Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Бочков, Юрий Александрович

• Бочков, Юрий Александрович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бочков, Юрий Александрович

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур.

2.2. Классификация возбудителя.

2.3. Репликация вируса инфекционного бронхита кур.

2.4. Антигенная вариабельность вируса инфекционного бронхита кур.

2.5. Изучение иммуногенных свойств пепломерного белка Б.

2.6. Диагностика инфекционного бронхита кур.

З.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.3. Результаты собственных исследований и их обсуждение.

3.3.1. Разработка стратегии штаммовой дифференциации вируса ИБК с использованием молекулярно-биологических методов.

3.3.2. Индикация генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР.

3.3.2.1. Очистка и концентрирование вируса ИБК.

3.3.2.2. Разработка метода выделения РНК вируса ИБК и суммарной РНК из различных вируссодержащих материалов.

3.3.2.3. Индикация генома вируса ИБК с помощью амплификации фрагмента кДНК консервативной нетранслируемой области (З'-иТЯ) методом ПЦР.

3.3.3. Исследование профиля вариабельности гена вируса ИБК и теоретический расчет праймеров для штаммовой дифференциации.

3.3.4. Амплификация кДНК вариабельной области гена методом ПЦР.

3.3.5. Секвенирование вариабельной области гена

3.3.6. Анализ генетической вариабельности вируса ИБК.

3.3.7. Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена изолятов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России в 1997-1998 гг.

3.3.7.1. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка Б1 изолятов, близких к Массачусеттской генетической группе.

3.3.7.2. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка "вариантных" изолятов, имеющих низкий уровень генетической гомологии со всеми зарубежными штаммами вируса ИБК.

4.3АКЛЮЧЕНИЕ.

5.ВЫВОД Ы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России»

Актуальность темы

Инфекционный бронхит кур (ИБК) - острое высококонтагиозное заболевание, поражающее кур различного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду Coronavirus, семейства Coronaviridae. В зависимости от штамма, вызвавшего инфекцию, могут поражаться респираторные органы, почки, а также герминативные органы и кишечник кур. Инфекционный бронхит регистрируется в птицеводческих хозяйствах мясного и яичного направления.

По данным серологических исследований наличие ИБК в настоящее время подтверждают практически во всех обследованных птицехозяйствах России, а также в странах СНГ, что указывает на широкое распространение инфекции.

В птицеводческих хозяйствах, неблагополучных по ИБК, отход молодняка составляет, в среднем, 18-20%, но при первичной циркуляции в хозяйстве вируса с нефрогенной тропностью смертность птицы может увеличиваться до 57-70% [8]. Вынужденная выбраковка цыплят в хозяйствах, где отмечают ассоциированное течение ИБК с вторичными инфекциями может достигать 40-60% среди цыплят 1-5 месячного возраста.

Проявление ИБК часто маскируется другими болезнями вирусной и бактериальной природы, а также физиологическими нарушениями. Даже при типичном течении постановка диагноза на ИБК по клиническим и па-тологоанатомическим признакам является затруднительной. Кроме того, в крупных птицехозяйствах ИБК может иметь стационарный характер и протекать как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов.

Система лабораторной диагностики ИБК включает в себя выделение вируса на куриных эмбрионах, постановку биопробы на восприимчивых цыплятах, идентификацию выделенного вируса в РН, РИФ и РТГА, выявление антител в сыворотках крови в РН, РТГА и ИФА, а также обнаружение гистологических изменений в органах и тканях.

Вирус ИБК отличается очень высокой генетической изменчивостью, которая обуславливает его антигенную вариабельность. По имеющимся к настоящему времени данным в мире известно более 30 серотипов вируса ИБК, причем перекрестная защита между штаммами разных серотипов практически отсутствует. Эффективность профилактических мероприятий при ИБК во многом обусловлена правильным выбором вакцинного штамма. В нашей стране в 1970-1980 гг. выделяли изоляты вируса ИБК, антиген-но родственные серотипам Массачусеттс и Коннектикут [6, 9], а в последнее время дигностика этого заболевания сводилась, в основном, к исследованию сывороток крови от больной птицы в ИФА и РЗГА. Таким образом, спектр штаммов, циркулирующих сейчас в России, оставался неизвестным. Постоянное появление новых антигенных вариантов вируса ИБК в разных странах мира, в том числе штаммов, способных вызывать заболевание у вакцинированной птицы, определяет актуальность работы и необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств индикации и идентификации вируса и профилактики ИБК.

Основными критериями при совершенствовании и разработке методов диагностики ИБК является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота проведения анализа, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.

В последнее время метод ПЦР, основанный на энзиматической амплификации части вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфичных праймеров, стал успешно использоваться в диагностике многих инфекционных заболеваний. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет выявлять даже фрагменты вирусного генома. Определение и сравнительный анализ первичной структуры кДНК фрагментов генома, характеризующихся высокой вариабельностью, позволяет наиболее точно установить штаммовую принадлежность вируса.

Метод ОТ-ПЦР для диагностики ИБК был впервые применен Lin и соавт. в 1991 году [114] и в настоящее время используется многими лабораториями в разных странах. Основными недостатками предложенных ранее методов при индикации вирусного генома являются необходимость культивирования полевых изолятов вируса в куриных эмбрионах, а при штаммо-вой дифференциации - анализ консервативных областей генома, что снижает информативность метода. Имеющиеся к настоящему времени данные о первичной структуре различных областей генома вируса ИБК позволяют разработать оптимальную тест-систему не только для индикации, но и для штаммовой дифференциации вируса. Цель и задачи исследования

Основная цель данных исследований заключалась в разработке метода индикации и штаммовой дифференциации вируса ИБК и изучении моле-кулярно-биологическими методами генетических взаимоотношений штаммов вируса ИБК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод индикации генома вируса ИБК в различных вируссо-держащих материалах на основе ОТ-ПЦР;

- разработать метод идентификации вируса ИБК на основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Б1, позволяющий определять штаммовую принадлежность вируса;

- провести анализ нуклеотидной последовательности вариабельной области гена 81 полевых изолятов вируса ИБК, выделенных в России и вакцинных штаммов вируса ИБК;

- сравнить первичные структуры вариабельной области гена полевых изолятов и зарубежных штаммов вируса ИБК.

Научная новизна исследования

Впервые определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена 21 изолята вируса ИБК, выделенного на территории России в течение 1997-1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Выявлены и дифференцированы генетические группы штаммов вируса ИБК.

Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельной области гена Б1 вируса ИБК.

Практическая значимость исследования

Разработаны метод очистки и концентрирования вируса ИБК и метод выделения вирусной РНК, позволяющие получать из аллантоисной жидкости РКЭ, инфицированных вирусом ИБК штаммом НПО препараты с концентрацией вирусного белка 0,5-1,5 мг/мл и, соответственно, около 0,3 мг вирусной РНК.

Разработан метод индикации вируса ИБК на основе ОТ-ПЦР с прай-мерами на консервативную область З'-ИТЯ, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах без выделения вируса в куриных эмбрионах в течение 4-6 часов.

Разработан метод прямого секвенирования амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК, позволяющий в течение 2-3 дней определять первичную структуру вариабельной области гена 81, и в результате сравнительного анализа с использованием созданного банка данных, проводить штаммовую дифференциацию новых изолятов вируса ИБК.

С помощью разработанного метода проведена идентификация 21 изолята ВИБК, выделенного на территории России в 1997-1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Разработанные методы индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, а также Департаментом ветеринарии МСХиП РФ и в настоящее время используются для индикации генома и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выделяемых на территории России и стран СНГ. Публикация научных исследований

По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ. Апробация работы

Основные материалы диссертации были доложены на научно-практической конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" ВНИИЗЖ, г. Владимир (1997 г.), научной конференции "Современные аспекты ветеринарной патологии животных" г. Владимир (1998 г.) и II Всероссийской конференции "ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" г. Москва (1998 г.).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 127 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 188 источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 5 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Бочков, Юрий Александрович

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод очистки и концентрирования вируса ИБК из аллантоисной жидкости развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных вакцинным штаммом Н120, основанный на центрифугировании в градиентах плотности сахарозы.

2. Предложен новый метод выделения РНК вируса ИБК с использованием ОГ/Р фильтров, преимуществами которого являются большой количественный выход РНК, техническая простота и высокая скорость анализа.

3. Разработан метод индикации генома вируса ИБК на основе ПЦР с праймерами на консервативную область З'-иТЯ, позволяющий выявлять вирусный геном в течение 6-8 часов в различных вируссодержащих образцах: органах инфицированных кур (легких, трахеях, почках, кишечнике), в инфицированных куриных эмбрионах, образцах вакцинных препаратов.

4. На основе прямого секвенирования амплифицированного в ПЦР фрагмента кДНК гена разработан метод идентификации вируса ИБК, позволяющий в течение 2-3 дней определить первичную структуру вариабельной области гена 81 и путем ее сравнения с имеющимися в банке данных аналогичными структурами других штаммов определить штаммовую принадлежность изолята.

5. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гена Б1 21 изолята вируса ИБК, выделенного на территории России в течение 1997-1998 г. и 10 отечественныхи зарубежных вакцинных и патогенных штаммов вируса.

6. Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов вируса ИБК, позволяющий проводить сравнительный анализ и идентификацию вновь выделенных изолятов. Выявлены генетические группы штаммов вируса ИБК. Показано, что распределение на группы коррелирует с серологической классификацией штаммов вируса ИБК при отсутствии четкой зависимости от места выделения вируса.

7. В результате сравнительного анализа вариабельной области гена и белка S1 было показано, что 11 изолятов, выделенных на территории России имеют структуру, близкую к таковой штаммов серотипа Массачусеттс (Н120, Н52, М41, Beaudette); 10 изолятов, не относятся к какой либо генетической группе и не имеют высоких уровней гомологии ни с одним зарубежным штаммом.

8. Установлено, что изолят IBV-14/98 обнаружил высокую степень гомологии со штаммами нового серотипа 793/В, впервые выделенными в Великобритании в 1991 г., а затем и в других странах, что позволяет предположить, что они имеют общее происхождение.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанный метод индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена S1 включен в "Методические указания по диагностике вирусных болезней животных", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России в 1998 г. и применяется для идентификации вновь выделенных изолятов вируса ИБК из патматериала, поступающего с различных п/ф России и стран СНГ.

2. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена S1 отечественных и зарубежных изолятов и вакцинных штаммов.

3. В процессе выполнения научных исследований разработана и утверждена научно-техническая документация:

НТД к набору для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур методом ИФА" - Владимир, 1997.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных штаммов вируса ИБК был использован для выбора участка генома, позволяющего проводить индикацию и штаммовую дифференциацию. В связи с тем, что филогенетический анализ консервативных областей генома вируса ИБК (ген N, область З'-UTR) не коррелирует с антигенными свойствами штаммов, а наиболее подходящая для штаммовой дифференциации область -ген S1, отличается высокой вариабельностью было выбрано два разных участка для амплификации в ПЦР: консервативная область З'-UTR для индикации вирусного генома и вариабельная область гена S1 для штаммовой дифференциации.

Для индикации вирусного генома в различных биопробах были использованы две пары праймеров для "гнездовой" ПЦР, фланкирующие консервативную область З'-UTR, предложенные Adzhar и соавт. (1996).

Анализ нуклеотидных последовательностей гена S1, штаммов вируса ИБК 17 различных серотипов, в З'-концевой части гена S1 позволил выявить область, характеризующуюся максимальной вариабельностью. Ранее было показано, что эта область генома кодирует вируснейтрализующие и сер отипо специфические эпитопы. В результате проведенного анализа последовательностей гена S1 были выбраны 6 праймеров для "nested"-ПЦР, гомологичные относительно консервативным участкам, фланкирующим вариабельную область гена S1 .

В результате сравнения различных способов очистки и концентрирования был разработан метод очистки вируса ИБК из аллантоисной жидкости РКЭ, инфицированных вирусом ИБК, штамм HI20, включающий осветление аллантоисной жидкости низкоскоростным центрифугированием, концентрирование вируса улырацентрифугированием, очистку в ступенчатом сахарозном градиенте (плотность 20%, 35%, 55%), дополнительную очистку в линейном градиенте плотности сахарозы (30-55%). Полученный вирусный препарат был использован в качестве антигена в реакции ИФА, обладая при этом высокой активностью и специфичностью.

Был разработан новый метод выделения и очистки РНК вируса ИБК с использованием фильтров GF, а также метод выделения суммарной РНК. Было показано, что качество полученных препаратов и количество содержащейся в них вирусспецифической РНК удовлетворяли требованиям ревертазных и полимеразных реакций. Сравнение метода выделения РНК с помощью фильтров GF/F и классического метода Chomczynski и соавт. [1987] показало, что разработанный метод выделения РНК не уступал методу Chomczynski и соавт. по количественному выходу и значительно превосходил его по скорости и технической простоте.

Для выбора наиболее оптимального метода амплификации фрагментов вирусного генома были сравнены метод раздельной постановки ОТ и ПЦР и "непрерывной" ОТ-ПЦР (continuous RT-PCR). Полученные результаты показали, что метод "непрерывной" ОТ-ПЦР по количественному выходу вирусспецифических фрагментов кДНК не уступал методу раздельной ОТ и ПЦР и при этом сокращал время постановки реакции и был технически проще первого. С использованием РНК, выделенной из концентрированного и очищенного вируса ИБК, был осуществлен подбор оптимального температурно-временного режима для ОТ-ПЦР, а также концентраций компонентов реакций. Оптимизированы условия выделения суммарной РНК для индикации вируса ИБК в различных вируссодержащих материалах. В результате, была отработана методика амплификации в ПЦР консервативной области З'-UTR, которая использовалась для индикации вируса ИБК в инфицированных куриных эмбрионах, внутренних органах инфицированных птиц, образцах вакцинных и вирулентных препаратов.

При разработке метода идентификации вируса ИБК было показано, что для определения нуклеотидной последовательности вариабельной области гена S1 наиболее удобно использовать метод циклического секвенирования. Данный метод отличается скоростью и технической простотой анализа.

На основе ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней проводить идентификацию штаммов вируса ИБК. Разработанный метод идентификации вируса ИБК был использован для выявления спектра штаммов вируса, циркулирующих на птицефабриках России. Определена первичная структура вариабельной области гена 81 22 изолятов вируса ИБК.

Для оценки возможности проведения штаммовой дифференциации с помощью сравнительного анализа первичной структуры выбранной нами вариабельной области мы использовали нуклеотидные последовательности гена 81.

Филогенетический анализ последовательностей вариабельной области гена 81 американских, европейских, и японских штаммов из базы данных ЕМВЬ показал, что они образуют несколько генетических групп и их распределение в большинстве случаев коррелирует с серологической классификацией, за исключением нескольких серологически отличных европейских штаммов конца 1970-х начала 1980-х гг, обладающих высокой генетической гомологией и японского изолята КВ8523. При этом следует отметить, что четкой корреляции между разделением штаммов на генетические группы и их геграфическим происхождением не было выявлено.

Таким образом, было показано, что анализ последовательностей выбранной нами вариабельной области гена отражает общую структуру филогенетических связей, полученную при анализе последовательностей полного гена 81 и серологическую классификацию изученных штаммов.

Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гена 81 исследованных изолятов сравнили между собой и с последовательностями, опубликоваными ЕМВЬ. Сравнительный анализ установленных первичных структур позволил определить вариабельность вируса, выявить генетические группы штаммов.

На основе гомологии первичной структуры вариабельной области гена 81 можно выделить несколько групп изолятов. Первая группа (10 изолятов) обладает большим сходством со штаммами серотипа Массачусеттс, которые выделяют во многих странах. Десять входящих в эту группу изолятов по нуклеотидной последовательности очень сходны с вакцинными штаммами Н120 и Н52. Широкое географическое распространение штаммов серотипа Массачусеттс, которые выделяют в разных странах Европы и в США объясняется, по-видимому, широким использованием живых вакцин против ИБК, полученных на основе штаммов этого серотипа (Н52, Н120, МА5, АМ и ряда других). Около половины нуклеотидных замен сосредоточено в двух гипервариабельных областях, определенных Niesters и соавт., (1986) для серотипа Массачусеттс. При сравнении аминокислотных последовательностей уровень различий между исследованными изолятами и штаммами М41, Beaudette, "Чапаевский" возрастает до 7-9%, так как большинство нуклеотидных замен приводит к заменам аминокислот, хотя различия изолятов между собой и штаммами H120, Н52 увеличиваются не столь значительно (до 4%). Полученные данные по первичной структуре вариабельной области гена S1 и теоретический расчет вторичных структур белка по методу Chou и соавт. [1974] изученных изолятов этой группы указывают на их сходство и позволяют предположить у них антигенные свойства, сходные со штаммами серотипа Массачусеттс.

К описанной выше генетической группе примыкает изолят IBV-06/98, выделенный в Краснодарском крае. Результаты сравнительного анализа показали, что его отличия от российских изолятов, а также от вакцинных и патогенных штаммов Массачусеттской группы по нуклеотидным последовательностям составляют от 4,5 до 6%, а по аминокислотным еще выше (7,5-9,5%), так как большинство нуклеотидных замен значимые, от других штаммов отличия значительно выше. Для оценки предполагаемых антигенных свойств изолята IBV-06/98, по нашему мнению, обязательно проведение серологических исследований, т.к. достаточно высокий уровень генетических различий (предельный внутри серотипа Массачусеттс), а также данные о том, что изолят выделен от вакцинированной птицы затрудняют оценку по данным филогенетического анализа.

Высокий уровень отличий, выявленный у 10 других отечественных изолятов от американских и европейских штаммов вируса ИБК показал, что они не относятся ни к одной из изученных генетических групп, поэтому они были названы "вариантными" изолятами. Они имеют от 25 до 30% отличий от всех анализируемых штаммов вируса.

Изоляты IBY-10/98 и IBY-20/98, выделенные на птицефабриках "Горинская" (Ивановская обл.) и "Истро-Сенежская" (Московская обл.) имеют высокий уровень гомологии нуклеотидных (92,5%) и аминокислотных (93,5%) последовательностей между собой, значительно отличаясь от других штаммов и изолятов. Наиболее высокой гомологией нуклеотидных последовательностей (19-20%) с этими двумя изолятами обладает изолят IBV-04/98, выделенный в Московской области.

Высокой степенью гомологии нуклеотидных последовательностей (около 93%) обладают изоляты IBV-08/98 и IBV-21/98, выделенные на п/ф "Дружба" и "Русь". Оба эти изолята были выделены в одном географическом регионе (Краснодарский край) от кур-несушек, у которых наблюдались сходные клинические признаки, характерные для ИБК (нефриты, недоразвитие и атрофия яичников, увеличение процента бесскорлуповых яиц). В обоих хозяйствах проводилась вакцинация живыми и инактивированными вакцинами против ИБК серотипа Массачусеттс производства Голландии и США, которая не обеспечивала надежной защиты против заболевания.

Проведенные за рубежом фирмами "Intervet" и "TAD" серологические исследования сывороток в РТГА от инфицированной вирусом ИБК птицы из двух птицефабрик Московской области и Краснодарского края, где по нашим данным были выявлены изоляты, имеющие сильно отличающуюся структуру исследуемой области подтвердили, что они антигенно отличны от референтных европейских штаммов.

Наибольшим своеобразием отличаются 4 изолята IBV-07/98, IBV-12/98, IBV-16/98 и IBV-17/98, выделенные в Краснодарском крае, Омской, Ростовской и Пермской областях. Они отличаются от всех изученных изолятов и между собой на 20-30% по нуклеотидным и на 22-30% по аминокислотным последовательностям на исследуемом участке.

Значительно отличающиеся по первичной структуре изоляты были выявлены с незначительным временным интервалом от бройлеров на птицефабрике "Сибирская", Омской области: IBV-09/98, IBY-12/98. Первый изолят был выявлен в апреле 1998 г. от цыплят-бройлеров с респираторной клиникой и, по результатам сравнительного анализа, был отнесен к Массачусеттской генетической группе. После вакцинации против ИБК, спустя 2 месяца, в июне 1998 г., в патматериале с этой же птицефабрики был выявлен изолят IBV-12/98, первичная структура вариабельной области гена S1 которого значительно отличалась как от выделенного ранее изолята, так и от всех остальных изолятов и штаммов. На основе полученных данных нельзя сделать однозначных выводов: или на одной птицефабрике могут практически одновременно перси стировать изоляты, вируса ИБК, генетически сильно отличающиеся друг от друга, или произошла быстрая смена одного штамма другим, причем вызывающим совершенно другие клинические проявления у птицы.

Изолят IBV-14/98, выявленный на птицефабрике "Большевик", Воронежской области от цыплят яичного направления, обнаружил 91-92% гомологии по нуклеотидным и 88,5-89% гомологии по аминокислотным последовательностям со штаммами серотипа 793/В, впервые выделенными в Великобритании в 1991 г., и распространившимися в других странах. Высокий уровень гомологии этого изолята и штаммов 793/В позволяет предположить, что они имеют общее происхождение и данный изолят мог быть занесен в Россию из Европы. Для профилактики ИБК, вызванного изолятами нового серотипа 793/В, фирмой "Intervet" (Голландия) была создана живая вакцина на основе аттенуированного штамма 4/91, применение которой, по-видимому является целесообразным в случаях выявления изолятов этой группы и в нашей стране.

Филогенетический анализ показал, что почти половина изолятов (10 из 22), выделенных на территории России не относятся к какой либо генетической группе и не имеют высоких уровней гомологии ни с одним зарубежным штаммом. Это свидетельствует о том, что вспышки ИБК, имевшие место на ряде птицефабрик России не были вызваны вирусами европейского или американского происхождения, а вызывались изолятами, появившимися в нашей стране. Столь значительные отличия в первичной структуре вариабельной области гена и белка S1, которая считается определяющей антигенные свойства вируса ИБК, выявленные у "вариантных" изолятов, позволяют предполагать у них наличие оригинальных антигенных характеристик.

За рубежом, для профилактики ИБК, вызванного вариантными штаммами, которые постоянно выявляются в разных странах применяют живые и инактивированные вакцины на основе этих штамов, а также поливалентные живые вакцины серотипов Массачусеттс и Арканзас (Gelb et al., 1991, 1997). В сложившейся на птицефабриках России ситуации с ИБК для профилактики и контроля за вариантными изолятами целесообразным, по-видимому, будет получение на их основе инактивированных вакцин, обеспечивающих достаточно высокие уровни иммунитета, специфичного к полевым изолятам.

С использованием результатов собственных исследований, а также данных ЕМВЬ, был создан банк данных, включающий 50 нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена 81 отечественных и зарубежных полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИБК. Анализ накопленных данных позволяет наиболее полно представить генетическую вариабельность вируса ИБК. Было показано, что сравнительный анализ исследуемого участка не выявляет четкой корреляции между разделением штаммов на группы и географическим местом выделения, что, по всей видимости, связано с особенностями распространения заболевания.

Создание банка данных, включающего первичные структуры вариабельной области гена Б1 штаммов вируса ИБК, выделенных в разных регионах и в разное время, позволяет проводить сравнение не только среди штаммов, циркулирующих на территории России, но и сравнивать их со штаммами, выделенными в других странах, что становится особенно важным, т.к. практика закупки племенной птицы у зарубежных фирм может способствовать быстрому распространению новых штаммов вируса на территории России.

Проведенный комплекс молекулярно-биологических работ позволил разработать метод индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК, изучить генетические взаимотношения между российскими изолятами вируса ИБК и зарубежными штаммами.

Таким образом, результаты изучения первичных структур полевых и вакцинных штаммов вируса ИБК свидетельствуют о том, что данное направление исследований является перспективным для изучения эпизоотологии ИБК, а также для изучения структурно-функциональной организации ИБК на молекулярном уровне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бочков, Юрий Александрович, 1999 год

1. Грибанов О.Г., Бочков Ю.А. Использование стекловолокнистых фильтров GF/F (GF/C) для выделения РНК вируса инфекционного бронхита кур // Пробл. инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф.- Владимир. 1997. - С. 163.

2. Грибанов О.Г., Щербаков A.B., Перевозчикова H.A. и др. Простой метод выделения и очистки РНК // Биоорганич. химия. 1997. - Т.23. - №9. -С.763-766.

3. КуриленкоА.Н., Чистова З.Я., Ромахова М.А. и др. Рекомендации по диагностике и профилактике инфекционного бронхита кур // М. 1981.- 35с.

4. Куриленко А.Н., Крупалъник В.Л., Якимчик Б.А. Инфекционный бронхит кур (обзор литературы) // Ветеринария. 1990. - №8. - С.36-43.

5. Мазурина М.Г. Биологические свойства изолятов вируса ИБК // Совр. средства и методы борьбы с заразными болезнями с.-х. птиц: Сб. науч. трудов.-Л. 1988. - ч.1.-С.7-14.

6. Мисиров З.Г. Одновременное течение инфекционного бронхита кур и пуллороза // Акт. вопр. вет. вирусол.: Тез. докл. IV Всероссийской вирусол. конф. Владимир. - 1995. - С. 18-19.

7. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Инфекционный бронхит кур // Диагностика вирусных болезней животных. М. Агропромиздат. -1991. -С.235-258.

8. Токарских В.В., Мазурина М.Г., Терюханов А.Б. Характеристика изолятов вируса ИБК, выделенных от птиц яичного и мясного направления // Комплекс противоэпизоот. и спец. мероприятий по борьбе с болезнями птиц: Сб. науч. трудов. J1. - 1990. - С.73-79.

9. I.Adzhar А.В., Shaw K., Britton P., Cavanagh D. Universal oligonucleotides for the detection of infectious bronchitis virus by the polymerase chain reaction //Avian Pathol. 1996. - Vol.25. - P.817-836.

10. Ъ.Alexander D.J., Collins M.S. Effect of pH on the growth and cytopathogenicity of avian infectious bronchitis virus in chicken kidney cells // Arch. Virol. 1975. - Vol.49. - P.339-348.

11. Alli ed J.N., Raggi L.G., Lee G.G. Susceptibility and resistance of phesants starlings and quail to three respiratory deseases of chickens // Calif. Fish. Game. 1973. - Vol.59. - P. 161-167.

12. Ambali A.G., Jones R.C. Early pathogenesis in chicks with an enterotropic strain of infectious bronchitis virus // Avian Dis. 1990. - Vol.34. - P.809-817.

13. Andreas en J.R., Jackwood M.W., Hilt D.A. Polymerase chain reaction amplification of the genome of infectious bronchitis vims // Avian Dis.-1991. Vol.35. -P.216-220.

14. Beach J.R., Schalm O.W. A filterable virus, distinct from that of laryngotracheaitis, the cause of a respiratory disease of chicks // Poult. Sci. -1936. Vol.15. - P. 199-206.

15. Berry D.M., Stokes K.J. Antigenic variations in isolates of infectious bronchitis virus // Vet. Record. 1968. - Vol.83. - P. 157-160.

16. Binns M.M., Boursnell M.E., Cavanagh D. et. al. Cloning and sequencing of gene encoding the spike protein of the coronavirus IBV // J. Gen. Virol. -1985. Vol.66. -P.719-726.

17. Binns M.M., Boursnell M.E., Tomley F.M. et al. Comparison of the spike precursor sequences of coronavirus IBV strains M41 and 6/82 with that of IBV Beaudette // J. Gen. Virol. 1986. - Vol.67. - P.2825-2831.

18. Boursnell M.E., Binns M.M., Brown T.D. Sequencing of coronavirus IBVgenomic RNA: three open reading frames in the 5' unique region of mRNA D //J. Gen. Virol. 1985. - Vol.66. - P.2253-2258.

19. Brierley I., Boursnell M.E., Binns M.M. et al. An efficient ribosomal frameshifting signal in the polymerase-encoding region of the Coronavirus IBV // EMBO J. 1987. - Vol.6. - P.3779-785.

20. Brier ley /., Rolley N.J., Jenner A.J. et al. Mutational analysis of the RNA pseudoknot component of a coronavirus ribosomal frameshifting signal // J. Mol. Biol. 1991. - Vol.220. - P.889-902.

21. Brown T.D., Boursnell M.E. Avian infectious bronchitis virus genomic RNA contains sequence homologies at the intergenic boundaries // Virus Res. -1984. Vol.1. - P. 18-24.

22. Brown A.J., Bracewell C.D. Effect of repeated infections of chickens with infectious bronchitis viruses on the specificity of their antibody responses // Vet. Rec. 1988. - Vol.122. - P.207-208.

23. Cavanagh D. Structural characterization of infectious bronchitis virus glycoproteins // Adv. Exp. Med. Biol. 1984. - Vol. 173. - P.95-108.

24. Ah .Cavanagh D. Structural polypeptides of coronavirus infectious bronchitis virus //J. Gen. Virol. 1981. - Vol.53. - P.93-103.

25. Cavanagh D., Davis P.J., Pappin D.J. Coronavirus IBV glycopolypeptides: locational studies using proteases and saponin, a membrane permeabiliser // Virus Res. 1986. - Vol.4. - P. 145-156.

26. Al .Cavanagh D., Davis P.J. Sequence analysis of strains of avian infectious bronchitis coronavirus isolated during the 1960s in the U.K. // Arch. Virol. -1992. Vol.130. -P.471-476.

27. Cavanagh D., Davis P.J., Mockett A.P. Amino acids within hypervariable region 1 of avian coronavirus IBV (Massachusetts serotype) spike glycoprotein are associated with neutralising epitops // Virus Res. 1988. -Vol.11. - P.141-150.

28. Sl.Clewley J.P., Morser «/., Avery R.J. et al. Oligonucleotide fingerprinting of ribonucleic acids of infectious bronchitis virus strains // Infect. Immun. -1981. Vol.32. - P. 1227-1233.

29. Collins M.S., Alexander D.J. Avian infectious bronchitis virus structural polypeptides: effect of different conditions of disruption and comparison of different strains and isolates //Arch. Virol. 1980. - Vol.63. - P.239-251.

30. Collisson E.W., Li J., Sneed L.W. et al. Detection of avian infectious bronchitis viral infection using in situ hybridization and recombinant DNA // Vet. Microbiol. 1990. - Vol.24. - P.261-271.

31. Cook J. K., Huggins M.B. Newly isolated serotypes of infectious bronchitis virus : Their role in disease. //Avian Pathol. 1986. - Vol.15. - P. 129-138.

32. Cook J.K., Smith H.W., Huggins M.B. Infectious bronchitis immunity: Its study in chickens, experimentally infected with mixtures of infectious bronchitis virus and E. coli //J. Gen. Virol. 1986. - Vol.67. - P. 1427-1434.

33. Co wen B.S., Hitchner S.B., Ubertini J. Characterization of a new infectious bronchitis virus isolate. II. Some chemical and physical properties of

34. Clarcke 333 11 Avian Dis. 1971. - Vol. 15. - P.527-532.

35. Cumming R.B. The control of avian infectious bronchitis / nephrosis in Australia // Aust. Vet. J. 1969. - Vol.45. - P.200-203.

36. Cunningham C.H. Newer information on the properties of infectious bronchitis virus // Proc. 13th World's Poultry Congr. 1966. - P.416-418.

37. Cunningham C.H. Immunologic methods in avian research: neutralization test// Avian Dis. 1973. - Vol.17. - P.227-235.

38. Darbyshire J.H. Assessment of cross-immunity in chickens to strains of infectious bronchitis virus using tracheal organ cultures // Avian Pathol. -1979. Vol.9. -P.179-183.

39. Darbyshire J.H., Rowell J.G., Cook J.K. et al. Taxonomic studies on strains of avian infectious bronchitis virus using neutralisation test in tracheal organ cultures // Arch. Virol. 1979. - Vol.61 - P.227-238.

40. Davelaar F.G., Kouwenhoven B., Burger A.G. Occurence and significance of infectious bronchitis virus variant strains in egg and broiler production in the Netherlands // Vet. Q. 1984. - Vol.6 - P. 114-120.

41. David-Ferveira J.F., Manarer R.A. An electron microscope study of the development of a mouse hepatitis virus in tissue culture cells // J. Cell. Biol. -1965. Vol.24. -P.57-78.

42. Dawson P.S., Gough R.E. Antigenic variation in strains of avian infectiousbronchitis virus // Arch, fur die Gesampte Virusforsch. 1971. - Vol.34. -P.32-39.

43. De Wit J.J., Koch G., Kant A. et al. Detection by iramunofluorescent assay of serotype-specific and group-specific antigenes of infectious bronchitis virus in tracheas of broilers with respiratory problems // Avian. Pathol. -1995. Vol.24. - P. 465-474.

44. Erlich H.A. PCR technology //New-York. Raven Press. 1988. - P.254.

45. Fulton R.M., Reed W.M., Tliacker H.L. Cellular responses of the respiratory tract of chickens to infection with Massachusets 41 and Australian T infectious bronchitis viruses // Avian Dis. 1993. - Vol.37. -P.951-960.

46. Gorbalenya A.E., Koonin E.V., Donchenko A.P., Blinov V.M. Coronavirus genome: prediction of putative functional domains in the nonstructural polyprotein by comparative amino acid sequence analysis // Nucleic Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P.4847-4861.

47. Hofstad M.S. Avian infectious bronchitis // Diseases of Poultry. 1984. -8th ed. - Iowa State University Press, Ames. - P.429-443.

48. Hopkins S.R. Serological comparisons of strains of infectious bronchitis virus using plaque purified isolants // Avian Dis. 1974. - Vol.18. - P.231-239.

49. Hopkins S.R., Beard C. W. Studies on methods for determining the efficacy of oil emulsion vaccines against infectious bronchitis virus // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1985. - Vol. 187. - P.305.

50. Hopkins S.R., Yoder H.W. Jr. Reversion to virulence of chicken passaged infectious bronchitis vaccine virus // Avian Dis. 1986. - Vol.30. - P.221-223.

51. Ignjatovic J., Ashton F. Detection and differentiation of avian infectious bronchitis viruses using a monoclonal antibody-based ELISA // Avian Pathol. 1996. - Vol.25. - P.721-736.1 ID

52. Ignjatovic J., Mcwaters P.G. Monoclonal antibodies to three structural proteins of of avian infectious bronchitis virus: Characterisation of epitopes and antigenic differentiation of Australian strains // J. Gen. Virol. 1991. -Vol.72. - P.2915-2922.

53. Jimenez G., Correa /., Melgosa M.P. et al. Critical epitopes in transmissible gastroenteritis virus neutralization //J. Virol. 1986. - Vol.60. - P. 131-139.

54. Johnson R.B., Marquardt W.W., Newman J. A. A new serotype of infectious bronchitis virus responsible for respiratory disease in Arkansas broiller flocks//Avian Dis. 1973. - Vol.17. - P.518-523.

55. Johnson R.B., Marquardt W.W. The neutralising characteristics of strains of infectious bronchitis virus as measured by the constant virus variable serum method in chicken tracheal cultures //Avian Dis. 1975. - Vol.19. - P.82-90.

56. Jones R.C., Ambali A.G. Re-excretion of enterotropic infectious bronchitis virus by hens at point of lay after experimental infection at day old // Vet. Rec. 1987. - Vol.120. - P.617-620.

57. Jungherr E.L., Chomiak T. W., Luginbuhl R.E. Immunologic differences in strains of infectious bronchitis // Proc. 60th Annu. Meet US Livestock Sanit Assoc. 1956. -P.203-209.

58. Kant A., Koch G., van Roozelaar D.J. et al. Location of antigenic sites defined by neutralizing monoclonal antibodies on the SI avian infectiousbronchitis virus glycopolypeptide // J. Gen. Virol. 1992. - Vol.73. - P.591-596.

59. Karaca K., Naqi S.A., Gelb J. Production and characterization of monoclonal antibodies to three infectious bronchitis virus serotypes // Avian. Dis. 1992. - Vol.36. - P.903-915.

60. Karaca K, Naqi S.A. A monoclonal antibody-based ELISA to detect serotypepspecific infectious bronchitis virus antibodies // Vet. Microbiol. -1993. -Vol.34. -P.249-257.

61. Keeler C.L., Reed K.L., Nix W.A. et al. Serotype identification of avian infectious bronchitis virus by RT-PCR of the peplomer (SI) gene // Avian Dis. 1998. - Vol.42. - P.275-284.

62. King D.J., Hopkins S.R. Evaluation of the hemagglutination inhibition test for measuring the response of chickens to avian infectious bronchitis virus vaccination // Avian Dis. 1983. - Vol.27. - P. 100-112.

63. Klieve A.V., Cumming R.B. Immunity and cross-protection to nephritis produced by Australian infectious bronchitis viruses used as vaccines // Avian Pathol. 1988. - Vol.17. - P.829-839.

64. Kusters J.G. Niesters H.G., Lenstra J.A. et al. Phylogeny of antigenic variants of avian coronavirus IBVII Virology. 1989. - Vol.169. - P.217-221.

65. Kwon H.M., JackwoodM.W. Molecular cloning and sequence comparison of the SI glycoprotein of the Gray and JMK strains of avian infectious bronchitis virus // Virus Genes. 1995. - Vol.9. - P.219-229.

66. Q7.Kwon H.M., JackwoodM.W., Brown T.P. et al. Polymerase chain reaction and biotin-labeled DNA probe for detection of infectious bronchitis virus in chickens // Avian Dis. 1993a. - Vol.37. - P. 149-156.

67. Kwon H.M., Jackwood M.W., Gelb J. Differentiation of infectious bronchitis virus serotypes using polymerase chain reaction and restriction fragment lenght polymorphism analysis // Avian Dis. 1993b. -Vol.37. -P. 194-202.

68. Lai M.M., Patton C.D., Stohlman S.A. Replication of mouse hepatitis virus: negative-stranded RNA and replicative form RNA are of genome length. // J. Virol. 1982. - Vol.44. - 487-492.

69. Lenstva J.A., Kusters J.G., Koch G. et al. Antigenicity of the peplomer protein of infectious bronchitis virus // Mol. Immunol. 1989. - Vol.26. -P.7-15.

70. A.Lin Z., Kato A., Kudou Y. et al. A new typing method for the avian infectious bronchitis virus using polymerase chain reaction and restriction enzyme fragment polymorphism // Arch. Virol. 1991 a. - Vol. 116. - P. 19-31.

71. Z,/« Z., Kato A., Kudou Y. et al. Typing of recent infectious bronchitis virus isolates causing nephritis in chickens // Arch. Virol. 1991b. - Vol.120. - P. 145-149.

72. Liu D.X., Inglis S.C. Asociation of the infectious bronchitis virus 3c protein with the virion envelope // Virol.- 1991. Vol. 185. - P.911 -917.

73. I.Liu D.X., Inglis S.C. Internal entry of ribosomes on a tricistronic mRNA encoded by infectious bronchitis virus // J. Virol. 1992. - Vol.66. - P.6143-6154.

74. Liu D.X., Xu H.Y., Brown T.D. Proteolytic processing of the coronavirus infectious bronchitis virus 1 a polyprotein: identification of a 10-kilodalton polypeptide and determination of its cleavage sites // J. Virol. 1997. -Vol.71.-P.1814-1820.

75. Liu D.X., Brown T.D. Characterization and mutational analysis of an

76. MacNaughton M.R., Davies H.A., Nermut M.V. Ribonucleoprotein-like structures from coronavirus particles // J. Gen. Virol. 1978. - Vol.39. -P.545-549.

77. MacNaughton M.R., Madge M.H. The polypeptide composition of avian infectious bronchitis virus particles //Arch. Virol. 1977. - Vol.55. - P.47-54.

78. Mallet F., Oriol G., Mary C. et al. Continuous RT-PCR using AMV-RT and Taq DNA polymerase. Characterization and comparison to uncoupled procedures // BioTechniques. 1995. - Vol.18. - P.678-687.

79. Mallucci L. Effect of chloroquine on lysosomes and on growth of mouse hepatitis virus (MHV-3)//Virology. 1966. - Vol.28. - P.355-362.

80. Meulemans G., Carlier M.C., Gonze M. et al. Incidence, characterization and prophylaxis of nephropathogenic avian infectious bronchitis viruses //

81. Yet. Rec. 1987. - Vol.120. - P.205-206.

82. Mockett A.P., Cavanagh D., Brown T. D. Monoclonal antibodies to the SI spike and membrane proteins of avian infectious bronchitis coronavirus strain Massachusetts M41 //J. Gen. Virol. 1984. - Vol.65. - P.2281-2286.

83. Moore K.M., Jackwood M.W., Hilt D.A. Identification of amino acids involved in a serotype and neutralization specific epitope within the SI subunit of avian infectious bronchitis virus // Arch. Virol. 1997. - Vol.142. -P.2249-2256.

84. A;|f L.F., Liu D.X. Identification of a 24-kDa polypeptide processed from the coronavirus infectious bronchitis virus la polyprotein by the 3C-like proteinase and determination of its cleavage sites // Virology. 1998. -Vol.243. - P.388-395.

85. Niemann H., Boscher B., Evans D. et al. Post-translational glycosylation of coronavirus glycoprotein El: Inhibition by monensin // EMBO J. 1982. -Vol.1. - P. 1499-1504.

86. Niesters H.G. Molecular epidemiology of infectious bronchitis virus // Thesis. Utrecht. - 1987.

87. Niesters H.G., Bleumink-Pluym N.M., Osterhaus A.D. et al. Epitopes on the peplomer protein of infectious bronchitis virus strain M41 as defined by monoclonal antibodies //Virology. 1987. - Vol.161. - P.511-519.

88. Niestevs H.G., Lenstra J.A., Spaan W.J. et al. The peplomer protein sequence of the M41 strain of coronavirus IBV and its comparison with Beaudette strains //Virus Res. 1986. - Vol.5. - P.253-263.

89. Otsuki K.H., Huggins M.B., Cook J.K. Comparison of the susceptibility to avian infectious bronchitis virus infection of two inbred lines of White Leghorn chickens // Avian Pathol. 1990. - Vol.3. - P.467-475.

90. Otsuki K.H., Yamamoto N., Tsuborura M. Studies on avian infectious bronchitis virus (IBV) 1.Resistance of IBV to chemical and physical treatments //Arch. Virol. 1979. - Vol.60. - P.25-32.

91. Pan- R.L., Collisson E.W. Epitopes on the spike protein of a nephropathogenic strain of infectious bronchitis virus // Arch. Virol. 1993. -Vol.133. -P.369-383.

92. Parsons D., Ellis M.M., Cavanagh D., Cook J.K. Characterization of an infectious bronchitis virus isolated from vaccinated broiler breeder flocks // Vet. Rec. 1992. - Vol.131. - P.408-411.

93. Picault J.P., Bennejean G., Drouin P. A new pathogenic avian infectious bronchitis virus isolated in France // In: Curent topics in vet. med. and animal science. 1986. - P. 122-127.

94. Raggi L.G., Gomes L. Two new isolants of infectious bronchitis virus with polyvalent immunogenicity // Avian Dis. 1975. - Vol.19. - P.323-328.

95. Rottier P. J., Welling G. W., Welling Wester S et. al. Predicted membrane topology of the coronavirus protein El. // Biochemistry. 1986. - Vol. 25. -P. 1335-1339.

96. Schmidt M.F. Acylation of viral spike glycoproteins, a feature of enveloped RNA viruses // Virology. 1982. - Vol.116. - P.327-338.

97. Siddell S.G., Wege H., ter Meiden V. The biology of coronaviruses // J. Gen. Virol. 1983. - Vol.64. -P.761-776.

98. Smith A.R., Bouvsnell M.E., Binns M.M. et al. Identification of a new membrane-asociated polypeptide specified by the Coronavirus infectious bronchitis virus // J. Gen. Virol. 1990. - Vol.71. - P.3-11.

99. Smith H.W., Cook J.K., ParsellZ.E. The experimental infection of chikens with mixtures of infectious bronchitis virus and E. coli // J. Gen. Virol. -1985. Vol. 66. - P. 777-786.

100. Snijder E.J., Den Boon J.A., Horzinek M.C. et al. Comparison of the genome organization of Toro- and Coronaviruses: Evidence for two nonhomologous RNA recombination events during Berne virus evolution // Virology. 1991. - Vol. 180. - P. 448-452.

101. Song C.S., Kim J.H., Lee Y.J. et al. Detection and classification of infectious bronchitis viruses isolated in Korea by dot-immunoblotting assay using monoclonal antibodies //Avian Dis. 1998. - Vol.42. - P.92-100.

102. Spaan W., Delins H., Skinner M. et al. Coronavirus raRNA synthesis involves fusion of noncontiguous sequences I I EMBO J. 1983. - Vol.2 -P. 1839-1844.

103. Spackman D., Cameron I.R. Isolation of infectious bronchitis virus from pheasants // Vet. Rec. 1983. - Vol.113. - P.354-355.

104. Stern D.F., Kennedy S.I. Coronavirus multiplication strategy. I. Identification and characterization of virus specified RNA // J. Virol. 1980. - Vol.34. - P.665-674.

105. Stern D.F., Sefton B.M. Coronavirus proteins: Biogenesis of avian infectious bronchitis virus virion proteins // J. Virol. 1982. - Vol.44. -P.794-803.

106. St em D.F., Sefton B.M. Coronavirus proteins: Structure and functions of the oligosacharides of the avian infectious bronchitis virus glycoproteins I I J. Virol. 1982. - Vol.44. - P.804-812.

107. Strauss E.G., Strauss J.H. Replication strategies of the single stranded RNA viruses of eukaryotes // Curr. Topics. Microbiol. Immunol. 1983. Vol.105. - P. 1-98.

108. Stui'man L.S., Holmes K.V. Characterization of a coronavirus. II. Glycoproteins of the viral envelope: Tryptic peptide analysis // Virology. -1977. Vol. 77. - P. 650-660.

109. Sturman L.S., Holmes K.V. The molecular biology of coronaviruses // Adv. Virus Res. 1983. - Vol.28. - P.35-112.

110. Tompley F. M., Mockett A. P., Boursnell M. E. et al. Expression of theinfectious bronchitis virus spike protein by recombinant Vaccinia virus and induction of neutralizing antibodies in vaccinated mice // J. Gen Virol. -1987. Vol. 68. - P. 2291-2298.

111. П 4.Ту t-ell D.A., Almeida J.D., Berry D.M. et ah Coronaviruses 11 Nature. -1968. Vol.220. -P.650.

112. Van Roekel H., Clarke M.K., Bullis K.L. et al. Infectious bronchitis // Am. J. Vet. Res. 1951. - Vol.12. - P. 140-146.

113. ПS.Wang C.-H., Hsieh M.C., Chang P.-C. Isolation, pathogenicity and HI20 protection efficacy of infectious bronchitis viruses isolated in Taiwan // Avian Dis. 1996. - Vol.40. - P.620-625.

114. Wang H.N., Wu Q.Z., HuangY. et al. Isolation and identification of infectious bronchitis virus from chickens in Sichuan, China // Avian Dis. -1997. -Vol.41. -P.279-282.

115. Wang L., Parr R.L., King D.J. et al. A higly conserved epitope on the spike protein of infectious bronchitis virus // Arch. Virol. 1995. - Vol.140. -P.2201-2213.

116. Wang L., Junker D., Collisson E.W. Evidence of natural recombination within the SI gene of infectious bronchitis virus // Virology. 1993.• Vol.192.-P. 710-716.

117. Wang L., Junker D., Hock L. Evolutionary implications of genetic variations in the SI gene of infectious bronchitis virus 11 Virus Res. 1994. -Vol.34. - P.327-338.

118. Wege H., Siddell S., V. ter Meulen The biology and pathogenesis of coronaviruses. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1982. - Vol.99. - P. 165200.

119. Williams A.K., Wang L., Sneed L.W. et al. Analyses of hypervariable region in the 3' non-coding end of the infectious bronchitis virus genome // Virus Res. 1993. - Vol.28. - P. 19-27.

120. Wint erfield R.W., Hitchner S.B. Etiology of an infectious nephritis-nephrosis syndrome of chickens // Am. J. Vet. Res. 1962. - Vol.23. -P. 1273-1279.

121. Wint erfield R.W., Hitchner S.B., Appleton G.S. Immunological characteristics of a variant of infectious bronchitis virus isolated from chickens // Avian Dis. 1964. - Vol.8. - P.40-47.

122. Yagyu K., Ohta S. Detection of infectious bronchitis virus antigen from experimentally infected chickens by indirect immunofluorescent assay with monoclonal antibody //Avian Dis. 1990. - Vol.34. -P.246-252.

123. Zwaagstra K.A., Van der Zeijst B.A., Kusters J.G. Rapid detection and identification of avian infectious bronchitis virus // J. Clin. Microbiol. -1992. Vol.30. -P.79-84.4 Я 6