Разработка методов контроля качества и стандартизации экзосом для целей генетического редактирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Пономарева Наталья Игоревна

• Пономарева Наталья Игоревна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Пономарева Наталья Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экзосомы как системы доставки лекарственных соединений

1.1.1. Природа, физические свойства и состав экзосом, экзосомоподобных и гибридных наночастиц

1.1.2. Способы получения и методы очистки

1.1.3. Потенциал применения экзосом в медицине и фармации

1.2. Системы генетического редактирования CRISPR/Cas в разработке лекарственных средств

1.2.1. Функционирование систем CRISPR/Cas

1.2.2. CRISPR/Cas-системы: практическое применение в медицине

1.2.3. Современные системы упаковки и доставки CRISPR/Cas систем in vivo

1.2.4. Создание целевых систем доставки карго на основе экзосом

1.3. Методы контроля качества биологических наночастиц для доставки лекарственных средств

1.3.1. Физические методы анализа

1.3.2. Методы анализа содержимого биологических наночастиц

1.4. Анализ биологической активности и безопасности биологических препаратов

1.5. Проблемы лечения хронической инфекции вирусом гепатита В: терапевтические

решения и препараты

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культивирование клеток человека

2.2. Трансфекция клеток человека

2.3. Получение экзосом

2.4. Производство экзосомоподобных наночастиц

2.5. Получение гибридных наночастиц

2.6. Получение РНК-кодирующих ПЦР-продуктов

2.7. In vitro транскрипция

2.8. Упаковка систем СRISPR/Сas9 в экзосомы

2.9. Просвечивающая криоэлектронная микроскопия

2.10. Метод динамического светорассеяния

2.11. Анализ траектории движения наночастиц

2.12. Выделение нуклеиновых кислот из клеток

2.13. Выделение РНК из наночастиц

2.14. Выделение белка из наночастиц и оценка высвобождения

2.15. Рамановская спектроскопия с поверхностным усилением

2.16. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

2.17. Метод анализа на бицинхониновую кислоту для измерения концентрации общего

белка

2.18. Флуориметрия для оценки количества липидов

2.19. Дот-блот

2.20. Вестерн-блот анализ целевых белков экзосом

2.21. Метод оценки токсичности in vitro

2.22. Оценка биологической активности in vivo

2.23. Иммуноферментный анализ

2.24. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.25. Оценка эндолизосомального выхода

2.26. Статистический анализ

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ И ОЦЕНКА ОСНОВНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК

3.1. Получение и очистка биологических наночастиц

3.2. Оценка основных физических характеристик наночастиц

3.2.1. Оценка морфологии

3.2.2. Определение среднего размера, заряда и распределения частиц по размеру

3.3. Оценка основных белковых маркеров

3.4. Оценка соотношения количества общих липидов к белку

3.5. Анализ биохимического состава наночастиц с помощью Рамановской спектроскопии

с поверхностным усилением

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 4. СОЗДАНИЕ МЕТОДИК ДЛЯ ОЦЕНКИ СОДЕРЖИМОГО БИОЛОГИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ

4.1. Создание методики для анализа РНК из биологических наночастиц

4.2. Количественное определение упакованного РНК-проводника с помощью ПЦР-РВ

4.3. Создание методики анализа белка из биологических наночастиц

4.4. Количественное определение упакованного белка Cas с помощью дот-блота

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 5. ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА ДЛЯ НАНОЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩИХ СИСТЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ, НА ЭТАПЕ РАЗРАБОТКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО

СРЕДСТВА

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ ЭНДОЛИЗОСОМАЛЬНОГО ВЫХОДА НАНОЧАСТИЦ

6.1. Определение влияния pH на размер и заряд наночастиц

6.2. Оценка высвобождения содержимого из наночастиц при низких значениях pH

6.3. Анализ эндосомального выхода

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ТОКСИЧНОСТИ НАНОЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩИХ CRISPR/CAS-СИСТЕМЫ

7.1. Определение токсичности биологических наночастиц in vitro

7.2. Оценка биологической активности наночастиц in vitro

7.3. Оценка биологической активности наночастиц in vivo

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов контроля качества и стандартизации экзосом для целей генетического редактирования»

Актуальность темы исследования

В связи со стремительным развитием генетических технологий в медицине, в области фармацевтического анализа возникает острая потребность в разработке подходов к оценке качества геннотерапевтических препаратов. Одним из важных аспектов практического использования систем генетического редактирования является применение искусственных носителей для упаковки и целевой доставки систем генетического редактирования. Следовательно, возникает необходимость в разработке надлежащих физических, физико -химических и биологических методик для фармацевтического анализа как самих инструментов генетического редактирования, так и для систем их упаковки и доставки.

Наиболее перспективными системами генетического редактирования являются инструменты CRISPR/Cas. Адаптация систем CRISPR/Cas для целей генетического редактирования может решить ряд ключевых проблем современной медицины, включая коррекцию генетических мутаций при наследственных заболеваниях, лечение хронических инфекций человека (такие как хронический гепатит В и др.), лечение онкологических заболеваний и др. [102, 149, 170]. В простейшем случае, системы CRISPR/Cas представляют собой комплексы белка-нуклеазы Cas и короткого РНК-проводника, направляющего Cas белок к заданным участкам генома [183]. Вирус гепатита В (ВГВ) - это высококонтагиозный вирус, который инфицирует гепатоциты человека. Хронический гепатит В (ХГВ) вызывается инфекцией ВГВ и является ведущей причиной рака и цирроза печени. Ежегодная смертность от исходов ХГВ составляет около 1 миллиона человек. Современные лекарственные препараты подавляют репликацию ВГВ, но не могут полностью уничтожить вирус в организме человека. Кольцевая ковалентно замкнутая ДНК (ккзДНК) ВГВ, находящаяся в ядрах инфицированных гепатоцитов, является источником вирусной персистенции, вызывая реактивацию вирусной репликации после прекращения лечения противовирусными препаратами. Считается, что уничтожение данной формы генома вируса в инфицированных клетках может привести к полной элиминации ВГВ из инфицированных клеток и излечению ХГВ.

Системы сайт-направленных нуклеаз CRISPR/Cas могут специфично расщеплять и разрушать ккзДНК в клетке. Однако, несмотря на высокую эффективность систем CRISPR/Cas на моделях ВГВ-инфекции in vitro, проблема целевой доставки данных систем генетического редактирования в организм животных и человека на сегодняшний день не решена.

Существуют различные способы доставки CRISPR/Cas, включая использование нанотехнологий. Однако, практическое применение подобных систем затруднено в связи с

низкой эффективностью упаковки комплексов CRISPR/Cas в наночастицы, сложной либо неэффективной целевой доставкой, дорогостоящим производством, а также индукцией токсических и иммунных нежелательных реакций [38, 119]. В свою очередь, биологические наночастицы (экзосомы, экзосомоподобные наночастицы или их гибриды с липосомами) с билипидной мембраной, аналогичной мембранам клеток, эффективно интернализуются в клетки человека, высвобождая свое содержимое - карго (белки, нуклеиновые кислоты). Биологические наночастицы считаются перспективными средствами доставки биомолекул и лекарственных препаратов для лечения различных заболеваний [74, 178].

К уникальным свойствам биологических наночастиц относятся высочайшая биосовместимость, безопасность, отсутствие иммунологических и токсических эффектов, возможность программирования свойств наночастиц (включая программирование поверхности для целевой доставки в заданные органы и ткани), а также наличие технологий для масштабирования производства [8]. Эти свойства определяют перспективы использования биологических наночастиц в медицине и фармации для доставки лекарственных препаратов, в том числе систем генетического редактирования.

Появление инновационных лекарственных препаратов требует создание методик для контроля их качества. Данная работа направлена на разработку методик для контроля качества и стандартизации лекарственных средств на основе наночастиц, загруженных комплексами генетического редактирования CRISPR/Cas.

Степень разработанности темы

Объектами исследования являются биологические наночастицы, содержащие системы CRISPR/Cas.

Разработка и апробация современных методов анализа для оценки качества биотехнологических препаратов способствуют развитию фармацевтической отрасли в России. Однако, в настоящее время, многие препараты данной области находятся на стадии разработки. Биологические наночастицы, содержащие системы генетического редактирования CRISPR/Cas, являются перспективными средствами доставки для лечения различных заболеваний и, следовательно, разработка методов анализа обеспечит подход для их безопасного применения.

Цель и задачи исследования

Цель - разработать методики получения лекарственных средств на основе наночастиц, загруженных комплексами генетического редактирования CRISPR/Cas, обладающих активностью против вируса гепатита B, и методики их контроля качества и стандартизации. Задачи исследования:

1. Разработать технологии получения и методики очистки лекарственных средств на основе наночастиц, загруженных комплексами генетического редактирования CRISPR^as.

2. Провести оценку физических, физико-химических и биологических свойств полученных генно-инженерных лекарственных средств для подтверждения их соответствия существующим требованиям.

3. Разработать методики пробоподготовки и количественного анализа CRISPR/Cas систем в составе наночастиц.

4. Сформулировать принципы стандартизации и установить нормативы качества для лекарственных средств на основе наночастиц, загруженных комплексами генетического редактирования CRISPR^as.

5. Оценить эндосомальный выход различных видов наночастиц на моделях клеток человека.

6. Оценить биологическую активность и токсичность CRISPR/Cas комплексов in vitro и in vivo на моделях вируса гепатита В.

Научная новизна

В процессе выполнения диссертационной работы были созданы методические подходы к анализу биологических наночастиц, использующиеся в качестве универсальной биологической платформы для доставки систем генетического редактирования CRISPR/Cas.

Было продемонстрировано, что гибридные наночастицы не только соответствуют физическим и биологическим характеристикам, но и содержат более 10 копий комплекса CRISPR^as в своем составе. Проведенный анализ токсичности подтвердил безопасность данного лекарственного средства (ЛС), а оценка биологической активности продемонстрировала эффективное воздействие на выбранную мишень в тестах in vitro и in vivo. Также для всех трех типов наночастиц проведено изучение эндолизосомального выхода, что является одним из лимитирующих факторов высвобождения и проявления своей биологической активности при попадании в клетку.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в изучении биохимического состава различных наночастиц, влияющих на высвобождение их содержимого, а также изучении особенностей эндолизомального выхода наночастиц. Впервые показано, что биологические и гибридные наночастицы по разному преодолевают эндолизосомальный барьер после интернализации: экзосомоподобные наночастицы избегают попадания в эндолизосомальный компартмент, в то время как гибридные наночастицы высвобождают свое содержимое при попадании в лизосомы при помощи механизма «протонной губки».

Практическими результатами данной диссертационной работы являются создание методик пробоподготовки, оценки качественного и количественного состава лекарственных средств, представляющих собой, биологические наночастицы, загруженные CRISPR/Cas-системами. Впервые выявлено, что биологические наночастицы резистентны к действию стандартных методов высвобождения белка и РНК, что приводит к заниженным результатам при оценке их содержимого. Впервые продемонстрировано, что добавление раствора сапонина способствует эффективному высвобождению белка и РНК из биологических наночастиц, что обеспечивает их достоверное количественное определение. В работе создан ряд новых и модифицированных методик оценки физических, физико-химических и биологических свойств экзосом, экзосомоподобных и гибридных наночастиц, качественной, количественной и функциональной оценки свойств систем CRISPR/Cas. На экспериментальных моделях in vitro и на моделях мышей in vivo проведена оценка биологической активности и безопасности наночастиц, загруженных CRISPR/Cas-системами.

В совокупности, были разработаны методики оценки качества, включая методики качественного и количественного анализа лекарственных средств, представляющих собой биологические наночастицы, загруженные CRISPR/Cas-системами, а также биологических свойств и биологической активности наночастиц и их содержимого. Тем самым, практическая значимость диссертационной работы заключается в создании системы контроля качества целого класса биологических препаратов на основе биологических наночастиц.

Методология и методы исследования

В ходе проведенного научного исследования были использованы культуральные, физические, физико-химические и молекулярно-биологические методы для создания и оценки биологических наночастиц и их содержимого.

В первую очередь, с помощью трансфекции клеток и последующего выделения и очистки были получены экзосомы, экзосомоподобные и гибридные наночастицы, содержащие комплексы CRISPR/Cas. Далее методом трансмиссионной электронной криомикроскопии были получены изображения наночастиц, проведена оценка их морфологии. Для оценки среднего размера, заряда и распределения частиц по размеру в обычных условиях и в средах с различным pH проводился анализ наночастиц методом динамического светорассеяния (DLS) и анализа траектории наночастиц (NTA). Вестер-блоттинг использовали для валидации изолятов экзосом по маркерам CD9, CD63, CD81, Hsp70.

Для качественного и количественного анализа изолятов экзосом, экзосомоподобных и гибридных наночастиц и их содержимого использовались методы: метод Бредфорда для определения количества общего белка в пробе, флуориметрия для количественного измерения липидов по реакции с сульфованилиновой кислотой, полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) для установления концентрации РНК-проводника, а также вестерн-блот и дот-блот анализ для определения количества Cas-белка в частицах. Исследование токсичности биологических наночастиц осуществляли по окрашиванию на аннексин. Биологическую активность оценивали in vitro на различных культурах клеток и in vivo на мышах Balb/С по снижению маркеров ВГВ при помощи методов: ПЦР-РВ и иммуноферментного анализа.

Статистическая обработка результатов проводилась по расчету критерия Стьюдента, однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для сравнения переменных и расчета p-значений для определения статистически значимых различий в средних значениях.

Положения, выносимые на защиту

1. Гель-эксклюзионная хроматография является более эффективным методом очистки биологических наночастиц в сравнении с ультрафильтрацией;

2. Наночастицы резистенты к действию стандартных протоколов для пробоподготовки и анализа белков и нуклеиновых кислот;

3. Сапонин способствует эффективному высвобождению содержимого наночастиц;

4. Методики количественного определения компонентов системы CRISPR^as валидированы и готовы к внедрению в практическую деятельность;

5. Установлены нормативы и принципы стандартизации биологических и гибридных наночастиц;

6. Гибридные наночастицы демонстрируют эффект «протонной губки», тогда как экзосомоподобные наночастицы избегают попадая в эндолизсоомальный компартмент;

7. Гибридные наночастицы не вызывают клеточный апоптоз и проявляют выраженную биологическую активность на моделях in vitro и in vivo.

Внедрение результатов исследования

Основные научные положения, выводы и рекомендации кандидатской диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии имени А.П. Арзамасцева Института фармации имени А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) «Методы исследования биопрепаратов» по направлению подготовки (специальности) 19.03.01 Биотехнология (акт № 468 от 1.08.2024 г.), и внедрены в работу научно-исследовательского отдела Института медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний имени Е.И. Марциновского ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) при проведении лабораторных исследований (Акт № 463 от 1.08.2024 г.).

Личный вклад

Личный вклад состоит в непосредственном участии во всех этапах диссертационной работы. Автор самостоятельно занимался постановкой цели и задач диссертационной работы, также тщательно изучал литературу по заданной тематике, участвовал в разработке методов пробоподготовки и методик комплексного анализа биологических наночастиц, содержащих CRISPR/Cas-системы, принимал участие в проведении всех исследований по контролю качества и стандартизации экзосом, получая исходные данные по качественному и количественному анализу экзосом в научных экспериментах, определяющих основные параметры наночастиц (морфологию, размер, заряд, компонентный состав), занимался обработкой результатов, полученных методами полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ), вестерн и дот-блота и др. Автор принимал участие в апробации результатов исследований, а также в написании публикаций, выступал с полученными данными на всероссийских конференциях, представляя результаты в виде устных и постерных докладов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Основные научные положения диссертации соответствуют п. 12, п. 13 и п. 14 паспорта научной специальности 1.5.3. Молекулярная биология и п. 2 и п. 3 паспорта научной специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Степень достоверности и апробация результатов

Все экспериментальные данные были получены на сертифицированном оборудовании, что позволяет сделать заключение о достоверности полученных результатов исследования. Статистическая обработка результатов проводилась в программме GraphPad Prism 8.0.1 по расчету критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием теста Тьюки для сравнения переменных и расчета p-значений для определения статистически значимых различий в средних значениях. Для статистической обработки данных эксперимента in vivo по динамике изменения уровня HBsAg в сыворотке крови в течение месяца использовался двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA), тест Даннетта. Данные ПЦР-РВ обрабатывались в программном обеспечении QuantStudio Design&Analysis Software v1.3.1 методом наименьших квадратов с использованием линейной модели. Построение калибровочной кривой и анализ линейной регрессии для дот-блота проводились в программме GraphPad Prism 8.0.1.

Оценка достоверности выявила воспроизводимость результатов исследования. Также экспериментальные данные согласуются с уже опубликованными статьями в данной области исследования. В диссертационной работе использованы современные методики сбора и обработки исходной информации. Эксперименты проводились в достаточном числе повторений согласно действующим нормативным документам.

Публикации по теме диссертации

По результатам исследования опубликовано 9 работ, в том числе 3 оригинальные научные статьи в изданиях, индексируемых в международной базе Scopus, 3 иные публикации, 3 публикации в сборниках материалов всероссийских научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук изложена на 119 страницах и состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, а также пяти глав с результатами собственных исследований, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы. Работа иллюстрирована 37 рисунками и 9 таблицами. Список литературы содержит 187 источников, из которых 6 источников отечественной литературы и 181 зарубежных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экзосомы как системы доставки лекарственных соединений

Внеклеточные везикулы - наноразмерные биологические наночастицы, секретируемые многими клетках человека, впервые были открыты в 1983 году при изучении потери трансферрина во время созревания ретикулоцитов в крови. В дальнейшем, были установлены их основные функции: участие в межклеточной коммуникации, передаче сигналов и регуляции клеточных процессов [70, 71]. Экзосомы осуществляют перенос биоактивных молекул из одной клетки в другую, что позволяет рассматривать их для применения в различных областях медицины [8]. В рамках клинической диагностики, экзосомы уже внедряются в медицинскую практику в качестве биологических маркеров. Было доказано, что состав и количество внеклеточных везикул пациентов с различными заболеваниями отличается от внеклеточных везикул здоровых людей [47, 69, 157, 179]. Но особый интерес для медицины, а в частности для фармации, вызывает использование экзосом в качестве средств для доставки лекарственных веществ (ЛВ).

1.1.1. Природа, физические свойства и состав экзосом, экзосомоподобных и гибридных

наночастиц

Биогенез экзосом происходит за счет двойной инвагинации плазматической мембраны и образования внутриклеточных мультивезикулярных тел, содержащих внутрипросветные везикулы, которые в конечном итоге сливаются с плазматической мембраной и высвобождаются во внеклеточное пространство с помощью экзоцитоза. Если рассматривать процесс формирования экзосом детально, то после первой инвагинации образуется чашеобразная структура, которая включает белки клеточной поверхности и растворимые белки, связанные с внеклеточной средой. Это приводит к образованию ранней эндосомы, и после ее созревания в позднюю эндосому, способствует генерированию мультивезикулярных эндосом. Мультивезикулярные тела формируются за счет внутренней инвагинации эндосомальной пограничной мембраны (то есть происходит двойная инвагинация плазматической мембраны). Результатом этого процесса являются частицы, содержащие внутри будущие экзосомы (Рисунок 1). Мультивезикулярные тела могут сливаться либо с лизосомами или аутофагосомами для деградации, либо с плазматической мембраной, высвобождая внутрипросветные везикулы в виде экзосом размером 50-150 нм, окруженные билипидной

мембраной [94, 109, 124]. Знание биогенеза важно, поскольку это определяет структуру, размер и биохимический состав биологических наночастиц, которые в дальнейшем будут использоваться в качестве терапевтических инструментов.

Лшосома

Рисунок 1 - Схема биогенеза экзосом. Содержимое сортируется путем эндоцитоза к ранним эндосомам. Ранние эндосомы участвуют в пути созревания эндосом, что приводит к появлению мультивезикулярных поздних эндосом (МПЭ). Наконец, МПЭ сливаются с плазматической

мембраной (ПМ), высвобождая экзосомы [97]

Однако, для экзосом характерен ряд недостатков, связанных с их производством, а именно - низкий выход частиц, высокая гетерогенность, сложность производства, выделения и очистки частиц, трудность стандартизации согласно стандартам надлежащей производственной практики (GMP). В связи с этим, растёт популярность биологических наночастиц клеточного происхождения, не имеющих недостатки экзосом.

Альтернативными наночастицами, обладающими схожими физико-химическими и биологическими свойствами, но более оптимальными в производстве, являются экзосомоподобные везикулы [48, 118]. Метод получения экзосомоподобных наночастиц основан на отпочковывании частиц от клеток или их формировании из поврежденных клеток путем серийной экструзии клеточной массы [77, 122]. Благодаря особенностям получения, такие везикулы имеют более простой, быстрый и высокопроизводительный процесс

производства, и в отличие от экзосом не требуют ожидания до момента секреции наночастиц в культуральную среду. За счет такого метода получения экзосомоподобные наночастицы имеют низкий уровень загрязнения секретируемыми белками [172]. Также данный тип частиц в процессе производства легче контролируется по показателю «количественное определение», поскольку количество клеток из которых получают экзосомоподобные наночастицы проще регулировать, чем секрецию экзосом.

Гибридные везикулы являются новым типом наночастиц и образуются при слиянии мембран биологических наночастиц и синтетических липосом методами ко-инкубации, экструзии, химически-индуцированного слияния, заморозки-разморозки, индуцируемого ультразвуком слияния и др. Гибридные везикулы продолжают сохранять свойства исходных биологических наночастиц, включая низкий макрофагальный клиренс и длительную циркуляцию [42]. Технология гибридных везикул может быть применена для улучшения свойств биологических наночастиц. Подбор более эффективных рН-чувствительных липидов (например, содержащих четвертичные аммониевые группы) позволит более эффективно накапливать ионы Н+ в кислой среде и обеспечивать более полное высвобождение содержимого, что приведёт к улучшению терапевтической активности гибридных частиц. Следовательно, включение в биологические наночастицы катионных липидов в составе липосом улучшит высвобождение упакованного содержимого после интернализации в клетку [62].

Все описанные биологические наночастицы имеют сложный биохимический состав, включая такие компоненты, как поверхностные белки (CD63, CD9, CD81 и др), белки теплового шока (НБР) и т.д., а также различные нуклеиновые кислоты (мРНК, микроРНК, длинные некодирующие РНК, ДНК), каждые из которых выполняют определенные функции [141]. Липидный бислой биологических наночастиц богат холестерином. Холестерол и насыщенные жирные кислоты определяет жесткость частиц, а ненасыщенные жирные кислоты влияют на ее текучесть [173].

1.1.2. Способы получения и методы очистки

Для промышленного производства внеклеточные везикулы необходимо получать из больших объемов (до тысяч литров) кондиционированной среды, представляющей собой жидкость, содержащую внеклеточные везикулы, компоненты среды, а также следующие загрязнители: микровезикулы, апоптотические тельца, клеточный дебрис и органеллы, ДНК, продукты некроза клеток, свободные белки и белковые агрегаты. Для получения экзосом были

разработаны различные подходы на основе ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, ассиметричного фракционирования, разнообразные хроматографические подходы, а также методы на основе осаждения.

Внеклеточные ВПИКУ1Ы

Белок

* Ультрлнктркфгтяровгте* ■ --->

Образец, очищенный от клеток ■ мусоря

Градиент плотности Дифференциальное Пр*ры».сты« Ншргрымыа ультрацентрифугнрование (шаром) («од»кс»пол)

осадок

НЙИМ г?

V V V

д

Фракционирование асимметричного потока в полевом потоке

Пряток верхняя мембрана Он

Нараболяческин ■ • • продольный * ф

■ото»

ж g

I

-ifi I

М*

нижняя мгморлнл

^ Улырафильтрапия '

До

SEC

о. ■

Е

11рецнпи|ааня

+ осалатель

После До После

■С

У *у* +

гчг t

/Ли

Ж

Пммуиио афинный метод

шарики, коньннированиые с антителами

До

•

• ■ • ■ >о

■ LJ А (Т ♦ » ■ • ♦ * .

• » промывка

♦ • 1 ♦ ♦ • ff Х3>

После До После

Рисунок 2 - Способы получения и методы очистки внеклеточных везикул. (А) Исходный образец представляет собой смесь внеклеточных везикул и белков, очищенных от клеток и клеточного дебриса; (Б) Ультрацентрифугирование осаждает внеклеточные везикулы и белки. Дополнительная очистка от белков может быть проведена с помощью дифференциального ультрацентрифугирования или ультрацентрифугирования в градиенте плотности; (В) Ультрафильтрация; (Г) Гель-эксклюзионная хроматография (SEC); (Д) Фракционирования наночастиц в ассиметричном потоке, (Е) Метод выделения наночастиц на основе преципитации полимерами (осадителем); (Ж) Иммунно-афинный метод [55]

В настоящее время метод ультрацентрифугирования считается «золотым стандартом» получения экзосом (Рисунок 2 А, Б). Данный метод основан на использовании центробежной силы для осаждения наночастиц, при этом основные загрязняющие вещества (белки, низкомолекулярные соединения и т. д.) остаются в супернатанте [87]. Недостатки данного метода включают низкий выход экзосом (на порядок меньше в сравнении с альтернативными методами), их частичное разрушение и агрегацию [89, 139], совместное выделение контаминирующих неэкзосомальных везикул [89] и попадание в образец белковых агрегатов. Во время стерилизующей фильтрации до 80% везикул могут быть потеряны из-за неполного ресуспендирования и удержания везикул в фильтре. Наконец, этот метод плохо совместим с принципами GMP из-за значительной внутрилабораторной и межлабораторной

вариабельности. При ультрацентрифугировании в градиенте плотности компоненты среды, содержащей экзосомы, дополнительно разделяются по плотности (Рисунок 2 Б). Наночастицы осаждаются центробежными силами, но остаются во взвешенном состоянии в средах определенной плотности. Контаминанты имеют другую плотность и поэтому могут быть эффективно отделены во время данного метода выделения [87, 90, 151]. Среда действует как подушка для захвата экзосом, поэтому их агрегации и повреждения под действием силы тяжести не происходит. Обычные реагенты для выделения биологических наночастиц включают сахарозу и йодиксанол [91]. После выделения следы этих реагентов следует удалить промыванием или другими методами очистки, поскольку остатки таких реагентов могут снижать биологическую активность экзосом или мешать методам их анализа [90].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пономарева Наталья Игоревна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Банников, А. В. CRISPR/Cas9 - король геномного редактирования / А. В. Банников, А. В. Лавров // Молекулярная биология. - 2017. - Т. 51. - № 4. - С. 582-594.

2. Высокопроизводительный метод получения экзосом и внеклеточных везикул / А. П. Пономарева, Н И Брезгин, С А Костюшева, Е. О. Баюрова, В. Г. Воля [и др.] // VII съезд биохимиков России. X российский симпозиум «Белки и пептиды». VII съезд физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 03-08 октября 2021 года. Том 2. - Москва: Издательство «Перо». - 2021. -С. 234.

3. Доставка РНК с помощью гибридных липосом-экзосом / Н. И. Пономарева, С. А. Брезгин, А. П. Костюшева [и др.] // Синтетическая биология и биофармацевтика: Материалы всероссийской конференции, Новосибирск, 24-28 июля 2022 года. - Новосибирск: ООО «Офсет-ТМ». - 2022. - С. 125.

4. Особенности определения специфической активности биотехнологических лекарственных средств / Алпатова Н.А., Л. А. Гайдерова, А. К. Яковлев [и др.] // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2017. - Т. 1. - № 61. - С. 13-26.

5. Пономарева, Н. И. Изучение стохастической упаковки Cas белков в экзосомы на линиях клеток человека / Н. И. Пономарева, В. Г. Костюшева, А П Воля, Д. С. Брезгин, С А Гегечкори, В И Чуланов, В П Костюшев // VII съезд биохимиков России. X российский симпозиум «Белки и пептиды». VII съезд физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 03-08 октября 2021 года. Том 2. -Москва: Издательство «Перо». - 2021. - С. 255.

6. Сравнение методов получения экзосом, используемых в биомедицинских исследованиях / Н. И. Пономарева, А. П. Костюшева, С. А. Брезгин [и др.] // Биомедицина. - 2021. - Т. 17. -№ 3E. - С. 79-82.

7. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing / O. O. Abudayyeh, J. S. Gootenberg, B. Franklin [et al.] // Science. - 2019. - Vol. 365. - P. 382-386.

8. A Good Manufacturing Practice-grade standard protocol for exclusively human mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles / K. Pachler, T. Lener, D. Streif [et al.] // Cytotherapy. -2017. - Vol. 19. - № 4. - P. 458-472.

9. A highly efficient method for isolating urinary exosomes / L. He, D. Zhu, J. Wang, X. Wu // International journal of molecular medicine. - 2019. - Vol. 43. - № 1. - P. 83-90.

10. A Self-Deleting AAV-CRISPR System for In Vivo Genome Editing / A. Li, C. M. Lee, A. E. Hurley [et al.] // Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. - 2019. - Vol. 12. -№ March. - P. 111-122.

11. Advanced Strategies for Overcoming Endosomal/Lysosomal Barrier in Nanodrug Delivery. / C.

Qiu, F. Xia, J. Zhang [et al.] // Research (Washington, D.C.). - 2023. - Vol. 6. - P. 148.

12. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. / M. J. Waring, J. Arrowsmith, A. R. Leach [et al.] // Nature reviews. Drug discovery. - 2015. - Vol. 14. -№ 7. - P. 475-486.

13. Anchor peptide captures, targets, and loads exosomes of diverse origins for diagnostics and therapy. / X. Gao, N. Ran, X. Dong [et al.] // Science translational medicine. - 2018. - Vol. 10. -№ 444. - P. 195.

14. Andreu, Z. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. / Z. Andreu, M. Yanez-Mo // Frontiers in immunology. - 2014. - Vol. 5. - P. 442.

15. Antiviral Activity of CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Complexes on a Hepatitis B Virus Model In Vivo. / A. P. Kostyusheva, S. A. Brezgin, N. I. Ponomareva [et al.] // Molekuliarnaia biologiia. - 2022. - Vol. 56. - № 6. - P. 884-891.

16. Biogenesis and molecular characteristics of serum hepatitis B virus RNA / S. Shen, Z. Xie, D. Cai [et al.] // PLoS pathogens. - 2020. - Vol. 16. - № 10. - P. 1008945.

17. Blood Exosomes Endowed with Magnetic and Targeting Properties for Cancer Therapy. / H. Qi, C. Liu, L. Long [et al.] // ACS nano. - 2016. - Vol. 10. - № 3. - P. 3323-3333.

18. Brezgin, S. Dead Cas Systems: Types, Principles, and Applications / S. Brezgin, A. Kostyusheva, D. Kostyushev // Int J Mol Sci. - 2019. - Vol. 9. - P. 1-26.

19. Consistent loss of serum HBV RNA might predict the " para-functional cure " of chronic hepatitis B / J. Wang, M. Du, H. Huang [et al.] // Journal of Hepatology. - 2016. - Vol. 66. - № 2. -P. 462-463.

20. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. / J. D. Gillmore, E. Gane, J. Taubel [et al.] // The New England journal of medicine. - 2021. - Vol. 385. - № 6. - P. 493-502.

21. CRISPR/Cas and Hepatitis B Therapy: Technological Advances and Practical Barriers. / D. Kostyushev, A. Kostyusheva, N. Ponomareva [et al.] // Nucleic acid therapeutics. - 2022. - Vol. 32. -№ 1. - P. 14-28.

22. CRISPR / Cas - Based Modifications for Therapeutic Applications: A Review / N. Bharathkumar, A. Sunil, P. Meera [et al.] // Molecular Biotechnology. - 2022. - Vol. 64. - № 4. -P. 355-372.

23. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma / Y. Yuana, R. I. Koning, M. E. Kuil [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2013. - Vol. 2. - № 1. - P. 21494.

24. Current and prospective strategies for advancing the targeted delivery of CRISPR/Cas system via extracellular vesicles / X. Huang, A. Li, P. Xu [et al.] // Journal of Nanobiotechnology. - 2023. -Vol. 21. - № 1. - P. 184.

25. Current Status of CRISPR/Cas9 Application in Clinical Cancer Research: Opportunities and

Challenges / S. Rafii, E. Tashkandi, N. Bukhari, H. O. Al-shamsi // Cancers. - 2022. - Vol. 14. - № 4.

- P. 1-14.

26. Delivering crispr: A review of the challenges and approaches / C. A. Lino, J. C. Harper, J. P. Carney, J. A. Timlin // Drug Delivery. - 2018. - Vol. 25. - № 1. - P. 1234-1257.

27. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes / L. Alvarez-erviti, Y. Seow, H. Yin [et al.] // Nature Biotechnology. - 2011. - Vol. 29. - № 4. - P. 341-345.

28. Dendritic cells in anticancer vaccination: rationale for ex vivo loading or in vivo targeting / A. V Baldin, L. V Savvateeva, A. V Bazhin, A. A. Zamyatnin Jr // Cancers. - 2020. - Vol. 12. - № 3. -P. 590.

29. Detection of hypertension-induced changes in erythrocytes by SERS nanosensors / E. I. Nikelshparg, A. A. Baizhumanov, Z. V Bochkova [et al.] // Biosensors. - 2022. - Vol. 12. - № 1. -P. 32.

30. Determination of the Biological Activity of Insulin and Its Analogues in Animals / P. V. Shadrin, L. V. Simutenko, T. A. Batuashvili [et al.] // Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. Regulatory Research and Medicine Evaluation. - 2022. - Vol. 13. -№ 2-1. - P. 292-301.

31. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10 / M. L. Maeder, M. Stefanidakis, C. J. Wilson [et al.] // Nature Medicine. - 2019. - Vol. 25. -№ 2. - P. 229-233.

32. Development of exosome surface display technology in living human cells / Z. Stickney, J. Losacco, S. McDevitt [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2016. -Vol. 472. - № 1. - P. 53-59.

33. Drugs in Development for Hepatitis B / A. Dawood, S. Abdul Basit, M. Jayaraj, R. . Gish // Drugs. - 2017. - Vol. 77. - № 12. - P. 1263-1280.

34. Durantel, D. New antiviral targets for innovative treatment concepts for hepatitis B virus and hepatitis delta virus. / D. Durantel, F. Zoulim // Journal of hepatology. - 2016. - Vol. 64. - № 1. -P. 117-131.

35. Dynamic light scattering for the characterization and counting of extracellular vesicles: a powerful noninvasive tool / V. Palmieri, D. Lucchetti, I. Gatto [et al.] // Journal of nanoparticle research. - 2014. - Vol. 16. - № 9. - P. 1-8.

36. Effect of MSCs and MSC-Derived Extracellular Vesicles on Human Blood Coagulation. / D. N. Silachev, K. V Goryunov, M. A. Shpilyuk [et al.] // Cells. - 2019. - Vol. 8. - № 3. - P. 258.

37. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum / R. Kornilov, M. Puhka, B. Mannerstrom [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2018. - Vol. 7.

- № 1. - P. 1422674.

38. Engineered amphiphilic peptides enable delivery of proteins and CRISPR-associated nucleases to airway epithelia / S. Krishnamurthy, C. Wohlford-Lenane, S. Kandimalla [et al.] // Nature Communications. - 2019. - Vol. 10. - № 1. - P. 1-12.

39. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. / U. Sterzenbach, U. Putz, L.-H. Low [et al.] // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. - 2017. - Vol. 25. - № 6. - P. 1269-1278.

40. Engineered exosomes for targeted co-delivery of miR-21 inhibitor and chemotherapeutics to reverse drug resistance in colon cancer / G. Liang, Y. Zhu, D. J. Ali [et al.] // Journal of Nanobiotechnology. - 2020. - Vol. 18. - № 1. - P. 1-15.

41. Engineering exosomes for targeted drug delivery / Y. Liang, L. Duan, J. Lu, J. Xia // Theranostics. - 2021. - Vol. 11. - № 7. - P. 3183.

42. Engineering hybrid exosomes by membrane fusion with liposomes / Y. T. Sato, K. Umezaki, S. Sawada [et al.] // Nature Publishing Group. - 2016. - № June 2015. - P. 1-11.

43. Enrichment of selective miRNAs in exosomes and delivery of exosomal miRNAs in vitro and in vivo. / D. Zhang, H. Lee, Z. Zhu [et al.] // American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. - 2017. - Vol. 312. - № 1. - P. 110-121.

44. Evaluation of exosomal non - coding RNAs in cancer using high - throughput sequencing / K. Hosseini, M. Ranjbar, A. P. Tazehkand [et al.] // Journal of Translational Medicine. - 2022. - P. 1-15.

45. Evaluation of optimal extracellular vesicle small RNA isolation and qRT-PCR normalisation for serum and urine / R. E. Crossland, J. Norden, L. A. Bibby [et al.] // Journal of immunological methods. - 2016. - Vol. 429. - P. 39-49.

46. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research / D.-K. Kim, J. Lee, S. R. Kim [et al.] // Bioinformatics. - 2015. - Vol. 31. - № 6. - P. 933-939.

47. Exosomal miR-29b of Gut Origin in Patients With Ulcerative Colitis Suppresses Heart Brain-Derived Neurotrophic Factor / H. Lian, X. S. Zhong, Y. Xiao [et al.] // Frontiers in Molecular Biosciences. - 2022. - Vol. 9. - № February. - P. 1-13.

48. Exosome-Mimetic Nanovesicles from Hepatocytes promote hepatocyte proliferation in vitro and liver regeneration in vivo / J.-Y. Wu, A.-L. Ji, Z. Wang [et al.] // Scientific reports. - 2018. -Vol. 8. - № 1. - P. 1-11.

49. Exosome-Liposome Hybrid Nanoparticles Deliver CRISPR/Cas9 System in MSCs / Y. Lin, J. Wu, W. Gu [et al.] // Advanced Science. - 2018. - Vol. 5. - № 4. - P. 1-9.

50. Exosome Display technology: applications to the development of new diagnostics and therapeutics. / A. Delcayre, A. Estelles, J. Sperinde [et al.] // Blood cells, molecules & diseases. -2005. - Vol. 35. - № 2. - P. 158-168.

51. Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically

reversible protein-protein interaction module. / N. Yim, S.-W. Ryu, K. Choi [et al.] // Nature communications. - 2016. - Vol. 7. - P. 12277.

52. Exosomes and Other Extracellular Vesicles with High Therapeutic Potential: Their Applications in Oncology , / U. Szwedowicz, Z. Lapinska, A. Gajewska-Naryniecka, A. Choromanska // Molecules. - 2022. - Vol. 27. - № 4. - P. 1303.

53. Exosomes as Drug Delivery Vehicles for Parkinson's Disease Therapy / W. Liu, M. MacDonald, J. Y. Scholz [et al.] // Physiology & behavior. - 2016. - Vol. 176. - № 1. - P. 139-148.

54. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers / S. E. L. Andaloussi, S. Lakhal, I. Mager, M. J. A. Wood // Advanced drug delivery reviews. - 2013. - Vol. 65. - № 3. -P. 391-397.

55. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography / M. Monguio-Tortajada, C. Galvez-Monton, A. Bayes-Genis [et al.] // Cellular and molecular life sciences : CMLS. - 2019. - Vol. 76. - № 12. - P. 2369-2382.

56. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis / C. Gardiner, Y. J. Ferreira, R. A. Dragovic [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2013. - Vol. 2. - P. 19671.

57. Fast characterisation of cell-derived extracellular vesicles by nanoparticles tracking analysis, cryo-electron microscopy, and Raman tweezers microspectroscopy / I. Tatischeff, E. Larquet, J. M. Falcon-Perez [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2012. - Vol. 1. - № 1. - P. 19179.

58. Fatal hepatitis B reactivation following discontinuation of nucleoside analogues for chronic hepatitis B / S. G. Lim, C. T. Wai, A. Rajnakova [et al.] // Gut. - 2002. - Vol. 51. - № 4. - P. 597-599.

59. Filipe, V. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates / V. Filipe, A. Hawe, W. Jiskoot // Pharmaceutical research. - 2010. - Vol. 27. - № 5. - P. 796-810.

60. Freeze-Dried Extracellular Vesicles From Adipose-Derived Stem Cells Prevent Hypoxia-Induced Muscle Cell Injury / K. B. Y. El Baradie, M. Nouh, O. I. F [et al.] // Frontiers in Cell and Developmental Biology. - 2020. - Vol. 8. - P. 181.

61. Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein / R. Chen, H. Huang, H. Liu [et al.] // Small. - 2019. - Vol. 15. - № 38. - P. 1-13.

62. Functional siRNA Delivery by Extracellular Vesicle - Liposome Hybrid Nanoparticles / M. J. W. Evers, S. I. Van De Wakker, E. M. De Groot [et al.] // Advanced Healthcare Materials. - 2021. -Vol. 11. - № 5. - P. 1-13.

63. Future Therapy for Hepatitis B Virus: Role of Immunomodulators / E. A. Pham, R. B. Perumpail, B. J. Fram [et al.] // Current Hepatology Reports. - 2016. - Vol. 15. - № 4. - P. 237-244.

64. Gene editing by extracellular vesicles / D. Kostyushev, A. Kostyusheva, S. Brezgin [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2020. - Vol. 21. - № 19. - P. 1-34.

65. Gene Therapy for Chronic HBV — Can We Eliminate cccDNA ? / K. Bloom, M. B. Maepa, A. Ely, P. Arbuthnot // Genes (Basel). - 2018. - Vol. 9. - № 4. - P. 207.

66. Glebe, D. The molecular virology of hepatitis B virus / D. Glebe, C. Bremer // Seminars in Liver Disease. - 2013. - Vol. 33. - № 2. - P. 103-112.

67. Glebe, D. Molecular virology of hepatitis B virus and targets for antiviral intervention / D. Glebe, A. König // Intervirology. - 2014. - Vol. 57. - № 3-4. - P. 134-140.

68. Guidance for design and endpoints of clinical trials in chronic hepatitis B - Report from the 2019 EASL-AASLD HBV Treatment Endpoints Conference^ / M. Cornberg, A. S. F. Lok, N. A. Terrault [et al.] // Journal of Hepatology. - 2020. - Vol. 72. - № 3. - P. 539-557.

69. Han, Y. Exosomal myeloperoxidase as a biomarker of deep venous thrombosis / Y. Han, X. Bai, X. Wang // Annual Translation Medicine. - 2022. - Vol. 10. - № 1. - P. 1-13.

70. Harding, C., Stahl, P. Transferrin recycling in reticulocytes: pH and iron are important determinants of ligand binding and processing / P. Harding, C., Stahl // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1983. - Vol. 113. - № 2. - P. 650-658.

71. Harding, C. V. Exosomes: Looking back three decades and into the future / C. V. Harding, J. E. Heuser, P. D. Stahl // Journal of Cell Biology. - 2013. - Vol. 200. - № 4. - P. 367-371.

72. Hepatitis B cure: From discovery to regulatory approval / A. S. Lok, F. Zoulim, G. Dusheiko, M. G. Ghany // Journal of Hepatology. - 2017. - Vol. 67. - № 4. - P. 847-861.

73. Hepatitis C can be cured: will hepatitis B become next? / V. . Chulanov, A. . Zueva, D. . Kostyushev [et al.] // Terapevticheskii arkhiv. - 2017. - Vol. 89. - № 11. - P. 4-13.

74. High-resolution proteomic and lipidomic analysis of exosomes and microvesicles from different cell sources / R. A. Haraszti, M. C. Didiot, E. Sapp [et al.] // Journal of Extracellular Vesicles. - 2016. - Vol. 5. - № 1. - P. 1-14.

75. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation / E. A. Mol, M.-J. Goumans, P. A. Doevendans [et al.] // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. - 2017. - Vol. 13. - № 6. - P. 2061-2065.

76. Hung, M. E. Stabilization of exosome-targeting peptides via engineered glycosylation. / M. E. Hung, J. N. Leonard // The Journal of biological chemistry. - 2015. - Vol. 290. - № 13. - P. 81668172.

77. Hydroxychloroquine Enhances Cytotoxic Properties of Extracellular Vesicles and Extracellular Vesicle - Mimetic Nanovesicles Loaded with Chemotherapeutics / S. Brezgin, A. Kostyusheva, N. Ponomareva [et al.]. - 2023. - P. 1-10.

78. Hyochol Ahn, PhD, Michael Weaver, PhD, Debra Lyon, PhD, Eunyoung Choi, RN, and Roger B. Fillingim, P. Exosomes Facilitate Therapeutic Targeting of Oncogenic Kras in Pancreatic Cancer / P. Hyochol Ahn, PhD, Michael Weaver, PhD, Debra Lyon, PhD, Eunyoung Choi, RN, and Roger B.

Fillingim, C. J. F. S. T. Tumbar // Physiology & behavior. - 2017. - Vol. 176. - № 1. - P. 139-148.

79. Identification and characterization of 293T cell-derived exosomes by profiling the protein, mRNA and microRNA components / J. Li, X. Chen, J. Yi [et al.] // PloS one. - 2016. - Vol. 11. -№ 9. - P. 163043.

80. Identification of Disubstituted Sulfonamide Compounds as Specific Inhibitors of Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA / D. Cai, C. Mills, W. Yu [et al.]. - 2012. - Vol. 56. - № 8. -P. 4277-4288.

81. Improved antiviral efficacy using TALEN-mediated homology directed recombination to introduce artificial primary miRNAs into DNA of hepatitis B virus / T. Dreyer, S. Nicholson, A. Ely [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2016. - Vol. 478. - № 4. -P. 1563-1568.

82. Improved Loading of Plasma-Derived Extracellular Vesicles to Encapsulate Antitumor miRNAs. / M. A. C. Pomatto, B. Bussolati, S. D'Antico [et al.] // Molecular therapy. Methods & clinical development. - 2019. - Vol. 13. - P. 133-144.

83. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System / J. P. Mitchell, J. Court, M. D. Mason [et al.] // Journal of immunological methods. - 2008. -Vol. 335. - № 1-2. - P. 98-105.

84. Inhibition of hepatitis B virus by the CRISPR/Cas9 system via targeting the conserved regions of the viral genome / X. Liu, R. Hao, S. Chen [et al.] // Journal of General Virology. - 2015. - Vol. 96.

- № 8. - P. 2252-2261.

85. Integrating Protein Engineering and Bioorthogonal Click Conjugation for Extracellular Vesicle Modulation and Intracellular Delivery. / M. Wang, S. Altinoglu, Y. S. Takeda, Q. Xu // PloS one. -2015. - Vol. 10. - № 11. - P. 141860.

86. Ion-exchange chromatography purification of extracellular vesicles / M. Kosanovic, B. Milutinovic, S. Goc [et al.] // Biotechniques. - 2017. - Vol. 63. - № 2. - P. 65-71.

87. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids / C. Thery, S. Amigorena, G. Raposo, A. Clayton // Current protocols in cell biology. - 2006. - Vol. 30.

- № 1. - P. 3-22.

88. Isolation and quantitation of exosomes isolated from human plasma via hydrophobic interaction chromatography using a polyester, capillary-channeled polymer fiber phase / L. Wang, T. F. Bruce, S. Huang, R. K. Marcus // Analytica chimica acta. - 2019. - Vol. 1082. - P. 186-193.

89. Isolation of exosomes from blood plasma: qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods / T. Baranyai, K. Herczeg, Z. Onodi [et al.] // PloS one. - 2015. - Vol. 10. - № 12. - P. 145686.

90. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient

ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma / Z. Onodi, C. Pelyhe, C. Terezia Nagy [et al.] // Frontiers in physiology. - 2018. - Vol. 9. - P. 1479.

91. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations / K. Iwai, T. Minamisawa, K. Suga [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2016. - Vol. 5. - № 1. - P. 30829.

92. Jing, H. Exosomes and regenerative medicine: state of the art and perspectives / H. Jing, X. He, J. Zheng // Translational Research. - 2018. - Vol. 196. - P. 1-16.

93. Jones, K. L. Evolving novel anti-HER2 strategies. / K. L. Jones, A. U. Buzdar // The Lancet. Oncology. - 2009. - Vol. 10. - № 12. - P. 1179-1187.

94. Kalluri, R. The biology, function, and biomedical applications of exosomes / R. Kalluri, V. S. LeBleu // Science. - 2020. - Vol. 367. - № 6478. - P. 6977.

95. Kartal, E. D. Adverse Effects of High-Dose Interferon- a -2a Treatment / E. D. Kartal, A. Prof.

- 2007. - Vol. 24. - № 5. - P. 963-971.

96. Krause, A. Strategies for the treatment of HBV/HDV / A. Krause, U. Haberkorn, W. Mier // European Journal of Pharmacology. - 2018. - Vol. 833. - P. 379-391.

97. Krylova, S. V. The Machinery of Exosomes: Biogenesis, Release, and Uptake. / S. V Krylova, D. Feng // International journal of molecular sciences. - 2023. - Vol. 24. - № 2. - P. 1337.

98. Label-free characterization and real-time monitoring of cell uptake of extracellular vesicles / A. Koponen, E. Kerkela, T. Rojalin [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. - 2020. - Vol. 168. -P. 112510.

99. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles / R. P. McNamara, C. P. Caro-Vegas, L. M. Costantini [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2018. - Vol. 7. - № 1. - P. 1541396.

100. Li, Q. CRISPR-Based Tools for Fighting Rare Diseases. / Q. Li, Y. Gao, H. Wang // Life (Basel, Switzerland). - 2022. - Vol. 12. - № 12. - P. 1968.

101. Light-Inducible Exosome-Based Vehicle for Endogenous RNA Loading and Delivery to Leukemia Cells / L. Huang, N. Gu, X.-E. Zhang, D.-B. Wang // Advanced Functional Materials. -2019. - Vol. 29. - № 9. - P. 1807189.

102. Lin, G. Application of CRISPR/Cas9 technology to HBV / G. Lin, K. Zhang, J. Li // International Journal of Molecular Sciences. - 2015. - Vol. 16. - № 11. - P. 26077-26086.

103. Lindh, M. Impact of integrated viral DNA on the goal to clear hepatitis B surface antigen with different therapeutic strategies / M. Lindh, G. E. Rydell, S. B. Larsson // Current Opinion in Virology.

- 2018. - Vol. 30. - P. 24-31.

104. Liposome-Based Carriers for CRISPR Genome Editing. / X. Yin, R. Harmancey, D. D. McPherson [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2023. - Vol. 24. - № 16. -

P. 12844.

105. Loading of Extracellular Vesicles with Hydrophobically Modified siRNAs / M.-C. Didiot, R. A. Haraszti, N. Aronin, A. Khvorova // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). - 2018. -Vol. 1740. - P. 199-214.

106. Lu, F. Potential use of serum HBV RNA in antiviral therapy for chronic hepatitis B in the era of nucleos ( t ) ide analogs / F. Lu // Frontiers in Medicine. - 2017. - Vol. 11. - № 4. - P. 502-508.

107. Lucifora, J. Specific and Nonhepatotoxic Degradation of Nuclear Hepatitis B Virus cccDNA / J. Lucifora // Science. - 2014. - Vol. 343. - № 6176. - P. 1221-1228.

108. Mapping the Interactions of HBV cccDNA with Host Factors / N. K. Mohd-ismail, Z. Lim, J. Gunaratne, Y. Tan. - 2019. - P. 1-18.

109. McAndrews, K. M. Mechanisms associated with biogenesis of exosomes in cancer / K. M. McAndrews, R. Kalluri // Molecular Cancer. - 2019. - Vol. 18. - № 1. - P. 1-11.

110. Mendt, M. Mesenchymal stem cell-derived exosomes for clinical use / M. Mendt, K. Rezvani, E. Shpall // Bone marrow transplantation. - 2019. - Vol. 54. - № 2. - P. 789-792.

111. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles affect disease outcomes via transfer of microRNAs / G. Qiu, G. Zheng, M. Ge [et al.] // Stem Cell Research & Therapy. - 2018. - Vol. 9. -№ 1. - P. 1-9.

112. Methods for the physical characterization and quantification of extracellular vesicles in biological samples / D. L. M. Rupert, V. Claudio, C. Lasser, M. Bally // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 2017. - Vol. 1861. - № 1. - P. 3164-3179.

113. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. / J. A. Welsh, D. C. I. Goberdhan, L. O'Driscoll [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2024. - Vol. 13. - № 2. - P. 12404.

114. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines / C. Thery, K. W. Witwer, E. Aikawa [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2018. -Vol. 7. - № 1. - P. 1535750.

115. Monitoring of blood oxygenation in brain by resonance Raman spectroscopy / N. A. Brazhe, K. Thomsen, M. L0nstrup [et al.] // Journal of Biophotonics. - 2018. - Vol. 11. - № 6. - P. e201700311.

116. Moon, B. Exosome as a Delivery Vehicle for Cancer Therapy / B. Moon, S. Chang // Cells. -2022. - Vol. 11. - № 3. - P. 1-15.

117. Naldini, L. Ex vivo gene transfer and correction for cell-based therapies. / L. Naldini // Nature reviews. Genetics. - 2011. - Vol. 12. - № 5. - P. 301-315.

118. Nanoghosts as a Novel Natural Nonviral Gene Delivery Platform Safely Targeting Multiple Cancers / L. Kaneti, T. Bronshtein, N. Malkah Dayan [et al.] // Nano Letters. - 2016. - Vol. 16. - № 3.

- P. 1574-1582.

119. Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair / K. Lee, M. Conboy, H. M. Park [et al.] // Nature Biomedical Engineering. -2017. - Vol. 1. - № 11. - P. 889-901.

120. Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression. / F. Pi, D. W. Binzel, T. J. Lee [et al.] // Nature nanotechnology. - 2018. - Vol. 13.

- № 1. - P. 82-89.

121. Nanotechnology-based delivery of CRISPR/Cas9 for cancer treatment. / X. Xu, C. Liu, Y. Wang [et al.] // Advanced drug delivery reviews. - 2021. - Vol. 176. - P. 113891.

122. Nasiri Kenari, A. Methods for loading therapeutics into extracellular vesicles and generating extracellular vesicles mimetic-nanovesicles / A. Nasiri Kenari, L. Cheng, A. F. Hill // Methods. -2020. - Vol. 177. - № December 2019. - P. 103-113.

123. New nanocomposites for SERS studies of living cells and mitochondria / A. S. Sarycheva, N. A. Brazhe, A. A. Baizhumanov [et al.] // Journal of Materials Chemistry B. - 2016. - Vol. 4. - № 3. -P. 539-546.

124. Niel, G. Van. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles / G. Van Niel, G. D'Angelo, G. Raposo // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2018. - Vol. 19. - № 4. - P. 213228.

125. Non-viral delivery of CRISPR-Cas9 complexes for targeted gene editing via a polymer delivery system / J. O'Keeffe Ahem, I. Lara-Saez, D. Zhou [et al.] // Gene Therapy. - 2022. - Vol. 29.

- № 3-4. - P. 157-170.

126. Nucleolin-targeted Extracellular Vesicles as a Versatile Platform for Biologics Delivery to Breast Cancer. / Y. Wang, X. Chen, B. Tian [et al.] // Theranostics. - 2017. - Vol. 7. - № 5. - P. 13601372.

127. Oksvold, M. P. Magnetic bead-based isolation of exosomes / M. P. Oksvold, A. Neurauter, K. W. Pedersen // RNA Interference. - 2015. - P. 465-481.

128. One-Vector System for Multiplexed CRISPR/Cas9 against Hepatitis B Virus cccDNA Utilizing High-Capacity Adenoviral Vectors / M. Schiwon, E. Ehrke-Schulz, A. Oswald [et al.] // Molecular Therapy - Nucleic Acids. - 2018. - Vol. 12. - № September. - P. 242-253.

129. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma / R. J. Lobb, M. Becker, S. Wen Wen [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2015. - Vol. 4. - № 1. -P. 27031.

130. Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus / D. Kostyushev, S. Brezgin, A. Kostyusheva [et al.] // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2019. - Vol. 76. - № 9. - P. 1779-1794.

131. Owens, R. M. Advanced tissue engineering for in vitro drug safety testing / R. M. Owens // MRS Communications. - 2023. - Vol. 13. - № 5. - P. 685-694.

132. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing / E. van der Pol, F. A. W. Coumans, A. E. Grootemaat [et al.] // Journal of thrombosis and haemostasis. - 2014. -Vol. 12. - № 7. - P. 1182-1192.

133. Perrillo, R. Benefits and risks of interferon therapy for hepatitis B / R. Perrillo // Hepatology. -2009. - Vol. 49. - № 5. - P. 101-103.

134. Pickar-Oliver, A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. / A. Pickar-Oliver, C. A. Gersbach // Nature reviews. Molecular cell biology. - 2019. - Vol. 20. - № 8. -P. 490-507.

135. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics / S. L. N. Maas, J. De Vrij, E. J. Van Der Vlist [et al.] // Journal of Controlled Release. - 2015. - Vol. 200. - P. 87-96.

136. Predicting Relapse after Cessation of Lamivudine Monotherapy for Chronic Hepatitis B Virus Infection / K. Ito, Y. Tanaka, E. Orito [et al.] // Clinical Infectious Diseases. - 2004. - Vol. 38. - № 4. - P. 490-495.

137. Present and future of surface-enhanced Raman scattering / J. Langer, D. Jimenez de Aberasturi, J. Aizpurua [et al.] // ACS nano. - 2019. - Vol. 14. - № 1. - P. 28-117.

138. Prevalence of Pre-existing Antibodies to CRISPR-Associated Nuclease Cas9 in the USA Population / V. L. Simhadri, J. McGill, S. McMahon [et al.] // Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. - 2018. - Vol. 10. - № September. - P. 105-112.

139. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells / H. G. Lamparski, A. Metha-Damani, J.-Y. Yao [et al.] // Journal of immunological methods. - 2002. -Vol. 270. - № 2. - P. 211-226.

140. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage / N. M. Gaudelli, A. C. Komor, H. A. Rees [et al.] // Nature. - 2016. - Vol. 533. - P. 420424.

141. Quantitative proteomics identifies the core proteome of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative universal biomarker / F. G. Kugeratski, K. Hodge, S. Lilla [et al.] // Nature Cell Biology. - 2021. - Vol. 23. - № 6. - P. 631-641.

142. Raman Spectroscopy and Its Modifications Applied to Biological and Medical Research / E. S. Allakhverdiev, V. V Khabatova, B. D. Kossalbayev [et al.] // Cells. - 2022. - Vol. 11. - № 3. - P. 386.

143. Raman spectroscopy as a quick tool to assess purity of extracellular vesicle preparations and predict their functionality / A. Gualerzi, S. A. A. Kooijmans, S. Niada [et al.] // Journal of extracellular

vesicles. - 2019. - Vol. 8. - № 1. - P. 1568780.

144. Raman spectroscopy uncovers biochemical tissue-related features of extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells / A. Gualerzi, S. Niada, C. Giannasi [et al.] // Scientific reports. - 2017. -Vol. 7. - № 1. - P. 1-11.

145. Rapid and Efficient Isolation of Exosomes by Clustering and Scattering / J. Kim, H. Lee, K. Park, S. Shin // Journal of clinical medicine. - 2020. - Vol. 9. - № 3. - P. 650.

146. Rapid isolation and enrichment of extracellular vesicle preparations using anion exchange chromatography / N. Heath, L. Grant, T. M. De Oliveira [et al.] // Scientific reports. - 2018. - Vol. 8. -№ 1. - P. 1-12.

147. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator / A. Cheruvanky, H. Zhou, T. Pisitkun [et al.] // American Journal of Physiology-Renal Physiology. - 2007. - Vol. 292. - № 5. - P. 1657-1661.

148. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolat ion from plasma / J. L. Welton, J. P. Webber, L. Botos [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2015. - Vol. 4. - № 1. -P. 27269.

149. Removal of integrated hepatitis B virus DNA using CRISPR-Cas9 / H. Li, C. Sheng, S. Wang [et al.] // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 2017. - Vol. 7. - № 91. - P. 1-9.

150. Reproducible large-scale isolation of exosomes from adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells and their application in acute kidney injury / J. H. Lee, D. H. Ha, H. Go [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2020. - Vol. 21. - № 13. - P. 4774.

151. Residual matrix from different separation techniques impacts exosome biological activity / L. Paolini, A. Zendrini, G. Di Noto [et al.] // Scientific reports. - 2016. - Vol. 6. - № 1. - P. 1-11.

152. Rider, M. A. ExtraPEG: a polyethylene glycol-based method for enrichment of extracellular vesicles / M. A. Rider, S. N. Hurwitz, D. G. Meckes Jr // Scientific reports. - 2016. - Vol. 6. -P. 23978.

153. RNA Editing with CRISPR-Cas13 / D. B. T. Cox, J. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh [et al.] // Science. - 2017. - Vol. 358. - P. 1019-1027.

154. RNA targeting with CRISPR-Cas13. / O. O. Abudayyeh, J. S. Gootenberg, P. Essletzbichler [et al.] // Nature. - 2017. - Vol. 550. - № 7675. - P. 280-284.

155. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA / A. V Anzalone, P. B. Randolph, J. R. Davis [et al.] // Nature. - 2019. - Vol. 576. - P. 149-157.

156. Seeger, C. Hepatitis B Virus Biology / C. Seeger, W. S. Mason // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 2000. - Vol. 64. - № 1. - P. 51-68.

157. Serum-Derived Exosomal miR-140- 5p as a Promising Biomarker for Differential Diagnosis of Anti-NMDAR Encephalitis With Viral Encephalitis / X. Liu, K. Fan, Q. Lin [et al.] // Frontiers in

Immunology. - 2022. - Vol. 13. - № February. - P. 1-8.

158. Serum hepatitis B virus RNA is encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistence of viral infection and rebound / J. Wang, T. Shen, X. Huang [et al.] // Journal of Hepatology. - 2016. - Vol. 65. - № 4. - P. 700-710.

159. Single-step RT-qPCR for detection of extracellular vesicle microRNAs in vivo: a time-and cost-effective method / H. Lee, X. He, T. Le [et al.] // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. - 2020. - Vol. 318. - № 4. - P. 742-749.

160. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study / B. Vestad, A. Llorente, A. Neurauter [et al.] // Journal of extracellular vesicles. -2017. - Vol. 6. - № 1. - P. 1-11.

161. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis / R. A. Dragovic, C. Gardiner, A. S. Brooks [et al.] // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.

- 2011. - Vol. 7. - № 6. - P. 780-788.

162. SsAAVs containing cassettes encoding SaCas9 and guides targeting hepatitis B virus inactivate replication of the virus in cultured cells / T. Scott, B. Moyo, S. Nicholson [et al.] // Scientific Reports.

- 2017. - Vol. 7. - № 1. - P. 1-11.

163. Stochastic Packaging of Cas Proteins into Exosomes / N. I. Ponomareva, S. A. Brezgin, A. P. Kostyusheva [et al.] // Molecular Biology. - 2024. - Vol. 58. - № 1. - P. 147-156.

164. Super-resolution Imaging of Proton Sponge-Triggered Rupture of Endosomes and Cytosolic Release of Small Interfering RNA. / M. Wojnilowicz, A. Glab, A. Bertucci [et al.] // ACS nano. -2019. - Vol. 13. - № 1. - P. 187-202.

165. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA- guided DNA endonuclease / E. M. Kennedy, L. C. Bassit, H. Mueller [et al.] // Virology. - 2015. - Vol. 476. - P. 196-205.

166. Swelling, Rupture and Endosomal Escape of Biological Nanoparticles Per Se and Those Fused with Liposomes in Acidic Environment. / N. Ponomareva, S. Brezgin, I. Karandashov [et al.] // Pharmaceutics. - 2024. - Vol. 16. - № 5. - P. 667.

167. Takov, K. Comparison of small extracellular vesicles isolated from plasma by ultracentrifugation or size-exclusion chromatography: yield, purity and functional potential / K. Takov, D. M. Yellon, S. M. Davidson // Journal of extracellular vesicles. - 2019. - Vol. 8. - № 1. -P. 1560809.

168. Tang, Y. Class 2 CRISPR/Cas: an expanding biotechnology toolbox for and beyond genome editing. / Y. Tang, Y. Fu // Cell & bioscience. - 2018. - Vol. 8. - P. 59.

169. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid / S. Busatto, G. Vilanilam, T. Ticer [et al.] // Cells. - 2018. - Vol. 7. - № 12. -

P. 273.

170. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication / C. Dong, L. Qu, H. Wang [et al.] // Antiviral Research. - 2015. - Vol. 118. - № April. -P. 110-117.

171. Targets and future direct-acting antiviral approaches to achieve hepatitis B virus cure / T. Asselah, D. Loureiro, N. Boyer, A. Mansouri // The Lancet Gastroenterology & Hepatology. - 2019. -Vol. 4. - № 11. - P. 883-892.

172. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles / S. Brezgin, A. Parodi, A. Kostyusheva [et al.] // Biotechnology Advances. - 2023. - Vol. 64. -№ September 2022. - P. 108122.

173. The Biological Function and Therapeutic Potential of Exosomes in Cancer: Exosomes as Efficient Nanocommunicators for Cancer Therapy. / J. U. Choi, I.-K. Park, Y.-K. Lee, S. R. Hwang // International journal of molecular sciences. - 2020. - Vol. 21. - № 19. - P. 7363.

174. The Endosomal Escape of Nanoparticles: Toward More Efficient Cellular Delivery. / S. A. Smith, L. I. Selby, A. P. R. Johnston, G. K. Such // Bioconjugate chemistry. - 2019. - Vol. 30. - № 2. - P. 263-272.

175. The exosome journey : from biogenesis to uptake and intracellular signalling / S. Gurung, D. Perocheau, L. Touramanidou, J. Baruteau // Cell Communication and Signaling. - 2021. - Vol. 19. -№ 1. - P. 47.

176. The impact of nanoparticle protein corona on cytotoxicity, immunotoxicity and target drug delivery / C. Corbo, R. Molinaro, A. Parodi [et al.] // Nanomedicine. - 2016. - Vol. 11. - № 1. - P. 81100.

177. The incidence and predictors of HBV relapse after cessation of tenofovir therapy in chronic hepatitis B patients / C. H. Chen, Y. C. Hsu, S. N. Lu [et al.] // Journal of Viral Hepatitis. - 2018. -Vol. 25. - P. 590-597.

178. The smart drug delivery system and its clinical potential / D. Liu, F. Yang, F. Xiong, N. Gu // Theranostics. - 2016. - Vol. 6. - № 9. - P. 1306-1323.

179. Three-dimensional hierarchical plasmonic nano-architecture based label-free surface-enhanced Raman spectroscopy detection of urinary exosomal miRNA for clinical diagnosis of prostate cancer / W. Hyun, J. Uk, M. Jin [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. - 2022. - Vol. 205. - № January. -P. 114116.

180. Toward Elimination of Hepatitis B Virus Using Novel Drugs, Approaches, and Combined Modalities / S. Boucle, L. Bassit, M. Ehteshami, R. F. Schinazi // Clinics in Liver Disease. - 2016. -Vol. 20. - № 4. - P. 737-749.

181. Towards traceable size determination of extracellular vesicles / Z. Varga, Y. Yuana, A. E.

Grootemaat [et al.] // Journal of extracellular vesicles. - 2014. - Vol. 3. - № 1. - P. 23298.

182. Update on controls for isolation and quantification methodology of extracellular vesicles derived from adipose tissue mesenchymal stem cells / M. Franquesa, M. J. Hoogduijn, E. Ripoll [et al.] // Frontiers in immunology. - 2014. - Vol. 5. - P. 525.

183. Wiedenheft, B. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea / B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna // Nature. - 2012. - Vol. 482. - № 7385. - P. 331-338.

184. Wu, Y. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers / Y. Wu, W. Deng, D. J. Klinke II // Analyst. - 2015. - Vol. 140. - № 19. -P. 6631-6642.

185. Yoo, S. H. New Potential Therapies for Chronic Hepatitis B / S. H. Yoo, J. H. Kwon // Korean J Gastroenterol. - 2019. - Vol. 74. - № 5. - P. 267-273.

186. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering NIH Public Access / Newman, T. Gaj, C. A. Gersbach, C. F. Barbas // Bone. - 2008. - Vol. 23. - № 1. - P. 1-7.

187. Zhang, H. X. Genome Editing with mRNA Encoding ZFN, TALEN, and Cas9 / H. X. Zhang, Y. Zhang, H. Yin // Molecular Therapy. - 2019. - Vol. 27. - № 4. - P. 735-746.