Разработка иммуностимулирующих комплексов на основе гликолипидов и тритерпеновых гликозидов из морских гидробионтов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Мазейка, Андрей Николаевич

• Мазейка, Андрей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мазейка, Андрей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммуностимулирующие комплексы.

1.1.1 .Химический состав и структура иммуностимулирующих комплексов.

1.1.2. Способы получения иммуностимулирующих комплексов.

1.1.3. Адъювантная активность иммуностимулирующих комплексов.

1.1.4. Токсичность иммуностимулирующих комплексов.

1.2.Иммуностимулирующие комплексы на основе гликоалкалоидов растений семейства пасленовые.

1.3. Способы оптимизации иммуностимулирующих комплексов.

1.3.1. Иммуномодулирующие свойства тритерпеновых гликозидов голотурий.

1.3.2. Токсические свойства тритерпеновых гликозидов голотурий.

1.3.3. Мембранотропная активность тритерпеновых гликозидов голотурий.

1.3.4. Липиды как компоненты иммуностимулирующих комплексов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологический материал.

2.2. Тонкослойная хроматография.

2.3. Выделение гликоглицеролипидов.

2.4. Выделение фосфатидилхолина.

2.5. Анализ состава жирных кислот фосфо- и гликолипидов.

2.6. Выделение кукумариозида Аг-2.

2.7. ЯМР-спектроскопия.

2.8. Получение липид-сапониновых комплексов.

2.8.1. Получение комплексов тритерпеновый гликозид-холестерол.

2.8.2. Получение тубулярных иммуностимулирующих комплексов

2.8.3. Введение антигенов в тубулярный иммуностимулирующий комплекс.

2.9. Получение иммуностимулирующих комплексов.

2.10. Электронная микроскопия.

2.11. Определение полноты включения антигенов в тубулярный иммуностимулирующий комплекс.

2.12. Реакция прямой гемагглютинации.

2.13. Определение гемолитической активности.

2.13.1. Реакция гемолиза.

2.13.2 Реакция торможения гемолиза.

2.14. Иммунизация животных.

2.15. Получение сывороток крови.

2.16. Анализ сывороток крови иммунизированных животных.

2.17. Определение протективной активности.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Физико-химические свойства и ИСКОМ-формирующая способность гликоглицеролипидов из морских макрофитов.

3.2. Тритерпеновые гликозиды голотурий как потенциальные компоненты иммуностимулирующих комплексов.

3.3. Комплекс тритерпеновый гликозид-холестерол как основа иммуностимулирующего комплекса.

3.4. Введение мембранных липидов в комплексы кукумариозид-холестерол и голотоксин Архолестерол.

3.5. Структура частиц тубулярного иммуностимулирующего комплекса.

3.6. Гемолитическая активность комплексов голотоксин А\ -холестрол-липид и кукумариозид-холестерол-липид.

3.7. Способы введения антигенов в тубулярный иммуностимулирующий комплекс.

3.8. Адъювантная активность тубулярного иммуностимулирующего комплекса моногалактозилдиацилглицерол-холестерол-кукумариозид 6:2:3.

3.9. Оптимизация тубулярного иммуностимулирующего комплекса.

3.9.1. Оптимизация условий для формирования тубулярного иммуностимулирующего комплекса.

3.9.2. Определение гемолитической активности оптимизированного тубулярного иммуностимулирующего комплекса.

3.9.3. Устойчивость тубулярного иммуностимулирующего комплекса.

3.10. Адъювантная активность оптимизированного тубулярного иммуностимулирующего комплекса.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуностимулирующих комплексов на основе гликолипидов и тритерпеновых гликозидов из морских гидробионтов»

Разработка нового поколения вакцин связана с использованием высокоочищенных субъединичных антигенов, способных повысить безопасность и протективность вакцин, получить высокоспецифичный иммунный ответ к бактериальным, вирусным патогенам и опухолевым клеткам. Серьёзным препятствием при создании субъединичных вакцин является недостаточная иммуногенность изолированных антигенов. Поэтому поиск эффективных адъювантов и новых способов презентации антигенов иммунокомпетентным клеткам приобретает большую актуальность (Morein, Ни, 2000).

В качестве формы презентации антгенов иммунной системе перспективными являются различные надмолекулярные комплексы, несущие антигены (неорганические сорбенты, водно-масляные эмульсии, липосомы и липид-сапониновые везикулы). Однако эти носители имеют ограниченную область применения, вследствие низкой эффективности, токсичности, нестабильности физико-химических свойств и дороговизны.

В последнее время пристальное внимание привлекает исследования мультимерной формы представления антигена в виде иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ). ИСКОМ является стабильным комплексом холестерола (Хол), фосфолипида и сапонина. Иммунизация антигеном в составе ИСКОМ позволяет индуцировать реакции клеточного и гуморального иммунитета, направленные против вирусных и бактериальных антигенов (Kersten, Crommelin, 1995, 2000). Такой способ иммунизации в десятки раз усиливает образование специфических антител по сравнению с использованием убитых возбудителей или липосом (Lovgren, Morein, 1988).

Основной недостаток ИСКОМ - токсичность, обусловленная присутствием Quil А, разрушающего мембраны клеток (Kersten, Crommelin, 1995). Другой важный недостаток - отсутствие методики получения ИСКОМ, пригодной для коммерческого получения качественных препаратов комплекса с воспроизводимыми свойствами (Sun et al., 2009). В связи с этим разработка нового эффективного и безопасного носителя антигенов, производство и применение которого было бы экономически выгодно, представляет собой актуальную проблему.

Известно ^окпёег е1 а1., 1997), что различные носители и адъюванты не только усиливают иммунный ответ макроорганизма к антигену, но и обладают иммуномодулирующими свойствами. В связи с этим представляется важным использование природных соединений, подобных по физико-химическим свойствам компонентам классических ИСКОМ. Мы остановили свой выбор на изменении состава липидной компоненты ИСКОМ путем замены фосфолипида, выделенного из яичного желтка, на гликоглицеролипиды из морских макрофитов (макроводорослей и трав), обладающих широким спектром биологической активности в отличие от иммунологически неактивных фосфолипидов. Так, известно, что моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ) зеленых водорослей обладает противоопухолевой активностью (Мопто1:о е1 а1., 1995), сульфохиновозилдиацилглицерол (СХДГ) ингибирует ДНК-полимеразу и обратную транскриптазу ВИЧ (О^аГБОп е1 а1., 1998; Ьоуа е1 а1., 1998; ОЬпа е1 а1., 1998). Кроме того, гликоглицеролипиды из морских макрофитов содержат до 80% полиненасыщенных жирных кислот (8ашпа е1 а1., 2003, 2004), которые также иммуноактивны и могут модулировать иммуногенность комплекса.

Использование тритерпеновых гликозидов голотурий, обладающих выраженной иммуностимулирующей активностью в сверхмалых концентрациях (Агшшп е1 а1., 2010Ь), для получения ИСКОМ вместо сапонина С)ш1 А позволит повысить эффективность ИСКОМ. Способность тритерпеновых гликозидов голотурий полностью утрачивать токсические свойства в присутствии экзогенного холестерола (Попов, 2002) позволит снизить токсичность ИСКОМ.

Цель и задачи исследования. Цель работы - разработка иммуностимулирующих комплексов на основе тритерпеновых гликозидов и гликолипидов из морских гидробионтов, оптимизация состава и метода получения адъювантного носителя антигенов со стандартными свойствами, более низкой токсичностью и более высокой иммуногенностью, чем классические ИСКОМ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать гликолипиды из морских макрофитов, пригодные для построения иммуностимулирующих комплексов.

2. Выбрать сапонины (тритерпеновые гликозиды) из морских голотурий, пригодные для построения иммуностимулирующих комплексов.

3. Исследовать токсичность (гемолитическую активность) выделенных гликолипидов и сапонинов.

4. Установить соотношения между сапонинами, гликолипидами и холестеролом, обеспечивающие наиболее эффективное формирование модифицированных иммуностимулирующих комплексов.

5. Оптимизировать способ получения иммуностимулирующих комплексов для достижения наиболее эффективного их формирования, последующего встраивания белкового антигена и получения препаратов со стандартными свойствами.

6. Исследовать токсичность (гемолитическую активность) полученных иммуностимулирующих комплексов и выбрать наиболее безопасный вариант.

7. Выбрать оптимальный способ введения полученных иммуностимулирующих комплексов в организм млекопитающего, обеспечивающий наибольшую иммуностимулирующую активность.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Оптимальными для формирования модифицированного иммуностимулирующего комплекса являются МГДГ из морских макрофитов и тритерпеновый гликозид из Cucumaria japónica кукумариозид А2-2.

2.Полученный комплекс в отличие от ИСКОМ является тубулярным иммуностимулирующим комплексом (ТИ-комплексом) и представляет собой тубулярные частицы с внешним диаметром около 16 нм, внутренним диаметром 6 нм и длинной около 500 нм.

3.Оптимальным для формирования ТИ-комплекса является весовое соотношение компонентов кукумариозид А2-2-холестерол-МГДГ 6:2:4.

4.ТИ-комплекс может служить носителем субъединичных антигенов бактериального и вирусного происхождения.

5.ТИ-комплекс обладает высокой адъювантной активностью в отношении тримера порина из Yersinia pseudotuberculosis. Иммунизация субъединичным антигеном в составе ТИ-комплекса более эффективна, чем иммунизация в составе известных адъювантов: ИСКОМ и полного адъюванта Фрейнда, позволяет значительно повысить концентрацию специфических антител, не приводит к развитию побочных реакций.

6.Оптимизированный ТИ-комплекс обладает низкой гемолитической активностью.

7. Иммунизацию необходимо проводить минимально разбавленным препаратом ТИ-комплекса.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые получен высокоэффективный липидный адъювантный комплекс с принципиально новым составом и суперструктурой. Впервые показано, что гликолипид МГДГ из морских макрофитов может эффективно замещать фосфолипиды в составе ИСКОМ, не изменяя их классической структуры. Впервые установлено, что тритерпеновый гликозид кукумариозид А2-2 из С. japonica способен заместить сапонин Quil А в иммуностимулирующих комплексах с преобразованием их везикулярной суперструктуры в тубулярную (тубулярные иммуностимулирующие комплексы или ТИ-комплексы). Впервые показано, что разработанный комплекс на основе МГДГ из морских макрофитов и кукумариозида А2-2 из голотурии С. japonica обладает низкой токсичностью, высокой адъювантной активностью и способен инкорпорировать субъединичные антигены.

Показана возможность использования ТИ-комплексов для создания вакцинных конструкций и разработаны оптимальные условия их практического применения.

Выполненные исследования подкреплены двумя патентами «Носитель антигенов» (№ 2322259) и «Иммуностимулирующий комплекс и его применение» (№ 2010115549), которые могут быть использованы в практической медицине и ветеринарии.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: II региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006); X, XI и XIII международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2006, 2007 и 2010); The Third Asian Symposium on Plant Lipids (Yokohama, Japan, 2009); IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток 2010); 8th LIPIDOMICS MEETING «Membranes and Bioactive Lipids» (Лион, Франция, 2011); 52nd International Conference on the Bioscience of Lipids, (Варшава, Польша 2011); The 4th Asian Symposium on Plant Lipids, (Hong Kong, 2011).

Материалы диссертации изложены в шести статьях, опубликованных в пяти отечественных журналах, двух патентах и двух статей, опубликованных в двух международных журналах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах, иллюстрирована 40 рисунками и содержит 7 таблиц. Список литературы насчитывает 170 наименований

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Мазейка, Андрей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ) в отличие от других гликоглицеролипидов Laminaria japónica эффективно замещает фосфолипидную составляющую в классических иммуностимулирующих комплексах (ИСКОМ), не изменяя их везикулярной суперструктуры.

2. Показано, что сумма моносульфатированных тритерпеновых гликозидов из Cucucmaria japónica - кукумариозид и кукумариозид А2-2, а также кукумариозид Gi из Eupentacta fraudatrix, фрондозид А из Cucumaria frondosa и голотоксин А] из Apostichopus japonicus формируют надмолекулярные комплексы с холестеролом в водной среде.

3. Выявлено, что кукумариозид и кукумариозид А2-2 с холестеролом эффективно формируют трубчатые частицы, которые имеют четкие очертания и характеризуются длиной тубул 150-350 нм, внешним диаметром 12-14 нм и диаметром канала 4 нм.

4. Найдено, что присутствие МГДГ в комплексах кукумариозида и голотоксина Ai с холестеролом необходимо для формирования гомогенных тубулярных частиц и снижения их гемолитической активности.

5. На примере порина из Yersinia pseudotuberculosis и гемагглютинина вакцины Influvac показано, что комплекс кукумариозид-холестерол-МГДГ 3:2:6 может служить носителем субъединичных антигенов и высокоэффективным адъювантом, более эффективным, чем ИСКОМ и полный адъювант Фрейнда. Применение комплекса не приводит к развитию воспалительных реакций, снимает токсическое действие порина на систему интерферона, защищает 25% животных при экспериментальной инфекции Y. pseudotuberculosis.

6. Проведена оптимизация состава и процедуры получения ТИ-комплекса, путем замены суммы моносульфатированных тритерпеновых гликозидов из С. japónica на хроматографически чистый кукумариозид А2-2, и подбора соотношения его компонентов, что позволило получать гомогенный препарат ТИ-комплекса без дополнительных процедур очистки.

7. Установлено, что оптимальным для формирования ТИ-комплекса является весовое соотношение компонентов кукумариозид А2-2-холестерол-МГДГ 6:2:4, обеспечивающее комплексу стабильно высокую адъювантную активность и протективность. Иммунизация тримером порина из Y. pseudotuberculosis в составе комплекса приводит к увеличению концентрации специфических антител в 4.5 раза, увеличивает среднюю продолжительность выживания в эксперименте и защищает 20% животных при экспериментальной инфекции от этого возбудителя.

8. Оптимизированный ТИ-комплекс обладает низкой гемолитической 109.2 мкг/мл, что соответствует 140-кратному снижению относительно чистого кукумариозида А2-2.

9. Разбавление препаратов ТИ-комплекса фосфатно-солевым буфером приводит к разрушению тубулярных частиц; степень разрушения частиц возрастает с увеличением разбавления. Поэтому необходимо использовать для иммунизации исходный препарат, разбавленный не более чем в 10 раз.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мазейка, Андрей Николаевич, 2012 год

1. Авилов С.А., Стоник В.А., Калиновский А.И. Строение четырех новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japónica // Химия природ, соед. 1990. № 6. С. 787-792.

2. Авилов С.А., Калинин В.И., Дроздова O.A., Калиновский А.И., Стоник В.А., Гудимова E.H. Тритерпеновые гликозиды голотурии Cucumaria frondosa // Химия природ, соед. 1993. № 2. С. 49-52.

3. Аминин Д.Л., Лебедев A.B., Левицкий Д.О., Влияние голотоксина Ai на перенос кальция через липидные модели биологических мембран // Биохим. 1990b. Т. 55. № 2. С. 270 275.

4. Анисимов М.М., Тритерпеновые гликозиды и структурно-функциональные свойтсва биомембран // Биол. науки. 1987. Т. 10. С. 49-63.

5. Афиятулов Ш.Ш., Тищенко Л.Я., Стоник В.А., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Структура кукумариозида Gi нового тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria fraudatrix II Химия природ, соед. 1985. № 2. С. 244248.

6. Белоусов М.В., Новожеева Т.П., Ахмеджанов P.P., Новицкая Л.Н., Юсубов М.С., Аминин Д.Л., Авилов С.А., Стоник В.А., Калинин В.И. Токсикологическое изучение кумазида // Экспер. и клин, фармакол. 2010. Т. 73., №2. С. 22-24.

7. Гайер Г. Электронная гистохимия. М.: Мир, 1974. - 488с.

8. Гришин Ю.И., Беседнова H.H., Стоник В.А., Ковалевская A.M., Авилов С.А., Регуляция гемопоэза и иммуногенеза тритерпеновыми гликозидами из голотурий // Радиобиология. 1990. Т. 30. № 4 С. 556.

9. Гришин Ю.И., Ковалевская A.M., Стоник В.А., Авилов С.А., Влазнев В.П., Слугин B.C. Иммуностимуляторы для звероводства КМ и КМ-2 // Новости звероводства. 1991. №. 2. С. 19-23.

10. Еляков Г.Б., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Строение голотоксина А\ (стихопозида А), основного тритерпенового гликозида тихоокеанской промысловой голотурии Apostichopus japonicus S. // Биоорг. химия. 1983. Т. 9. № 2. С. 280-281.

11. Калинин В.И., Степанов В.Р., Стоник В.А. Псолюсозид А новый тритерпеновый гликозид из голотурии Psolus fabricii II Химия природных соединений. 1983. С. 789-790

12. Калинин В.И., Левин B.C., Стоник В.А., Химическая морфология: тритерпеновые гликозиды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata). -Владивосток: Дальнаука, 1994. 284с.

13. Костецкий Э.Я., Попов A.M., Санина Н.М., Ли И.А., Цыбульский A.B., Шныров В.Л. Патент РФ № 2311926 Носитель и адъювант для антигенов. Заявка № 2006104795/13 от 15.02.2006. Опубл. 10.12.2007 Бюл. № 34.

14. Костецкий, Э.Я., Попов, A.M., Санина, Н.М., Ли, И.А., Цыбульский, A.B., Шныров, В.Л., Мазейка, А.Н. Патент РФ № 2322259 Носитель антигенов. Заявка № 2006123270/13 от 21.06.2006; опубл.20.04.2008 Бюл. №11.

15. Лихацкая Г.Н., Яровая Т.П., Руднев B.C., Попов A.M., Анисимов М.М., Ровин Ю.Г. Образование комплекса тритерпенового гликозида голотурина А с холестеролом в липосомальных мембранах // Биофизика. 1985. Т. 30. №2. С. 358-359.

16. Мазейка А.Н., Попов A.M., Калинин В.И., Авилов С.А., Костецкий Э.Я., Комплексообразование тритерпеновых гликозидов голотурии как основа липид-сапониновых носителей субъединичных аетигенов // Биофизика. 2008. Т. 53. № 5. с. 826-835.

17. Методы общей бактериологии в Зх тт., Т.1. // Под ред. Ф Герхардта идр., пер. с англ. М.: МИР 1983. 536с

18. Перестенко Л.П. Водоросли залива Петра Великого. Л.: Наука. 1980. -232с.

19. Поликарпова С.И., Волкова О.Н., Седов A.M., Стоник В.А., Лиходед В.Г. Цитогенетическое исследование мутагенности кукумариозида // Гентика. 1990. Т. 26. № 9. С. 1682-1684.

20. Попов A.M., Калиновская Н.И., Кузнецова Т.А., Агафонова И.Г., Анисимов М.М. Роль стеринов в мембранотропной активности тритерпеновых гликозидов голотурий в липосомальных мембранах // Биофизика. 1985. Т. 30. № 2. С. 358-359.

21. Попов A.M. Сравнительное изучение цитотоксического и гемолитического действия тритерпеноидов женьшеня и голотурий // Известия РАН. Серия биологическая. 2002. № 2. С. 155-164.

22. Попов A.M. Сравнительное изучение влияния различных стеринов и тритерпеноидов на проницаемость модельных липидных мембран // Журн. эвол. биох. физиол. 2003. Т. 39. № 3. С. 244-249.

23. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф., Динамика иммунного ответа на порин из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis//БЭБиМ. 1999. Т. 128. № 10. С. 437-440.

24. Растения и животные залива Петра Великого // под. ред. A.B. Жирмунского. JI.: Наука, 1976.- 363 с.

25. Стоник В.А., Авилов С.А., Федоров С.Н., Богуславский В.М. Патент РФ № 2110522. Способ получения суммы тритерпеновых гликозидов. Заявка №96124224 от 25ю12.1996. Опубл. 10.05.1998 Бюл. 13.

26. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS. Владивосток: РАМН, ГУ НИИ Эпидемиологии и микробиологии, 2004. 220с.

27. Турищев С.Н., Большакова Г.Б., Саканделидзе О.Г. Влияние комплексов тритерпеновых гликозидов голотурий на репарацию печени // Известия АН СССР. Серия Биологическая. 1991. № 2. С.306-310.

28. Afrinzon Е., Deutsch A., Shafran Y., Zurgil N., Sandbank J., Pappo I., Deutsch M. Intracellular esterase activity in living cells may distinguish between metastatic and tumor-free lymph nodes // Clin. Exp. Methastasis. 2008. Vol. 25. P. 213-224.

29. Agafonova I.G., Aminin D.L., Avilov S.A., Stonik V.A. Influence of Cucumariosides upon intracellular Ca2+.I and lysosomal Activity of Macrophages // J. Agric. Food. Chem. 2003. Vol. 51. P. 6982-6986.

30. Aminin D.L., Agafonova I.G., Berdyshev E.G., Isachenco E.G., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory propertties of cucumariosides from the edible Far-Eastern holothurian Cucumaria japonica // J. Med. Food. 2001. Vol. 4, № 3. P. 127-135.

31. Aminin D.L., Pinegin B.V., Pichugina L.V., Zaporozhets T.S., Agafonova I.G., Boguslavsky V.M., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomudulatori properties of Cumaside // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol. 6. P. 1070-1082.

32. Aminin D.L., Agafonova I.G., Kalinin V.I., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A., Collin P.D., Woodward C. Immunomodulatory Properties of frondoside

33. A, a major triterpene Glycoside from the North Atlantic Commercially Harvested Sea Cucumber Cucumaria frondosa II J. Med Food. 2008. Vol. 11. № 3.P. 443-453.

34. Aminin D.L., Koy C., Dmitronok P.S., Muller-Hilke B., Koczan D., Argobast

35. Aminin D.L., Chaykina E.L., Agafonova I.G., Avilov S.A., Kalinin V.I., Stonik V.A. Antitumor activity of the immunomodulatory lead Cumaside // Int. Immunopharmacol. 2010a. Vol. 10. P. 648-654.

36. Aminin D.L., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stepanov V.G., Kalinin V.I. Immunomodulatory Action of Mono sulphated Triterpene Glycosides from the

37. Sea Cucumber Cucumaria okhotensis: Stimulation of Activity of Mouse Peritoneal Macrophages // Nat. Prod. Commun. 2010b. Vol. 5. № 12. P. 18771880.

38. Anisimov M.M., Kuznetsova T.A., Shirokov V.P., Prokofieva N.G., Elyakov G. B. The Toxic Effect Of Stichoposide Al from Stichopus japónicas Selenka On Early Embryogenesis of the sea Urchin // Toxicon. 1972. Vol. 10. № 2. P. 187188.

39. Anisimov M.M., Fronert E.B., Kuznetsova T.A., Elyakov G.B. The Toxic Effect Of Triterpene Glycosides From Stichopus japónicas Selenka On Early Embryogenesis Of The Sea Urchin //Toxicon. 1973. Vol. 11. № 1. P. 109-111.

40. Attard G.S., Morrow W.J., Rajananthanan P.US. Patent No 6,673,357. Alkaloid glycoside for use as a medicament. January 6, 2004

41. Barr I.G., Mitchell G.F. ISCOMs (immunostimulating complexes): the first decade // Immunol. Cell Biol. 1996. Vol. 74. №1. P 8-25.

42. Bomford R., Stapleton M., Beesley J.E., Jessup E.A., Priece K.R., Fenwick G.R. Adjuvanticity and ISCOM Formation by structurally divests saponins // Vaccine. 1992. Vol. 10. P. 572-577

43. Calder P.C. Polyunsaturated fatty acids and inflammation // Biochemicall society transactions. 2005. Vol. 33. Part 2. P.423-427

44. Carreau J.P., Dubacq J.P., Adaptation of macro-scale method to the microscale for faty acid methyl transesterification of biologicall lipid extracts // J. Chromatogr. Sci. 1985. Vol. 23. № 2. P. 54-56.

45. Carrol K.K. Quantitative estimation of peak areasin gas-liquid chromatography //Nature. 1961. Vol. 191. № 4786. P. 377-37

46. Chludil H.D., Muniain C.C., Seldes A.M., Maier M.S. Cytotoxic and antifungal triterpene glycosides from the Patagonian sea cucumber Hemoiedema spectabilis // J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65. P. 860-865.

47. Chrzanowski T.H, Crotty R.D., Hubbard J.G., Welch R.P. Applicability of the fluorescein diacetate method of detecting active bacteria in freshwater // Microb. Ecol. 2005. №io. P. 179-185.

48. Christie W.W. Equivalent chain length of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography // J. Cromatogr. 1988. Vol. 447. № 2. P. 305-314.

49. Copland M.J., Rades T., Davies N.M. Hydration of lipid films an aqueosus solution of Quil A: a simple method for the preparation of immune-stimulating complexes // Int. J. Pharmaceutics. 2000. Vol. 196. P. 135-139

50. Dancey G.F., Yashuda T., Kinsky S.C. Effect of liposomal model membrane composition on immunogenicity // J. Immunol. 1978. Vol. 120. P. 1109 1113.

51. Denama P.H., Davies N.M., Vosgerau U., Rades T. Pseudo-ternary phase diagrams of aqueous mixtures of QuilA, cholesterol and phospholipid prepared by the lipid-film hydration method // Int. J.Pharm. 2004b. Vol. 270. № 1, P. 229-239.

52. Denama P.H., Davies N.M., Hook S., Rades T. QuilA-lipid powder formulations releasing ISCOMs and related colloidal structures upon hydration // J. Control Release. 2005. Vol. 103. P. 45-59.

53. Dreveny I., Kondo H., Uchiyama K., Shaw A., Zhang X., Freemont P.S. Structural basis of the interaction between the AAA ATPase p97/VCP and its adaptor protein p47 // EMBO J. 2004. Vol. 23. P. 1030-1039

54. Drozdova O.A., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinivsky A.I., Stonik V.A., Riguera R., Jimenez C. Cytotoxic Triterpene Glycosides from Far-Eastern Sea Cucumbers Belonging to the Genus Cucumaria //Liebigs Ann. 1997. Vol. 1997. № 11. P.2351-2356

55. Findlay J., Yayli N., Radics L. Novel sulphated oligosaccharides from the sea cucumber Cucumaria frondosa. II J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55. P. 93-101

56. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G.A. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. P. 497-509.

57. Fransis Sh., Holden H., Holz C. Interleukin 10 in human arterias and veins // J. Cell. Biochem. 1994. Suppl 17A. P. 2843.

58. Fries S.L., Standaert F.G., Whitcomb E.R., Nigrelli R.F., Chanley J.D., Sobotka H. Some pharmacologic properties of holothurin, an active neurotoxin from the sea cucumber // J. Pharmacol. Exp. Therap. 1959. Vol. 126. P. 323-329.

59. Friess S.L., Duran R.C., Chanley J.D., Mezzetti T. Some structural requirements underlying holothurin A interactions with synaptic chemoreceptors // J. Biochem. Pharmacol. 1965. Vol. 14. P. 1237-1247.

60. Friess S.L., Chanley J.D., Hudak W.V., Weems H.B. Interaction of the Echinoderm toxin Holothurin A and its de sulfated derivative with the cat superior cervical ganglion preparation // Toxicon. 1970. № 8. P. 211-219.

61. Fries S.L. Mode of action of marine saponins on neuromuscular tissues // Fed. Proc. 1972. Vol. 31. №3. P. 1146-1149.

62. Garab G., Lohner K., Laggner P., Farkas T. Self-regulation of the lipid content of membranes by non-bilayer lipids: a hypothesis // Trends in Plant Science. 2000. Vol. 5. P. 489-494.

63. Garcia Z., Silio V., Marques M., Cortes I., Kumar A., Hernandez C., Checa A.I., Serrano A., Carrera A.C. A PI3K activity-independent function of p85 regulatory subunit in control of mammalian cytokinesis // EMBO J. 2006. Vol. 24. P. 4740-51.

64. Gorshkov B.A., Gorshkova I.A., Stonik V.A., Elyakov G.B. Effects of marine glycosides on adenosine triphosphatase activity // Toxicon. 1989. Vol. 27. № 8. P. 937-945.

65. Gorshkova I.A., Kalinovsky A.I., Ilyin S.G., Gorshkov B.A., Stonik V.A. Physicochemical characteristics of interaction of toxic triterpene glycosides from holothurians with rat brain Na-K-ATPase // Toxicon. 1989. Vol. 27. № 8. P. 937-945.

66. Grover, A., Sundharads G. Effect of liposomes on lymphocytes: induction of proliferation of B lymphocytes and potentiation of the cytotoxic response of T lymphocytes to alloantigens // Eur. J. Immunol. 1986. Vol. 16. № 6. P. 665670.

67. Gustafson K.R., Cardellina J.H., Fuller R.W., Weislow O.S., Kiser R.F., Snader K.M., Patterson G.M., Boyd M.R. AIDS-antiviral sulfolipids from cyanobacteria blue-green algae // J. Natl. Cancer Institute. 1998. Vol. 81. P. 1254-1258.

68. Huang Y.-W., Yan M., Collins R.F., DiCiccio J.E., Grinstein S., Trimble W.S. Mammalian septins are required for phagosome formation // Mol. Biol. Cell. 2008. Vol. 19. P. 1717-1726

69. Ishida H., Hirota Y., Nakazawa H. Effect of sub-skinning concentration of saponin on intracellular Ca2+ and plasma membrane fluidity in cultured cardiac cell //Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1145. P. 58-62.

70. Israelashvili J.N. Intermolecular and Surface forces. New York: Academic Press, 1992. -340p.;

71. Seddon J.M., Templer R.H. Polymorphism of lipid-water system // In: Structure and Dynamics of Membranes (Eds. Lipowski R., Sackmann E.) Elsevier. 1995. P. 97-161

72. Kersten G.F.A., Spiekstra A., Beuvery E.C., Crommelin D.J.A. On the structure of immune-stimulating saponin-lipid complexes (ISCOMs) // Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1062. P. 165 171.

73. Kersten G.F.A., Crommelin D.J.A. Liposomes and ISCOMS as vaccine formulations // Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1241. №. 2. P. 117 138.

74. Kersten G.F.A., Crommelin D.J.A. Liposomes and ISCOMs // Vaccine. 2003. Vol. 21. P. 915-920.

75. Keukens E.A.J., de Vrije T., Fabrie H.J.P., Demel R.A., Jongen W.M.F., de Kruiff B. Dual specifity of sterol-mediated glycoalcaloid induced membrane disruption // Biochem. Biophis. Acta. 1992. Vol. 1110. P. 127-136.

76. Keukens E.A.J., de Vrije T., van den Boom C., de Waard P., Plasman H.H., Thiel F., Chupin V., Jongen W.M.F., de Kruiff B. Molecular basis of glycoalkaloid induced membrane disruption // Biochim. Biophis. Acta. 1995. Vol. 1240. P. 216-228.

77. Kitagawa I. Bioactive marine natural products // Yakugaku Zasshi. 1988. Vol. 108. P. 398-416.

78. Kouranti I., Sachse M., Arouche N., Goud B., Echard A. Rab35 regulates an endocytic recycling pathway essential for the termanal steps of cytokinesis // Curr. Biol. 2006. Vol. 16. P. 1719-25.

79. Kondo H., Rabouille C., Newman R., Levine T.P., Pappin D., Freemont P., Warren G. p47 is cofactor for h97-mediated membrane fusion //Nature. 1997. Vol. 388. P. 75-78.

80. Konings S., Copland M.J., Davies N.M., Rades T. A method for incorporation of ovalbumin into immune stimulating complexes prepared by the hydration method // Int. J. Pharm. 2002. Vol. 241. № 2, P. 135-139.

81. Koynova M., Caffrey. Phases and phase transitions of the phosphftidilcholines // Biochim. Biophis. Acta. 1998. Vol. 1376. P. 91-145.

82. Larsen E., Kharazmi A., Christensen L.P., Christensen S.B. An antiinflammatory galactolipid from rose hip (Rosa canina) that inhibits chemotaxis of human peripheral blood neutrophils in vitro // J.Nat.Prod. 2003. Vol. 66. № 7. P. 994-995.

83. Lasley B.J., Nigrelli R.F. The Effects of crude Holothurine on Leucocyte Phagocytosis // Toxicon. 1970. Vol. 8. P. 301-306.

84. Lee T.-K., Johnke R.M., Allison R.R., O'brien F., Dobbs L.J. Review. Radioprotective potential of ginseng / Mutagenesis. 2005. Vol. 20. P. 237-243.

85. Lendemans D.G., Myschik J., Hook S., Rades T. Immuno-stimulating complexes prepared by ethanol injection // J. Pharm. Pharmacol. 2005. Vol. 57. P. 729-733.

86. Liang M.T., Toth I., Davies N.M. A nowel method for preparing immune stimulating complexes (ISCOMs) by hydration of freez-dried lipid matrix // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008. Vol. 68. № 3. P. 840-845.

87. Lovgren K., Morein B. The requirement of lipids for the formation of immunestimulating complexes (ISCOMs) // Biotechnol.Appl. Biochem. 1988. Vol. 10. P.161-172.

88. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurements with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265 275.

89. Pons M., Foradada M., Estelrich J. Liposomes obtained by the ethanol injection method //Int. J. Pharm. 1993. Vol. 95. № 1-3. P. 51-56.

90. Morein B., Bengtsson K.L., Immunomodulation by ISCOMs, immune stimulating complexes // Methods. 1999. Vol. 19. № 1. P. 94-102.

91. Morein B., Hu K.-F., Biological aspects and prospects for adjuvants and delivery systems // Ed. Ronald W. New Vaccine Technologies. 2000. P. 274 -291

92. Morimoto T., Nagatsu A., Murakami N., Sakakibara J., Tokuda H., Nishino H., Iwashima A. Antitumour-promoting glyceroglycolipids from the green alga, Chlorella vulgaris II Phytochemistry. 1995. Vol. 40. P. 1433-1437.

93. Morrins S.C., Lee T.H. The toxicity and teratogenicity of solanaceae glycoalkaloids, particularly those of the potato (Solarium tuberosum.) II Food Technol. Australia. 1984. Vol. 36. P. 118 124.

94. Myschik J., Lendemans D.G., McBurney W.T., Denama P.H., Hook S., Rades T. On the preparation, microscopic investigation and application of ISCOMs // Micron. 2006. Vol. 37. № 8. P. 724-734.

95. Myrphy D.J. The importance of Non-planar Bilayer Regions in Photosynthetic Membranes and Their Stabilization by Galactolipids // FEBS Lett. 1982. Vol. 150. P. 19-26.

96. Nakata K., Guo C.T., Matsufuji M., Yoshimoto A., Inagaki M., Higuchi R., Suzuki Y. Influenza A virus-binding activity of glycoglycerolipids of aquatic bacteria II J. Biochem. 2000 Vol. 127. № 2. P. 191-198.

97. Neta R. Modulation of the radiation response by cytokines // In Radioprotectors. Chemical, biological and clinical perspectives. Bump EA, Malaker K (Eds.) CRC Press LLC, Boca Raton, FL. 1998. P. 237-247.

98. Nigrelli R.F. The effects of holothurine on fish and mice with sarcoma-180 // Zoologica (New York). 1952. Vol. 37. P. 89-90.

99. Nigrelli R.F., Chaley S.K., Sobotka H. The chemical nature of holothurine, a toxic principle from sea cucumber // Zoologica. 1955. Vol. 40. P. 47-48.

100. Nigrelly R.F., Jakowska S. Effects of Holothurin, a Steroid Saponin from the Bahamian Sea Cucumber (Actinopyga agassizi) on Various Biological System // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1960. Vol. 90. P. 884-892.

101. Poscidio G.N. The mutagenicity potential of holoturin of some Philipina holoturians // Philipina J. Sci. 1983.Vol. 112. № 1-2. P.l-2.

102. Rajananthan P., Attard G.S., Sheikh N.A., Morrow W.J.W. Evaluation of novel aggregate structure as adjuvants: composition, toxicity studies and humoral responses //Vaccine. 1999. Vol. 17. P. 715-730.

103. Rajananthanan P., Attard G.S., Sheikh N.A., Morrow W.J.W. Novel aggregate structure adjuvants modulate lymphocyte proliferation and Thl and Th2 cytokine profiles in ovalbumin immunized mice // Vaccine. 2000. Vol. 18 P. 140 152.

104. Rodrigues J., Castro R., Riguera R., Holothurinosides: New Antitumor Non Sulphated Triterpenoid Glycosides from The Sea Cucumber Holothuria Forskali // Tatrahedron. 1991. Vol. 47. № 26. P. 4753-4762.

105. Rosenberg J.P. Characterization of the major protein from Esherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecylsulfate binding // -J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249. № 10. P. 8019-8029.

106. Ruggieri G.D., Nigrelli R.F. Effects of holothurin, a steroid saponin from the sea cucumber on the development of the sea urchin // Zoologica (New York). 1960. Vol. 45. P. 1-16.

107. Sanina N.M., Förster G., Hübner W., Blume A. Phase behavior of glycolipids from marine macrophytes // Chem. Phys. Lipids. 2002. Vol. 118. P. 63-64.

108. Sanina N., Goncharova S., Kostetsky E. Fatty acid composition of individual polar lipid classes from marine macrophytes // Phytochemistry. 2004. Vol. 65. P. 721-730.

109. Sanina N.M., Goncharova S.N., Kostetsky E.Y. Seasonal changes of fatty acid composition and thermotropic behavior of polar lipids from marine macrophytes // Phytochemistry. 2008. Vol. 69. P. 1517-1527.

110. Sheikh N.A., Rajananthanan P., Attard G.S., Morrow W.J.W. Generation of antigen specific CD8+ cytotoxic T cells following immunization with soluble protein formulated with novel glycoside adjuvants // Vaccine. 1999. Vol. 17. P. 2974-2982.

111. Shimada S. Antifungal steroid glycosides from sea cucumbers // Science. 1969. № l.P. 148-67.

112. Singleton W.S., Gray M.S., Brown ML, White JL. Chromatographycally homogenous lecithin from egg phospholipids // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1965. Vol. 42. P. 53-56.

113. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (holoturoids): Chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosinthesis and evolution // J. Nat. Toxins. 1999. № 8. P. 235-248.

114. Sun H.X., Xie Y., Ye Y.P. ISCOM and ISCOMATRIX™ // Vaccine. 2009. Vol 2. P. 4388-4401.

115. Svetachev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin-layer microchromatography of lipids // J. Chromatogr. 1972. Vol. 67. № 2. P. 376

116. Thron C.D., Durant R.C., Friess S.L. Neuromuscular and cytotoxic effects of holothurin A and related saponins at low concentration levels. Ill // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1964a. № 6. P. 182-196.

117. Thron C.D. Hemolysis by Holothurin A, Digitonin, and Quilaia saponin: estimates of the required celular lysin uptakes and free lysine concentrations // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1964b. Vol. 145. P. 194-202.

118. Tian F., Zhang X., Tong Y., Yi Y., Zhang S., Li L., Sun P., Lin L., Ding J. PE, a new sulphated saponin from sea cucumber, exhibit anti-angiogenetic and antitumor activities in vitro and in vivo / Cancer Biol. Ther. 2005. Vol. 48. P. 874882.

119. Tingey W.M. Glycoalcaloids as pest resistance factor // Am. Potato J. 1984. Vol. 61. P. 157- 167.

120. Tong Y., Zhang X., Tian F., Yi Y., Xu Q., Li L, Tong L., Lin L., Ding J. Philinopside A, a novel marine-derived compound possessing dual anti-angiogenetic and anti-tumor effect / Int. J. Cancer. 2005. Vol. 114. P. 843-853.

121. Uchiyama K., Kondo H. h97/h47-mediated biogenesis of Goldgi and ER // J. Biochem. 2005. Vol. 137. P. 115-119.

122. Van Gent C.M., Roseleur O.J., Van Der Bijl P. The detection of cerebrosides on thin-layer chromatograms with an anthrone spray reagent // J. Chromatogr. 1973. Vol. 85. № l.P. 174-176.

123. Vaskovsky V.E., Kostetsku E.Y., Vasendin J.M. Universal reagent for determination of phosphorus in lipids // J. Chromatogr. 1975. Vol. 114. P.129 -141.

124. Wagner H., Horhammer L., Wolf P. Dunnschicht chromatogrraphie von phosphatiden and glicolypyden // Biochem Z. 1961. Vol. 334. № 1. P. 175-184.

125. Watson D.L., Lovgren K., Watson N.A., Fossum C., Morein B., Hoglund S. Inflamatory response and antigen localization following immunization with influenza virus ISCOMs // Inflammation. 1989. Vol. 13. P. 641-649.

126. Yamanouchi T. On the poisonous substance contained in holothurians // Publ. Seto Marine Biol. Lab. 1955. Vol. 4. P. 183-203.

127. Yamasaki Y., Ito K., Enomoto Y., Sutko J. Alterations by saponins of passive Ca2+ permeability and Na+/Ca2+ exchange activity of canine cardiac sarcolemmal vesicles // Biohim. Biophis. Acta. 1987. Vol. 897. P. 481-487.

128. Yang Y.-W., Sheikh N.A., Morrow W.J.W. The ultrastructure of tomatine adjuvant // Biomaterials. 2001. Vol. 23. P. 4677-4686.

129. Yasuda T., Dancey G.F., Kinsky S.C. Immunogenicity of liposomal model membranes in mice: dependence on phospholipid composition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. № 3. P. 1234-1236.

130. Yayli N., Findlay J. A triterpenoid saponin from Cucumaria frondosa II Phytochemistry. 1999. Vol. 50. P. 135-138.

131. Yayli N. Minor saponins from the sea cucumber Cucumaria frondosa II Indian J. Chem. 2001. Vol. 40B. P. 399-404.

132. Yoo Y., Wu X., Egike C., Li R., Guan J.-L. Interaction of N-WASP with hnRNPK and its role in filopodia formation and cell spreading // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. P. 15352-15360.

133. Zlatkis A., Zak B., Boyle A.J. A new method for the direct determination of serum cholesterol // The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 1953. Vol. 41. №3. P. 486-492.