Реации орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.16, кандидат биологических наук Шаинидзе, Кристина Зурабовна

• Шаинидзе, Кристина Зурабовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шаинидзе, Кристина Зурабовна

14.00.16 - ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ 03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ

20 0.S

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Академик РАМН, профессор Е.А.Корнева доктор б. н., профессор Ю.А. Даринский

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009 Г.

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Нейропептид орексин.

2.2 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в регуляции различных физиологических процессов.

2.2.1 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в регуляции пищевого поведения.

2.2.2 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в регуляции цикла сон-бодрствование.

2.2.3 Участие системы орексин-содержащих нейронов в регуляции функций автономной и эндокринной систем.

2.2.4 Участие системы орексин-содержащих нейронов в регуляции пищеварения и энергетического обмена.

2.2.5 Участие системы орексин-содержащих нейронов в регуляции функций репродуктивной системы.

2.2.6 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в терморегуляции.

2.2.7 Орексин-содержащие нейроны и регуляция функций иммунной системы.

2.3 Система орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций на стрессорные воздействия.

2.4 Центральные механизмы реализации реакций на стрессорные воздействия.

2.4.1 Центральные механизмы реализации реакций на иммобилизационный стресс.

2.4.2 Центральные механизмы реализации реакций на холодовой стресс.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Реации орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение»

Актуальность работы.

На протяжении многих десятилетий главной задачей нейроиммунофизиологии являлось изучение возможных связей между нервной и иммунной системами. Применение прецизионных методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа в сочетании с иммуногистохимическими методами исследования дало возможность оценить вовлеченность различных структур мозга, а также степень участия различных биологически активных веществ, вырабатываемых нервными клетками, в механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий.

В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J. et al., 1991; Sheridan J. et al., 1998; Glaser R. et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., 1987; Rybakina et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия.

Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексинсодержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), 7 дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (РН) (Реутоп С., 1998).

С помощью иммунногистохимического метода выявления c-Fos белка и орексина А в клетках мозга установлена избирательность реакции орексин-содержащих нейронов при различных стресс-индуцирующих воздействиях. Показано, что данные воздействия приводят к активации доли орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi Т., 1999; Kurose Т. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al, 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества с-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого раздражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха - напротив снижается (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose T. et al. 2002; Zhu, L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса.

Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M. et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru М. et al., 2004; Kurose Т. et al., 2002; Jaszberenyi M. et al., 2000; Jaszberenyi M. et al., 2001; Hagan J.J. et al., 1999; Al-Barazanji K.A. et al., 2001; Russell S.H. et al., 2001; Mullett M.A. et al., 2000), а также увеличению количества c-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998).

Появившиеся в последнее время данные свидетельствуют о том, что орексин-содержащие нейроны помимо участия в ответе на стрессорные воздействия, вовлечены в процесс терморегуляции и теплопродукции (Monda М, 2001; Monda М, 2003; Monda М, 2003; Monda М, 2004; Jaszberenyi М, 2002; Digby J. Е., 2006; Szekely М., 2002). Однако, данные работ, в которых показана причастность орексин-содержащих нейронов к процессу терморегуляции, неоднозначны. Известно, что дорзомедиальное (DMH) и паравентрикулярное (PVH) ядра, а также латеральное и заднее (РН) гипоталамические поля, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, имеют причастность к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura К, et al 1984; Amir, 1990, Zaretskaia, 2002; Cao, 2004; Tanaka et al., 2001). При разных условиях внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda М., 2001; Monda М., 2003; Monda М., 2003; Monda М., 2004; Jaszberenyi М., 2002; Digby J. Е., 2006; Szekely М., 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki Т., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина A (Monda М., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi М., 2002).

Известно, что ограничение подвижности, охлаждение животных и комбинированный стресс (ограничение подвижности в сочетании с охлаждением) запускают ярко выраженную стрессорную реакцию, инициируя значительные изменения содержания в плазме крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Sheridan et al., 1991; Pacak К., 2001). Таким образом, применение адекватной экспериментальной модели стресс-индуцирующего воздействия позволит расширить представления о степени участия орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в развитии комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на стрессорное воздействие. Решение данного вопроса представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие механизмов реализации реакции нейронов гипоталамуса, синтезирующих орексин, на изменения, происходящие в центральной нервной системе на фоне стрессорного воздействия.

Цель данной работы.

Изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику экспрессии гена препроорексина по синтезу м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс во время и после ограничения подвижности, а также во время и после комбинированного воздействия -ограничения подвижности и охлаждения.

2. Определить иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах перифорникальной области латерального гипоталамуса, при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении.

3. Установить паттерн реакций структур и зон гипоталамуса, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, характерный для проявления ответа мозга на данные виды стрессорных воздействий.

4. Проанализировать возможные механизмы развития морфофункциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии — ограничении подвижности и охлаждении на основе результатов сочетанного исследования изменений экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе и иммуногистохимических особенностей орексин-содержащих нейронов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса возрастает в

5.5 раз через 1 час после окончания ограничения подвижности крыс и нормализуется через 1 час после охлаждения на фоне ограничения подвижности.

2. Изменения иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, после примененных стрессорных воздействий, происходят только в определенных структурах и зонах гипоталамуса крыс, представленных на срезах мозга 29-го уровня.

3. Ограничение подвижности приводит к снижению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHAd на срезах мозга 28-го уровня; в LHAm на срезах мозга 29-го уровня; и к повышению иммунореактивности этих нейронов в DMHa, LHAs на срезах мозга 29-го уровня, а также в РН на срезах мозга 31 уровня (согласно атласу мозга Swanson L.W).

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения приводит к повышению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в LHAjd, LHAd, локализованных на срезах мозга 28-го уровня и понижению иммунореактивности таких нейронов в РН на срезах мозга 31 уровня.

5. Картирование орексин-позитивных нейронов в различных структурах гипоталамуса и определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и его сочетании с охлаждением, позволило выявить функциональную дискретность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах гипоталамуса.

6. Снижение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в отдельных структурах и зонах гипоталамуса, при одновременном повышенном уровне экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и вовлеченности данных структур в реализацию реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Научно-практическое значение и новизна работы.

Работа является приоритетным экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.

Апробация работы.

Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:

1. Второй Санкт-Петербургский Международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» 1—4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия

2. 4-й Объединенный Иммунологический Форум 30 июня — 3 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия

3. Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы» 1517 сентября 2008 года, Москва, Россия.

4. Межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» 13-16 апреля 2008 года.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 258 источников, из них 249 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 5 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Шаинидзе, Кристина Зурабовна

6 выводы.

1. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс снижается (с 0,283±0,034 до 0,027±0,010, р<0.005) сразу после окончания ограничения подвижности, а через 1 час - возрастает (с 0,165±0,038 до 0,945±0,247, р<0.05).

2. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс сразу после окончания ограничения подвижности, сочетанного с охлаждением, уменьшается (с 0,027±0,010 до 0,003±0,002, р<0.05) и нормализуется через 1 час после его окончания.

3. Через 1 час после окончания ограничения подвижности иммунореактивность орексин-содержащих нейронов изменяется: в LHAd количество орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах мозга

28-го уровня, снижается на 31%, на срезах мозга 29-го уровня - в LHAs и DMHa увеличивается на 76% и 75% соответственно, а в LHAm снижается на 63%; на срезах мозга 31-го уровня — возрастает на 41%в дорзальной части РН.

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения через 1 час после окончания воздействия приводит к восстановлению снижающегося при ограничении подвижности количества орексин-позитивных нейронов до показателей, характерных для количества этих нейронов у интактных животных в LHAd, на срезах мозга 28-го уровня, а также в LHAm и РН на срезах мозга 29-го и 31-го уровней соответственно. В DMHa, LHAjd на срезах мозга 28-го уровня, в LHAs и DMHa, на срезах мозга

29-го уровня, а также в DMHa, на срезах мозга 31-го уровня количество орексин-позитивных нейронов остается повышенным.

5. Картирование орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса и их зонах, при ограничении подвижности и ограничении подвижности на фоне охлаждения демонстрирует дискретность функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, участвующих в процессе реализации ответа на данные виды стрессорных воздействий.

6. Повышение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса при одновременном снижении количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах и зонах гипоталамуса, в условиях ограничения подвижности и его сочетанного применения с охлаждением, свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и их вовлеченности в процессы реализации реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

2.5 Заключение

Анализ современной литературы не позволяет сделать определенные выводы об участии орексин-содержащих нейронов, расположенных в различных структурах гипоталамуса, в центральных механизмах формирования ответной реакции организма на стрессорные воздействия. Также не ясным остается вопрос об особенностях функционирования орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в условиях стресса. Однако, очевидно, что применение адекватной модели стресса позволит дифференцировать локализацию и морфофункциональные изменения орексин-содержащих нейронов в различных структурах гипоталамуса в этих условиях. Анализ литературы по данному вопросу свидетельствует о том, что ограничение подвижности в сочетании с охлаждением животных, является универсальной моделью для установления характера реакции орексин-содержащих нейронов структур гипоталамуса на стрессорное воздействие (Kuru М. et al., 2004; Kurose Т., et al., 2002; Jaszberenyi M., et al., 2000; Jaszberenyi M., et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), а также дает возможность выяснить, вовлекаются ли орексин-содержащие нейроны в процесс терморегуляции, так как известно, что часть этих нейронов локализована в областях гипоталамуса, участвующих в этом процессе. Для изучения структурно-функциональных характеристик орексин-содержащих нейронов гипоталамуса целесообразно использовать иммуногистохимический метод, позволяющий определить количество клеток, содержащих орексин, и локализацию этих нейронов в различных структурах гипоталамуса, а также метод ПЦР, позволяющий оценить уровень экспрессии орексина в ответ на примененные воздействия. Данная работа позволит выявить характер ответа определенных групп орексин-содержащих нейронов на примененные стрессорные воздействия, а также, исследуя степень иммунореактивности этих нейронов в совокупности с интенсивностью экспрессии гена препроорексина, судить об изменениях синтеза и потребления данного нейромедиатора в нейронах гипоталамуса. Учитывая иммуносупрессирующее действие используемого варианта стрессороного воздействия, результаты этой работы позволят обозначить и возможность участия орексина в модуляции функций иммунной системы.

3 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Экспериментальная модель.

Работы была выполнена на 80 крысах-самцах, породы Wistar, весом:

200-250г. Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище. Опыты начинали в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в клетках гипоталамуса. Экспериментальные животные были поделены на 2 группы. I-ой группе животных ограничивали подвижность в течение 1 часа. II группе также ограничивали подвижность в течение часа, но после первых 20 минут они подвергались охлаждению: - 20 С. в течение 20 минут. После охлаждения животные II группы находились в контейнерах, ограничивающих подвижность оставшиеся 20- минут. Взятие материала проводили через 20, 40, 60, 90, 120 минут от начала опыта. По завершению опыта животные были наркотизированы фенобарбиталом (в/б бОмкг/кг веса животного). В качестве контроля использовали интактных животных, которых наркотизировали фенобарбиталом (в/б бОмкг/кг веса животного) " одновременно с экспериментальными.

Необходимо отметить, что используемая нами модель ограничения подвижности была выбрана с учетом следующих требований:

1. Воздействие на экспериментальных животных должно проводиться в момент, когда естественные колебания в уровне орексинов А и Б минимальны (Taheri S. et al., 2000).

2. Учитывая, что орексин-содержащие нейроны гипоталамуса участвуют в регуляции таких процессов как обезболивание (Zhu L. et al., 2002), пищевое поведение (Moriguchi Т., 1999), а также регуляция цикла сон-бодрствование (Mignot Е. et al., 2002), наиболее адекватно использовать модель, минимально влияющую на эти процессы, что и обусловило использование модели ограничения подвижзягости в пластиковых контейнерах в течение 1 часа без фиксации конечен:остей.

Для проведения полимеразно-цепной реакцией: в реальном времени (PCR RT), по завершению опыта у наркотизированных крыс извлекали мозг и помещали в Purezol (BioRad). Для иммуногистохимического анализа животных подвергали интракардиальной перфузкеи: для последующего приготовления замороженных срезов мозга.

3.2 Измерение динамики уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс.

1) Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производило сь с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-i^ad).

2) Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием One Step RT PCR Kit (BioRad).

Полимеразная Цепная Реакция в Реальном Времени (KJT—PCR):

Для проведения реакции использовались праймеры:

- к последовательности кодирующей препроорексин (Ох): Прямой: 5'-TGT CGC CCA GAA GAC GTG TTC CTG-3' Обратный: 5'-AAG ACG GGT TCA CAC TCT GGA TC-3' Температура отжига: 61°C, длина продукта — 287 пар нз^тслеотидов.

- к последовательности кодирующей глицеральдегид-3—фосфат дегидрогеназу (G3PDH/GAD):

Прямой: 5'-ССА СТС AGA AGA CTG TGG АТ-3' Обратный: 5'-GTC АТС ATA СТТ GGC AGG ТТ-3' Температура отжига: 55°С, длина продукта — 224 пары тзгутслеотидов.

Праймеры были произведены лабораторией «СинТол».

Регистрация длины продукта была проведена методом электрофореза в агарозном геле.

Реакционная смесь для одной пробы м-РНК содержала: — One step SYBR Green Reaction Mix 10 мкл, Taq-полимераза - 0.4 мкл («МедиГен»); праймеры прямой и обратный (20 пмоль/мкл) по 0.5 мкл каждого для препроорексина и по 1 мкл для глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы; Н2О — для пробы с праймерами к препроорексину - 8,1 мкл, с праймерами к глицеральдегид-3 -фосфат дегидрогеназе - 7,1 мкл.

После приготовления реакционной смеси с праймерами Ох или GAD, в реакционную смесь добавляли пробу м-РНК (0,5 мкл), перемешивали и осаждали. Пробы помещали в амплификатор («MiniOpticon System» Bio-Rad). Из-за разности в температурах отжига праймеров реакции проводили отдельно.

Контроль за ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью ПК и программы «Opticon Monitor 3.1».

Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. И высчитывали по следующей формуле:

Iox= E0xAC(t)0x/ EGADAC(t)GAD,

Где: Iox - относительный уровень экспрессии гена препроорексина, выраженный в долях от уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы.

Е — эффективность протекания реакции в конкретной пробе.

C(t) — пороговый показатель циклов (количество циклов необходимое для достижения порогового значения флюоресценции).

Эти параметры рассчитаны встроенным программным обеспечением амплификатора.

3.3 Электрофорез в агарозном геле.

Используемые реагенты:

- 50 х ТАЕ буфер: 5М трис-аретат рН 8.2; 0.125 М ЭДТА

- Агароза

- Раствор бромистого этидия 10%

- Раствор для нанесения проб: 20% Ficoll 400; 1% ДСН; 9% Ыа2ЭДТА; ксилен цианол (в следовых количествах)

- Бромфеноловый синий

- Маркер молекулярного веса ДНК

Постановка электрофореза:

Для постановки электрофореза амплифицированных фрагментов готовили 2% агароза на lxTAE буфере. В качестве электродного буфера использовали lxTAE буфер.

Пробы, полученные в ходе RT-PCR, смешивали с раствором для нанесения в соотношении 9:1 по объему. На гель наносили амплифицированные фрагменты кДНК, контроли, ДНК-маркеры, а так же бромфеноловый синий в качестве краски-лидера.

Электрофоретическое разделение проводили в направлении от катода к аноду при напряженности электрического поля 10 В/см геля в течении 30-40 мин. По окончанию разделения гель фотографировали при помощи установки для документации результатов ПЦР-анализа (Gel Imager) с использованием трансиллюминатора с длиной волны 260-340 нм.

3.4 Иммуногистохимическое выявление орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс.

Наркотизированных животных подвергали интракардиальной перфузии, которую проводили теплым физиологическим раствором, содержащим гепарин (10ед/мл.), а затем охлажденным фиксирующим раствором (100мл 4% параформальдегида на ОДМ фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и 0,2% пикриновой кислоты, рН 7,4). Через 1 час после перфузии мозг извлекали и погружали в свежий фиксирующий раствор, не содержащий пикриновую кислоту, на 12 часов при температуре +4°С с последующим приготовлением замороженных фронтальных срезов. Анализировали фронтальные срезы мозга (толщина — 30 мкм) с 26 по 32 уровень, с использованием максимально возможного количества срезов каждого уровня мозга.

Детекцию орексин-содержащих нейронов гипоталамуса осуществляли авидин-биотиновым методом. В качестве первых антител использовали кроличьи антитела к орексину А (1:5000) (Sigma), а в качестве вторых — моноклональные анти-кроличьи иммуноглобулины (клон RG-16), конъюгированные с биотином (1:1000) (Sigma), выявление которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки. В качестве субстрата для пероксидазы использовали З'З диаминобензидин (DAB) (Sigma). Затем срезы монтировали на предметные стекла и заключали в канадский бальзам (Sigma). При анализе иммуногистохимически окрашенных срезов мозга оценивали количество орексин-позитивных клеток во всех структурах гипоталамуса. Меченые нейроны имели темно-коричневую окраску. При подсчете клеток, учитывали только клетки, с четко окрашенными контурами и наполненные гранулами с орексином не меньше чем на 1/3 клетки.

Для минимизации случайных ошибок, возникающих при изготовлении срезов, в исследовании учитывали количество орексин-содержащих нейронов на всех срезах мозга с 26 по 32 уровень срезов в соответствии с

51 атласом мозга крыс [31]. Окрашивание срезов мозга всех групп животных, проводили одновременно. Время окраски было строго стандартизировано. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стьюдента. Подсчеты данных и построение гистограммы выполнены на IBM PC при помощи программы Excel.

3.5 Статистический анализ данных.

Статистическую обработку данных проводили с использование^»* методов описательной статистики, а так же с помощью д вухф акторного дисперсионного анализа (программа STATISTIKA, version 8.0). Для построения диаграмм использовали пакет Microsoft Office 2007.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шаинидзе, Кристина Зурабовна, 2009 год

1. Анохин П.К. и Судаков К.В. Нейрофизиологическая теория голода, аппетита и насыщения.//Усп. физиол Наук. 1971.- Т.2.-№ 1.-С. 3.

2. Корнева Е.А., Хай JI.M. Влияние разрушения участков гипоталамической области на процесс иммуногенеза. //Физиологический журнал СССР. — 1963.-Т.49.- №1.- С.42-48.

3. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л., 1988. 251 с.

4. Лакомкин А.И., Мягков И.Ф. Голод и жажда. М.: Медицина, 1975.

5. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т., Каткова Л.С. Адаптация организма к стрессорным ситуациям и предупреждение стрессорных повреждений // Вестн. АМН СССР.-1984.- № 4.- С. 45-51.

6. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т. Стрессорные нарушения в системе противоопухолевого иммунитета и их ограничение стресс-лимитирующими факторами // Вестник АМН СССР. -1985.- № 8.- С. 2329.

7. Фролов Е.П. Нейрогуморальные механизмы регуляции иммунологических процессов. М.- 1974.- 264 с.

8. Фролов Б.А. Стрессорные нарушения функций иммунной системы и их предупреждение: Автореферат диссертации доктора мед.наук.-Л., -1987.49 с.

9. Abrahamson, ЕЕ, Leak RK, and Moore RY. The suprachiasmatic nucleus projects to posterior hypothalamic arousal systems.//Neuroreport.-2001.-12: 435-440.

10. Amir S. Stimulation of the paraventricular nucleus with glutamate activates interscapular brown adipose tissue thermogenesis in rats.//Brain Res.-1990.-V.-5 08.-P. 152-155.

11. Amir S. Intra-ventromedial hypothalamic injection of glutamate stimulates brown adipose tissue thermogenesis in the rat.//Brain Res.-1990.-V.511.-P.341-344.

12. Amir S. Activation of brown adipose tissue thermogenesis by chemical stimulation of the posterior hypothalamus.//Brain Res. 1990.-V.534.-P. 303308.

13. Amir S. and Schiavetto A. Injection of prostaglandin E2 into the anterior hypothalamic preoptic area activate brown adipose tissue thermogenesis in the rat.//Brain Res. -1990.-V.528.-P. 138-142.

14. Ammoun S., Holmqvist Т., Shariatmadari R., Oonk H.B., Detheux M., Parmentier M.3 Akerman K.E.O., Kukkonen J.P., Distinct recognition of OX1 and OX2 receptors by orexin peptides. // J Pharmacol Exp Ther. — 2003. — №305.-P. 507-514.

15. Antunes V.R., Brailoiu G.C., Kwok E.H., Scruggs P., and Dun N.J. Orexins/hypocretins excite rat sympathetic preganglionic neurons in vivo and in vitro://Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol.- 2001-V.281.- P.1801-1807

16. Arihara Z., Takahashi K., Murakami O:, Totsune K., Sone M., Satoh F., Ito S., Hayashi Y., Sasano H., and Mouri T. Orexin-A in the human brain and tumor tissues of ganglioneuroblastoma and neuroblastoma.//Peptides.- 2000.-V.21-P.565-570.

17. Armario A., Marti O., Gavalda A., Giralt M., Jolin T Effects of chronic immobilization stress on GH and TSH secretion in the rat: response to hypothalamic regulatory factors.//Psychoneuroendocrinology.-1993-.V.-l 8-P.405-413.

18. Aston-Jones G. A neural circuit for circadian regulsirtion of arousal. G. Aston-Jones, S. Chen, Y. Zhu, M.L. Oshinsky. // Nat. Nex^xosci. 2001. - №4. - P. 732-738.

19. Bailey T.W., and DiMicco J.A. Chemical StimuiJLa-tion of the Dorsomedial Hypothalamus Elevates Plasma ACTH in Conscious IRats. Am J Physiol.-2001 .-V.280.- P.8-15.

20. Balasko M., Szelenyi Z., and Szekely M. Central ^thermoregulatory effects of neuropeptide Y and orexin A in rats.//Acta Physiol ZE^Lung.- 1999.-.V.86.- P.219-222.

21. Bamshad M., Song C.K., and Bartness T.J. CNS origins of the sympathetic nervous system outflow to brown adipose tissue-ZA^^^^^m J Physiol. 1999- 276.-:R1569-R1578.

22. Bartanusz V., Jezova D., Bertini L.T., Tilders F.J., А^тлЪгу J.M., Kiss J.Z. Stress-induced increase in vasopressin and corticotropmresIL easing factor expression in hypophysiotrophic paraventricular neurons. Endcz> crinology.-1993 .-132:895902.

23. Beck B, Richy S. Hypothalamic hypocretin/orexin and neuropeptide Y: divergent interaction with energy depletion and le^-£in.//Biochem Biophys Res Commun, 1999.- V.258(l).-P.-119-22.

24. Becskei C., N. Hernadfalvy D. Arsenijevic T.A. Щ/utza W. Langhans and T. Riedige. Inhibitory effects of LPS on hypothalamic nuclei involved in the control of food intake//Elsevier Ltd.-2007.-V. 125 .-F* Г222-228.

25. Beuckmann C.T., Yanagisawa. M. Orexins: from, neuropeptides to energy homeostasis and sleep/ wake regulation. // J Mol Med. — 2002. №80. - P. 329342.

26. Bingham S., Davey P.T., Babbs A.J., Irving Е.А.Э Sammons M.J., Wyles M., Jeffrey P., Cutler L., Riba I., Johns A., Porter R.A., XJpton N., Hunter A.J., and107

27. Parsons A. A. Orexin-A, an hy othalamic peptide with analgesic properties.//Pain.-2001 .-V.92.-P.81 -90

28. Blanco M., M. Lopez, T. Garcia-Cabe==HLlero, R. Gallego, A. Vazquez-Boquete, G. Morel, R. Senaris, F. Casanueva, С— Dieguez, A. Beiras.Cellular localization of orexin receptots in human pituitajL // J Clin Endocrinol Metab.—2001 .-№86.-P. 1616-1619.

29. Bligh J. The thermosensitivity of thex liypothalamus and thermoregulation in mammals. Biol Rev.-1966.-V.41 .-P.31 367.

30. Boulant J.A., Bignall K.E. Hypothalaj=rzidc neuronal responses to peripheral and deep-body temperatures. // Am J Phys5.«=z>l.-1973.-V.225.-P.1371-1374

31. Boulant J.A., Demieville H.N. Respondses of thermosensitiv preoptic and septal neurons to hippocampal and brain stimulation.//! Neurophysiol.-1977.-V.40.-P. 1356-1368

32. Boulant J.A. Hypothalamic control of thermoregulation. In: Morgane PJ, Panksepp J, eds.//Handbook of the h-3^pothalamus, vol. 2.- New York.- 1980.-Marcell Decker.-p.82

33. Boulant J.A., Dean J.B. Temperatures zreceptors in the central nervous system. //Annu Rev Physiol.-1986.- V.48.-P.63. S>-654.

34. Boulant J.A. Properties of hypothalaj=—zlic temperature sensitive and insensitive neurones.//Physiol Res.- 1992.- V.41IP.83-84

35. Boulant J.A. Cellular mechanisms "temperature sensitivity in hypothalamic neurons.//Prog Brain Res.- 1998.- V.l ZEL5 .-P.3-8

36. Briski K.P., and Sylvester P.W. ZErlypothalamic orexin-A-immunopositive neurons express Fos in response to «central glucopenia.//Neuroreport.- 2001.-V.12.- P.531-534

37. Burlet S., Tyler C.J., and Leonard C.S. Direct and indirect excitation of laterodorsal tegmental neurons by Hypocretin/Orexin peptides: implications for wakefulness and narcolepsy .//J Neurosci.-2002.-V.22.-P.2862-2872.

38. Cai X.J., Widdowson P.S., Harrold J., Wilson S., Buckingham R.E., Arch J.R., Tadayyon M., Clapham J.C., Wilding J., and Williams G. Hypothalamic orexin expression: modulation by blood glucose and feeding.//Diabetes.-1999.-V.48.-P.2132-2137.

39. Cano G., A.F. Sved, Characterization of the central nervous system innervation of the rat spleen using viral transneuronal tracing. // J. of сотр. neurol. — 2001. -V.- 439.-P. 1-18.

40. Cano G., Passerin A.M., Schiltz J.C., Card J.P., Morrison S.F., and Sved A.F. Anatomical substrates for the central control of sympathetic outflow to interscapular adipose tissue during cold exposure.//J Comp Neurol.- 2003.-V.460.- P.303-326.

41. Cao W.H., Fan W., and Morrison S.F. Medullary pathways mediating specific sympathetic responses to activation of dorsomedial hypothalamus.//Neuroscience.-2004.-V. 126.- P.229-240.

42. Ceccatelli S., Orazzo C. Effect of different types of stressors on peptide messanger ribonucleic acids in the hypothalamic paraventricular nucleus. Acta Endocrinol (Copenh).-1993.-V.128.-P.485—492.109

43. Chen C.T., Hwang L.L., Chang J.K., and Dun NJt Pressor effects of orexins? injected intracisternally and to rostral ventrolaterals medulla of anesthetized: rats.//Am JiPhysioliRegul^Integr Comp Physiol.-2000-rV.278:-Pl692-697~

44. Clark G., Magoun H.W., Ranson S.W. Hypothalamic regulation of body temperature.//J.Neurophysiol.-1939!-V.2.-P.61-80.

45. Cluderay J;E., HarrisonD.C., and: Hervieu G.J. Protein distribution of the orexin-2 receptor in the rat central nervous system./ZRegul Pept.-2002.-V. 104.-P.131-144

46. Cullinan W.E, Herman J.P;, Battaglia D.F., Akil H;, Watson S.J. Pattern and time course of immediate; early gene expression in rat brain following acute stress.//Neuroscience.-1995.-V.64.-P.477—505.

47. Cutler D:J., Morris R;,Sheridhar V., Wattam T.A., Holmes S., Patel S., Arch J.R., Wilson S., Buckingham R:E., Evans M.L., Leslie R.A., and; Williams G.

48. Differential distribution of orexin-A and orexin-B immunoreactivity in the rat brain and spinal cord.//Peptides.-1999.-V.20.-P.1455-1470.

49. Dalai M.A., Schuld A., Haack M., Uhr M., Geisler P., Eisensehr I., Noachtar S., and Pollmacher T. Normal plasma levels of orexin A (hypocretin-1) in narcoleptic patients.//Neurology.-2001.-V.56.-P.1749-1751.

50. Date Y., Mondal M.S., Matsukura S., and Nakazato M. Distribution of orexin-A and orexin-B (hypocretins) in the rat spinal cord. //Neurosci Lett.-2000.-V.288.-P.87-90.

51. Date Y. Mondal M.S., Matsukura S., Ueta Y., Yamashita H., Kaiya H., Kangawa K., and Nakazato M. Distribution of orexin/hypocretin in the rat median eminence and pituitary.//Brain Res Mol Brain Res.-2000.-V.76.-P.l-6.

52. Denes A., Boldogkoi Z., Uhereczy G. Characterization of the central nervous system innervations of the rat spleen using viral transneuronal tracing.//J Comp Neurol. 2001. - V. 439. - P. 1-18.

53. Dering M.A., Santer R.M. and Watson A.H.D. Age related changes in the morphology of preganglionaric neurons projecting to the rat hypogastric ganglion. // J. Neurocytol.-1996.-V.25.-P.555-563.

54. Digby J.E., Chen J., Tang J.Y., Lehnert H., Matthews R.N., and Randeva H.S., Orexin receptor expression in human adipose tissue: effects of orexin-A and orexin-B //Journal ofEndocrinology.-2006.-191.-129-136.

55. Dube M.G., Kalra S.P., and Kalra P.S. Food intake elicited by central administration of orexins/hypocretins: identification of hypothalamic sites of action./ZBrain Res.-1999.-V.842.-P.473 -477.

56. Elmquist J.K., Scammell Т.Е., and Saper C.B. Mechanisms of CNS response to systemic immune challenge: the febrile response.//Trends Neurosci.-1997.-V.20.-P.565-570.

57. Eriksson K.S., Sergeeva O., Brown R.E., and Haas H.L. Orexin/hypocretin excites the histaminergic neurons of the tuberomammillary nucleus.//J Neurosci.-2001 .-V.21 .-P.9273-9279.

58. Espana R.A., Baldo B.A., Kelley A.E., and Berridge C.W. Wake-promoting and sleep-suppressing actions of hypocretin (orexin): basal forebrain sites of action.//Neuroscience.-2001 .-V. 106 .-P.699-715.

59. Estabrooke I.V., McCarthy M.T., Ко E., Chou T.C., Chemelli R.M., Yanagisawa M., Saper C.B., and Scammell Т.Е. Fos expression in orexin neurons varies with behavioral state.//J Neurosci.-2001 .-V.21 .-P. 1656-1662.

60. Fodor M., Palkovits M. Neuropeptide Y-containing neuronal pathway from the spinal trigeminal nucleus to the pontine peribrachial region in the rat.//Neurosci Lett.-1991.-V.133.-P.195—198.

61. Ford Gemma K., Kamal A. Al-Barazanji, Shelagh Wilson, Declan N.C. Jones, Michael S. Harbuz, and David S. Jessop. Orexin expression and function: Glucocorticoid manipulation, stress and feeding studies.//Endocrinology.-2005.-10.1210/en. -0496.

62. Frank S.M., Raja S.N., Bulcao C.F., Goldstein D.S. Relative contribution of core and cutaneous temperatures to thermal comfort and autonomic responses in humans. // J Appl Physiol.-1999.-V.86.-P.1588-1593.

63. Fujiki N., Yoshida Y., Ripley В., Honda K., Mignot E., and Nishino S. Changes in CSF hypocretin-1 (orexin A) levels in rats across 24 hours and in response to food deprivation. //Neuroreport.-2001.-V.12.-P.993-997.

64. Fukuhara K., Kvetnansky R., Weise V.K., Ohara H., Yoneda R., Goldstein D.S., Kopin I.J. Effects of continuous and intermittent cold (SART) stress on sympathoadrenal system activity in rats. // J Neuroendocrinol.-1996.-V.8.-P.65-72.

65. Glaser R., Kennedy S., Lafuse W/Р/ et al. Phsychological stress-induced modulation of interleukin-2 production in periferal blood leukocytes.//Arch.Gen.Psychiatry. -1990. -V.47. -P.707-712.

66. Griffond В., Risold P.Y., Jacquemard C., Colard C., and Fellmann D. Insulin-induced hypoglycemia increases preprohypocretin (orexin) mRNA in the rat lateral hypothalamic area. //Neurosci Lett.-1999.-V.262.-P.77-80.

67. HakanssomМШ,., Brown Hi, Ghilardi":N., Skoda RiC.,. and Meister В. Ueptin receptor immunoreactivity in chcmically defined target neurons of the hypothalamus.//J!Neurosci:-1998i-V.18-P:559-572.

68. Harbuz M.S., Chalmers L, De Souza L., Lightman S.L. Stressinduced activation! of CRF andt c-fos mRNAs in the paraventricular nucleus are not affected by serotonin depletion. Г I Brain Res.-1993 .-V.609.-P. 167-173.

69. Harbuz M.S., Lightman S.L. Responses of hypothalamic and pituitary mRNA to physical and psychological stress in the rat:.// J Endocrinol.-1989V. 122.-P.705-711.

70. Harbuz M.S., Chowdrey H.S., Jcssop D.S., Biswas S., Lightman S.L. Role ofcatecholamines in mediating messenger RNA andi hormonal responses to stress.

71. Brain Res.-1991.-V.551.-P.52-57.

72. Harrisom T. A., Chenr C.T., Dun; N. J., and Chang J.K. Hypothalamic orexin A-immunoreactive neurons projcct to the rat dorsal medulla.// Neurosci Eett.-1999.- V.273.-P: 17-20.

73. Haynes A.C., Jackson В., Chapman H., Tadayyon M., Johns A., Porter R.A., and Arch J.R. A selective orexin-1 receptor antagonist reduces food consumption in male and female rats.//Regul Pcpt.-2000.-V.96.-P.45-51.

74. Hellstrand К. Evidence for a beta-adrenoreceptor-mediated regulation of human natural killer cells, / K. Hellstrand, S. Hermodsson, O.J. Strannegard. // Immunol. 1985. - V. 134. - P. 4095 - 4099:

75. Hilairet S. Hypersensitization of the Orexin 1 Receptor by the CB1 Receptor. / S. Hilairet, M. Bouaboula, D. Carrie"re, G. Le Fur, P. Casellas. // The Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278, №26. - P. 23731-23737.

76. НП1 J.J., and Peralta E.G. Inhibition of a Gi-activated potassium channel (GIRK1/4) by the Gq-coupled ml muscarinic acetylcholine receptor. // J Biol Chem.- 2001.-V. 276.-P.5505-5510.

77. Hinckel P., Schroder-Rosenstock K. Responses of pontine units to skin-temperature changes in the guinea-pig. // J Physiol (Lond).-1981.-V.314.-P. 189-194.

78. Hervieu G.J., Cluderay J.E.,, Harrison D.C., Gene expression and protein distribution of the orexin-1 receptor in the rat brain and spinal cord. // Neuroscience.-2001 .-V. 103 .-P.777-797.

79. Hori Т., Nakayama T. Effects of biogenic amines on central thermoresponsive neurons in the rabbit. // J Physiol.-1973.-V.232.-P.71-85.

80. Horvath T.L., Peyron C., Diano S., Ivanov A., Aston-Jones G., Kilduff T.S., and van Den Pol AN. Hypocretin (orexin) activation and synaptic innervation of the locus coeruleus noradrenergic system. // J Comp Neurol.-1999.-V.415.-P.145-159.

81. Horvath T.L., Warden C.H., Hajos M., Lombardi A., Goglia F., and Diano S. Brain uncoupling protein -2: uncoupled neuronal mitochondria predict115thermal synapses in homeostatic centers. // J Neurosci.-1999.-V.19.-P.10417-10427.

82. Huang Z.L., Qu W.M., Li W.D., Mochizuki Т., Eguchi N., Watanabe Т., Urade Y., and Hayaishi O. Arousal effect of orexin A depends on activation of the histaminergic system. // Proc Natl Acad Sci.-USA.-2001.-V.98.-P. 99659970.

83. Ida Т., Nakahara K., Murakami T. Possible involvement of orexin in the stress reaction in rats. // Biochem. Byophys. Res. Gommun.-2000.-V.270.-P.318-323.

84. Imai-Matsumura K., Matsumura K., and Nakayama T. Involvement of ventromedial hypothalamus in brown adipose tissue thermogenesis induced by preoptic cooling in rats. // Jpn J Physiol.-1984.-V.34.-P.939-943.

85. Isenschmid R., Krehl L. Uber den Einfluss des Gehirns auf die Warmeregulation. //Arch exp Path Pharmacol.- 1912.-V.70.-P.149-182.

86. Isenschmid R., Schnitzler W. Beitrage zur Lokalisation des der Warmeregulation vorstehenden Zentralapparates im Zwischenhirn. // Arch exp Path Pharmacol.-1914.-V.76.-P.202-233.

87. Jaszberenyi M., Bujdoso E., Pataki I., and Telegdy G. Effects of orexins on* the hypothalamic-pituitary-adrenal system. // J Neuroendocrinol.-2000.-V.12.-P.1174-1178.

88. Jaszberenyi M:, Bujdoso E., Kiss E., Pataki I., Telegdy G. The role of NPY in the mediation of orexin-induced hypothermia. // Regul. Pept.-2002.-V.104.-P.55—59i

89. Jaszberenyi Mi, Bujdoso E., and Telegdy G. The role of neuropeptide Y in orexin-induced hypothalamic-pituitary-adrenal activation. // J Neuroendocrinol.-200Г.-V. 13 .-P. 43 8-441.

90. Johren O.', Neidert S.J., Kuramer Ml, Dendorfer A., and Dominiak P. Prepro-orexin and orexin receptor mRNAs are differentially expressed, in peripheral' tissues of male and female rats. // Endocrinology.- 2001.-V.142.-P: 3324-3331.

91. Johren 0., Bruggemann N., Dendorfer A. Gonadal steroids differentially regulate the messenger ribonucleic acid expression of pituitary orexin type 1-receptors and orexin type 2 receptors. // Endocrinology.-2003.-V.144.-P. 12191225.

92. Kalin N.H., Takahashi L.K., Ghen F.L. Restraint stress increases corticotropin-releasing hormone mRNA content in the amygdale and paraventricular nucleus. // Brain Res.-1994.-V.656.-P.l82-186.

93. Karteris E., Randeva H.S., Grammatopoulos D.K., Jaffe R.B., and Hillhouse E.W. Expression and coupling characteristics of the crh and orexin type 2 receptors in human fetal adrenals. // J Clin Endocrinol Metab.-2001.-V.86.-P.4512-4519*

94. Kastin A.J., and Akerstrom V. Orexin A but not orexin В rapidly enters brain from blood by simple diffusion. // J Pharmacol Exp Ther.-1999.-V.289.-P: 219-223.

95. Kayaba Y., Nakamura, A., Kasuya, Y., et al. Attenuated defense response and low basal blood pressure in orexin knockout mice. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.-2003.-V.285.- P581-593.117

96. Keller A.D., Hare W.K. The hypothalamus and heat regulation. // Proc Soc Exp Biol Med.-1932.- V.29.-P. 1069-1070.

97. Kirchgessner A.L., and Liu M. Orexin synthesis and response in the gut. // Neuron.-1999.-V.24.-P.941-951.

98. Konarska M., Stewart R.E., McCarty R. Predictability of chronic intermittent stress: effects on sympathetic-adrenal medullary responses of laboratory rats. // Behav Neural Biol.-1990.- V.53.-P.231-243.

99. Konarska M., Stewart R.E., McCarty R. Sensitization of sympathetic-adrenal medullary responses to a novel stressor in chronically stressed laboratory rats. // Physiol Behav.-1989.-V46.-P. 129-135.

100. Kukkonen J.P., Akerman K.E.O. Orexin receptors couple to Ca2+ channels different from store-operated Ca2+ channels. // Neuroreport.- 2001.-V. 12.-P.2017-2020.

101. Kunii K, Yamanaka A., Nambu Т., Matsuzaki I., Goto K., and Sakurai T. Orexins/hypocretins regulate drinking behaviour. // Brain Res.- 1999.-V842.-P.256.261.

102. Kuru M., Ueta Y., Serino, R. Centrally administered orexin/hypocretin activates HPA axis in rats. // Neuroreport.-.2004.-V.l 1.-P. 1977-1980.

103. Kuwahara M., Huh M.D., Hirose H., Sugano S. Alteration of the intrinsic heart rate and autonomic nervous tone during the growing process of rats and pig. // Jpn.J.Vet.Sci.-1986.-V.48.-P.703-709.

104. Kvetnansky R., Palkovits M., Mitro A., Torda Т., Mikulaj L. Catecholamines in individual hypothalamic nuclei of acutely and repeatedly stressed rats. // Neuroendocrinology.-1977.-23.-P.257-2671. Л I

105. Lee J.H., Bang E., Chae K.J., Kim J.Y., Lee D.W., and Lee W. Solution structure of a new hypothalamic neuropeptide, human hypocretin-2/orexin-B.// Eur J Biochem.- 1999.-V.266.- P.831-839.

106. Li Y. Gao X.B., Sakurai Т., van den Pol A.N. Hypocretin/orexin excites hypocretin neurons via a local glutamate neuron-A potential mechanism for orchestrating the hypothalamic arousal system. // Neuron. 2002. - V. 36. - P. 1169-1181.

107. Lin M.T, Wang PS, Ghuang J, Fan LJ, Won SJ Cold stress or a pyrogenic substance elevates thyrotropin-releasing hormone levels in the rat hypothalamus and induces thermogenic reactions. //Neuroendocrinology.-1989.-V.50.-P.177-181.

108. Lipton J.M. Thermal stimulation of the medulla alters behavioral temperature regulation. //Brain Res.-1971.-V.26.-P.439-442.

109. Lipton J.M. Thermosensitivity of medulla oblongata in control of body temperature'. //Am J Physiol.-1973.-V.224.-P.890-897.

110. Lipton J.M, Dwyer P, Fossler DE Effects of brainstem lesions on temperature regulation in hot and cold environments. //Am J Physiol.-1974.-V. 226.-P.1356-1365.

111. Lipton J.M, ClarkWG Neurotransmitters in temperature control. //Annu Rev Physiol.-1986.-V.48 .-P.613-623.

112. Lopez M, Seoane L, Garcia MC, Lago F, Casanueva FF, Senaris R, and Dieguez C. Leptin regulation of prepro-orexin and orexin receptor mRNA levels in the hypothalamus./ZBiochem Biophys Res Commun.-2000.-V.269.-P.41-45.

113. Lubkin M, and Stricker-Krongrad A. Independent feeding and metabolic actions of orexins in mice.// Biochem Biophys Res Commun.-1998.-V.253.-P.241-245.

114. Luo X, Kiss A, Makara GB, Lolait S, Aguilera G Stressspecific regulation of corticotropin releasing hormone receptor expression in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus in the rat.//J Neuroendocrinol.-1994.-V.6.-P.689-696.

115. McCarty Richard. Sympathetic-adrenal medullary and cardiovascular responses to acute cold stress in adult and aged rats. // Auton. Nerv. Syst.-1985 .-V. 12.-P. 115-122.

116. Malendowicz, L.K, Hochol A, Ziolkowska A, Nowak M, Gottardo L, and Nussdorfer GG. Prolonged orexin administration stimulates steroid-hormone secretion, acting directly on the rat adrenal gland.//Int J Mol Med.-2001.-V.7.-P.401-404.

117. Martins P.J.F., D'Almeida, V., Pedrazzoli, M., Lin, L., Mignot, E. and Tufik, S. Increased hypocretin-1 (Orexin-A) levels in cerebrospinal fluid of rats after short-term forced activity. //Regul. Pept.- 2004.-V.117.-P.155-158.

118. Marcus J.N., Aschkenasi C.J., Lee CE, Chemelli RM, Saper CB, Yanagisawa M, and Elmquist JK. Differential expression of orexin receptors 1 and 2 in the rat brain. //J Comp Neurol.-2001.-V.435.-P.6-25.

119. Marino F, Sockler JM, Fry JM. Thermoregulatory, metabolic and sympathoadrenal responses to repeated brief exposure to cold. // Scand J Clin Lab Invest.-1998.-58.-P.537-545.

120. Mark M.D., and Herlitze S. G-protein mediated gating of inward-rectifier K+ channels. Eur J Biochem.-2000.-V.267.-P.5830-5836.

121. Mason J.W. A re-evaluation of the concept of "non-specificity" in stress theory. /Л Psych Res.-1971.-V.8.-P.323-333.

122. Matsumura K., Tsuchihashi Т., and Abe I. Central orexin-A augments sympathoadrenal outflow in conscious rabbits.//Hypertension.-2001.-V.37.-P.1382-1387.

123. Matsuzaki I., Sakurai Т., Kunii K., Nakamura Т., Yanagisawa M., and Goto K. Involvement of the serotonergic system in orexin-induced behavioral alterations in rats.//Regul Pept.-2002.-104.-P.l 19-123.

124. Melia K.R., Ryabinin A.E., Schoroeder R., Bloom F.F., Wilson M.C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.// J.of Neuroscience.-1994.-V.14. N.10. P.5929-5938.

125. Methippara M.M., Alam M.N., Szymusiak R., and McGinty D. Effects of lateral preoptic area application of orexin-A on sleep-wakefulness. //Neuroreport.-2000.-V. 11 .-P.3423-3426.

126. Mignot E., Taheri S., Nishino S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. // Nature Neuroscience.-2002.-V.5.-P.1071-1075.

127. Mintz E.M., van den Pol A.N., Casano A.A., and Albers H.E. Distribution of hypocretin-(orexin) immunoreactivity in the central nervous system of Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). //J ChemNeuroanat.-2001.- V.21.-P.225-238.

128. Mitsuma Т., Hirooka Y., Mori Y., Kayama M., Adachi K., Rhue N., Ping J., and Nogimori T. Effects of orexin A on thyrotropin-releasing hormone and thyrotropin secretion in rats. //Horm Metab Res.-1999.-V.31 .-P.606-609.

129. Mochizuki Takatoshi, Elizabeth B. Klerman, Takeshi Sakurai and Thomas E. Scammell. Elevated body temperature during sleep in orexin knockout mice.// Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol.-2006.-V.291.-P.533-540.

130. Mochizuki Takatoshi, Amanda Crocker, Sarah McCormack, Masashi Yanagisawa, Takeshi Sakurai, and Thomas E. Scammell. Behavioral State Instability in Orexin Knock-Out Mice. // The Journal of Neuroscience.-2004.-V.24(28) .-P.6291-6300.

131. Monda M., Viggiano A., Mondola P., De Luca V: A paradoxical effect of orexin A: the hypophagia induced by hyperthermia. // Brain Res.-2003.-V.961.-P.220-228.

132. Monda M., Viggiano A., Mondola P., De Luca V: Haloperidol reduces the sympathetic and thermogenic activation induced by orexin A.//Neurosci Res 2003 .-V.45 .-P. 17-23.

133. Monda M., Viggiano A., Mondola P., Fuccio F., De Luca V: Cortical spreading depression blocks the hyperthermic reaction induced by orexin A. //Neuroscience.-2004.-V. 123.-P.567-574.

134. Monda M., Viggiano A., Mondola P., De Luca V: Inhibition of prostaglandin synthesis reduces hyperthermic reactions induced by hypocretin-1/orexin A. // Brain Res.-2001 .-V.909.-P.68-74.

135. Monda M., Viggiano A., Mondola P., Fuccio F., De Luca V: Clozapine blocks the hyperthermia induced by orexin A in the rat. // Physiol Res.-2004.-V.53.-P.507-513.

136. Mondal M.S., Nakazato M., Date Y., Murakami N., Yanagisawa M., and Matsukura S. Widespread distribution of orexin in rat brain and its regulation upon fasting.//Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.256.-P.495-499.

137. Moriguchi Т., Sakurai Т., Nambu Т., Yanagisawa M., and Goto K. Neurons containing orexin in the lateral hypothalamic area of the adult rat brain are activated by insulin-induced acute hypoglycemia. //Neurosci Lett.-1999.-V.264.-P.101-104.

138. Mosso J.A., Kruger L. Spinal trigeminal neurons excited by noxious and thermal stimuli. //Brain Res.-1972.-V.38.-P.206-210.

139. Mullett M.A., Billington C.J., Levine A.S., and Kotz C.M. Hypocretin I in the lateral hypothalamus activates key feeding-regulatory brain sites. //Neuroreport.-2000.-V.l l.-P.: 103-108.

140. Muroya S., Uramura K., Sakurai Т., Takigawa M., and Yada T. Lowering glucose concentrations increases cytosolic Ca2+ in orexin neurons of the rat lateral hypothalamus. //Neurosci Lett.-2001.-V.309.-P.165-168.

141. Muschamp J.W. A Role for Hypocretin (Orexin) in Male Sexual Behavior. / J.W. Muschamp, J.M. Dominguez, S.M. Sato, S. Roh-Yu, E.M. Hull. // The Journal of Neuroscience. 2007. - V. 27, №11. - p. 2837-2845.

142. Nakamura Т., Uramura K., Nambu Т., Yada Т., Goto K., Yanagisawa M, and Sakurai T. Orexin-induced hyperlocomotion and stereotypy are mediated by the dopaminergic system.// Brain Res.-2000.-V.873.-P.181-187.

143. Nambu Т., Sakurai Т., Mizukami K., Hosoya Y., Yanagisawa M., and Goto K. Distribution of orexin neurons in the adult rat brain. // Brain Res.-1999.-V.827.-P.243-260.

144. Nanmoku Т., Isobe K., Sakurai Т., Yamanaka A., Takekoshi K, Kawakami Y, Goto K., and Nakai Т. Effects of orexin on cultured porcine adrenal medullary and cortex cells. //Regul Pept.-2002.-V.104.-P.125-130.

145. Naslund E., Ehrstrom M., Ma J., Hellstrom P.M., and Kirchgessner A.L. Localization and effects of orexin on fasting motility in the rat duodenum. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.-2002.-V.282.-P.470-479.

146. Nishino S., Fujiki N., Ripley B1., Sakurai E., Kato M., Watanabe Т., Mignot E., and Yanai K. Decreased brain histamine content in hypocretin/orexin receptor-2 mutated narcoleptic dogs. //Neurosci Lett.-2001.-V.313.-P.125-128.

147. Nowak K.W., Mackowiak P., Switonska M.M., Fabis M., and Malendowicz L.K. Acute orexin effects on insulin secretion in the rat: in vivo and in vitro studies.// Life Sci.-2000.-V.66.-P.449-454.

148. Osaka T, Matsumura H. Noradrenaline inhibits preoptic sleep-active neurons through alpha 2-receptors in the rat. // Neurosci Res.- 1995.-V.21.-P.323-330.

149. Pacak K., Palkovits M., Yadid G., Kvetnansky R, Kopin I J., Goldstein D.S. Heterogeneous neurochemical responses to different stressors: a test of Selye's doctrine of nonspecificity. // Am J Physiol.-1998.-V. 275.-P.1247-1255.

150. Pacak K., Palkovits M., Makino S., Kopin I.J., Goldstein D.S. Brainstem hemisection decreases corticotropin-releasing hormone mRNA in the paraventricular nucleus but not in the central amygdaloid nucleus.//J Neuroendocrinol.-1996.-V.8.-P.543—551.

151. Pacak Karel and Palkovits Miklos. Stressor Specificity of Central Neuroendocrine Responses: Implications for Stress-Related Disorders. // Endocrine Reviews.- 2001.-V. 22(4) .-P.502-548.

152. Pace-Schott E.F. The* neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. / E.F. Pace-Schott, J.A. Hobson. // Nat. Rev. Neurosci. — 2002. — V. 3. — P. 591-605.

153. Palkovits M., Baffi J.S., Расак K. Stress-induced Fos-like immunoreactivity in the pons and the medulla oblongata of rats. // Stress.-1997.-V.l.~P.155-168.

154. Peyron, C, Tighe DK, van den Pol AN, de Lecea L, Heller HC, Sutcliffe JG, and Kilduff TS. Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal'systems. // J Neurosci.-1998.-V.18.-P.9996-10015.

155. Pharmacology in exercise and sports. Satu M. // Somani. CRC Press.-1996.-359 p.

156. Piper D.C., Upton N., Smith M.I., and Hunter A.J. The novel brain neuropeptide, orexin-A, modulates the sleep-wake cycle of rats. // Eur J Neurosci.-2000.-V.12.-P.726-730.

157. Richard F., Faucon-Biguet N., Labutu R., Rollet D., Mallet J., Buda M. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. // J Neurosci Res.-1988.-V.20.-P.32-37.

158. Rodgers R.J., Halford J.C., Nunes de Souza R.L., Canto de Souza A.L., Piper D.C., Arch J.R., and Blundell J.E. Dose-response effects of orexin-A on food intake and the behavioural satiety sequence in rats. // Regul Pept.-2000.-V.96.-P.71-84.

159. Rondeel J.M.M., de Greef W.J., Hop W.C.J., Rowland D.L., Visser T.J. Effect of cold exposure on the hypothalamic release of thyrotropin- releasing hormone and catecholamines. //Neuroendocrinology.-1991.-54.-P.477^481.

160. Rybakina E.G., Shanin S.n., Kozinets I.A., Fomicheva E.E., Korneva E.A. Cellular mechanisms of cold stress-related immunosupression and the action of interleukin 1 // INT.J.TISS.REAC. XIX.-1997.- V.3/4.-P.135-140.

161. Sakurai Т., Moriguchi Т., Furuya K, Kajiwara N, Nakamura T, Yanagisawa M, and Goto K. Structure and function of human prepro-orexin gene. // J Biol Chem .-1999.-V.274.-P. 17771-17776.

162. Samson W.K., Gosnell В., Chang J.K., Resch Z.T., and Murphy T.C. Cardiovascular regulatory actions of the hypocretins in brain. // Brain Res.-1999.-V.831.-P.248-253.

163. Samson W.K., Taylor M.M., Follwell M., and Ferguson A.V. Orexin actions in hypothalamic paraventricular nucleus: physiological consequences and cellular correlates. // Regul Pept.-2002.-V.104.-P.97-103.

164. Satinoff E., Rutstein J. Behavioral thermoregulation in rats with anterior hypothalamic lesions. // J Comp Physiol Psychol.-1970.-V.71.-P.77-82.

165. Satinoff E:, Shan S.Y. Loss of behavioral thermoregulation after lateral hypothalamic lesions in rats.// J Comp Physiol Psychol.-1971.-V.77.-P.302-312.

166. Satinoff E. Neural organization and evolution of thermal regulation in mammals. // Science.-1978.-V.201.-P.16-22.

167. Scammell Т.Е., Estabrooke I.V., McCarthy M.T., Chemelli R.M., Yanagisawa M., Miller M.S., and Saper C.B. Hypothalamic arousal regions are activated during modafinil-induced wakefulness. // J Neurosci.-2000.-V.20.-P.8620-8628.

168. Scammel Т.Е. // Current Biology.-2001 .-V.I 1 .-P.R769—R771.

169. Selye H. Thymus and adrenals in the response of the organism to injuries and intoxications. // Br J Exp Pathol.-1936.-V.17.-P:234-248.

170. Senba E., Ueyama T. Stress-induced expression of immediate early genes in the brain and peripheral organs of the rat. // Neurosci Res.-1997.-V.29.-P.183-207.

171. Shanin S.N. Natural killer cell cytotoxic activity and c-Fos protein synthesis in rat hypothalamic cells after painful electric stimulation of the hind limbs and EHF irradiation of the skin. // Med Sci Monit. 2005. - V. 11(9) - P. BR309-315.

172. Sheridan J., Feng N., Bonneau R. et al. // J. Neuroimmunol.-1991.-V.31.-№ 2.-P. 245-255.

173. Sherin J.E., Elmquist J.K., Torrealba F., Saper C.B. Interaction of histaminergic tuberomammillary neurons by GABAergic and galaninergic neurons in the ventrolateral preoptic nucleus of the rat. // J Neurosci.-1998.-V.18.-P.4705—4721.

174. Shibahara M., Sakurai Т., Nambu Т., Takenouchi Т., Iwaasa H., Egashira S.I., Ihara M., and Goto K. Structure, tissue distribution, and pharmacological characterization of Xenopus orexins. // Peptides.-1999.-V.20.-P.1169-1176.

175. Shiraishi Т., Oomura Y., Sasaki K., and Wayner MJ. Effects of leptin and orexin-A on food intake and feeding related hypothalamic neurons. // Physiol Behav.-2000.-V.71 .-P.251-261.

176. Shirasaka Т., Nakazato M., Matsukura S., Takasaki M., and Kannan H. Sympathetic and cardiovascular actions of orexins in conscious rats. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.-1999.-V.277.-P. 1780-1785.

177. Simpkins J.W., Hodson C.A., Meites J. Differential effects of stress on release of thyroid-stimulating hormone in young and old male rats. // Proc Soc Exp Biol Med.-1978.-V.157.-P. 144-147.

178. Slugg R.M., Light A.R. Spinal cord and trigeminal projections to the pontine parabrachial region in the rat as demonstrated with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. //J Comp Neurol.-1994.-V.339.-P.49-61.

179. Stress and immunity. Plotnikoff N. P., Murgo A.//CRC Press.-1991 .-558'p.

180. Suemaru S., Hashimoto K., Ota Z . Brain corticotropin-releasing factor (CRF) and catecholamine responses in acutely stressed rats. // Endocrinol Jpn.-1985 .-V.32.-P.709-718.

181. Swanson L.W.// Brain Maps: Computer Graphics Files. Elsevier Science, Amsterdam. -1992.

182. Sweet D.C., Levine A.S., Billington C.J., and Kotz C.M. Feeding response to central orexins. //BrainRes.-1999.-V821.-P.535-538.

183. Switonska M.M., Kaczmarek P., Malendowicz L.K., and Nowak K.W. Orexins and adipoinsular axis function in the rat. // Regul Pept.- 2002.-V.104.-P.69-73.

184. Sz6kely M., Petervari E., Balasko M., Hernadi I., Uzsoki B. Effects of orexins on energy balance and thermoregulation. // Regul Pept.-2002.-V. 104(1-3) .-P.47-53.

185. Taheri S., Sunter D., Dakin C., Moyes S., Seal L., Gardiner J., Rossi M., Ghatei M., and Bloom S. Diurnal variation in orexin A immunoreactivity and prepro-orexin mRNA in the rat central nervous system. // Neurosci Lett.-2000.-V.279.-P. 109-112.

186. Takahashi N., Okumura Т., Yamada H., and Kohgo Y. Stimulation of gastric acid secretion by centrally administered orexin-A in conscious rats. // Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.254.-P.623-627.

187. Takayama H., Ota Z., Ogawa N. Effect of immobilization stress on neuropeptides and their receptors in rat central nervous system. // Regul Pept.-1986.-V.15.-P.23 9-248.

188. Tanaka M., Tonouchi M., Hosono Т., Nagashima K., Yanase-Fujiwara M., and Kanosue K. Hypothalamic region facilitating shivering in rats. // Jpn J Physiol.-2001 .-V.51 .-P.625-629.

189. Tanaka M., Nishikawa Т., Kohno Y., Nagasaki N., Noda Y., Inanaga K.

190. Hypothermia and gastric lesions in rats exposed to immobilization stress.// i

191. Kurume Med J.-1981.-V.28.-P.247-253.

192. Teague R.S., Ranson S.W. The role of the anterior hypothalamus in temperature regulation. // Am J Physiol.-1936.-V.l 17.-P.562-570.

193. Thoenen H. Induction of tyrosine hydroxylase in peripheral and central adrenergic neurones by cold-exposure of rats. // Nature.-1970.-V.228.-P.861-862.

194. Trivedi P., Yu H., MacNeil D.J., Van der Ploeg L.H., and Guan X.M. Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain. // FEBS Lett.-1998.-V.438.-P.71-75.

195. Van den Pol A.N., Gao X.B., Obrietan K., Kilduff T.S., and Belousov A.B. Presynaptic and postsynaptic actions and modulation of neuroendocrine neurons by a new hypothalamic peptide, hypocretin/orexin. // J Neurosci.-1998.-V. 18 .-P.7962-7971.

196. Van den Pol A.N. Hypothalamic hypocretin (orexin): robust innervation of the spinal cord. // J Neurosci.-1999.-V.19.-P.3171-3182.

197. Weiner H. Behavioral biology of stress and psychosomatic medicine. In: Brown M.R, Koob G.F, Rivier C, eds. Stress. // Neurobiology and neuroendocrinology. New York: Marcel Dekker.-1991.-P.23-51.

198. Wenner M. Reward linked to increased natural killer cell activity in rats. / M. Wenner, N. Kawamura, T. Ishikawa. // Neuroimmuno Modulation. 2000. -V. 7.-P. 1-5.

199. Williams G., Harrold J.A., and Cutler D.J. The hypothalamus and the regulation of energy homeostasis: lifting the lid on a black box. // Proc Nutr Soc.-2000.-V.59.-P.385-396.

200. Willie J.T. To eat or to sleep? Orexin in the regulation of feeding and wakefulness. / J.T. Willie, R.M. Chemelli, C.M. Sinton, M. Yanagisawa. // Annu Rev Neurosci. 2001. - V. 24. - P. 429-458.

201. Wickman, K, and Clapham DE. Ion channel regulation by G proteins. // Physiol Rev.-1995.-V.75.-P.865-885.

202. Wrona D. Chronic electrical stimulation of the lateral hypothalamus increases natural Killer cell cytotoxicity in rats / D. Wrona, W. Trojniar. // J. of Neuroscience. -2000. V. 20(17). - P. 6578-6586.

203. Yamada H., Okumura Т., Motomura W., Kobayashi Y., and Kohgo Y. Inhibition of food intake by central injection of anti-orexin antibody in fasted rats. //Biochem Biophys Res Commun.-2000.-V.267.-P.527-531.

204. Yamanaka A., Tsujino N., Funahashi H., Honda K, Guan J.L., Wang Q.P., Tominaga M., Goto K, Shioda S., and Sakurai T. Orexins activate histaminergic neurons via the orexin 2 receptor. // Biochem Biophys Res Commun.-2002.-V.290.-P. 1237-1245.

205. Yang Y.L. and Lu K.T. Effects of orexin-A on rat thermoregulation: the roles of prostaglandin E2// Proceedings of the Australian Physiological and Pharmacological Society 2008.

206. Yoshimatsu H., Egawa M., and Bray G.A. Sympathetic nerve activity after discrete hypothalamic injections of L-glutamate. // Brain Res.-1993.-V.601.-P.121-128.

207. Yoshimichi Go, Hironobu Yoshimatsu, Takayuki Masaki and Toshiie Sakata. Orexin-A Regulates Body Temperature in Coordination with Arousal // StatusExperimental Biology and Medicine.-2001.-V.226.-P.468-476.

208. Zaretskaia M.V., Zaretsky D.V., Shekhar A., and DiMicco J.A. Chemical Stimulation of the dorsomedial hypothalamus evokes non-shivering thermogenesis in anesthetized rats. // Brain Res.-2002.-V.928.-P.l 13-125.

209. Zhang S. Expression of orexin receptors in the brain and peripheral tissues of the male sheep. / S. Zhang, D. Blache, P.E. Vercoe, C.L. Adam, M.A. Blackberry, P.A. Findlay, K.A. Eidne, G.B. Martin. // Regul Pept. 2005. - V. 124.-P. 81-87.

210. Zhu L., Опака Т., Sakurai Т., Yada T. Activation of orexin neurons after noxious but not conditioned fear stimuli in rat. // Neuroendocrinol.-2002.-V.13 (10).-P.1351-1353.