Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Ефременко, Елена Николаевна

• Ефременко, Елена Николаевна
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Ефременко, Елена Николаевна

Введение.

Глава 1. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ АТФ КАК ОСНОВНОЙ

ПАРАМЕТР КОНТРОЛЯ ПРИ РАЗРАБОТКЕ, ИССЛЕДОВАНИИ И

ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ.

1.1. Подходы к оценке эффективности действия гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

1.1.1. Современные методы исследования биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

1.1.2. Потенциал биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ в исследованиях гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

1.1.3. Адаптация биолюминесцентного метода определения АТФ к анализу биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток индивидуальных и смешанных культур.

1.1.3.1. Удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для различных микроорганизмов.

1.1.3.2. Определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках, входящих в состав биокаталитических систем на основе индивидуальных и смешанных культур.

1.1.3.2.1. Определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках индивидуальных культур.

1.1.3.2.2. Определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках в составе гетерогенных биокатализаторов на основе смешанных культур.

1.2. Внутриклеточная концентрация АТФ как критерий оптимизации процесса получения новых иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов.

1.2.1. Анализ концентрации внутриклеточного АТФ как основа аргументированного выбора условий подготовки клеток к 46 иммобилизации.

1.2.1.1. Значимость условий культивирования клеток дрожжей для их последующей иммобилизации.

1.2.1.2. Условия роста клеток бактерий, подлежащих иммобилизации, как инструмент для направленного регулирования свойств получаемого гетерогенного биокатализатора.

1.2.2. Выбор условий иммобилизации клеток на основе результатов биолюминесцентного анализа внутриклеточного АТФ в клетках микроорганизмов в составе гетерогенных биокатализаторов.

1.2.2.1. Выбор температурных условий иммобилизации клеток микроорганизмов с учетом результатов биолюминесцентного анализа внутриклеточной концентрации АТФ.

1.2.2.2. Выбор среды для иммобилизации клеток микроорганизмов с учетом результатов биолюминесцентного анализа внутриклеточной концентрации АТФ.

1.2.2.3. Выбор компонентного состава гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

1.3. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для мониторинга характеристик биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов при их использовании в биотехнологических процессах и при хранении.

1.3.1. Применение биолюминесцентной АТФ-метрии для мониторинга каталитических характеристик гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов при их использовании в разных биотехнологических процессах.

1.3.2. Мониторинг метаболических характеристик гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов при их длительном хранении.

1.4. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для анализа биокаталитических систем, природных и искусственно создаваемых на основе иммобилизованных клеток смешанных бактериальных культур.

1.4.1. Подход к разработке новых функциональных продуктов питания, основанный на применении иммобилизованных клеток смешанных культур 119 пробиотиков.

1.4.2. Биолюминесцентная АТФ-метрия в исследованиях природных биокаталитических систем на основе самоиммобилизующихся 123 клеток.

1.4.2.1. Исследование закономерностей формирования биокаталитических систем в виде коррозионно-опасных биопленок и факторы, влияющие на их формирование.

1.4.2.2. Применение ингибиторов коррозии и биоцидов для предотвращения процессов биокоррозии с использованием биолюминесцентной АТФ-метрии в качестве критерия эффективности их применения.

1.4.2.2.1. Исследование влияния различных ингибиторов коррозии на кинетические параметры биолюминесцентной реакции.

1.4.2.2.2. Определение биолюминесцентным методом биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к планктонным клеткам и биопленкам

Глава 2. ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ

ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ.

2.1. Разработка многоцелевых гетерогенных биокатализаторов на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС.

2.1.1. Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения белого столового вина.

2.1.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения красного столового вина.

2.1.3. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для устранения недобродов.

2.1.4. Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, для биологического кислотопонижения плодово-ягодных сусел.

2.2. Установление общих закономерностей в формировании гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, создание полифункциональных биокатализаторов и исследование их характеристик.

2.2.1. Скрининг продуцентов различных гидролитических ферментов (амилаз, липаз, пектиназ) среди мицелиальных грибов для разработки на их основе иммобилизованных биокатализаторов.

2.2.2. Разработка образцов гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток-продуцентов гидролитических ферментов.

2.2.2.1. Определение наиболее благоприятных условий формирования гетерогенного биокатализатора на основе клеток R. oryzae для получения амилолитических ферментов.'.

2.2.2.2. Установление оптимальных условий формирования гетерогенного биокатализатора на основе клеток R. oryzae для получения липолитических ферментов.

2.2.2.3. Разработка гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованного мицелия гриба A. foetidus для получения пектинолитических ферментов.

2.2.2.4. Разработка гетерогенного биокатализатора на основе клеток галоалкалофильного гриба Н. alkalinum для получения гидролитических ферментов.

2.2.3. Исследование основных операционных характеристик разработанных гетерогенных биокатализаторов для получения гидролитических ферментов.

2.2.3.1. Характеристики ГБК при длительном культивировании иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные амилолитические ферменты.

2.2.3.2. Установление условий, обеспечивающих длительное и эффективное использование иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные липолитические ферменты.

2.2.3.3. Исследование свойств иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные пектинолитические ферменты в периодических условиях.

2.2.3.4. Исследование внеклеточных гидролитических активностей иммобилизованных клеток мицелиального гриба Н. alkalinum, продуцируемых им в периодических условиях культивирования.

2.2.3.5. Исследование наличия общих тенденций во взаимодействии иммобилизованных клеток мицелиальных грибов и полимерного носителя на примере криогеля ПВС.

2.3. Гетерогенные биокатализаторы, полученные в результате трансформации' компетентных иммобилизованных клеток бактерий.

Глава 3. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ОБЩИЕ

ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ.

3.1. Отличия, существующие в характеристиках свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов.

3.2. Глобальная система регуляции экспрессии генов, функционирующая под контролем концентрации иммобилизованных клеток в составе ГБК.

Глава 4. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИЕ МОНОФЕРМЕНТНОЙ

ЦЕЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ: ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ И ИХ СВОЙСТВА

4.1. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток, содержащих глюкозоизомеразу.

4.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток с активностью органофосфатгидролазы.'.

4.2.1. Новые штаммы-продуценты органофосфатгидролазы и исследование свойств генетически модифицированных аналогов ОРН.'.

4.2.2. ' Разработка ГБК на основе иммобилизованных клеток, содержащих ОРН или

His6-OPH, и его применение для гидролиза пестицидов.

4.2.3. Гетерогенный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий, составляющих искусственный консорциум, для разложения паратиона.

4.2.4. Разработка биосенсора на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток

E.coli DH5a для прямого определения фосфорорганических нейротоксинов.

Глава 5. НОВЫЕ ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ, РАЗРАБОТАННЫЕ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ, В РАЗЛИЧНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОЦЕССАХ.

5.1. Иммобилизованные гетерогенные биокатализаторы на основе клеток микроорганизмов для получения топливного биоэтанола из различных отходов промышленности и сельского хозяйства.

5.1.1. Получение этанола из ферментативно гидролизованной лактозы, содержащейся в творожной сыворотке, с использованием ГБК на основе иммобилизованных клеток дрожжей.

5.1.2. ГБК в процессах конверсии глюкозы, полученной ферментативным гидролизом полисахаридного сырья в составе различных отходов сельского хозяйства и промышленности, в этанол.

5.1.2.1. ГБК на основе иммобилизованных клеток дрожжей.

5.1.2.2. Исследование возможности использования ГБК на основе иммобилизованных клеток различных мицелиальных грибов, секретирующих внеклеточные целлюлазы, для получения биоэтанола.

5.2. ГБК на основе клеток иммобилизованного гриба в процессе получения L(+)-молочной кислоты.

5.2.1. Состояние проблемы, связанной с биотехнологическим получением МК.

5.2.2. ГБК па основе клеток R. oryzae и криогеля ПВС в процессах получения МК.

5.3. Применение ГБК, полученного на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, секретирующих гидролитические ферменты, в процессе очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности.

5.4. Гетерогенные биокатализаторы в процессе биодеструкции ФОВ и продуктов их разложения.

5.4.1. Состояние проблемы ликвидации реакционных масс, образующихся в результате химического уничтожения.

5.4.2. Биоразложение фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx.

5.4.2.1. Ферментативный гидролиз ФОВ в составе реакционных масс, полученных при химическом уничтожении нейротоксинов.

5.4.2.2. Разложение фосфорсодержащих соединений с С-Р-связью под действием иммобилизованного ГБК, полученного на основе клеток Pseudomonas sp. 78Г и криогеля ПВС.

5.4.2.3. Комплексное биоразложение фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, образующихся в результате химического уничтожения вещества типа Vx.

Глава 6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты»

Биотехнологические процессы, реализуемые при использовании гетерогенных биокатализаторов (ГБК) в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов, позволяют получать целевые продукты как результат сложных многостадийных биохимических превращений исходных субстратов. Иммобилизация клеток, означающая любое ограничение свободы их движения в пространстве, давно обсуждается как эффективный подход к решению задач по интенсификации и повышению экономической привлекательности современных биотехнологических процессов, основанных на применении различных микроорганизмов. При использовании ГБК на основе иммобилизованных клеток возникает возможность создания эффективных биотехнологических процессов, которые характеризуются тем, что ГБК в них используются в течение длительного времени с высоким выходом целевых продуктов, при этом техническое решение таких процессов может быть существенно упрощено по сравнению с процессами на основе биокатализаторов, представляющих собой свободные (суспензионные) клетки [1-4].

В настоящее время ГБК на основе иммобилизованных клеток используются для решения экологических задач (очистка сточных вод и вредных выбросов - в Голландии, Японии, Германии и Финляндии); в пищевой промышленности (ферментация пива и игристых вин - в Италии, Франции, Германии и Канаде; получение пробиотических молочно-кислых продуктов - в Швейцарии, Австралии, Канаде); для получения различных аминокислот, органических кислот, антибиотиков - в Японии и США [4-7].

Вместе с этим, широкомасштабная реализация биотехнологических процессов, основанных на применении иммобилизованных клеток (рис.1), на сегодняшний день сдерживается несколькими основными причинами:

- существованием традиционных подходов к проведению процессов;

- отсутствием адекватных и экспрессных методов контроля биокаталитической активности иммобилизованных клеток микроорганизмов в составе ГБК;

- коротким перечнем ГБК, производство и применение которых можно масштабировать и осуществить в промышленных условиях;

- недостатком научных фундаментальных знаний о биокаталитических системах на основе иммобилизованных клеток и кинетических закономерностях, лежащих в основе их функционирования.

Объективность существования этих причин подтверждается тем огромным научным и практическим интересом, который существует уже несколько десятилетий по отношению к ГБК на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов. Этот интерес находит свое отражение в числе публикаций, которое с каждым годом растет, и рост этот

Год публикации .

Рис.1. Динамика изменения количества статей, опубликованных в рецензируемых журналах по годам, согласно данным поисковой системы Science Direct (www.sciencedirect.com), и связанных с исследованием ГБК на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов по годам: • - общее количество публикаций, А - исследования иммобилизованных, клеток в биореакторах, ■- разработка препаратов иммобилизованных клеток для целей биодеградации, О - исследования, связанные с применением иммобилизованных клеток в промышленности.

1500 1

1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

Год публикаций

Рис.2. Динамика изменения количества статей, опубликованных в рецензируемых журналах, по годам, согласно данным поисковой системы Science Direct (www.sciencedirect.com), и связанных с исследованием ГБК, искусственно полученных на основе клеток различных микроорганизмов.

1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

Год публикации

Рис.З. Динамика изменения количества статей, опубликованных в рецензируемых журналах, по годам согласно данным поисковой системы Science Direct (www.sciencedirect.com), связанным с исследованием природных биоплепок, образующихся в результате самоиммобилизации бактериальных клеток, по годам: О -общее количество публикаций, О - исследования, связанные с элиминированием биопленок, ♦ - исследование биопленок, развивающихся в реакторах, А - исследование возможности использования биопленок в процессах биоремедиации и очистки сточных вод, ■ - биопленки и их антимикробная устойчивость.

Проведенный анализ динамики развития исследований ГБК, которые ведутся во всем мире, показал, что в начале 21 века произошел фактически перелом, приведший к увеличению числа научных изысканий в этой области, которые преимущественно оказались связанными с исследованием иммобилизованных клеток бактерий (рис.2), причем включенных в ГБК нативно (рис.3), то есть самоиммобилизованных в природных условиях, как правило, в биопленки.

Известно, что иммобилизация клеток — это широко распространенный в природе феномен, так как фиксация микроорганизмов на поверхностях различных носителей играет особую роль в стратегии выживания и сохранения максимального числа каталитических функций у клеток [7]. Формирующиеся при этом ГБК в виде биопленок с включенными в них клетками оказались суперэффективными катализаторами различных негативных процессов (биокоррозия металлических конструкций, возникновение воспалительных процессов, деструкция пластиковых материалов и др.) [4,8-9]. Попытки исследователей биопленок применить к своим объектам информацию о закономерностях функционирования искусственно создаваемых в течение многих лет ГБК на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов ярко высветили существующие пробелы в знаниях об этих биокаталитических системах, способах их контроля и управления ими.

Сложилась парадоксальная ситуация с ГБК на основе иммобилизованных клеток, когда понимание существующих преимуществ этих систем (высокая операционная стабильность, резистентность к воздействию негативных факторов, продолжительные временные периоды активного, каталитического действия, высокие выходы целевых продуктов) перед свободными клетками, традиционно используемыми в биотехнологических процессах, стимулировало на протяжении многих лет развитие исследований, направленных на внедрение их в промышленность (конструирование биореакторов, организация непрерывных процессов и др.), на фоне недостатка фундаментальных знаний о причинах существования этих преимуществ, а также о кинетических принципах, лежащих в основе функционирования ГБК с такими преимуществами.

Такая ситуация была в научной литературе названа «телегой, бегущей перед лошадью» [4]. В связи с этим, исследования, позволяющие сократить пробелы на информационном поле в отношении ГБК, основу которых составляют иммобилизованные клетки микроорганизмов, являются крайне актуальными и имеют большое научно-практическое значение.

Целью- данной работы было решение комплекса научно-практических задач, связанных с разработкой подходов к получению высокоэффективных ГБК на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов, способных обеспечить реализацию различных биотехнологических процессах, а также исследование их биохимических свойств и основных кинетических закономерностей функционирования.

В рамках этой работы были поставлены следующие основные задачи: - разработать научно-методологический подход, базирующийся на использовании биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного аденозин-5'-трифосфата (АТФ) в иммобилизованных клеток различных микроорганизмов, к адекватной оценке эффективности их каталитического ■ действия и установить возможность использования данного биофизического метода исследования на разных стадиях изучения (получение, применение и хранение) иммобилизованных ГБК в качестве одного из главных аналитических инструментов;

- исследовать возможность создания полифункциональных ГБК на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов, определить факторы, позволяющие направленно регулировать каталитические характеристики иммобилизованных ГБК в процессе их получения;

- провести критический сравнительный анализ биохимических и каталитических характеристик свободных и иммобилизованных клеток, позволяющий обобщить характерные особенности действия ГБК, и на основе результатов аналитического обобщения составить гипотезу о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток;

- разработать новые ГБК на основе иммобилизованных клеток природных и рекомбинантных штаммов микроорганизмов с использованием криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве носителя и исследовать возможность их эффективного применения в различных биотехнологических процессах с целью создания научно-практических основ для реализации инновационных технических решений уже существующих процессов или организации принципиально новых биотехнологий.

Существенным отличием данной работы от ряда других [10, 11], связанных с разработкой и исследованием ГБК на основе клеток микроорганизмов, является то, что основным объектом исследования являлись не способы иммобилизации и носители, выбранные для их реализации, а сами клетки микроорганизмов как основная каталитически активная составляющая таких ГБК. При этом для выявления и лучшего понимания существующих общих закономерностей в функционировании иммобилизованных клеток различных микроорганизмов в работе в большинстве случаев использовался один и тот же способ и носитель для иммобилизации клеток — включение их в гелевую матрицу, в качестве которой применялся криогель поливинилового спирта (ПВС).

Научные данные, представленные в работе, являются результатом многолетних исследований (1987-2009 гг.), проводившихся при непосредственном участии автора в качестве их участника и исполнителя, а также научного руководителя и организатора.

При решении научных задач данной докторской диссертации при участии автора было подготовлено 8 кандидатских диссертаций по специальностям катализ (02.00.15) и биотехнология (03.00.23).

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Ефременко, Елена Николаевна

выводы

1. Разработан универсальный научно-методологический подход к получению, оптимизации условий функционирования и хранения, а также мониторингу эффективности действия гетерогенных биокатализаторов (ГБК) на основе иммобилизованных клеток (ИмК) разных микроорганизмов: дрожжей, мицелиальных грибов и бактерий (грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, нативных и рекомбинантных, мезофильных и термофильных клеток, самоиммобилизованных в составе биопленок и искусственно иммобилизованных методом включения в полимерные носители). Подход основан на оценке энергетического статуса ИмК по концентрации внутриклеточного АТФ, определяемой с использованием биолюминесцентного люциферин-люциферазного метода. Разработан способ дифференцированного определения клеток различных бактерий в составе ГБК на основе иммобилизованных смешанных культур, предусматривающий применение биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ.

2. Впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК; установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок в проточных системах; разработан подход к оценке биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к различным коррозионно-опасным биопленкам на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ. Установлено, что на эффективность применения биоцидов с целью подавления развития коррозионно-опасных биопленок влияет стадия роста биопленок. Впервые определены минимальные ингибирующие концентрации для широко применяемых на практике ингибиторов коррозии, обладающих свойствами биоцидов, в отношении коррозионно-опасных биопленок разного микробного состава.

3. На примере ИмК дрожжей рода Saccharomyces показана возможность разработки универсального способа получения ГБК, предполагающего жесткое соблюдение условий подготовки клеток к иммобилизации, а также условий проведения самого процесса иммобилизации. Продемонстировано, что с использованием такого способа могут быть получены полифункциональные ГБК, имеющие высокую эффективность действия в различных биотехнологических процессах, связанных с конверсией Сахаров в этанол.

4. Выявлены общие закономерности в формировании ГБК, получаемых на основе ИмК мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные гидролазы, и показаны особенности изменения деформационных характеристик матрицы криогеля ПВС в присутствии таких ГБК на основе ИмК различных мицелиальных грибов при варьировании состава используемых сред для культивирования ИмК и длительности процесса применения ГБК. Установлена принципиальная возможность создания полифункциональных биокаталитических систем при использовании одного и того же исходного спорового материала, включенного в матрицу носителя. Показана возможность направленной индукции необходимых каталитических свойств ГБК, разрабатываемых на основе ИмК мицелиальных грибов, при варьировании состава среды культивирования. Продемонстрирована высокая стабильность каталитических свойств ГБК, полученных на основе ИмК различных мицелиальных грибов.

5. Впервые установлена возможность трансформации клеток в иммобилизованном состоянии плазмидной ДНК. Показано, что компетентные иммобилизованные клетки могут быть использованы для получения ГБК путем их трансформации различными генетическими конструкциями, что создает основу для разработки многофункциональных ГБК с новыми характеристиками на основе заранее иммобилизованных клеток.

6. Проведен критический анализ общих закономерностей изменения характеристик иммобилизованных клеток в сравнении со свободными, а также характерных особенностей функционирования ГБК на основе нативно и искусственно иммобилизованных клеток. Впервые выдвинута гипотеза о том, что в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе искусственно полученных ГБК лежит система регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток. Иммобилизация клеток в высоких концентрациях активирует проявления генетически запрограммированного ответа клеток, приводящего к устойчивому изменению их биохимического статуса. Гипотеза основана на экспериментальных данных и расширяет представления о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток.

7. Разработаны высокоэффективные генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез органофосфатгидролазы и ее генетически модифицированных аналогов, содержащих полигистидиновые последовательности, в растворимой и каталитически активной форме. Исследованы каталитические и физико-химические свойства новых белков. Наиболее привлекательным, с точки зрения применения для решения различных прикладных задач, оказался фермент органофосфатгидролаза с шестью остатками гистидина, генетически введенными на Nконец молекулы белка. Показана высокая эффективность его использования в процессах деструкции фосфорорганических отравляющих веществ и продуктов их деградации. Разработаны ГБК на основе клеток-продуцентов ферментов с активностью органофосфатгидролазы, показана целесообразность их использования как в виде биокаталитических систем с моноферментной активностью в процессах разложения и аналитической детекции фосфорорганических нейротоксинов, так и в виде метаболически активных клеток в составе искусственного иммобилизованного консорциума, предназначенного для комплексного разложения фосфорорганических пестицидов.

8. Разработана серия ГБК на основе ИмК микроорганизмов, обладающих уникальными каталитическими характеристиками (продуктивностью, способностью трансформировать высокие концентрации субстратов, длительной операционной стабильностью), превосходящими известные аналоги, которые могут быть рекомендованы к реализации в ряде биотехнологических процессов, в частности, для получения: топливного этанола из отходов промышленности и сельского хозяйства, получения L(+)-молочной кислоты, производства спиртосодержащих напитков, очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности, биоаналитической детекции экотоксикантов, получения гидролитических ферментов, деградации фосфорорганических пестицидов и супертоксичных отравляющих веществ, в том числе в средах со сложным химическим составом, представляющих собой реакционные массы, полученные после химического уничтожения вещества типа Vx.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя вышеизложенный материал, можно отметить, что научная новизна данной работы состоит в следующем:

- широко апробирован биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ для осуществления направленного получения высокоактивных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, являющихся продуцентами различных целевых продуктов. Многочисленные экспериментальные данные в совокупности формируют научно-методологический подход к исследованию ГБК, который основан на выборе наиболее благоприятных условий подготовки клеток к иммобилизации и получения ГБК с использованием концентрации внутриклеточного АТФ в качестве критерия такого выбора. Данный подход позволяет выявить и обосновать основные закономерности изменения характеристик ИмК и может быть рекомендован для широкого применения в исследованиях ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов в качестве эффективного аналитического инструмента;

- впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК; установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок (КОБ) в проточных системах; разработан подход к оценке биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к различным КОБ на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ; установлено, что эффективность применения биоцидов с целью подавления развития КОБ зависит от их стадии роста;

- впервые установлено влияние условий формирования ГБК, а также условий и длительности их применения в периодическом режиме на прочностные характеристики ГБК, разработанных на основе ИмК мицелиальных грибов. Показана возможность создания полифункциональных ГБК на основе общих подходов, базирующихся на варьировании условий формирования иммобилизованного мицелия при исходной иммобилизации спор одной и той же культуры;

- показана возможность создания полифункциональных ГБК на основе клеток дрожжей. Установлено, что использование оптимизированного способа получения ГБК для клеток рода Saccharomyces, позволяет получить ИмК, применение которых возможно в разнообразных биотехнологичееких процессах, в основе которых лежит конверсия моносахаридов в этанол (шампанизация вина, получение образцов красного и белого вина, устранение винных недобродов, получение этанола из различных отходов сельского хозяйства и промышленности);

- впервые установлена возможность трансформации клеток в иммобилизованном состоянии плазмидной ДНК. Показано, что компетентные ИмК могут быть использованы для получения полифункциональных ГБК путем их трансформации новыми генетическими конструкциями;

- впервые выдвинута гипотеза о том, что в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе ГБК, разрабатываемых на основе ИмК, лежит система глобальной регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток. Иммобилизация клеток в высоких концентрациях активирует проявления генетически запрограммированного ответа клеток, приводящего к изменению их генетического и биохимического статуса. Научная гипотеза, основана на экспериментальных данных и расширяет представления о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе ИмК, а также о подходах, которые могут быть применены на стадии получения ГБК и регулирования эффективности их действия в биотехнологических процессах;

- исследованы каталитические и физико-химические свойства новых белков — генетически модифицированных аналогов органофосфатгидролазы (ОРН). Впервые показана высокая эффективность разложения фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) и продуктов их деградации, катализируемая ферментом Hise-OPH. Разработаны новые ГБК на основе ИмК, содержащих ферменты с ОРН-активностыо, и показана их высокая эффективность каталитического действия в реакциях разложения фосфорорганических соединений;

- разработано 25 новых ГБК на основе ИмК микроорганизмов для разнообразных процессов. Новизна и оригинальность этих разработок поддержана 14 Патентами РФ и 2 Авторскими свидетельствами СССР на изобретения. Показано превосходство данных ГБК по своим характеристикам над известными аналогами или установлено, что аналоги отсутствуют.

Научные принципы, изложенные в работе и касающиеся способов получения и исследования свойств ГБК, могут быть широко использованы исследователями при разработке и применении новых ГБК на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов природных и рекомбинантных штаммов, предназначенных для разнообразных процессов. В целом полученные в работе данные существенно расширяют представления о биокаталитических системах на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов, об их возможностях, о принципах, лежащих в основе их каталитического функционирования, и подходах, которые могут быть применены на стадии их разработки, а также при осуществлении контроля и регулирования эффективности их действия и хранения.

Практическая значимость результатов работы заключается в следующем:

- установлены удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для большого числа клеток микроорганизмов, установлены пределы варьирования этого параметра среди различных культур. Разработан ряд методик, адаптирующих применение биолюминесцентного метода к анализу ИмК разных микроорганизмов, установлена адекватность оценки каталитических характеристик ГБК на основе результатов, получаемых при использовании биолюминесцентного метода путем установления корреляции полученных значений концентраций внутриклеточного АТФ в ИмК с другими их биохимическими характеристиками. Разработан дифференцированный метод анализа концентрации ИмК в составе ГБК, полученных на основе смешанных культур;

- разработан общий подход к получению ГБК на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта; показана возможность получения различных гидролитических ферментов с использованием разработанных ГБК в течение длительного времени, а также продемонстрирована эффективность применения таких ГБК для снижения уровня ХПК сточных вод предприятий пищевой промышленности при использовании их в качестве сред для культивирования ИмК;

- показано, что разработанный ГБК на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces перспективен как объективная альтернатива свободным клеткам, традиционно используемым в промышленных условиях, и может служить основой для разработки новых биотехнологий, способных заменить существующие в области этанольного конверсии Сахаров;

- показана возможность получения иммобилизованных компетентных клеток с пролонгированным сроком хранения и создания на их основе ГБК с новыми свойствами, в частности, с ОРН-активностыо. На основе полученных результатов обоснованы рекомендации о проведении процессов с ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммов-продуцентов;

- впервые определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в отношении биопленок разного микробного состава для широкого ряда. ингибиторов коррозии (ИК), обладающих биоцидным действием. Полученные данные могут быть рекомендованы к использованию в антикоррозионных программах, составляющих основу мониторинга и применения ИК и биоцидов на практике; созданы генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез ОРН и ее генетически модифицированных аналогов, оптимизированы условия их получения в растворимой и каталитически активной форме. Показана целесообразность их использования в иммобилизованном виде для биосенсорного определения фосфорорганических нейротоксинов или для разложения фосфорорганических пестицидов.

Практическое применение результатов работы, в том числе разработанных ГБК и процессов с их участием, может быть реализовано в биотехнологической (производство гидролитических ферментов, молочной кислоты), нефтяной (для устранения коррозионных ситуаций, развитие которых провоцируют КОБ), химической и биотопливной промышленности (получение этанола), в разных отраслях пищевой промышленности с целью получения различных целевых продуктов (пробиотических продуктов питания, продукции винодельческой промышленности, глюкозо-фруктозных сиропов), при решении различных экологических задач в сельском хозяйстве, на предприятиях оборонного комплекса МО РФ и пищевой промышленности (очистка сточных вод, разложение пестицидов, утилизация целлюлозо- и лактозосодержащих отходов), для решения вопросов, связанных с выполнением международных обязательств РФ по уничтожению химического оружия (биоразложение реакционных масс различного химического состава, полученных после химической ликвидации ФОВ).

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Ефременко, Елена Николаевна, 2009 год

1. Бейли Дж., Оллис Д. (1989) Основы биохимической инженерии.// Пер. с англ. в 2-х час. 4.2., М.: Мир, 590 с.

2. Вудворд Дж. (ред.) (1988) Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы.// Пер с англ., М.: Мир, 215 с.

3. Tampion J., Tampion M.D. (1987) Immobilized cells: principles and applications. // New York: Cambridge University Press, 257 p.

4. Junter G-A., Jouenne T. (2004) Immobilized viable microbial cells: from the process to the proteome. or the cart before the horse. H Biotechnol. Adv., V.22, p.633-658.

5. Хенце M., Армоэс П., Ля-Кур-Янсен Й., Арван Э. (2004) Очистка сточных вод. Биологические и химические процессы. // М.: Изд. Мир., 241с.

6. Nedovic V., Willaert R. (2005) Applications of cell immobilisation biotechnology. // Springer Pbsh. Ser.: Focus on biotechnology. V.8B, 573 p.

7. Wijffels R.H., Buitelaar R.M., Bucke C., Tramper J. (Eds.) (1996) Progress in Biotechnology 11. Immobilized cells: basics and applications.// Elsevier Science B.V., 840 p.

8. Beech I.B. (2004) Corrosion of technical materials in the presence of biofilms-current understanding and state-of-the-art methods of study.// Int. Biodeterior. Biodegrad., V.53, p.177-183.

9. Хмель И.А., Метлицкая А.З. (2006) Quorum sensing регуляция экспрессии генов — перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий.// Молек. Биолог., Т.40 (2), с.195-210.

10. Марквичева Е.А. (2005) Клетки, белки и пептиды, иммобилизованные в композитные гидрогели: получение, свойства, применение в биотехнологии и биомедицине.// Дисс. .д.х.н., Москва, 50 с.

11. Коваленко Г.А. (2007) Катализ ферментами и нерастущими бактериальными клетками, иммобилизованными на неорганических носителях.// Дисс.д.х.н., Новосибирск, 300 с.

12. Nedovic V., Willaert R. (2004) Fundamentals of cell immobilisation biotechnology. // Kluwer Pbsh. Ser.: Focus on biotechnology. V.8A, 550p.

13. Hocknull M.D., Lilly M.D. (1990) The use of free and immobilised Arthrobacter simplex in organic solvent/aqueous two-liquid-phase reactorsJ/Appl. Microbiol. Biotechnol., V.33(2), p. 148-153.

14. Ramsden D.K., Brennan M.R., Hughes J. (2000) Design of an automated bioreactor system to screen immobilised whole cell catalysts J I Biotechnol. Lett., V.22(15), p. 1259-1263.

15. Naito M., Kawamoto Т., Fujino K., Kobayashi M., Maruhashi K., Tanaka A. (2001) Long-term repeated biodesulfurization by immobilized Rhodococcus erythropolis KA2-5-1 cells J/Appl. Microbiol. Biotechnol., V.55(3), p. 374-378.

16. Swope K.L., Flickinger M.C. (1996) Activation and regeneration of whole cell biocatalysts: Initial and periodic Induction behavior in starved Escherichia coli after immobilization in thin synthetic films J/Biotechnol. Bioeng., V.51, p. 360-370.

17. Beech I.W., Sunner J. (2004) Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals.//Cwrr. Opin. Biotechnol., V.15, p. 181-186.

18. Bowen W.R., Lovitt R.W., Wright C.J. (2001) Atomic Force Microscopy Study of the Adhesion of Sac char о myces cerevisiae!I I J. Colloid. Interface Sci., V.237(l), p.54-61.

19. Martin M., Mengs G., Plaza E., Garbi C., Sanchez M., Gibello A., Gutierrez F., Ferrer E. (2000) Propachlor Removal by Pseudomonas Strain GCH1 in an Immobilized-Cell System.IIAppl. Environ. Microbiol., V.66(3), p. 1190-1194.V

20. Packroff G., Lawrence J.R., Neu T.R. (2002) In situ confocal laser scanning microscopy of protozoans in cultures and complex biofilm communities./Л4с/a Protozoologica, V.41, p. 245-253.

21. Siripattanakul S., Wirojanagud W., McEvoy J., Khan E. (2008) Effect of cell-to-matrix ratio in polyvinyl alcohol immobilized pure and mixed cultures on atrazine degradation.// Water. Air. Soil. Pollut: Focus., V.8(3-4), p.257-266.

22. Almeida C., Branyik Т., Moradas-Ferreirac P., Teixeira J. (2005) Use of two different carriers in a packed bed reactor for endopolygalacturonase production by a yeast strain.I I Process Biochem., V.40, p. 1937-1942.

23. Kariminiaae-hamedaani H-R., Kanda K., Kato F. (2003) Wastewater treatment with bacteria immobilized onto a ceramic carrier in an aeration system./// Biosci. Bioeng., V.95(2), p. 128-132.

24. Riscaldati E., Moresi M., Federici F., Petruccioli M. (2002) Ammonium fumarate production by free or immobilised Rhizopus arrhizus in bench- and laboratory-scale bioreactors. // J. Chem. Tech. Biotechnol., V.77(9), p. 1012-1024.

25. Kuhad R.C., Kapoor M., Rustagi R. (2004) Enhanced production of an alkaline pectinase from Streptomyces sp. RCK-SC by whole-cell immobilization and solid-state cultivation.// World J. Microbiol. Biotechnol., V. 20, p. 257-263.30.