Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в гипоталамических структурах головного мозга крыс после антигенного воздействия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Носов, Михаил Анатольевич

• Носов, Михаил Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Носов, Михаил Анатольевич

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.взаимодействие нервной и иммунной систем.,.

2.1.1.Влияние разрушения и элекгростимуляции структур головного мозга на протекание иммунологических процессов.

2.1.2. Электрофизиологическое исследование активности гипоталомических структур при антигенном воздействии.

2.2. ГЕН немедленного ответа c-fos.

2.2.1.Экспрессия гена c-fos в ЦНС.

2.2.2.Экспрессия гена c-fos при антигенном воздействии.

2.3.Гумораальные перестройки при иммунизации.

2.4. Ген раннего ответа интерлейкин-2.

2.4.1.0бщие сведения.

2.4.2.ИЛ-2 в ЦНС.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в гипоталамических структурах головного мозга крыс после антигенного воздействия»

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Начало развития работ в области иммунофизиологии может быть отнесено к концу XIX, началу XX века, когда впервые, работами И.Г.Савченко (1891), а затем Е.С.Лондона, (1899) было показано влияние перерезки или удаления частей мозга на течение инфекционного процесса. И только несколько десятилетий спустя появились первые предположения об участии мозга в регуляции иммунологических реакций (Метальников, 1926). С этого момента началось целенаправленное изучение влияния разрушения различных структур мозга на протекание иммунологических реакций.

Так в 1927 году Bogendorfer в опытах на собаках показал, что перерезка спинного мозга в шейном отделе оказывает тормозящее влияние на образование антител. Позднее в более тонких экспериментах Е.А.Корневой и Л.М.Хай, установлено, что локальное электрическое повреждение области заднего гипоталамического поля сопровождается выраженным подавлением продукции антител (Корнева, Хай 1963), а его электростимуляция ведет к увеличению выработки антител (Корнева и др., 1978). Наиболее выраженные изменения фагоцитарной активности наблюдали при электростимуляции задних и средних отделов подбугорья (Thakur & Manchande, 1969; Konar & Manchande, 1970). Таким образом, было установлено влияние разрушения и электростимуляции структур головного мозга на протекание иммунологических процессов.

С 70-х годов началось изучение электрофизиологических изменений в структурах головного мозга в процессе развития иммунологических реакций. Регистрируя количество активных нейронов в треке по наличию нейрональной активности до и после иммунизации БЦЖ Броун с соавторами (1970) обнаружил увеличение числа активных нейронов в области переднего и заднего гипоталамического полей мозга кролика. Анализ нейрональной активности структур гипоталамуса выявил определенную двухволновую динамику: в 1-е -3-е сутки и на 15 сутки после иммунизации кроликов лошадиной сывороткой и эритроцитами барана (Клименко, 1972; Григорьев, 1982; Корнева и др., 1989). Особое внимание исследователей привлекали процессы, развертывающиеся на ранних сроках после введения антигена, т.е. в первые минуты и часы после введения антигена. В большинстве исследованных структур гипоталамуса происходил сдвиг уровня постоянного потенциала не менее чем через 30 минут после введения антигена. В заднем гипоталамическом поле изменения были зарегистрированы уже через 19 минут. Внутривенное введение лошадиного глобулина вызывало значительное отклонение уровня постоянного потенциала гипоталамических структур, причем наиболее отчетливые изменения зарегистрированы в задних гипоталамических полях.

Анализ электрофизиологических характеристик головного мозга позволил выявить структуры, реагирующие на присутствие чужеродного агента в крови.

Однако использованные в подобных экспериментах методы травматичны и ведут к повреждению как исследуемых, так и прилегающих к ним участков мозга. Поэтому полученные результаты сложно трактовать однозначно. Неоспоримым результатом данных работ является подтверждение факта вовлечения структур головного мозга, в первую очередь гипоталамуса, в реализацию иммунных реакций организма в ответ на появление чужеродного агента в крови.

В настоящее время разработан ряд молекулярно-биологических и биохимических методов исследования, позволяющих выявлять отдельные клетки головного мозга, активирующиеся в ответ на различные воздействия. Эти методы основаны на изучении изменения активности экспрессии генов.

Изучая экспрессию генов, можно судить не только об активации клетки, но и о начальных стадиях изменения ее метаболизма, т.е. о реакциях клетки в ответ на определенное воздействие.

Одним из таких маркерных генов активации клеток нервной системы является протоонкоген c-fos (Curran, 1982; Bullitt, 1990; и другие).

Количество клеток, экслрессирующих ген c-fos в норме мало (Curran, 1988), однако, внешние стимулы, такие как: деполяризующие агенты (Morgan and Curran, 1986), сенсорная стимуляция (Hunt et al, 1987), различные виды стресса (иммобилизационный, плавательный, осмотический, гипертонический и др.) (Honkaniemi et al, 1992; Rossi et al, 1995), а также внутрижелудочковые и внутрибрюшинные инъекции различных лекарственных препаратов, хирургическое воздействие, электрический шок, гипоксия, ишемия, введение липополисахарида (Conde et al, 1999) и некоторые др. стимулы, приводят к быстрому кратковременному повышению уровня экспрессии гена c-fos (Bullitt, 1990; Giulia et al, 1986; Guthrie and Gall, 1995; Hata et al, 1998; Muller et al, 1997; Oladehin and Blatteis, 1995).

Существующие данные свидетельствуют о том, что интенсивность, локализация и продолжительность изменений экспрессии гена c-fos в ЦНС зависит от характера стимула, способа воздействия, возраста животного и других условий.

Поскольку сигналом для активации экспрессии гена c-fos служит деполяризация нейронов (Bullitt et al, 1992), логично ожидать активацию этого гена в тех структурах мозга, в которых происходит изменение импульсной активности клеток.

Известно, что продукт гена c-fos - c-Fos белок, входит в состав некоторых транскрипционных факторов (АР-1, NFxb, NF-AT) целого ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2.

Ген ИЛ-2 относится к генам раннего ответа и кодирует белок, известный как фактор роста Т-лимфоцитов и играет важную роль в регуляции иммунологических процессов. ИЛ-2 кроме своих иммунорегуляторных функций, действует также как нейромодулятор (Hanisch, Quirion, 1996).

Данные литературы не дают четкого представления о том, какие именно структуры головного мозга участвуют в реализации реакции организма на антиген, в какой последовательности происходит вовлечение этих структур в ответную реакцию, а также молекулы каких веществ являются молекулами коммуникации между нервной и иммунной системами.

В ряде работ в качестве антигена был использован бактериальный липополисахарид (ЛПС), который вызывает выраженные различные неспецифические реакции организма, в том числе и лихорадку (Rivest &

Laflamme, 1995; Elmquist et al, 1993; Yokoyama and Sasaki, 1999; и др.). Использование столбнячного анатоксина в качестве антигена обладает тем преимуществом, что это - слабый антиген и его введение не вызывает выраженных неспецифических реакций организма.

Работ, посвященных изучению экспрессии гена ИЛ-2 в клетках головного мозга при иммунизации, практически нет, хотя цитокинам отводится первое место в числе претендентов на роль посредников нейроиммуных взаимодействий.

Применение в данной работе метода детекции мРНК (in situ гибридизация) позволяет судить о начальных стадиях реакции клеток нервной системы на антигенное воздействие, проявляющихся в активации экспрессии генов немедленного и раннего ответа c-fos и ИЛ-2.

Таким образом, знание точной локализации структур головного мозга, вовлеченных в реализацию ответа на сигнал, связанный с поступлением антигена в организм, а также анализ молекулярных основ реагирования нейроэндокринной системы на этот сигнал, создает предпосылки для поиска рациональных способов коррекции процессов, происходящих в организме в ходе иммунного ответа. Выяснение локализации структур головного мозга, в которых экспрессируется ген ИЛ-2 при введении антигена представляется особенно важным, поскольку ИЛ-2 является естественным регулятором функций иммунной системы и широко применяется в клинике, в частности, в терапии опухолей.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение динамики процесса активации клеток гипоталамических структур головного мозга крыс в ответ на введение антигена по экспрессии генов немедленного и раннего ответа: c-fos и ИЛ-2.

В задачи работы входило:

1. Исследовать влияние внутривенного введения антигена (столбнячного анатоксина) на экспрессию гена c-fos в гипоталамических структурах головного мозга крыс по синтезу c-fos мРНК.

2. Исследовать влияние внутривенного введения антигена (столбнячного анатоксина) на экспрессию гена ИЛ-2 в гипоталамических структурах головного мозга крыс по синтезу ИЛ-2 мРНК.

3. Провести анализ влияния внутривенного введения антигена (столбнячного анатоксина) на синтез c-Fos белка в гипоталамических структурах головного мозга крыс.

4. Проанализировать пространственно-временную динамику процесса экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 в головном мозге крыс при антигенном воздействии.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Внутривенное введение столбнячного анатоксина приводит к активации экспрессии гена c-fos в структурах гипоталамуса головного мозга крыс (РНА, LHA,DMH, VMH, AHA, PVH), что проявляется индукцией синтеза c-fos мРНК и c-Fos белка в клетках этих структур мозга.

2. Внутривенное введение столбнячного анатоксина приводит к активации экспрессии гена ИЛ-2, выраженное в индукции синтеза ИЛ-2 мРНК в клетках структур гипоталамуса крысы (РНА, DMH, VMH, PVH).

3. Стимуляция экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 в клетках гипоталамуса в ответ на антигенное воздействие характеризуется определенной пространственно-временной динамикой.

Научная новизна работы:

Впервые по экспрессии генов немедленного и раннего ответа: c-fos и ИЛ-2 определены структуры гипоталамуса крыс и установлены пространственно-временные характеристики их активации в ответ на воздействие антигеннного стимула.

Полученные результаты создают предпосылки для поиска путей направленной коррекции функциональной активности клеток нервной системы при нарушениях.

Практическая значимость работы:

Работа является важным этапом в изучении участия экспрессии генов немедленного и раннего ответа в клетках ЦНС в процессе реализации реакции организма на антигенное воздействие.

Реализация результатов исследования:

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов ответа организма на антигенное воздействие, а также регуляции экспрессии индуцибельных генов, и могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии. Полученные данные рационально использовать в фармакологии при разработке иммунокоригирующих препаратов.

Апробация работы:

Материалы исследования представлены на Российских и Международных Форумах:

Immunorehabilitation, Израиль, май 2000 г.

27th Annual Meeting Society for Neuroscience, 25-30 сентября 1998 г. Ростов, 1998

Семинар по экспрессии генов раннего ответа в клетках мозга, Рокфеллерский Ун-т, Нью-Йорк, США, апрель 2000 г.

III Съезд иммунологов и аллергологов СНГ, Сочи-Дагомыс, Россия, 16-20 сент.2000 г.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Носов, Михаил Анатольевич

6.ВЫВОДЫ

1. Внутривенное введение столбнячного анатоксина приводит к увеличению с-fos мРНК содержапщх клеток через 30 минут после воздействия только в DMH головного мозга крыс (2,6±0,7);

2. Через 2 часа после в/в введения столбнячного анатоксина наблюдается увеличение c-fos мРНК содержащих клеток в РНА (36,6±12), LHA(51,6±17,1), DMH (41,6±7,8), VMH (13,0±4,0) и AHA (4,5±0,3) головного мозга крыс;

3. Количество c-fos мРНК содержащих клеток через 6 часов после внутривенного введения столбнячного анатоксина составляет: в РНА -14,7±4,1; LHA - 33,2±20,0; VMH - 13,8±5,0; AHA - 27.0±2,0; PVH - 22,5+2,5;

4. Через 2 часа после внутривенного введения столбнячного анатоксина количество клеток экспрессирующих c-Fos-подобные белки возрастает в РНА (20,0 ±13,2), LHA (12,0±7,1), DMH (8,5±2,1), VMH (25,1±13,2) и AHA (8,6±4,3) головного мозга крыс;

5. Внутривенное введение столбнячного анатоксина приводит к увеличению количества c-Fos-иммунореакгивных клеток в LHA (11,8±2,3), VMH (24,8±4,1), AHA (17,3±5,2), PVH (8,5±4,9) головного мозга крыс через 6 часов после воздействия;

6. Количество ИЛ-2 мРНК содержащих клеток через 2 часа после внутривенного введения столбнячного анатоксина возрастает в РНА (5,3±1,6), DMH (3,0+0,6) и VMH (5,3+1,7) головного мозга крыс;

7. Через 6 часов после в/в введения столбнячного анатоксина зарегистрировано увеличение количества ИЛ-2 мРНК содержащих клеток только в PVH (9,7±4,2) головного мозга крыс;

8. Через 16 часов после в/в введения столбнячного анатоксина во всех исследуемых структурах количество c-fos мРНК, c-Fos и ИЛ-2 мРНК содержащих клеток, не отличается от количества таких клеток у интактных животных.

9. Определенные структуры гипоталамуса характеризуются сходной временной динамикой активации синтеза c-fos мРНК, c-Fos подобного белка и ИЛ-2

96 мРНК. Через 2 часа наблюдается максимум активации клеток в РНА, DMH и VMH, через 6 часов - bPVH.

10. Сравнительный анализ экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 через 2 часа после антигенного воздействия выявил, что интенсивность активации экспрессии с-fos мРНК, c-Fos подобного белка и ИЛ-2 мРНК в структурах гипоталамуса различна, что выражено в меньшем количестве ИЛ-2 мРНК содержащих клеток по сравнению с количеством c-fos мРНК содержащих (РНА - в 8, DMH - в 13, VMH - в 3 раза) и c-Fos -иммунореактивных клеток (РНА - в 4, DMH - в 3, VMH - в 5 раз). А так же в меньшем количестве c-Fos и м м у но р с а к т и в н ы х клеток по сравнению с количеством c-fos мРНК содержащих клеток (исключение составляют клетки VMH, где наблюдается большее количество c-Fos -иммунореактивных клеток).

Заключение

Многочисленными исследованиями подтверждена тесная взаимосвязь функционирования нервной и иммунной систем. Известно, что биологически активные вещества, вырабатываемые одной из систем, оказывают влияние на функциональное состояние другой (Blalock, 1984; Smith & Blalock, 1986). Показано присутствие рецепторов к белкам иммунной системы на поверхности клеток нервной системы и наоборот. Доказано, что антигенное воздействие приводит к активации различных структур головного мозга, причем характер реакции зависит от вида иммуногена, возраста и состояния животного (Корнева и др, 1989; Besedovsky, 1977; Григорьев, 1982; Saphier, 1987 и др.). Повреждение определенных участков головного мозга приводит к угнетению функций иммунной системы ( Корнева, Хай, 1963; Корнева, 1964; Корнева, Потин, 1970; Nance, 1987). Известен временной интервал реакции ЦНС на антигенное воздействие. Продемонстрировано, что в ЦНС в первую очередь реагируют на введение антигена структуры гипоталамуса (Корнева и др., 1989; Besedovsky, 1977; Григорьев, 1982; Rivest & Laflamme, 1995).

Тем не менее, данные литературы не позволяют создать четкое представление о том, какие именно структуры головного мозга и в какой последовательности вовлечены в ответную реакцию организма на антиген на генном уровне, а также принимает ли ген ИЛ-2 участие в этом процессе.

Попыткой дать ответ на перечисленные вопросы и является настоящая работа.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Экспериментальные животные и схема эксперимента.

В работе использовались крысы самцы линии Sprague-Dawley весом 275300 грамм. Крысы содержались в пластиковых клетках по 6 животных при постоянной температуре (21±2 гр. С) и 12 часовом световом дне и имели неограниченный доступ к воде и пище.

Работа проведена на 36 крысах, по 4 животных на каждый вариант эксперимента. Животных брали в эксперимент в одно и то же время суток (препараты вводили в 11.00 утра). В качестве антигена использовали столбнячный анатоксин в дозе 200 мкг/кг веса в 250 мкл. физиологического раствора (титр антител был равен 4). В качестве контрольных использовали интактных животных и животных, получивших инъекцию апирогенного физиологического раствора (250 мкл).

Через фиксированное время (30 минут, 2 часа, 6 часов, 16 часов) после внутривенного введения столбнячного анатоксина или апирогенного физиологического раствора (АФР) в хвостовую вену крысы животным вводили нембутал (60 мг/кг веса). После того, как животное засыпало, вскрывали грудную клетку и проводили перфузию теплым физиологическим раствором с гепарином (10 ЕД/мл) через аорту со скоростью протекания 10-15 мл/мин. Затем вели перфузию фиксирующим раствором (4% параформальдегид на lxPBS (130 мМ NaCl, 10 мМ фосфатный буфер РН 7,4)).

3.2.0пределение содержания c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках тканей головного мозга крыс методом in situ гибридизации.

3.2.1 Получение меченых ДНК-зондов.

3.2.1.1 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, содержащей кДНК ИЛ-2 или кДНК v-fos.

В данной работе использовали клетки E.coli (штамм НВ 101), трансформированные рекомбинантными ДНК плазмид рАА1213 и pPL32, содержащими полноразмерные копии кДНК гена ИЛ-2 человека длиной 550 п.н., или плазмиды pUC, содержащей копию кДНК v-fos, вирусного аналога протоонкогена c-fos.

Трансформацию E.coli плазмидной ДНК осуществляли следующим образом. Для получения компетентных клеток 1 мл ночной культуры вносили в 100 мл среды LB и выращивали при 37°С с интенсивным перемешиванием до плотности примерно 5x105 клеток/мл (В 450=0,5); обычно это занимало 3 часа. Культуру охлаждали в течение 10 минут во льду. Осадок клеток получали центрифугированием при 4000 х g в течение 20 минут при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, клетки ресуспендировали в половине начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 тМ СаС12, 10 тМ трис-HCl, рН 8,0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 15 минут. Осажденные клетки, полученные в результате центрифугирования при 4 000 х g, 4°С3 в течение 20 минут, ресуспендировали в 1/15 начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 тМ СаС12, 10 тМ трис-HCl, рН 8,0 и оставляли при 4°С. Максимальная эффективность трансформации клеток достигалась через сутки.

К охлажденным компетентным клеткам в объеме 0,1 мл добавляли 100200 нг плазмидной ДНК, растворенной в ТЕ буфере, размешивали и инкубировали смесь во льду 30 минут. Затем пробы помещали на водяную баню (42°С) на две минуты. В каждую пробу вносили по 1 мл среды LB и инкубировали их 1 час при 37°С.

Нужное количество клеток высеивали на чашки с агаром. Селекцию трансформированных клонов вели на устойчивость к ампициллину (Маниатис и др., 1984).

3.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК из E.coli методом щелочной экстракции.

Для получения больших количеств плазмидной ДНК предварительно производили амплификацию плазмиды в богатой среде. Для этого 0,1 мл ночной культуры E.coli, трансформированной плазмидной ДНК, засевали в 25 мл среды LB с ампициллином (100 мг/мл) и инкубировали при 37°С при интенсивном встряхивании до тех пор, пока культура не достигала поздней логарифмической фазы (D46o=0,6). 25 мл культуры в поздней логарифмической фазе вносили в 500 мл среды LB с ампициллином и инкубировали примерно 2,5 часа при энергичном встряхивании. При достижении 0460=0,4 в культуру вносили раствор хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации 170 мкг/мл, после чего клеточную культуру инкубировали при 37°С и интенсивном встряхивании еще 12-16 часов.

Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 4 000 х g в течение 10 минут при 4 °С и промывали 100 мл охлажденного во льду буфера STE (0,1 М NaCl, 10 mM трис-HCl, рН 7,8, ImM ЭДТА).

Осадок клеток бактерий, полученный из 500 мл культуры, ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозу, 25 мМ трис-HCI рН 8,0, 10 мМ ЭДТА и лизоцим в концентрации 5 мг/мл. Суспензию оставляли на 5 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 20 мл свежеприготовленного раствора, содержащего 0,2 н NaOH и 1% ДДС-Na. Смесь инкубировали на льду 10 минут, затем добавляли 15 мл охлажденного ЗМ ацетата натрия, смесь снова инкубировали на льду в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 20 000 об/мин в течение 20 минут при 4°С. К надосадочной жидкости добавляли 0,6 исходного объема изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 15 минут. При этом наблюдали помутнение жидкости. Осадок, полученный в результате последующего центрифугирования надосадочной жидкости при 12 000 х g в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом и растворяли в 5 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА). Для очистки плазмидной ДНК проводили равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием. К каждому мл раствора ДНК добавляли 1 г сухого хлористого цезия и перемешивали до полного растворения соли. На каждые 10 мл раствора с хлористым цезием добавляли 0,8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Конечная плотность раствора при этом составляла 1,55 г/мл, а концентрация бромистого этидия была 600 мкг/мл. Градиент плотности устанавливали центрифугированием при 36 ООО об/мин в течение 36 часов в роторе Ti-50 на ультрацентрифуге "Spinco" В-65 при температуре 15°С. ДНК очищали от бромистого этидия экстракцией равным объемом изопропанола. Смесь энергично встряхивали и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3-х минут при комнатной температуре. Затем отбирали нижнюю водную фазу в чистую пробирку. Экстракцию повторяли несколько раз, пока не исчезала розовая окраска у водной фазы. ДНК осаждали 70% этанолом при температуре -20°С. Диализ водной фазы проводили против нескольких смен буфера ТЕ рН 8,0.

Очищенную ДНК анализировали электрофоретически, при необходимости доводили концентрацию до желаемой осаждением спиртом и растворением в требуемом объеме буфера ТЕ (Маниатис и др., 1984).

3.2.1.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами.

Реакционная смесь приводится в расчете на 1 мкг ДНК. К раствору ДНК в стерильной пробирке типа "Эппендорф" добавляли деионизованную воду до объема 18 мкл и 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной концентрации. Затем вносили 1 ед. рестриктазы и тщательно перемешивали. Смесь инкубировали при 37°С в течение 2-6 часов в зависимости от количества ДНК. Реакцию останавливали добавлением 0,5М ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Необходимые фрагменты ДНК получали рестрицированием плазмид рАА1213-ИЛ-2 и плазмиды рРЬ32-ИЛ-2 по сайтам BamHI и SalGI а также плазмиды pUC-v-fos по сайтам Pstl.

BamHI реакцию проводили в буфере, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМтрис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ. Для рестриктазы SalGI буфер имел следующий состав: 1 00 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCb и 1 мМ ДТТ (Маниатис и др., 1984).

При расщеплении плазмиды pUC-v-fos, содержащей вирусную копию протоонкогена c-fos, рестрикцию вели рестриктазой Pstl в буфере, содержащем 50мМ Трис-HCl рН 7,5; ЮмМ MgCl2H 1мМ ДТТ.

Рестрикционные фрагменты ДНК анализировали электрофоретически в агарозном геле.

3.2.1.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 0,8% агарозе ("Sigma") в буфере, содержащем 40 мМ трис-ацетат рН 7,8 и 2 мМ ЭДТА на горизонтальных пластинах размером 8,5 х 12,5 см, при силе тока 25 мкА до вхождения образца в гель и, в дальнейшем, при 40 мкА. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в электрофоретическом буфере (Маниатис и др., 1984).

3.2.1.5. Выделение фрагментов ДНК из лекгоплавкой агарозы.

После обработки плазмид рАА1213-ИЛ2, рР132-ИЛ-2 и pUCv-fos рестриктазами, и предварительного пробного электрофореза, смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в 1% легкоплавкой агарозе (Sigma). В растворенную легкоплавкую агарозу добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Гель заливали в электрофорезную плату и остужали при 4°С. После нанесения проб проводили электрофорез при 4°С, чтобы гель не расплавился во время разделения. Расположение фрагментов ДНК определяли в ультрафиолетовом свете. Кусочки геля, содержащие необходимые фрагменты ДНК, вырезали, помещали в пробирки и заливали пятью объемами 20 мМ трис-НС1 рН 8,0, 1 мМ ЭДТА. Смесь прогревали при 65°С 5 минут. Пробу с расплавленным гелем экстрагировали равным объемом фенола при комнатной температуре. Водную фазу, содержащую ДНК, собирали после центрифугирования и повторяли фенольную экстракцию 4-5 раз. Затем собранную водную фазу экстрагировали смесью фенол: хлороформ (1:1) дважды и хлороформом 1 раз. Для осаждения ДНК к полученной водной фазе прибавляли 3 исходных объема этанола и 1/10 исходного объема ацетата калия. Смесь помещали при -20°С на ночь (Маниатис и др., 1984). После осаждения центрифугированием при 10 000 х g в течение часа фрагменты кДНК метили дигоксигенином.

3.2.1.6. Нерадиактивное мечение кДНК-фрагментов дигоксигенином.

Мечение фрагментов кДНК производили при помощи дигоксигенинового кита фирмы "Boehringer Mannheim".

Основной принцип нерадиактивного мечения состоит в том, что двухцепочечный фрагмент ДНК денатурируется в растворе, а затем по одноцепочечной нуклеотидной последовательности достраивается вторая цепь. При этом происходит внедрение в случайные места дУТФ, меченных дигоксигенином. Стероидный растительный гормон дигоксигенин присоединяется к дУТФ при помощи "спейсерной ножки" с образованием DIG-дУТФ. После специфической гибридизации кДНК с белками или мРНК гибриды фиксируются с использованием антитело-коньюгата, представляющего собой антитела к дигоксигенину с пришитыми к ним гаптеновым комплексом щелочной фосфатазы, которая участвует в реакции окрашивания. Катализируемая ферментом цветная реакция, происходит с участием 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (Х-фосфата) и нитросиней тетразолиевой соли (NBT).

Процедура мечения состояла в следующем: 1 мкг фрагмента ДНК, полученного после рестрикции эндонуклеазами и выделенного из легкоплавкой агарозы, растворяли в 5 мкл стерильной деионизованной воды и денатурировали прогреванием при 95°С в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением, вызванным помещением пробирки в кювету со льдом на 5 минут. Затем к денатурированной ДНК добавляли 2 мкл 10-кратного гексануклеотидного буфера, 2 мкл смеси дезоксинуклеотидов, содержащей короткий праймер с произвольной нуклеотидной последовательностью, 1 мМ дАТФ, 1 мМ дЦТФ, 1 мМ дГТФ, 0,65 мМ дТТФ, 0,35 мМ DIG-дУТФ рН 7,5; доводили объем смеси до 19 мкл стерильной деионизованной водой, после чего вносили 1 мкл (2 ед.) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Описанную процедуру проводили на льду. Затем смесь инкубировали около 20 часов при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,2 М ЭДТА. dig*i^HK преципитировали внесением 2,5 мкл 4М LiCl и 75 мкл предварительно охлажденного этанола. Для эффективного осаждения с%*кДНК пробирку оставляли на ночь при -20°С. Осадок меченой ДНК получали центрифугированием при 10 ООО х g в течение 1 часа при 4°С, промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ.

3.2.2.Приготовление срезов головного мозга.

Выделение головного мозга производили через 1 час после перфузии Мозг помещали в 4% параформальдегид на lxPBS и оставляли на ночь при 4°С. Далее ткань отмывали в lxPBS и дегидрировали, проводя, через градиент спиртов: 50% (2 ч.), 70% (12 ч.), 90% (3 ч.), 100% (1.5 ч.) х2, затем удаляли липиды хлороформом (2 ч.) х2. После этого, ткань помещали в парафин (1 ч., 60 С) после чего заливали новым парафином.

Срезы толщиной 5 микрометров приготавливали на микротоме и монтировали на стекла предварительно обработанные 3-аминопропилтритоксиланом.

3.2.3. Ги бридизация c-fos и ИЛ-2 мРНК -dig кДНК.

Далее, проводили обеспарафинивание срезов и регидратацию в градиенте этанола: орто-ксилол (30 мин. 60° С), свежий орто-ксилол (5 мин. 20° С), этанол (99% 2 раза, 96% 2 раза, 70% 1 раз и в воде 1 раз по 5 мин.). Срезы обрабатывали протеиназой К 15 мин при 37° С (10мкг/мл в 50мМ Трис НС1, рН 7,5; ЮмМ ЭДТА; ЮмМ NaCl) и фиксировали 0,4% параформальдегидом на lxPBS 5 мин. Для удаления излишка фиксатора срезы промывали 5 мин в стерильной воде. Гибридизацию проводили на покрытых стеклах в течение 3 часов при 37°С во влажной камере, распределяя на каждый срез по 10-15 мкл гибридизационного буфера: 10 мкл. 50х раствора Денхарта (1% поливинилхлорид, 1% пирролидон, 2% БСА), 50 мкл. 50% декстран сульфата, 10 мкл. денатурированной фрагментированной ДНК тимуса теленка (10 мгр/мл.), 100 мкл. 20xSSC, 500 нг денатурированной v-fos, кДНК меченой дегоксигенином в буфере ТЕ, 250 мкл. формамида, дистиллированная вода до 500 мкл. В качестве негативного контроля срезы инкубировали в гибридизационном буфере, не содержащим меченый ДНК зонд. После гибридизации покровное стекло удаляли и срезы отмывали 2 раза в 2xSSC по 5 мин при комнатной температуре и в 0,lxSSC 10 мин при 42° С.

3.2.4. Иммунодетекц и я комплекса сИд*кДНК- мРНК.

Срезы промывали буфером 1 (ЮОмМ Трис-HCl рН 7,5; 150мМ NaCl) 1 мин и 20 мин в буфере 2 (0,5% блокирующий реагент в буфере 1). После быстрой промывки в буфере 1, срезы инкубировали 1 час с антителами против дигоксигенина, разведенными в 500 раз на буфере 2. В качестве негативного контроля срезы инкубировали буфере 2 без антител против дигоксигенина. После чего срезы отмывали 2 раза по 15 мин буфером 1 и 2 мин буфером 3 (ЮОмМ Трис-HCl; ЮОмМ NaCl; 50mM MgCl2 рН 9,5). Срезы инкубировали в 100 мкл красящего раствора в темноте в течение ночи, отмывали буфером ТЕ (ЮОмМ Трис-HCl рН8,0; 1мМ ЭДТА рН8,0) и заключали под покровные стекла с желатин-глицериновой смесью. Для подсчета меченых клеток использовали систему анализа видео изображения Иста-Видио-Тест (JIOMO), которая позволяет получить качественное изображение препарата среза головного мозга и автоматически определяет количество меченых клеток на заданную площадь.

Достоверность различия определяли по t-зависимому критерию Стьюдента.

3.3. Иммунохимическое выявление c-Fos в тканях головного мозга.

Получение срезов головного мозга проводилось также как и в предыдущих экспериментах.

Срезы отмывали в 0,1 М PBS (рН 7.4) при комнатной температуре 3 раза по 5 минут от излишка фиксажа и инкубировали их в растворе содежащем 10% телячью сыворотку на PBS и 0,4% тритон Х-100 около 1 часа. Отмывали PBS 3 раза по 5 минут и инкубировали с c-Fos антителами 2 суток при 4°С. Затем, после отмывки, инкубировали с вторичными антителами 1-2 часа, опять промывали и окрашивали 5-15 минут в растворе 0,02% диаминбензидина (DAB) на трис-буфере (5 мМ трис НС1 рН 7,4) с 0,001% Н202.

41

Далее срезы промывали, монтировали на стеклах (предварительно обработанных раствором желатина с хром-алюминевыми квасцами) и приготавливали постоянные препараты, покрывая канадским бальзамом.

3.4. Статистическая обработка результатов.

Данные, представленные в разделе "Результаты исследования" являются результатами 4-5 экспериментов, каждое определение проводилось в 3-4 повторах. Результаты экспериментов обрабатывали используя стандартные методы вариационной статистики.

Графики выполнены на IBM PC при помощи программы Excel, схемы головного мозга с помощью программы Corel Drow9 с использованием компьютерных карт Brain Maps (Swanson, 1992), анализ распределения метки в клетках головного мозга проводили с помощью системы ИстаВидеоТест 4.0.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Носов, Михаил Анатольевич, 2001 год

1. Адо А.Д. Антигены как чрезвычайные раздражители нервной системы,- М., 1951,- 201 с.

2. Барабанова С.В., Головко О.И., Новикова Н.С., Носов М.А., Корнева Е.А., Казакова Т.Б. Влияние стресса на экспрессию индуцибельных генов c-fos и ИЛ-2 в клетках нервной и иммунной систем// Нейрохимия.-1998.-Т. 15.-N4.-С.380-387.

3. Броун Г.Р. О характеристике функционального состояния некоторых структур гипоталамуса при экспер туберкулезе. Автореферат дис. . канд. мед. наук. Л., 1969, 19 с.

4. Броун Г.Р., Могутов С.С., Кан Г.С. Роль некоторых структур гипоталамуса в регуляции иммунобиологических процессов при иммунизации организма вакциной БЦЖ. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1970. Т.70. №7. С.74-78.

5. Воробьев А.А., Васильев Н.Н., Кравченко А.Т. Анатоксины. М: Медицина. 1965.

6. Григорьев В. А. Динамика уровня постоянного потенциала гипоталамических структур кроликов в процессе развития иммунных реакций. : Автореф. дис. канд. мед. наук. Л., 1982, 24 с.

7. Ю.Григорьев В.А. Влияние экспериментальной модуляции функционального состояния гипоталамуса на развитие иммунного ответа // Физиол. журнал СССР, 1990. -Т.76. -№10. -С. 1449-1458.

8. Девойно Л.В. Пути реализации регуляторного влияния серононинергической системы на иммунные реакции //Физиология иммунного гомеостаза: Тезисы докл. На II Всесоюзн. Симпоз. Ростов-на-Дону, 1977. С.59-60.

9. Зотова В.В. К вопросу о роли гипоталамической области в формировании некоторых иммунологических реакций: Автореф.дис. .канд.мед.наук Донецк, 1968, 24 с.

10. Клименко В.М. Изучение некоторых нейрональных механизмов гипоталамической регуляции иммунологических реакций у кроликов. Дисс. . канд. мед. наук. Л., 1972.170 с.

11. Клименко В.М. К вопросу об анализе длительно текущих нервных процессов в гипоталамусе // Тез. докл. III Всесоюз.конф. по физиологии вегетативной нервной системы. Ереван. 1971. - С. 105.

12. Клименко В.М., Миславская Н.С. Метод количественной оценки изменений возбудимости структур мозга при длительно текущих реакциях. //Применение мат. Методов и ЭВМ в медико-биол. Исследованиях.: Тез. Всесоюзн. симпоз. 4 1. Л., 1982, с. 63-65.

13. Корнева Е.А. О влиянии локального разрушения структур заднего гипоталамуса на интенсивность синтеза белков крови и органов у кроликов// Физиол.журн. СССР. 1969. -Т.55, -№1.- С.93-98.

14. Корнева Е.А. О подкорковой регуляции иммунологических процессов. // Очерки эволюции нервной деятельности. Л., 1964. -С. 102-103.

15. Корнева Е.А., Григорьев В.А., Клименко В.М., Столяров И.Д. Электрофизиологические феномены головного мозга при иммунных реакциях. Наука, Ленинград, 1989.

16. Корнева Е.А., Клименко В.М., ШхинекЭ. К. Нейрогуморальное обеспечение иммунного гомеостаза. Л.: Наука, 1978,- 175 с.

17. Корнева Е.А., Потин В.В. Влияние повреждения ядер заднего гипоталамуса на тиреотропную и экзофтальмическую активность гипофиза кроликов // Физиол.журнал. СССР, 1970. -Т.56.-№2. -С. 159-163.

18. Корнева Е.А., Хай Л.М. Влияние разрушения участков гипоталамической области на процесс иммуногенеза. //Физиологический журн.СССР, 1963,Т.49, №1, С.42-48.

19. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л., 1988. 251 с.

20. Курашвилли В.Е. Экспериментальное изучение патогенеза гриппа и формирования противогриппозного иммунитета: Дис.д-ра мед. Наук Л.: Тбилиси, 1965, 555 с.

21. Лесников В.А. , Каничка Б., Фекете М. Уровень катехоламинов в гипоталамусе и гормональные реакции крыс на ранних сроках после иммунизации// Нейрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза: Тез. Всес. симп. Л., 1986, с.47-48.

22. Лесников В.А., Аджиева С.Б. Влияние бутироксана и фенамина на миграцию стволовых кроветворных клеток // Бюлл.эксперим. биологии и медицины. 1985, №8.-С.159.

23. Лесникова М.П. , Шхинек Э.К. Влияние глюкокортикоидных гормонов на реакции циклазных систем клеток селезенки, вызванные антигеном, у крыс и мышей//Физиол. журнал СССР. 1986. -Т.72. -№2. -С.214-220.

24. Лондон Е.С. О влиянии удаления различных частей головного мозга на иммунитет сибирской язвы.//Арх.биол.наук. 1899, Т.7, с. 177-187.

25. Магаева С.В. Об участии гиппокампа в регуляции иммунологических реакций // Материалы 3-й научн. конф. патофизиологов Сев. Кавказа. Ростов-на-Дону, 1969.-С. 152-154.

26. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир. 1984.

27. Марцинкевич JT. Д. Лимфоидные органы в условиях разрушения гипоталамических ядер. // Физиология иммунного гомеостаза: Тез.Всесоюзн. симпоз. Ростов-на-Дону, 1977. -С.27-28.

28. Михайлов В.А., Соловьева В.Я. Об участии центров заднего гипоталамуса в механизме отторжения гомотрансплантантов кожи. // Бюлл. Эксперим. биологии и медицины. 1968. -Т.66. -66. -№9. - С.37-40.

29. Моренков Э.С. Нервная регуляция иммунитета// Материалы научн. студ. конф. Рост.гос.ун-та, посвящ. 40-летию ВЛКСМ. Ростов-на-Дону. -1959. -С.64-72.

30. Петров Р.В. Иммунология. М., 1982,368 с.

31. Петровский И.П. Вопросы нервной регуляции реакций иммунитета// Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. —1961. -Т.32. -№7ю -С. 103108.

32. Плецитый Д.Ф., Магаева С.В. О регуляции иммуногенеза структурами гиппокампа//ДАН СССР. 1970. -Т. 194. -№1. -С.232-233.

33. Сааков Б.А., Поляк А.И., Зотова В.В. Некоторые аспекты центральной регуляции иммуногенеза. Сообщение 1// Журн. Микробиол., эпидемиол., и иммунологии. -1971. -Т.42. -№4. -С. 103-110.

34. Савченко И.Г. К вопросу о невосприимчивости к сибирской язве.// Врач. 1891, №5, с. 132-134.

35. Фролов Е.П. Нейрогуморальные механизмы регуляции иммунологических процессов. М., 1974. 264 с.

36. Шхинек Э.К. , Корнева Е.А., Штарк Э., Ач Ж., Абвари К., Салаи К., Фиок Я. Глюкокортикоидные гормоны и иммунный ответ// Физиол.журн. СССР им.И.М.Сеченова.-1984. -Т.70. -№2. -С.213-220.

37. Angel P., Imagama М., Chin R. et al. Phorbl ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor.// Cell. -1987. -V.49. -P.729-739.

38. Araujo D.M., Lapchak P.A.,Collier В., Quirion R. Localization of interleukin-2 immunoreactivity and interleukin-2 receptors in the rat brain: Interaction with the cholinergic system.//Brain Res.-1989.-Y.498.-P.257-266.

39. Araujo D.M., Lapchak P.A.,Collier В., Quirion R. Localization of interleukin-2 immunoreactivity and interleukin-2 receptors in the rat brain: Interaction with the cholinergic system.//Brain Res.-1989.-V.498.-P.257-266.

40. Awatsuji H., Furukawa Y, Nakajima M, Furukawa S, and Hayashi K. Interleukin-2 as a neurotrophic factor for supporting the survival of neurons cultured from various regions of fetal rat brain. //J Neurosci.Res. 1993. V.35. - P.305-311.

41. Bading H., Ginty D.D., Greenberg M.E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. //Science.-N.260,-P.181-186.

42. Banks W.A., Kastin A.J., Broadwell R.D. Passage citokines across the dlood-brain barrier. Neuroimmunomodulation. 2(4):241-248. 1995.

43. Bartholomew S.A., Hoffinan S.A. Effects of peripheral cytokine injections on multiple unit activity in the anterior hypothalamic area of the mouse.//Brain Behav.Immun. 1993. -V.7. -P.301-316.

44. Barve S.S., Cohen D.A., De Benedetti A., Rhoads R.E., Kaplan A.M. //Immunol.-1994.-V.152.-N.3.-P. 1171-1181.

45. Bellavance L. & Beitz A. Altered c-fos expression in the parabrachial nucleous in a rodent model of cfa- induced peripheral inflammation // J. of comparative neurology, 1996.- V.336.- P.431-447.

46. Benveniste E.N., Merrill J.E. Stimulation of oligodendroglial proliferation and maturation by interleukin-2.//Nature.-1986.-V.321.-P.610-613.

47. Berkendosch F., De Goeij D.E., del Rey A., Besedovsky H.O. Neuroendocrine, sympathetic and metabplic responses induced by interleukin-1. //Neuroendocrinology. V.50. P-570-576.

48. Besedovsky H.O. Network of immune neuroendocrine interaction.// Clin. Exp. Immunol. - 1977,- V. 27,- P. 1-12.

49. Besedovsky H.O. and del Rey A. Immune-neuroendocrine circuits: integrative role of cytokines.//Front.Neuroendocrinol. 1992. -V.13. -P.61-94.

50. Besedovsky H.O., del Rey A., Da Prada M., Keller H.H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system // Cell.Immunol. -1979. -V.48. -P.346-155.

51. Bindoni M., Perciavalle V., Berretta S., Belluardo N., Diamanstein T. Interleukin-2 modifies the bioelectric activity of some neurosecretory nuclei in the rat hypothalamus.//Brain Res.-1988.-V.462.-P. 10-14.

52. Blalock J.E. The immune system as sensory organ.//J.Immunol.-1984.-V.132.-P. 1067-1070.

53. Blalock J.E., Smith E.M. A complete regulatory loop between the immune and neuroendocrine systems.// Fed.Proc. -1985. -Vol.44. P. 108-111.

54. Bogendorfer L. Uber den Einflub des Zentralnervensystems auf Immunitatsvorgange. II. Mitt.// Arch. Exp. Path.Parmacol. 1927. Bd. 24. S.378-380.

55. Bohman D., Bos Т., Admon A., Nishimura Т., Vogt P., Tjian R. Human proto-oncogene c-jun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1. //Science. -1987. -V.232. -P. 1386-1392.

56. Bonaz В., Tach Y. Water-avoidance stress-induced c-fos expression in the rat brain and stimulation of fecal output: role of corticotropin-realising factor. //Brain Res.-1994.-V.641.-N.21.-P.21-29.

57. Brandhuber B.J., Boone Т., Kenney W.C., McKay D.B. Three-demensional structure of interleukin-2.//Science. 1987. -V.238. -P.1707-1709.

58. Bullitt E. Expression of c-Fos-like protein as a marker for Neuronal Activity following noxious stimulation in the rat. //The J. of Comparative Neurol. 1990. N.296. P.517-530.

59. Bullitt, E., Lee, Ch. L., Right, A.R. and Willcockson, H. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord.// Brain Res.-1992.-V.580.-P. 172-179.

60. Cerretti.D.P., Kereghan K., Larsen A. et al. Cloning, siguence, and expression of bovine interleukin-2.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1986.-V.83. -P.3223-2227.

61. Chen J., Kelz M.B., Hope B.T., Nakabeppu Y., Nestler E J. Chronic Fos-related antigens : stable variants of delta FosB induced in brain by chronic treatments. //J.Neurosci. 1997. -V.17. -P.4933-4941.

62. Chiu R., Boyle W.J., Meek J., Smeal Т., Hunter Т., Karin M. The c-fos protein interacts with c-jun/AP-1 to stimulate transcription of AP-1 responsive genes.//Cell. -1988. -V.54. -P.541-552.

63. Conde G.L., Renshaw D., Zubelewicz В., Lightman S.L., Harbuz M.S. Central

64. S-induced c-fos expression in the PVN and A1/A2 branstem noradrenergic cell groups is altered by adrenalectomy. Neuroendocrinology. 70(3): 175-185. 1999.

65. Cullinan W.E., Herman J.P., Battagia D.F., Akil H., Watson J.S.J. Pattern and time course of immediate early gene expression in rat brain following acute stress. // Neuroscience. 1995(a). -V.64. -P.477-505.

66. Curran Т., Franza B.R. Fos and Jun: AP-1 connection.// Cell.- 1988. -V.55. -P.395-397.

67. Curran Т., Miller A., Zokas L. And Verma I. Viral and cellular fos proteins, a comparative analysis.// cell. 1984. -V.36. -P.259-268.

68. Curran Т., Teich N.M. Candidate product of the FBJ murine osteosarcoma virus oncogene: characterization of a 55,000 dalton phosphoprotein.//J. Virol. 1982. -V.42.P. 114-122.

69. Didier M., Roux P., Piechaczyk M., Verrier В., Bockaert J., Pin J.P. Cerebellar granule cell survival and maturation induced by K+ and NMDA correlate with c-fos proto-oncogene expression.//Neurosci.Lett.l989. V.107.P.55-62.

70. Diorio D., Viau V., Meaney M.J. The role of the medial prefrontal cortex (cingulate girus) in the regulation of liypotlialamic-pituitaiy-adrenal responses to stress // The J of Neurosci. -1993. -V.13. -P38-3847.

71. Distel R.J., Ro H.-S, Rosen B.S., Groves D.L., Spiegelman. Nucloprotein complexes that regulate gene expression in adipocyte differentiation: direct participation of c-fos. // Cell. -1987. -V.49. -P.835-844.

72. Dony C., Gruss P. Proto-oncogene c-fos expression in drowth regions of fetal bone and mesodermal web tissue/ZNature. -1987. -V.328.-P.711-714.

73. Dragunow M., Goulding M., Faull R.L., Ralph R., MeeE., Frith R. Induction of c-fos mRNA and protein in neurons and glia after traumatic brain injury: pharmacological characterization.//Expl.Neurol.l990. V.107. P.236-248.

74. Dragunow M., Robertson H.A. Localization and induction of c-Fos protein-like immunoreactive material in the nuclei of adult mammalian neurons. //Brain Res. 1988. V.440.P.252-260.

75. Dragunow M, Peterson M.R., RobertsonH.A. Presence of c-fos like immunoreactivity in the adult rat brain.//Eur.J.Pharmacol. 1987. V. 135.P. 113-114.

76. Du Bow M.S. The detaction and characterization of genetically programmed responses to environmental stress. In: Stress of life, from molecules to man. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. -N-Y. 1998. У.851. P.286-291.

77. Dunn A J., Powell M.L., Meitin C., Small Jr. P. A. Virus infection as a stressor: influenza virus elevates plasma corticosterone and brain concentrations of MHPG and tryptophan //Physiol.Behav. -1989. -V.45. -P.591-594.

78. Eizenberg O., Faber-Elman A., Lotan M. and Schwartz M. Interleukin-2 transcripts in human and rodent brains: possible expression by astrocytes.// J/Neurochem. -1995. -V.64. -P. 1928-1936.

79. Eizenberg O., Faber-Elman A., Lotan M., Schwartz M. Interleukin-2 transcripts in human and rodent brains: possible expression by astrocytes.//J.Neurochem. -1995. -V.64. -P. 1928-1936.

80. Elliot J.F., Lin Y., Mizel S.B. et al. Induction of IL-2 messenger RNA inhibited by cyclosporin A. //Science. -1984. -V.226. -P. 1439-1441.

81. Elmquist J.K., Ackermann M.R., Register K.B., Rimler R.B., Ross L.R., Jacobson C.D. Induction of c-Fos-like immunereactivity in the rat brain following

82. Pasteurella multocida endotoxin administration. //Endocrinology. -1993. -V.133. -P.3054-3057.

83. Elmquist J.K., Saper C.B. Activation of neurons projecting to the paraventricular hypothalamic nucleus by intravenous lipopoly saccharide. //The J. of Compar.Neurology. -1996. -V.374. -P.315-331.

84. Elmquist J.K., Scammell Т.Е., Jacobson C.D., Saper C.B. Distribution of Fos-like immunoreactivity in the rat brain following intravenous lipipolysaccharide administration. //The J. Compar.Neurology. -1996. -Y.371. -P.85-103.

85. Ericsson A., Kovacs K.J., Sawchenko P.E. A functional anatomical analysis of central pathways subserving the effects of interleukin-1 on stress-related neuroendocrine neurons. //J.Neurosci. -1994. -V.14. -P.897-913.

86. Fung M.R., Green W.C. The numan interleukin-2 receptor: insights into subunit structure and growth signal transduction. // Semin.Immunol. -1990. -V.2. -P. 119128.

87. Giulia C., Cirafici A.M., Vecchio G. Induction of the c-fos oncogene by thyrotroic hormone in rat thyroid cells in culture. //Science. 1986. V.233. N.4762. P.458-460

88. Glaser R., Kennedy S., Lafuse W/Р/ et al. Phsychological stress-induced modulation of interleukin-2 production in periferal blood leukocytes.//Arch.Gen.Psychiatry. -1990. -V.47. -P.707-712.

89. Goldstone S.D., Fragonas J.-Ch., Jeitner T.M., Hunt N.H. //Biochim. Biophys. Acta. -1995. -V. 1263 .-N.2.-P. 114-122.

90. Gordon M.A., Cohen J.J., Wilson LB. Muscarinic cholinergic receptors in murine lymphocytes: demonstration by direct binding // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1978. -Vol.75. -N6. -P.2902-2904.

91. Groot J. de , Harris G. Hypothalamic control of the anterior pituitary gland and blood lymphocytes // J. Physiol.-1950.- Vol.11. P.335-346.

92. Guthrie K.M., Gall C.M. Odors incriease Fos in olfactory bulb neurons including dopaminergic cells. //Neuroreport. 1995. V.6. N.16. Р.2145-2149/.

93. Hadden J. Cyclic nucleotides and related mechanisms in immune regulation: a mini review// Immuneregul. Proc. Workshop. Urb ino., 8-10 July, 1981. New York; London., 1983, P.201-230.

94. Hall N.R., Goldstein A.L. Interactions between the CNS and precursor cells of immunity// J.Immunol.- 1980. -Vol.145. -N3. P.223-234.

95. Hall N.R., Goldstein A.L. Neurotransmitters and host defense //Neural modulation of immunity/ Ed.R.Guillemin et al.New York, 1985. P. 143-156.

96. Hanisch U.K., Qurion R. Interleukin-2 as a neuroregulatory cytokine.//Brain Res.Rew. -1996. -V.21. -P.246-284.

97. Hanisch U.K., Rowe W., Sharma S., Meaney MJ. and Qurion R. Hypothalamic-pituitary-adrenal activity during chronic central administration of interleukin-2.//Endocrinology. -1994. -V.135. -P.2465-2472.

98. Hanisch U.K., Seto D., Qurion R. Modulation of hippocampal acetylcholine release: a potent central action of interleukin-2.// Neursci. 1993. -V.13. -P.3368-3374.

99. Harbuz MS, Chalmers J, De Souza L, Lightman SL. Stress-induced activation of CRF and c-fos mRNAs in the paraventricular nucleus are not affected by serotonin depletion.// Brain Res. 1993 Apr 23;609(l-2):167-73.

100. Harbuz MS, Jessop DS. Dissociation between c-fos mRNA in the paraventricular nucleus and corticosterone secretion in rats with adjuvant-induced arthritis. //J Endocrinol. 1999. -V.163. -#1. -P. 107-113.

101. Hata R., Mies G., Wiessner C., Hossmann K.-A. Differential expression of c-fos and hsp72 mRNA in focal cerebral ischemia of mice. //NeuroReport. 1998. N.9. P.27-32.

102. Hatakeyama M, Kawahara A, Mori H, Shibuya H, Taniguchi T. c-fos gene induction by interleukin 2: identification of the critical cytoplasmic regions within the interleukin 2 receptor beta chain. //Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 15;89(6):2022-6.

103. Herrera D.G. and Robertson H.A. Unilateral induction of c-Fos protein in cortex following cortical devascularization. //Brain Res. 1989. V.503. P.205-210.

104. Hinde J., Hammaek S., Gaukema R., Goehler L., Maier S. & Watkins L. Intraperitoneal injections of interleukin-lb induce c-fos immunoreactivity in vagal// Society for neuroscience, 1998,- V.24.

105. Honkaniemi J., Kainu Т., Ceccatelli S., Rechardt L., Hukfelt Т., Pelto-Huikko M. Fos and jun rat central amygdaloid nucleus after stress. //Mol.Neurosci. 1992. N.3. P.849-852.

106. Hunt S.P., Pini A. and Evan G. Induction of c-Fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation.//Nature. 1987,- У.328. P.632-634.

107. Jain A.J, Valge-Archer V.E., Sinskey A.J., Rao A. The AP-1 site at -150 b.p., but not the NF-кВ site, is likely to represent the major target of protein kinase С in the interleukin-2 promoter. //J.Exp.Med. -1992. -У.175. -P.853-862.

108. Jamali A.K., Tramu G. Daily cycle of fos expression within hypothalamic POMC neurons of the male rat. // Brain Res. 1997. V.771. N.l. 45-54.

109. Jianping Wang and Adrian J. Dunn. The role of interleukin-6 in the activation of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis and brain indoleamines by endotoxin and interleukin-1 //Brain Research. -1999. -V.815. -P.337-348.

110. Johnson H.M., Tozres B.A. Immunoregulatory properties of neuroendocrine peptide hormones.//Progr.Allergy. -1988. -V.43. -P.37-67.

111. Jones Т.Н. and Kennedy R.L. Cytokines and hypothalamic-pituitary functions.//Cytokine. -1993. -V.5.-P.531-538.

112. Karanth S. and McCann S.M. Anterior pituitary hormone control by interleukin 2. //Proc.Nat.Acad.Sci.USA. -1991. -V.88. P.2961-2965.

113. Karanth S., Lyson K., McCann S.M. Effects of colinergic agonists and antagonists on interleukin-2 induced corticotropin-releasing hormone release from the mediobasal hypothalamus.//Neuromodulation. -1999. -V.6. P. 168-174.

114. Kasof G.M., Smeyne R.J., Curran Т., Morgan J.I. Developmental expression of Fos-LacZ in the brain of postnatal transgenic rats.//Brain Res. Develop.Br.Res. 1996. V.43. N.l-2. P. 191-197.

115. Kazakova T.B., Barabanova S.V., Novikova N.S., Nosov M.A., Rogers V., Korneva E.A. Induction of c-fos and interleukin-2 genes expression in the central nervous system following stressor stimuli.//Pathophysiology. -2000. -V.7. -P.53-61.

116. Kllimenko V.M. Neural hypothalamic mechanisms in the development of an immune response.//Neurohumoral maintenance of immune homeostasis.Cicago; London, 1985.P.55-98.

117. Koenig J.I. Presence of cytokines in the hypothalamic-pituitary axis.//Progr.Neuroendocrinimmunol. -1991. -V.4. -P. 143-153.

118. Konar D.V., Manchande S.K. Role of hypothalamus in the activity of reticuloendothelial system.// Indian J.Physiol. Pharmacol. 1970. Vol.14. P.23-31.

119. Korneva E.A., Lesnikov V.A. Spleen colony formation of mice at different times after lesioning hypothalamic structures // Neuroimmunomodulation: Proc. 1st Intern. Workshop onNIM. Bethesda. -1985. -P.34-36.

120. Kujubu D.A., Lim R.W., Varnum В., Herschman H.R. Induction of transiently expressed genes in PC12 pheocromocytoma.//Oncogene. -1987. -N.l. -P.257-262.

121. Lanterni-Minet, M., Weil-Fugazza, J., De Pommery, J. and Menetry, D. () Hindbrain structures involved щ pain processing as revealed by the expression of c-Fos and other immediate early gene proteins.// Neurosci.-1994.-V.58.-P.287-298.

122. Lapchak P.A., Arajio D.M., Quirion R.,Beaudet A.: Immunoautoradiographic localization of interleukin-2-like immunoreactivity and interleukin-2 receptors (Tac antigen-like immunoreactivity) in the rat brain.//Neuroscience.-1991.-V.44.-P.173-184.

123. Lavrovsky Y., Mastyugin V., Stoltz R.A., Abraham N.G. Specific inhibition of c-fos proto-oncogene expression by triple-helix-forming oligonucleotides.// J. of Cellular Biochemistry. 1996. N.61. P.301-309.

124. Le W., Mitchel P., Tjian R. Purified transcriptiona factor AP-1 interacts with TPA-inducible enhancer elements.// Cell. -1987. -Y.49. -P.741-752.

125. Maki Y., Bosch T J., Davis C., Starbuck M., Vogt P.K. Avian sarcoma virus 17 carries the jun oncogene. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1987. -V.84. P.-2848-2852

126. Malinski W., Kullberg M., Nordstorm O. et al. Muscarinic receptors and receptor-mediated action on rat thymocytes // J. Neuroimmunol. 1988. -N17. -P.265-274. Marshall C.J. Oncogenes and growth control.//Cell. -1987. -V.49. P.723-725.

127. Martinez-Murillo R., Caro L., Nieto-Sampedro M. Lesion-induced expression of low-affinity nerve growth factor receptor-immunoreactive protein in Purkinje cells of the adult rat.//Neurocsince. -1993. -V.52. -P.587-593.

128. McCann S.M., Karanth S., Kamat A., Les Dees W., Lyson K., Gimeno M. and Rettori V. Induction by cytokines of the pattern of pituitary hormone secretion in infection.// Neuroimmunomodulation. -1994. -Y.l. -P.2-13.

129. McNaughton L.A., Hunt S.P. Regulation of gene expression in astrocytes by excitotory amino acid. // Brain Res.Mol.Brain Res. -1992. -Y.16. -N3-4. -P.621-626.

130. Melia K.R., Ryabinin A.E., Schoroeder R., Bloom F.F., Wilson M.C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.// J.of Neuroscience. 1994. V.14. N.10. P.5929-5938.

131. Merrill J.E. Interleukin-2 effects in the central nervous system. //Ann.NY Acad.Sci. -1990.-V.594.-P. 188-199.

132. Metalnikov S. Role des reflexes condicionels dans l'immunite .//Ann.InstPasteur. Paris. -1926. -V.40. -P.893-900.

133. Minami Y., Kono Т., Yamada K., Kolayashi N., Kawahara A., Perlmutter R.M., Taniguchi T. Association of p561ck, with IL-2 receptor beta chain is critical for the IL-2 induced activation of p561ck. // EMBO J. 1993. -V.12. -N2. -P.759-768.

134. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R.C. Selective in vitro growth of T-lymphocytes from normal human bone marrows.// Science. -1976. -V.193. -РЛ007-1008.

135. Morgan J.I. and Curran T. Role of ion flux in the control of c-fos expression.//Nature. 1986. -V.322. -P.552-555.

136. Muller Y.M., Krauss В., Kaltschmidt C., Baellerle P.A., Rupee R.A. Hypoxia induces c-fos transcription via a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. //J.Bio.Chem. 1997. V.272. N.37. P.23435-23439.

137. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J. and Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc.// Nature.-1984,-V.312.-P.716-720.

138. Naito Y., Fukata J., Tominaga Т., Masui Y., Hirai Y., Murakami N., Tamai S., Mori K., Imura H. Adrenocorticotropic hormone-releasing activities of interleukins in a homologus in vivo sistem.// Biochem.Biophis.Res.Commun. 1989. -У.164. P. 1262-1267.

139. Nance D.M., Rayson D. and Cair R.I. The effects of lessons in the lateral septal and hippoeampal areas on the humoral immune response of adult female rats //Brain Behav. Immunol. 1987. -V.l. -P.292-305.

140. Nelson B.N., Lord J.D., Greenberg P.D. //Nature.-1994.-V.594.-P. 188-199.

141. Niimi M., Sato M., Wada Y., Takahara J., Kawanishi K. Effect of central and continious intravenous injection of interleukin-lb on brain c-fos expression in the rat: involvement of prostaglandins // Neuroimmunomodulation, -1996.- V.3. P. 87-92.

142. Nistico G., De Sarro G. Is interleukin 2 a neuromodulator in the brain? //Trends in Neurosciences. -1991.- Vol. 14.-N.4.-P. 146-150.

143. Okamoto Y., Minamoto S., Shimizu K., Mogami H. and Taniguchi T. Interleukin 2 receptor beta chain expressed in an oligodendroglioma line binds interleukin 2 and delivers growth signal.//Proc.Natl.Acad.Sci. USA. -1990. -V.87. -P.6584-6588

144. Oladehin A., Blatteis C. Lipopolysaecharide induced fos expression in hipothalamic nuclei of neonatal rats.// Neurpimmunomodulation. - 1995,- V.2.-P.282-289.

145. Oladehin A., Blatteis C.M. Lipopolysaccharide-induced Fos expression in Hypothalamic nuclei of neonatal rats. //NeurohnmunoModulation. 1995. V.2. N.5.P.282-289.

146. Petitto-JM; Huang-Z. Molecular cloning of a partial cDNA of the interleukin-2 receptor-beta in normal mouse brain: in situ localization in the hippocampus and expression by neuroblastoma cells.//Brain-Res.-1994.-V.650.-Nl.-P.140-150.

147. Plata Salaman C.R. Immunoregulators in the nervous system.//Neurosci.Biobehav.Rev. -1991. -V.15. -P. 185-215.

148. Raber J. and Bloom F.E.IL-2 induces vasopressin release from hypothalamus and the amigdala: Role of nitric oxide-mediated signaling. //J.Neurosci. 1994. -V.14. -P.6187-6195.

149. Rajotte D, Sadowski HB, Hainan A, Gopalbhai K, Meloche S, Liu L, Krystal G, Hoang T. Contribution of both STAT and SRF/TCF to c-fos promoter activation by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. //Blood. 1996 Oct 15;88(8):2906-16.

150. Reeves R., Spies A.G., Nissen M.S. et al. Molecular cloning of a functional bovine interleukin-2 cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986,- V.83.- P. 32283232.

151. Renaud L.S., Pittman Q.I., Blume H.W. et al. Effects of peptides on central neuronal excitability // Collu system effects of hypothalamic hormones and other peptides. New York. 1979. -P.147-161.

152. Rivest S., Laflamme N. Neuronal activity and neuropeptide gene transcription in the brains of immune-challenged rats.//J.Neuroendocrinol. -1995. -V.7. -N.7. -P.501-525.

153. Rivier C., Vale W., Brown M. In the rat, interleukin-la and P stimulate adrenocoiticotropin and catecholamine release. //Endocrinology. 1989. -V.125. P -3096-3102.

154. Rossi D., Conti A.M.F., De Grada L., Larizza L. Hypertonic stress induces c-fos but not c-jun expression in the human embryonal EUE epithelial cell line. // European J. of Cell Biology. 1995. N.68. P.457-462.

155. Roy S., Chapin R.B., Cain K.J., Charboneau R.G., Ramakrishnan S., Barke R. Morphine inhibits transcriptional activation of IL-2 in Mouse Thymocytes. //Cellular Immunology. -1997. -N. 179.-P. 1-9.

156. Ryder K., Lanahan A. , Perez-Albuerne E., Nathans D. Jun-D: a third member of the jun gene family// Proc. Natl.Acad. Sci.USA. -1989. -V.86. -P. 1500-1503.

157. Sagar S.M., Price K.J., Kasting N.M., Sharp F.R. Anatomic patterns of FOS immunostaining in rat brain following systemic endotoxin administration. //Brain Res. Bull. -1993. -V.36. -P.381-392.

158. Sambucetti L.C. and Curran T. The fos protein complex is associated with DNA isolated nucleic and binds to DNA cellulose.// Science. -1986. -V.234. -P. 1417-1419.

159. Saper C.B. and Breder C.D. The neurological basis of fever. //N.Engl. J.Med.-1984.-V.330. -P. 1880-1886.

160. Saphier D., Abramsky О., Мог G., Ovadia H. Multiunit electrical activity in conscious rats during an immune response// Brain Behav.Immunol. -1987. -V.l. -P.40-51.

161. Saries S.C., Rosenberg S.A., Friedman R.B., Rubin J.T., Barra D., Oldfield E.F. Penetration of recombinant interleukin-2 across the blood-cerebrospinal fluid barrier.//J.Neurosurg. 1988. -V.69. -P.29-34.

162. Sei Y., Vitkovic L., Yokoyama M.M. Cytokines in the central nervous system: regulatory roles in the neuronal function, cell death and repair.// Neuroimmunomodulation.- 1995.- V.2.-P. 121-133.

163. Sepiashvili R.I., Malashkhia Yu.A., Nadareishvili Z.G., Malashkhia V.Yu. Immune system of the brain, neuroAIDS, problem and perspectives (Facts and conceptual position). //Int. J. Immunorehabilitation. -1996. -N.3. -P.11-16.

164. Setoyama C., Frunzio R., Liau G., Mudryj M., B. De Crombrugghe. Transcription activation encoded by the v-fos gene. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1986. -V.83. -P.3213-3217.

165. Sheng M., Greenberg M.E. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system.//Neuron. 1990,- V.4. P.477-485.

166. Sheridan J.F., Feng N., Bonneau R.H. et al. Restraint stress differentially affects anti-viral cellular and humoral immune responses in mice.//J. Neuroimmunol -1991.-V.31.-P.245-255.

167. Shibuya H, Kohu K, Yamada K, Barsoumian EL, Perlmutter RM, Taniguchi T. Functional dissection of p561ck, a protein tyrosine kinase which mediates interleukin-2-induced activation of the c-fos gene.// Mol Cell Biol. 1994 Sep; 14(9):5812-9.

168. Smith E.M., Blalock J.E. A complete regulatory loop between immune and neuroendocrine system.//Enkephalins and endorphins: Stress and immune system. -1986.-P. 119-127.

169. Spangelo B.L., Judd A.M., Isakson P.C., MacLeod R.M. Interleukin-6 stimulates anterior pituitary hormone release in vitro. //Endocrinology. -1989. -V.125. P.575-578.

170. Stagaard M., Balslev Y., Lundberg J.J., Mollgaed K. Microglia in the hypendyma of the rat subcommissural organ following brain lesion with serotonin neurotoxin. //Neurocytol.-1987.-N. 16.-P. 131-142.

171. Swanson L.W. Brain maps computer grafics files. Amsterdam,The Netherlands: Elsevier Sci. B.V., 1992.

172. Szekely A.M., Barbaccia M.L., Costa E. Activation of specific glutamate receptor subtypes increases c-fos proto-oncogene expression in primary cultures ofneonatal rat cerebellar granule cells. I I Neuropharmacology. -1987. -V.26. -N.12. -P.1779-82.

173. Szentivatyi A., Szekely J. Effect of injury and electrical stimulation of hypothalamus on anaphylactic and histamine shock of the gunea pig. A preliminary report// Ann.Allergy. -1956. -V.14. -P.259.

174. Tabibzadeh S. Cytokines and the hypothalamic-pituitary-ovarian-endometrial axis.//Human Reprod. Update. -1994. -V.9. -P.947-967.

175. Taniguchi T. and Minami Y. The IL-2/IL-2 receptor system: A cuirent overview//Cells.-1993. V. 73 .-P. 5.

176. Thakur P.K., Manchande S.K. Hypotalamic influence on the activity of reticuloendotelial system of cat.// Indian J.Physiol. Pharmacol. 1969. Vol.13. P. 10.

177. Triesman R. Transient Accumulation of c-fos RNA following serum stimulation requires a conserved 5'element and c-fos 3'sequences. //Cell. 1985. V.42. P.889-902.

178. Varmus H.E. Oncogenes and transcriptional control.// Science. -1987. -V. 238. -P.1337-1339.

179. Veyrune J., Carillo S., Vie A., Blauchard J. C-fos mRNA instability determinants present within both the coding and the 3' non coding region link the degradation of this nRNA to its translation. Oncogene. 16: 2127-2134, 1995

180. Villemain F., Owens Т.Деппо Т., Beaudet A. Localization of mRNA for interleukin-2 (IL-2) in mouse brain by in situ hybridization.//Soc.Neurosci.Abstr. -1991.-V. 17.-P. 1199.

181. Waguespack P.J., Banks W.A., Kastin A.J. Interleukin-2 does not cross the blood-brain barrier by saturable transport system.//Brain Res.Bull. -1994. -V.34. -P. 103-109.

182. Warren J.L., O'Shea J.J. JAKs and STATs: Biological Implications. //Annu.Rev.Iimmmol. -1998. -V.16. -P.293-322.

183. Weigent D.A. and Blalock J.E. Associtions between the neuroendocrine and immune systems.//J.Leukoc.Biol. -1995. -Y.58. -P. 137-150.

184. Weir M.P., Chaplin M.A., Wallace D.M. et al. Structure-activity relationships of recombinant human interleukin-2.// Biochem.- 1988,- V.27.-P. 6883-6892.

185. Wick G., Hu Y., Schwarz S. and Kroemer G. Immunoendocrine communication via the hypothalamo-pituitary-adrenal axis in autoimmune diseases.//Endocr. Rev. -1993. -V.14. -P.539-563.

186. Wybran J. Enkephalins as molecules of lymphocyte activation and modifiers of the biological response.// Enkephalines and endorphins: Stress and immune system// Ed.N.P.Plotnikoff et al. New York ; London, 1986. P.253-262.

187. Yaseen N.R., Maizel A.L., Wang F., Sharma S.Comparative analysis of NF-AT (nuclear factor of activated Tcells) complex in human T and В lymphocytes.// J. Biol. Chem.~ V.268.- N.19.- P. 14285-14293.

188. Yokoyama C., Sasaki K. Regional expressions of Fos-like immunoreactivity in rat cerebral cortex after stress; restraint and intraperitoneal lipopolysaccharide. // Brain Research. -1999. -V.816. -P.267-275.

189. Zhang P., Hirsch E.C., Damier P., Duyckaerts C., Javoy-Agid F. C-Fos protein-like immunoreactivity: distribution in the human brain and over-expression in the hippocampus of patients with Alzheimer's disease.//Neuroscience. 1992.V.46.P.9-21.