в командных нейронах виноградной улитки. Молекулярная биология, 2005 (в печати).

154. Работа представлена на конференциях, съездах,симпозиумах

155. VI east European conference of the international society for invertebrate neurobiology. Boguslavsky D. V., Balaban P.M., Belyavsky A. V. HCS2 is a unique hybrid protein. 2000.

156. Научная конференция молодых ученых, посвященная 50-летию основания Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Москва, 11-12 октября 2000г.

157. Богуславский Д.В. НС&2-уникалъный гибридный белок.

158. XVIII съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. Казань, 25-28 Сентября 2001. Иерусалимский В.Н., Богуславский Д.В. Исследованиеусловий экспрессии пептида HCS2, специфичного для командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки.

159. XVIII съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. Казань, 25-28 Сентября 2001. Богуславский Д.В., Лучинская Н.Н., Белявский А.В. Изучение белка HCS2, специфически экспрессирующегося в командных нейронах улитки.

160. Научная конференция молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Москва, 11-12 октября 2001г.

161. XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 11-15 февраля 2002 г. Д.В. Богуславский, А. Малышев, П.М. Балабан, А.В. Белявский НС32-уникалъный гибридный белок.

162. Научная конференция молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Москва, 11-12 октября 2002 г.

163. Sixth international congress Polish neuroscience society (Including Jerzy Konorski Memorial). Warsaw, Poland, July 16-19 2003. Boguslavsky D.V., Balaban P.M., Belyavsky A. V. HCS2 is a unique hybrid protein.

164. VII east European conference of the international society for invertebrate neurobiology. Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe, September 12-16 2003. Boguslavsky D. V., Malyshev A.Yu., Balaban P.M., Belyavsky A. V. HCS2 is a unique hybrid protein.