Лейкоз крупного рогатого скота: Разработка методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, доктор биологических наук Мальцева, Надежда Анатольевна

• Мальцева, Надежда Анатольевна
• доктор биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук Мальцева, Надежда Анатольевна

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ДАННЫЕ О ВОЗБУДИТЕЛЕ

1.1. Краткие эпизоотологические сведения

1.2. Структурная организация ВЛКРС

1.3. Патогонез ЛКРС

1.4. Культивирование ВЛКРС

1.5. Лабораторная диагностика лейкоза крупного рогатого скота

1.5.1. Гематологический метод

1.5.2. Серологическая диагностика ЛКРС

1.5.2.1. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле

1.5.2.2. Реакция связывания комплемента

1.5.2.3. Иммуноферментный анализ

1.5.2.4. Иммунный блотинг

1.5.2.5. Реакция иммунофлюоресценции

1.5.2.6. Радиоиммунологический анализ

1.5.3. Молекулярно-биологические методы диагностики ЛКРС

1.5.4. Вирусологические методы обнаружения ВЛКРС

ГЛАВА 2. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА ЛКРС 45 2.1. Изучение возможности специфической иммунопрофилактики лейкоза крупного рогатого скота

2.1.1. Инактивированные цельновирионные вакцины

2.1.2. Субъединичные вакцины

2.1.3. ДНК-вакцины на основе вируса осповакцины

2.1.4. Живые аттенуированные вакцины 5 3 Заключение

ЧАСТЬ П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.1.1. Среды

3.1.2. Сыворотки крови

3.1.3. Вирус

3.1.4. Животные

3.1.5. Культуры клеток и тканей

3.1.5.1. РЬКУ+

3.1.5.2. ПТ

3.1.5.3. Краткосрочные культуры лейкоцитов

3.2. Методы

3.2.1. Вирусологические методы исследования

3.2.1.1. Концентрирование и очистка ВЛКРС

3.2.1.2. Приготовление антигена ВЛКРС

3.2.1.3. Определение плотностных характеристик ВЛКРС

3.2.1.4. Инактивация вируса

3.2.1.5. Сорбция вируса

3.2.2. Серологические реакции

3.2.2.1. Реакция иммунодиффузии в геле

3.2.2.2. Реакция связывания комплемента

3.2.2.3. Иммуноферментный анализ

3.2.2.4. Иммунный блотинг

3.2.2.5. Получение кроличьих антисывороток к ВЛКРС

3.2.3. Молекулярно-биологические методы

3.2.3.1. Определение обратно-транскриптазной активности

ВЛКРС

3.2.3.2. Выделение ДНК из лейкоцитов крови животных

3.2.3.3. Выделение ДНК из цельной крови животных

3.2.3.4. Радиоактивная обработка ДНК-зонда

3.2.3.5. Молекулярная гибридизация

3.2.3.6. Полимеразная цепная реакция

3.2.4. Биохимические методы

3.2.4.1. Получение очищенных белков ВЛКРС

3.2.4.2. Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле

3.2.4.3. Определение концентрации белка в растворах

ГЛАВА 4. ЭПИЗООТИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ ПО ЛКРС

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лейкоз крупного рогатого скота: Разработка методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики»

Лейкоз крупного рогатого скота является одной из крупнейших и актуальнейших проблем ветеринарии настоящего времени. Если рассматривать болезнь в аспекте современных взглядов и последних достижений в области рет-ровирусологии, то она представляет собой общую медико-биологическую проблему, выходящую за узкие рамки ветеринарии. Принимая во внимание теоретические установки и концепции вирусного канцерогенеза, ЛКРС представляет определенный санитарно-медицинский интерес, и не случайно он изучается наряду с лейкозами и онкологическими заболеваниями людей, таких как Т-клеточный лейкоз, СПИД, возбудитель которого имеет близкое эволюционное родство и морфологическое сходство с Т-лимфотропными вирусами человека и обезьяны. Болезнь протекает бессимптомно, проявляясь на последних стадиях высоким лимфоцитозом и опухолевыми образованиями кроветворных органов и тканей. ЛКРС широко распространен во всем мире и наносит значительный экономический ущерб. В Российской Федерации лейкоз среди хронических инфекций КРС твердо занимает ведущее место, имея форму энзоотий и опережая такие болезни, как туберкулез и бруцеллез по уровню инфицированности стад.

Патогенез ЛКРС изучен недостаточно, однако известно, что после инфицирования у 70-90% животных наблюдается длительный персистентный лим-фоцитоз, у 10-30% происходит злокачественная трансформация клеток крови, в 5% случаев наблюдаются лимфосаркомы.

Впервые лейкоз у коров был зарегистрирован и описан немецким ученым 81ес^го1гку в 1878 г., который установил тенденцию болезни к дальнейшему распространению. Позднее КпиШ и Уо1кшапп (1916 г.) установили увеличение числа лейкоцитов крови и изменения в лейкоцитарной формуле, а также появление ядерных клеток, являющихся специфическим признаком заболевания. Среди патологий крупного рогатого скота термин «лейкоз» был введен БоЬЬе^ет в 1958 г., когда было установлено происхождение опухолевых клеток из ретикулоэндотелиальной системы, как и то, что лейкоз является болезнью злокачественной природы. Отечественные ученые Славянский и Щастный впервые описали лейкемические разрастания у коров, сравнивая их с опухолевыми (1875 г.).

Теория опухолевого происхождения лейкоза в настоящее время не вызывает сомнений, когда имеет место избыточное разрастание патологической кроветворной ткани, так же как и изменения картины периферической крови с усиленным размножением недифференцированных клеток лимфоидного происхождения.

Первое сообщение о лейкозе коров появилось во второй половине XIX столетия в Восточной Германии, он был назван «болезнь к востоку от Эльбы», а затем ее перенесли и в Западную Германию. Позднее болезнь распространилась на страны, граничащие с Балтийским морем, а затем и в Европу, США, Канаду, Японию.

Большой вклад в изучение проблемы, начиная с 1945 г., внес Ганноверский ветеринарный институт, где было установлено, что опухолевой стадии болезни предшествует длительная лейкемическая стадия в виде персистентного лимфоцитоза, а по результатам гематологического обследования начали устанавливать более ранний диагноз болезни, чем обнаружение опухолей или посмертная диагностика. Эту фазу болезни впоследствии стали называть гиперпластической предшествующей стадией, субклинической фазой или предлейко-зом, общая картина болезни представлялась в новом свете.

Разработанные впоследствии «лейкозные ключи» для оценки гематологических исследований с учетом общего количества лейкоцитов и процента лимфоцитов в крови позволили получить данные о степени поражения хозяйства. Благодаря гематологическим исследованиям можно было понять энзоотические ситуации, а по степени поражения и потерям в лейкозных хозяйствах предположить, что ЛКРС - инфекционная болезнь. Установление связи между двумя стадиями болезни позволило правильно толковать опыты по передаче лейкоза, что явилось причиной интенсификации исследований по данной проблеме во многих странах - Англии, Дании, США, Канаде, Японии и других.

Позднее, начиная с 50-х годов, была установлена перевиваемость болезни, когда телятам вводили кровь, молоко, мочу, кал, гомогенаты тканей лейке-мических опухолей, у значительной части животных был воспроизведен лейкоз. В последующих опытах выяснились и другие пути передачи и распространения лейкоза: плацентарная (от матери к плоду), с молоком матери и от больных коров, а также при проведении ветеринарных мероприятий через кровь. Результаты описанных опытов по передаче лейкоза были подтверждены экспериментами ряда исследователей, которые позволили с уверенностью сказать, что возбудителем болезни является вирус, тем более, что было уже известно, что лейкоз кур, мышей, морских свинок и кошек вызывается вирусами. Данные, подтверждающие это предположение, были получены при электронно-микроскопическом исследовании материалов лейкозного скота Dgarett (1962), Zorenson (1963). Обнаруженный и описанный возбудитель имел сходство с известными вирусами лейкемии животных других видов, так называемыми частицами С-типа, однако однозначной интерпретации роли возбудителя лейкоза КРС не последовало. И только в 1969 г. американские ученые Miller, Olson сообщили о доказательстве наличия вирусных частиц типа С в краткосрочных культурах лимфоцитов и опухолевых клеток больных лейкозом коров, стимулированных фитогемагглютинином, а впоследствии один из зараженных этим материалом теленок через 4,5 года пал от лейкоза сычуга. Вирусная этиология болезни была доказана, что и определило дальнейшее развитие основных направлений проблемы. Впоследствии этим же авторам удалось получить из краткосрочных культур лейкоцитов коров, зараженных BJIKPC, антигены, которые специфически реагировали в реакции иммунодиффузии с сыворотками больных лейкозом коров, а после получения в США д-ром Van der Maaten (1974) перевиваемой линии клеток почки эмбриона овцы, хронически продуцирующей BJIKPC, возникли предпосылки для разработки серологических методов диагностики ВЛКРС.

В настоящее время серодиагностика лейкоза широко применяется во всем мире, где в качестве антигена используется вирус, полученный в перевиваемой линии клеток РЬКу+, для культивирования которой в среде роста необходимо присутствие дорогостоящей фетальной сыворотки коров, поэтому актуальным и сегодня является вопрос бессывороточных способов культивирования вируса, так же как и разработки принципиально иных, более чувствительных методов диагностики болезни, основанных на обнаружении ДНК-провируса ВЛКРС в лимфоцитах крови животных при использовании молекулярно-биологических методов на самых ранних стадиях инфицирования животных до появления антител в сыворотках крови. Таким образом, вопросы совершенствования используемых диагностических и разработка новых лабораторных тестов остаются актуальными и на сегодня.

Многочисленные попытки найти способ лечения лейкоза КРС не дали никаких результатов. В настоящее время единственным способом борьбы с болезнью во всем мире является выбраковка больных и инфицированных животных на основании своевременной и точной диагностики. Больных животных определяют методом гематологического анализа, инфицированных по обнаружению антител в сыворотках крови с использованием, в основном, серологических тестов.

Вопрос использования активной специфической профилактики болезни остается открытым: все предпринимавшиеся многими учеными попытки создания различных протективных препаратов так и не достигли завершенного варианта, примененного в практике ветеринарии, по разным причинам, которые будут обсуждены в следующих разделах работы. и

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Лейкоз крупного рогатого скота -хроническое инфекционное заболевание животных лимфопролиферативной природы, наносящее значительный экономический ущерб вследствие падежа, вынужденной выбраковки больных животных, падения уровня продуктивности, нарушения племенной работы, недополучения молодняка, ставит новые задачи и требует более углубленного изучения многих вопросов в решении данной проблемы (Смирнов и соавт., 1983; Валихов и соавт., 1992; Белов и соавт., 1997; Гулюкин и соавт., 1999; Бусол и соавт., 1999). Болезнь поражает коров, начиная с 3-х летнего возраста, протекает бессимптомно на протяжении длительного времени, проявляясь в дальнейшем персистирующим лимфоцитозом, реже -лимфосаркомой.

Установлено, что этиологическим агентом данного заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) или в английской транскрипции bovine leukemia virus (BLV), относящийся к экзогенным РНК-содержащим вирусам семейства Retroviridae, роду Deltaretrovirus, куда также входят Т-лимфотропные вирусы человека 1 и 2 и вирус лейкоза обезьян (Miller, и соавт., 1969; Calafat и соавт., 1974, Van der Maaten и соавт., 1974; Парфанович и и соавт., 1974, Kaaden и соавт., 1977, Burny и соавт., 1978, 1985, Валихов и соавт., 1979, Copeland и соавт., 1983, Орлянкин и соавт., 2000).

Ввиду близкого морфологического и эволюционного родства ВЛКРС с вирусами Т-клеточного лейкоза человека, его способности преодолевать меж-видодовые барьеры (доказана способность ВЛКРС заражать кроликов, свиней, лошадей, коз, овец и культуры клеток и тканей различных видов животных и человека), рассматриваемая проблема имеет медико-биологическое и социальное значение.

Продукты от больных лейкозом животных (мясо и молоко) содержат вредные метаболиты триптофана и других аминокислот, обладающих лейкозогенными свойствами, и, следовательно, являются опасными для здоровья человека. Среди серопозитивных к BJIKPC животных другие незаразные болезни (маститы, метриты, ретикулиты, перикардиты и др.) встречаются в 2-4 раза чаще, чем у серонегативных, поэтому необходимость целенаправленной борьбы с этим заболеванием возрастает.

Болезнь распространена во всем мире, в РФ носит характер прогрессирующей эпизоотии. Инфицированность стад КРС составляет 12-70% в разных регионах страны и возрастных группах животных.

В настоящее время единственным эффективным средством борьбы с болезнью является выбраковка больных и инфицированных животных на основе своевременной и точной диагностики. Многие страны Европы и США таким образом за несколько лет тщательной и кропотливой работы полностью освободились от JIKPC или значительно снизили показатели болезни, однако, в РФ по экономическим причинам выбраковывают только больных, инфицированных животных лишь изолируют по результатам серодиагностики.

Единственным диагностическим серологическим тестом BJ1KPC-инфекции, используемым в отечественной ветеринарной практике, является реакция иммунодиффузии в геле, который, являясь высокоспецифичным, обладает низким уровнем чувствительности и позволяет выявлять антитела к вирусу на поздних стадиях инфекционного процесса, тогда как в странах Европы и США для серодиагностики болезни, кроме того, применяется более чувствительный иммуноферментный анализ (Portetelle и соавт., 1989, Carli и соавт., 1993, 1999, Rodak и соавт., 1997, Dolz и соавт., 1999), а также молекулярно-биологические методы обнаружения вируса, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) на самых ранних стадиях инфекционного процесса (Belak и соавт., 1993, Fechner и соавт., 1996, Rovnak и соавт., 1999). Поэтому вопросы совершенствования и разработки новых диагностических приемов остаются особенно актуальными. В последнее время за рубежом разработан и используется метод диагностики BJIKPC-инфекции, основанный на использовании полимеразной цепной реакции (Belak и соавт., 1993, Beier и соавт., 1998), а также во Всероссийском институте защиты животных (Прохватилова, 1998), высокоспецифичный и значительно более чувствительный, чем методы серологического анализа с относительно простой, воспроизводимой технологией и доступной стоимостью.

Отдельным направлением в решении проблемы JIKPC является разработка и применение средств специфической профилактики болезни. Изучению возможности применения специфических профилактических препаратов против J1KPC посвящено много работ как отечественных, так и зарубежных исследователей, в которых были экспериментально разработаны и испытаны профилактические препараты против JIKPC (Miller и соавт.,1978,1983; Парфанович и соавт., 1981; Альтштейн и соавт., 1992, Patrascu, и соавт., 1980; Onuma и соавт., 1984, Ohishi и соавт., 1991, Brillowska и соавт., 1999, Reichert и соавт., 2000), обладающие достаточной иммуногенностью и защищающие животных от последующего заражения вирусом, однако ни один из них не был применен в практике ветеринарии по разным причинам, в том числе и вследствие высокой стоимости фетальной сыворотки коров, необходимой для культивирования перевиваемых культур клеток, являющихся источником вируса. В этой связи представляется актуальным продолжение работы в данном направлении, связанным с разработкой новых подходов к вопросу изыскания возможности таких способов культивирования вируса, которые позволили бы накопить достаточные его количества для получения биопрепаратов при снижении их себестоимости.

Внедрение ПЦР-диагностики JIKPC в практику ветеринарии позволило бы расширить рамки представлений об эпизоотическом процессе болезни, а также открыло новые возможности в изучении патогенеза, путей передачи инфекции, степени поражения стад крупного рогатого скота и разработки новых схем оздоровления хозяйств. В связи с вышеизложенным нам представилось актуальным дальнейшее изучение вопросов совершенствования лабораторной диагностики и специфической профилактики лейкоза крупного рогатого скота с целью повышения эффективности мер борьбы с болезнью.

В основу настоящей диссертационной работы положены материалы, полученные в результате выполнения научно-исследовательской программы лабораторий лейкоза, вирусологии, биотехнологии Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского института по тематике Государственного Комитета по науке и технике СССР 0.69.05 «Разработать методы и средства борьбы с лейкозами человека, сельскохозяйственных животных и птиц», 0.74.05 «Разработать новые направления исследований генетического аппарата, основных биополимеров и структур клетки и внедрить достижения физико-химической биологии в народное хозяйство», а также по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 г.г. проблемы «Разработать молекулярно-биологические основы совершенствования и создания новых высокоэффективных и экологически безопасных методов, средств, технологий и систем диагностики, профилактики и терапии болезней животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие и получение продукции животноводства высокого санитарного качества».

Отдельные фрагменты работы выполнены совместно и на базах научно-исследовательских учреждений: Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

РАМН (рук. лаб. лейкозов, д.м.н. |М.И.Парфанович| ), Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ (рук. отдела клинической вирусологии, д.м.н. В.Ф. Еремин), Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина рук. лаб. генной инженерии, д.м.н. |В.П. Карелин], ст.н.с., к.х.н. А.С.Каледин), Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (ст.н.с., к.б.н. Г.О. Шайха-ев), Донского государственного аграрного университета (рук. лаб. лейкозов А.Г. Ропаев), Эстонской сельхозакадемии (рук. лаб. лейкозов, к.в.н Ю.А.Симоварт), СПК племзавода «Россия» Октябрьского района Ростовской области (директор к.с/х.н. А.А.Животов), Шахтинской ветеринарной лаборатории (директор Ю.В.Назаров). Я им всем приношу искреннюю благодарность.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Целью исследований являлись изучение эпизоотической ситуации в регионе, разработка и усовершенствование методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики ЛКРС с дальнейшим их испытанием в полевых условиях. Перед нами стояли следующие задачи:

- изучить эпизоотическую ситуацию по ЛКРС в Ростовской области;

- изучить свойства вируса, полученного в культуре клеток РЬКУ+ при использовании усовершенствованной среды роста;

- разработать новый способ культивирования ВЛКРС в переживающих культурах тканей животных в бессывороточной среде роста с целью получения промышленных количеств вируса при значительном снижении себестоимости изготавливаемых биопрепаратов;

- на основе нового способа культивирования ВЛКРС в переживающих культурах тканей разработать, изучить свойства и провести испытания:

• антигена для диагностики ВЛКРС-инфекции в РИД;

• антигена для иммуноферментной диагностики ВЛКРС-инфекции;

• вакцины для специфической профилактики ЛКРС;

- разработать и провести испытание молекулярно-биологических методов обнаружения ВЛКРС в лейкоцитах крови с использованием:

• молекулярной ДНК гибридизации с меченным ДНК-зондом;

• полимеразной цепной реакции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

В процессе проведения диагностических исследований проведен анализ эпизоотической ситуации по ЛКРС в Ростовской области.

Усовершенствована методика культивирования вируспродуцирующей линии клеток РЬКУ+, путем замены сыворотки крови эмбриона коровы сывороткой крови северных оленей с целью снижения стоимости вирусных препаратов и изучены свойства полученного вируса.

Впервые показана способность ВЛКРС репродуцироваться в переживающих тканях эмбрионов и молодняка КРС, овец и свиней. Изучены свойства вируса, показана способность его к последующему пассированию в тех же тканях.

Разработан способ изготовления антигена ВЛКРС из вируса, накопленного в переживающих культурах тканей, для использования его в РИД и в ИФА. В опытах показаны специфичность и антигенная активность вновь полученного вирусного препарата в сравнении с ВЛКРС из БЬКу+. Впервые показана способность инактивированного ВЛКРС, накопленного в эксплантатах переживающих культур тканей, вызывать у телят иммунный ответ, обеспечивающий устойчивость к последующему заражению вирулентным вирусом.

Разработан и испытан молекулярно-биологический метод обнаружения ДНК-провируса ВЛКРС в лейкоцитах крови с помощью молекулярной гибридизации при использовании меченного ДНК-зонда, в опытах показаны его специфичность и более высокая чувствительность в сравнении с серологическими методами.

Сконструирована и испытана тест-система диагностики ЛКРС с помощью полимеразной цепной реакции, в опытах показаны ее специфичность и более высокая чувствительность относительно серологических методов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Использование разработанного способа культивирования ВЛКРС в эксплантатах переживающих культур тканей для накопления вируса в больших количествах с целью изготовления диагностических и профилактических биопрепаратов позволит значительно снизить их стоимость вследствие исключения из состава среды культивирования вируса дорогостоящей и дефицитной сыворотки крови эмбриона коровы. Способ изготовления и контроля вакцины защищен авторским свидетельством.

Внедрение разработанного метода ПЦР-диагностики болезни позволит значительно снизить затраты на диагностические мероприятия вследствие использования в тест-системе синтетических соединений, а также ввиду более высокой чувствительности метода относительно серологических, повысить эффективность оздоровительных мероприятий. Тест-система ПЦР-диагностики одобрена и рекомендована к проведению широких полевых испытаний межведомственной комиссией Департамента ветеринарии МСХ и П РФ (акт испытаний прилагается). Диагностический набор ПЦР-ВЬУ-тест представлен к испытаниям впервые в РФ.

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учитывая, что стоимость сыворотки эмбриона коровы составляет 5001000 у.е. (Ну Clon, ICN, Sigma, США), стоимость получаемых биопрепаратов при культивировании вируса в бессывороточной среде роста значительно снижается. Трудно определить это в цифровом выражении относительно стоимости РИД-диагностикума на основе вируса из FLKV+, поскольку расходы на его приобретение ветеринарными лабораториями компенсируются государством (себестоимость одного исследования в РИД - 2,28 руб.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

- новые способы культивирования вируса ЛКРС с целью снижения затрат на его получение;

- разработка, получение и испытание биопрепаратов из вируса, накопленного новыми способами:

• антигена для РИД;

• антигена для ИФА;

• препарата для специфической профилактики;

- разработка и испытание молекулярно-биологических методов обнаружения ВЛКРС в клетках крови животных при использовании:

• молекулярной гибридизации;

• полимеразной цепной реакции.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ

Работа выполнена лично автором на базе Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского института Росийской Академии сельскохозяйственных наук. Автору принадлежат организация и проведение экспериментальных исследований, теоретическое обобщение полученных результатов и выводы. Отдельные разделы выполнены совместно с сотрудниками Северо-Кавказского зонального НИВИ к.б.н. Молчановым В.П., к.в.н. Пиголкиной В.В., института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН д.м.н. |Парфанович М.И.|, к.б.н. Яро-славцевой Н.Г., Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ д.м.н. Ереминым В.Ф., Института общей генетики им. Н.Н.Вавилова РАН, к.б.н. Шайхаевым Г.О., Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина д.м.н. [Карелиным В.П.|, к.х.н. Калединым A.C., Донского государственного аграрного университета зав.лаб. лейкоза Ропаевым А.Г., Эстонской сельскохозяйственной академией к.б.н. Си-мовартом Ю.А., а также специалистами ветеринарной службы Ростовской области к.с/х.н. Животовым A.A., Постовым С.Г., Назаровым Ю.В., Шлычковым Е.Е.

Я приношу им свою искреннюю благодарность. По всем результатам имеются совместные публикации.

Я выражаю глубокую благодарность научным консультантам д.м.н. Еремину В.Ф. и д.в.н., проф. Дубовому Б.Л.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунотерапия лейкоза человека и животных" (Самарканд, 1984), II Всесоюзном съезде гематологов и транфузиологов (Львов, 1985), Всесоюзном координационном совещании по проблеме лейкозов человека и животных (0.69.05 ГКНТ СМ СССР, Минск, 1986), на конкурсе молодых ученых в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва, 1986), на научных конференциях по итогам научно-исследовательской работы в Северо-Кавказском зональном научно-исследовательском ветеринарном институте (Новочеркасск, 1988-2002) и в Донском государственном аграрном университете (Персиановка, 1985-2001), на научной конференции «Современные методы профилактики и оздоровительные мероприятия по лейкозу крупного рогатого скота» (Тарту, 1987), на симпозиуме «Этиология, диагностика, профилактика гемобластозов, проблемы диспансеризации и реабилитации гематологических больных» (Рига, 1987), на конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии и современные методы лечения» (Пенза, 2000), на конференции «Лабораторное дело: организация и методы исследований» (Пенза, 2000), на конференции «Студенческая наука - экономике России» (Ставрополь, 2001), на научно-производственной конференции по актуальным вопросам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001), на конференции, посвященной 50-летию Пензенской ГСХА «Современные методы производства и переработки сельскохозяйственной продукции» (Пенза, 2001).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 1 монография и 34 работы в периодических научных изданиях, материалах научных конференций, научно-методических рекомендаций.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введения, общей характеристики работы, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и предложений. Материалы диссертации иллюстрированы 21 таблицами и 23 рисунками. Библиографический список включает 342 работы отечественных и зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Мальцева, Надежда Анатольевна

выводы

1. Проведен анализ эпизоотической ситуации по лейкозу и ВЛКРС-инфекции в Ростовской области, установлено, что как болезнь, так и инфекция распространены повсеместно. Высокий уровень болезни (2%) и инфекции (около 30% среди коров дойного стада и около 20% среди молодняка) сохраняется на постоянном высоком уровне в течение многих лет.

2. Разработанный новый способ культивирования ВЛКРС в культуре клеток РЬКу+ при использовании сыворотки крови северных оленей позволяет получать достаточные количества вируса высокой антигенной активности (1:64 в РСК, 1:8-1:32 в РИД).

3. Показана возможность и разработаны условия репродукции ВЛКРС в переживающих культурах тканей эксплантатов селезенки, легкого, тимуса эмбриона коровы и селезенки теленка, овцы, свиньи при заражении последних ВЛКРС из культуры клеток БЬКу+ или лейкоцитами больных лимфолейко-зом коров без использования какой-либо сыворотки крови в среде культивирования.

4. Полученный и испытанный антиген ВЛКРС для РИД из вируса, накопленного в переживающих культурах тканей, показал высокую активность (1:32 в РИД) и специфичность ВЛКРС из РЬКу+. Использование вируса, полученного по новой технологии для приготовления РИД-антигена значительно снижает стоимость препарата. Применение разработанного РИД-диагностикума позволит снизить затраты на проведение диагностических исследований животных.

5. Полученный и испытанный антиген ВЛКРС для ИФА из вируса, накопленного в переживающих культурах тканей, показал высокую активность и специфичность, что подтверждает возможность использования полученного препарата для диагностических исследований в практике ветеринарии со значительным снижением затрат на проведение диагностических исследований животных ввиду низкой себестоимости вируса, полученного в бессывороточной среде роста.

6. Препарат для специфической профилактики лейкоза крупного рогатого скота, полученный из вируса, накопленного в переживающих культурах тканей, показал высокую иммуногенность и протективные свойства, продемонстрированные в опытах на животных (от 85% защиты), может быть использован в практических целях ветеринарии. Стоимость препарата, ввиду исключения из среды культивирования вируса сыворотки эмбриона коровы, доступна для практического использования.

7. Разработан и испытан метод молекулярной гибридизации для диагностики ВЛКРС-инфекции при использовании меченного 32Р ДНК-зонда. В опытах продемонстрирована его более высокая чувствительность в сравнении с методами серологического анализа - реакцией иммунодиффузии и иммуно-ферментным анализом.

8. Сконструирована и испытана тест-система ПЦР-диагностики ВЛКРС-инфекции. Показаны его высокая специфичность и более высокая чувствительность в сравнении с РИД. В опытах по экспериментальному воспроизведению на овцах показано, что ПЦР позволяет выявлять ДНК-провирус ВЛКРС на 15-25 дней раньше, чем РИД. С помощью ПЦР можно дифференцировать телят с колостральным иммунитетом от вирусоносителей. Применение ПЦР-диагностики в практике ветеринарии позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий при снижении затрат на диагностические исследования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

1. Методические рекомендации по обнаружению ДНК-провируса вируса лейкоза крупного рогатого скота в лейкоцитах периферической крови с помощью молекулярной гибридизации. Утверждены Ученым советом Института вирусологии РАМН 13.01.86 г.

2. Научно-методические рекомендации «Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота». Утверждены Ученым советом СКЗНИВИ 9.04.02 г.

3. Научно-методические рекомендации «Полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза крупного рогатого скота». Утверждены Ученым советом СКЗНИВИ 9.04.02 г.

4. Способ изготовления контроля вакцины из вируса лейкоза крупного рогатого скота. А. с. РФ 1389058 МПК А61 КЗ9/12 39/295.

5. Тест-система для обнаружения ДНК-провируса ВЛКРС с помощью по-лимеразной цепной реакции «ИЦР-ВЬУ-тест». Проект технических условий и временное наставление по применению. Акт межведомственных испытаний прилагается.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди болезней сельскохозяйственных животных, характеризующихся злокачественным ростом, лейкозы занимают первое место по частоте и тяжести заболевания. Это выдвигает проблему ЛКРС в число важнейших биологических и социальных задач, учитывая, что статистические данные, публикуемые во многих странах, показывают увеличение числа случаев заболевания лейкозами среди людей и животных всех континентов. Что касается ситуации по ЛКРС в Российской Федерации, есть все основания говорить о разлитой прогрессирующей эпизоотии - болезнь регистрируется повсеместно в 1,5-2% случаев, инфицированность стад в разных регионах составляет 13-70%.

Борьба с ЛКРС является одной из основных задач практической ветеринарии и вирусологии и включает широкие диагностические исследования, проведение ветеринарно-санитарных и противоэпизоотических мероприятий, направленных на выбраковку больных и изоляцию инфицированных животных и создание благополучных по заболеванию стад.

Внедрение в практику изучения лейкоза и ВЛКРС-инфекции ряда современных методов исследования (морфологических, вирусологических, молеку-лярно-биологических и др.) позволило добиться значительных успехов в решении обсуждаемой проблемы. Так, было установлено, что этиологическим агентом данного заболевания является экзогенный РНК-содержащий вирус, относящийся к роду БеЙагейттгш семейства 11е1гоутс1ае [10, 15, 21, 42, 138, 241], изучена морфология, морфогенез, биофизические и биохимические свойства вируса, показана возможность моделирования ВЛКРС-инфекции на овцах, как и вызывать иммунный ответ на введение инактивированного вируса с целью специфической иммунопрофилактики болезни [1, 45, 210, 244, 245, 259, 269, 271,278,330].

В дополнение к ранее существующему методу диагностики ЛКРС (кли-нико-гематологическому) был разработан ряд серологических (РИД, РСК,

МФА, ИФА), вирусологических (тест синцитиеобразования, седиментационно-градиеитиый анализ), молекулярно-биологических (определение обратно-транскриптазной активности, молекулярная гибридизация, ПЦР).

В настоящее время диагностика этого заболевания во всем мире основана на выявлении серопозитивных животных методами серологического анализа.

Первым методом обнаружения антител в сыворотках крови животных к вирусу, разработанным Miller и соавт. [241] к антигену вируса из хронически инфицированной BJIKPC перевиваемой линии клеток почки эмбриона овцы (FLKy+), полученной Van der Maaten [332], является реакция иммунодиффузии в геле, высокая специфичность которой при доступном исполнении сделали ее незаменимым диагностическим серологическим тестом BJIKPC-инфекции и до настоящего времени.

Широкое применение метод нашел и в отечественных институтах, лабораториях, где успешно применяется многие годы, при использовании стандартного диагностического набора Курской биофабрики (Биок, Россия), разработанного в 80-х годах отечественными учеными (Валихов и соавт.) [9].

Однако, несмотря на неоспоримые преимущества метода РИД, прочно занявшего свое место в ряду лабораторных тестов определения ВЛКРС-инфекции, как самого специфичного, его низкая чувствительность не позволяет выявлять всех инфицированных животных на ранних стадиях развития болезни.

В последние годы за рубежом был разработан и широко используется до настоящего времени в ветеринарной практике большинства стран мира при проведении программы ликвидации лейкоза крупного рогатого скота новый метод серологической диагностики болезни, более чувствительный, чем РИД и, в то же время пригодный для проведения массового скрининга - иммунофер-ментный анализ. Благодаря высокой чувствительности и специфичности, а также скорости постановки ИФА завоевал большую популярность в практических лабораториях мира. В качестве антигена в этом тесте используются как вирусные белки gp51 и р24, так и рекомбинантные белки, и синтетические пептиды, а также моноклональные антитела к ним. Различают ИФА прямой, непрямой, «ловушечный», двухсайтовый, конкурентный и амплификационный, в ветеринарной практике для обнаружения антител к BJIKPC используется непрямой иммуноферментный анализ. Кроме вышеперечисленных достоинств ИФ-диагностики показано, что ИФА позволяет обнаруживать антитела к ВЛКРС не только в сыворотке крови животных, но также в молоке и в моче, что является важным фактором в случаях необходимости подтверждения диагноза, а также еще раз подчеркивает высокую степень чувствительности метода. Причем при тестировании образцов мочи практически не наблюдается ложноположитель-ных реакций, которые имеют место при работе с сыворотками крови и молоком. Одним из достоинств метода является возможность одновременного проведения тестирования 90 и более образцов сывороток, что имеет большое значение при массовых исследованиях животных. Как было показано Dolz и Moreno, Simard и соавт. [162] ИФА на основе gp51 обладает более высокой чувствительностью, чем с р24 и с РИД [22,25, 32, 56, 62, 85, 169, 172, 184, 203, 235, 275, 285].

Разработанные препараты ИФА диагностики ЛКРС отечественными авторами (Чекишев, 1992, Иванова, 2000) также показали высокие результаты по чувствительности и специфичности метода, однако они не были применены в практических целях по ряду причин, в том числе и из-за высокой стоимости ввиду необходимости использования фетальной сыворотки коров для культивирования вируспродуцирующей линии клеток FLKy+ (стоимость 1 л коммерческого препарата сыворотки - 500-1000 у.е. (ICN, Sigma, Ну Clon, США), являющейся источником вируса. В работе Ивановой [22] предлагается бессывороточная среда роста для поддержания культуры клеток FLKV+, снижающая стоимость получаемого препарата, однако возможность промышленного производства диагностикума при культивировании вируса таким способом вызывает сомнения.

Производство отечественного препарата сыворотки эмбриона коров ограничено из-за высокого уровня ВЛКРС-инфекции среди коров дойного стада (40-60% и выше) при снижении поголовья КРС в стране.

В связи с вышеизложенным, в настоящей работе нами были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ эпизоотической ситуации по ЛКРС в регионе.

2. Разработать способы культивирования В ЛКРС для дальнейшего изготовления биопрепаратов, достаточно технологичных и приемлемых для практического применения в экономическом отношении.

3. На основе нового способа культивирования вируса разработать, изучить свойства и провести полевые испытания:

- антигена ВЛКРС для использования его в РИД;

- антигена ВЛКРС для использования его в ИФА;

- вакцины инактивированной цельновирионной.

4. Разработать и испытать молекулярно-биологические методы диагностики ВЛКРС-инфекции при использовании:

- молекулярной ДНК-гибридизации с меченным ДНК-зондом;

- полимеразной цепной реакции.

Нами был разработан ИФ-тест для диагностики ВЛКРС, где в качестве антигена использован вирус, полученный в переживающих культурах тканей в бессывороточной среде роста, что значительно снижает стоимость получаемого препарата. Результаты экспериментальных и полевых испытаний показали специфичность полученного вируса и более высокую чувствительность метода ИФА в сравнении с РИД (5-7%), что согласуется с данными других авторов, опубликованных ранее [23, 34, 35, 44, 56, 78, 95, 146, 198, 235, 291, 307, 333]. Другие методы серологической диагностики, такие как иммунофлюоресцент-ный, иммунный блотинг, радиоиммунный, реакция связывания комплемента ввиду сложности выполнения и необходимости соответствующего оборудования для массовых исследований не применяются.

За рубежом (Западная Европа, США, Украина) инфицированных животных немедленно выбраковывают, что позволило в значительной степени оздоровить стада, возможно, этот путь решения проблемы и есть наиболее эффективный, однако, в РФ данный подход не применяется в силу экономических причин. В нашей стране основным методом оздоровления стад является изоляция серопозитивных по РИД животных в отдельные фермы с последующей заменой их здоровыми. Однако применение диагностического РИД-теста для оздоровления стад в течение многих лет (1988-2002гг.) не привело к положительным результатам: ЛКРС по-прежнему широко распространен, что, возможно, связано с низкой чувствительностью РИД-теста, а также, возможно, с несвоевременным выполнением противоэпизоотических мероприятий по выбраковке больных и изоляции инфицированных животных.

В связи с вышеизложенным вопросы совершенствования диагностики ВЛКРС-инфекции и продолжение изучения вопроса разработки специфической профилактики болезни приобретают еще большее значение.

Нами был проведен анализ эпизоотической ситуации по ЛКРС и ВЛКРС-инфекции в Ростовской области, в результате которого выяснилось, что как болезнь (1,6-2%), так и инфекция (26,5% в среднем за последние 6 лет) распространены повсеместно.

В дальнейшем с целью изучения возможности снижения стоимости получаемого вируса нами была испытана питательная среда для культивирования культуры клеток РЬКУ+, содержащая сыворотку крови северных оленей. В исследованиях, проведенных в сравнении со средой, содержащей фетальную сыворотку коров, была показана продукция вируса высокой антигенной активности, и таким образом была продемонстрирована возможность получения вируса без использования дорогостоящей фетальной сыворотки коров. В последующем нами был разработан способ культивирования ВЛКРС в переживающих культурах тканей, позволяющий повысить эффективность технологии его получения при снижении стоимости получаемых биопрепаратов вследствие исключения из состава среды роста сыворотки эмбриона коров.

Результаты исследований показали, что вирус накапливался во всех вышеперечисленных переживающих культурах тканей при заражении последних как BJIKPC из культуры клеток FLKV+, так и в виде вируссодержащих лейкоцитов.

Используемые в опытах по заражению переживающих культур тканей лейкоциты крови больных коров исследовались на наличие ВЛКРС с помощью седиментационного, радиоизотопного анализов, электронной микроскопии, антигенную активность культуральной жидкости краткосрочных культур лейкоцитов определяли в РИД, РСК, ИФА, ДНК-провирус - при использовании ДНК-гибридизации с меченным ДНК-зондом.

Определение репродукции ВЛКРС в переживающих культурах тканей проводили по наличию обратно-транскриптазной активности, наибольшего значения индекс OTA регистрировался на 3 сутки культивирования.

При использовании градиентного, седиментационного и радиоизотопного анализа было установлено, что наибольший пик Н3 - радиоактивности определяется на 3 сутки культивирования, структуры, собранные из зоны с плотностью 1,14-1,18 г/мл были иммунологически идентичны ВЛКРС в РИД. Наибольшие титры вирусных антигенов в РСК, ИФА определялись также на 3 сутки культивирования.

Таким образом, в наших опытах было определено, что при культивировании ВЛКРС разработанным способом размножение вируса наблюдается во всех испытанных системах переживающих культур тканей.

Вирус сохранял свои свойства в нативном состоянии при глубоком замораживании в жидком азоте (при -196° С) в течение 12 месяцев, при температуре - 20° С в течение 2 месяцев, в лиофилиризованной виде при температуре от 4° С до минус 20° С в течение 12 месяцев. Аналогов данной разработки в мировой литературе не обнаружено.

Следующим этапом нашей работы было исследование возможности приготовления биопрепаратов из вируса, полученного в переживающих культурах тканей по новой технологии. Нами были разработаны и испытаны антиген для РИД, антиген для ИФА, а также вакцина инактивированная цельновирионная для активной специфической профилактики болезни. В опытах на животных были показаны антигенные свойства вируса и специфичность вирусу из FLKV+ с сыворотками крови разных групп животных и с гипериммунными сыворотками крови кролика.

Изучению возможности активной специфической профилактики JIKPC посвящено много работ отечественных и зарубежных исследователей (Van der Maaten, 1978,1983, Парфанович и соавт., 1982; Patrascu и соавт., 1983; Альт-штейн,1992, Onuma и соавт., 1984, Ohishi и соавт., 1991, Brillowska и соавт., 1999, Reichert и соавт., 2000), в которых показана возможность изготовления вакцинных препаратов, обладающих иммуногенностью и защитным эффектом, однако ни один из них не был применен в практических целях по разным причинам, одной из которых является высокая стоимость препаратов вследствие необходимости присутствия в среде культивирования вируспродуцирующих линий клеток дорогостоящей сыворотки эмбриона коровы [1, 45, 210, 244, 245, 259, 269, 271,278, 330].

Miller и соавт. [245] исследовали возможность иммунопрофилактики BJIKPC-инфекции. Источником вируса также была культура клеток FLKV+ при культивировании в среде Игла с 10% сыворотки эмбриона коров. Инактивация вируса проводилась бинарным этиленимином. Из 18 вакцинированных животных 14 получили контрольное заражение ВЛКРС в дозе 2,5x105 лимфоцитов больной лейкозом коровы. (100 инфекционных доз на каждое животное). Из 14-ти иммунизированных и получивших контрольное заражение защиту получили только 2, что, возможно, связано с большой дозой вируса в опыте контрольного заражения. Полнота инактивации исследовалась в опыте биопробы на овцах. Антигенная активность инактивированного вируса в данной работе не проводилась.

Разработанная в Институте вирусологии РАМН инактивированная аминометилольными соединениями цельновирионная вакцина (Парфанович и со-авт., 1979,1980,1981; Жданов и соавт., 1981) была также приготовлена из BJIKPC, полученного из культуры клеток FLKV+ при культивировании в среде Игла с 10% сыворотки эмбриона коров [21, 36, 41, 54, 81].

В опытах на телятах и овцах, поставленных на экспериментальных базах ЭСХА (г. Тарту), ДГАУ (г. Новочеркасск), БелНИИ экспериментальной ветеринарии (г. Минск), была показана высокая эффективность полученного препарата (защита составила около 90% животных), несмотря на более высокую, чем в опытах американских исследователей разрешающую дозу инфекционного материала (8x109 и 2x1010 лейкоцитов на 1 животное), использованного в опыте контрольного заражения.

Вакцина, приготовленная румынскими авторами (Patrascu и соавт., 1980) из BJIKPC из культуры клеток легкого летучей мыши (NBL-BJIKPC2) и селезенки эмбриона коровы (FLS-N1-1228), культивирование которых проводится в среде Игла с 5-10% сыворотки эмбриона коров, обладала высокой иммуноген-ностью и защитным действием: из 20 вакцинированных телят защищенными оказались 18 [299].

Большой интерес представляет работа японских авторов (Onuma и соавт., 1984) [270], где изучалось действие 4-х вакцинных препаратов: очищенных белков BJIKPC (gp51 и р24) из FLKV+ при культивировании ее в среде Игла с 20% сыворотки эмбриона коровы, а также фиксированных клеток FLKV+ и SF -28 (фибробласты овцы; транформированные ВЛКРС), где было подтверждено уже известное ранее (Miller, Van der Maaten, 1978,1983; Hunsmann и соавт., 1975; Bolonesi и соавт., 1976; Hile и соавт., 1976; Schafer и соавт., 1977) положение о том, что основным компонентом, ответственным за индукцию нейтрализующих антител против ретровирусов, в том числе и против ВЛКРС, являются гликопротеины оболочки вириона: от последующего заражения активным вирусом защищенными оказались только животные, иммунизированные gp51 и клетками FLKV+ , тогда как препараты р24 и клеток SF -28 даже не индуцировали выработки антител к BJIKPC.

Ряд работ (Theilen и соавт.,1982; Roberts и соавт.,1982) посвящены изучению протективных препаратов, полученных при культивировании в среде Игла или PPMI-1640 при содержании 15% сыворотки эмбриона коров лимфоидных культур клеток BL-3 и BL-20, полученных их костного мозга и тимуса телят с лимфосаркомой. Клетки не продуцировали BJIKPC, и поэтому не индуцировали у телят и овец выработки специфических противовирусных антител, однако, оказали некоторое протективное действие от последующего заражения активным BJIKPC [329]. Препарат BJIICPC, полученный из культуры клеток при культивировании их в среде Игла с 10% сыворотки эмбриона коров и инакти-вированный этиленимином по методу Miller и соавт. [245] был приготовлен в ВИЭВ им. Р.Я.Коваленко, однако, опыты на животных продемонстрировали отсутствие защиты.

Отрицательные результаты в опытах по вакцинации 32 телят 4-мя препаратами BJIKPC - ослабленным вирусом, разрушенным вирусом, лизатами культивированных и нативных лейкоцитов, несмотря на определенный иммуноген-ный эффект, был получен в работе Кукайн и соавт. [31, 84].

Необходимо отметить, что во всех вышеизложенных работах по изготовлению и испытанию различных протективных препаратов против бычьего лейкоза использовался вирус, полученный при культивировании культур клеток с обязательным присутствием в среде роста не менее 10% сыворотки эмбриона коровы, что является серьезным препятствием для применения их в практике, вследствие высокой стоимости получаемого вируса.

Предложенный нами способ изготовления вакцины (инактивированной цельновирионной) из BJIKPC, полученного по новой технологии, стоимость которого, ввиду отсутствия в составе среды роста фетальной сыворотки коров, позволяет получить профилактический препарат против JIKPC в достаточных количествах для применения его в практических целях.

Так как наша работа является прямым продолжением работы по разработке инактивированной цельновирионной вакцины, выполненной в лаборатории вирусов лейкозов Института вирусологии РАМН, то ряд этапов приготовления вакцины (инактивация вируса, выбор адъюванта , условия сорбции вируса, постановка опытов по вакцинации животных) выполнен по разработанной ранее схеме, тем не менее, внесены новые методы оценки антигенных свойств вакцины при использовании иммуноблот-анализа и контроля полноты инактивации вируса с помощью молекулярной ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции.

Высокая иммуногенность и достаточный защитный эффект вакцины (89%), полученной по новой технологии, были показаны в опытах на телятах параллельно и в сравнении с препаратом, полученным ранее из вируса, накопленного в культуре клеток РЬКУ+. Опыты проводились на базах Калужского отдела лейкозов ВИЭВ, Эстонской сельскохозяйственной академии, Донского государственного аграрного университета, СПК племзавода «Россия».

Результаты наших опытов по испытанию вакцины на телятах можно сделать вывод, что препарат, полученный по новой технологии, обладает иммуно-генностью и защищает 75-85% животных от последующего заражения активным ВЛКРС.

Таким образом, нами разработаны препараты из вируса, накопленного в переживающих культурах тканей, антигенные и иммуногенные, а также защитные свойства которых были показаны в опытах на животных. Ввиду отсутствия сыворотки крови животных в составе среды культивирования стоимость полученных препаратов позволяет использовать их для массового применения. Большое значение также имеет факт значительного упрощения способа получения вируса при использовании нового метода культивирования вируса и возможность получения этим способом достаточно больших количеств вируса (для промышленного производства биопрепаратов).

Получено авторское свидетельство "Способ изготовления и контроля вакцины из вируса лейкоза крупного рогатого скота".

Одним из подходов к созданию профилактического препарата против BJIKPC является создание ДНК-вакцины на основе вируса осповакцины. Такой препарат был сконструирован и использован отечественными авторами (Альт-штейн и соавт., 1992, Валихов и соавт., 1992, Листкова, 2000), где в качестве исходного материала была использована провирусная ДНК, проклонированная по Sstl в плазмиде pBR322. Для введения env гена в геном ВОВ были использованы интеграционные плазмиды на основе плазмиды pVAR15, содержащей участок Hindlll J-фрагмента генома ВОВ, включающий ген тимидинкиназы (tk) ВОВ, в который был встроен поксвирусный промотор гена 7.5 К-белка (Р7.5). Иммуногенность рекомбинантов ВОВ, экспрессирующих gp51, изучали на кроликах: все полученные рекомбинанты вызывали у животных образование нейтрализующих антител. В опытах на телятах было показано, что иммуногенность полученных рекомбинантов недостаточна: индуцировать образование антител одним лишь рекомбинантом не удалось, что, возможно, связано с недостаточной экспрессией env гена ВЛКРС.

Ohishi и соавт. [213, 259, 311] сконструировали рекомбинант BOB (L01-HA/7.5S), экспрессирующий env ген ВЛКРС под контролем промотора Р7.5. Однако этот рекомбинант слабо экспрессировал gp60 и не индуцировал образование антител к этому белку у кролика, но обладал праймирующим эффектом в отношении образования антител у привитых рекомбинантом животных.

Kumar и соавт. [180] испытывали три рекомбинанта на основе BOB: VV-BLV1, содержащий часть env гена, кодирующую только gp51 и gp30; VV-BLV2, содержащий весь ген env; YV-BLY3, содержащий весь ген env под контролем ранне-позднего промотора вируса оспы птиц. Все рекомбинанты экс-прессировали gp51 в культуре клеток, однако только два последних индуцировали этот антиген на поверхности зараженных клеток, как и образование антител к gp51 у привитых кроликов.

Рекомбинанты, полученные Portetelle и соавт. [187, 205] на основе ВОВ, отличающиеся штаммом вируса-вектора (штамм Копенгаген с делециями в tk и на генах, экспрессирующне к gp51 или gp51 и gp30 при двукратной инокуляции овцам вызывали образование нейтрализующих антител и защищали животных от BJIKPC-инфекции.

Таким образом, была показана возможность создания живой рекомби-нантной вакцины против ЛКРС на основе вируса осповакцины, но для более убедительных данных необходимы дальнейшие исследования.

Создание и испытание живых аттенуированных вакцин также представляет определенный интерес. В работе Willems и соавт. [105], Kerkhofs и соавт. [169], Reichert и соавт. [271] была показана принципиальная возможность использования рекомбинантного клона pBLVDX, сконструированного путем удаления фрагмента BamHI-Xbal, содержащего гены R3 и G4 в диком провирус-ном клоне pBLV344. При введении препарата овцам внутрикожно было определено, что данный препарат обладает защитным эффектом, однако для дальнейшего подтверждения полученного результата необходимо проведение дальнейших экспериментов на телятах, являющихся естественным хозяином вируса.

Таким образом, можно сделать заключение, что инактивированные цель-новирионные препараты на сегодняшний день представляют собой наиболее законченные разработки, обладающие высокой иммуногенностью, защитным действием. Нам представляется актуальным дальнейшие испытания разработанных нами препаратов в широкомасштабных опытах с перспективой дальнейшего использования в практических целях.

Своевременное выявление и удаление из стада инфицированных ВЛКРС животных является основным условием ликвидации ЛКРС.

Безусловно, использование относительно недорогих серологических методов диагностики (РИД, ИФА) позволяет выявлять ВЛКРС-инфекцию. Однако, из-за невысокой чувствительности этих методов часть инфицированных животных, особенно ранних стадиях инфекции, остается невыявленной. Использование молекулярно-биологических методов диагностики (с использованием ДНК-зонда, ПЦР) позволяет выявить большее количество инфицированных животных. Так в сравнительных исследованиях было показано, что методы молекулярной биологии обладают чувствительностью на 30% превосходящей метод серологического анализа - РИД и на 25% - ИФА.

В нашей стране до настоящего времени в практике ветеринарии используется только РИД. Разработка молекулярно-биологических диагностических тестов (ДНК-зонд, ПЦР) заканчивалась на стадии лабораторных экспериментов без проведения сравнительных полевых испытаний [80].

Нами был разработан и оптимизирован метод диагностики ВЛКРС-инфекции с помощью ПЦР, позволяющий определить ДНК-провирус ВЛКРС в инфицированных В-лимфоцитах крови. Высокие показатели созданной в дальнейшем тест-системы ПЦР-диагностики ВЛКРС-инфекции были продемонстрированы в межведомственных испытаниях, проведенных на базе института вирусологии им. Д.И.Ивановского. В сравнительных полевых испытаниях, проведенных на базах института вирусологии РАМН и института общей генетики РАН нами было показано, что ПЦР-диагностика позволит выявить на 30% больше инфицированных коров, чем РИД.

Таким образом, использование метода ПЦР в практике ветеринарии необходимо для определения ранних стадий инфекции и дальнейшего своевременного ее искоренения с целью повышения эффективности борьбы с болезнью.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Мальцева, Надежда Анатольевна, 2002 год

1. Альтштейн А.Д., Валихов А.Ф. Живая рекомбинантная вакцина против бычьего лейкоза на основе вируса осповакцины: современное состояние и перспективы / Биотехнология. 1992. - №6. - С.12 - 18;

2. Анализ гематологических и патоморфологических исследований при гемо-бластозах / Бусол В.А., Ярчук Б.М., Заярнюк В.П, и др. // Ветеринария 1991. -Т.6. - С.28 - 29;

3. Анализ антигенных компонентов вируса лейкоза крупного рогатого скота / Макарова Л.А., Валихов А.Ф., Иванова Л.А., Васин A.B. // Труды ВИЭВ. 1981. -Т.54.-С.91 -95;

4. Белов А.Д., Рогожина Л.В., Сноз Г.В. О патогенезе лейкозов крупного рогатого скота / Ветеринария 1997. - Т.2. - С.16 - 20;

5. Биологические свойства молока и его роль в распространении возбудителя лейкоза крупного рогатого скота / Снежков Н.И., Гулюкин М.И., Бурба Л.Г., Васин A.B. // Ветеринария 1991. - Т. 11. - С.ЗО - 34;

6. Биохимическая и биологическая характеристика онкорнавирусов типа С, изолированных от больного лейкозом крупного рогатого скота / Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Ложа В.П., и др. // Вирусы рака и лейкоза., М. 1974. - С.92 - 99;

7. Бутенко З.Н., Пащенко С.Н., Карлова А.П. Выявление экспрессии генома вируса лейкоза крупного рогатого скота // Докл. АН УССР. 1982. - Б7. - С.62 -64;

8. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Ложа В.П., и др. // Рига., Зинатне. 1982;

9. Voevodin A.F, Lapin В.А. An improved immunodiffusion test for antibodies to bovine leukemia virus antigens // Vet.Microbiol. 1980. - V.5. - P. 195 - 204;

10. Выделение вируса бычьего лейкоза из продуцирующих культур клеток и изучение стабильности вирионов / Ложа В.П., Гринберг Г.И., Мелдрайс Я.А. и др. // В кн.: Репликация и биологические свойства онкорнавирусов. Рига. -1979. - С.60 - 73;

11. Выделение лейковируса из линии клеток лимфатического узла коровы с хроническим лимфолейкозом и изучение его физико химических свойств / Жданов В.М., Парфанович М.И., Ершов Ф.И. и др. // В сб.: Вирусы рака и лейкоза. - 1974. - С.37 - 39;

12. Выявление вирусспецифического белка вируса лейкоза крупного рогатого скота методом конкурентного радиоиммунологического анализа/ Кукайн P.A., Ложа В.П., Нагаева Л.И. и др. // В сб.: Вирусы рака и лейкоза. 1980. - С.118 -120;

13. Галеев Р.Ф. Иммунный ответ у овец в РИД и РДСК при экспериментальном инфицировании ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ. 1983. - Т.59. - С.64 - 66;

14. Гулюкин М.И., Бурба Л.Г., Иванова Л.А. Результаты серологических и мор-фофункциональных исследований крови телят от инфицированных вирусом лейкоза и больных лифолейкозом матерей // Ветеринария. 1985. - №11. - С.32 -38;

15. Детекция нуклеиновых последовательностей БЛВ в клетках тканей КРС / Цибиногин В.В., Чапенко C.B., Нагаева Л.И. и др. // Изв.АН Латв.ССР 1982. -№7.-С.104- 109;

16. Еремин В.Ф. Структурная организация и внутривирионные взаимодействия белков вируса лейкоза крупного рогатого скота / Экспериментальная онкология 1989.-Т11.-С. 3-9;

17. Иванова JI.A. Разработка и испытание метода иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Авт. реф. диссерт. канд. биолог, наук. Москва.- 2000. 21 С.;

18. Иванова Л.А. Выявление иммунного ответа на вирус лейкоза крупного рогатого скота иммуноферментным методом // В сб.: Актуальные проблемы ветеринарии в промышленном животноводстве. Москва. 1989. - С.99 - 100;

19. Иванова Л.А., Гулюкин М.И. Антителообразование на ранних стадиях развития ретровирусной инфекции // Мат. Всесоюзн. Конфер. Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. Ташкент. 1984. - С.52 - 53;

20. Иванова Л.А. Разработка иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Бюллетень ВИЭВ. 1996. - В.77. - С.71;

21. Иванова Л.А. Опыт применения иммуноферметного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза на заключительном этапе оздоровления // Труды ВИЭВ. 1999. - Т.72. - С.202 - 209;

22. Иммуногенность рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего оболочечный гликопротеид вируса бычьего лейкоза / Валихов А.Ф., Кузьмичев B.C., Иванова Л.А. и др. // Труды ВИЭВ. 1991. - Т.70. - С.89 - 97;

23. Immunogenecity of vaccinia vims (VV) recombinants expressing Bovine Leukemia virus (BLV) env gene, in rabbits and calves / Valikhov A., Makarova L., Ivanova L., et al. // 4 th International Congress of Veterinary Virology, Edinburg, 24 -27 Aug. 1997;

24. Иммунологическая и иммунохимическая диагностика лейкозов крупного рогатого скота / Коромыслов Г.Ф., Бурба Л.Г., Симонян Г.А. и др. // Труды ВИЭВ. 1983. - Т.59. - С.20 - 23;

25. Иммуноферментный метод определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота / Шишков В.П., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф. и др. // Бюллетень ВИЭВ. 1985. - В.58. - С.23 - 25;

26. Isolation and characterization of oncornavirus from primary cultures of tissues from cattle with leukemia / Parphanovich M.I., Kazak N.F., Baranov A.E., et al. // Arch. Virol. 1977. - V.53. - P.9 -23;

27. Использование реакции иммунодиффузии для оценки состояния стад крупного рогатого скота по лейкозу / Смирнов П.Н., Бурба Л.Г., Левашев А.Т., Валихов А.Ф. // Научно технический бюллетень СО ВАСХНИЛ. - 1983. - №37. -С.3-11;

28. Исследование возможности иммунопрофилактики ретровирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота при использовании ретровируса, инактиви-рованного аминометилольными соединениями / Парфанович М.И., Поверенный

29. A.M., Нымм Э.М. и др. // В сб.: Вирусы рака и лейкоза. 1980. - С.122 - 124;

30. Испытание живой рекомбинантной поксвирусной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота в производственных условиях / Валихов А.Ф., Аль-штейн А.Д., Васин A.B. и др. // Бюл.ВИЭВ. 1996. - вып.77. - С.48;

31. Исследование на лейкоз в РИД и ИФА секрета молочной железы коров / Щекотурова Т.В., Романова В.А., Щекотуров A.B., Иванова JI.A. // Труды ВИ-ЭВ. 1999. - Т.72. - С.213 - 214;

32. Касьян E.H. Характеристика некоторых биологических особенностей ретро-вирусов крупного рогатого скота (BLY, BIV) при использовании экспериментальных моделей // Автореф. диссерт. канд. ветерин. наук. Москва. 1996. -19с.;

33. Касьян E.H. Изучение некоторых параметров течения BJIKPC-инфекции у кроликов // В сб.: Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных, Моск.Госуд. Акад. вет. мед. и биотехн. 1994. - С.143 - 147;

34. К вопросу о возможности иммунопрофилактики лейкоза крупного рогатого скота / Жданов В.М., Парфанович М.И., Симоварт Ю.А. и др. // В сб.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Тарту. 1981.- Т.2. - С.З - 9;

35. Классификация ретровирусов и характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота / Орлянкин Б.Г., Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Кунаков К.Ю. // Ветеринария 2000. - Т.2. - С. 17 - 19;

36. Колчин П.Д., Симонян Г.А. Внутриутробная передача вируса лейкоза крупного рогатого скота / Ветеринария 1994. - Т.8. - С.25 - 27;

37. Колчин П.Д., Симонян Г.А. Эффективность противолейкозных мероприятий с использованием серологического метода диагностики // В сб.: Современные методы профилактики и оздоровительные мероприятия по лейкозу крупного рогатого скота. Тарту. 1987. - С. 14;

38. Комплекс вирусологических, молекулярно биологических и иммунологических методов для диагностики ретровирусной инфекции при лейкозе крупного рогатого скота / Парфанович М.И., Коломиец Н.Д., Лазаренко A.A., Жданов

39. B.М. // Тез. докл. 5-й Всесоюзной конф. Казань 1980. - С.51;

40. Краснопёрое В.А. Эффективность системы оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота в условиях Свердловской области // Авто-реф. дис.канд. ветер, наук., Москва 1999. - 24 С;

41. Кузнецов А.П., Маринин Е.А., Семина JI.K. Влияние некоторых факторов на интенсивность перезаражения коров лейкозом / Ветеринария 2000. - Т.7. - С. 16-18;

42. Кукайн P.A., Нагаева ЛИ. Продукция бычьего лейкозного вируса в клетках культур различных тканей больного лейкозом крупного рогатого скота // В сб.: Вирусы рака и лейкоза. 1978. - С.66 - 67;

43. Кукайн P.A., Муцениеце А.Я. Этиология, диагностика и эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота // В кн.: Рига., Зинатне. 1982;

44. Кукайн P.A., Нагаева Л.И. Теоретические основы иммунопрофилактики лейкоза крупного рогатого скота // В сб.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Тарту. 1983. - Т.З. - С. 17 - 18;

45. Кунаков A.A., Абакин С.С. ВЛКРС инфекция крупного и мелкого рогатого скота в хозяйствах ставропольского края / Ветеринария - 1993. - Т.З. - С.25 - 26;

46. Лабораторная диагностика респираторных болезней телят ДНК-зондами / Русанова Л.П., Баранов В.И., Лысухо A.C., и др. // Ветеринария 1992. - Т.2.1. C.24 25;

47. Лазаренко A.A. Иммуногенность и защитные свойства инактивированного вируса лейкоза крупного рогатого скота // Дисс. канд. биол. наук. М. 1984. -С.1 - 172;

48. Листкова H.A. Биологические свойства рекомбинантного вируса осповакци-ны, экспрессирующего ген env вируса лейкоза крупного рогатого скота // Автореф. диссерт. канд. биол. наук. Москва. 2000. - 20 С.;

49. Листкова H.A., Васин A.B. Экспериментальное изучение на телятах пато-генности рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего ген env вируса лейкоза крупного рогатого скота // В сб.: Болезни сельскохозяйственных животных, Владимир. 1995. - С.202;

50. Макарова Л.А., Валихов A.B., Шишков В.П. Антигенный состав вируса лейкоза крупного рогатого скота, сравнительная оценка диагностических препаратов / Труды ВИЭВ. 1983. -Т.59. - С.11-15;

51. Мандыгра Н.С. Эпизоотологическое значение прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Ветеринария. 2000. - Т.6. - С. 15 - 17;

52. Морфологическая характеристика и иммунологические свойства онкорнави-руса типа С КРС / Надточей Т.А., Валихов А.Ф., Бурба Л.Г., Горбатов В.А. // Докл. ВАСХНИЛ.- 1976. №5. - С.31 - 32;

53. Научные основы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота / Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Замараева Н.В. и др. // Труды ВИЭВ. 1999. -Т.72. - С.38 - 47;

54. Овчинникова C.E., Царев Ю.П. Серологическая диагностика лейкоза крупного рогатого скота на примере хозяйств Красноярского края // В сб.: Профилактика и лечение болезней крупного рогатого скота. Новосибирск. 1984. -С.140-141;

55. Петракова Н.С. Некоторые результаты комплексных исследований при диагностике гемобластозов крупного рогатого скота. // Бюл. ВНИИЭВ. 1983. -№50. -С.18-20;

56. Применение иммуноферментного метода в целях диагностики ретровирус-ной инфекции при лейкозе крупного рогатого скота / Хлюстов C.B., Коломиец Н.Д., Коломиец А.Г. и др. // В сб.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Тарту. 1981. - С.25 - 31;

57. Развитие гуморального иммунного ответа на вакцинацию рекомбинантной вакциной и контрольное заражение овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Иванова Л.А., Макарова Л.А., Васин A.B. и др. // Труды ВИЭВ. 1999. -Т.72. - С.181 - 191;

58. Симонян Г.А., Горбатов В.А., Петровский Т.С. Цитоморфологическая диагностика гемобластозов крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ. 1983. - Т.59. -С.35-43;

59. Симонян Г.А. Методы диагностики в борьбе с лейкозами крупного рогатого скота // В сб.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии. 1983. -Т.З. - С.88 - 95;

60. Смирнов Ю.П. Значение серологических исследований в системе противолейкозных мероприятий / Ветеринария -1991. Т.8. - С.28 - 29;

61. Смирнов Ю.П. Эффективность противолейкозных мероприятий в зависимости от кратности и интервалов серологических исследований / Ветеринария -1991. Т.П. - С.29 - 30;

62. Смирнов Ю.П. Эффективность различных методов оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук 1999 - Т. 2. - С. 69 -71;

63. Сравнение нескольких методов выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота / Гриненко А.Д., Тарасишин JI.A., Валихов А.Ф. и др. // Вопр. вирусол. 1980. - №3. - С.281 - 284;

64. Тест система для выявления ВЛКРС полимеразной цепной реакцией / Бу-сол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. // Ветеринария -1999. -Т.6. -С. 27-30;

65. The possibility of specific protection against bovine leukemia virus infection andbovine leukemia with inactivated BLV / Parphanovich M.I., Zhdanov V.M., Lazarenko A.A., et al. // Brit. Med. J. 1983. - V.139. - P.137 - 146;

66. Федорченко A.H. Антителообразование у больного лейкозом крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ. 1983. - Т.59. - С.73 - 78;

67. Физико -химическая характеристика вирусных частиц, полученных из ткани эмбрионов коров / Кукайн P.A., Муравска М.Ф., Конычева В.В. и др. // В сб.: Взаимодействие вирусов и клетки. Рига.- 1977. С. 16 - 21;

68. Формирование иммунитета к Б JIB у крупного рогатого скота и овец в процессе иммунизации разными препаратами / Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Крикун В .А. и др. // Труды ВИЭВ. 1983. - Т.59. - С.52 - 56;

69. Шишков В.П., Бурба Л.Г., Иванова Л.А. Методические рекомендации по определению антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом имму-ноферментного анализа // Москва. 1983. - 10 С;

70. Шукель A.A. Сравнительная характеристика иммунологических методов диагностики инфекции ВЛКРС в системе противолейкозных мероприятий // Ато-реф. диссерт. канд. ветер, наук. Барнаул. 1998. - 26С.;

71. Шукель A.A. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Мирнинском улусе Республика Саха (Якутия) // В сб. научн. тр. РАСХН. Сиб. отдел. ИЭВСиДВ, Новосибирск. 1996. - С.42 - 45;

72. Экспериментальная ВЛКРС-инфекция и лимфолейкоз у овец / Васин A.B., Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Замараева Н.В. // Труды ВИЭВ. 1999. - Т.72. -С.224 - 231 ;

73. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной диагностики лейкоза

74. КРС / Гулюкин М.И., Дун Е.А., Замараева Н.В. и др. // Вестник Российскойакадемии сельскохозяйственных наук 2000. - Т.З. - С.60-62;

75. Этиология и иммунодиагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота /

76. Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Чапенко C.B. и др. // Рига. Зинатне. 1979;

77. A field evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukemia virus proviral DNA in cattle / Eaves F.W., Molloy J.B., Dimmock C.K., Eaves L.E. II Vet Microbiol. 1994. - V.3-4. - P.313 - 321;

78. Agar gel immunodiffusion test for the detection of bovine leukemia virus antibodies: lack of trans Atlantic standardization / Simard C., Richardson S., P. Dixon., J. Komal // Can. J. Vet. Res. - 2000. -V. 64. - P. 96 - 100;

79. Alfonso R. Almansa J.E., Barrera J.C. Serological prevalence and evaluation of the risk factors of bovine enzootic leukosis in the Bogota savannah and the Ubate and Chiquinquira Valleys, Colombia // Rev. Sci Tech. 1998. - V.3. - P.723 - 732;

80. An effective peptide vaccine to eliminate bovine leukemia virus (BLV) infected cells in carrier sheep / Kabeya H., Ohashi K., Ohishi K., et al. // Vaccine. 1996. -V.12. -P.1118 -1122;

81. An enzyme linked immunosorbent assay for detection of bovine leukemia virus p24 antibody in cattle / Molloy J.B., Walker P.J., Baldock F.C., et al. // J. Virol. Methods. - 1990. - V.28. - P.47 - 57;

82. An ether sensitive antigen associated with bovine leukemia virus infection / Onuma M., Olson C., Baumgartener., et al. // J Natl Cancer Inst. - 1975. - V.56. -P.1155 - 1158;

83. Antibody production against BLV p24 in calves following application of cellextracts from tumorous lymph nodes of cattle with enzootic bovine leukosis / Ristau E., Starick E., Burkardt H„ Wittmann W. // Acta Virol. 1988. - V.32. - P.104 - 108;

84. Antigenic variants of bovine leukemia virus (BLV) are defined by amino acid substitutions in the NH2 part of the envelope glycoprotein gp51 / Portetelle D., Couez D., Bruck C, et al. // Virology. 1989. - V.169. - P.27 - 33;

85. A peptide-based human T cell leukemia virus type 1 vaccine containing T and B cell epitopes that induces high titers of neutralizing antibodies / Baba E., Nakamura M., Ohkuma K., et al. // J Immunol. 1995. - V.l. -P.399 - 412;

86. Associations between farm management practices, productivity, and bovine leukemia virus infection in Ontario dairy herds / Sargeant J.M., Kelton D.F., Martin S.W., Mann E.D. // Prev. Vet. Med. 1997. - V.3-4. -211-221;

87. Attenuation of bovine leukemia virus by deletion of R3 and G4 open reading frames / Willems L., Kerkhofs P., Dequiedt F., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994.-V.91.-P.11532- 11536;

88. Beier D., Blankenstein P., Fechner H. Possibilities and limitations for use of the polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) infection in cattle // DTW Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1998. - V.ll. -P.408 -412;

89. Belak S., Ballagi-Pordany A. Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology // Vet. Res. Commun. 1993. - V.l7. - P.55 -72;

90. Berneco D., Lewin H.A. Genetic aspects of bovine leukemia virus infection and disease progression//Anim. Genet. 1989. - V.20. - P.337 - 339;

91. Blood from bovine leukaemia virus infected cattle: antigen production correlated with infectivity / Miller L.D., Miller J.M., Van der Maaten M.J., Schmerr M.J.F. //Am.J.Vet. Res. - 1985. - V.46. - P.808-810;

92. Bonilla J.A. Occurrence of bovine viral leukemia in Costa Rica and immunochemical characterization of the most abundant viral protein (p24) // MSc Thesis, University of Costa Rica. 1985;

93. Both wild-type and strongly attenuated bovine leukemia viruses protect peripheral blood mononuclear cells from apoptosis / Dequiedt F., Hanon E., Kerhofs P., et al. // J. Virol. 1997. - V.71. - P.630 - 639;

94. Bovine leukemia virus as a model for the human T-cell leukemia viruses / Willems L., Burny A., Dangoisse O., et al. // Cur. Top. Virol. 2000. - V.3. - 36 - 38;

95. Bovine leukemia virus induces CD5-B cell lymphoma in sheep despite temporarity increasing CD5+ B cells in asymptomatic stage / Murakami K., Okada K., Ikawa Y., Aida Y. // Virology. 1994. - V.l. - P.458 - 465;

96. Bovine leukemia virus / Kettmann R., Burny A., Callebaut I., et al. // In: The Reroviridae. 1994. - V.3. - P.39 - 81;

97. Bovine leukemia virus (BLV) a structural model based on chemical cross linking studies / Uckert W., Wunderlich V., Ghysdael J., et al. // Virology. - 1984. -V.133. - P.386 - 392;

98. Bovine leukemia virus gag particle assembly in insect cells: formation of chimeric particles by domain-switched Leukemia/Lentivirus gag polyprotein / Kakker N.K., Mikhailov M.V., Nermut M.V., et al. // Virology. 1999. - V.265. -P.308 - 318;

99. Bovine leukemia virus specific antibodies among French cattle. II. Radioimmunoassay with the major structural protein (BLV p24) / Levy D., Deshayes L, Parodi A.L., et al. / Int. J. Cancer. 1977. - V.20. - P.543 - 550;

100. Bovine leukemia virus protease: purification, chemical analysis and in vitroprocessing of gag procesor polyprotein / Yoshinaka Y., Katon I., Copeland T.D., et al. I IJ Yirol. 1986. - V.57. - P.826- 832;

101. Bovine leukemia virus a versatile agent with various effect in various animal species / Burny A., Bruck C., Cleuter Y., et al. // Cancer Res. 1985. - V.45. - P.4578 - 4582;

102. Bovine leukemia virus related antigens in lymphocyte cultures infected with AIDS-associated viruses / Thiry L., Sprecher-Gildberger S., Jacquemin P., et al. // Science. - 1984. - V.227. - P. 1482 - 1484;

103. Bovine leukemia virus (BLV): prevalence in the Cuenca Lechera Mar y Sierras from 1994 to 1995 / Ghexxi P.C., Dolcini G.L., Gutierrez S.E., et al. // Rev. Argent Microbiol. 1997. - V.3. - P. 137 - 146;

104. Bovine leukemia virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves / Klintevall K., Ballagi-Pordany A., Naslund K., Belak S. // Vet Microbiol. 1994. - V.2-3. - P. 191 - 204;

105. Bovine leukemia virus (BLV) specific RNA in infected cells / Astier T., Mamoun R., Guillemain B., et al. // Ann Rech Vet. 1978. - V.4. - P.643 - 649;

106. Bovine leukemia virus, a distinguished member of the human T-lymphotropic virus family / Burny A., Bruck C., Cleuter Y., et al. // Princess Takamatsu Symp. -1984.-V.15.-P.219-227;

107. Bovine lymphosarcoma: expression of BLV-related proteins in cultured cells / Mamoun R.Z., Astier T., Guillemain B., Duplan J.F. // J Gen Virol. 1983. - Pt.9. -P.1895 -1905;

108. Brunner M.A., Lein D.H., Dubovi E.J. Experiences with the New York state bovine leukosis virus eradication and certification program // Vet. Clin. North. Am. Food Anim. Pract. 1997. - V.13. - P.143 - 150;

109. Buehring G.C., Kramme P.M., Schultz R.D. Evidence for bovine leukemia virus in mammary epithelial cells of infected cows // Lab. Invest. 1994. - V. 71. - P. 369 - 365;

110. Buxton B.A., Hinkle N.C., Schultz R.D. Role of insects in the transmission ofbovine leukosis virus: potential for transmission by stable flies, horn and tabanids // Am. J. Vet. Res. 1985. - V.46. - P. 123 - 126;

111. Cavrois M., Wain-Hobson S., Wattel E. Stochastic events in the amplification of HTLV-I integration sites by linker-mediated PCR // Res Virol. 1995. - V.3. -P. 179 -184;

112. CD4 T lymphocyte activation in BLV induced persistent B lymphocytosis in cattle / Stone D.M., Norton L.K., Chambers J.C., Meek W.J. // Clin Immunol.- 2000. - V.3. -P.280-288;

113. Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of bovine leukemia virus / Demirhan I., Altanerova V., Chandra A., et al. // Anticancer Res. 1996. -V.5A.-P.2501 -2505;

114. Cockerell G.L., Rovnak J. The correlation between the direct and indirect detection of bovine leukemia virus infection in cattle // Leuk. Res. 1988. - V.12. -P.465 - 469;

115. Comparison of serum, milk and urine as samples in an enzyme immunoassay for bovine leukaemia virus infection / Carli K.T., Batmaz H., Sen A., Minbay A. // Res. Vet Sci. 1993. - V.55. - P. 394 - 395;

116. Complete amino acid sequence of human T-cell leukemia virus structural protein pl5 / Copeland T.D., Oroszlan S., Kalyanaraman V.S., et al. // FEBS Lett. -1983.-V.2.-P.390-395;

117. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses / Sagata N., Yasunaga T., Tsuzuku-Kawamura J., et al. // Rpoc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82. - P.677 - 681;

118. Copeland T.D., Morgan M.A., Oroszlan S. Complete amino acid sequence of the nucleic acid-binding protein of bovine leukemia virus // FEBS Lett. 1983.1. V.l. -P.37-40;

119. Current status of bovine leukaemia virus (BLV) infection in Turkey / Batmaz H., Carli K.T., Kenneman E., et al. // XIX World buiatrics congress, Edinburgh, England, 8 12 July. - 1996. - .626 - 628;

120. D'Angelino J.L., Garcia M., Birgel E.H. Epidemiological study of enzootic bovine leukosis in Brazil // Trop. Anim. Health Prod. 1998. - V.l. - P.13 -15;

121. Detection of antibodies against the virus of enzootic bovine leukosis in serum and milk samples using an immunoblot / Bunger I., Khalaf H., Cripe C., Rimpler M. // DTW Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1994. - V.10. - P.402 - 405;

122. Derse D. Bovine leukemia virus transcription is controlled by a virus encoded trans - acting factor and by cis - acting response elements // J. Virol. - 1987. - V. 2462 -2471;

123. Derse D. trans acting regulation of bovine leukemia virus mRNA processing //J. Virol. - 1988.-V. 62.-P.l 115- 1119;

124. Derse D., Casey W. Two elements in the bovine leukemia virus long terminal repeat that regulate gene expression // Science. 1986. - V.231. - P. 1437 - 1440;

125. Detection by immunodiffusion and radioimmunoassay tests of antibodies to bovine leukemia virus antigens in sera of experimentally infected sheep and cattle / Mammerickx M., Portetelle D., Burny A., Leunen J. // Zbl. Vet. Med. 1980. - B27. -P.291;

126. Detection of antibodies against the core protein p24 of the bovine leukaemia virus in cattle for confirmatory serological testing / Kittelberger R., Reichel M.P., Meynell R.M., et al // J. Virol. Meth. 1999. - V.77. - P.109 - 114;

127. Detection of IgG antibody to bovine laukaemia virus in urine and serum bytwo enzyme immunoassays / Carli K.T., Sen A., Batmaz H., Kennerman E. // Let. Appl. Microb. 1999. - V.28. - P.416 - 418;

128. Detection of a novel bovine lymphotropic herpesvirus / Rovnak J., Quackenbush S.L., Reyes R.A., et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.4237 - 4242;

129. Detection of bovine leukemia virus by syncytium assay / Onuma M., Watarai S, Sonoda M., et al. // Can J Comp Med. 1980. - V.3. - P. 289 - 293;

130. Detection of proviral DNA of bovine leukemia virus in cattle by a combination of in-situ hybridization and the polymerase chain reaction / Xie B., Oyamada T., Yoshikawa H., et al. // J Comp. Pathol. 1997. - V.l. -P.87 - 96;

131. Detrimental effect of bovine leukemia virus (BLV) on the immunological state of cattle / Trainin Z., Brenner J. Meirom R., Ungar-Waron H. // Vet. Immunol. Immunopathol. 1996. - V.54. - P.293-302;

132. Devare S.G., Stephenson J.R. Biochemical and immunological characterization of the major envelope glycoprotein of bovine leukemia virus // J. Virol. 1977. -V.23. - P.443 - 447;

133. Development of persistent lymphocytosis in cattle is closely associated with DRB2 / Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Beever J.E., et al. // Immunogenetics. 1992.-V.37.-P. 64-68;

134. Diagnosis of bovine leukemia virus infection evaluation of serologic and hematologic tests by a direct infectivity detection assay / Ferrer J.F., Piper C.E., Abt D.A., Marshak R.R. // Am J Vet Res. 1977. - V.12. - P.1977 - 1981;

135. DiGiacomo R.F., Hopkins S.G. Food animal and poultry retroviruses and human health // Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 1997. - V.13. - P.177 -190;

136. Giglio C.A., Ferrer J.F. Induction of syncytia by the bovine C type leukemia virus // Cancer Res. - 1976. - V.3. -P.1056- 1067;

137. Diagnostic tests of bovine leukemia: comparison between an hematological test and the serological diagnosis / Mammerickx M., Portetelle D., Kettmann P., et al. // Eur J Cancer. 1976. - V.6. - P.433 - 439;

138. Direct detection of bovine leukaemia virus infection: practical applicability of a double polymerase chain reaction / Ballagi-Pordany A., Klintevall K., Merza M., et al. // J. Vet. Med. B. 1992. - V.39. - P.69 -77;

139. Direct use of cell lysites in PCR-based diagnosis of bovine leukemia virus infection / Fechner H., Kurg., Blankenstein P., et al. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 1996. - V. 11 - 12. - P.446 - 450;

140. Djilali S., Parodi A.L. The BLV induced leukemia - lymphosarcoma complex in sheep // Vet. Immunol. Immunophathol. - 1989. - V.22. - P.233 - 244;

141. Dolz G., Moreno E. Comparison of agar gel immunodiffusion test, enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting for the detection of BLV antibodies // J. Vet. Med. 1999. -V.B 46. - P.551 - 558;

142. Driscoll D.M., Olson C. Bovine leukemia virus-associated antigens in lymphocyte cultures // Am J Vet Res. 1977. - V. 11. - P. 1897 - 1898;

143. Effect of Brucellosis vaccination and dehorning on transmission of bovine leukemia virus in heifers on a California dairy / Lassauzet M.G., Thurmond M.C., Johnson W.D. // Can.J.Vet.Res. 1990. - V.54. - P.184-189;

144. Elicitation of bovine antibody to BLV-gp51 by BLV-vaccination / Maruyama K., Fukushima T., Mochizuki S., et al. // Leukemia. 1988. - Suppl.12. - P.216S -222S;

145. Epidemiological evaluation of a monoclonal ELISA detecting antibodies against bovine leukemia virus in serum pools / Knapen K., Kerkhofs P., Thiry E., Mammerickx M. // Epidemiol Infect. 1994. - V.3. - P.563 - 569;

146. Eradication of enzootic bovine leukosis based on the detection of the disease by the GP immunodiffusion test / Mammerickx M., Cormann A., Burny A., et al. // Ann Rech Vet. 1978. - V.4. - P.885 - 894;

147. Evaluation of alternative methods for the detection of bovine leukemia virus in cattle / Reichel M.P., Tham K.M., Barnes S., Kittelberger R. // N.Z. Vet. J. 1998. -V.46.-P.140- 146;

148. Evaluation of a bulk milk ELISA test for the classification of herd - level bovine leukemia virus status / Sargeant J.M., Kelton D.F., Martin S.W., Mann E.D. //Prev. Vet. Med. - 1997. - V.3-4. -P.223 -230;

149. Evaluation of electrophoretic immunoblotting for the detection of antibodies against the bovine leukosis virus in cattle / Kittelberger R., Laybourn B.J., Diak D.S., et al. // J. Virol. Meth. 1996. - V.61. - P.7 - 22;

150. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle / Fechner H., Kurg A., Geue L., et al. // Zentralbl. Veterinarmed. 1996. - V.10. - P.621 - 630;

151. Evaluation of radioimmunoprecipitation for the detection of bovine leukemia virus infection in domestic cattle / Devare S.G., Chander S., Samagh B.S., Stephenson J.R. // J. Immunol. 1977. - V. 119. - P.277 - 282;

152. Even transcriptionally competent proviruses are silent in bovine leukemia virus-infected sheep tumor cells / Van den Broeke A., Cleuter Y., Chen G., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85. - P.9263 - 9267;

153. Evermann J.F., Digiacomo R.F., Hopkins S.G. Bovine leukosis virus: understanding viral transmission and the methods of control // Vet. Med. 1987. -V.82. - P.1051 - 1058;

154. Evidence for bovine leukemia virus infection of peripheral blood monocytes and limited antigen expression in bovine lymphoid tissue / Heeny J.L., Valli P.J.S.,

155. Jacobs R.M., Valli V.E.0.11 Lab Investig. 1992. - V.66. - P.608 - 617;

156. Experimental transmission of bovine leukosis virus by rectal palpation / Wentink G.H., van Oirschot J.T., Pelgrim W., et al. // Vet. Rec. 1993. - V.132. -P.135-136;

157. Expression of bovine leukemia virus envelope gene by recombinant vaccinia viruses / Kumar S., Andrew M.E., Boyle D.B., et al // Virus Re. 1990. - V.2. -P.131 - 142;

158. Ferrer J.F. Bovine leukosis: natural transmission and principles of control // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1979. - V.175. - P.1281 - 1286;

159. Ferrer J.F., Stock N.D., Lin P. Detection of replicating C-type viruses in continuous cell cultures established from cows with leukemia: effect of the culture medium // J Natl Cncer Inst. 1971. - V.47. - P.613 - 621;

160. Ferrer J.F. Eradication of bovine leukemia virus infection from a high-prevalence herd, using radioimmunoassay for identification of infected animals // J Am Vet Med Assoc. 1982. - V.8. - P.890 - 893;

161. Florent G., Delgoffe J.C., Zygraich N. Detection of antibodies to bovine leukemia virus in bovine milk samples with an ELISA involving monoclonal antibodies //Vet. Microb. 1988. - V. - 18. - P.89 - 93;

162. Franchini G., Streicher H. Human T-cell leukemia virus // Baillieres Clin Haematol. 1995. - V.l. - P.131 - 148;

163. Frenzel B., Kaaden O.R., Muussgay M. Purification of a glycoprotein from bovine leukemia virus (BLV) // Z Naturforsch. 1977. - V.3-4. - P.301 - 304;

164. Fusion of bovine leukemia virus with target cells monitored by R18 fluorescence and PCR assays / Zarkik S., Defrise Quertain F., Portetelle D., et al. // J. Virol. - 1997.-V.l.-P. 738-740;

165. Gaynor E.M., Mirsky M.L., Lewin H.A. Use of flow cytometry and RT-PCR for detecting gene expression by single cells // Biotechniques. 1996. - V.2. - P.286 -291;

166. Gene inoculation generates immune responses against HIV-I / Wang R., Ugen

167. K.E., Srikantan V., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90. - P.4156 - 4160;

168. Genetic determinants of bovine leukemia virus pathogenesis / Willems L., Burny A., Collete D., et al. // AIDS Res. Hum Retrovir. 2000. - V.16. - P. 1787 -1795;

169. Ghysdael J., Hubert E., Cleuter Y. Biosynthesis of bovine leukemia virus (BLV) major internal protein (p24) in infected cells and X.laevis oocytes microinjected with BLV 60 70S RNA proceedings. // Arch Int Physiol Biochim . -1977.-V.5.-P.978-979;

170. Ghysdael J., Kettmann R., Burny A. Translation of bovine leukemia virus virion RNAs in heterologous protein-synthesizing systems // J Virol. 1979. - V.3. -P. 1087- 1098;

171. Graves D.C., Jones L.V. Early syncytium formation by bovine leukemia virus //J Virol. 1981.-V.3.-P.1055- 1063;

172. Graves D.C., Ferrer J.F. In vitro transmission and propagation of the bovine leukemia virus in monolayer cell cultures // Cancer Res. 1976. - V.llPt. - P.4152 -4159;

173. Gupta P., Ferrer J.F. Detection of a precursor-like protein of bovine leukemia virus structural polypeptides in purified virions // J Gen Virol.- 1980. V.2. - P.311 - 322;

174. Gupta P., Ferrer J.F. A critical comparison of the virus neutralizaition, radioimmunoprecipitaion and immunodiffusion tests for the serological diagnosis of BLV infection // Ann Rach Vet. 1978. - V.4. - P.683 - 688;

175. Haas L., Divers T., Casey J.W. Bovine leukemia virus gene expression in vivo // J Virol. 1992. - V.66. - P.6223 - 6225;

176. Hoff-Jorgensen R. An international comparison of different laboratory tests for the diagnosis of bovine leukosis: suggestions for international standardization // Vet Immunol Immunophatol. 1989. - V.22. - P.293 - 297;

177. Hopkins S.G., DiGiacomo R.F. Natural transmission of bovine leukemia virus in dairy and beef cattle // Vet. Clin. North. Am. Food Anim. Rpact. 1997. - V.13.1. P.107- 128;

178. Hruskova-Heidingsfeldova O. Proteins of bovine leukemia virus and human T-cell leukemia viruses // Folia Biol. 1995. - V.5. -P.201 - 212;

179. Humoral antibody response to bovine leukemia virus infection in cattle and sheep / Bex F., Brack C., Mammerickx M., et al. // Cancer Res. 1979. - V.39. -P.1118- 1123;

180. Identification and some biochemical properties of the major Xbl gene product of bovine leukemia virus / Sagata N., Tzuzuki-Kawamura J., Nagayoshi-Aida M., et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. - V.82. - P.7879 - 7883;

181. Identification of alternatively spliced mRNAs encoding potential new regulatory proteins in cattle infected with bovine leukemia virus / Alexandersen S., Carpenter S., Christensen J., et al. // J. Virol. 1993. - V.67. - P.39 - 52;

182. Identification of functional sites on bovine leukemia virus envelope glycoproteins using structural and immunological data / Callebaut I., Portetelle D., Burny A., Mornon J.P. // Eur J Biochem. 1994. - V.2. - P.405 - 414;

183. Immunogenicity of a recombinant vaccinia virus expressing envelope a glycoprotein of bovine leukaemia virus / Ohishi K., Marayama T., Shida H., et al. // Vaccine. 1988. - V.6. - P.428 - 432;

184. Immunopathologic study and characterization of the phenotype of transformed cells in sheep with bovine leukemia virus-induced lymphosarcoma / Murakami K., Aida Y., Kageyama R., et al. // Am J Vet Res. 1994. - V. 1. - P.72 - 80;

185. Importance of primer selection in the application of PCR technology to the diagnosis of bovine leukemia virus / Marsolais G., Dubuc R., Bergeron J., et al. // J Vet Diagn Invest. 1994. - V.3. - P.297 - 301;

186. In animals infected by bovine leukemia virus (BLV) antibodies to envelopeglycoprotein gp51 are directed against the carbohydrate moiety / Portetelle D., Bruck C., Mammerickx M., Burny A. // Virology. 1980. - V.105. - P.223 - 233;

187. Infectivity of bovine leukemia virus infected cattle: An ELISA for detecting antigens expressed in in vitro cultured lymphocytes / Cowley J.A., Molloy J.B., Dimmock C.K.,et al. // Vet. Microbiol. 1992. - V.30. - P. 137 - 150;

188. Infection of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in water buffalo and cattle populations in Pakistan / Meas S., Seto J., Sugimoto C,, et al. // J. Vet. Med. Sci. 2000. - V.62. - P.329 - 331;

189. Induction of bovine leukaemia virus Env-specific Thl type immunity in mice by vaccination with short synthesized peptide-liposome / Ohishi K., Kabeya H., Amanuma H., Onuma M. // Vaccine. 1996. - V.14. - P.1143 - 1148;

190. Induction of C-type virus in cell lines derived from calf form bovine lymphosarcoma / Onuma M., Okada K., Yamazaki Y., et al. // Microbiol Immunol. -1978.-V.11.-P.683-691;

191. Infection and pathogenicity of chemeric simian human immunodeficiency viruses in macaques: determinants of high virus loads and CD4 cell killing / Shibata R., Maldarelli F., Siemon C., et al. // J. Infect. Dis. - 1997. - V.176. - P.362 - 373;

192. In vitro infection of cells of the monocytic/macrophage lineage with bovine leukaemia virus / Domenech A., Goyache A., Llames L., et al. / J. Gen. Virol. 2000. -V.81.-P.109-118;

193. In vitro and in vivo oncogenic potential of bovine leukemia virus G4 protein / Kerkhofs P., Heremans H., Burny A., et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.2554 - 2559;

194. In vivo infection of sheep by bovine leukemia virus mutants / Willems L., Kettmann F., Dequiedt D., et al. // J Virol. 1993. - V.67. - P.4078 - 4085;

195. In vivo leukocyte tropism of bovine leukemia virus in sheep and cattle /

196. Schwartz I., Bensaid A., Polack B., et al. // J Virol. 1994. - V.7. - P.4589 - 4596;

197. Isolation of a pi5 polypeptide from bovine leukemia virus and detection of specific antibodies in leukemic cattle / Kaaden O.R., Frenzel B., Dietzschold B., et al. //Virology. 1977.- V.2. -P.501 - 509;

198. Jensen W.A., Rovnak J., Cockerell G.L. In vivo transcription of the bovine leukemia virus tax/rex region in normal and neoplastic lymphocytes of cattle and sheep // J. Virol. 1991. - V.65. - P.2484 - 2490;

199. Johnson R., Kaneene J.B. Bovine leukaemia virus and enzootic bovine leukosis / Vet. Bull. 1992. - V.62. - P.287 - 312;

200. Kaaden O.R., Neth R., Frenzel B. Sequential studies of bovine leukemia virus antibody development in dairy cattle over a four year period // Ann Rech Vet. -1978.-V.4.-P.771 -776;

201. Kashmiri S.V.S., Mendi R., Ferrer J.F. Detection, purification and characterisation of two species of covalently closed circular proviral DNA molecules of bovine leukemia virus//J. Virol. 1983. - V.45. - P. 1172 - 1176;

202. Kiss Toth E., Unk I. A downstream regulatory element activates the bovine leukemia virus promoter // Biochem Biophys Res Commun. - 1994. - V.3. - P. 1553 - 1561;

203. Kramme P.M., Thomas C.B., Schultz R.D. Temporal stability of the virus load of cattle infected with bovine leukemia virus // Vet Immunol Immunopathol. 1995. -V.3-4.-P.347-354;

204. Lagarias D.M., Radke K. Transcriptional activation of bovine leukemia virus in blood cells from experimentally infected, asymptomatic sheep with latent infection // J Virol. 1989. - V.63. - P.2099 - 2107;

205. Lewin H.A., Russell G.C., Glass E.J. Comparative organization and function ofthe major histocompatibility complex of domesticated cattle // Immunol Rev. 1999. -Y.167.-P.145 - 158;

206. Lewin H.A., Bernoco D., Evidence for BoLA-linked resistance and susceptibility to subclinical progression of bovine leukemia virus infection // Anim. Genet. 1986. - V.17. - P.187 - 207;

207. Long term protection against bovine leukemia virus replication in cattle and sheep / Kerkhofs P., Gatot J-S., Knapen K., et al. // J. Gen. Virol. - 2000. - V.81. -P.957-963;

208. Long term protection against SIV-induced disease in macaques vaccinated with a live attenuated HIV-2 vaccine / Putkonen P., Walther L., Zhang Y.J., et al. // Nature Med. - 1995. - V.l. - P.914 - 918;

209. Lucas M.H. Enzootic bovine leukosis // In: Bovine Medicine, Blackwell Sci. Pub., London. 1992. - P.530 - 537;

210. Mammerickx M., Portetelle D., Burny A. Experimental crosstransmission of bovine leukemia virus (BLV) between several animal species // Zenralblatt Veterinarmed. 1981. - V.28. - P.69 - 81;

211. Mamoun R.Z., Astier T., Guillemain B. Establishment and propagation of a bovine leukaemia virus producing cell line derived from the leukocyte of a leukaemic cow // J Gen Virol. - 1981. - Pt.2. - P.357 -365;

212. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. /Molecular cloning. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Labor. 1982. - P.480.

213. McDonald H.C., Graves D.C., Ferrer J.F. Isolation and characterization of an antigen of the bovine C-type virus // Cancer Res. 1976. - V.4. - P.1251 - 1257;

214. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus infected Holstein cattle with persistent lymphocytosis / Da Y., Shanks R.D., Steward J.A., Lewin H.A. //

215. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993. V.90. - P. 6538 - 6541;

216. Miller J.M. Bovine leukemia virus vaccine // In: Animal Models of Retrovirus Infect, and their Relationship to AIDS. 1986. - P.421 - 430;

217. Miller J.M., Olson C. Precipitating antibody to an internal antigen of the C-type virus associated with bovine lymphosarcoma // J Natl Cancer Inst. 1972. -Y.49. -P.1459- 1462;

218. Miller J.M., Van Der Maaten M.J. Use of glycoprotein antigen in the immunodiffusion test for bovine leukemia virus antibodies // Eur. J. Cancer. 1977. -V.13.-P.1369- 1375;

219. Miller J.M. Bovine lymphosarcoma // Mod Vet Pract. 1980. - V.7. - P.588 -591;

220. Miller J.M., Van der Maaten M.J. Evaluation of an inactivated bovine leukemia virus preparation as an immunogen in cattle // Ann Rech Vet. 1978. -V.4.-P.871 -877;

221. Miller J.M., Van der Maaten M.J., Schmerr M.J. Vaccination of cattle with binary ethylenimine-treated bovine leukemia virus // Am J Vet Res. 1983. - V.l. -P.64 - 67;

222. Miller J.M., Schmerr M.J.F., Van Der Maaten M.J. Comparison of four serological tests for the detection of antibodies to bovine leukemia virus // Am. J. Vet. Res. 1981. - V.42. - P.5 - 8;

223. Misdorp W. Veterinary cancer epidemiology // Vet. Q. 1996. - V.l8. - p.32 -36;

224. Morgan M.A., Copeland T.D., Oroszlan S. Structural and antigenic analysis of the nucleic acid binding protein of bovine and feline leukemia viruses // J. Virol. -1983.-V.46.-P. 177 - 186;

225. Monoclonal antibodies define eighth independent independent antigenic regions on the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein gp51 / Brack C., Mathol S., Portetelle D., et al. // Virology. 1982. - V.122. - P.342 - 352;

226. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. - V.155. - P.335-350;

227. Muluneh A. Seroprevalence of bovine immunodeficiency-virus (BIV) antibodies in the cattle population in Germany // Zentralbl Veterinarmed. 1994. -V.10. -P.679 - 684;

228. Nucleotide sequence and restriction fragmant length polymorphism analysis of the long terminal repeat of human T cell leukemia virus type II / Eiraku N., Monken C., Kubo T., et al. // AIDS Res Hum Retrovir. 1995. - V.5. - P.625 -636;

229. Onuma M. Studies on cell lines derived from calf, thymic and skin forms of bovine lymphosarcoma // Ann Rech Vet. 1978. - V.4. - P.859 - 866;

230. Onuma M., Olson C., Driscoll D.M. Properties of two isolated antigens associated with bovine leukemia virus infection // J Natl Cancer Inst. 1976. - V.3. -P.571 -578;

231. Oroszlan S., Copeland T.D. Primary structure and processing of gag and env gene products of human T-cell leukemia viruses HTLV-ICR and HTLV-IATK // Curr Top Microbiol Immunol. 1985. - V.115. -P.221 - 233;

232. Pamba R., Jeronimo C., Archambault D. Detection of bovine retrospumavirus by the polymerase chain reation // J Virol Methods. 1999. - V.78. - P.199 - 208;

233. Pelzer K.D. Economics of bovine leukemia virus infection // Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 1997. - V.13. - P.129 - 141;

234. Peptide based bovine leukemia virus (BLV) vaccine that induces BLV - Env specific Th-1 type immunity / Ohishi K., Kabeya H., Amanuma H., Onuma M. // Leukemia. - 1997. - Sup.3. - P.223 - 226;

235. Perach M., Hizi A. Catalytic features of the recombinant reverse transcriptase of bovine leukemia virus expressed in bacteria // Virology. 1999. - V.259. - P.176

236. Philpott S.M., Buehring G.C. Defective DNA repair in cells with human T-cell leukemia/bovine leukemia viruses: role of tax gene // J Natl Cancer Inst. 1999. -V.91.-P.933 -942;

237. Phosphorylation of bovine leukemia virus Tax protein is required for in vitro transformation but not for transactivation / Willems L., Griminpont C., Kerkhofs P., et al. // Oncogene. 1998. - V.16. - 2165 - 2176;

238. Polyclonal bovine sera but not virus neutralizing monoclonal antibodies block bovine leukemia virus (BLY) gp51 binding to recombinant BLV receptor BLVRcpl / Orlik O., Ban J., Hlavaty J., et al. // J Virol. - 1997. - V.4. - P.3263 -3267;

239. Polymerase chain reaction (PCR) for detection of BLV provirus a practical complement for BLV diagnosis ? / Blankenstein P., fechner H., Looman A.C., et al. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. - 1998. - V. 5. - P. 180 - 186;

240. Porteteile D., Mammerickx M., Burny A. Use of two monoclonal antibodies in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukemia virus envelope protein gp51 // J Virol. Meth. 1989. - V.23. - P.211 - 222;

241. Preliminary report: accurate assays for anti HIV in urine / Connell J.A., Parry J.V., Mortimer P.P., et al. // Lancet. - 1990. - V.335. - P. 1366 - 1369;

242. Protection of cattle against bovine leukemia virus (BLV) infection could be attained by DNA vaccination / Brillowska A., Dabrowski S., Rulka J., et al. // Acta

243. Biochim Pol. 1999. - Y.46. - P.971 - 976;

244. Protection by vaccination against bovine leukemia virus infection in sheep / Onuma M., Hodatsu T., Yamamoto S., et al. // Am J Vet Res. 1984. - V.6. - P.1212 -1215;

245. Protective effects of a live attenuated bovine leukaemia virus vaccine with deletion in the R3 and G4 genes / Reichert M., Cantor G.H., Willems L., Kettmann R. //J. Gen. Virology.- 2000. V.81. - P.965 - 969;

246. Protective vaccination against bovine leukaemia virus infection by means of cell derived vaccine / Altaner C., Barr J., Altanerova V., Janik V. // Vaccine. - 1991. - V.9. - P. 889- 895;

247. Purification and characterization of the major internal protein (p24) of bovine leukemia virus proceedings. / Portetelle D., Mammerickx M., Burny A., et al. // Arch Int Physiol Biochem. 1977. - V.l. - P. 192 - 193;

248. Rapid detection of specific polyclonal and monoclonal antibodies against bovine leukemia virus / Llames L., Goyache J., Domenech A., et al. // J Virol Meth. -1999.-V.82.-P.129- 136;

249. Rapid RT PCR amplification from limited cell numbers / Edmands S., Kirk J., Lee A., Radich J.// PCR Methods Appl. 1994. - V.3. - P.317 - 319;

250. Reactivity of monoclonal antibodies of the B cell panel on PBM from BLV-infected and lymphocytotic cows / Poli G., Turin L., Rocchi M., Ponti W. // Vet. Immunol. Immunopat. 1996. - V.4. - P.295 - 299;

251. Recombinant vaccinia virus expression of the bovine leukaemia virus envelope gene and protection of immunized sheep against infection / Portetelle D., Limbach K., Burny A., et al. // Vaccine. 1991. - V.9. - P.194- 200;

252. Recombinant viral vaccines for enzootic bovine leukosis / Daniel R.C.W.,

253. Gatei M.H., Good M.F., et.al. // Immunol. Cell Biol. 1993. - V.71. - P. 399 - 404;

254. Retrovirus-like particles produced by vaccinia viruses expressing gag-pro-pol region genes of bovine leukemia virus / Hertig C., Pye A.D., Hyatt A.D., Boyle D.B. // J Gen Virol. 1994. -Pt.9. - P.2213 - 2221;

255. Reyes R.A., Cockerell G.L. Unintegrated bovine leukemia virus DNA: association with viral expression // J Virol. 1996. - V.70. - P.4961 - 4965;

256. Robinson H.R., Hunt L.A., Webster R.G. Protection against lethal influenza virus challenge by immunization with hemagglutinin-expressing plasmid DNA // Vaccine. 1993. - V.ll. - P.957 - 960;

257. Role of the 3'long open reading frame region of bovine leukemia virus in the maintence of all transformation / Kettmann R., Cleuter Y., Gregoire D., Burny A. // J Virol. 1985. - V.54. - P.893 - 901;

258. Rosskopf M., Staub E., Ackermann M. Comparison of two ELISA systems for the detection of antibodies against IBR/IPV and against enzootic bovine leukemia virus // Schweiz Arch Tierheilkd. 1994. - V.2. - P.58 - 67;

259. Rovnak J., Casey J.W. Assessment of bovine leukemia virus transcripts in vivo // J. Virol. 1999. - V.73. - P.8890 - 8897;

260. Samagh B.S., Keller J.A. Seroepidemiological survey of bovine leukemia virus infection in Canadian cattle. 4th Int Symp. bovine leukosis, Brussels-Luxembourg. -1982.-P.397-412;

261. Schultz A.M., Copeland T.D., Oroszlan S. The envelope proteins of bovine leukemia virus: purification and sequence analysis // Virology. 1984. - V.135. -P.417 - 427;

262. Schwartz I., Levy D. Pathobiology of bovine leukemia virus // Vet. Res.1994.-V.25.-P.521 -536;

263. Serological evidence of the occurrence of enzootic bovine leukosis (EBL) virus infection in cattle in Tanzania / Schoepf K.C., Kapaga A.M., Msami H.M., Hyera J.M. // Trop. Anim. Health. Prod . 1997. - V.l. - P.15 - 19;

264. Serological and haematological diagnosis of enzootic bovine leukosis in cattle in Turkey / Batmaz H., Carli K.T., Kahraman M., et al. // Vet. Ree. 1995. - V.136. -P. 42 - 44;

265. Serological diagnosis of infection with the putative bovine leukemia virus / Ferrer J.F., Bhatt D.M., Abt D.A., et al. // Cornell Vet. 1975. - V.4. - P.527 - 542;

266. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus in dairy and beef cattle herds in Korea / Cho K.O., Meas S., Park N.Y., et al. // J Vet Med Sei. 1999. - V.5. -P.549 - 551;

267. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in draught animals in Cambodia / Meas S., Ohashi K., Tum S., et al. // J. Vet. Med. Sei. 2000. - V.62. - P.779 - 781;

268. Seroprevalance of enzootic bovine leukosis in Trakya district ( Marmara region ) in Turkey / Uysal A., Yilmaz H., Bilal T., et al. // Prev Vet Med 1998. - V.l. - P. 121 - 128;

269. Seroprevalance of bovine leukemia virus infection in cattle slaughtered at Bursa abattoir / Carli K.T., Ten A., Ulgen M., Batmaz H. // Tr.J.Vet. and Ani.Sci.1995.-V.19.-P.325 327;

270. Simian immunodeficiency virus specific cytotoxic T - lymphocyte induction through DNA vaccination of rhesus monkeys / Yasutomi Y., Robinson H., Lu S., et at. //J Virol. - 1996. - V.70. - P.678 - 681;

271. Specific protection against bovine leukemia virus infection conferred on cattleby the Romanian inactivated vaccine BL-VACC-RO / Patrascu I.V., Coman S., Sandu I., et al. // Virologie. 1980. - V.2. - P.95 - 102;

272. Studies on bovine leukaemia 1. Establishment of type C virus producing cell lines / Ressang A.A., Mastenbroek N., Quak J., et al. // Zentralbl. Veterinarmed. -1974.-V.21.-P.602-617;

273. Studies on bovine leukemia III. The haematological and serological response of sheep and goats to infection with whole blood from leukemic cattle / Ressang A.A., Baars J.C., Calafat J., et al. // Zentralbl Veterinarmed. 1976. - V.8. - P.662 -668;

274. Study on the diagnosis of enzootic bovine leukosis by complement fixation / Mammerickx M., Burny A., Dekegel D., et al. // Zentralbl Veterinarmed. 1977. -V.5. -P.349-357;

275. Sugimoto M., Ohishi F., Ikawa Y. Role of cell-mediated immunity in bovine leukemia virus (BLV) infection in ruminants: its implication for the vaccination strategy against retroviruses // Ther. Immunol.- 1994. V.l. - P.297 - 301;

276. Sugimoto M., Yamanouchi K. Characteristics of an attenuated vaccinia virus strain, LC16mO, and its recombinant virus vaccines II Vaccine. 1994. - V.8. -P.675 - 681;

277. Summary of round table discussion on methods concerned with leukocyte migration / Bendixen G., Bloom B.R., Brostoff J., et al. // Transplant Proc. 1972. -V.2. -P.239-240;

278. Tajima S., Ikawa Y., Aida Y. Complete bovine leukemia virus (BLV) provirus is conserved in BLV-infected cattle throughout the course of B-cell lymphosarcoma development // J Virol. 1998. - V.9. - P.7569 - 7576;

279. Tajima S., Aida Y. The region between amino acids 245 and 265 of the bovine leukemia virus (BLV) tax protein restricts transactivation not only via the BLV enhancer but also via other retrovirus enhancers // J Virol. 2000. - V.23. - P. 10939 - 10949;

280. T-cell responses to highly conserved CD4 and CD8 epitopes on the outermembrane protein of bovine leukemia virus: relevance to vaccine development / Gatei M.H., Good M.F., Daniel R.C., Lavin M.F. // J. Virol. 1993. - V.67. - P.1796 -1802;

281. The bovine leukemia virus p34 is a transactivator protein / Willems L., Gegonne G., Chen A., et al. // EMBO J. 1987. - V.6. - P.3385 - 3389;

282. The complete genomic sequence of a BLV strain from a holstein cow from argentina / Dube S., Dolcini G., Abbott L., et al. // Virology. 2000. - V.2. - P.379 -386;

283. The gag and pol genes of bovine leukemia virus nucleotide sequence and analysis / Rise N.C., Stephens R.M., Buray A., Gilden R.V. // Virology. 1985. -V.142.-P.351 -377;

284. The nucleotide sequence of the env and post-env region of bovine leukemia virus / Rice N.R., Stephens R.M., Couez D., et al. // Virology. 1984. - V.138. - P.82 -93;

285. The stimulation of gene expression by R region from HTLV-1 and BLV / Attal

286. J., Theron M.C., Kann G., et al. II J Biotechnol. 2000. - V.77. - P. 179 - 189;

287. The YXXL signalling motifs of the bovine leukemia virus transmembrane protein are required for in vivo infection and maintenance of high virus loads / Willems L., Gatot J.S., Mammerickx M., et al. // J Virol. 1995. - V.69. - P.4137 -4141;

288. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets :procedure and some applications // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. - V.9. - P.4350 - 4354;

289. Trainin Z., Meirom R., Gluckmann A. Comparison betweem the immunodiffusion and the immunofluorescence tests in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) // Ann Rech Vet. 1978. - V.4. - P.659 - 662;

290. Trans activation of the bovine leukemia virus long terminal repeat in BLV-infected cells / Rosen C.A., Sodroski J., Kettmann R., et.al. II Science. 1984. -V.227. - V.320 - 322;

291. Uckert W., Wunderlich V. Proteins of bovine leukemia virus: p. 15 is the major phosphorprotein // Acta Biol Med Ger. 1979. - V.l 1-12. - P.K35 - 42;

292. Uckert W., Grofova G., Beaudrea U. Translation order of bovine leukemia virus gag and env gene-coded proteins // Virology. 1984. - V.135. - p.288 - 293;

293. Uckert W., Westermann V., Wunderlich V. Nearest neighbour relationships of major structural proteins with bovine leukemia virus particles // Virology. 1982. -V.123. - P.240 - 250;

294. Unk I., Kiss-Toth E., Boros I. Transcription factor AP-4 participates in activation of bovine leukemia virus long terminal repeat by p34 Tax // Nucleic Acids Res. 1994. - V.23. - P.4872 - 4875;

295. Use of monoclonal antibody in an ELISA test for the detection of antibodies tobovine leukemia virus / Portetelle D., Brack C., Mammerickx M., Burny A. // J Virol. Methods. 1983. - V.6. - P.19-29;

296. Use of monoclonal antibodies in an ELISA for the diagnosis of bovine leukemia virus infection / Ban J., Gieciova E., Orlik O., Altaner C. // J. Virol. Meth. -1990. V.30. - P.79 - 88;

297. Vaccination against bovine leukaemia virus infection / Theilen G.H., Miller J.M., Higgins J., et al. // Curr. Top. Vet Med. Anim. Sci. 1982. - V.15. - P.547 -559;

298. Vaccination against animal retroviruses / Portetelle D., Callebaut I., Bex F., Burny A. // In:Progress in Vaccinology. 1993. -V.4. - P.87 -138;

299. Vaccine protection by a triple deletion mutant of simian immunodeficiency virus / Wyand M.S., Manson K.H., Garscia-Moll M., et al. // J Virol. 1996. - V.70. -P.3724 - 3733;

300. Van Der Maaten M.J., Miller J.M. Replication of bovine leukemia virus in monolayer cell cultures // Bibl. Haematol. 1976. - V.43. - P.360 - 362;

301. Van der Maaten M.J., Miller J.M. Use of a continuous feline cell line for virologic and serologic investigations of bovine leukemia virus infections // Am J Vet Res. 1980. - V.l 1. - P.1785 - 1788;

302. Van der Maaten M.J., Miller J.M., Schmerr M.J. Effect of colostral antibody on bovine leukemia virus infection of neonatal calves // Am J Vet Res. 1981. - V.9. -P.1498 - 1500;

303. Verdin E., Van Lint C. Internal transcriptional regulatory elements in HIV-1 and other retroviruses // Cell Mol Biol. 1995. - V.3. - P.365 - 369;

304. Viltrop A., Laht T. The historical backgraund of the control of enzootic bovine leukosis in Estonia // Rev. Sci. Tech. 1996. - V.3. - P.1007 - 1020;

305. Virus like particles in phytohemagglutinin - stimulated lymphocyte cultures with reference to bovine lymphosarcoma / Miller J.M., Miller L.D., Olson C., Gillette K.G. // J Natl. Cancer Inst. - 1969. - V.43. - P.1297 - 1305;

306. Walker P.J., Molloy J.B., Rodwell B.J. A protein immunoblot test for thedetection of bovine leukemia virus p24 antibody in cattle and experimentally infected sheep // J. Virol. Meth. 1987. - V.15. - P.201 -211;

307. Ward M.P. Serological studies of bovine leukemia virus infection in Queensland beef cattle // Aust Vet J. 1995. - V.2. - P. 71 - 72;

308. Wilesmith J.W., Straub O.C., Lorenz R.J. Iatrogenic transmission of bovine leukosis virus // Tierarztl. Umschau. 1978. - V.33. - P.519 - 523;

309. Wuu K.D., Graves D.C., Ferrer J.F. Inhibition of the reverse transcriptase of bovine leukemia virus by antibody in sera from leukemic cattle and immunological characterization of the enzyme // Cancer Res. 1977. - V.5. - P. 1438 - 1442;