Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Гудов, Владимир Петрович

• Гудов, Владимир Петрович
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гудов, Владимир Петрович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Генетически модифицированные организмы.

1.1.1. Обоснование необходимости создания трансгенных растений.

1.1.2. Проблемы использования ГМ-продукции.

1.1.3. Актуальность диагностики трансгенных культур.

1.1.4. Методы обнаружения ГМО.

1.2. Полимеразная цепная реакция.

1.2.1. Принцип метода полимеразной цепной реакции.

1.2.1.1. Компонентная база.

1.2.1.2. Циклический температурный режим.

1.2.1.3. Эффект "плато".

1.2.2. Амплификация.

1.2.3. Оценка результатов реакции.

1.2.3.1. Метод горизонтального электрофореза.

1.2.3.2. Метод гибридизационных зондов.

1.2.3.3. Метод ПЦР в реальном масштабе времени.

1.2.3.4. Химические реагенты, необходимые для обеспечения проведения ПЦР в реальном времени.

1.2.3.5. Неспецифическое детектирование.

1.2.3.6. Специфическое детектирование.

1.2.3.7. Зонд (Scorpion probe), имеющий праймерную часть вместе с системой FRET.

1.2.3.8. Молекулярные маяки (Molecular Beacon probes™).

1.2.3.9. Линейные зонды, содержащие два красителя (TaqMan™).

1.2.4. Понятие порогового цикла.

1.2.5. Полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени.

1.2.6. Приборы для ПЦР в реальном времени.

1.3. Люминофоры, теория флуоресценции.

1.3.1. Важнейшие характеристики люминесцентных веществ.

1.3.2. Возбужденные состояния молекул.

1.3.3. Пути дезактивации возбужденного состояния. Сенсибилизация и тушение флуоресценции.

1.3.4. Ксантеновые флуоресцентные красители.

1.3.4.1. Строение и свойства

1.3.4.2. Разнообразие ксантеновых красителей.

1.3.5. Системы с переносом энергии (ШЕТ системы).

1.3.5.1. Гасители флуоресценции.

1.3.5.2. Сравнение механизмов переноса энергии от донора к акцептору флуоресценции

Глава 2. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Синтез компонентов для создания флуоресцентных зондов.

2.1.1. Синтез флуоресцентных красителей.

2.1.2. Синтез активированных сукцинимидных эфиров флуоресцентных красителей

2.1.3. Синтез молекул прекурсоров на основе флуоресцентных красителей для иммобилизации их на СРО.

2.1.4. Синтез гасителя флуоресценции ВНС>-1 и его фосфорамидита.

2.2. Решение уравнения Форстера.

2.2.1. Теоретическая база.

2.2.2. Преобразование и решение модифицированного уравнения Форстера

2.3. Проверка теоретических результатов, на практике, методом ПЦР в реальном масштабе времени.

2.3.1. ПЦР в реальном масштабе времени и анализ результатов.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и приборная часть.

3.2. Общие методики.

3.2.1. Приготовление растворителей.

3.2.2. Определение концентрации олигонуклеотидов и зондов.

3.3. Синтез ксантеновых флуоресцентных красителей и их активированных производных.

3.3.1. Синтез 8-гндроксиюлолидина (26) из 3-аминофенола.

3.3.2. Синтез 5'-карбокси-Х-родам1ша (6 а,б).

3.3.3. Синтез 14,>Г-тетраметил-5'(6')-карбоксиродамина (7 а,б)

3.3.4. Синтез 5'(6')-карбокси-6С-родамина (8 а,б).

3.3.4.1. Получение Ы,Ы'-дитрифторацетил-5'(6')-карбокси-60-родамина (5(6)

Кбв, Т£а) (8 в,г).

3.3.5. Синтез 5'(6')-карбоксифлуоресцеина (9 а,б).

3.3.5.1. Синтез 0,0'-дипивалата-5'(6')-карбоксифлуоресцеина (0,0'-Рп?-5(6)

БАМ) (9 в,г).

3.3.6. Сукцинимидный эфир 0,0'-дипивалата-5'-карбоксифлуоресцеина (13 б)

3.3.7. Сукцинимидный эфир Ы,1чГ'-тетраметил-5'-карбоксиродамииа (11 б)

3.3.8. Сукцинимидный эфир М,Ы'-дифторацетил-Ы,Ы'-диэтил-2,7-диметил-5'-карбоксиродамина (12 6).

3.3.9. Сукцинимидный эфир 5'-карбоксиродамина X (10 б).

3.3.10 0,0'-<ШЧу-5-РАМ, АРОМТг 3-(3'-0-диметокситритил-(пропа11-2,,3'диол))-пропиламнд 0,0'-дипивалоил-5'-карбоксифлуоресцеина (22)

3.3.11. 5-ТАМЯА, АРОМТг 3-(3'-0-диметокснтритил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламид К,№-тетраметил~5'-карбоксиродамина (23).

3.3.12. 5-Ы6С, ТБА APDM.Tr 3-(3'-0-диметокситритил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламид Ы,Ы'-дифторацетил-К,К'-диэтил-2,7-диметил-5'-карбоксирод амина (24).

3.3.13. 5-1ЮХ, АРОМТг 3-(3'-0-диметокситритил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламид 5'-карбоксиродамина X (25).

3.3.14. 3-(3'-0-Диметокситритнл-2'-0-сукцинил-(пропан-2',3'-диол))-пропи-ламида 0,0'-днпивалоил-5'-карбоксифлуоресцеина (26).

3.3.15. 3-(3'-0-Диметокситритил-2'-0-сукцинил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламида 1чГ,М'-тетраметил-5'-карбоксиродамина (27).

3.3.16. 3 -(3 '-О-Диметокситритил-2 '-0-сукцинил-(пропан-2' ,3 ,-диол))-пропи-ламида К,№-дифторацетил-^М'-диэтил-2,7-диметил-5'-карбоксирода-мина (28).

3.3.17. 3-(3 '-О-Диметокситритил-2' -0-сукцинил-(пропан-2' ,3 ,-диол))-пропиламида 5'-карбоксиродамина X (29).

3.4. Синтез гасителя флуоресценции ВН(2-1 и его активированного производного

3.4.1. Синтез 4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-4',-(ЫД<Г'-дигидроксиэтил)-5'-метилазобензола (ВНС>-1) (36).

3.4.2. Синтез монотритил производного ВНС>-1 - (4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-5'-метилазобензил-4м-(^етил-2-0-(4,4'-диметокситритил))-М-этан-2-ола (37).

3.4.3. Синтез монотритил производного ВН<3-1 фосфорамидита - (4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-5'-метилазобензил-4"-(М-етил-2-0-(4,4'-диме-токситритил))-Ы- 2-цианоэтил-(ЪГ^,-диизопропил)-фосфорамидита (39)

3.5. Синтез и очистка зондов.

3.6. ПЦР в масштабе реального времени.

3.7. Расчет эффективности работы зондов для ПЦР-РВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени»

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка диагностических наборов реагентов для выявления генетически модифицированных источников (ГМИ) в семенном материале, кормах животных, пищевых продуктах лекарственном сырье и т.д. Принцип работы современных приборов для анализа ДНК базируются на количественном определении ДНК, используя метод ПЦР в реальном масштабе времени. Зарубежные приборы и реактивы для них, разработанные для осуществления данной методологии достаточно дороги. В настоящее время созданы отечественные аналоги приборной и реагентной базы; доступные по ценовым и качественным характеристикам, для лабораторий, проводящих массовые исследования.

Для тестирования трансгенных растений применяют те же жесткие стандарты по параметрам токсичности и аллергенности, что и для традиционных новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания.

В настоящий момент невозможно полностью исключить ошибки в сертификации генетически модифицированных растений (ГМР). Продукты, полученные с использованием ГМР, по международным нормам и согласно санитарным нормам РФ должны нести на себе информацию в виде маркировки, из которой явно следовало бы, что продукт был получен из генетически модифицированных организмов. Пищевой продукт маркируется соответствующим образом, если соотношение трансгенного продукта к генетически немо-дифицированному более 0,9% .

Особую актуальность приобретают проблемы идентификация и оценки количественного содержания модифицированной ДНК пищевых продуктов, полученных из ГМР. Для выполнения этой задачи необходимо создание простой, воспроизводимой и доступной широкому кругу лабораторий, систему диагностики трансгенных растений и продуктов питания.

На сегодняшний день существует два основных подхода, которые позволили бы решить вышепоставленную задачу.

1 - Иммуноферментный анализ.

Данный метод использует специфичность антител к интересующему белковому материалу, содержащемуся в ГМР. Он показывает наличие и количество белка в исследуемой пробе с высокой специфичностью.

Основным недостатком является невозможность тестирования белков в образцах, прошедших термическую и биохимическую обработку.

2 - метод ПЦР.

Предпосылкой для ГМО детекции является наличие информации о типе генетической модификации, последовательность нуклеотидов введенного гена и регуляторных элементах (промотор и терминатор). Для анализа необходимы микроколичества исследуемого образца, содержащего ДНК материал, включающий целевой ДНК фрагмент. Генетический материал остается стабильным.

Достоинствами ПЦР диагностики является:

1. Высокая чувствительность, способность детектировать от одной до нескольких у копий искомого гена в рамках генетического материала организма или в смесях пищевых продуктов.

2. Меньшее время, затрачиваемое на производство реагентов для анализа

3. ПЦР-диагпостика способна различить несколько различных вариантов генетической модификации в геноме трансгенного растения, тем самым повышая точность анализа.

4. Генетичесий материал не претерпевает качественных изменений в процессе превращения трансгенного растения в продукт, употребляемый в пищу. Тогда как белок, как мишень анализа менее устойчив, что может привести к недостоверным результатам анализа

Целью данной работы являлось создание методологической и компонентной базы, а также оригинальных схем синтеза флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции, разработка подхода для эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.

Задачи данного исследования:

1. Синтез флуоресцентных зондов для ПЦР в реальном времени на основе собственной оригинальной методологической с варьированием длины олигонуклеотидной части и взаимном расположении флуорофора и гасителя флуоресценции;

2. Проверка синтезированных зондов на объекте растительного происхождения, с целью определения в нем ЫОЗ-терминатора - широко распространенного маркера генетически модифицированных растений;

3. Формирование критериев и математического аппарата планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени;

4. Проведение математического расчета Фостеровского радиуса, оптимального с точки зрения используемой системы.

В результате выполненной работы впервые была создана отечественная методологическая база для получения наборов реагентов для осуществления ПЦР в реальном масштабе времени. Созданы оригинальные схемы синтеза и очистки флуоресцентных красителей ксантенового ряда, гасителей флуоресценции их активированных производных с целью получения зондов для ПЦР-РВ. Это позволит получить новый ПЦР-диагностикум, для обнаружения различных смысловых ДНК-фрагментов в генах растений, что дает основание для дальнейших исследований в данной области с целью создания новых наборов, или их модификации с целью дальнейшей оптимизации и адаптации под новые задачи.

Научная новизна заключается в проверке теоретического подхода для планирования флуоресцентных зондов, основанного на эффекте Форстера с правками, учитывающих вероятностную пространственную ориентацию красителя и гасителя молекул флуоресценции, задача подобного плана была поставлена и осуществлена впервые.

На практике данные наборы позволят в лабораторных условиях с высокой степенью точности и надежности исследовать растения и продукты питания на предмет генетической модификации, что позволит их идентифицировать как трансгенные.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гудов, Владимир Петрович

Выводы

1. Разработаны оригинальные схемы синтеза и очистки флуоресцентных красителей (ЯОХ, ТАМИЛ, ЯбО) и их активированных производных, меченных ими зондов. Был предложен новый математический подход для планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.

2. Предложен доступный и универсальный метод расчета величины Форстеров-ского радиуса для любых линейных зондов. Обнаружена корреляция между значениями связанных с расчетом величины Е, эффективностью работы системы с переносом энергии по Форстеру, и величины флуоресцентного сигнала, полученного в результате протекания ПЦР в реальном масштабе времени.

3. Разработан алгоритм расчета Форстеровского радиуса для систем зондов с флуорофором - БАМ и гасителями флуоресценции ВН<3-1 и КТС>-1 с помощью программной среды для математических вычислений — МАТЬАВ.

4. Подтверждена эффективность математического подхода планирования зондов для ПЦР-РВ. На практике данный подход позволит в лабораторных условиях с высокой степенью точности и надежности планировать зонды для ПЦР-РВ для решения различных диагностических задач.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гудов, Владимир Петрович, 2009 год

1. Conner A.J, Jacobs J.M. "Genetic engineering of crops as potential source of genetic hazard in the human diet". // Mutat Res. 1999, Jul 15, 443(1-2), pp. 223-234.

2. Hammond J. "Overview: the many uses and applications of transgenic plants". // Сип-Тор Microbiol Immunol. 1999, 240, pp. 1-19.

3. Гончаров Ю.Л. «Общие положения опытов в оценке биобезопасности трансгенных растений» Серия "Генетическая инженерия и экология". // М.: Центр "Биоинженерия" РАН, 2001. Т.2. с. 120.

4. Vaitilingom М., Pijnenburg Н., Gendre F., Brignon P. «Real-time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready soybean in some representative foods». //J. Agric. Food Chem. 1999, Dec, 47(12), pp. 5261-5266.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. // Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. с. 589.

6. Маниатис Т. "Молекулярное клонирование". //М.: Мир, 1984.

7. Holland P., Abrainson R.D., Watson R. and Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction products by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of thermos acuaticus. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1991, Vol.88, pp. 7276-7280.

8. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. // Analytycal Biocliemistry.-1999. -№273,- p. 221-228.

9. Tyagi S., Marras A.E., and Kramer F.R., Wavelength-shifted molecular beacons. // Nature Biotechnology, 2000, Vol.18, pp.1191-1196.

10. Nasarabadi S., Milanovich F., Richards J. and Belgrader P. Simultaneous detection of TaqMan probes containing FAM and TAMRA reporter fluorophores. // BioTechniques, 1999, Vol.27 (6), pp. 1116-1117.

11. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. //Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030.

12. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. // Analytycal Biochemistry.-1999.-№273,- p. 221-228.

13. Berlman B. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules. // N. Y. — London, Academic Press, 1965, p. 258.

14. Нурмухамстов P. И. Поглощение и люминесценция ароматических соединений. М„ Химия, 1971.216 с.

15. Эльдерфильд Р. ред., Гетероциклические соединения, том 2. // Издатинлит, Москва, 1954 г.

16. Forster Т. Fluoreszenz organischer Verbindungen. Gottingen,Vandenhoeck Ruprecht, 1951.320 с.

17. Теренин A. H. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. JL, Наука, 1967. 616 с.

18. Berlman I. В. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules. N. Y. — London, Academic Press, 1965. 258 p.

19. Снагощенко JI. П., Богданова JI. И., Григорьева В. И. — В кн.: Сцинтилляторы и органические люминофоры. Харьков, ВНИИ монокристаллов, 1973, вып. 2, с. 9—15.

20. Chardonncrs, Schlapbach, // Hoiv. Chim. Acta, 1940, V. 29, p 1413.

21. Мигге1 J. N. The Theory of the Electronic Spectra of Organic Moleculs. London, Chapman a. Hall, Ltd., 1971. 328 p.

22. Wilkinson F. Advances in Photochemistry. — N. Y. etc., 1964, v. 3, p. 241—263.

23. Vencataraman V. The chemistry of synthetic dyes .: N.Y. — London, Academic Press, 1971. p. 1441.

24. Mitchell R.H. A novel reaction of a-chlorosulfides. A new synthesis of diarylethyl-enes (stilbenes) // Tetrahedron Lett., 1973, № 44, p. 4395-4398.

25. Pete Theisen, Christie McCullum, Krishna Upadhya, Karen Jacobson, Huynb Vu, Alex Andrus Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides // Tetrahedron Letters, Volume 33, Issue 35, 25 August 1992, pp. 5033-5036

26. J. Woodland Hastings Bioluminescence : Cell Physiology Source Book (Third Edition), 2001, Pages 1115-1131.

27. Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. // Ann. Phys. (Leipzig) 1948, 2:55-75.

28. Auzel F.E. // Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758.

29. Dietrich et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and competing processes in donor-acceptor substituted DNA strands: a comparative study of ensemble and single-molecule data. // Reviews in Molecular Biotechnology, 1996, vol. 82, p 221-231.

30. Dale, R. E., J. Eisinger and W. E. Blumberg. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. // Biophys. J. 1979 26:161-93.

31. Van der Meer, B. W., G. Coker and S. Y. S. Chen. Resonance energy transfer : theory and data. // 1994, New York: Vch. x, 177 p.

32. Blasse G. // Materials Chemistry and Physics 1987, 16, 201.

33. Dexter D.L.// Journal of Chemical Physics 1953,21,836.

34. Inokuti M., Hirayama F. // Journal of Chemical Physics 1965, 43, 1978.

35. Lois M. Geren and Francis Millett // J. of biochemistry, 1981, Vol. 256. No. 20, Issue of October 25, pp. 10485-10489.

36. Сергиеико А., Цифровая обработка сигналов. // Санкт-Петербург, изд. Питер. 2002.

37. Мэтьюз Д., и Финк К. Численные методы. Использование MATLAB. // Вильяме, Москва 2001.

38. Дьяконов В., Абраменкова И. MATLAB. Обработка сигналов и изображений. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2002.

39. Дьяконов В., Вейвлеты. От теории к практике. // Солон-Р, Москва 2002.

40. Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Анисимова О.В. Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полиме-разной цепной реакции. // Методические указания МУК 4.2. 1902 -04. Минздрав России. Москва 2004.

41. Steven A. Kates, Femando Albericio Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide / Marcel Dekker Inc., USA, New York, 2000, p. 475-529.

42. Förster T., Fluoreszenz organischer Verbindungen. // Göttingen, Vandenhoeck Ruprecht, 1951.320 S.

43. Гинцбург A.JT., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 123-124.

44. Степанов Б.И. В кн.: Волысенштейн М.В. Строение и физические свойства молекул. // М.-Л., Изд-во АН СССР. 1955, с. 560-576, 579-581.

45. Терепин А. И. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. // Л., Наука, 1967. 616 с. 7.

46. Чен К., Джиблин П., Ирвинг A. MATLAB в математических исследованиях. // Мир, Москва 2001.

47. Ануфриев И., Самоучитель MatLab 5.3/б.х. // Санкт-Петербург, 2002.

48. Божевольнов Е. А. Люминесцентный анализ. // М., Химия, 1966. 415 с.

49. Вест В. Применение спектроскопии в химии. // М., Издатинлит, 1959. 659 с. 5.

50. Мартынов Н., Введение в MATLAB 6. // Кудиц-образ, Москва 2002.

51. Гультяев А., MATLAB 5.3. Имитационное моделирование в среде Windows. // Корона принт, Москва 2001.

52. Данилов А. Компьютерный практикум по курсу "Теория управления". Simulink-моделнрование в среде Matlab. // МГУИЭ, Москва 2002.58. Директива ЕС 1430/94/ЕС.

53. Дьяконов В. Компьютерная математика. Теория и практика. // Нолидж, Москва 2000.60. Директива ЕС 89/622/ЕС.61. Директива ЕС 90/425/ЕС.

54. Haughland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. // Molecular Probes, Eugene , OR, 1992.

55. Медведев В., Потемкин В. Нейронные сети. MATLAB 6. // Диалог-МИФИ. Москва 2002.

56. Дьяконов В. MATLAB: Учебный курс. // Санкт-Петербург, изд. Питер, 2000.

57. Haughland, R.P., Wise D.L., and Wingard D. Biosensors with Fiberoptics. // Humana Press, Clifton, NJ 1991, p. 85 -109.

58. Heid С.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

59. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

60. Глушаков C.B., Жакин И.А., Хачиров Т.С. Математическое моделирование. Mathcad 2000. Matlab 5.3. // ACT., 2001.

61. Гультяев А. MATLAB 5.2. Имитационное моделирование в среде Windows. // Корона принт, Москва 1999.

62. Lakowicz, J. R. Energy Transfer. // Principles of Fluorescence Spectrosopy. 2nd ed. Plenum, New York. 1999, 367-394.

63. Дорф P., Бишоп P., Современные системы управления. // Перевод с английского. Лаборатория базовых знаний, Москва 2002.

64. Дьяконов В. MATLAB 6: Учебный курс. // Санкт-Петербург, изд. Питер, 2001.

65. Дьяконов В., Абраменкова И., Круглов В. MATLAB с пакетами расширений. // Нолидж, Москва 2001.

66. Wolfenbarger LL, Phifer PR."The ecological risks and benefits of genetically engineered plants". // Science. 2000, Dec 15; 290(5499), pp.2088-2093.

67. Дьяконов В., Круглов В. Математические пакеты расширения MATLAB. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2001.

68. Дьяконов В., Круглов В., MATLAB. Анализ, идентификация и моделирование систем. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2001.

69. Кондратов В., Королев С., Matlab как система программирования научно-технических расчетов. // Мир., Москва 2002.

70. Дьяконов В. Simulink 4. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2001.

71. Королев A.A. «Медико-биологическая оценка качества и безопасности генетически модифицированных источников пищи» Серия "Генетическая инженерия и экология". // М.: Центр "Биоинженерия" РАН, 2001. Т.2. с. 165.

72. Круглов В., Дли М., Голунов Р. Нечеткая логика и искусственные нейронные сети. // Физматлит, Москва 2001.

73. Левенко Б.А.'Ъиотехнология растений: сегодня и завтра" // Физиология и биохимия культурных растений, 1999, т. 31, № 3, с. 163-172.

74. Потемкин В. Система Matlab 5 для студентов. // Диалог-МИФИ, Москва. 1998.

75. Мартынов Н., Иванов A. Matlab 5.x. Вычисления, визуализация, программирование. // Кудиц-образ, Москва 2000.

76. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., Петухов A.PL, Королев А.А., Аксюк II.Н., Сорокина Е.Ю. «Современные подходы к оценке безопасности генетически модифицированных источников пищи. Опыт изучения соевых бобов линии 40-3-2» // Вопросы питания, Москва 1999.

77. Патрушев JI. И. Искусственные генетические системы. // М.: Наука, 2005, 2 т. pp. 458-486.

78. Потемкин В. Введение в MATLAB. // Диалог-МИФИ, Москва 2000.

79. Orndorff, Purdy // J. Am. Chem, Soc. 48, 2212 (1926).

80. Owens, M.A., Loken M.R. Flow Cytometry: Principles for Clinical Laboratory Practice // Wiley-Liss, New York, 1995, pp. 28-29.

81. Rogers S.O. & Bendich A.J. «Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues». // Plant Molecular Biology. 1985, 5, pp. 69-76.

82. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. // BioTechniques.-1995.-№ 13.- p.444-449.

83. Потемкин В. Инструментальные средства Matlab 5.x. // Диалог-МИФИ, Москва 2000.

84. Потемкин В. Система MATLAB. Справочное пособие. // Диалог-МИФИ, Москва 1997.

85. Потемкин В. Система инженерных и научных расчетов MATLAB 5.x (в 2-х томах). //Диалог-МИФИ, Москва 1999.

86. Романов Г.А. "Генетическая инженерия растений и пути решения биобезопасности" // Физиология растений, 2000, т. 47, № 3, с. 343-353.

87. Рудаков П., Сафонов В. Обработка сигналов и изображений Matlab 5.x. // Диалог-МИФИ, Москва 2000.

88. Wei-Chuan Sun, Kyle R. Gee, Dieter H. Klaubert and Richard P. Haugland. J. Synthesis of fluorinated fluoresceins. // Org. Chem., 1997, 62, pp. 6469-6475.

89. Wilkinson F. — In; Advances in Photochemistry. // N. Y. etc., 1964, v. 3, p. 241— 268.

90. Семененко M., Введение в математическое моделирование. // Солон-Р, Москва 2002.

91. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. // Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004, с. 496.

92. Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. // Москва, Мир 1985.

93. Adamczyk M., Jeffrey R. Fishpaugh and Kevin J. Heuser. Preparation of suc-cinimidyl and pentafluorophenyl active esters of 5- and 6-carboxyfluoresccin. // Bioconjugate Chem., 1997, 8, pp. 253-255.

94. Bodanszky, M. The Peptides. // Academic Press, New York, 1979, Vol. 1, pp. 106175.

95. Bright F.V. Bioanalytical Applications of Fluorescence Spectroscopy. // Anal. Chem. 1998, 60, 1031A-1039A.

96. Clegg ct al. Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer. // PNAS vol. 90, 1993, pp.2994 2998

97. Clegg, R. M. Fluorescence Resonance Energy Transfer. // Fluorescence imaging spectroscopy and microscopy. X.F. Wang, B. Herman, editors. John Wiley, New York. 1996, 179-252.

98. Edwards K, Johnstone C, Thompson C. "A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis". // Nucleic Acids Res. 1991, Mar 25, 19(6), pp. 1349.

99. Gressel J. "Molecular biology of weed control". // Transgenic Res. 2000, 9(4-5), pp.355-382.

100. Lee D.K., Seok S.J., Jang I.C., Nahm B.H., Kim J.K. «Triprimer-PCR method: rapid and reliable detection of transgenes in transgenic rice plants». // Mol Cells. 1998, Feb 28, 8(1), pp. 101-106.113. Директива 2000/418/EG.

101. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. // 1978, Annu. Rev. Biochem. 47:819-846.115. Директива 2000/766/EG.116. Директива EC 06/23/EC.

102. Lin J.J., Fleming R., Kuo J., Matthews B.F., Saunders J.A. "Detection of plant genes using a rapid, nonorganic DNA purification method". // Biotechniques. 2000, Feb, 28(2), pp.

103. Murrel J. N., The Theory of the Electronic Spectra of Organic Moleculs. // London, Chapman a. Hall, Ltd., 1971. p. 328.

104. Мартынов H., Иванов A. Matlab 5.x. Пособие по программированию в системе MATLAB. // МГУ, Москва 2000.

105. Андриевский Б., Фрадков А. Элементы математического моделирования в программных средах MATLAB 5 и Scilab. // Наука. 2001.

106. Tyagi S., and Kramer F.R., Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. // 1996 Nature Biotechnology Vol.14, pp. 303-308.346.350.