Обнаружение опухолей на основе идентификации экзосомальных белков в сыворотке крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Никитина, Инна Геннадьевна

• Никитина, Инна Геннадьевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Никитина, Инна Геннадьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль экзосом в процессе канцерогенеза

1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков

1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой

прогрессии и метастазирования

1.1.3. Подавление систем наследственного

и приобретенного иммунитета

1.1.4. Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза

1.1.5. Анализ протеома опухолевых экзосом

1.2. Методы иммуноанализа белков

1.2.1. Общий обзор

1.2.2. Радиоиммуноанализ (РИА)

1.2.3. Иммуно-ферментный анализ (ИФА)

1.2.4. Иммуно-ПЦР

1.2.5. Электрохимический анализ

1.2.6. Коиммунопреципитация хроматина (СЫР)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Антисыворотки

2.2. Коммерческие антитела и их конъюгаты

2.3. Коллекция образцов

2.4. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и

микровезикул

2.5. Экстракция белков

2.6. Электрофорез белков в ПААГ

2.6.1. Трис-глициновая система

2.6.2. Трис-трициновая система

2.7. Окрашивание гелей

2.7.1.Окрашивание гелей Кумасси

2.7.2.0крашивание гелей солями серебра

2.8. Вестерн-блот анализ

2.9. Дот-блот анализ

2.10. Разделение продуктов ПЦР

2.11. Выделение сывороточных экзосом

2.11.1. Выделение экзосом ультрацентрифугированием

2.11.2.Выделение экзосом с использованием препарата Exoquick

2.12. Иммунопреципитация

2.12.1.Иммунопреципитация дефензина 5 из образцов

сыворотки крови

2.12.2.Иммунопреципитация экзосом из образцов сыворотки крови

1

2.13. Получение рекомбинантных фрагментов белков

2.14. Масс-спектрометрический анализ

3

2.15. Получение моноклональных антител

2.16. Очистка моноклональных антител

2.17. Получение высокоаффинных поликлональных антител

2.18. Очистка поликлональных антител

2.19. Иммуно-ПЦР

2.19.1. Синтез праймеров

2.19.2.Конъюгация антител и ДНК-репортера с

магнитными микрошариками

2.19.3. Иммуно-ПЦР в прямом формате

2.19.4. Иммуно-ПЦР в сэндвич формате

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сбор коллекции образцов

3.2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом

3.3. Получение рекомбинантных фрагментов отобранных белков

3.4. Получение высокоаффинных поликлональных антител к фрагментам рекомбинантных белков

3.5. Получение моноклональных антител

3.6. Разработка нового формата иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки

3.6.1. Очистка экзосом из образцов сыворотки крови

3.6.2. Обнаружение рака толстой кишки на основе анализа белков

опухолевых экзосом сыворотки крови

3.6.2.1.Синтез бинарного конъюгата детектирующих антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками

3.6.2.2. Амплификация ДНК-репортера

3.6.2.3.Оценка чувствительности протокола в модельном эксперименте

3.6.2.4. Иммуно-ПЦР сывороточных экзосом

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DTT (dithiothreitol) - дитиотреитол

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) - этилендиаминтетрауксусная кислота

FPLC (fast performance liquid chromatography) - высокоэффективная

жидкостная хроматография

IP (immunoprecipitation) - иммунопреципитация

IPTG (isopropyl P-D-l-thiogalactopyranoside) - изопропил-p-D-1 -

тиогалактопиранозид

MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass

spectrometry) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

времяпролетная масс-спектрометрия

PBS (phosphate buffered saline) - фосфатный буфер

PC (Paneth cells) - клетки Панета

PSA (ammonium persulfate) - персульфат аммония

SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецилсульфат натрия

TEMED (tetramethylethylenediamine) - тетраметилэтилендиамин

a.o. - аминокислотный остаток

БД - база данных

ПААГ - полиакриламидный гель

т.п.о. - тысяча пар оснований

РТК - рак толстой кишки

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

TGF-P (transforming growth factor (3) - трансформирующий фактор роста бета

АСТА2 - а-актин

FGF2 (fibroblast growth factor 2) - фактор роста фибробластов

ATP (adenosine triphosphate) - аденозинтрифосфат

6

VEGF (vascular endothelial growth factor) - фактор роста сосудистого эндотелия

ANGPTL (angiopoietin-like protein) - ангиопоэтин-подобный белок HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor) - гепарин-связывающий фактор роста эпидермиса DEFA (defensin) - дефензин

EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) - молекула эпителиальной

клеточной адгезии

CDH17 (cadherin 17) - кадгерин

СЕАСАМ 5 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5) -раково-эмбриональный антиген

MMP14 (matrix metallopeptidase 14, membrane-inserted) - металлопептидаза матрикса

PCNA (proliferating cell nuclear antigen) - ядерный антиген пролиферирующих клеток

ИФА - иммуно-ферментный анализ

СТА - стрептавидин

ILPCR - иммуно-липосомный ПЦР-тест

ChIP - коиммунопреципитация хроматина

ChlP-seq - коиммунопреципитация хроматина с последующим

секвенированием

ChIP-on-Chip - коиммунопреципитация хроматина с последующей гибридизацией к микрочипам

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Обнаружение опухолей на основе идентификации экзосомальных белков в сыворотке крови»

ВВЕДЕНИЕ

Одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии является разработка новых способов молекулярной диагностики заболеваний, одним из наиболее распространённых типов которых является рак толстой кишки (РТК). Современные методы сывороточной диагностики рака основаны на количественном анализе содержания проникающих в кровоток биомаркеров (белков, ДНК и некодирующих РНК), содержание которых заметно возрастает в сыворотке крови при развитии опухоли. Однако идентифицированные до настоящего времени потенциальные белковые маркеры РТК пока недостаточно надежны, а имеющиеся методы их детекции недостаточно чувствительны для диагностики рака в образцах сыворотки крови населения из групп повышенного риска [1]. На протяжении многих лет прилагались значительные усилия для разработки клинических тестов для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга повторного роста опухолей толстой кишки и их метастазирования. Тем не менее, разработанные тесты почти не используются в клинической практике вследствие их низкой чувствительности и специфичности.

Одним из наиболее перспективных подходов к созданию клинических тестов для диагностики и прогнозирования заболеваний является анализ молекулярного состава опухолевых экзосом. Экзосомы (т.е. покрытые липидной мембраной микропузырьки) экспортируются в кровоток большинством типов клеток в процессе межклеточной коммуникации [2, 3]. Молекулярный состав и количество экзосом заметно изменяются при возникновении целого ряда заболеваний. Многочисленные исследования показали, что количество экзосом в крови (в норме составляющее 100-400 миллионов частиц на мл) резко возрастает в процессе канцерогенеза. На последних стадиях развития опухолей различных типов (в отсутствие

метастазирования) количество опухолевых экзосом может составлять до 30% от общего количества экзосом сыворотки крови [4].

Поскольку количество опухолевых экзосом в кровотоке и некоторых других биологических жидкостях (лимфе, слюне, моче, молоке, желчи и.т.д.) резко увеличивается в процессе злокачественной трансформации, вследствие их массового экспорта раковыми клетками, анализ биомаркеров экзосом открывает возможность эффективной диагностики раковых заболеваний [5]. Анализ биомаркеров опухолевых экзосом, циркулирующих в кровотоке, обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами детекции биомаркеров сыворотки. Поскольку опухолевые экзосомы формируются из эндоплазматической мембраны клетки [6], репертуар имеющихся на их поверхности мембранных белков хорошо коррелирует с репертуаром мембранных белков экспортирующих их опухолевых клеток. Это открывает возможность очистки опухолевых экзосом из биологического образца с использованием иммуно-аффинной хроматографии. Аффинная очистка опухолевых экзосом с использованием иммобилизованных антител к опухолеспецифичным или тканеспецифичньш поверхностным белкам позволяет полностью удалить компоненты сыворотки (или другой биологической жидкости), а также нормальные экзосомы неопухолевой природы и тем самым резко повысить специфичность диагностического теста. Дополнительным преимуществом анализа экзосом является то, что число копий индивидуального белка в их мембране обычно весьма велико. В результате, вследствие амплификации сигнала, тесты, основанные на детекции присутствия индивидуального белка или другого биомаркера в препарате опухолевых экзосом, аффинно очищенных из сыворотки, заметно более чувствительны, чем при использовании традиционных методов иммуноанализа.

Детекция тканеспецифичных или опухолеспецифичных биомаркеров

опухолевых экзосом открывает возможность диагностики рака. При этом в

качестве диагностических маркеров могут использоваться белки и мРНК

9

экзосом [7, 8], а также некодирующие РНК, т.е. микроРНК [9] и пока почти не используемые в диагностике длинные некодирующие РНК [5]. Полученные в последние годы результаты показывают, что анализ состава сывороточных экзосом позволяет заметно увеличить чувствительность методов диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга различных видов опухолей, а также к расширению арсенала методов персонализированной медицины.

Основной целью данной работы являлась разработка нового способа обнаружения опухолей толстой кишки, основанного на сывороточной детекции белков опухолевых экзосом с использованием иммуно-ПЦР. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей толстой кишки, а также сывороток здоровых доноров и сывороток крови пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.

2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул.

3. Получение высокоаффинных антител к идентифицированным белкам.

4. Разработка новой модификации метода очистки опухолевых экзосом из образцов сыворотки пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.

5. Разработка нового формата иммуно-ПЦР, основанного на использовании бинарных конъюгатов ДНК-репортера и антител к активированной поверхности микрошариков. Определение предела чувствительности детекции нового формата в модельном эксперименте.

6. Сравнительный анализ содержания идентифицированных в п. 2 мембранных белков в составе опухолевых экзосом, аффинно очищенных из сыворотки крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки и здоровых доноров, с использованием нового формата иммуно-ПЦР.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РОЛЬ ЭКЗОСОМ В ПРОЦЕССЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков.

Значительное повышение чувствительности и специфичности

иммуноанализа может быть достигнуто в результате предварительного

удаления из образца большинства посторонних белков. Одним из наиболее

часто используемых методов такого рода является аффинная очистка из

образцов биологических жидкостей экзосом, т.е. покрытых мембраной

микропузырьков секретируемых в окружающее пространство

прокариотическими и эукариотическим клетками в процессе межклеточной

коммуникации [2, 3]. Первоначально секретируемые во внеклеточный

матрикс, микропузырьки в дальнейшем попадают в кровь, лимфу и другие

биологические жидкости и переносятся на значительное расстояние от

клетки-донора. Слияние микропузырьков с клеткой-реципиентом приводит к

проникновению в ее цитоплазму белков, липидов, мРНК, а также

некодирующих РНК клетки-донора, что приводит к

«перепрограммированию» клетки-реципиента [10]. Этим действие

микропузырьков не ограничивается, поскольку содержащиеся в них

металлопептидазы участвуют в деградации внеклеточного матрикса при

перестройке и регенерации тканей [11]. Многолетние исследования показали,

что микропузырьки играют важную роль в функционировании

приобретённого иммунитета [12, 13], воспалительных процессах [14. 15] и

эмбриогенезе [16]. В норме уровень секреции микропузырьков и их состав

меняются в ответ на различные стимулы, например, при изменении

концентрации кальция в клетках крови [17], деполяризации нейронов [18], а

также сразу после потери клетками способности к адгезии к поверхности

чашки Петри в процессе культивирования [19]. Кроме того, уровень секреции

и состав микропузырьков заметно изменяются при целом ряде патологий [20,

И

21]. Выявление тканеспецифичных маркеров микропузырьков, секретируемых в кровоток пораженными клетками, может найти применение в клинической практике для диагностики и мониторинга целого ряда заболеваний, включая вирусные инфекции [22], нейродегенеративные и сердечнососудистые заболевания [23, 24], болезни печени и почек [25], а также различных видов рака [26].

Эукариотические микропузырьки подразделяются на экзосомы (диаметром 40-100 нм), более крупные микровезикулы (100-1000 нм) и апоптотические тельца (1-5 мкм) [27, 28]. Наиболее изученным классом микропузырьков являются экзосомы, которые образуются из интралюминальных мультивезикулярных частиц, в свою очередь формирующихся в результате отпочкования частей мембраны поздних эндосом. В процессе отпочкования мембраны происходит захват мембранных, цитоплазматических и ядерных белков клетки, а также цитоплазматических мРНК, микроРНК и длинных некодирующих РНК, содержащихся в эндосомах.

Возникает вопрос, каким образом клетка-реципиент узнает микропузырьки,

адресованные ей клеткой-донором для последующего слияния?

Исследования последних лет показали, что в процессе узнавания участвуют

трансмембранные рецепторы межклеточной адгезии, относящиеся к

семействам интегринов, кадгеринов и селектинов [29]. При этом

взаимодействующие друг с другом рецепторы, расположенные на

поверхности микропузырька и клетки-реципиента, не только принадлежат к

одному и тому же семейству, но и имеют одинаковую первичную структуру.

Таким образом, процесс узнавания микропузырьков, адресованных клеткой-

реципиентом, основан на образовании димеров или олигомеров идентичных

молекул (так называемом гомофильном связывании). На следующей стадии

происходит слияние микропузырька с клеткой-реципиентом и частичное

перепрограммирование ее метаболизма [30], обусловленное действием трёх

процессов: 1) прямого влияния содержащихся в микропузырьках молекул

белков, а также транслируемых в белки мРНК [31, 32]; 2) регуляции уровня

12

трансляции клеточных мРНК экзосомальными микроРНК [10]; 3) эпигенетических изменений структуры и функции хроматина в ядре клетки-реципиента содержащимися в экзосомах ядерными белками и длинными некодирующими РНК [33].

1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования. Радикальное повышение уровня секреции опухолевых экзосом происходит при возникновении рака. При этом опухолевые экзосомы приобретают способность к связыванию и перепрограммированию трех основных типов клеток-реципиентов, проникающих в очаги воспаления и поражения тканей:

1.Зрелых клеток (главным образом фибробластов, клеток периферической иммунной системы и клеток эндотелия).

2.Клеток-предшественников зрелых клеток.

3.Циркулирующих в кровотоке мультипотентных стволовых клеток костного мозга, из которых образуются клетки-предшественники, играющие основную роль в регенерации и репарации тканей [31]. Такие клетки были впервые описаны в работе российского ученого Фриденштейна с соавторами в 1974 году [34].

Наиболее часто при изучении роли опухолевых экзосом в процессах

перепрограммирования клеток используется экспериментальный подход,

основанный на анализе результатов слияния опухолевых экзосом с

клеточными культурами. Многолетние исследования показали, что

очищенные из культуральной среды экзосомы, продуцируемые опухолевыми

клетками, индуцируют дифференцировку зрелых стромальных

(мезенхимных) клеток и их предшественников в миофибробласты [35, 36].

Одной из причин изменения направления клеточной дифференцировки

считается проникновение в клетку-реципиент комплексов

трансформирующего фактора роста бета (ТвР-Р) с его рецептором,

находящихся на поверхности опухолевых экзосом (Рис. 1). Последующая

13

активация сигнальных путей клетки-реципиента приводит к фосфорилированию проникающих в ядро факторов транскрипции семейства 8МАБ и эпигенетически наследуемым изменениям структуры хроматина, в результате чего повышается уровень экспрессии генов, кодирующих а-актин гладкой мускулатуры (АСТА2) и фактор роста фибробластов (РОР2). Кроме того, в результате слияния стромальных клеток с опухолевыми экзосомами инициируется массовая секреция аутокринных факторов, стимулирующих рост и пролиферацию клеток-реципиентов, а также паракринных факторов, стимулирующих пролиферацию опухолевых клеток-доноров экзосом [30, 37] (Рис. 1).

CD44- инвазия.. миграция и внедрение опухолевых клеток во вторичный сайт

А

Дегрддади и сборка внеклеточного матрикса

оэм

V

Перепрограммирование клет ск-рецнпиенгов

М у льтип огентны е стволовые клетки

=>

Клетки -пр едшеств енннки

тканш

=>

Зрелые клетки тканей

V

Прогрессия и м етастазир ов ан и е: TGFp/TGFpR -секреция аутокринных и паракринных факторов клеточной пролиферации СМЕТ-м етастазир о ванн е Подавление иммунного ответа: ILlO.TGFp-ингибирование киллеров и лимфоцитов Fas лиганд - апоптоз лимфоцитов CD39, CD73 -ингибирование лейкоцитов, лимфоцитов и макрофагов аденозином Активация васкуляризации и ангиогенеза: СМЕТ, С-КГГ» ТГЕ2 VEGF и AGPT

Рисунок 1. Роль опухолевых экзосом в процессе канцерогенеза (жирным шрифтом выделены белки экзосом, участие которых в этом процессе показано экспериментально).

Недавно было показано, что опухолевые экзосомы также сливаются с циркулирующими в кровотоке мультипотентными стволовыми некроветворными клетками костного мозга. Эти клетки перемещаются под действием хемоаттрактантов по кровеносной и лимфатической системам к районам воспаления, поражения или регенерации мышц, печени, легких и других органов [34]. В результате слияния опухолевых экзосом с

проникшими в различные органы стволовыми клетками, последние начинают генерировать сигналы, необходимые для выживания и размножения раковых клеток, которые проникают в различные органы через кровеносную и лимфатическую системы. В результате, за пределами первичной опухоли возникают метастатические ниши, часть из которых развивается в метастатические фокусы.

Ключевая роль опухолевых экзосом в процессе метастазирования была установлена экспериментально. При этом в хвостовую вену мышей вводили клетки метастатической меланомы мыши (линия В16-Р10) или происходящей из нее линии, не секретирующей опухолевых экзосом [31]. В последнем случае секреция экзосом подавлялась в результате ингибирования синтеза необходимого для их образования белка ЯаЬ27А с помощью трансфекции клеток малой интерферирующей РНК. Оказалось, что количество метастатических фокусов в легких мышей, которым ввели опухолевые клетки, секретирующие лишь небольшое количество опухолевых экзосом, было намного меньше, чем при введении стандартной линии опухолевых клеток. В результате дальнейшего анализа был идентифицирован ключевой индуктор перепрограммирования клеток-предшественников костного мозга клетками злокачественной меланомы - онкобелок с-МЕТ, резкое снижение уровня синтеза которого в результате трансфекции опухолевых клеток малой интерферирующей РНК предотвращало развитие метастазирования (Рис. 1) [31].

Важный вклад в изучение роли опухолевых экзосом в процессе канцерогенеза внес эксперимент, основанный на анализе результатов слияния экзосом, секретируемых клетками опухолей эпителиального происхождения, со стволовыми опухолевыми клетками мезенхимной природы [38]. Недавно было показано, что клетки первичной опухоли разделяются на две группы:

1. Обычные опухолевые клетки эпителиальной природы.

2. Мезенхимальные, мультипотентные стволовые опухолевые клетки (составляющие около одной тысячной объема опухоли) из которых образуются обычные опухолевые клетки. Обычные опухолевые клетки в свою очередь в редких случаях способны превращаться в стволовые клетки в результате эпителиально-мезенхимальной транзиции (ЕМТ) [39]. Эксперимент показал, что результаты слияния экзосом, секретируемых двумя вышеописанными типами клеток с клетками-реципиентами, заметно отличаются. Так, внутривенное введение иммунодефицитным мышам БСГО опухолевых экзосом, секретируемых мезенхимными стволовыми СБ105+-клетками рака почки человека (но не обычными, нестволовыми клетками рака почки эпителиальной природы), перед инъекцией самих стволовых опухолевых клеток резко увеличивает количество метастатических фокусов в легких мышей. Как показано ниже, аналогичная картина наблюдалась и в процессах активации васкуляризации и ангиогенеза. Результаты эксперимента позволяют сделать два важных вывода:

1. Движущей силой процесса метастазирования является миграция мезенхимных стволовых опухолевых клеток во вторичный сайт роста опухоли (метастатическую нишу).

2. Стромальные клетки ниши, также как и мигрирующие в различные органы

клетки костного мозга, по-видимому, подвергаются перепрограммированию

в результате слияния с экзосомами, секретируемыми в кровеносную и

лимфатическую системы организма стволовыми опухолевыми клетками.

Важную роль в инвазии опухоли в сопредельные ткани и последующем

проникновении опухолевых клеток в кровоток играет индуцируемая

опухолевыми клетками и секретируемыми ими экзосомами деградация

внеклеточного матрикса металлопептидазами [40, 41, 42]. Недавно

установлено, что при внедрении опухолевой стволовой клетки в

метастатическую нишу происходит обратный процесс локальной сборки

внеклеточного матрикса из растворимых компонентов, содержащихся в

тканевой жидкости, опосредованный трансмембранным рецептором

17

металлопептидаз CD44, представленным на поверхности стволовых опухолевых клеток и секретируемых ими экзосом (Рис. 1). В результате, генетический нокаут гена, кодирующего белок CD44, приводит к резкому понижению инвазивности опухолей поджелудочной железы и частоты их метастазирования [43].

1.1.3. Подавление систем наследственного и приобретенного иммунитета.

Многочисленные эксперименты показали, что подавление обеих систем иммунитета обусловлено слиянием опухолевых экзосом с клетками иммунной системы (лейкоцитами, лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками) и их предшественниками, в результате чего инициируется целый ряд процессов [44 ,45]. Во-первых, подавляется активация и пролиферация, как естественных клеток-киллеров (NK-киллеров), так и цитотоксических Т-лимфоцитов в ответ на воздействие интерлейкина 2 (IL2) [46]. Ингибирование клеточной активности в этом случае является результатом действия содержащегося в опухолевых экзосомах цитокина интерлейкина 10 (ILIO) и белка TGF-ß (Рис. 1). В процессе ингибирования, по-видимому, принимают участие и кодирующие эти белки экзосомальные мРНК, транслируемые в цитоплазме клетки-реципиента [47]. Во-вторых, в результате действия расположенного на поверхности опухолевых экзосом Fas-лиганда индуцируется апоптоз цитотоксических Т-лимфоцитов [48]. Наконец, еще один механизм подавления иммунной системы состоит в локальном гидролизе АТР расположенными на поверхности опухолевых экзосом белками CD39 и CD73 (Рис. 1). Образующийся в результате гидролиза АТР аденозин супрессирует функционирование лейкоцитов, макрофагов и лимфоцитов, на поверхности которых находятся рецепторы аденозина. В норме такой механизм локальной супрессии иммунного ответа осуществляется регуляторными Т-лимфоцитами [49].

Интересно, что слияние опухолевых экзосом с антиген-представляющими дендритными клетками и макрофагами, активированными сигналами системы врожденного иммунитета, приводит к прямо противоположному результату: активации этих клеток, а также пролиферации лимфоцитов [50]. При этом в опухолевых клетках запускаются механизмы избегания системы приобретенного иммунитета, основанные на ингибировании дифференцировки моноцитов в дендритные клетки [44, 51]. Эти механизмы основаны на активации регуляторных Т-клеток, супрессирующих иммунный ответ, и их предшественников, опосредуемой содержащимся в опухолевых экзосомах белком теплового шока Hsp72 [52, 53].

Недавно было показано, что важную роль в активации антиген-представляющих клеток играют микроРНК опухолевых экзосом [54]. Так, слияние опухолевых экзосом, очищенных из сыворотки крови больных раком легкого, с первичными культурами макрофагов приводило к активации системы врожденного иммунитета в результате присоединения содержащихся в экзосомах микроРНК miR-21 и miR-29a к То11-подобному рецептору TLR8, который локализуется в мембране эндосом макрофагов. Результаты, полученные в культуре клеток, были подтверждены в опытах in vivo, в которых в хвостовую вену мышей вводили клетки мышиной карциномы легких Льюиса. В качестве контроля использовались опухолевые клетки, в которых функционирование микроРНК miR-21 и miR-29a подавлялось в результате трансфекции клеток антисмысловыми РНК. При этом количество метастатических фокусов, образующихся в лёгких мышей, оказалось значительно меньше, чем в эксперименте. Таким образом, была подтверждена важная роль опухолевых экзосом в инициации каскада прометастатических воспалительных процессов, инициируемых вследствие связывания экзосомальных микроРНК с TLR-рецепторами макрофагов. Этот результат открывает новые возможности в терапии опухолей [54].

1.1.4. Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза. Прогрессию опухолей, размер которых достиг 1 мм, ограничивает активация процесса новообразования сосудов из циркулирующих в кровотоке ангиобластов (васкуляризация), а также роста и разветвления уже существующих сосудов (ангиогенез). Показано, что слияние опухолевых экзосом с клетками-предшественниками эндотелия (ангиобластами) приводит к локальной активации обоих процессов, что позволяет увеличить доставку в опухоль кислорода и питательных веществ [38, 55]. Анализ белкового состава экзосом, секретируемых опухолевыми клетками в культуральную среду, привел к идентификации ряда активаторов пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. В перечень идентифицированных активаторов входят:

1. Белки семейства фактора роста сосудистого эндотелия (YEGF) и ангиопоэтина (ANG и ANGPTL) (Рис. 1) [36, 38].

2. Фактор роста фибробластов (FGF) и гепарин-связывающий фактор роста эпидермиса (HB-EGF) [38].

3. Хемоаттрактант эндотелиальных клеток и их предшественников SDF-1 [36]

4. Проангиогенный комплекс факторов свертывания крови TF и Vila [55].

5. Металлопептидазы ММР2 и ММР9, деградирующие внеклеточный матрикс [38].

Показано, что миграция клеток-предшественников эндотелиальных клеток,

мигрирующих из костного мозга в район опухолевой гипоксии, значительно

усиливается в результате их слияния с опухолевыми экзосомами. Усиление

миграции является следствием изменений в содержании белков

межклеточной адгезии [56, 57] и ингибирования сигнального пути белка

Notch [58]. Наконец, было показано, что слияние экзосом, секретируемых

клетками мышиной меланомы, с ангиобластами приводит к эпигенетически

наследуемому (в результате метилирования промотора и перестройки

хроматина) повышению уровня экспрессии протоонкогенов c-Met и с-Kit, а

20

также гена, кодирующего рецептор семейства ангиопоэтинов Tie2 (Рис. 1)

[31].

Анализ результатов слияния опухолевых экзосом с находящимися в опухоли зрелыми клетками эндотелия и их предшественниками продемонстрировал, что следствием слияния является локальная индукция васкуляризации и ангиогенеза [38, 58]. Эти данные были получены в эксперименте, основанном на сравнении количества сосудов, которые образовались после подкожной имплантации иммунодефицитным SCID-мышам клеток пуповинной вены человека (HUVEC) и тех же клеток, предварительно обработанных in vitro опухолевыми экзосомами, секретируемыми опухолями почек человека. При этом было показано, что резкая активация образования сосудов происходит лишь при слиянии с экзосомами, секретируемыми мезенхимными, мультипотентными стволовыми опухолевыми CD 105+-клетками, но не экзосомами, секретируемыми обычными опухолевыми клетками эпителиальной природы [38, 59].

1.1.5. Анализ протеома опухолевых экзосом. В качестве маркеров для диагностики рака наиболее часто используются белки и микроРНК опухолевых экзосом [9]. В исследованиях последних лет с использованием масс-спектрометрии и Вестерн-блоттинга были идентифицированы экзосомальные белки, секретируемые нормальными и опухолевыми клетками доноров [60-64]. Подробный перечень белков, содержащихся в экзосомах и микровезикулах секретируемых нормальными и опухолевыми клетками, содержится в базах данных ExoCarta и Vesiclepedia. Однако имеющиеся данные часто не воспроизводятся вследствие следующих причин:

1. Различиям в методах очистки экзосом (центрифугирование в градиенте плотности, ультрафильтрация и аффинная хроматография).

2. Трудности надежного разделения экзосом и более крупных микровезикул, белковый состав которых заметно отличается от состава экзосом [65].

3. Различиям в методах разделения экзосомальных белков и продуктов их трипсинолиза (одно- или двумерный электрофорез, различные варианты хроматографии) и методах масс-спектрометрической идентификации пептидов (MS/MS, MALDI-TOF-MS и MALDI-TOF/TOF) [63, 66, 67]. Результаты анализа, проведенного с использованием различных технологических платформ, показали, что протеомы экзосом и производящих их клеток заметно различаются. При этом в протеоме экзосом можно выделить как группу белков, синтезируемых повсеместно, вне зависимости от разновидности клетки-продуцента, так и тканеспецифичные и опухолеспецифичные экзосомальные белки. Важным результатом сравнительного протеомного анализа стало обнаружение того факта, что большое количество специфичных белков, секретируемых в составе опухолевых экзосом, принимают участие в опухолевой прогрессии [67, 57]. Показано, что наиболее распространенные функции экзосомальных белков состоят в регуляции формирования клеточного цитоскелета, адгезии клеток, а также в регуляции сигнальных путей, активность которых заметно меняется в процессе канцерогенеза: ингибировании апоптоза, активации образования сосудов и подавлении иммунного ответа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Никитина, Инна Геннадьевна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. United States Cancer Statistics: 1999-2010 Incidence and Mortality Web-based Report, http://apps.nccd.cdc.gov/uscs/toptencancers.aspx

2. Nieuwland R, Sturk A. Why do cells release vesicles? Thromb Res. 2010 Apr; 125 Suppl 1:S49-51.

3. Silverman JM, Reiner NE. Exosomes and other microvesicles in infection biology: organelles with unanticipated phenotypes. Cell Microbiol. 2011 Jan; 13(l):l-9.

4. Khan S, Jutzy JM, Valenzuela MM, Turay D, Aspe JR, Ashok A, Mirshahidi

5. Mercola D, Lilly MB, Wall NR. Plasma-derived exosomal survivin, a plausible biomarker for early detection of prostate cancer. PLoS One. 2012;7(10):e46737

5. Huang X, Yuan T, Tschannen M, Sun Z, Jacob H, Du M, Liang M, Dittmar RL, Liu Y, Liang M, Kohli M, Thibodeau SN, Boardman L, Wang L. Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing. BMC Genomics. 2013 May 10;14:319.

6. Simona F, Laura S, Simona T, Riccardo A. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 2013 May;13(10-11):1581-94.

7. Friel AM, Corcoran C, Crown J, O'Driscoll L. Relevance of circulating tumor cells, extracellular nucleic acids, and exosomes in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2010 Oct;123(3):613-25.

8. Klein-Scory S, Kiibler S, Diehl H, Eilert-Micus C, Reinacher-Schick A, Stiihler K, Warscheid B, Meyer HE, Schmiegel W, Schwarte-Waldhoff I. Immunoscreening of the extracellular proteome of colorectal cancer cells. BMC Cancer. 2010 Feb 25; 10:70.

9. Krutovskikh VA, Herceg Z. Oncogenic microRNAs (OncomiRs) as a new class of cancer biomarkers. Bioessays. 2010 0ct;32(10):894-904.

10. Batagov A.O., Kuznetsov V.A., Kurochkin I.V. 2011. Identification of nucleotide patterns enriched in secreted RNAs as putative cis-acting elements targeting them to exosome nano-vesicles. BMC Genomics. 12(Suppl 3), S18.

11. Roberson C.D., Atay S., Gercel-Taylor C., Taylor D.D. 2010--2011. Tumor-derived exosomes as mediators of disease and potential diagnostic biomarkers. Cancer Biomark. 8(4-5), 281-291.

12. Vincent-Schneider H., Stumptner-Cuvelette P., Lankar D., Pain S., Raposo G., Benaroch P., Bonnerot C. 2002. Exosomes bearing HLA-DR1 molecules need dendritic cells to efficiently stimulate specific T cells. Int. Immunol. 14(7), 7X3— 722.

13. Théry C., Duban L., Segura E., Véron P., Lantz O., Amigorena S. 2002. Indirect activation of naïve CD4+ T cells by dendritic cell-derived exosomes. Nat. Immunol. 3(12), 1156-1162.

14. Bhatnagar S., Shinagawa K., Castellino F.J., Schorey J.S. 2007. Exosomes released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and in vivo. Blood. 110(9), 3234-3244.

15. Kim S.H., Lechman E.R., Bianco N., Menon R., Keravala A., Nash J., Mi Z., Watkins S.C., Gambotto A., Robbins P.D. 2005. Exosomes derived from IL-10-treated dendritic cells can suppress inflammation and collagen-induced arthritis. J. Immunol. 174(10), 6440-6448.

16. Liégeois S., Benedetto A., Gamier J.M., Schwab Y., Labouesse M. 2006. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. J .Cell Biol. 173(6), 949-961.

17. Savina A., Furlân M., Vidal M., Colombo M.I. 2003. Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. J. Biol. Chem. 278(22), 20083-20090.

18. Fauré J., Lachenal G., Court M., Hirrlinger J., Chatellard-Causse C., Blot B., Grange J., Schoehn G., Goldberg Y., Boyer V., Kirchhoff F., Raposo G., Garin J., Sadoul R. 2006. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Mol. Cell Neurosci. 31(4), 642-648.

19. Koumangoye R.B., Sakwe A.M., Goodwin J.S., Patel T., Ochieng J. 2011. Detachment of breast tumor cells induces rapid secretion of exosomes which subsequently mediate cellular adhesion and spreading. PLoS One. 6(9), e24234.

20. Anderson H.C., Mulhall D., Garimella R. 2010. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90(11), 1549-1557.

21. Van der Pol E., Bôing A.N., Harrison P., Sturk A., Nieuwland R. 2012. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacol. Rev. 64(3), 676-705.

22. Lenassi M., Cagney G., Liao M., Vaupotic T., Bartholomeeusen K., Cheng Y., Krogan N.J., Plemenitas A., Peterlin B.M. 2010. HIV Nef is secreted in exosomes and triggers apoptosis in bystander CD4+ T cells. Traffic. 11(1), 110122.

23. Vingtdeux V., Sergeant N., Buée L. 2012. Potential contribution of exosomes to the prion-like propagation of lesions in Alzheimer's disease. Front Physiol. 3, 229.

24. Kuwabara Y., Ono K., Horie T., Nishi H., Nagao K., Kinoshita M., Watanabe S., Baba O., Kojima Y., Shizuta S., Imai M., Tamura T., Kita T., Kimura T. 2011. Increased microRNA-1 and microRNA-133a levels in serum of patients with cardiovascular disease indicate myocardial damage. Circ. Cardiovasc Genet. 4(4), 446^54.

25. Bala S., Petrasek J., Mundkur S., Catalano D., Levin I., Ward J., Alao H., Kodys K., Szabo G. 2012. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56(5), 1946-1957.

26. Rak J. 2010. Microparticles in cancer. Semin. Thromb. Hemost. 36(8), 888906.

27. Gyôrgy B., Szabô T.G., Pâsztôi M., Pal Z., Misjâk P., Aradi B., Lâszlô V., Pâllinger E., Pap E., Kittel A., Nagy G., Falus A., Buzâs E.I. 2011. Membrane

vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol. Life Sci. 68(16), 2667-2688

28. Lai C.P., Breakefield X.O. 2012. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Front Physiol. 3, 228.

29. Pluskota E., Woody N.M., Szpak D., Ballantyne C.M., Soloviev D.A., Simon D.I., Plow E.F. 2008. Expression, activation, and function of integrin alphaMbeta2 (Mac-1) on neutrophil-derived microparticles. Blood. 112(6), 23272335.

30. Kharaziha P., Ceder S., Li Q., Panaretakis T. 2012. Tumor cell-derived exosomes: a message in a bottle. Biochim. Biophys. Acta. 1826(1), 103-111.

31. Peinado H., Aleckovic M., Lavotshkin S., Matei I., Costa-Silva B., Moreno-Bueno G., Hergueta-Redondo M., Williams C., Garcia-Santos G., Ghajar C., Nitadori-Hoshino A., Hoffman C., Badal K., Garcia B.A., Callahan M.K., Yuan J., Martins V.R., Skog J., Kaplan R.N., Brady M.S., Wolchok J.D., Chapman P.B., Kang Y., Bromberg J., Lyden D. 2012. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18(6), 883-891.

32. Hong B.S., Cho J.H., Kim H., Choi E.J., Rho S., Kim J., Kim J.H., Choi D.S., Kim Y.K., Hwang D., Gho Y.S. 2009. Colorectal cancer cell-derived microvesicles are enriched in cell cycle-related mRNAs that promote proliferation of endothelial cells. BMC Genomics. 10, 556.

33. Quesenberry PJ, Aliotta JM. Cellular phenotype switching and microvesicles. 2010. Adv Drug Deliv Rev. 62(12): 1141-8.

34. Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luriá EA, Ruadkow IA. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 1974; 2(2):83-92.

35. Webber J., Steadman R., Mason M.D., Tabi Z., Clayton A. 2010. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70(23), 9621-9630.

36. Cho J.A., Park H., Lim E.H., Lee K.W. 2012. Exosomes from breast cancer cells can convert adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into myofibroblast-like cells. Int. J. Oncol. 40(1), 130-138.

37. Cho J.A., Park H., Lim E.H., Kim K.H., Choi J.S., Lee J.H., Shin J.W., Lee K.W. 2011. Exosomes from ovarian cancer cells induce adipose tissue-derived mesenchymal stem cells to acquire the physical and functional characteristics of tumor-supporting myofibroblasts. Gynecol Oncol. 123(2), 379-386.

38. Grange C., Tapparo M., Collino F., Vitillo L., Damasco C., Deregibus M.C., Tetta C., Bussolati B., Camussi G. 2011. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71(15), 5346-5356.

39. Castellanos JA, Merchant NB, Nagathihalli NS. Emerging targets in pancreatic cancer: epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cells. Onco Targets Ther. 2013 Sep 13;6:1261-1267.

40. Janowska-Wieczorek A., Wysoczynski M., Kijowski J., Marquez-Curtis L., Machalinski B., Ratajczak J., Ratajczak M.Z. 2005. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. Int. J. Cancer. 113(5), 752-760.

41. Yang C., Robbins P.D. 2011. The roles of tumor-derived exosomes in cancer pathogenesis. Clin. Dev. Immunol. 2011, 842849

42. Ge R., Tan E., Sharghi-Namini S., Asada H.H. 2012. Exosomes in cancer microenvironment and beyond: have we overlooked these extracellular messengers? Cancer Microenviron. 5(3), 323-332.

43. Jung T., Castellana D., Klingbeil P., Cuesta Hernández I., Vitacolonna M., Orlicky D.J., Roffler S.R, Brodt P., Zoller M. 2009. CD44v6 dependence of premetastatic niche preparation by exosomes. Neoplasia. 11(10), 1093-1105.

44. Clayton A. 2012. Cancer cells use exosomes as tools to manipulate immunity and the microenvironment. Oncoimmunology. 1(1), 78-80.

45. Filipazzi P., Biirdek M., Villa A., Rivoltini L., Huber V. 2012. Recent advances on the role of tumor exosomes in immunosuppression and disease progression. Semin. Cancer Biol. 22(4), 342-349.

46. Clayton A., Mitchell J.P., Court J., Mason M.D., Tabi Z. 2007. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67(15), 7458-7466.

47. Szczepanski M.J., Szajnik M., Welsh A., Whiteside T.L., Boyiadzis M. 2011. Blast-derived microvesicles in sera from patients with acute myeloid leukemia suppress natural killer cell function via membrane-associated transforming growth factor-betal. Haematologica. 96(9), 1302-1309.

48. Abusamra A.J., Zhong Z., Zheng X., Li M., Ichim T.E., Chin J.L., Min W.P. 2005. Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis. Blood Cells Mol. Dis. 35(2), 169-173.

49. Clayton A., Al-Taei S., Webber J., Mason M.D., Tabi Z. 2011. Cancer exosomes express CD39 and CD73, which suppress T cells through adenosine production. J. Immunol. 187(2), 676-683.

50. Marton A., Vizier C., Kusz E., Temesfoi V., Szathmary Z., Nagy K., Szegletes Z., Varo G., Siklos L., Katona R.L., Tubak V., Howard O.M., Duda E., Minarovits J., Nagy K., Buzas K. 2012. Melanoma cell-derived exosomes alter macrophage and dendritic cell functions in vitro. Immunol. Lett. 148(1), 34-38.

51. Zhang H.G., Grizzle W.E. 2011. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin. Cancer Res. 17(5), 959-964.

52. Szajnik M., Czystowska M., Szczepanski M.J., Mandapathil M., Whiteside T.L. 2010. Tumor-derived microvesicles induce, expand and up-regulate biological activities of human regulatory T cells (Treg). PLoS One. 5(7), el 1469

53. Chalmin F., Ladoire S., Mignot G., Vincent J., Bruchard M., Remy-Martin

J.P., Boireau W., Rouleau A., Simon B., Lanneau D., De Thonel A., Multhoff G.,

Hamman A., Martin F., Chauffert B., Solary E., Zitvogel L., Garrido C., Ryffel B.,

Borg C., Apetoh L., Rebe C., Ghiringhelli F. 2010. Membrane-associated Hsp72

from tumor-derived exosomes mediates STAT3-dependent immunosuppressive

90

function of mouse and human myeloid-derived suppressor cells. J. Clin. Invest. 120(2), 457-471.

54. Fabbri M., Paone A., Calore F., Galli R., Gaudio E., Santhanam R., Lovat F., Fadda P., Mao C., Nuovo G.J., Zanesi N., Crawford M., Ozer G.H., Wernicke D., Alder H., Caligiuri M.A., Nana-Sinkam P., Perrotti D., Croce C.M. 2012. MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109(31), E2110-2116.

55. Svensson K.J., Kucharzewska P., Christianson H.C., Skold S., Lofstedt T., Johansson M.C., Morgelin M., Bengzon J., Ruf W., Belting M. 2011. Hypoxia triggers a proangiogenic pathway involving cancer cell microvesicles and PAR-2-mediated heparin-binding EGF signaling in endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108(32), 13147-13152.

56. Taverna S., Flugy A., Saieva L., Kohn E.C., Santoro A., Meraviglia S., De Leo G., Alessandro R. 2012. Role of exosomes released by chronic myelogenous leukemia cells in angiogenesis. Int. J. Cancer. 130(9), 2033-2043.

57. Park J.E., Tan H.S., Datta A., Lai R.C., Zhang H., Meng W., Lim S.K., Sze S.K. 2010. Hypoxic tumor cell modulates its microenvironment to enhance angiogenic and metastatic potential by secretion of proteins and exosomes. Mol. Cell Proteomics. 9(6), 1085-1099.

58. Sheldon H., Heikamp E., Turley H., Dragovic R., Thomas P., Oon C.E., Leek R., Edelmann M., Kessler B., Sainson R.C., Sargent I., Li J.L., Harris A.L. 2010. New mechanism for Notch signaling to endothelium at a distance by Deltalike 4 incorporation into exosomes. Blood. 116(13), 2385-2394.

59. Bruno S., Bussolati B., Grange C., Collino F., Graziano M.E., Ferrando U., Camussi G. 2006. CD 133+ renal progenitor cells contribute to tumor angiogenesis. Am. J. Pathol. 169(6), 2223-2235.

60. Bard, M. P., Hegmans, J. P., Hemmes, A., Luider, T. M. et al., Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2004, 31, 114-121.

61. Choi, D. S., Park, J. O., Jang, S. C., Yoon, Y. J. et al., Proteomic analysis of microvesicles derived from human colorectal cancer ascites. Proteomics 2011, 11, 2745-2751

62. Simpson, R. J., Lim, J.W., Moritz, R. L., Mathivanan, S., Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev. Proteomics 2009, 6, 267283

63. Welton, J. L., Khanna, S., Giles, P. J., Brennan, P. et al., Proteomics analysis of bladder cancer exosomes. Mol. Cell. Proteomics 2010, 9, 1324-1338

64. Xiao, Z., Blonder, J., Zhou, M., Veenstra, T. D., Proteomic analysis of extracellular matrix and vesicles. J. Proteomics 2009, 72, 34-45

65. Choi DS, Yang JS, Choi EJ, Jang SC, Park S, Kim OY, Hwang D, Kim KP, Kim YK, Kim S, Gho YS. The protein interaction network of extracellular vesicles derived from human colorectal cancer cells. J Proteome Res. 2012 Feb 3; 11 (2): 1144-51.

66. Fontana, S., De Leo, G., Sedic,M., Alessandro, R., Proteomics in antitumor research. Drug Discov. Today Technol. 2006, 3, 441-449

67. Palazzolo, G., Albanese, N. N., Di Cara, G., Gygax, D. et al., Proteomic analysis of exosome-like vesicles derived from breast cancer cells. Anticancer Res. 2012, 32, 847-860.

68. Lee, H. S., Jeong, J., Lee, K. J., Characterization of vesicles secreted from insulinoma NIT-1 cells. J. Proteome Res. 2009, 8, 2851-2862.

69. Choi, D. S., Lee, J. M., Park, G. W., Lim, H. W. et al., Proteomic analysis of microvesicles derived from human colorectal cancer cells. J. Proteome Res. 2007, 6,4646-4655

70. Mathivanan, S., Lim, J. W., Tauro, B. J., Ji, H. et al., Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol. Cell. Proteomics 2010, 9, 197-208.

71. Henderson MC, Azorsa DO. The genomic and proteomic content of cancer

cell-derived exosomes. Front Oncol. 2012 Apr 17;2:38.

92

72. Букурова Ю.А., Краснов Г.С., Никитина И.Г., Карпов В.Л., Лисицын Н.А., Берестень С.Ф.Методы поиска маркеров для сывороточной диагностики опухолей Молекулярная биология. - Москва: Издательство «Наука», 2012. - 47: - стр. 3-11. ISSN 0026-8984

73. Rubenstein КЕ, Schneider RS, Ullman EF. "Homogeneous" enzyme immunoassay. A new immunochemical technique. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1972, 47, 846-851

74. http://www.bialexa.ru/?Page=ELISA

75. Wang WS, Lin JK, Lin TC, Chiou TJ, Liu JH, Yen CC, et al: EIA versus RIA in detecting carcinoembryonic antigen level of patients with metastatic colorectal cancer. Hepatogastroenterology 2004, 51:136-141.

76. Lin J, Yan F, Ju H: Noncompetitive enzyme immunoassay for carcinoembryonic antigen by flow injection hemiluminescence. Clin Chim Acta 2004, 341:109-115.

77. Wacker R, Niemeyer CM: DDI-microFIA-A readily configurable microarrayfluorescence immunoassay based on DNA-directed immobilization of proteins. Chembiochem 2004, 5:453-459.

78. Hang JF, Wu YS, Yu WH, Huang Y, Li M: Time-resolved fluoroimmunoassay of carcino-embryonic antigen and preparation of its diagnostic reagent. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 2006, 22:121-124

79. Liu R, Liu X, Tang Y, Wu L, Hou X, Lv Y: Highly sensitive immunoassay based on immunogold-silver amplification and inductively coupled plasma mass spectrometric detection. Anal Chem 2011, 83:2330-2336.

80. Zhang Y, Yuan R, Chai Y, Xiang Y, Qian X, Zhang H: Sensitive label-free immunoassay of carcinoembryonic antigen based on Au-Ti02 hybrid nanocomposite film. J Colloid Interface Sci 2010, 348:108-113.

81. Ye F, Shi M, Huang Y, Zhao S: Noncompetitive immunoassay for carcinoembryonic antigen in human serum by microchip electrophoresis for cancer diagnosis. Clin Chim Acta 2010, 411:1058-1062.

82. Song L, Hanlon DW, Chang L, Provuncher GK, Kan CW, Campbell TG, Fournier DR, Ferrell EP, Rivnak AJ, Pink BA, Minnehan KA, Patel PP, Wilson DH, Till MA, Faubion WA, Duffy DC. Single molecule measurements of tumor necrosis factor a and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J Immunol Methods. 2011 Sep 30;372( 1-2): 177-86.

83. Xiang Y, Zhang Y, Chang Y, Chai Y, Wang J, Yuan R: Reverse-micelle synthesis of electrochemically encoded quantum dot barcodes: application to electronic coding of a cancer marker. Anal Chem 2010, 82:1138-1141.

84. Chon H, Lee S, Son SW, Oh CH, Choo J: Highly sensitive immunoassay of lung cancer marker carcinoembryonic antigen using surface-enhanced Raman scattering of hollow gold nanospheres. Anal Chem 2009, 81: 3029-3034.

85. Zheng G, Patolsky F, Cui Y, Wang WU, Lieber CM: multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays. Nat Biotechnol 2005, 23:1294-1301.

86. Niemeyer CM, Wacker R, Adler M: Combination of DNA-directed immobilization and immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of self-assembled DNA-protein conjugates. Nucleic Acids Res 2003, 31:e90

87. He J, Evers DL, O'Leary TJ, Mason JT. Immunoliposome-PCR: a generic ultrasensitive quantitative antigen detection system. J Nanobiotechnology. 2012 Jun 22;10(1):26.

88. Sanghvi M, Moaddel R, Wainer IW. The development and characterization of protein-based stationary phases for studying drug-protein and protein-protein interactions. J Chromatogr A. 2011 Dec 9;1218(49):8791-8.

89. Berson SA, Yalow RS. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods. Nature 1959;184:1648-9.

90. Rissin DM, Kan CW, Campbell TG, Howes SC, Fournier DR, Song L, Piech T, Patel PP, Chang L, Rivnak AJ, Ferrell EP, Randall JD, Provuncher GK, Walt DR, Duffy DC. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 2010. 28(6):595-9

91. Wilson DH, Hanlon DW, Provuncher GK, Chang L, Song L, Patel PP, Ferrell EP, Lepor H, Partin AW, Chan DW, Sokoll LJ, Cheli CD, Thiel RP, Fournier DR, Duffy DC. Fifth-generation digital immunoassay for prostate-specific antigen by single molecule array technology.Clin Chem. 2011. 57(12):1712-21

92. Chang L, Rissin DM, Fournier DR, Piech T, Patel PP, Wilson DH, Duffy DC. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays: theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 2012. 378(1-2): 102-15.

93. Joerger, R.D. et al. (1995) Analyte detection with DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction. Clin. Chem. 41, 1371-1377

94. Schweitzer, B. et al. (2000) Immunoassays with rolling circle DNA amplification: a versatile platform for ultrasensitive antigen detection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10113-10119

95. Nam, J.M. et al. (2003) Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science 301, 1884-1886

96. Niemeyer CM, Adler M, Wacker R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification. Trends Biotechnol. 2005 Apr;23(4):208-16.

97. Zhou, H. et al. (1993) Universal immuno-PCR for ultrasensitive target protein detection. Nucleic Acids Res. 21, 6038-6039

98. Niemeyer, C.M. et al. (1999) Self-assembly of DNA-streptavidin nanostructures and their use as reagents in immuno-PCR. Nucleic Acids Res. 27, 4553-4561

99. Pei X, Zhang B, Tang J, Liu B, Lai W, Tang D. Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels: A review. Anal Chim Acta. 2013 Jan 3;758:1-18.

100. Chikkaveeraiah BV, Bhirde AA, Morgan NY, Eden HS, Chen X. Electrochemical immunosensors for detection of cancer protein biomarkers. ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6546-61.

101. Zang D, Ge L, Yan M, Song X, Yu J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem Commun (Camb). 2012 May 16;48(39):4683-5.

102. http://www.cs.columbia.edu/476 l/notes07/chapter7.2-regulation.pdf

103. Mercer TR, Mattick JS. Understanding the regulatory and transcriptional complexity of the genome through structure. Genome Res. 2013 Jul;23(7):1081-8.

104. Harlow Ed., Lane David. Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988

105. Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Ханкин С.JI., Краснов Г.С., Лисицын Н.А., Карпов В.Л., Берестень С.Ф 2011. Поиск белковых маркеров для сывороточной диагностики рака на основе анализа профилей экспрессии микроРНК. Молекуляр. биология. 45, 376-381.

106. http://diana.cslab.ece.ntua.gr/

107. http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/

108. http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_prediction.html

109. http://mirdb.org/miRDB/

110. http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html

111. http://www.geneontology.org/

112. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685

113. Schagger HI, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987. 166(2):368-79.

114. Mortz E., Krogh Т., Vorum H., Gorg A. 2001. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix assisted laser desorption/ionization time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363.

115. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 1984.

116. http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input

117. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

96

118. www.matrixscience.com/help/interpretation_help.html

119. Bradford M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.

120. Берестень и др. Патент РФ № 2478646, 2013 «Способ получения высоко-аффинных поликлональных антител»

121. www.exocarta.org

122. Hakulinen Jl, Sankkila L, Sugiyama N, Lehti K, Keski-Oja J. Secretion of active membrane type 1 matrix metalloproteinase (MMP-14) into extracellular space in microvesicular exosomes. J Cell Biochem. 2008, 105(5): 1211-8.

123. Mees ST1, Mennigen R, Spieker T, Rijcken E, Senninger N, Haier J, Bruewer M. Expression of tight and adherens junction proteins in ulcerative colitis associated colorectal carcinoma: upregulation of claudin-1, claudin-3, claudin-4, and beta-catenin. Int J Colorectal Dis. 2009; 24(4):361-8.

124. Ji HI, Greening DW, Barnes TW, Lim JW, Tauro В J, Rai A, Xu R, Adda C, Mathivanan S, Zhao W, Xue Y, Xu T, Zhu HJ, Simpson RJ. Proteome profiling of exosomes derived from human primary and metastatic colorectal cancer cells reveal differential expression of key metastatic factors and signal transduction components. Proteomics. 2013 May;13(10-11):1672-86. doi: 10.1002/pmic.201200562.

125. Dai SI, Wan T, Wang B, Zhou X, Xiu F, Chen T, Wu Y, Cao X. More efficient induction of HLA-A*0201-restricted and carcinoembryonic antigen (CEA)-specific CTL response by immunClin Cancer Res. 2005, 11(20):7554-63.ization with exosomes prepared from heat-stressed CEA-positive tumor cells.

126. Nazarenko II, Rana S, Baumann A, McAlear J, Hellwig A, Trendelenburg M, Lochnit G, Preissner KT, Zoller M. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 2010, 70(4): 1668-78.

127. www.humanproteinatlas.org

128. Bartolomé RAI, Barderas R, Torres S, Fernandez-Aceñero MJ, Mendes M, García-Foncillas J, Lopez-Lucendo M, Casal JI. Cadherin-17 interacts with a2pl

integrin to regulate cell proliferation and adhesion in colorectal cancer cells causing liver metastasis. Oncogene. 2013 Apr 22.

129. Bernhard OKI, Greening DW, Barnes TW, Ji H, Simpson RJ. Detection of cadherin-17 in human colon cancer LIM1215 cell secretome and tumour xenografit-derived interstitial fluid and plasma. Biochim Biophys Acta. 2013 Nov;1834(l l):2372-9.

130. Notkins A.L. Polyreactivity of antibody molecules. 2004. Trends in Immunology, 25, 174-9

131. Reddy S.T. et al. Monoclonal antibodies isolated without screening by analyzing the variable-gene repertoire of plasma cells. 2010. Nat. Biotechnol. 28, 965-71

132. Friguet B. et al. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complex by enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Immunological Methods, 1985, 77, 305-19

133. Rupp AK1, Rupp C, Keller S, Brase JC, Ehehalt R, Fogel M, Moldenhauer G, Marme F, Sultmann H, Altevogt P. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 2011 Aug; 122(2):437-46.

134. Hashimoto M, Aoki M, Winblad B, Tjernberg LO. 2012. A novel approach for APx-40 quantification using immuno-PCR. J Neurosci Methods. 205(2):364-7

135. И.Г. Никитина, Ю.А. Букурова, C.JI. Ханкин, В.Л. Карпов, Н.А. Лисицын, С.Ф. Берестень. Кишечный альфа-дефензин 5 секретируется в кровоток опухолями толстой кишки. 2013. Молекулярная биология. 47, 133136.

136. Lisitsyn N.A., Bukurova Y.A, Nikitina I.G, Krasnov G.S, Sykulev Y, Beresten S.F. Enteric alpha defensins in norm and pathology. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2012, 11; 11:1.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю большую признательность научному руководителю, Сергею Федоровичу Берестеню, за предоставленную возможность выполнения диссертационной работы, ценные советы и замечания в процессе проведения экспериментов и написания диссертации. Сердечно благодарю Николая Александровича Лисицына за ценные советы и редактирование диссертации. От всей души хочу поблагодарить всех сотрудников Лаборатории регуляции внутриклеточного протеолиза: Карпова Вадима Львовича, Тютяеву Веру, Карпова Дмитрия, Морозова Алексея, Спасскую Дарью, Букурову Юлию - за необычайно теплую и сердечную рабочую атмосферу, располагающую к плодотворной научной деятельности.

Безграничную благодарность выражаю Краснову Георгию за помощь в биоинформатическом поиске и оформление статей.

Кроме того, благодарю моих родителей, сестру и мужа за терпение и понимание на протяжении всего периода выполнения диссертационной работы.