Развитие Bdellovibrio в иммобилизованных бактериальных системах хищник-жертва тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Шорохова, Анна Павловна

• Шорохова, Анна Павловна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шорохова, Анна Павловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений, используемых в диссертации

ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Характеристика бактерий рода Вс1е11оу1Ьгю

ГЛАВА 2. Экология бактерий рода Вёе11оу1Ьпо

2.1. Распространение бделловибрионов в природе

2.2. Роль Вс1е11оу1Ьгю в природе 27 ГЛАВА 3. Иммобилизация бактериальных клеток

3.1. Адгезия микроорганизмов на твердых поверхностях. Адгезия и когезия - процесс взаимодействия двух поверхностей

3.2. Роль твердой поверхности в жизнедеятельности микроорганизмов 45 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ *

ГЛАВА 4. Объекты и методы исследования

4.1. Штаммы Вс1е1ктЬгю и бактерий -жертв

4.2. Среды для культивирования

4.3. Культивирование Вс1е11оу1Ьгю и клеток бактерии-жертвы

4.3.1. Определение числа клеток бделловибрионов

4.3.2. Определение количества интактных и инфицированных клеток бактерии- жертвы

4.4. Световая микроскопия

4.5. Электронная микроскопия

4.5.1. Ультратонкие срезы

4.5.2. Электронно -микроскопическая криофрактография

4.5.3. Приготовление препаратов для сканирующей микроскопии

4.6. Отделение ВсЬПоуШпо от клеток и мембран бактерии -жертвы

4.7. Изучение гидрофобных свойств клеток

4.8. Получение бделлопластов бактерии -жертвы

4.9. Изучение агрегатной устойчивости двухкомпонентной бактериальной системы

4.10. Определение внеклеточных полисахаридов. 55 4.10.1. Определение содержания глюкозы в культуральной

среде

4.11. Иммобилизация двухкомпонентной бактериальной системы в ПААГ

4.12. Иммобилизация Bdellovibrio и бактерии -жертвы на гранулированных и волокнистых носителях

4.12.1. Взаимодействие Bdellovibrio с углеродно-волокнистым носителем

4.12.2. Подбор оптимальных условий адсорбции

4.13. Ингибировани внутриклеточного роста

бделловибрионов

4.14. Изучения влияния физико- химических факторов на процессы десорбции клеток двухкомпонентной бактериальной системы с углеродно- волокнистого носителя

4.15. Эксперименты в искусственно изолированных экосистемах in situ

4.15.1. Определение общего количества микроорганизмов

4.15.2. Определение общего количества сапрофитных микроорганизмов

4.15.3. Определение количества грамотрицательных микроорганизмов

4.15.4. Определение количества E.coli

4.15.5. Определение количества псевдомонад

4.16. Изучение поведения двухкомпонентной бактериальной системы, иммобилизованной на АУВМ-Ш в условиях

непрерывного культивирования

4.17. Статистический анализ экспериментальных данных

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 5. Иммобилизация двухкомпонентной бактериальной системы в полиакриламидный гель

5.1. Подбор оптимальных условий иммобилизации

5.2. Изучение взаимодействия Bdellovibrio с жертвой в

матриксе носителя

ГЛАВА 6. Иммобилизация Bdellovibrio и бактерии- жертвы на поверхности гранулированных и волокнистых носителей

6.1.Изучение адгезивной способности Bdellovibrio и жертвы в отношении различных носителей

6.2.Влияние времени экспозиции, температуры, pH и плотности бактериальной суспензии на связывание клеток двухкомпонентной системы с носителем. 70 6.3.Определение удельной емкости АУВМ-3

6.4.Изучение взаимодействия Bdellovibrio и жертвы на поверхности АУВМ-3

6.5.Изучение природы сил адгезии клеток двухкомпонентной системы на АУВМ-3. 81 ГЛАВА 7 Когезия клеток в периодической культуре Bdellovibrio - жертва. 86 7.1 .Динамика когезии бделлопластов в двухкомпонентной бактериальной системе. 86 7.2.Изучение агрегатной устойчивости двухкомпонентной системы 88 ГЛАВА 8 Иммобилизация Bdellovibrio как подход для разработки новых биотехнологических способов обеззараживания загрязненных вод. 98 8.1.Влияние интродукции Е coli на динамику численности

некоторых групп бактерий и Bdellovibrio микрокосмах in situ

8.2.Влияние интродукции в сточные сооружения иммобилизованных на носителях клеток Bdellovibrio на динамику очистки воды

8.3.Изучение декомтаминации загрязненной воды путем интродукции иммобилизованных на АУВМ -3

бделловибрионов в условиях непрерывного культивирования. 102 ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Список сокращений, используемых в диссертации ДП - дрожжево-пептонная среда

ДП/4 , дрожжево-пептонная вода, разведенная в четыре раза МПА - мясопептонный агар МПБ - мясо-пептонный бульон ПААГ - полиакриламидный гель АА - акриламид МБА - метиленбисакриламид ТЕМЭД - МДчГДчГ1 Ы1 -тетраметилэтилендиамин АУВМ- (I, II, III) - активированный углеродно-волокнистый материал "Днепр" МН ПЭГ - полиэтиленгликоль ПАВ - поверхностно-активные вещества СРС - цетидилперидиниумхлорид Ь8 - лаурилсульфат натрия РР - пирофосфат натрия ЭМБО - диметилсульфоксид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Развитие Bdellovibrio в иммобилизованных бактериальных системах хищник-жертва»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований.

Bdellovibrio - хищные бактерии, рост и развитие которых осуществляется в периплазме грамотрицательных бактерий. Жизненный цикл бделловибрио-нов состоит из двух стадий - внеклеточной нерепродуктивной и внутриклеточной репродуктивной. Широкое распространение бактерий рода Bdellovibrio в природе, позволяет рассматривать их как составную часть природных микробоценозов. Установлена корреляция между численностью бделловибрионов и уровнем микробного загрязнения природных водоемов, что может служить косвенным подтверждением их активного функционирования и участия в регуляции численности грамотрицательных бактерий. В то же время прямое доказательство значимости и роли этой группы микроорганизмов в почвенных и водных микробоценозах оказалось весьма затруднительным. Априорно принималось, что взаимодействие хищных бактерий с жертвами осуществляется в водной фазе естественных местообитаний. Известно, что решающим фактором для размножения бделловибрионов в таких условиях является концентрация потенциальных жертв (Rittenberg, 1979), на несколько порядков превосходящая уровни численности грамотрицательных бактерий в водоемах и почве. Данные об экстремально высокой чувствительности Bdellovibrio во внеклеточной стадии к физико-химическим воздействиям (Varón a Shilo 1968; Fridberg, 1977) также не способствовали пониманию аспектов, связанных с выживанием и функциональной активностью этой группы бактерий в структуре бактериопланктона водных экосистем. Требовался иной подход, позволяющий объяснить не только факт широкого распространения хищников в природе, но и оценить характер их функционирования в естественной среде обитания.

Было сделано предположение, что жизнедеятельность Bdellovibrio в естественной среде обитания приурочена к границам раздела фаз, которые, как известно, аккумулируют на единицу площади в десятки тысяч раз большие количества микроорганизмов, чем в единице объема (Costerton et al, 1987;

Costerton, 1995). В литературе сообщалось о единичных случаях обнаружения хищных бактерий в биообрастаниях различных поверхностей, изъятых из морской среды, (Williams, 1987). Эти данные рассматривались как результат концентрации Bdellovibrio из водной толщи, и не увязывались со способом их жизнедеятельности на поверхностях. Нам представлялось, что иммобилизованные двухкомпонентные системы Bdellovibrio - жертва являются наиболее адекватной моделью для экспериментальной проверки выдвинутого предположения, в котором центральное место занимает доказательство процесса взаимодействия между хищником и жертвой.

В связи с актуальностью проблемы очистки окружающей среды от прогрессирующего загрязнения все большее значение приобретает поиск безопасных путей преодоления кризисных ситуаций. Широкий спектр литическо-го действия Bdellovibrio по отношению к грамотрицательным бактериям, высокий репродуктивный потенциал, отсутствие патогенности для человека, животных и растений, позволяет использовать бделловибрионы в разработке эффективных и экологически безопасных технологий обеззараживания загрязненных вод. Практическая реализация этого подхода в значительной мере сдерживается отсутствием надежных способов интродукции бделловибрио-нов в загрязненные источники, которые обеспечивали бы пролонгированное сохранение их жизнеспособности и функциональной активности. В данной ситуации иммобилизованные системы представляются одним из технологических путей решения проблемы интродукции Bdellovibrio.

В связи с изложенным, целью данной работы являлось изучение взаимодействия Bdellovibrio с жертвой в иммобилизованном состоянии и возможности использования бактериальных хищников, иммобилизованных на твердых носителях, для очистки загрязненных вод. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Разработать методы искусственной иммобилизации двухкомпонентной бактериальной системы на поверхности гранулированных и волокнистых носителей и в полиакриламидный гель.

2. Получить экспериментальное подтверждение осуществления процесса взаимодействия хищника с жертвой в иммобилизованном состоянии при адгезии на поверхности биологически инертных волокнистых носителей и при включении в полиакриламидный гель.

3. Выявить роль внутриклеточной стадии хищника в развитии Bdellovibrio в иммобилизованном на носителе состоянии и неблагоприятных для роста условий.

4. Исследовать влияние интродукции в сточные воды бделловибрионов, иммобилизованных на волокнистом носителе, на процесс очистки воды от бактериального загрязнения в модельных экспериментах in situ и в условиях непрерывного культивирования.

Научная новизна.

Впервые изучено поведение двухкомпонентной бактериальной системы хищник-жертва в иммобилизованном состоянии.

Установлено активное функционирование системы хищник-жертва в иммобилизованном состоянии. Показано осуществление процесса взаимодействия хищника и жертвы в гранулах ПААГ и на поверхности волокна. Методами электронной микроскопии были выявлены все стадии развития бделло-вибриона на поверхности носителя. Кроме того, выявлена особенность развития двухкомпонентной системы в иммобилизованном состоянии, выражающаяся в формировании особой разновидности покоящихся форм, организованных по типу цист с многоклеточным сложноструктурированным "ядром" с обширной полисахаридной оболочкой ("коллективная циста"). Образование подобных структур обнаружено и в периодической двухкомпонентной системе, что дает бделловибриону возможность закрепляться и развиваться на поверхности, а также переживать неблагоприятные условия среды. Иммобилизованное состояние обеспечивает бделловибриону пролонгированное сохранение жизнеспособности.

Впервые разработаны способы иммобилизации клеток двухкомпонентной системы в полиакриламидном геле и на поверхности гранулированных и во-

локнистых носителей. Подобраны благоприятные условия иммобилизации, которые обеспечивали активное функционирование иммобилизованной двух-компонентной системы. Иммобилизация бделловибрионов во внутриклеточной стадии развития обеспечивает больший процент выживаемости при включении в гранулы геля и адсорбции на поверхности активированного углеродно-волокнистого материала АУВМ-Ш клеток двухкомпонентной системы, по сравнению с иммобилизацией внеклеточных бделловибрионов.

Изучение иммобилизованных систем позволило установить, что инфицированные клетки бактерии-жертвы обладают повышенными гидрофобными свойствами по сравнению с интактными, что позволило бделловибриону активно взаимодействовать с твёрдой поверхностью. Гидрофобное взаимодействие является основным механизмом адгезии хищников на твердых поверхностях и когезии бделлопластов в суспензии клеток. Коиммобилизация Вс1е11оу1Ьпо во внутриклеточной стадии развития и бактерии-жертвы на различных носителях, при высокой прочности связывания, не исключает свободной миграции клеток в жидкую фазу.

На основе полученных данных предложена концепция иммобилизованной двухкомпонентной системы, как наиболее адекватной модели существования ВёеПоуШпо природе, позволяющая объяснить развитие бделловибрионов в природных условиях.

Практическая ценность.

Результаты работы представляют практический интерес в связи с перспективами использования бактерий -хищников как биологического способа очистки бытовых и сельскохозяйственных стоков. Интродукция иммобилизованных на волокне бделловибрионов в сточные воды вызывает ускорение процесса лизиса грамотрицательных бактерий. На основе иммобилизованных систем, с использованием бактерий рода ВёеПоуМэпо могут быть предложены безопасные для окружающей среды технологии по обеззараживанию загрязненных водоемов.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции "Биотехнология и биосинтез популяций" (Алма-Ата, 1991), на школе-конференции молодых ученых "Микробиология и биотехнология" (Алушта, 1991), на Международном симпозиуме по экологии микроорганизмов (Барселона, 1992).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 3 сообщения в тезисной форме.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Изложена на 151 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, иллюстрирована 25 рисунками. Список литературы включает 237 наименований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Характеристика бактерий рода Bdellovibrio.

В 1962 году при выделении бактериофагов из почвенных образцов, Штольпом и Петцольдом (Stolp a Petzold, 1962) были обнаружены на газоне тест бактерий необычные литические пятна, которые увеличивались в размерах с течением времени. Светооптический анализ материала пятна обнаружил маленькие, подвижные бактерии вибриоидной формы. Так были открыты бактерии рода Bdellovibrio, которые первоначально были описаны как экзо-паразиты и лишь спустя пять лет охарактеризованы как внутриклеточные паразиты грамотрицательных бактерий (Bergey's Manual, 1984). Хеспел с соавт. (Hespell et al., 1973) на основании данных о том, что необратимые изменения клетки хозяина, пораженной бделловибрионами (прекращение синтеза РНК, белка, деградация ДНК), предшествуют началу роста Bdellovibrio, предложили рассматривать взаимоотношения бделловибрионов с бактериальными клетками как хищничество. Клетки вибрионов имеют размеры 0,2-0,4 х 0,81,2 мкм, снабжены обычно одним полярным очехлённым жгутиком (Burnham et al, 1968; Seidler a Starr, 1968; Abram a Davis, 1970; Ламбина с соавт., 1973; Коновалова с соавт., 1977.), диаметр которого в 1,5-2 раза превышает диаметр жгутика других бактерий и составляет по данным разных авторов от 21-25 нм (Abram а Davis, 1970) до 28 нм (Seidler a Starr, 1968). В основании жгутика бактерий рода Bdellovibrio обнаружено базальное тело (Коновалова с соавт., 1977), ультраструктура которого по форме, размерам и строению (Thomashow а Rittenberg, 1985 a,b) имеет сходство с организацией аналогичных образований у других грамотрицательных бактерий и представляет систему колец, одетых на сердцевину жгутика. Однако в базальном теле бделловибриона отсутствует L-кольцо, находящееся в наружной мембране грамотрицательных бактерий (De Pamphilis а Adler, 1971), а имеется только кольцо, на уровне внутреннего слоя клеточной стенки, соответствующего Р-кольцу, а также терминальное и субтерминальное кольца, располагающиеся на уровне клеточной мембраны (Thomashow а Rittenberg, 1985 a,b), соответствующие S- и

М-кольцам других бактерий.

О происхождении чехла жгутика у бактерий рода Bdellovibrio в литературе имеются различные сведения. Большинство исследователей (Burnham et al., 1968, 1970; Seidler a Starr, 1968; Abram a Davis, 1970; Thomashow a Rittenberg, 1985 a,b), придерживаются точки зрения, что чехол жгутика является продолжением клеточной стенки бделловибриона. С другой точки зрения, очехлён-ный жгутик берет начало в цитоплазме и непосредственно связан с базальной везикулой (Ламбина с соавт., 1973; Коновалова с соавт., 1977).

Ультратонкая организация клеток Bdellovibrio при общем сходстве с другими грамотрицательными бактериями имеет свои отличительные черты. Так, например, внешняя поверхность цитоплазматической мембраны клеток Bdellovibrio покрыта рассеянными частицами диаметром 6-10 нм, тогда как у клеток Escherichia coli подобные частицы плотно упакованы. Контур внутреннего осмофильного слоя клеточной стенки хищника зубчатый в отличие от относительно гладких концов сколов этого слоя у E.coli (Abram а Davis, 1970). Центральную часть клетки занимает нуклеоид (Starr a Bagient, 1966; Ламбина и Иванчикова, 1973).

Геном большинства штаммов Bdellovibrio составляет 1/3 от размера генома клетки бактерии- жертвы (Seidler a Starr, 1968) и занимает около 2/3 общего цитоплазматического пространства бделловибриона (Starr а Bagient, 1966). В ДНК Bdellovibrio sp.OITH обнаружено большее количество 5-метилцитозина, по сравнению с N6 - метиладенином, что не характерно для ДНК бактерий (Александрушкина с соавт., 1974), а пиримидиновые основания отличаются высокой степенью сблоченности. По этому признаку ДНК хищника отличается от ДНК других бактерий и приближается к ДНК эукари-от (Александрушкина с соавт., 1974).

Уникальной особенностью хищников является сложный цикл развития, в котором происходит чередование двух фаз - внеклеточной, нерепродуктивной и внутриклеточной, репродуктивной.

Внеклеточные бделловибрионы способны к осуществлению целого ряда

функций. При наличии в окружающей среде источников энергии, таких как аминокислоты, рибонуклеозидмонофосфаты, рибонуклеозиды и дезоксири-бонуклеозидмонофосфаты предотвращается деградация внутриклеточных компонентов и отмирание Bdellovibrio (Hespell et al., 1973). В отсутствии этих источников у бделловибриона обнаружен механизм, позволяющий эффективно расходовать внутриклеточные ресурсы, который выражается в циклическом образовании АТФ с периодом 60 минут, направленный на предотвращение быстрой деструкции клетки (Gagkari a Stolp, 1975). Энергия эндогенного дыхания расходуется на двигательную активность клеток (Hespell et al., 1974), а также на некоторые биосинтетические процессы, которые были обнаружены у Bdellovibrio во внеклеточной стадии развития. Внеклеточные бделловиб-рионы способны синтезировать флагеллин, из которого строится дистальная часть жгутика клетки (Thomashow а Rittenberg, 1985 a,b), а также пептидогли-кан клеточной стенки (Thomashow а Rittenberg, 1978,а).

Известно, что популяция Bdellovibrio при периодическом культивировании после достижения максимального титра быстро теряет жизнеспособность. Причиной замедления роста и гибели бделловибрионов является исчерпание ростовых субстратов (Stolp а Petzold,1962; Hespell et al., 1975). Если учитывать высокую скорость эндогенного дыхания , которая у Bdellovibrio в 5 раз больше, чем у E.coli и в 100 раз больше, чем у Arhtrobacter crystallopoites, то можно предположить, что во внеклеточном состоянии бделловибрион находится в условиях голодания (Rittenberg a Shilo, 1970; Hespell et al., 1974). И поэтому, казалось бы, естественной реакцией популяции Bdellovibrio в данных условиях, должен являеться поиск потенциальных бактерий-жертв, механизмом которого может служить хемотаксис, являющийся стратегией выживания бактерий в условиях голодания. При изучении роли хемотаксиса в инфекционном цикле Bdellovibrio (Stolp, 1968; Starr а Baigent, 1966; Hespell et al., 1974) была обнаружена хемотактическая подвижность к компонентам дрожжевого экстракта факультативного штамма B.stolpii UKi-2 и облигатного штамма Bdellovibrio sp. 114 (Straley а Conti 1974). Выявлено, что такие ами-

нокислоты как L-аспарагин, L-цистеин, L - глутамин, L-гистидин, глицин, L-лизин и L-треонин могут играть роль аттрактантов для штамма B.stolpii UKi-2, однако, хемотактический ответ на несколько порядков слабее, чем у E.coli (La Marre et al., 1977). Слабая ответная хемотактическая реакция бделловиб-рионов в отношении клеток как чувствительных, так и нечувствительных к Bdellovibrio бактерий была выявлена в модифицированной мембранной камере Бойдена (Straley a Conti, 1977). Было показано, что аттрактантами для бделловибрионов являются неорганические ионы, кислород и ацетат, а репе-лентами - ионы водорода (Straley at al., 1979).

Таким образом, исследования в этой области свидетельствуют, что хемотаксис, обнаруженный у Bdellovibrio, не играет существенной роли в поиске потенциальных бактерий-жертв. Тогда встает вопрос - каким образом бделло-вибрион обнаруживает свою жертву? Есть ли у хищника механизмы, позволяющие ему существовать в природных условиях вне зависимости от клеток бактерии-жертвы? Существуют ли условия, при которых бделловибрион мог бы расти аксенично?

Все выделенные к настоящему времени из природных источников штаммы Bdellovibrio являются облигатно зависимыми от бактерии-жертвы и не способны к росту на средах, используемых для культивирования гетеротрофных бактерий (Reiner a Shilo 1969; Ishiguro 1973; Horowitz et al., 1974; Freidberg, 1978). Попытки культивировать изоляты дикого типа Bdellovibrio на богатых средах были неудачными (Reiner a Shilo, 1969; Dedrich et al., 1970; Horowitz et al., 1974;). Было установлено, что дикий тип бактерий рода Bdellovibrio культивируется на богатой среде с добавками экстрактов клеток жертвы (Reiner a Shilo, 1969; Horowitz et al., 1974; Freidberg, 1978). Однако недавно была сконструирована среда, на которой бделловибрионы дикого типа могут расти аксенично после воздействия на клетки теплового шока (Gordon et al., 1993). По мнению авторов (Gordon et al., 1993), возможно тепловой шок имитирует сигнал, который в обычных условиях бделловибрион получает от клетки бактерии-жертвы.

Природа фактора, ответственного за запуск аксеничного роста бделловиб-риона дикого типа не изучена. Трудность в изучении сигнальной молекулы, запускающей аксеничный рост, заключается в вероятном наличии более чем одного сигнала, необходимого для периплазматического роста. Преждевременное высвобождение бделловибрионов дикого типа из бделлопласта выражается в дифференциации клеток в бделловибрионы атакующей стадии (Ruby a Rittenberg, 1983). Если бделловибрионы высвобождаются до начала репликации ДНК, они дифференцируются в клетки атакующей стадии без инициации репликации ДНК. Если же они высвобождаются после начала репликации ДНК, то начавшийся синтез ДНК заканчивается. Таким образом, досрочно высвобожденные бделловибрионы способны к синтезу ДНК, но не могут начать новый раунд репликации ДНК, даже в богатой среде. Для возобновления синтеза ДНК (Ruby a Rittenberg, 1983) необходимо присутствие в среде фактора клетки жертвы. И этот фактор, ответственный за стимуляцию синтеза ДНК, по-видимому, отличается от такового, ответственного за переключение с атакующей фазы бделловибрионов в ростовую, так как экстракты, которые стимулируют ДНК-репликацию досрочно высвобожденных бделловибрионов дикого типа, не действуют на клетки атакующей фазы. Фактор, вызывающий репликацию ДНК хищника был найден как в экстрактах клеток жертвы, например E.coli, так и не жертвы B.subtilis, но не был обнаружен в экстрактах Bdellovibrio (Gray a Ruby, 1990).

Исходя из результатов проведенных экспериментов, можно предположить, что для завершения цикла развития Bdellovibrio необходимо по крайней мере два различных сигнала: 1 ) дифференцирующий бделловибрион атакующей стадии в клетки ростовой фазы и 2) инициирующий репликацию ДНК (Gray a Ruby, 1990).

Обобщая литературные данные, касающиеся анализа мутантов Bdellovibrio, независимых от клеток жертвы (Shilo a Bruff, 1965; Reiner а Shilo, 1969; Seidler a Starr, 1969; Diedrich et al., 1970; Ishiguro, 1973; Horowitz, Kessel a Shilo, 1974; Friedberg, 1978; Cotter a Thomashow, 1992 a,b), можно

сказать, что бделловибрионы дикого типа спонтанно дают, по-крайней мере, два типа мутантов, независимых от клеток жертвы. Мутанты первого типа имеют зависимый от плотности высева клеток на чашку фенотип и образуют на среде колонии, если в нее добавлены клеточные экстракты (Shilo a Bruff, 1965; Ishiguro, 1973). Мутанты второго типа формируют независимый от плотности фенотип и образуют колонии на коммерческих средах без добавления клеточных экстрактов (Ishiguro, 1973). Мутанты второго типа являются двойными мутантами (Cotter a Thomashow 1992 a,b) и возникают из мутантов первого типа (Ishiguro, 1973).

Таким образом, представления о двух типах мутантов, независимых от клеток жертвы, согласуются с тем, что для потери зависимости от жертвы хищнику требуется более, чем один сигнал. Единственная мутация, приводящая к появлению мутантов первого типа, устраняет потребность в одной из двух сигнальных молекул жертвы, но способность образовывать изолированные колонии на богатых средах еще зависит от второго сигнала, содержащегося в клеточных лизатах или экстрактах. Частота появления мутантов первого типа - 10"6 -10"7 (Ishiguro, 1973; Horowits et al., 1974), что соответствует частоте единичной мутации. Частота мутантов второго типа не ясна. Возможно, что мутанты второго типа возникают из мутантов первого типа, после их роста на чашке в непосредственной близости от колоний мутантов первого типа.

Выяснение молекулярной основы фенотипа, независимого от клеток жертвы дикого штамма Bdellovibrio, является фундаментальной задачей в понимании биологии бделловибрионов. Недавно был определён первый локус в ДНК хищника, мутации которого приводили к возможности аксеничного роста бделловибриона . Этот локус (hit) ответственен за синтез полипептида, который экспортируется в периплазму и связывается с сигнальной молекулой клетки бактерии-жертвы, что приводит к дерепрессии синтеза ДНК Bdellovibrio. Мутанты по этому локусу могут расти вне зависимости от клеток бактерии-жертвы (Cotter a Thomashow, 1992 a,b).

Таким образом, в результате создания генетических систем для манипули-

рования с геномом Bdellovibrio (Cotter a Thomashow, 1992 a,b) был идентифицирован первый генетический локус, ассоциированный с фенотипом хищника, независимого от клеток жертвы.

Таким образом, литературные данные не дают исчерпывающего ответа на поставленный вопрос о возможном развитии бделловибриона вне зависимости от клеток бактерии-жертвы. Остается проблематичным решение вопроса о существовании бактерий рода Bdellovibrio в природной среде обитания.

Процесс взаимодействия Bdellovibrio с клетками бактерии -жертвы к настоящему моменту изучен достаточно полно. Инфекционный цикл включает в себя следующие стадии (Starr a Huang, 1972): 1) атака и прикрепление хищника к клеточной стенке жертвы; 2) внедрение в периплазму поражённой клетки; 3) внутриклеточный рост и развитие; 4) деление Bdellovibrio; 5) выход дочерних бделловибрионов из клетки жертвы, сопровождающийся лизисом поражённой клетки.

Бделловибрион имеет рекордно высокую скорость движения - 100 мкм/сек (Stolp 1968), что имеет значение при атаке жертвы.

Самая ранняя стадия инфекционного цикла Bdellovibrio по мнению ряда авторов (Starr а Baigent, 1966; Wood а Hirsch, 1966; Burger et al., 1968; Мишу-стин и Никитина, 1970) является неспецифическим процессом. Однако, при изучении роли компонентов клеточных стенок взаимодействующих бактерий было установлено специфическое связывание хищника и клетки бактерии-жертвы. Поверхностные слои типа полисахаридных капсул не являются барьером для прикрепления и проникновения бделловибриона в клетку бактерии-жертвы. Капсула остаётся неповрежденной в процессе формирования бделло-пласта (Koval, Bayer, 1997). Природа рецепторных участков внешней мембраны клеток бактерии-жертвы может быть неодинакова для различных штаммов Bdellovibrio. Это могут быть липополисахариды, пориновые белки (Shelling а Conti, 1986). Чемерис с соавт., (1986) было обнаружено специфическое связывание лектинов клеточной стенки хищника с углеводными рецепторами наружной мембраны клетки бактерии-жертвы. На стадии прикрепления выяв-

ляются необратимые изменения клетки жертвы, свидетельствующие о её гибели. Нарушается проницаемость цитоплазматической мембраны (Varon et al., 1969; Rittenberg a Shilo, 1970; Crothers a Robinson, 1972; Matin a Rittenberg 1972; Galdiero 1975; Hespell et al., 1975; Hespell, 1976), повреждаются электронно-транспортные процессы (Rittenberg a Shilo, 1970; Комиссарова и Гер-шанов 1974), происходит дезагрегация нуклеоида (Ламбина и Иванчикова, 1973), останавливается синтез белка и РНК (Varon et al., 1969), под влиянием нуклеаз происходит деградация нуклеиновых кислот до олигонуклеотидов (Matin a Rittenberg, 1972).

Наиболее полно изучен процесс внедрения бделловибриона в клетку бактерии-жертвы. По литературным данным, описано несколько моделей, объясняющих механизм инвазии. Согласно гипотезе "баллистического" проникновения (Stolp, 1968,1969) энергии физического удара достаточно, чтобы хищник механически разрушил клеточную стенку бактерии-жертвы и образовал в ней пору для внедрения. Модель пассивного втягивания клетки Bdellovibrio, прикрепленного на цитоплазматической мембране, в периплазму клетки бактерии-жертвы (Abram et al., 1974) предполагает, что вследствие нарушения проницаемости цитоплазматической мембраны последней, потоки солей и воды генерируют силы, достаточные для того, чтобы вызвать отхождение мембраны от клеточной стенки в месте образования поры внедрения и втягивания через нее бделловибриона. Однако, имеются убедительные доказательства, что процесс внедрения имеет ферментативную природу. Основными ферментами в модели, описанной Томашовым и Риттенбергом (Thomashow а Rittenberg, 1978 а, Ь, с), являются: глюкозидаза, расщепляющая 10-15% пеп-тидогликана клетки бактерии-жертвы, что теоретически необходимо для образования входного отверстия; пептидаза, ослабляющая связи в пептидной части пептидогликанового слоя, что приводит к изменению формы клетки жертвы, трансформирующейся в бделлопласт; N-деацетилаза, активность которой проявляется на завершающих этапах внедрения жертвы внутрь бактериальной клетки и которая модифицирует пептидогликан клеточной стенки

таким образом, что он становится резистентным к действию глюкозидазы. Такая модификация пептидогликана обеспечивает предотвращение преждевременного лизиза бделлопласта, в котором происходит рост бделловибрио-на, а также исключает внедрение в инфицированную клетку вновь прикрепившихся хищников. Дополнительная осмотическая стабильность бделлопласта обеспечивается О-ацетилированием модифицированного пептидогликана длинноцепочечными жирными кислотами, что придает ему гидрофобные свойства. В модели, описанной Тудором с соавт. (Tudor et al., 1990), основным ферментом процесса внедрения является пептидаза, разрывающая поперечные сшивки пептидогликана и позволяющая бделловибриону механически проникнуть внутрь клетки жертвы, при этом инфицированная клетка не изменяет своей формы. Возможно, существуют и другие механизмы преодоления хищником клеточной стенки. Коноваловой (Коновалова, 1986) на прикрепительном полюсе бделловибриона были обнаружены фибриллы, которые располагаются в виде пучка вдоль поверхности клетки. По мнению автора (Коновалова, 1986) эти структуры могут быть ответственны за форму клетки бделловибриона и при этом играть определенную роль при внедрении последних в клетку жертвы. На стадии специфического прикрепления к клетке жертве бделловибрион теряет жгутик, а следовательно, и способность передвигаться. Возможно при сокращении белков фибрилл, а также при изменении формы тела пластичной клетки хищника возникает поступательное движение, которое и обеспечивает продвижение внутрь клетки бактерии-жертвы.

К моменту завершения проникновения бделловибриона в клетку бактерии-жертвы наблюдается полная декомпартментализация периплазмы и цитоплазмы последней (Cover et al., 1984). Цитоплазматическая мембрана уже не играет роль барьера в отношении низкомолекулярных компонентов, происходит утечка молекул в периплазматическое пространство, что дает хищнику возможность развиваться внутри клетки бактерии-жертвы (Ruby а McCabe, 1988). Обнаружено тридцать полипептидов, которые синтезируются на разных этапах внутриклеточного роста, что свидетельствует о том, что

бделловибрион имеет комплексную систему для регулирования генной экспрессии во внутриклеточной стадии развития (McCann et al., 1998). В комплекс литических ферментов, с помощью которых Bdellovibrio создает внутри клетки бактерии-жертвы пул мономеров, используемых хищником для синтеза макромолекул, входят протеазы (Huang a Starr, 1973; Engelking a Seidler, 1974), нуклеазы (Matin a Rittenberg, 1972; Hespell et al., 1975; Hespell a Odelson, 1978) и липаза (Huang a Starr, 1973), которые синтезируются в цитоплазме бделловибриона и транспортируются в цитоплазму жертвы (Saier, 1994). Хищник не может синтезировать мономеры (Pritchard et al., 1975), а также имеет ряд биохимических дефектов, связанных с транспортом и утилизацией углеводов (Romo et al., 1992), отсутствием основных ферментов гликолиза и окислительной части пентозофосфатного шунта (Simpson a Robinson, 1968; Гершанович с соавт., 1974). В то же время, анаэробная часть шунта функционирует достаточно эффективно. Доказано наличие у Bdellovibrio почти всех ферментов цикла трикарбоновых кислот (Simpson a Robinson, 1968; Seidler et al., 1972; Гершанович с соавт., 1974), НАДН+ и НАДФН оксид аз, а также компонентов дыхательной цепи (Simpson a Robinson, 1968; Seidler et al., 1972; Tourella et al., 1978). На фоне сравнительно низкого содержания АТФ Бобыком с соавт., (Bobyk et al., 1980) обнаружены значительные количества полифосфатов и высокие активности ферментов фосфорного обмена. Сделано предположение о важной роли неорганических полифосфатов в биоэнергетических процессах Bdellovibrio и, в частности, в регуляции системы гликолиза. Внутриклеточный хищник ассимилирует 50% и окисляет до С02 15% углерода клетки бактерии-жертвы (Rittenberg a Hespell, 1975). Основными источниками энергии при внутриклеточном росте Bdellovibrio являются аминокислоты (Hespell et al., 1973), в меньшей - степени продукты деградации нуклеиновых кислот клетки бактерии-жертвы - нуклеозидмонофосфаты (Hespell а Odelson, 1978), а также АТФ бактерии-жертвы (Ruby a McCabe, 1986). Транспорт этих соединений осуществляется энергозависимыми пермеазами, специфичными для каждого соединения (Ruby et al., 1985). Способность ассимили-

ровать фосфорилированные формы нуклеозидов, транспорт которых не сопряжен с использованием энергии электрохимического градиента АМФ-АДФ и АДФ-АТФ, является уникальной особенностью бактерий рода Bdellovibrio. Еще одной отличительной чертой Bdellovibrio при внутриклеточном росте является то, что хищник включает в свою структуру готовые строительные блоки клеток жертвы, в частности такой важный структурный компонент клетки, как липополисахарид внешней мембраны (Kuenen а Rittenberg, 1975; Andreev et al, 1983; Stein et al, 1992). Согласно Моулдеру (1965) способность усваивать метаболически активные молекулы представляет значительное "достижение" без которого внутриклеточное существование не имело бы преимуществ перед внеклеточным.

Таким образом, бактерии рода Bdellovibrio являются организмами с достаточно широкими метаболическими возможностями, однако развитие их может происходить только внутри клетки бактерии-жертвы и причиной этому является неспособность начать репликацию ДНК (Cotter a Thomashow, 1992 a,b). В связи с этим бделловибрионы имеют черты специализации, отражающие уникальный способ существования в периплазме других бактерий. Bdellovibrio имеет механизм активного внедрения в клетку жертвы. Бделло-вибрион рациональным образом модифицирует структуры бделлопласта, чтобы избежать утечки в среду клеточного содержимого и обеспечить бесконкурентное существование. Уникальность среды обитания отражается на его метаболизме. Бделловибрион синтезирует макромолекулы из готовых мономерных единиц жертвы, имеет высокий уровень сопряженности процессов деградации клеточных компонентов и биосинтеза, сбалансированность процессов генерации и расхода энергии.

Глава 2. Экология бактерий рода Bdellovibrio.

Исходя из физиолого-биохимических свойств Bdellovibrio, экологическая роль хищника, наряду с другими антагонистами, казалась бы естественной и вероятно должна заключаться в сохранении популяционного равновесия микроорганизмов в природе. Анализ межпопуляционных взаимоотношений сис-

темы Bdellovibrio- бактерия-жертва показывает, что ее поведение подчиняется известным закономерностям, обусловленным особенностями самой системы (Афиногенова с соавт., 1978). Такая система обнаруживает устойчивые во времени периодические колебания, в соответствии с моделью Вольтерра для систем хищник-жертва, паразит-хозяин (Вольтерра, 1976). Однако вопрос о функциональной роли Bdellovibrio в природе оказался наиболее спорным и обнаружил ряд пробелов в наших знаниях об этой уникальной группе бактерий.

Для того, чтобы охарактеризовать экологическую роль Bdellovibrio в природе нужно, по крайней мере, провести сравнительный анализ и дать количественную оценку данной уникальной группы бактерий для различных природных источников; изучить процессы, протекающие в естественных условиях с участием этой группы бактерий; доказать возможность выживания в данной среде обитания.

2.1 Распространение бделловибрионов в природе.

Бделловибрионы широко распространены в природе, от тропиков до полярных районов, они выделены из прибрежных вод морей и океанов (Guelin et al., 1967; Shilo, 1969; Daniel, 1969; Ferro et al., 1970; Campanile, 1970; Marbach et al., 1976; Sutton, Bezant, 1994; Pan et al., 1997), из рек (Fry a Staples, 1974; 1976; Ламбина с соавт.,1974; 1981; Чувильская с соавт.,1976; Афиногенова с соавт., 1981), обнаружены в озерах повышенной солености (Amat a Torrella, 1989), являются составным компонентом микробных сообществ сточных вод (Доскина, 1973; Fry a Stalples, 1976; Westergaard, 1977; Ламбина с соавт, 1981), они были выделены из почвы (Stolp a Starr, 1962; Klein a Casida, 1967; Parker a Grove, 1970; Framico a Cooke, 1996) и ризосферы растений (Маркелова и Керженцев, 1998), из экскрементов некоторых жвачных животных (Ибрагимов, 1978), с поверхности пищевых продуктов (Guelin, 1976; Framico a Whiting, 1995).

Количественные данные, приводимые различными авторами колеблются от единичных клеток до нескольких миллионов, что может быть связано с

объективными закономерностями распространения бделловибрионов в природе.

Исследуя взаимоотношения бделловибрионов со штаммами тест- бактерий, выделенных из различных районов Северного моря, Хентцшел (Hentzschel, 1980) сформулировал вывод о высокой степени сходства штаммов хищников одного региона и их жертв, и возможность оценки по этому признаку представителей автохтонной микрофлоры. Аналогичные результаты были получены при изучении распространения Bdellovibrio в пресных водоемах. Было установлено, что в местах выпуска сточных вод численность бделловибрионов, взаимодействующих с бактериями сем. Enterobacteriaceae выше, чем взаимодействующих с P.fluorescens (Чувильская с соавт.,1976; Ламбина с совт., 1983). Бделловибрионы из морских экосистем или соленых озер имеют преимущественную специфичность к грамотрицательным бактериям, свойственным этой среде обитания (Taylor et al., 1974; Miyamoto, 1979; Amat a Torrella, 1989). Таким образом, приведенные данные позволяют считать, что особенности местообитания жертвы оказывают влияние на специфичность природных популяций Bdellovibrio и можно ожидать, что наиболее адекватное представление об ареале и количественных размерах природных популяций Bdellovibrio зависит от использования в качестве тест-бактерий изолятов автохтонной микрофлоры.

Исходя из литературных данных, проследить определенные закономерности в распространении бделловибрионов в микробных ценозах сложно. В таблице 1 суммируются данные о численности хищных бактерий в природных экосистемах.

Ряд исследователей (Shilo, 1966;Guelin et ai 1967; Daniel, 1969; Ламбина с соав., 1974; 1981; 1983; 1987; Fry a Staples, 1976; Чувильская с совт., 1976), изучавших распространение Bdellovibrio в реках и морях, показали, что число бделловибрионов коррелирует со степенью бактериального загрязнения водоемов. Концентрация хищников в сточных водоемах в несколько тысяч раз превышает таковую в воде открытых водоемов. Максимальные титры

Таблица 1. Численность Bdellovibrio в природных экосистемах

(Афиногенова, 1992).

Экосистема Количество в 1 мл/г Авторы

Вода

Сточные воды, Калифорния,США 80 - 400 Stolp a Starr, 1963

Сточные воды, Индия 206 DiasaBhat, 1965

Сточные воды, Клиши, Франция 10000 Guelin a Lambina

Сточные воды, Израиль 10000 Shilo, 1966

Озерная, прудовая вода, Израиль 40-50 Shilo, 1966

Сточные воды, Пенсильвания, США 10000-70000 Klein a Casida, 1967

Реки, впадающие в залив Анже, Франция 1 -4 Daniel, 1969

Прибрежная зона залива Анже, Франция 1-24 Daniel, 1969

Ирригационные воды, Япония 3-276 Uematsu a Wakimoto,

1970

Москва - река, СССР 15 Доскина, 1973

Сточные воды, СССР 530 Доскина, 1973

Река Ока, СССР 5-4100 Ламбина с соавт, 1974

Морская вода, Гаваи 0,1 -0,2 Taylor et al., 1974

Сточные воды, Англия 0-864 Fry a Staples, 1976

Реки Южного Уэльса, Англия 0-51 Fry a Staples, 1976

Атлантический океан 0,1 -22 Williams et al., 1979

Морской залив, Япония 1000- 10000 Miyamoto, 1979

Северное море 0,03 - 20 Hentzschel, 1980

Сточные воды, СССР 1000- 10000 Ламбина с соавт, 1981

Река Сырдарья, СССР 0 - 5000 Ламбина с соавт, 1983

Аральское море, СССР 4-301 Новожилова с со-

авт, 1983

Река Майле, Балтимор, США 0,3-9,1 Williams a Falkler, 1984

Оз. Иссык-Куль, СССР 0-170 Ламбина с соавт, 1986

Аквариумы, Балтимор, США 1 -38 Toon et al., 1986

Черное море, СССР 0-500 Ламбина с соавт, 1987

Аквариумы, Балтимор, США 23 - 238 Williams et al., 1987

Микрослой поверхности пресных и мор- 420 - 560000 Williams, 1987

ских водоемов

Река Ашампа, Краснодарский край, СССР 10-60 Ламбина с соавт, 1987

Почва

Почва Калифорнии, США 40 Stop a Starr, 1963

Почва, Израиль 40-50 Shilo, 1966

Почва центральных и восточных районов 100-90000 Klein a Casida, 1967

США

Почва различных географических зон Ита- 100 Corberi a Solaro, 1971

лии Почва городских и сельскохозяйственных 2 - 1200 Parker a Grove, 1970

районов Австралии

Почва Нью-Йорка, США 5 Keya a Alexander, 1975

Речные осадки, Южный Уэлс, Англия 55 - 29000 Fjy a Staples, 1976

Иловые отложения Аральского моря 1 - 192 Новожилова с соавт.,

1983

Осадки аквариумов, Балтимор, США 990- 1637 Williams et al., 1987

Bdellovibrio в речной воде обнаруживаются в местах выпуска сточных вод (Daniel, 1969; Ferro et al., 1970; Ламбина с соавт., 1974). Исследованиями Фрея

и Степлса (Fry a Staples, 1974; 1976) было показано, что максимальные кон' —i

центрации бделловибрионов, равно как и гетеротрофов, E.coli и грамотрица-тельных бактерий в речной воде обнаруживаются в местах сброса сточных вод. Буковская (1974) при изучении распространения бделловибрионов в реке умеренного климата обнаружила, что в местах выпуска сточных вод, где обнаруживались максимальные количества сапрофитных бактерий, E.coli, энтерококков и анаэробов, хищники не выявлялись, тогда как в пробах воды противоположного берега или отобранных в 2 км от стока концентрации бделловибрионов были максимальными (Буковская, 1974). Григорьевой с со-авт.(1976), при исследовании прибрежной зоны Северного моря, было отмечено, что максимальные количества Bdellovibrio обнаруживались в местах максимального количества микроорганизмов. Такие же закономерности были обнаружены при изучении распространения Bdellovibrio в акватории Большого барьерного рифа (Sutton a Besant, 1994). Таким образом, литературные данные не дают четкого представления о закономерностях количественного распространения бделловибрионов. Эти данные свидетельствуют, что жизнедеятельность Bdellovibrio связана со степенью загрязненности водного источника.

Однако бделловибрионы являются естественными представителями биоценозов. Анализ популяций бделловибрионов из морского залива и из загрязненных прибрежних вод, сделанный Даниэлем (Daniel, 1969), показал присутствие неморских бделловибрионов в дополнении к морским штаммам. Из морской воды выделены бделловибрионы, которые отличаются от бделловибрионов, выделенных из почвы, сточной и речной воды по своей абсолютной и специфической потребности в катионах Na+, К+, Са2+, Mg2+ и более низким, по сравнению с бделловибрионами пресных водоемов и почвы, содержанием ГЦ в ДНК (Taylor et al., 1974; Marbach et al., 1976). Бделловибрионы обнаружены в незагрязненных водах реки ледникового происхождения в Канаде на расстоянии двух милей от источника (Varón a Shilo, 1978).

В 1976 году Фрей и Стейплс (Fry a Staples, 1976) обнаружили в 5 санти-

метровой зоне речных осадков количество Bdellovibrio (5,5x10' -2,9x104 кл/г) во много раз превосходящее таковое в водной толще рек (0-51 кл/мл). Однако эти данные не получили должной оценки, так как интерпретация этого факта вступала в противоречие с представлениями о внутриклеточных хищниках как строго аэробных организмах. В 1978 году появилась первая публикация о возможном взаимодействии Bdellovibrio с бактерией-жертвой в анаэробных условиях (Афиногенова с соавт., 1978). А в 1984 году Вильяме и Фолклер (Williams a Folkler, 1984) установили отсутствие какой либо связи между содержанием в морской воде растворенного в ней кислорода и численностью в ней хищников. Этими авторами были обнаружены хищники из образцов 13-ти метрового слоя р.Майлс, лишенного слоев кислорода, причем количество их было большее, в сравнении с образцами вышележащих слоев. Вильямсом с соавторами (Williams, 1986; Williams et al., 1987; Williams a Falkler, 1989) приводятся данные о численности Bdellovibrio в осадках искусственных аквариумах и морского залива, на 3-4 порядка превышающих их количество в поверхностных водах. Высокие концентрации Bdellovibrio были обнаружены на

4 2 2 2

поверхности моллюсков (10 кл/мм ), рыб (1,7x10 кл/мм ), корабельных ка-

-у 2 12

натов (2x10 кл/мм ), водных растений (1,2-9x10 кл/мм ) (Williams et al., 1980; Desai a Williams, 1986). Еще одним местом обитания бделловибрионов является микрослой водной поверхности на границе с воздухом (Williams, 1987).

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о широком распространении бактерий рода Bdellovibrio в природных экосистемах.

2.2.Роль Bdellovibrio в природе.

Присутствие микроорганизмов в экосистеме еще не является свидетельством их активной жизнедеятельности в этой экологической обстановке (Кузнецов с соавт., 1962). Оценка экологической роли Bdellvibrio в природных и искусственных экосистемах зависит от выбора критериев, при помощи которых можно было бы определить значение бделловибрионов в природе. Большинство работ выполненных на открытых водных экосистемах было

ориентировано на вычленение из всей совокупности трофических связей системы одной цепочки и анализ причинно-следственных связей между ее звеньями, поиск различного рода корреляций между концентрациями хищников и других групп бактерий. Поскольку результатом межпопуляционных взаимодействий в системе хищник-жертва является увеличение концентрации хищника и уменьшение концентрации жертвы, ожидалось, что зависимость между составляющими этих цепочек будет, в случае активной жизнедеятельности Bdellovibrio, носить обратнопропорциональный характер.

Фрей и Стейплс (Fry a Staples, 1976) при исследовании процессов самоочищения в реках небольшой протяженности с локальными источниками загрязнения, показали, что максимальные концентрации бделловибрионов, равно как и гетеротрофов, E.coli и грамотрицательных бактерий в речной воде обнаруживались в местах сброса сточных вод, тогда как далее по течению наблюдается прогрессирующее снижение всех микробиологических показателей за счет разбавления привносимой со стоками микрофлоры речной водой. Вычисление коэффициентов корреляции не выявило какой-либо связи между исследованными параметрами (Fry a Staples, 1976). Поэтому авторы сделали вывод о том, что Bdellovibrio не является фактором, ответственным за самоочищение воды от бактериального загрязнения.

Буковской (1974) при изучении распространения Bellovibrio в реке умеренного климата были обнаружены обратные коррелятивные зависимости между сапрофитами, анаэробами с одной стороны и количеством бделловибрионов с другой. А при исследовании прибрежной зоны Северного моря Григорьевой с соавт., (1976) были найдены прямые корреляции между общим количеством микроорганизмов и Bdellovibrio. При исследовании рек Оки (Ламбина с соавт., 1974; Чувильская с соавт., 1976), Сыр-Дарьи (Ламбина с соавт., 1983), Ашампы (Ламбина с соавт., 1987) максимальные количества бделловибрионов, поражающих E.coli, были обнаружены в местах, где численность E.coli, по сравнению с другими участками, была достаточно низкой. Величины численности Bdellovibrio в воде этих рек находятся в обратной за-

висимости от их бактерий-жертв, в частности кишечной палочки. Обнаружив различные виды корреляций между концентрациями Bdellovibrio и E.coli в различных природных источниках авторы (Буковская 1974; Ламбина с соавт., 1974; 1983; 1987; Григорьева с соавт., 1976; Чувильская с соавт., 1976) тем не менее приходят к одному выводу об участии бактериальных хищников в процессах самоочищения водоемов от фекальной микрофлоры. Поэтому, со всей очевидностью, вытекает необходимость в разработке критериев для интерпретации количественных закономерностей, для возможности оценки с определенной долей достоверности, интенсивности процессов, происходящих в природе с участием Bdellovibrio.

Ламбиной с соавт., (1981) для количественной оценки интенсивности процессов взаимодействия Bdellovibrio с бактериями-жертвами в природной экосистеме было предложено использовать соотношение концентраций хищника и жертвы (индекс п/х) (Ламбина с соавт., 1981). При использовании этого индекса было выявлено влияние температуры на степень участия Bdellovibrio в процессах самоочищения пресных и морских водоемов (Ламбина с соавт., 1983; 1986; 1987), что позволило интерпретировать данные исследования многих исследователей о сезонных изменениях численности Bdellovibrio открытых водоемов (Сидоренко с соавт., 1979; Finance, 1976; Miamoto, 1979; Williams, 1979). Однако и такой подход не внес особого вклада в решение проблемы. Тем не менее с санитарно-гигиенической точки зрения ценность полученной информации не вызывает сомнения. Так, в частности, при сравнении средних показателей численности микроорганизмов, Bdellovibrio и E.coli в реке Оке на протяжении трех лет было отмечено ухудшение санитарного состояния водоема, тогда как популяция Bdellovibrio снижалась (Чувильская с соавт., 1976). Изменение средних показателей бактерий может рассматриваться как отклик системы на различные воздействия и обусловленное им нарушение экологического равновесия. Существование функциональной зависимости между биологической структурой водоема и его самоочищающей способностью делает возможным привлечение в качестве одного

из информативных показателей реального состояния экосистемы соотношение клеток хищника и жертвы.

Представление о функциональной роли Bdellovibrio может дать изучение динамики звеньев одной трофической цепочки в полевых микрокосмах, являющихся уменьшенными копиями природных экосистем. Результаты исследований различных авторов по изучению экологической роли Bdellovibrio не дают однозначный ответ на этот вопрос.

Изучение динамики численности клеток E.coli, введенных в грязевые и почвенные образцы, содержащие автохтонные штаммы бделловибрионов, не выявило сколько-нибудь существенного снижения их количества (Dias a Bhat, 1965; Klein a Casida, 1967). На основании полученных данных авторы сделали вывод о том, что бактерии рода Bdellovibrio не играют существенной роли в самоочищении грязевых источников (Dias a Bhat, 1965; Klein a Casida, 1967) и, что круг бактерий-жертв почвенных бделловибрионов может быть ограничен лишь автохтонными штаммами бактерий, не включая E.coli (Klein а Casida, 1967).

Исследования Кейа и Александера (Key a Alexander, 1975,b) показали, что введение в почву клубеньковых бактерий вызывает отклик естественной популяции бделловибрионов, а сопряженность процессов элиминации клеток Rhizobium и увеличение популяции хищника можно оценить как свидетельство реального вклада Bdellovibrio в процессы регуляции численности в микробных ценозах. Лимитирующим фактором процесса взаимодействия автохтонного штамма Bdellovibrio с клубеньковыми бактериями в почве является концентрация клеток Rhizobium. Бделловибрионы размножаются и вызывают значительное уменьшение числа клеток жертвы, если последние присутству-

о

ют в концентрации не меньше, чем 10 кл/г. Снижение числа клеток Rhizobium за счет инфицирования бделловибрионами никогда не было ниже 106 кл/г, что соизмеримо с реальными концентрациями клубеньковых бактерий в почве.

При исследовании динамики численности гетеротрофов, грамотрицатель-

ных бактерий, E.coli и Bdellovibrio в диализных мешках, погруженных в воду реки в районе впадения сточных вод, Фрей и Стейплс (Fry a Staples, 1976), на основании того, что снижение количества E.coli не коррелировало с увеличением популяции Bdellovibrio, и Хендрикс (Hendricks, 1974) при моделировании типов поведения двухкомпонентной системы в речной воде в условиях хемостата пришли к выводу о незначительной роли бделловибрионов в самоочищении водоемов.

Самоочищение природной экосистемы - процесс, безусловно, интегральный, определяемый множеством различных связей, включающих межвидовую и внутривидовую конкуренцию, действие простейших, возможно фагов, а также иных, чем Bdellovibrio, хищников и паразитов. Имеются работы, посвященные изучению более широкого круга причинно-следственных связей в природных сообществах микроорганизмов в связи с вопросами саморегуляции экосистем. Ряд авторов отмечает, что взаимодействие Bdellovibrio с гра-мотрицательными бактериями в природных микрокосмах имеет место, однако результаты этого взаимодействия несоизмеримы с выеданием бактерий простейшими. Энзигер и Купер (Enziger a Cooper, 1976) показали, что удаление E.coli из вод морского залива связано с увеличением числа простейших. Если удалить простейшие фильтрацией, то уничтожение популяции колиформ было незначительным. Родес и Катор (Rhodes a Kator, 1988) не выявили существенной разницы между степенью участия Bdellovibrio и литических микроорганизмов, с одной стороны, и простейших, с другой, в снижении численности популяции E.coli и Salmonella, введенных в речную воду. Изучение участия Bdellovibrio в процессах самоочищения проводилось Ламбиной с соавторами (Ламбина с соавт.,1982; 1987) в образцах сточной воды с ведением в них пте-ридина, обладающего избирательным бактериостатическим действием на хищника (Seidler et al., 1972; Афиногенова с соавт., 1983). Если с помощью этого ингибитора вывести Bdellovibrio из образца, то популяция E.coli выходит из под контроля хищника и не испытывает никаких сдерживающих факторов, таких, как хищные простейшие, фаги. Четкое различие количествен-

ных параметров, характеризующих динамику численности бделловибрионов и E.coli в опыте и контроле позволило авторам (Ламбина с соавт.1982; 1987) придти к выводу о ведущей роли Bdellovibrio как биотического фактора в процессе очищения сточных вод.

Представляют интерес наблюдения Ропер и Маршала (Roper a Marshall, 1978 b) сложной мозаики взаимоотношений Bdellovibrio, миксобактерий, мелких амеб Vexillifera, хищных простейших и E.coli в микрокосме сточной воды в ответ на интродукцию E.coli. Авторы отмечают, что наиболее динамичной часть микробного сообщества являются паразитические и хищные микроорганизмы, которые ответственны за отмирание привнесенных бактерий. Увеличивавшиеся популяции этих микроорганизмов немедленно становятся добычей хищных простейших, в результате чего концентрации всех составляющих этого сложного микробного ценоза возвращается к исходному уровню. Работы по изучению более широкого круга причинно-следственных связей в природных сообществах микроорганизмов дают более ясное представление о саморегуляции экосистем.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют об отсутствии однозначной оценки роли Bdellovibrio в природных экосистемах. Нельзя не отметить, что эксперименты, проводимые различными исследователями, осуществлялись в разных условиях. Противоречивость в выводах, вытекающих из этих исследований, возможно обусловлена тем, что на взаимодействие Bdellovibrio с клетками жертвы могут влиять факторы внешней среды. Поэтому, для изучения экологической роли Bdellovibrio важен не только поиск критериев оценки взаимодействия хищника и жертвы в природных условиях, но и той экологической ниши, в которой осуществляется их жизнедеятельность, где можно учитывать влияние параметров внешней среды.

Как уже было сказано ранее хищники широко распространены в сточных водах. Система сточных вод является привлекательным объектом для изучения экологической роли Bdellovibrio, во-первых, тем, что это закрытая система, в которой можно контролировать физико-химические параметры, а, во-

вторых, тем, что в этой системе с высокой скоростью происходят процессы самоочищения.

Фрей и Стейплс (Fry a Staples, 1976) исследуя процессы самоочищения сточных вод, показали увеличение количества бделловибрионов на выходе из сточных сооружений, по сравнению с входом, а также установили, что на фильтрах сточных сооружений, где концентрация клеток бактерий-жертв достигает 109 -10ю кл/г, обнаруживается наибольшее количество Bdellovibrio. Ламбиной с соавт., (Ламбина с соавт., 1981; 1987) удалось выявить типичное для процесса взаимодействия в двухкомпонентной системе снижение концентрации E.coli, сопровождающееся приростом Bdellovibrio, при прохождении сточных вод от решетки до аэротенка.

Большие перспективы в изучении потенциальной роли Bdellovibrio в природе Вильяме с соавт. (Williams et al., 1987) связывают с использованием в качестве модельных систем - аквариумов, в которых при некоторой имитации природных условий, основные физико-химические параметры находятся под контролем. Проведенные исследования на таких модельных экосистемах позволили Вильямсу с соавт. (Williams et al., 1987) выявить значительные флуктуации численности Bdellovibrio в донных осадках и воде, носившие фазный характер. Выяснить причину таких флуктуаций пока не удалось, однако авторами было высказано предположение о возможной роли в этом явлении ассоциации Bdellovibrio с дисперсными частицами водоемов. Это предположение согласуется с наблюдениями Кейа и Александера (Keya a Alexander, 1975а) об адсобции бделловибрионов на почвенных компонентах и не может не приниматься во внимание при оценке реальных масштабов жизнедеятельности Bdellovibrio в природе.

Таким образом, нельзя отрицать роли Bdellovibrio, как одного из основных факторов биологического равновесия в микробиоценозах.

Однако, существуют факты, которые не могут найти объяснения в рамках представления о Bdellovibrio, как регуляторе численности грамотрицательных бактерий в микробных сообществах. Например, известно, что бделловибрио-

ны являются рекордсменами среди бактерий по скорости эндогенного дыхания (Hespel et al, 1974) и поэтому не выживают в условиях голодания. В связи с этим очень важными представляются данные о величине минимальной концентрации бактерии-жертвы, при которой реализуется процесс взаимодействия в двухкомпонентной системе. Исходя из экспериментальных данных Хес-пел с соавторами (Hespel et al., 1974) пришли к выводу, что минимальная концентрация клеток потенциальных бактерий-жертв необходимая для процесса взаимодействия хищника и жертвы в природе должна составлять по крайней мере 1,5x105 кл/мл при условии 100% столкновений хищника с жертвой. Учитывая, что только в 3% случаев от общего числа столкновений клеток хищника и жертвы имеет место реальное взаимодействие (Rittenberg, 1979), величина минимальной пороговой популяции бактерий-жертв увеличивается до 106 -107 кл/мл, что очень далеко от реальных концентраций грамотрицательных бактерий потенциальных жертв бделловибрионов в естественных экосистемах, которые едва ли превышает 105 - 106 кл/мл даже в загрязненных источниках (Никитин и Никитина, 1978).

Таким образом, данные, полученные Хеспел с соавторами (Hespel et al., 1974) и последующая работа Риттенберга (Rittenberg, 1979) о величине минимальной пороговой концетрации бактерий-жертв, не акцентировали внимания на разрешение проблемы о роли Bdellovibrio в естественных сообществах. Более того произошла поляризация мнений на экологическую роль Bdellovibrio, ни одно из которых не было строго аргументировано.

Существуют и другие факты, которые в значительной мере определяют остроту дискуссии о возможной экологической роли Bdellovibrio. Из литературных данных известно, что бделловибрионы чувствительны к ультрафиолетовому излучению, которое оказывает бактерицидное воздействие на Bdellovibrio (Freidberg, 1977). В среде с низким значением pH хищники теряют подвижность (Varón a Shilo, 1968). Бделловибрионы обладают значительно более высокой, чем клетки бактерии-жертвы, чувствительностью к различным ксенобиотикам (Wehr a Klein, 1971). Гербициды, соли тяжелых металлов,

детергенты, хлороформ, бензол, фенол и толуол ингибируют процесс взаимодействия Bdellovibrio с клетками бактерий-жертв (Varón a Shilo, 1981).

Выживание Bdellovibrio в природе можно было бы объяснить наличием у этого рода бактерий форм длительного переживания неблагоприятных условий, таких как цисты. Некоторые штаммы Bdellovibrio способны к образованию цист (Burger et al., 1968, Hoenigen et al, 1972, Tudor a Conti, 1977 а,б) -"бделлоцист". Бделлоцисты более устойчивы, чем вегетативные клетки к действию высоких температур, ультрафиолета, ультразвуку, высушиванию.

Однако покоящиеся формы до настоящего времени обнаружены только у двух штаммов бделловибрионов - Bdellovibrio sp. W (Burger et al., 1968, Hoenigen et al, 1972, Tudor a Conti, 1977 а,б) и почвенного штамма, описанного Мишустиным и Никитиной (Мишустин и Никитина, 1972) из более, чем двухсот выделенных к настоящему времени штаммов Bdellovibrio. В то же время, данные о выделении бделловибрионов из почв, хранившихся в высушенном состоянии два года (Germida, 1987), могут свидетельствовать еще недостаточной изученности этого явления и его роли в переживании неблагоприятных условий. По мнению Никитина и Никитиной (1978) образование цист у почвенных штаммов Bdellovibrio является основным путем выживания при уменьшении численности бактерий-жертв, высыхании, изменении аэрации, истощении среды. В двухкомпонентных бактериальных системах этими исследователями были обнаружены мелкие эллипсоидные и палочковидные клетки, поверхность которых покрывала волокнистая капсула толщиной 300 -700А0 (Мишустин и Никитина, 1972).

При общем сходстве ультраструктурной организации бделлоцист Bdellovibrio sp W. и цист почвенного штамма Мишустина и Никитиной, обнаруживается принципиальное различие в топографии процесса цистообразова-ния. Образование покоящихся клеток Bdellovibrio sp. W начинается и заканчивается в периплазме инфицированной клетки жертвы. У почвенного штамма Bdellovibrio все стадии этого процесса осуществляются вне клетки бактерии-жертвы. Являются ли эти пути цистообразования (Tudor a Conti, 1977 а,б;

Никитин и Никитина^ 978) альтернативными или взаимоисключающими, или их реализация определяется неадекватными внешними факторами остается неясным.

В литературе бактерии рода Bdellovibrio описаны как строгие аэробы на основании того, что все исследованные штаммы хищных бактерий имеют окислительный тип обмена и развитые системы переноса электронов на кислород (Bergey's manual, 1984). Вопрос о значении кислорода для жизнедеятельности Bdellovibrio изучен недостаточно. Бюргер с соавт. (Burger et al., 1968) не наблюдали образование негативных колоний Bdellovibrio sp. W на газоне R.rubrum при парциальном давлении кислорода ниже 4-5 мм рт. ст. Симпсон и Робинсон ( Simpson a Robinson, 1968) изучали взаимодействие хищника с жертвой в двухкомпонентной системе Bdellovibrio sp. 6-5-S -S.serpens в условиях удаления из среды растворенного кислорода и замещении его инертным газом. По данным этих авторов (Simpson a Robinson, 1968), взаимодействия хищника и жертвы в этих условиях не происходило, а количество бделловибрионов через 4-5 суток культивирования уменьшалось на 45% по сравнению с исходным. Многие исследователи отмечают, что процесс взаимодействия в двухкомпонентной системе происходит более интенсивно при встряхивании, чем при культивировании в стационарных условиях (Stolp a Starr, 1963; Starr a Baient, 1966; Varón a Shilo, 1968). В литературе имеется только одна публикация, в которой сообщается о возможном взаимодействии Bdellovibrio с бактерией-жертвой в анаэробных условиях (Афиногенова с соавт., 1978).

Отмеченные представления о Bdellovibrio как строгом аэробном планктонном организме, лишенном форм длительного персистирования не оставляют ему никаких шансов на выживание в природных условиях. Однако эти представления противоречат имеющимся данным о широком распространении Bdellovibrio в пресных и морских водоемах, биогеоценозах почв, соленых и ирригационных вод.

Поэтому, для изучения экологической роли Bdellovibrio требуются иные

методы решения проблемы, иная концептуальная модель существования бделловибрионов в природе.

Глава 3. Иммобилизация бактериальных клеток.

Формы иммобилизации клеток различны. Основными методами иммобилизации бактериальных клеток являются: флокуляция, адсорбция на поверхности, химическое связывание с поверхностью, включение в различные гели (Cassidy et al., 1996). Рассматривая иммобилизацию клеток можно отметить, что этот процесс не является только прерогативой технического использования иммобилизованных клеток как биокатализаторов. Такие системы могут использоваться для изучения эколого- биологических проблем в качестве моделей, имитирующих природные ситуации. Главная причина неудовлетворённости микробиологического изучения естественных сред выражалась С.Н. Виноградским (Виноградский, 1952) в резком несоответствии между природными условиями и условиями, создаваемыми при искусственном культивировании микроорганизмов. Очевидно этот разрыв может быть восполнен в модельных экспериментах, в которых имитируются среды естественного обитания микроорганизмов. Почвенные микроорганизмы являются ярким примером микробных клеток, иммобилизованных в гелях (Звягинцев, 1987). Бактерии в почвах погружены и прочно закреплены в органоминеральном геле сложного состава, который меняется с течением времени. Как уже было отмечено в разделе 2.1. обзора литературы, бделловибрионы в больших количествах обнаруживаются на поверхностях подводных предметов (Williams et al., 1980; Desai a Williams, 1986), в микрослое водной поверхности на границе с воздухом (Desai a Williams, 1986; Williams, 1987), в донных осадках (Fry а Staples, 1976; Williams et al., 1987; Williams a Falkler 1989). Однако ни одним из исследователей не было сделано попытки связать этот факт с иным образом жизни Bdellovibrio, жизнедеятельность которого происходит в ассоциативном с границами раздела фаз состоянии. Такое заключение требует серьезной экспериментальной проверки, поскольку оно противоречит сложившемуся стереотипу: колонизация микроорганизмами поверхностей - это страте-

гия защиты от паразитов и хищников (Marshall, 1976; Cassidy et al., 1996). В связи с этим представляет интерес подробно рассмотреть процесс прикрепления бактерий к твердой поверхности.

3.1. Адгезия микроорганизмов на твердых поверхностях. Адгезия и когезия - процесс взаимодействия двух поверхностей.

Процесс прикрепления микроорганизмов к твердой поверхности в литературе обозначается различными терминами, такими как адсорбция, сорбция, адгезия, прилипание, прикрепление и т. д. Наиболее часто употребляется термин адгезия, что и соответствует основным представлениям об этом процессе.

Микроорганизмы по своим размерам (от 1 до 10 мкм) относятся к той категории частиц, которые должны подвергаться наиболее сильной адгезии. У частиц большего размера гравитационные силы превосходят силы прикрепления, а частицы меньшего размера, вследствие малого веса не в состоянии выдавить слой жидкости и вступить в непосредственный контакт с поверхностью (Звягинцев, 1973). В то же время микроорганизмы соизмеримы с размерами коллоидных частиц, поэтому их водные суспензии можно рассматривать как коллоидные системы, подчиняющиеся законам термодинамики гетерогенных систем. Однако микроорганизмы не являются инертными частицами, поэтому биологические характеристики накладывают отпечаток на их поведение в водных суспензиях. Согласно современной концепции, суспензии микроорганизмов могут рассматриваться как живые коллоидные системы (Marshall, 1976; Loosdrecht et al., 1990).

Бактерии рассматриваются как коллоидные частицы несущие на себе отрицательный заряд (Marshall et al., 1971; Fletcher a Marshall, 1983; Loosdrecht, 1990, Козляк с соавт., 1991). Поверхностный заряд клеток микроорганизмов образуется за счет диссоциации ионогенных карбоксильных, фосфатных и сульфатных групп высокомолекулярных соединений сиаловых кислот, фосфолипидов, мукополисахаридов в наружном слое и порах оболочки бактерии ( Seno, 1987; Motla et al., 1991). Вокруг отрицательно заряженной

клетки бактерии имеется слой противоионов - катионов, компенсирующий этот заряд и формирующий двойной электрический слой(ДЭС). Часть из противоионов ДЭС находится на значительном расстоянии от поверхности клетки - это так называемый диффузный слой, другая часть непосредственно примыкает к этой поверхности и связана с нею настолько прочно, что не покидает плотный или "гельмгольцевский слой". Сумма зарядов плотного и диффузного слоев ДЭС равна заряду клетки. При движении клетки относительно воды часть противоионов диффузного слоя отстает. Разность между абсолютными значениями истинного заряда клетки и количеством противоионов плотного слоя представляет собой электрокинетический потенциал движущейся клетки.

Помимо заряда и гидратного барьера клетки немаловажной характеристикой, определяющей стабильность бактериальных суспензий, является соотношение гидрофобных и гидрофильных компонентов клеточной оболочки. К настоящему времени охарактеризованы гидрофильно-гидрофобные свойства микроорганизмов, относящихся к разным таксономическим группам. Фаттом и Шило (Fattorn a Shilo, 1984) установили, что гидрофильные участки клеточной стенки цианобактерий при росте на свету в течении 48 часов становятся гидрофобными. Гидрофобность клеточных стенок бактерий увеличивается в условиях голодания (Kjelleberg a Hermanson, 1984). Большинство планктонных бактериальных культур обладают гидрофильной поверхностью (Fattom а Shilo, 1984). Гидрофобные свойства клеточной стенки отмечены у Moniliella pollinis (Mozes a Rouxhet, 1984), бентосных форм цианобактерий (Fattom а Shilo, 1984), Salmonella enteritidis (Никовская с соавт., 1989). Однако, у большинства бактерий клеточная поверхность разнородна, может содержать в себе как гидрофобные, так и гидрофильные участки (Звягинцев, 1973).

Бактериальные суспензии - это ультрагетерогенные системы, обладающие большой суммарной поверхностью составляющих ее частиц (клеток). Известно, что в коллоидных системах с развитой поверхностью раздела фаз и, следовательно, обладающих большой свободной энергией, особое место принад-

лежит поверхностным явлениям, понижающим избыток свободной энергии. В термодинамически неустойчивых коллоидных системах уменьшение свободной энергии происходит в результате явлений адсорбции и коагуляции. В живых коллоидных системах явления, имеющие ту же природу, обозначаются как адгезия и когезия (Marshall, 1984). Процесс адгезии микробных клеток в гетерогенных системах зависит не только от строения поверхности бактерии, но и от свойств поверхности, на которой будет происходить адсорбция, а также от свойств среды, в которой находятся взаимодействующие поверхности. Твердые поверхности могут быть гетерогенны и представлять коллоидные материалы, частички песка и почвы, горные породы, металлоконструкции, макроорганизмы (Marshall, 1976). В отличие от клеточной поверхности адсорбент может быть заряжен как положительно, так и отрицательно. В соответствии с этим ДЭС будет состоять из противоионов отрицательно или положительно заряженных. На процесс адсорбции большое влияние оказывает структура адсорбента - шероховатая, складчатая или гладкая поверхность (Fletcher a Marshall, 1983).

Бактерии могут прикрепляться к водным растениям и животным и использовать секретируемые ими вещества. На поверхности моллюска Rorippa 6 2

находится до 10 кл/см бактерий. Макроорганизмы могут препятствовать прикреплению микроорганизмов к их поверхности путем снижения рН или выделения веществ - ингибиторов роста бактерий. Так при колонизации водоросли Leucothrixmuca бактериями, ее апикальная часть всегда бывает свободной от бактерий (Fletcher a Marshall, 1983).

В механизме прикрепления микроорганизмов к твердой поверхности можно выделить четыре этапа: 1) транспорт клеток к поверхности, который может осуществляться за счет диффузного перемещения клеток в среде, их активного перемещения при помощи жгутиков и движения за счет конвекционных потоков жидкости (Meadous, 1971; Bryers a Characklis, 1982; van Loosdrecht et al., 1990); 2) первоначальная адгезия, которая включает в себя две стадии - обратимую и необратимую; 3) прикрепление за счет полимеров и

фибрилл; 4) колонизация поверхности с образованием Loosdrecht et al., 1990). Прикрепление бактериальных клеток к повер^&Я^й!*^ существенным образом зависит от таких органелл как фимбрии, пили, холд-фаст и жгутики (Hirsch а Pankratz, 1970). Флетчер (Fletcher, 1979) показано, что при снижении в популяции подвижных клеток доли безжгутиковых форм соответственно уменьшается и количество клеток с адгезивной способностью. Предполагается, что кинетическая энергия подвижных клеток имеет значение для преодоления электростатических сил отталкивания одноименно заряженных поверхностей. По вопросу о природе сил, обуславливающих адгезию было высказано несколько гипотез. Первоначально считалось, что процесс бактериальной адгезии обусловлен действием электростатических сил, возникающих при взаимодействии разноименно заряженных поверхностей. Однако, как оказалось в большинстве случаев, при адгезии клеток происходит взаимодействие поверхностей с одноименными отрицательными зарядами. В последнее время для объяснения явлений адгезии клеток тканей, микроорганизмов, фагов и вирусов широко используется теория стабильности коллоидных систем. Эта теория рассматривает поведение коллоидных систем как результат сложения электростатических сил отталкивания и Ван-дер-Ваальсовых сил притяжения. Энергия взаимодействия этих сил является функцией расстояния между бактерией и твердой поверхностью. При малых расстояниях между поверхностями 10 А0 преобладают силы притяжения, при больших расстояниях преобладают силы отталкивания, на еще больших расстояниях энергия притяжения несколько преобладает над энергией отталкивания (Busscher et al., 1984; van Loosdrecht et al., 1989; van Loosdrecht et al., 1990). Таким образом, существуют два стабильных положения при которых клетка удерживается на поверхности: первое - на расстоянии 100 А°, когда прочность сцепления невелика и клетка может переходить в раствор, эта стадия адсорбции считается обратимой, и второе - когда клетка находится на расстоянии 5-10 А°, когда прочность сцепления значительна. Эта стадия считается необратимой (Busscher et al., 1984; van Loosdrecht et al., 1989). Однако

экспериментальная оценка сил сцепления в процессах адгезии и когезии клеток (Jones et al., 1969; Reid et al., 1990; Vechtlifshits et al., 1990) показала, что эта величина на порядок больше максимальной теоретической оценки сил Ван-дер-Ваальса. Обобщая огромный объем информации, накопленный еще с прошлого столетия по изучению явления адгезии микроорганизмов, Звягинцев (1973) указывает на возможное участие более 11 разновидностей сил, которые могут принимать участие в адгезии клеток. По природе сил вовлекаемых в процесс обратимой и необратимой адсорбции различают специфическую и неспецифическую адгезию. Предполагается, что при неспецифической адгезии процесс взаимодействия определяется взаимодействием гидрофобных, электростатических сил и их комбинаций (Marshall a Cruicshank, 1973; Pedersen, 1980; Dahlback et al., 1981; Fletcher a Marshall, 1983; Powell a Slater, 1982; McEldowney a Fletcher, 1986). Специфическая адгезия это такой тип ассоциации, которая осуществляется путем взаимодействия комплиментарных молекул микроорганизмов и поверхностей. Поверхностные макромолекулы клетки, ответственные за специфическую адгезию называются адгезинами, комплементарный адгезину компонент поверхности называется рецептором. Классическим примером специфической адгезии является адгезия вирусов и фагов на клетках хозяев. Высокая специфичность фагов к бактериям указывает на большую степень комплиментарности между молекулярными компонентами фагов и поверхности клеток-хозяев. Известно, что рецепторами многих фагов являются липополисахаридные или липопротеиновые участки внешней мембраны оболочки клетки (Marshall, 1976). Моноха и Чен (Monocha a Chen, 1990) показали, что имеются специальные места прикрепления паразитических грибов к клеткам их хозяев, так называемые места узнавания топографии и ультраструктуры клетки-жертвы. Связывание происходит за счет комплиментарных макромолекул, которыми являются белки или гликопротеины, на поверхности как паразита так и жертвы (Monocha a Chen, 1990). Известно, что прикрепление Bdellovibrio клетке бактерии-жертвы является двухфазным процессом. Первая фаза прикрепления неспецифична и об-

ратима, обусловлена возникновением электростатических связей между клеточной стенкой бактерии-жертвы и хищника (Abram, 1973). Вторая фаза прикрепления специфична и необратима. По данным Чемерис с соавт.(1984), эта стадия взаимодействия обусловлена специфическим связыванием лектина, локализованного в клеточной стенке бделловибриона и комплиментарных ему Сахаров липополисахаридов бактерии-жертвы. Показано, что механизм углевод-белкового узнавания достаточно универсален и определяет также начальные этапы взаимодействия бактериальных хищников рода Micavibrio с клетками жертвы (Chemeris a Afmogenova, 1986). Показано, что многие бактерии прикрепляются к твердым поверхностям за счет внеклеточных полимеров, которые выполняют функцию адгезинов (Costerton et al.,1978; Read a Costerton, 1987). Секретируемые полимеры могут вести себя как полиэлектролиты, вызывая, помимо адгезии бактерий к твердым поверхностям, флоку-ляцию бактериальной суспензии. Как и в процессах адгезии, в образование клеточных агрегатов вовлекаются ионные, водородные связи, гидрофобные взаимодействия (Marshall, 1984), внеклеточные вещества (Jones et al., 1969). Известно, что в образовании конгломератов Zooglea raminogera, Pseudomonas, Aerobacter и многих других бактерий важную роль играют фибриллы целлюлозной природы (Dienema a Zevenuizen, 1971). Флетчер и Маршал (Fletcher а Marshall, 1983) предположили, что в процессе необратимой адсорбции принимают участие три вида полимеров: липополисахариды у грамотрицатель-ных бактерий (Beveridye et al., 1997) пептидгликан у грамположительных и внеклеточные полисахариды и капсулы, которые встречаются как у грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Гистохимическими и химическими методами была выявлена полисахаридная (Fletcher a Floodgate, 1973; Costerton et al., 1978;) и гликопротеиновая природа этих полимеров (Corpe et al., 1976). У некоторых бактерий эти полимеры присутствуют в клеточной оболочке до прикрепления (Fletcher a Floodgate, 1973), тогда как у других они секретируются в период необратимого прикрепления и образуют своего рода полимерный мостик, соединяющий бактерию с поверхностью

(Marshall et al., 1973). Адгезия одних микроорганизмов на поверхности сорбента, на котором существует ограниченное число мест для прикрепления бактерий, и продуцирование внеклеточных полимеров, приводит к модификации поверхности и способствует расширению, мест на которых могут прикрепляться другие бактерии (Kiremitci et al., 1989). Бактерии способны размножаться на поверхности, образуя тем самым колонии, а затем биослои, биопленки, толщина которых со временем увеличивается до десятков микрон (Fletcher a Marshall, 1983). Таким образом, биополимеры являются одним из основных функционально значимых компонентов как при адгезии перифи-тонных микроорганизмов, так и при агрегации бактерий (Marshall, 1984).

Различают естественную и искусственную когезию микроорганизмов. При естественной когезии генезис конгломератов клеток является частью естественного развития организма, независимо от того, происходит оно в природе или в лабораторных условиях. Примером когезии такого типа является механизм половой аглютинации у дрожжей, поведение миксобактерий, уникальных по биологии развития организмов, при образовании на поверхности ага-ризованных сред плодовых тел в процессе кооперативного морфогенеза. Искусственная агрегация клеток характерна для бактериальных культур в нефизиологических условиях, при помощи которых можно воздействовать на электрокинетический потенциал клетки, изменяя свойства поверхности клетки бактерии.

Форстер с соавт. (Forster et al., 1985) описывают еще один тип когезии микроорганизмов, получивший название аутофлоккуляция, под которой понимают процесс агрегации микробных клеток, вызываемых действием агентов микробного происхождения, например, продуктами клеточного лизиса.

Таким образом, по своей природе процессы адгезии и когезии микроорганизмов представляют явления одного порядка. Механизмы, лежащие в их основе универсальны. В соответствии с современной концепцией о роли пограничных процессов в экологии микроорганизмов, изучению микробной адгезии и когезии отводится центральное место в понимании жизнедеятельности

микроорганизмов в макро- и микросреде обитания.

3.2 Роль твердой поверхности в жизнедеятельности микроорганизмов.

Вопрос о влиянии адсорбентов на развитие бактерий имеет большой общеэкологический и практический интерес. В природе многие микробные популяции развиваются в присутствии твердых адсорбентов. При изучении водных микроорганизмов было показано, что многие из них активно прикрепляются к твердым поверхностям, растут и развиваются на них (Fletcher, 1979). Такие микроорганизмы называются ассоциированными с твердой поверхностью.

Разнообразие типов микробных сообществ на твердых поверхностях в водных системах в значительной мере зависит от таких условий, как концентрация питательных и биологически активных веществ. Вследствие легкого усвоения бактериями питательных веществ, адсорбированных на твердой поверхности в бедных средах, увеличивается их рост и дыхание (Gordon et al., 1983). Твердая поверхность может оказывать благоприятное действие, препятствуя рассеиванию экзоферментов и продуктов гидролиза органических веществ, которые концентрируются на поверхности вблизи от адсорбированных клеток. Помимо естественного органического вещества на твердой поверхности, в частности на стекле , могут сорбироваться и искусственно вносимые органические вещества.

По пищевым потребностям, согласно Поиндекстер (Poindexter, 1981), бактерии могут быть разделены на две большие группы: олиготрофы, способные к росту в бедной питательными веществами среде, и копиотрофы, нуждающиеся в больших концентрациях питательных веществ для своего роста. В настоящее время известно, что стратегия выживания копиотрофных бактерий в олиготрофных водоемах связана с измельчением голодающих клеток в популяции, повышением их адгезивной способности за счет увеличения гидро-фобности клеточной стенки (Kjelleberg a Hermanson, 1984) и секреции внеклеточных полимеров, отсутствующих у вегетативных форм клеток в благоприятных условиях роста. В прикрепленном состоянии карликовые копиотроф-

ные формы бактерий в процессе роста и размножения за счет адсорбированных на поверхности сорбента органических веществ восстанавливают свои первоначальные размеры (Fletcher a Marshall, 1983).

Введение твердых адсорбентов в среду для культивирования бактерий изменяет их скорость размножения, интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов бактерий. Изменяется также интенсивность дыхания бактерий, которая, по сообщениям одних авторов может увеличиваться при введении твердых субстратов в культуральную среду (Stotzky a Rem, 1966; Morisaki, 1983; 1984), и может уменьшаться в зависимости от конкретных условий эксперимента, в частности природы адсорбента (Bright а Fletcher, 1983). Иногда введение адсорбента дает возможность развиваться в данной среде микроорганизмам, которые без адсорбента вообще не развивались (Звягинцев, 1987). Причина изменения жизнедеятельности клеток при адгезиии заключается, по мнению Звягинцева (1987), в избирательной адсорбции органических веществ и создающейся при этом специфики условий на поверхности раздела твердой фазы и жидкости, а также возникновение специфических микрозон в этой области. Специфика условий может определяться взаимным расположением микроорганизмов и твердых частичек, а также насколько близко и плотно связаны бактерии с твердой поверхностью. Состав среды оказывает сильное воздействие на адгезию клеток и поведение бактерий в прикрепленном состоянии. Прежде всего большое значение имеет концентрация и природа содержащихся в среде солей, ионная сила, рН среды, наличие органических и других веществ, макромолекул, коллоидов. Эти вещества могут сорбироваться на поверхности, меняя ее характер, ультраструктуру и топографию, а также менять электрокинетический потенциал взаимодействующих поверхностей.

Таким образом, действие адсорбентов в первую очередь обусловлено свойствами их поверхности, а также изменением концентрации и активности различных веществ на границе твердого тела и жидкости. Очевидным преимуществом жизнедеятельности микроорганизмов в прикрепленном состоя-

нии является экономия энергии, затрачиваемой на поиски доступных источников питания, устойчивость к турбулентным водным потокам и наличие на поверхности адсорбента питательных веществ. С другой стороны бактерии в адгезированном состоянии теряют ряд преимуществ планктонных форм: лимитирование массообмена питательных веществ и газов в полимерном мат-риксе, формируемом прикрепленными клетками. В таком матриксе межклеточные взаимоотношения микроорганизмов приобретают большую значимость, чем их взаимодействия с водной средой. Отмечается ингибирующее действие на рост микроорганизмов метаболитов и ингибиторов, сорбируемых поверхностями, на которых осуществляется жизнедеятельность бактерий (Напуоос! а Ри1, 1972). В естественной водной среде обитания предсказать активность прикрепленных бактерий особенно затруднительно, так как поверхности несут на себе не один вид бактерий а целые сообщества, между членами которого могут устанавливаться взаимодействия самого разного типа. Адгезия клеток выступает как экологическая приспособительная особенность бактерий. Влияние адсорбентов на жизнедеятельность микроорганизмов имеет и большой практический интерес. Адсорбенты широко применяются при культивировании микробных культур в некоторых микробиологических производствах, в очистных сооружениях при очистке сточных вод для удержания клеток при проточном культивировании.

Изучение специфики жизнедеятельности микроорганизмов, ассоциированных с твердой поверхностью, является ключом к пониманию микробиологических процессов в естественных и искусственных экосистемах.

Исследования, затрагивающие изучение экологической роли Вс1е11оу1Ьгю основывались на представлении о хищных бактериях, как части бактерио-планктона водных экосистем. Однако, с увеличением объема информации, все большее количество фактов не могло получить адекватного объяснения. К числу таких фактов относятся следующие: Вс1е11оу1Ьио имеет низкую выживаемость вследствие высокой скорости эндогенного дыхания (НезреП ег а1., 1974) и чрезвычайной подверженности отрицательному воздействию физико-

химических факторов (Abram a Davis, 1970; Wehr a Klein, 1971; Varón a Shilo, 1981). В своем жизненном цикле эти бактерии не имеют форм длительного переживания неблагоприятных внешних условий. В тоже время бделловиб-рионы выделяются из природных образцов различных климатических зон. Высокие концентрации грамотрицательных бактерий 107 кл/мл, необходимых для процесса взаимодействия с хищником, могут быть реализованы в локальных участках водных экосистем, а именно на поверхности твердых подводных предметов, в донных осадках. Бделловибрионы обнаружены в больших количествах в донных осадках и на границах раздела жидкой и твердой, а также жидкой и газообразной фаз (Williams, 1986; 1987; Williams a Falkler, 1989). Должной оценки факт такого обнаружения не получил.

На основе анализа и закономерностей межпопуляционных взаимоотношений, количественного распространения хищных бактерий в водных экосистемах, физиологии развития бделловибрионов нами предложена концепция существования бделловибрионов, в основе которой лежит положение о Bdellovibrio как организме, жизнедеятельность которого связана с поверхностями. Такое предположение требовало строгой экспериментальной проверки, доказательств взаимодействия хищника с твердой поверхностью. Несмотря на то, что бделловибрионы легко связываются с поверхностями, эта связь считается непрочной, обратимой и несовместимой с колоссальной скоростью, развиваемой хищником.

Искусственная иммобилизация бактериальной системы Bdellovibrio- бактерия-жертва помимо перспективного подхода для адекватного моделирования особенностей существования клеток в природных условиях и понимания природных процессов с участием бактериальных хищников, масштабов их жизнедеятельности, а также изучения пока еще мало понятных аспектов их биологии, таких как, например, форма существования в природе, представляет интерес с практической точки зрения. Изучение этих вопросов открывает перспективы искусственной интродукции бактериальных хищников в загрязненные воды для защиты окружающей среды от микробного заражения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шорохова, Анна Павловна

выводы

1. Разработаны способы иммобилизации клеток двухкомпонентной системы в полиакриламидном геле и на поверхности гранулированных и волокнистых носителей. Показано, что выживаемость Вёе11оу1Ьпо во внутриклеточной стадии развития (бделлопласт) при включении в ПААГ значительно превышает выживаемость хищника на внеклеточной стадии развития. Подобраны оптимальные условия (иммобилизация бделловибрионов во внутриклеточной стадии развития, рН суспензии 7,0-7,2; время экспозиции -30 минут;, температурный режим - 30°С и плотность бактериальной суспензии -108 бделлопластов/мл) иммобилизации клеток двухкомпонентной системы на поверхности активированного углеродно-волокнистого материала (АУВМ-Ш), обеспечивающие максимальную удельную емкость носителя для бделлопла-стов.

2. Установлено активное функционирование двухкомпонентной системы хищник-жертва в иммобилизованном состоянии. Экспериментально доказано осуществление всех стадий процесса взаимодействия ВёеПоуШпо с клетками жертвы в условиях иммобилизации на поверхности волокнистого носителя АУВМ-Ш и в ПААГ, при их продолжительном сосуществовании. Коиммоби-лизация бделлопластов с клетками жертвы при адгезии на волокне и включении в ПААГ не нарушает процесс взаимодействия хищника с жертвой и пролонгирует жизнеспособность клеток двухкомпонентной системы.

3. Выявлен обратимый, зависимый от концентрации клеток жертвы феномен когезии бделлопластов в периодической двухкомпонентной системе и иммобилизованной системе. Процесс когезии бделлопластов завершается формированием особой разновидности покоящихся форм, организованных по типу цист с многоклеточным сложноструктурированным «ядром» и обширной полисахаридной оболочкой («коллективная циста»).

4. Инвазия бделловибрионов повышает гидрофобность клеток жертвы. Адгезивные свойства бделлопластов превышает адгезивные свойства внеклеточных хищников по отношению к большинству исследованных носителей гранулированной и волокнистой природы. Гидрофобное взаимодействие является основным механизмом в процессе адгезии Bdellovibrio на поверхности АУВМ- III и когезии бделлопластов в суспензии клеток двухкомпонентной системы.

5. Интродукция иммобилизованных на волокнистых носителях клеток Bdellovibrio в сточные воды ускоряет процесс обеззараживания загрязненной воды и повышает его эффективность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках предложенной нами модели поведения Вс1е11оу1Ьгю в природной среде обитания в поверхностно- ассоциативном состоянии впервые была проведена иммобилизация бделловибрионов на поверхности гранулированных и волокнистых носителей, а также в ПААГ во внутриклеточной стадии развития. Такой метод иммобилизации позволил повысить процент прикрепления бделловибрионов, за счет, как нами было показано повышенной гидрофобно-сти бделлопластов, по сравнению с интактными клетками, к твердым поверхностям, а также увеличить выживаемость хищника при включении его в гранулы геля.

В ходе изучения иммобилизованных систем хищник-жертва было установлено, что иммобилизованный бделловибрион способен не только завершать свой инфекционный цикл, но и сохранять способность к инфицированию клеток бактерии-жертвы, внутриклеточному развитию как на поверхности волокна, так и в гранулах геля и выходу в жидкую фазу. Динамическое равновесие хищника и жертвы на поверхности АУВМ-Ш и в матриксе ПААГ регулировалось концентрацией последнего - увеличение числа клеток бактерии-жертвы интенсифицировало процесс взаимодействия.

Большое значение для понимания экологии ВсЬПоуПшо имеют полученные нами данные о сохранении хищниками жизнеспособности в иммобилизованном состоянии в течение длительного времени - более 21-го месяца.

Наши исследования показали, что бделловибрион во внутриклеточной стадии развития более резистентен к неблагоприятным факторам внешней среды (Шорохова с соавт., 1992), а также к токсическому воздействию мономеров и катализаторов ПААГ, чем во внеклеточной стадии. Находясь внутри бделлопласта, хищник имеет механизм адекватной реакции на экстремальные изменения в макросреде. При снижении концентрации бактерии-жертвы в двухкомпонентной системе ниже критического уровня, наблюдалось явление когезии бделлопластов - естественной иммобилизации клеток в растворе. Добавление в среду клеток бактерии-жертвы и клеточного экстракта инициировало дезагрегацию уже сформировавшихся конгломератов. Процесс агрегации бделлопластов был выявлен и на поверхности АУВМ-Ш. По-видимому, в естественной среде обитания внутриклеточная стадия является доминирующей по времени в жизненном цикле Вс1е11оу1Ьгю.

Рис.25. Схема. Предполагаемая модель поведения Вбактерии

7 3 жертвы больше 10 кл/мл, Б- 10 кл/мл - обычная концентрация грамотрица-тельных бактерий в водных экосистемах.

Таким образом, внутриклеточная стадия развития Вс1е11оу1Ьпо обладает рядом экологических преимуществ, которые можно сформулировать следующим образом (рис. 25): 1- повышенная адгезивность, обеспечивающая хищнику эффективную колонизацию твердых поверхностей; 2- повышенная резистентность по сравнению с хищниками вне клетки жертвы к неблагоприятным факторам; 3- наличие у внутриклеточных бделловибрионов механизмов адекватной реакции на внешнее окружение, вплоть до прекращения деления на стадии внутриклеточного развития. Кроме того, образующиеся конгломераты представляют собой не просто скопления клеток, а сложные структурированное образования с многоклеточным "ядром", в виде плотноупако-ванных бделлопластов, заключенных в матрикс, содержащий везикулы и остатки мембран клеток жертвы и вещество полисахаридной природы. Внутриклеточный бделловибрион окружен дополнительным слоем пепдидогликанов, в виде везикул, которые отшнуровываются от внешней мембраны хищника. "Ядро" окружено оболочкой плотноупакованных фибрилл полисахаридной природы. В таком состоянии бделловибрион может длительное время переживать неблагоприятные условия без потери жизнеспособности. Для этого состояния характерны признаки, свойственные покоящимся формам микроорганизмов: прекращение деления клеток, устойчивость к экстремальным воздействиям, отличающиеся от вегетативных клеток особенности ультраструктурной организации, выживаемость в течение длительного времени, образование их в жизненном цикле микробных культур (Калакуцкий и Агре, 1977). Подобные образования являются своего рода "коллективными цистами".

В связи с своеобразием условий среды обитания Bdellovibrio нами была показана значительная толерантность бделловибрионов к условиям аноксии. Был установлен факт длительного существования хищника в условиях анаэробиоза с сохранением инфекционной активности (24 сут.) (Афиногенова с соавт., 1991). При просмотре в световом микроскопе бделловибрионы находились во внутриклеточной стадии развития в конгломератах бделлопластов.

В ходе исследований было показано, что в процессе адгезии клеток на поверхности АУВМ-Ш и когезии бделлопластов в суспензии принимают участие силы электростатического и гидрофобного взаимодействия.

Создание иммобилизованных систем представляется одним из наиболее оптимальных путей решения проблемы интродукции Bdellovibrio в загрязненные природные источники. В модельных экспериментах in situ нам удалось в несколько раз повысить интенсивность и ускорение процесса обеззараживания за счет интродукции иммобилизованных на волокнистых носителях клеток ВёеПоуШпо. Результаты модельных экспериментов с интродукцией иммобилизованных на носителе бделловибрионов в загрязненные воды свидетельствуют о перспективности их использования с целью усовершенствования способов очистки воды.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шорохова, Анна Павловна, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Афиногенова A.B. Особенности взаимодействия Bdellovibrio bacteriovorus с клетками бактерий-хозяев. Канд. дисс. Пущино, 1978.

2. Афиногенова A.B. Бактериальные паразиты водных экосистем (Blellovibrio и Micavibrio) // Док дисс. - М.1992

3. Афиногенова A.B., Ламбина В.А. Влияние температурного фактора на динамику взаимодействия Bdellovibrio bacteriovorus с бактерией-хозяином // Микробиология.-1977. Т. 46, N 4.-С. 741-745.

4. Афиногенова A.B., Ратнер E.H., Ламбина В.А. Колебания численности паразита и хозяина в двухкомпонентной бактериальной системе //Микробиология.- 1978.Т 47, N 2.-С 265-269.

5. Афиногенова A.B., Шкидченко А.Н., Ламбина В.А. Сравнительное изучение динамики взаимодействия Bdellovibrio bacteriovorus с бактерией-хозяином в аэробных и анаэробных условиях // Микробиология.-1979. Т. 48, N 1.-С. 102-105.

6. Афиногенова A.B., Ромай Пенабад С., Коновалова С.М., Чуркина Л.Г., Ламбина В.А. Сравнительная характеристика штаммов Bdellovibrio, выделенных из речной и сточных вод // Микробиология,-1981. Т. 50, N 2.- С. 378-385.

7. Афиногенова A.B., Ромай Пенабад С., Чуркина Л.Г., Ламбина В.А. Способ опреднления чувствительности к птеридину паразитических бактерий рода Bdellovibrio // Биол. науки.-1983. N 6.- С. 104-105.

8. Афиногенова A.B., Шорохова А.П., Чувильская H.A., Фихте Б.А. Двухком-понентная бактериальная система Bdellovibrio - бактерия- хозяин в условиях аноксии // Микробиология.-1991. Т. 60, N 2.- С. 253-258.

9. Александрушкина Н.И., Комиссарова Л.В., Гершанович В.Н., Ванюшин Б.Ф. Нуклеотидный состав и пиримидиновые блоки ДНК паразитической и сапрофитной форм Bdellovibrio bacteriovorus // ДАН АН СССР.-1974.-Т. 219, N 3.-С.738-741.

10. Белецкая О.П., Рязанова Л.П., Полоротова Е.В., Кан Дон Ук, Стефанова

М.Е., Стайкова Д.Д., Панин A.JL, Ледова Л.А., Говорко Д.В. Целлюлазы и кеиланазы грибов рода Aspergillus: свойства, физиологическая роль, способ образования множественных форм // Актуальные проблемы биохимии прокариотов и эукариотов. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1991.- С. 90- 107.

П.Бобык М.А., Афиногенова A.B., Чуркина Л.Г., Заичкин Э.И., Ламбина В.А., Кулаев И.С. Очистка Bdellovibrio bacteriovorus от клеток и мембран бактерий-хозяев // - Изв. АН СССР сер биол. 1978. N 1.-С. 155.

12. Бородинская И.Н., Мишунин И.Ф. Адсорбция аминокислот и пептидов активированным углеродно-волокнистым носителем // Укр. биол. ж. 1988. Т 60, N3. -С. 81-84.

13. Буковская С.Н. Распространение бделловибрио бактериоворус в воде открытого водоема и его роль в процессах самоочищения // Гигиена и санитария." 1974.-N 12.-С.86-88.

14. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. Методы почвенной микробиологии // Изд. Московского университета. 1952.

15. Вольтерра В. Математическая теория борьбы за существование. М: Наука, 1976.

16. Гершанович В.Н., Комиссарова Л. В., Юровицкая Н.В. О некоторых биохимических особенностях факультативно паразитирующего штамма Bdellovibrio bacteriovorus // ЖМЭИ.-1974.-Ы 7.-С. 35-39.

17. Григорьева Л.В., Корчак Г.И., Пономарева Л.В. Обнаружение бделловиб-рионов и бактериофагов в прибрежной зоне моря // ЖМЭИ.- 1976.-N 10.-С. 41-44.

18. Доскина Т.В. Выделение паразитических и сапрофитных форм бделловибрио бактериоворус из вод различной степени загрязнения // Актуальные вопросы гигиены населенных мест, М., 1973.-С. 40-43.

19. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова Думка, 1982.

20. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. Изд. МГУ, 1973.

21. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд. Московского Университета. 1987.

22. Ибрагимов Ф.Х. Обсеменение бактериями Bdellovibrio bacteriovorus организма животных и их взаимодействие с возбудителями острых кишечных инфекций // ЖМЭИ.-1980.-N 5.-С.97-99.

23. Калакуцкий J1.B., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. М.: Изд. "Наука".1977.

24. Козляк Е.И., Якимов М.М., Уткин И.Б., Рогожин И.С., Соломон З.Г., Без-бородов A.M. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции // Прикл. биохимия и микробиология 1991.- Т. 27, N 6.-С. 788-803.

25. Коновалова С.М. Цитологические исследования Bdellovibrio bacteriovorus Bdellovibrio bacteriovorus // Канд.дисс., Пущино, 1986.

26. Коновалова С.М., Ламбина В.А., Бирюзова В.И. Электронномикроскопи-ческое исследование жгутиков Bdellovibrio bacteriovorus // Микробиология 1977.-Т.46, N.1.-C. 134-136.

27. Кощеенко К.А., Суходольская Г.В. Иммобилизация клеток микроорганизмов. // Сб. научн. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущино, 1987, С.

28. Кощеенко К.А., Суходольская Г.В. Иммобилизованные клетки: трансформация стероидов // Иммобилизованные клетки и ферменты / Ред. Д. Вуд-ворд, М.: Мир. - 1988,- С. 115-153.

29. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука, 1989.

30. Кузнецов С.И., Иванов М.В., Ляликова H.H. Введение в геологическую микробиологию. М.Ж Изд. АН СССР, 1962.

31. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.Ж Высшая школа, 1973.

32. Ламбина В.А., Афиногенова A.B., Балыкин A.B. Распространение бделло-вибрионов в прибрежной зоне озера Иссык-Куль и их взаимоотношения с бактериями-хозяевами // Биологические науки. - 1986.- N 10.-С.87-90.

33. Ламбина В.А., Иванчикова С.М. Динамика изменения ядерного аппарата

Bdellovibrio bacteriovorus и бактерии-хозяина Escherichia coli в процессе их взаимодействия //Цитология.-1973.-Т. 15, Т10.- С.1312-1314.

34. Ламбина В.А., Иванчикова С.М., Бирюзова В.И. Электронномикроскопи-ческие исследования паразита бактерий Bdellovibrio bacteriovorus Stolp а Starr gen et sp. nov. // Микробиология.-1973.-Т.42, T5.-C.859-861.

35. Ламбина B.A., Чувильская H.A., Ледова Л.А., Афиногенова A.B., Авербург И.В. Количественные закономерности распространения Bdellovibrio bacteriovorus в речной воде //Микробиология. -1974.- Т 43, N4.-С. 715-720.

36. Ламбина В.А., Ледова Л.А., Сщухина Н.С. Участие бделловибрионов в процессах самоочищения сточных вод // Микробиология.- 1981.-Т.50, Т1.-С.140-146.

37. Ламбина В.А., Афиногенова A.B., Ромай Пенабад С., Коновалова С.М., Пушкарева А.П. Micavibrio admirandus gen. et sp. nov. // Микробиология. -1982.-T.51, Tl.-С. 114-117.

38. Ламбина B.A., Ледова Л.А., Кутлиев Д.К. Факторы, влияющие на участие бактерий рода Bdellovibrio в процессах самоочищения реки Сырдарьи // Биол. науки. -1983. -Т6. - С. 78-83.

39. Ламбина В.А., Ледова Л.А., Афиногенова A.B. Взаимоотношения бделловибрионов с бактериями-хозяевами в прибрежной зоне северовосточной части Черного моря // Микробиол. ж.- 1987 а. -Т.З, N49.-C 41-46.

40. Ламбина В.А., Ледова Л.А., Чуркина Л.Г. Значение бделловибрионов в регуляции микробных ценозов и процессах самоочищения бытовых сточных вод // Микробиология.-1987 б.- Т. 56, N 5.-С. 860-864.

41. Маркелова Н.Ю., Керженцев A.C. Выделение и спектр литического действия нового изолята рода Bdellovibrio из ризосферы растений // Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 6. - С. 837-841.

42. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. Карбоксилазы пирувата и фосфоенолпиру-вата у метилотрофов.// Микробиология. - 1979. - Т. 47, N 2.-С.

43. Мишустин E.H., Никитина Э.С. Цистоподобные клетки почвенного штамма Bdellovibrio bacteriovorus // Изв. АН СССР. Сер. биол.- 1972. -N1.- С.

149-150.

44. Мишустин E.H., Никитина Э.С., Березина Ф.С. Галотолерантные формы Bdellovibrio в иле и воде озера Балхаш и Аральского моря // Изв. АН СССР. Сер. биол. -1974.-N 1.-С. 127-128.

45. Моулдер Д. Биохимия внутриклеточного паразитизма // М. Мир. 1965.

46. Никитин Д.И.,Никитина Э.С. Процессы самоочищения окружающей среды и паразиты бактерий (род Bdellovibrio). М. Наука, 1978.

47. Никовская Г.Н., Гордиенко A.C., Глоба Л.И. Гидрофильно-гидрофобные свойства микроорганизмов при различных условиях культивирования // Микробиология. -1989. -Т.58, N 3. - С. 448-451.

48. Новожилова М.И., Семенченко Г.В., Тарасова Л.П. Паразитирующие микроорганизмы в водной толще и иловых отложениях Аральского моря // Изв. АН КазССР. Сер.биол. -1983. -N 5.- С. 39-45.

49. Печников Н.В., Афиногенова., Ламбина В.А. Особенности образования бделлопластов бактерии-хозяина в процессе взаимодействия // Цитология.-1974.- Т. 17, N3 - С. 343-347.

50. Плохинский H.A. Математические методы в биологии // Изд. Московского унивевситета. 1978.

51. Сергеев В.П., Рожавин М.А., Литвинов В.Ф., Баглей H.H. Микробиологические исследования сорбции различных видов бактерий аппликационным АУВМ "Днепр" МН. 1 Всесоюзная конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов". Тез. докл. М. 1989.

52. Сидоренко Г.И., Багдасарьян Г.А.,Талаева Ю.Г., Абиева P.M., Сатдыков Ш.И. Изучение бделловибрио бактериоворус как одного из биологических факторов самоочищения воды водоемов // Гигиена и санитария.-1973. -N 1. - С. 11-14.

53. Фихте Б.А.., Заичкин Э.И., Ратнер E.H. Новые методы физического препарирования биологических объектов для электронно - микроскопических исследований. Москва. "Наука". 1973.

54. Чемерис Н.А., Афиногенова А.В., Царикова Т.С. Роль углевод- белкового узнавания в процессе прикрепления Bdellovibrio к клеткам бактерий-хозяев // Микробиология. - 1984. - Т.53, в.4. - С. 556-558.

55. Чувильская Н.А. Количественные закономерности распространения Bdellovibrio bacteriovorus в речной воде // Канд. дисс. Пущино, 1981.

56. Чувильская Н.А., Ледова Л.А., Чуркина Л.Г., Ламбина В.А. Bdellovibrio bacteriovorus как фактор самоочищения речной воды // Гигиена и санитария.-1976.-N2.-C. 10-13.

57. Шорохова А.П., Маркелова Н.Ю., Афиногенова А.В. Сравнительное изучение чувствительности к физико -химическим факторам паразитических бактерий Bdellovibrio и Micavibrio // Микробиология.-1992. Т. 61, N 1.- С. 53-56.

58. Abram D. Structural aspects of Bdellovibrio-prey interaction // Abstr. Symp. Intern. Assoc. Microbiol. Soc. Jerusalem.- 1973. -Vol. 1. -P. 106-107.

59. Abram D., Castro e Melo J., Chou D. Penetration of Bdellovibrio bacteriovorus into host cell // J. Bacteriol. -1974. -Vol. 118, N2. -P. 663-680.

60. Abram D., Davis B.K. Structural properties and features of parasitic Bdellovibrio bacteriovorus //J. Bacteriol. -1970 .- Vol. 104, N2. -P. 948-965.

61. Abram D., Shilo M. Structural features of Bdellovibrio bacteriovorus in cultures and in host-parasite mixtures // Bacteriol. Proc. 1967. N 1 -P.41.

62. Amat Sanchez A., Torrella F. Isolation and characterization of marine and salt pond halophylic bdellovibrios // Can. J. Microbiol. -1989. -Vol. 35, N8. -P. 771778.

63. Amat Sanchez A., Torrella F. Formanion of stable bdelloplastsas a starwation-survival strategy of marine bdellovibrios // Appl. Env. Microbiol. -1990,- Vol. 56, N9.-P. 2717-2725.

64. Andreev L.V., Afinogenova A.V., Romay Penabad Z., Lambina V.A. Peculiarites of the fatty asid composition of Bdellovibrio // Folia microbiol. -1983.- Vol. 28, N1.-P. 28-35.

65. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th ed. Baltimore: Williams and

Wilkins Co. -1984. -Vol. 1.- P. 118-124.

66. Beveridge T.J., Makin S.A., Kadurugamuva J.L., Zushing Li. Interacnion between biofilms and the environment // FEMS Microbiol. Rew. - 1997.- N 20. - P. 291-303.

67. Bobyk M.A., Afinogenova A.V., Dudinskaya M.V., Lambina V.A., Kulaev I.S. Detection of polyphosphates and enzimes of polyphosphate metabolism in Bdellovibrio bacteriovorus // Zbl. Bakt., II Abt., B.135, H. 6, S. 461-466. 1980.

68. Bright J.J., Fletcher M. Amino acid assimilation and eletron transport system activity in attached and freeliving marine bacneria // Appl. Envron. Microbiol. -1983.- Vol. 45, N 3.- P. 818-825.

69. Bryers J.D., Characrlis W.J. Processes governing primari biofilm formation // Biotech. Bioeng. -1982. -Vol. 24, N 11.-P. 2451-2476.

70. Burger A., Drews G., Ladwig R. Wirtskreis und Infections cyclus eines neu isolierten Bdellovibrio bacteriovorus - Stammes // Arch. Microbiol. -1968.-Vol. 61, N3,-P. 261-278.

71. Burnham J.C., Hashimoto T., Conti S.F. Electron microscopie observations on the penetration of Bdellovibrio bacteriovorus into gram-negative bacterial hosts // J. Bacteriol. -1968. -Vol. 96, N 4.-P. 1366-1381.

72. Burnham J.C., Hashimoto T., Conti S.F. Ultrastructure and cell division of a facultatively parasitic strain of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1970. -Vol. 101, N3. -P. 997-1004.

73. Busscher H.J., A.H. Weerkamp, H.C. van der Mei, A.W.J, van Pelt H.P. de Jong, J. Arends. Measurement of the surface free energy of bacterial cell surfaces and its relevance for adhesion // Appl. Environ. Microbiol. -1984.-Vol. 48, N 5.-P. 980-983.

74. Campanile E., Ferro V., Simone E., Grasso S., Fusco R. Souches bacteriolytiques dans l'eau de mer // Rev. Intern. Oceanogr. Med. -1970.-Vol. 1819. -P. 117-124.

75. Cassidy M.B., Lee H., Trevors J.T. Environmental applications of immobilized microbial sells: a reviev// J Indust. Microbiol. - 1996.- N 16. - P. 79 - 101.

76. Chemeris N.A., Afinogenova A.V. Role of carbohydrate receptor in the interaction of Micavibrio admirandus and host- bacterium //Zbl.Bakt., II Abt., B. 141, H7, S. 559-562. 1986.

77. Corberi E., Solaro M.L. Ricerche sulla presenza in diversi terreni coltivati di un microorganismo predatore di batteri //Ann. Microbiol. Enzimol. -1971.-Vol. 21, N l.-P. 123-133.

78. Corpe W.A., Matsuuchi L., Armbruster B. Secretion of adhesive polimers and attachment of marine bacteria to surfaces // Proc.3d Intern. Biodegrad. Symp., Sharpley I.M., Kaplan A.M. (eds)., Appl. SC. Pabl., L, -1976 -P.433-442.

79. Costerton J.W. Overview of microbial biofilms // J. Industr. Microbiol. - 1995. -N 15, P. 137-140.

80. Costerton J.W., Cheng K.I., Geesey G.G., Ladd T.I., Nickel J.C., Dasgupta M., Marrie T.J. Bacterial biofilm in nature and desease // Annu. Rev. Microbiol. -1987.- Vol. 41, P. 435-464.

81. Costerton J.W., Irwin R.T., Cheng K.I. The bacterial glicocalex in nature and disease. // Annu. Rev. Microbiol. - 1981. - Vol. 35, P. 299-324.

82. Cotter T.W. and Thomashow M.F. A conjugation procedure for Bdellovibrio bacteriovorus and its use to indentify DNA sequences that enhance the plaque -forming ability of spontaneus host - independent mutant // J. Bacteriol.-1992a.-Vol. 174, N 19.-P. 6011-6017.

83. Cotter T.W. and Thomashow M.F. Identification of a Bdellovibrio bacteriovorus genetic locus hit, associatiated with the host independent phenotipe // J. Bacteriol. -1992b.- Vol. 174, N 19.- P. 6018-6024.

84. Cover W.H., Martinez R.J., Rittenberg S.C. Permeability of the boundary layers of Bdellovibrio bacteriovorus 109J and its bdelloplasts to small hydrophylic molecules // J. Bacteriol. -1984. - Vol. 157, N2. -P. 385-390.

85. Crothers S.F., Robinson J. Changes in the permeability of Escherichia coli during parasitization by Bdellovibrio bacteriovorus // Can. J. Microbiol. -1971. -Vol. 17, N5.-P. 689-697.

86. Dahlback B., Hermanson M., Kjelleberg S., Norksans B. The hydrophobicity of

bacteria - an important factor in their initial adhesion at the air -water interface // Arch. Micribiol. -1981. -Vol. 128, N 4.-P. 267-270.

87. Daniel S. Etude de l'influence de Bdellovibrio bacteriovorus dans l'auto-epuration marine // Rev. Int. Oceanogr. Med. -1969. - Vol. 15-16.-P. 61-102.

88. Dienema M.N., Zevenuizen L.P.T.M. Formation of cellulose firils by gramnegative bacteria and the role in bacterial flocculation //Arch. Micribiol. -1971. -Vol. 78, N1.- P. 42-57.

89. De Pamphilis M.L., Adler J. Fine structure and isolation of the hookbasal body complex of flagella from Escherichia coli and Bacillus subtilis // J. Bacteriol. -1971. -Vol. 105, N l.-P. 384-395

90. Desai D.R., Williams H.N. Quantitative recoveri Bdellovibrios from aquatic habitats // Abstr. Ann. Meet. ASM, W. 1986,- P. 248.

91. Dias F.T., Bhat J.V. Microbial ecology of activated studge. II. Bacteriophages, Bdellovibrio, coliforms and other organisms // Appl. Microbiol. -1965. -Vol. 13, N2.-P. 257-261.

92. Diedrich D.L., Denny C.F., Hashimoto T., Conti S.F. Facultatively parasitic strain of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1970. -Vol. 101, N 3.-P. 989996.

93. Dubuis M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugar and related substrated substancens // Anal. Chem. -1956. - Vol. 281, N 1. P. 350.

94. Engelking H.M., Seidler R.J. The involvement of extracel- lular enzymes in the metabolism of Bdellovibrio //Arch. Microbiol. -1974. -Vol. 95, N 4.-P. 293-304.

95. Enzinger R.M., Cooper R.C. Role of bacteria and protozoa in the removal of Escherichia coli from estuarine waters // Appl. Env. Microbiol. -1976. -Vol 31, N5.-P. 758-763.

96. Fattom A., Shilo M. Hydrophobicity as an adhesion mechanisms of benthic cyanobacteria// Appl. Env. Microbiol. -1984. - Vol.47, N l.-P. 135-143.

97. Ferro V., Simone E., Campanile E., Fusco R., Grasso S. Recherche du Bdellovibrio bacteriovorus dans la mer, les fleuves et les eaux d'egout // Rev.

Intern. Oceanogr. Med. -1970. -N 18-19.- P. 109-115.

98. Finance C. Contribution a l'etude de la bacteriolyse spontanee dans les rivieres Moselle et Meurthe // These Doct. Pharm., Paris, 1976.

99. Fletcher M. The attachments of bacteria to surfaces in aquatic environments // In "Adhesion of microorganisms to surfaces" a Melling I (eds) Acad. Press Let. 1979.- Ellwood D.C., London, New York, San Francis. -P.87-108.

100. Fletcher M., Floodgate G.D. An electron - microscopic demonstration of an acid polysaccharide involved in the adhesion of marine bacterium to solid surfaces // J. Gen. Microbiol. - 1973. - Vol. 74, N 2.- P. 325-334.

101. Fletcher M., Marshall K.C. Are solid surfaces of ecologi- cal significance to aquatic bacteria? // Adv. Microb. Ecology / Ed. K.C.Marshall, N.Y.: Plenum Press, 1982. - Vol. 6.- P. 199-236.

102. Forster C.P., Knight N.I.B., Wase D.A.I. Autofloculation - floculation under the treatment of microbial agents.// In "Adv. Biotech. Proc." -1985. -N 4, -P. 211-240.

103.Framico P.M., Cooke P.H. Isolation of bdellovibrios that prey on Escerichia coli 0157/H7 and Salmonella spesies and application for removal of prey from stainless-steel surfaces // J. Food Safety. - 1996.- Vol 16, N 2. - P. 161 - 173.

104. Framico P.M., Writing R.C. Ability of Bdellovibrio bacteriovorus 109J lyse gram- negative food - borne pathogenic and spoilage bacteria // J. Food Protection - 1995 Vol 58, N 2. - P. 160 - 164.

105. Friedberg D. Effect of light on Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1977. - Vol. 131, N 2.- P. 399-404.

106. Friedberg D. Growth of host dependent Bdellovibrio in host cell free system // Arch. Microbiol. -1978. -Vol. 116, N 2. - P. 185-190.

107. Fry J.C., Staples D.G. The occurrence and role of Bdellovibrio in a polluted river // Water Res.- 1974. - Vol. 8, N 12. -P. 1029-1035.

108. Fry J.C., Staples D.G. Distribution of Bdellovibrio bacteriovorus in sewage works, river water, and sediments // Appl. Env. Microbiol. -1976. -Vol. 31, N 4. -P. 469-474.

109. Fujimura M., Kato J., Tosa T., Chibaba I. Continuous production of Lovigimine using immobilized growing Servantia marcescens cells: effectiveness of supply of oxygen // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1984.-Vol. 19, N 2.-P. 79-84.

110. Gadkari D., Stolp H. Energy metabolism of Bdellovibrio bacteriovorus. I. Energy production, ATP pool, energy charge // Arch. Microbiol. - 1975.-Vol. 102, N3. -P. 179-185.

111.Galdiero F. Membrane damage and incorporation of Escherichia coli components into Bdellovibrio bacteriovorus // Zbl. Bakt. Hyg. -1975. -Abt. 1, Orig. A. -Vol. 230, N 2.-P. 203-209.

112. Germida J.J. Isolation of Bdellovibrio spp that prey on Azospirillum brasilense in soil // Can. J. Microbiol. -1987. -Vol. 33, N 5.-P. 459-461.

113. Gordon A.S., Gerchakv S.M., Millero E.J. Effects of innorganic particles on metabolism by a periphytic marine bacterium // Appl. Env. Microbiol. -1983. -Vol 45, N2.-P. 411-417.

114. Gordon R.F., Stein M.A., Diedrich D.L. Heat shock - induced axenic growth of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol.- 1993. - Vol. 175, N 7.- P. 21572161.

115. Gray K.M. and Ruby E.G. Prey-derived signals regulation of the develomental growth of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. - 1990. -Vol. 172, N 7.- P. 4002-4007.

116. Grindrod P. Models of individual aggregation or clustering in single and multi - species communities// J. Math. Biol. - 1988. -Vol. 26, N 6, -P. 651- 660.

117. Guelin A. L'intensite du pouvoir bactericide des eaux marines et leur teneur en microvibrions // C. R. Acad. Se. Serie D. - 1976. -Vol. 282.-P. 397-400.

118. Guelin A., Lamblin D. Quelqes remarques sur la presence des antagonistes du bacille typhique a la surface de denrees ali- mentaires // Ann. Inst. Pasteur de Lille.-1967. -P. 234-237.

119. Guelin A., Lepine P., Lamblin D. Pouvoir bactericide des eaux polluces et role de Bdellovibrio bacteriovorus // Ann .Inst. Pasteur. -1967. -Vol. 113, N4301. -P.

660-665.

120. Guerrero R., Esteve I., Pedros-Alio C., Gaju N. Predatory bacteria in prokaryotic communities: the earliest trophic relati- onships // Endocytobiology III / Eds. J.J. Lee a. J.F. Fredrick, Ann. N.-Y. Acad. Sci.-1987. - Yol. 503.-P. 238-250.

121. Guerrero R., Pedros-Alio C., Esteve I., Mas J., Chase, Margulis L. Predatory prokaryotes: predation and primary consumption evolved in bacteria // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. -1986. -Vol. 83, N7. -P. 2138-2142.

122. Harwood I H., Pirt S.I. Quantitative aspects of growth of the metane oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus on methane in sheke flask continuos chemostat culture. // J. Appl. Bacteriol. -1972. -Vol. 35,N4. -P. 597-607.

123. Hendricks C.W. Bdellovibrio bacteriovorus - Escherichia coli interactions in the continuous culture of river-water // Env. Let. -1974. -Vol.7, N4. -P.311-319.

124. Hentzschel G. Wechselwirkungen bakteriolytischer und saprophytischer Bakterien aus der Nordsee // Mitt. Inst. Allg. Bot. Hamburg. -1980. -N17. -P.l 13-124.

125. Hespell R.B. Glycolytic and tricarboxylic acid cycle enzyme activities during intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus on Escherichia coli // J. Bacteriol. -1976. -Vol. 128, N2.- P.677-680.

126. Hespell R.B., Miozzari G.F., Rittenberg S.C. Ribonucleic acid destruction and synthesis during intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1975. -Vol. 123, N2. - P.481-491.

127. Hespell R.B., Odelson D.A. Metabolism of RNA-ribose by Bdellovibrio bacteriovorus during intraperiplasmic growth on Escherichia coli // J. Bacteriol. -1978. -Vol. 136, N3. -P.936-946.

128. Hespell R.B., Rosson R.A., Thomashow M.F., Rittenberg S.C. Respiration of Bdellovibrio bacteriovorus strain 109J and its energy substrates for intraperiplasmic growth //J. Bacteriol. -1973. -Vol. 113, N3. -P.1280-1288.

129. Hespell R.B., Thomashow M.F., Rittenberg S.C. Changes in cell composition and viability of Bdellovibrio bacteriovorus during starvation // Arch. Microbiol.

-1974. - Vol.97, N4. -P.313-329.

130. Hoeniger J.F.M., Ladwig R., Moor H. The fine structure of "resting bodies" of Bdellovibrio sp. strain W developed in Rhodospirillum rubrum // Can. J. Microbiol. -1972. -Vol.18, N1. -P.87-92.

131.Hirsch P., Pankratz S.H. Study of bacterial populations in natural envirouments by use of submerged electron microscope grids // Z. Allg. Mikrobiol. -1970. -Vol.10, N8. -P.589-605.

132. Horowitz A.T., Kessel M., Shilo M. Growth cycle of preda- cious bdellovibrios: in a host-free extract system and some pro- perties of the host extract // J. Bacteriol. -1973. -Vol.117, N1. - P.270-282.

133. Huang J., Hooijmans C.M., Briasco C.A., Jeraats B.J.M., Luyben K.C.A.M., Thomas D., Barbotin J.-N. Effect of free-cell growth parameters on oxygen concentration profiles in gel-immobilized recombinant Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. -Vol.33, N6. P.612-623.

134. Huang J.C.C., Starr M.P. Possible enzymatic bases of bacteriolysis by bdellovibrios // Arch. Microbiol. -1973. -Vol.89, N2. - P. 147-169.

135. Ishiguro E.E. A growth initiation factor for host independent derivates of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1973. -Vol.115, N1. -P.243-252.

136. Jones H.C., Roth I.L., Sandres W.M. Electron microscopic study of a slime layer//J. Bacteriol. -1969. -Vol. 99,N1. -P.316-325.

137. Kelley J.I., B.-F. Turn, Williams H.N., Baer M.L. Effect of temperature, salinity, and substrate on the colonization of surfaces in situ by aquatic bdellovibrious// Appl. Env. Microbiol. -1997. -Vol 63, N 1. -P.84-90.

138. Keya S.O., Alexander M. Factors affecting growth of Bdellovibrio on Rhizobium // Arch. Microbiol. -1975a. -Vol.103, N1. - P.37-43.

139. Keya S.O., Alexander M. Regulation of parasitism by host density: the Bdellovibrio-Rhizobium interrelationship // Soil Biol. Biochem. -1975b. -Vol.7, N3. -P.231-237.

140. Kiremitci M., Ozigen M., Piskin E. Attachment and growth kinetiks of anchorage - dependent BHR cells on microcarriers // Enz. Microb Technol. -

1989. -Vol.11, N12. -P.830-836.

141. Kjelleberg S., Hermanson M. Starvation- induced effects on bacteria surface characteristics // Appl. Env. Microbiol. -1984. -Vol48, N 3. -P.497-503.

142. Klein D.A., Casida L.E. Occurence and enumeration of Bdellovibrio bacteriovorus in soil capable of parasitizing Escherichia coli and indigenous soil bacteria // Canad. J. Microbiol. -1967. - Vol.13, N9. -P.1235-1241.

143. Koval S.F., Bayer M.E. Bacterial capsules - no barrier against Bdellovibrio // Microbiology UK. 1997. - Vol.143, Iss Mar. - P.749-753.

144. Kuenen J.G., Rittenberg S.C. Incorporation of long-chain fatty acids of the substrate organism by Bdellovibrio bacteriovorus during intraperiplasmic growth // J. Bacteriol. -1975.- Vol.121, N3.- P.l 145-1157.

145. La Marre A.G., Straley S.C., Conti S.F. Chemotaxis toward amino acids by Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. - 1977. - Vol.131, N1. -P.201-207.

146. Luft J.H. Ruthenium red staining of the striated muscle cell membrane and the myotendinal junction.// VI Int. Congr. E.M. Kioto, 1966, P.65-66.

147. Marbach A., Varon M., Shilo M. Properties of marine bdellovibrios // Microbial. Ecology. -1976. -Vol.2, N4,- P.284-295.

148. Marshall K.C. Interfaces in microbial ecology. C.M.L.: Harvard Univ., 1976.

149. Marshall K.C. Microbial adhesion and aggregation. Springer Verlag, Berlin etc. 1984.

150. Marshall K.C., Cruickshank R.H. Cell surface hydrophobicity and the orientation of certain bacteria at interfaces // Arch. Mikrobiol. -1973. -Vol.91. -P.29-40.

151. Marshall K.C., Stout R., Mitcchell R. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces // J. Gen. Microbiol. -1971. -Vol.68.-P.337-348.

152. Matin A., Rittenberg S.C. Kinetics of deoxyribonucleic acid destruction and synthesis during growth of Bdellovibrio bacteriovorus strain 109D on Pseudomonas putida and Escherichia coli // J. Bacteriol. -1972. -Vol.111, N3. -P.664-673.

153.Mayrand D., Grenier D. Biological activites of outer membrane vesicles // Can. J. Microbiol. -1989.- Vol.35, N5. -P. 607-613.

154. McCann M.P., Solemeo H.T., Cusick F.Jr., McCullen C. Developmentally regulated protein sinthesis during intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus 109J // Can. J. Microbiol. - 1998. - Vol.44, N1. -P.50-55.

155. McEldowney S., Flether M. Variability of influence of physicochemical factors affecting bacterial adhesion to polystyrene substrate // Appl. Env. Microbiol. -1986. -Vol.52, N3. -P.460-465.

156. Meadows P.S. The attachment of bacteria to soid surfaces // Arch. Mikrobiol. -1971. -Vol.75. -P.374-381.

157. Miyamoto S. Physiological and ecological studies on marine bdellovibrios // J. Osaka city Med. Center. -1979. -Vol.28, N4. -P.501-519.

158. Morisaki H. Effect of solid-liquid interfase on metabolic activity of E.coli // J. Gen. Appl. Microbiol. -1983. -Vol.29, N3. -P. 195-204.

159. Morisaki H. Effect of liquid-liquid interfase on metabolic activity of E.coli // J. Gen. Appl. Microbiol. -1984. -Vol.1, N3. -P.35-43.

160. Monocha M.S., Chen Y. Specifity of attachment of fungal parasites to their host // Can. J. Microbiol. -1990. -Vol.36, N2. -P.69-76.

161. Motla M.C.M., Saraiva E.M.B., Filho F.C.S., Sousa W. Cell surface amd sugar residues of Crithida fasciculata and Crithida luciliae // Microbios. -1991. -Vol.275, N68. -P.87-96.

162. Mozes N., Rouxhet P.G. Method for measuring hydrophobicity of microorganisms // J. Microbiol. Methods. -1987. -Vol.6, N 12. -P.99-112.

163. Pan C.L., Hsu Y.L., Tsai G.J., Kuo H.J, Chang C.M., Wang F.J, Wu C.S. Isolation and identification of Bdellovibrio from coastal arias of Taiwan // Fisheries Sci. - 1997, Vol. 63, N 1.- P. 52 - 59.

164. Parker C.A, Grove P.L. Bdellovibrio bacteriovorus parasitizing Rhizobium in Western Australia // J. Appl. Bacteriol. -1970. - Vol.33, N1. -P.253-255.

165. Pedersen K. Electrostatic interaction chromatography, a method for assaying the relative surfase charges of bacteria // FEMS Microb. Let. -1980. -Vol.12, N4.

-P.365-367.

166. Poindexter J.S. Oligotrophy: fast and famine existence // Adv. Microb. Ecology / Ed. M.Alexander, N.-Y., Plenum Press, 1981.

167. Powell M.S., Slater N.K.H. Removal rates of bacterial cells glass surfaces by fluid shear // Biotechnol. Bioeng. -1982. -Vol.24, N11. -P.2527-2537.

168. Pritchard M.A., Langley D., Rittenberg S.C. Effects of methotrexate on intraperiplasmic and axenic growth of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1975.-Vol.121, N3. -P.l 131-1136.

169. Read R.R., Costerton J.W. Purification and characterization of adhesive exopolysaccharides from Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens // Can. J. Microbiol. -1987. -Vol.33, N12. -P.1080-1090.

170. Reid G., Bruce A.W., Llano M.,McGroarty G.A., Blake M. Bacterial aggregation in sepsis // Cur. Microb. -1990. -Vol.20, N3. -P. 185-190.

171. Reiner A.M., Shilo M. Host-independent growth of Bdellovibrio bacteriovorus in microbial extracts // J. Gen. Microbiol. -1969. -Vol.59, N3,- P.401-410.

172. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an eiectronopaque strain in electron microscope.// J. Cell. Biol. -1963. -Vol. 17. -P 208-212.

173. Rhodes M., Kator H. Survival of Escherichia coli and Salmonella spp. in estuarine environments //Appl. Env. Microbiol. 1988 Vol. 54, N12.- P. 29022907.

174. Rittenberg S.C. Strategies of microbiol life in extreme environments.// Ed. M.Shilo. B. Dahlem Konferenzen. - 1979.- P.303-322.

175. Rittenberg S.C., Hespell R.B. Energy efficiency of intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. - 1975. -Vol.121, N3.- P.l 158-1165.

176. Rittenberg S.C., Shilo M. Early host damage in the infection cycle of Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1970. - Vol.102, N1. -P.149-16

177. Romo A. J., Ruby E.G., Saier M.H. Jr. Effect of Bdellovibrio bacteriovorus infection on the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system in Escherichia coli: evidence for activation of cytoplasmic proteolysis // Res. Microbiol. - 1992. - Vol 143, N 1.- P 5-14.

178. Roper M.M, Marshall K.C. Effects of a clay mineral on microbial predation and parasitism of Escherichia coli // Microb. Ecol. -1978b. -Vol.4 -P.279-289.

179. Rosenberg M, Gutnick D, Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell surface hydrophobicity // FEMS Microbiol. Let. -1980. -Vol.9, N1. -P.29-33.

180. Ruby E.G., McCabe J.B. ATP transport system in the intracellular bacterium Bdellovibrio bacteriovorus //J. Bacteriol. -1986. -Vol.167, N3.- P. 1066-1070.

181. Ruby E.G., McCabe J.B. Metabolism of periplasmic membranederived oligosaccharides by the predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus 109J // J. Bacteriol. -1988. -Vol. 170, N2. -P.646-652.

182. Ruby E.G., McCabe J.B, Barke J.I. Uptake of intact nucleoside monophosphates by Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1985. -Vol.163, N3.-P. 1087-1094.

183. Ruby E.G., Rittenberg S.C. Differentiation after premature release of intraperiplasmically growing Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1983. -Vol.154, N1.-P.32-40.

184. Saier M.H. Protein uptace into Escherichia coli during Bdellovibrio infection -a process of reverse secretion // FEBS Letters. - 1994.- Vol. 337, N 1.- P 14-17.

185. Sato K, Toda K. Oxygen uptake rate immobilized graving Candida lipolitica // J. Ferm. Technol. -1983. -Vol.61, N3. -P.239-245.

186. Schelling M.E, Conti S.F. Host receptor sites involved in the attachment of Bdellovibrio bacteriovorus and Bdellovibrio stolpii // FEMS Microbiol. Let. -1986. -Vol.36, N2/3. -P.319-323.

187. Shoeffield A.J, Williams H.N, Turng B.F, Falkler W.A. A comparison of the survival of intraperiplasmic and attack phase bdellovibrios with reduced oxigen // Microb Ecol. - 1996.- Vol 32, N 1,- P 35 -46.

188. Seidler R.J, Mandel M, Baptist J.N. Molecular heterogeneity of the bdellovibrios: evidence of two new species // J. Bacteriol. -1972. -Vol.109, N1. -P.209-217.

189. Seidler R.J, Starr M.P. Structure of the flagellum of Bdellovibrio

bacteriovorus // J. Bacteriol. -1968. -Vol.95, N5. -P. 1952-1955.

190. Seidler R.J., Starr M.P. Isolation and characterization of host-independent bdellovibrios // J. Bacteriol. -1969. -Vol.100, N2. -P.769-785.

191. Seno S. Ionized groups on the cell surface: their cytichemical detection and related cell function// Int. Rev. Cytol. -1987. - N100. -P.203-248.

192. Shilo M. Predatory bacteria // Science. -1966. -Vol.2, N9. - P.33-37.

193. Shilo M. Morphological and physiological aspects of the interaction of Bdellovibrio with host bacteria // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1969. -Vol.50. -P. 174-201.

194. Shilo M., Bruff B. Lysis of gram-negative bacteria by host- independent ectoparasitic Bdellovibrio bacteriovorus // J. Gen. Microbiol. -1965. -Vol.40, N3. -P.317-328.

195. Simpson F.J., Robinson J. Some energy producing systems in Bdellovibrio bacteriovorus strain 6-5-S // Can. J. Biochem. -1968. - Vol.46, N8. -P.865-873.

196. Starr M.P., Baigent N.L. Parasitic interaction of Bdellovibrio bacteriovorus with other bacteria // J. Bacteriol. -1966. - Vol.91, N5. -P.2006-2017.

197. Stein M.A., McAllister S.A. and Torian B.E. Acquistion of apparently intact and unmodified lipopolysaccharides from Escherichia coli by Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1992. - Vol.174, N9. -P.2858-2864.

198. Stolp H. Bdellovibrio bacteriovorus - ein räuberischer Bakterienparasit // Naturwissenschaften. -1968. -Vol.55, N2. -P.57-63.

199. Stolp H. Bdellovibrio bacteriovorus: ein intrazellularer Bakterienparasit // Arz. Praxis. -1969. -Vol.21, N38. -P.2293-2297.

200. Stolp H., Petzold H. Untersuchungen über einen obligat parasitischen Mikroorganismus mit lytischer Aktivität fur Pseudomonas-Bakterien // Phytopath. Z.-1962. -Vol.45, N4. -P.364-390.

201. Stolp H., Starr M.P. Bdellovibrio bacteriovorus gen et sp. n., a predatory, ectoparasitic and bacteriolytic microorganism // Ant. van Leeuwenhoek. -1963. -Vol.29, N3.-P.217-248.

202. Stotzky G., Rem L.T. Influense of clay minerals on microorganisms . I.

Montmorilonite a kaolinite on bacteria // Can. J. Microbiol. -1966. -Vol.12, N3. -P.517-563.

203. Straley S.C, Conti S.F. Chemotaxis in Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1974. -Vol.120, N1. -P.549-551.

204. Straley S.C, Conti S.F. Chemotaxis by Bdellovibrio bacteriovorus toward prey // J. Bacteriol. -1977. -Vol.132, N2. -P.628-640.

205. Straley S.C, LaMarre A.G, Lawrence L.J, Conti S.F. Chemotaxis of Bdellovibrio bacteriovorus toward pure compounds // J. Bacteriol. -1979. -Vol.140, N2. -P.634-642.

206. Sutton D.C, Besant P.J. Ecologi and characteristics of bdellovibrios from 3 tropical marine habitats // Marine Biol. - 1994,- Vol 119, N 2. - P 313 -320.

207. Taylor V.I, Baumann P, Reichelt J.L, Allen R.D. Isolation, enumeration and host range of marine bdellovibrios // Arch. Microbiol. -1974. -Vol.98, N2. -P.101-114.

208. Thomashow M.F, Rittenberg S.C. Intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus 109J: solubilization of Escherichia coli peptidoglycan // J. Bacteriol. -1978a. -Vol.135, N3. -P.998-1007.

209. Thomashow M.F, Rittenberg S.C. Intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus 109J: N-deacetylation of Escherichia coli peptidoglycan amino sugars // J. Bacteriol. -1978b. -Vol.135, N3. -P. 1008-1014.

210. Thomashow M.F, Rittenberg S.C. Intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus 109J: attachment of long-chain fatty acids to Escherichia coli peptidoglycan // J. Bacteriol. -1978c. - Vol.135, N3. -P.1015-1023.

211. Thomashow L.S, Rittenberg S.C. Isolation and composition of sheathed flagella from Bdellovibrio bacteriovorus 109J // J. Bacteriol. -1985a. -Vol.163, N3.-P. 1047-1054.

212. Thomashow L.S, Rittenberg S.C. Waveform analysis and structure of flagella and basal complexes from Bdellovibrio bacteriovorus 109J // J. Bacteriol. -1985b. -Vol.163, N3. -P. 1038-1046.

213. Toon S, Williams H.W, Falk E. Recovery of Bdellovibrio from aquarium

water and biorings // Abstr. Ann. Meet. ASM, W.: 1986. -P.248.

214. Torrella F., Guerrero R., Seidler R.J. Further taxonomic characterization of the genus Bdellovibrio // Can. J. Microbiol. - 1978. -Vol.24, N11. -P.1387-1394.

215. Tudor J.J., Conti S.F. Characterization of bdellocysts of Bdellovibrio sp. // J. Bacteriol. -1977a. -Vol.131, N1. -P.314-322.

216. Tudor J.J., Conti S.F. Ultrastructural changes during encystment and germination of Bdellovibrio sp. //J. Bacteriol. -1977b. -Vol.131, N1. -P.323-330.

217. Tudor J.J., Karp M.A. Translocation of outer membrane protein into prey cytoplasmic membranes by bdellovibrios. // J. Bacteriol. -1994. -Vol.176, N4, -P.948-952.

218. Tudor J. J., McCann M.P., Acrich I. A. A new model for the penetration of prey cells by bdellovibrios //J. Bacteriol. -1990.- Vol.172, N5. -P.2421-2426.

219. Uematsu T., Wakimoto S. Biological and ecological studies on Bdellovibrio. I. Isolation, morphology and parasitism of Bdellovibrio // Ann. Phytopath. Soc. Japan. -1970. -Vol.36, N1. -P.48-55.

220. van Loosdrecht M.C.M, Lyklema J., Norde W., Zender A.J.B. Bacterial adchesion: a physicochemical approach // Microb. Ecol. - 1989. -Vol.17, N1.-P.l-15.

221. van Loosdrecht M.C.M, Lyklema J., Norde W., Alexander J., Zender B. Influence of interfaces on microbial activity // Microbiological Rev. -1990. -Vol.54, N1. -P.75-87.

222. Varon M., Drucker I., Shilo M. Early effects of Bdellovibrio infection on the synthesis of protein and RNA of host bacteria // Bioch. Bioph. Res. Comm. -1969.-Vol.37, N3.-P.518-525.

223. Varon M., Shilo M. Interaction of Bdellovibrio bacteriovorus and host bacteria. I. Kinetic studies of attachment and invasion of Escherichia coli B by Bdellovibrio bacteriovorus // J. Bacteriol. -1968. -Vol.95, N3. -P.744-753.

224. Varon M., Shilo M. Ecology of aquatic bdellovibrios // Adv. Aq. Microbiol. / Eds. M.R.Droops a. H.Jannash, L.: Acad. Press, -1978. -Vol.2. -P. 1-48.

225. Varon M., Shilo M. Inhibition of the predatory activity of Bdellovibrio by

various environmental pollutants // Microb. Ecol. - 1981. -Vol.7, N2. -P. 107111.

226. Vecht-Lifshits S.E, Magdassi S, Braun S. Pellet formation and cellular aggregation in Streptomyces tendae // Biotech. Bioeng. -1990. -Vol.35, N9.-P.890-896.

227. Wehr N.B, Klein D.A. Herbicide effects on Bdellovibrio bacteriovorus parasitism of a soil pseudomonad // Soil. Biol. Biochem. -1971. -Vol.3, N2.-P.143-149.

228. Westergaard J.M, Kramer T.T. Bdellovibrio and the intestional flora of vertebrates // Appl. Env. Microbiol. -1977. -Vol.34, N5. -P.506-511.

229. Williams H.N. The ecology of bdellovibrios in estuarine sediments // Abstr. Ann. Meet. ASM, W.: 1986. -P.261.

230. Williams H.N. The recovery of high number bdellovibrios from the surface water microlayer // Can. J. Microbiol. -1987. - Vol. 33, N6. -P.572-575.

231. Williams H.N, Falkler W.A. Distribution of bdellovibrios in the water column of an estuary //Can. J. Microbiol. -1984. -Vol.30, N7. -P.971-974.

232. Williams H.N, Falkler W.A. The ecology of bdellovibrios in an estuary // Abstr. V Int. Symp. Microb. Ecology, Kyoto: 1989. P. 162.

233. Williams H.N, Falkler W.A, Shay D.E. Seasonal distribution of marine Bdellovibrios // Abstr. Ann. Meet. ASM, W.: 1979. -P. 187.

234. Williams H.N, Falkler W.A, Shay D.E. Recovery of marine Bdellovibrios from surfaces of ouster shells, fish and marine rope // Abstr. Ann. Meet. ASM, W.: 1980.-P.178.

235. Williams H.N, Kelly J.I, Baer M.L, Turng B.F. The association of bdellovibrios with surfases in the aqatic environment // Can. J. Microbiol.- 1995. -Vol 41, N 12,-P 1142-1147.

236. Williams H.N,Toon S, Faulk E,Falkler W.A. The incidence of bdellovibrios in an artificial environment: the national aqua-rium in Baltimore // Can. J. Microbiol. -1987. -Vol.33, N6. -P.483-488.

237. Wood O.L, Hirsch P. Lysis and colony formation by Bdellovibrio isolates parasitical on bidding bacteria and Pseudomonas fluorescens // Bacteriol. Proc. -1966. -Vol.54, N12. -P.2902-2907.

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю д.б.н. Альбине Владимировне Афиногеновой за постоянную помощь и поддержку при выполнении работы.

Благодарю также к.б.н. Наталью Егоровну Сузину, совместно с которой были проведены электронно-микроскопические исследования.

Я глубоко признательна моему заведующему лабораторией профессору Виталию Иосифовичу Дуде за постоянный интерес к работе, полезные советы и замечания при оформлении диссертации.

Большое спасибо всем сотрудникам Лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов, а также сотрудникам других лабораторий института, принимавшим участие в обсуждении результатов и оказавшим техническую помощь при подготовке диссертации.