Разработка твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свиней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Васильев, Александр Павлович

• Васильев, Александр Павлович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Васильев, Александр Павлович

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность работы.

1.2. Цель и задачи исследований.

1.3. Научная новизна.

1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследований.

1.5. Апробация работы.

1.6. Публикации.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту.

1.8. Личный вклад соискателя.

1.9. Структура и объём работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Современная таксономия, патогенность вируса.

2.2. Культивирование вируса КЧС in vitro.

2.3. Патогенез, течение и симптомы болезни.

2.4. Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней - обзор и критическая оценка.

2.4.1. "Ранние" методы лабораторной диагностики КЧС.

2.4.1.1. Прямое обнаружение вирусных антигенов.

2.4.1.2. Изоляция и идентификация инфекционного вируса КЧС.

2.4.1.3. Обнаружение вирусспецифических антител.

2.4.2. Новые методы лабораторной диагностики КЧС.

2.4.2.1. Результаты достижения молекулярной биологии вируса и их роль в развитии методов лабораторной диагностики КЧС.

2.4.2.2. Моноклональные антитела - получение, использование для прямого обнаружения вируса.

2.4.2.3. Гистохимические варианты иммуноферментного анализа.

2.4.2.4. Методы твердофазного иммуноферментного анализа для обнаружения антигена вируса КЧС в крови и пробах органов.

2.4.2.5. Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для обнаружения антител к вирусу КЧС в сыворотках проб крови.

2.4.2.6. Методы анализа генома.

2.5. Методы дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса КЧС.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свиней»

1.1. Актуальность работы

Несмотря на многолетние усилия, прилагаемые для ликвидации классической чумы свиней (КЧС), болезнь продолжает представлять серьезную угрозу свиноводству во всем мире. Благоприятная эпизоотическая ситуация в России, значительное сокращение числа вспышек классической чумы свиней, (9 - в 2002 г. и 6 - в 2003 г.) привели к относительному благополучию страны по КЧС, однако угроза спорадических вспышек болезни, в том числе в крупных свинокомплексах, постоянно существует.

Различные формы течения болезни, циркуляция вируса различной патогенности на фоне вакцинированного поголовья свиней, вторичные инфекции приводят к многообразию клинических симптомов, патологоанатомических изменений, что затрудняет постановку точного диагноза на классическую чуму свиней и оценку истинной эпизоотической ситуации (9).

Для проведения лабораторных исследований на КЧС применяется метод выделения вируса в культуре клеток с последующей идентификацией иммунофлуоресценцией, который в настоящее время считается эталонным (OIE, 2000), но его использование возможно только в хорошо оснащенных, вирусологических лабораториях или научных учреждениях (3, 7, 8).

Для прямого обнаружения вируса непосредственно в патологическом материале используются реакция прямой иммунофлуоресценции и полимеразная цепная реакция (ПЦР), однако первый метод обладает невысокой чувствительностью (26-77%) и субъективностью (5, 7, 9, 119), а ПЦР хотя и признан весьма полезным диагностическим инструментом, особенно при исследовании аутолизированных или цитотоксических проб, пока применяют для исследования ограниченного количества проб, и в основном, для филогенетических исследований полевых изолятов вируса (29, 104, 120).

В ведущих лабораториях Европейского Союза и США для обнаружения антигена вируса КЧС разработаны несколько вариантов иммуноферментного анализа под разными коммерческими названиями: CHEKiT® CSF-VIRUS (DR.BOMMELI AG, Швейцария), Herd Chek CSFV Ag, (IDEXX, США), SERELISA HCV Ag (RHONE MERIEUX, Франция), однако сведения об их диагностической оценке ограничены. В России были выполнены работы по разработке метода прямого обнаружения специфического антигена вируса, основанного на ингибиции рекомбинантного белка Е2 непрямым жидкофазным блокирующим вариантом ИФА (Бъядовская О.П. и соавт., 2002), но в ветеринарных лабораториях метод пока не используется.

Таким образом, в связи с очевидной необходимостью решения проблемы мониторинга и ликвидации болезни на территории России, необходим дополнительный, доступный и чувствительный метод прямого обнаружения антигена вируса КЧС в патологическом материале для использования в региональных лабораториях и, особенно, при вспышках КЧС в промышленных свинокомплексах.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Васильев, Александр Павлович

3. ВЫВОДЫ

1. Получено 8 клонов гибридом, стабильно продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам основного структурного полипептида Е2 вируса КЧС.

2. Моноклональные антитела клонов К1, КЗ, К4, Кб, К9 и К12 в виде асцитических жидкостей имеют активность от 1:78125 до 1:1953125 в непрямом ТФ ИФА и реагируют с вирулентным, вакцинными штаммами вируса КЧС, а также антигенно-родственными пестивирусами (диареи крупного рогатого скота, пограничной болезни овец). Моноклональные антитела клонов К2, К5 и К11 обладали избирательной способностью реагировать с референс-штаммами и полевыми изолятами вируса.

3. Отобранные методом сэндвич ТФ ИФА неконкурирующие моноклональные антитела клонов гибридом К9 и К12 обладали специфичностью к разным эпитопам структурного полипептида Е2 вируса КЧС и пригодны для его улавливания и детекции методом двухсайтового ТФ ИФА.

4. Разработан метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения антигенов в лейкоцитах больных классической чумой свиней. Аналитическая чувствительность метода составила при концентрации вируса не менее 3.0-3.5 lg ККИД50/ см3 вируса ;

5. Установлено, что при исследовании проб лейкоцитов от свиней, полученных в период между 6-12 сутками после экспериментального заражения вирусом КЧС разной патогенности диагностическая чувствительность двухсайтового ТФ ИФА, посравнению с методом вирусовыделения, составляет 83,3-91,6%;

6. В результате апробации при исследовании полевых материалов, полученных из неблагополучных и благополучных по КЧС свинокомплексах, разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА, посравнению с методом вирусовыделення, имеет чувствительность 81% и специфичность 100%.

7. Практические предложения

Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ временная нормативная документация: «Инструкция на изготовление и контроль набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител», «Технические условия на набор препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител», «Наставление по применению набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител».

Пригодность для практического использования подтверждена комиссионными испытаниями и при проведении диагностических исследований в ГНУ ВНИИВВиМ.

Заключение.

Таким образом, анализ собственных результатов исследований показал, что они не только согласуются с данными литературы, но и решают некоторые проблематичные вопросы технологии получения моноклональных антител, их характеристики и использование для совершенствования способов прямого обнаружения вируса КЧС методом ТФ ИФА. Диагностическая оценка характеристик метода в острых опытах на животных в эксперименте и при исследовании полевого материала при вспышках КЧС позволяют рекомендовать разработанный двухсайтовый ТФ ИФА для прямого обнаружения антигена вируса КЧС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Васильев, Александр Павлович, 2005 год

1. Вишняков И.Ф., Куриннов В.В., Яшин А.Т. и др. Иммунофлуоресцентное выявление разных штаммов вируса чумы свиней.// Ветеринария.- 1984.-№3.- С. 34 36

2. Вишняков И.Ф. Диагностика классической чумы свиней // Ветеринария.- 1986.- № 3.- С. 27-30.

3. Галко Н.В., Макарова Н.Г., Ватукова С.С. и др. Применение иммуноферментного анализа для обнаружения ротавирусного антигена у людей // Актуальные проблемы вирусологии.- М., 1985.- С.36.

4. Джонс, Э.И., Грегори Дж. Иммунопероксидазные методы / под ред. Кэтти Д.- М., 1991.- С. 239-267.

5. Дудникова Е.К. Разработка и применение имуноферментного анализа для выявления противоящурных антител в сыворотках крови животных : дис. канд. биол. наук: 03.00.06: защищена 23.12.97 .Владимир, 1997.- С. 160.

6. Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Яшин А.Т. и др. Некоторые вирусологические и флуоресцентно-серологические исследования органов и сывороток свиней, вакцинированных против КЧС // Материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ.- Покров, 1983.- С. 111-113.

7. Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Хухоров И.Ю., и др. Эпизоотологические, патогенетические и диагностические особенности классической чумы свиней // Ветеринария.- 1993.- № 11-12.-С. 6-12.

8. Куриннов В.В. Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л. и др. Эпизоотологические проблемы, клиническое проявление и диагностика классической чумы свиней // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: труды Междунар. науч.- практ. конф.-Покров, 1995.- С. 50-54.