Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор биологических наук Игнатов, Сергей Георгиевич

• Игнатов, Сергей Георгиевич
• доктор биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации доктор биологических наук Игнатов, Сергей Георгиевич

ГЛАВА 1 ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1.1 Основы электрооптического метода

1.2 Электрофизические параметры клеток и клеточных 20 структур

1.3 Физиологические параметры клеток

1.4 Показатели гетерогенности клеточной популяции

1.5 Морфометрические параметры клеток и методы их 24 измерения

1.5.1 Прямые оптические методы измерения размера клеток

1.5.2 Прямой электрический метод измерения размеров и 26 концентрации клеток

1.6 Методы измерения поляризационных, электрофизических 27 и электрокинетических параметров суспендированных клеток

1.6.1 Измерение поляризационных и электрофизических 27 параметров суспендированных клеток

1.6.2 Измерение электрокинетических параметров клеток

1.7 Электрооптический метод анализа клеток 32 1.7.1 Феноменология электрооптического эффекта

1.8 Применение электрооптического метода для исследования 35 клеток, клеточных структур и биомолекул

1.8.1 Методологические аспекты применения метода

1.8.2 Направления использования электрооптического метода

ГЛАВА 2 БИОСЕНСОРЫ

2.1 Биосенсорные измерения

2.2 Типы биосенсоров

2.2.1 Амперометрические биосенсоры

2.2.2 Сенсоры, основанные на пьезоэлектрических кристаллах

2.2.3 Оптические сенсоры

2.2.4 Биосенсоры на основе фагов

2.3 Иммунологические методы определения бактерий

2.3.1 Получение антител

2.3.1.1 Поликлональные антитела

2.3.1.2 Моноклональные антитела

2.3.1.3 Рекомбинантные антитела

2.3.2 Иммуноферментный анализ

2.3.3 Иммуносенсоры

2.4 Биосенсор для определения антиоксидантной активности

2.4.1 Супероксид

2.4.2 Патофизиологическая роль свободных радикалов

2.4.3 Механизмы повреждений

2.4.3.1 Липиды

2.4.3.2 Белки

2.4.3.3 ДНК

2.4.4 Защитные механизмы против АФК

2.4.5 Свободные радикалы в биологических системах 61 2.4.5.1 Повреждения при реперфузии

2.4.6 Определение свободных радикалов 64 2.4.6.1 Электрохимический метод определения супероксида

ГЛАВА 3 ПРИМЕНЕНИЕ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

3.1 Бионанотехнология,.

3.2 Анализ наноорганизации аффинных поверхностей с помощью зондовой микроскопии.

3.2'Л.- Антитела-.

3.2.2. Аффинность антител.

3.3 Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии

3.3.1 Сканирующая туннельная микроскопия.

3.3.2 Атомно-силовая микроскопия.

3.4 Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта.

3.5 АСМ вирусов.

3.6 АСМ бактерий.

3.6.1 Нанесение бактериальных клеток на подложку для АСМ

3.7 Изучеиие взаимодействия фаг-бактерия с помощью АСМ микроскопии.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1 Культивирование микроорганизмов и фагов.

4.2 Электрооптический метод.

4.2.1 Подготовка клеток к анализу.

4.2.2 Измерение ориентационных спектров, к леток.

4.2.3 Идентификация микроорганизмов с использованием электрооптического метода и магнитных частиц.

4.3 Биосенсор на основе клеток или мембран.

4.3.1 Методика криоиммобилизации.

4.3.1.1 Перекристаллизация поливинилового спирта.

4.3.1.2 Концентрирование выращенной биомассы.

4.3.1.3 Приготовление суспензии клеток или мембран в растворе гелеобразователя.

4.3.1.4 Гранулирование с одновременным замораживанием

4.3.1.5 Реактивация и хранение иммобилизованных клеток или бактериальных мембран.

4.3.1.6. Криоиммобилизация клеток и мембран.

4.3.2 Приготовление сенсора на основе кислородного датчика

4.3.3 Тонкопленочные электроды.

4.3.4 Биосенсорные измерения антиоксидантных свойств веществ.

4.3.5 Оптический сенсор.

4.4 Иммунологические методы

4.4.1 Получение поливалентных сывороток к адено- и ротовирусам

4.4.2 Определение титра антител методом реакции диффузной преципитации (РДП).

4.4.3 Получение поликлональных антител.

4.4.4 Получение и характеристика моноклональных антител

4.4.5 Характеристика кроличьих специфических антител к S. typhimurium■

4.4.5.1 Получение гипериммуннойгкроличьей сыворотки

4.4.5.2 Выделение IgG фракций из.гипериммунных кроличьих сывороток

4.4.5.3 Дот-блот анализ

4.4.5.4 Тестирование сыворотки.

4.4.6 Подготовка латексных частиц для АСМ микроскопии

4.4.7 АСМ микроскопия.

4.4.8 Получение макрофагов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 5 ЭЛЕКТЕООПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 6 БИОСЕНСОРЫ.

6.1 Бесконтактное определение микроорганизмов

6.2 Биосенсор для определения глюкозы.

6.2.1 Глюкозный биосенсор для контроля синтеза авермиктина

6.2.2 Применение глюкозного биосенсора для определения фенол ьных соединений.

6.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизации.

6.4 Биосенсоры на основе ЦПМ.

6.5 Дормантные клетки как узнающий элемент биосенсора

6.6 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе ЦПМ.

6.7 Амперометрический биосенсор для определения антиоксидантной активности.

ГЛАВА 7 БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ.

7.1 Визуализация латексных частиц, сенсибилизированных антителами, в присутствии антигена методом атомно-силовой микроскопии.

7.2 АСМ микроскопия вирусов.

7.3 АСМ микроскопия бактерий.

7.4 Аффинные подложки.

7.5 Изучения взаимодействия фаг-бактерия.

7.6 Изучение фрагментов бактериальных клеток.

7.7 Изучение токсичности нанообъектов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов»

Разработка новых методов анализа в микробиологии имеет большое значение для развития науки и применения ее результатов в различных отраслях народного хозяйства. Одним из наиболее востребованных направлений в микробиологии является разработка быстрых и чувствительных методов изучения и идентификации бактерий на основе бионанотехнологий.

В настоящее время разнообразный анализ бактериальных клеток имеет большое значение в биотехнологии и медицине при создании препаратов на основе клеток, оптимизации микробиологического синтеза продуктов и других биотехнологических процессов, а также при разработке новых методов контроля и диагностики в микробиологии. Большинство методов для определения физиологического состояния бактерий, используемых микробиологией, основано на измерениях параметров внешней среды. Наличие между клетками и измерительным прибором промежуточного звена в виде поддерживающей среды обуславливает ряд недостатков этих методов: инерционность процесса измерений и усреднение измеряемых параметров. Поэтому электрооптический метод анализа, основанный на исследовании клеток как электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представляет собой новый подход к оценке прижизненных физиологических параметров клеток и их гетерогенности (ОиНу е! а1., 2007). Различие электрических свойств среды культивирования (поддерживающей среды) и бактериальных клеток приводит к появлению индуцибельных зарядов при наличии поля. Эти заряды образуются на границе любой пары электрически разных сред. Известно, что индуцированные электрическим полем заряды образуются и на границах клеточных структур. Их величина зависит от отношения электрических свойств соприкасающихся структур (8ЬсЬуо§о1еу е1 а1., 1994). Частным случаем измерений, который представляет особый интерес, является определение электропроводности цитоплазмы на поверхности контакта с мембраной. Взаимодействие индуцированных зарядов с электрическим полем приводит к возникновению вращательного момента, задавая ориентацию клеткам. Данная ориентация определяется минимальной потенциальной энергией и соответствует параллельной направлению электрического поля ориентации клеток. Изменение ориентации бактериальных клеток приводит к изменению оптических свойств суспензии. Оптическая плотность суспензии может изменяться на 1-2%, однако этого достаточно для электрооптического анализа бактериальных клеток (Bunin and Angersbach, 2008). Измерение вариаций оптических свойств суспензии после воздействия на нее электрического поля лежит в основе фотометрического метода (Stoylov, 1991).

Этот метод измерений является прижизненным. Он не использует дополнительных меток или химических компонент и не вызывает изменений в исследуемом» объекте. Преимуществом данного метода является то, что влияние среды измерения на точность измерения поляризационных параметров является незначительным и. предсказуемым. Воздействие на бактериальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. С помощью электрооптического метода возможно определить, количество и жизнеспособность бактерий. Метод является оперативным, причем процесс измерений может быть полностью автоматизирован.

Возможность применения" электрооптического метода для оценки состояния микроорганизмов в ходе технологического процесса и для анализа взаимодействия бактерий со специфическими антителами и фагами является актуальной и будет раскрыта в данной работе

Классические методы определения бактерий, основанные на культивировании микроорганизмов с последующим микробиологическим и биохимическим анализом, являются трудоемкой и длительной процедурой с использованием дорогостоящего оборудования. Биосенсоры являются аналитически чувствительной и недорогой альтернативой стандартным методам, применяемым сегодня для идентификации бактерий (Cardosi, Turner 1987). Они представляют собой аналитические приборы для селективного определения веществ и организмов, в которых используется комбинация биологической системы узнавания и физического преобразователя. В зависимости от физического преобразователя можно выделить три основных класса биосенсоров- электрохимические, оптические и масс-метрические (Vo-Din and Cullum, 2000). Электрохимические биосенсоры в основном представлены амперометрическими и потенциометрическими биосенсорами. С помощью амперометрических биосенсоров измеряют величину тока при постоянном потенциале, используя окислительно-восстановительные процессы узнающего элемента (Zhang et al., 2010). Пользуясь потенциометрическими биосенсорами, анализируют изменение потенциала преобразователя после взаимодействия* узнающего элемента с аналитом (Wang et al., 2010). Оптические- биосенсоры делятся на флуоресцентные и интегрированные оптические сенсоры. С помощью флуоресцентных биосенсоров измеряют изменение флуоресценции после специфического взаимодействия (Doong and Shih, 2010); Интегрированные оптические сенсоры - это сложные системы, анализирующие оптические изменения (Ноа et.al., 2007). На основе масс-метрических систем анализируют изменение массы после специфического взаимодействия. Они могут быть представлены пьезоэлектрическими сенсорами и сенсорами на основе микрокантилевера. Пьезоэлектрические биосенсоры делятся на кварце-кристаллические и поверхностно-акустические (Fu et al., 2010), с их помощью измеряют изменение резонансной частоты и величину поверхностной амплитуды соответственно. Биосенсоры на основе микрокантилевера анализируют частоту колебания микрокантилевера после специфического связывания с аналитом (Boisen and Thundat, 2010). В последнее время интенсивно развивается применение биосенсоров высокой плотности и системы искусственного носа. Биосенсоры высокой плотности характеризуются наличием системы, объединяющей до тысячи и более микросенсоров со сложной системой анализа данных для проведения большого массива исследовательских работ (LaFratta and Walt, 2008). Система искусственного носа - это набор измерителей анализирующих газовую фазу, подобно настоящему носу (Knobloch et al., 2010).

Наблюдается заметный рост интереса в области определения бактерий в реальном времени, в широком диапазоне дисциплин, включая медицинский анализ, анализ продовольствия и мониторинг окружающей среды (Tothill 2001, Walt and Franz, 2001, Ivnitski et al., 1999). В ряде случаев для увеличения чувствительности измерений применяются магнитные частицы (Laschi et al., 2009) и «квантовые точки» (Roda et al., 2009)

Увеличение числа анализируемых образцов,- требующих проверки и КОНТРОЛЯ-, И ПОТребнОСТЬ, В ВЫСОКОЙ ЧуВСТВИТеЛЬНОСТИ, СКОРОСТИ И ТОЧНОСТИ' аналитических измерений стимулировали значительный-, интерес к развитию, биосенсоров в качестве мощной-и недорогой альтернативы по отношению к стандартным химическим и энзимологическим методам, используемым на сегодняшний день. Несмотря на использование биосенсоров на основе бактериальных клеток (Buchinger et al., 2010), практически нет данных по использованию' клеточных фрагментов или субклеточных структур для повышения чувствительности и специфичности- измерений субстратов. Отсутствуют также литературные данные и по использованию простых систем «искусственного носа» и систем на основе оптоволоконных пучков для идентификации бактерий. Перспективным направлением является разработка биосенсора для анализа антиоксидантной активности веществ с последующим изучением их влияния на защитные функции макроорганизма.

Бионанотехнология - современная биологическая наука, оперирующая наноразмерными объектами. Возможности получения нанообъектов и способность анализировать их качественно изменяют уже существующие подходы в исследованиях. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) получила такое название благодаря ключевому элементу, обязательно присутствующему во всех её модификациях - зонду (Cuenat, 2010).

Микроскопический зонд двигается, как правило, построчно вдоль поверхности исследуемого образца, взаимодействуя с ним таким образом, что становится возможным детектировать количественную характеристику этого взаимодействия, которая, в конечном счёте, и несёт информацию о свойствах объекта. Передвижение зонда относительно поверхности образца осуществляет пьезосканер. Современные зондовые микроскопы обладают большим количеством режимов работы, позволяя изучать различные классы образцов. В настоящее время разработано более 20 модификаций СЗМ и их количество продолжает расти. В зависимости от типа зонда и детектируемого взаимодействия, выделяют следующие разновидности зондовой микроскопии: сканирующая- туннельная (измеряется сила тока туннелирования, электронов (Binning and Rohrer 1983), атомно-силовая (измеряется силовое взаимодействие атомов зонда и образца (Binning and Quate 1986), магнитно-силовая (измеряется магнитное взаимодействие (Saens et al., 1987), кельвин-микроскопия (измеряется контактная разность потенциалов (Nonnenmacher et al., 1991) и др.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) принадлежит к семейству проксимальной зондовой микроскопии* для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне. В течение последних десятилетий достигнут большой прогресс в применении АСМ как инструмента изучения нанообъектов в микробиологии (Dufrene 2002, Dufrene et al., 2009). С помощью АСМ можно- получить - трехмерное изображение поверхностных ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях путем анализа взаимодействия между поверхностью и специальным наконечником — кантилевером. Однако все исследования с применением АСМ в основном сводились к наноразмерному анализу бактериальной поверхности. Не была осуществлена специфическая иммобилизация вирусов и бактериальных клеток и/или их нанофрагментов для анализа и идентификации бактерий.

Важным аспектом бионанотехнологии является определение бактерицидной активности наносоединений (Кс1 еХ. а!., 2006). Следует учитывать, что наряду с бактерицидной активностью наносоединений, важна также их роль в функционировании макрофагов при фагоцитозе патогенов.

Бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов. Результаты работы очень важны для микробиологии, поскольку существенно расширяют и дополняют представления о методах идентификации прокариот и вносят существенный вклад в понимание процессов анализа бактериального мира.

Цель исследования

Основной целью работы является разработка и применение новых высокоэффективных методов анализа и идентификации бактерий на основе элетрооптических, биосенсорных и бионанотехнологических методов.

Задачи* исследования

1. Разработка электрооптического метода анализа и контроля физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов, а также идентификации микроорганизмов при специфическом взаимодействии с антителами и фагами.

2. Выявление электрооптических изменений микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антигенами и фагами.

3. Разработка биосенсоров с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов.

4. Изучение возможности использования глюкозного биосенсора для контроля синтеза авермиктина.

5. Разработка биосенсоров на основе бактериальных клеток или их фрагментов для определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий.

6. Разработка биосенсора для определения антиоксидантной активности веществ.

7. Определение наличия микроорганизмов по анализу летучих компонентов бактериальной культуры. Изучение возможности использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими летучих компонентов, либо по их поглощению из окружающей среды.

8. Получение аффинных поверхностей для. идентификации бактерий и использование бионанотехнологического подхода-на основе, атомно-силовой микроскопии для высокоспецифичной идентификации микроорганизмов.

9. Изучение токсического действия наносоединений на микроорганизмы.

Научная новизна

Разработан электрооптический метод диагностики физиологического состояния бактериальных клеток в процессе производства биологических препаратов и идентификации бактерий.

Впервые предложено использовать цитоплазматические мембраны бактерий при конструировании новых биосенсоров для определения лактата и оценки бактериальной обсемененности свежего коровьего молока. Использованы новые подходы для определения антиоксидантной активности веществ и их роли в ходе инфекционного процесса. Разработан новый простой метод идентификации бактерий по анализу органических летучих компонентов.

Впервые разработана система специфической визуализации прокариот с помощью АСМ. Предложены методы оценки бактерицидной активности наносоединений.

Практическая значимость

Разработан электрооптический метод анализа выживаемости бактериальных клеток и оценки целостности клеточной оболочки в биотехнологических процессах, а также идентификации микроорганизмов (подана заявка на патент). Создана новая система биологического узнавания биосенсора на основе цитоплазматической мембраны бактерий, увеличивающая чувствительность определения лактата по сравнению с биосенсорами на основе бактериальных клеток. Реализована методология специфической визуализации прокариотических клеток и их фрагментов для сверхчувствительной идентификации микроорганизмов с помощью АСМ на основе аффинных поверхностей < (Патент России RU 2261279 С1). Разработанный подход широко используется Институтом Теоретической и Экспериментальной Физики (г. Москва) в вопросе исследования микроорганизмов с помощью атомно-силовой микроскопии. Разработан метод оценки бактерицидной активности наносоединеий для микроорганизмов и фагоцитарной активности макрофагов (готовится заявка на патент). Результаты работы применяются Национальным исследовательским технологическим университетом «МИСиС» при разработке новых видов нанопокрытий с учетом их бактерицидных свойств и функциональной активности фагоцитов.

Личный вклад соискателя

Соискателю принадлежит решающая роль в выборе направлений исследований, в формулировании проблемы, постановке целей и задач, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Соискатель принимал участие во всех этапах исследований. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель принимал участие в проведении экспериментальной работы, в обобщении и интерпретации научных результатов, в подготовке научных публикаций, а также выступал с научными докладами.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены: на Всесоюзной конференции «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980 г.), на XI научной конференции по итогам НИР ВНИИ ПМ (Оболенск, 1986 г.), на Всесоюзной конференции «Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем» (Велегож, 1990 г.), на международной конференции «Развитие медицинского оборудования» (Подольск 1996 г.), на международном симпозиуме «Стресс и азотный обмен» (Москва, 1996 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Быстрые методы анализа биологических материалов в окружающей среде» (Варшава, 1997 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Новые направления* в развитии биосенсоров» (Киев, 199& г.), на международной конференции «Биокатализ-98» (Пущино, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-2000» (Москва, 2000 г.), на Всероссийской- конференции «Проблемы^ медицинской и экологической биотехнологии», (Оболенск, 1999 г.), на международной конференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии бактерий» (Пущино, 2000 г.), на международной конференции «Биосенсоры 2000» (Сан-Диего, США, 2000 г.), на международной конференции «Окись азота: фундаментальные исследования и применение в клинике» (Эриче, Италия, 2001 г.), на международной конференции «IT + ME» (Гурзуф, 2003 г., 2007 г.), на международной конференции «Канадский биологический коллоквиум» (Москва, 2004 г.), на 5 международном совещании МНТЦ/Корея (Сеул, Корея, 2004 г.), на 37 международном совещании МНТЦ-Япония по наноматериалам (Цукуба, Япония, 2004 г.), на международной конференции «Нанотех» (Бостон, США, 2 006 г. ), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ" (Оболенск, 2006 г.), на IX ежегодном зимнем совещании «Успехи в исследованиях на молекулярном уровне для биологии и нанонауки» (Линц, Австрия, 2007 г.), на Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007 г.), на Международной конференции «Сенсоры для окружающей среды, здравоохранения и безопасности (Виши, Франция, 2007 г.), на IV международной конференции «НаноБио и другие новые перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.), на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 г.), на Международном совещании экспертов по разработке лекарств (Москва, 2007 г.), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008 г), на Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008 г.), на Международной конференции «Евромат-2009» (Глазго, Великобритания, 2009 г.) и на Семинаре «Производство и применение наноматериалов в России: токсикологическое воздействие и нормативные вопросы" (Москва, 2009 г.).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах, содержит 11 таблиц, 88 рисунков. Список литературы включает 223 работы.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Игнатов, Сергей Георгиевич

212 ВЫВОДЫ

1. Показана принципиальная возможность применения электрооптического метода для анализа физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов. Разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

2. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при? анализе взаимодействия бактерий со специфическими антителами или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими антителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного носа на основе: высокоплотных оптоволоконных; пучков для» бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная; возможность использования? простой модификации метода спектрофотометрическош анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо- по выделению; ими летучих компонентов,' либо по их поглощению: из; окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутантыt' N. crassa, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями S. avermitilis показана принципиальная возможность использования биосенсора для контроля; биотехнологического процесса. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика, была успешно применена для: оптимизации условий выделения данного антибиотика.

5. Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цитоплазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и установлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсемененностью коровьего молока.

6. Разработан амперометрический супероксидный биосенсор для анализа антиоксидантной активности веществ, с последующим изучением действия антиоксидантов на выживаемость бактерий в макрофагальных клетках.

7. Впервые показано использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии совместно с получением аффинных поверхностей для специфической визуализации бактериальных нано-фрагментов, позволяющих повысить чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

8. Для визуализации и анализа взаимодействия фаг-бактерия использованы уникальные возможности АСМ для получения трехмерного изображения ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

9. Для поверхностей с мн ого функциональными биоактивными наноструктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки токсичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов направлены на повышение чувствительности и уменьшение времени процедур. С этой точки зрения применение электрооптического и биосенсорного подходов анализа и идентификации бактерий представляются весьма привлекательными благодаря нативности и чувствительности (для электрооптики), и чувствительности и быстроте (для биосенсоров), а применение бионанотехнологических подходов способствует не только визуализации процессов в нанометровом разрешении, но и увеличению чувствительности определения бактериальных клеток.

Электрооптический метод анализа клеток обеспечивает контроль электрофизических и связанных с ними морфологических и функциональных параметров бактерий. Интерпретация электрофизических параметров клеточных структур, фракционного состава популяции и морфометрии построена на взаимосвязи структуры и функций клетки.

К сожалению, в силу многообразия существующих особенностей морфологии и физиологии клеток, не существует универсального рецепта использования^ данного метода для исследования любых клеток в любых условиях. Однако основные направления применения электрооптического метода анализа достаточно строго обоснованы. К их числу можно отнести:

-определение абсолютной концентрации клеток и фракционного состава клеточной суспензии при существовании электрофизической или морфометрической гетерогенности образца;

-контроль качества препаратов на основе целых клеток при их производстве и при хранении;

-анализ физиологических процессов в клетках по их электрофизическим проявлениям;

-идентификация состояния клеток в ходе технологического процесса при воздействии факторов замораживания и лиофилизации;

-определение и идентификация микроорганизмов с применением иммунологических подходов;

-определение механизмов действия на клеточные биотест-системы вновь синтезированных биологически активных веществ.

Перечень направлений использования электрооптического метода анализа клеток, и клеточных структур достаточно внушителен и он опирается на результаты завершенной объемной методической работы, литературные данные и итоги экспериментов. Результаты электрооптических исследований взаимодействия микроорганизмов с антителами или с частицами, модифицированными антителами, позволяют оценить возможность, совмещения достижений в области иммуноидентификации и электрофизических измерений: Электрооптическое исследование взаимодействия фаг-бактерия также может быть применено для обнаружения и идентификации- микроорганизмов. Следует остановиться- на некоторых ограничениях метода. В первую очередь они касаются размеров и формы клеток Клетки должны, обладать ассиметрией формы и иметь, размеры, не превышающие 5-8 мкм. Последнее ограничение в значительной степени «относится' к корректности используемой оптической модели и строгости интерпретации полученных результатов. Второе ограничение метода касается требований к электропроводности поддерживающей среды, которая не должна превышать величины 2-10 /Ом-м. Данное ограничение может быть преодолено с помощью достаточно простых методических или технических средств.

На основании итогов многолетней работы по разработке основ электрооптики микроорганизмов, можно сделать обобщающий вывод о создании теоретической и методической базы для широкого внедрения электрофизического метода анализа клеточных структур и определения гетерогенности клеточных популяций.

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов могут быть чувствительными, недорогими, с хорошими количественными и качественными характеристиками. Однако их применение требует обученного персонала и длительных временных процедур. Биосенсоры представляют собой- разумную альтернативу традиционным методам, сокращая процедуру измерения и улучшая ее качество. В данной работе были предприняты попытки расширения применения известных биосенсоров и создание новых биосенсорных элементов.

Ранее оптоволоконные биосенсоры применялись, в основном, для анализа процессов гибридизации ДНК, при оценке взаимодействия антиген -антитело или для изучения летучих органических соединений. В представленной работе предпринята попытка идентификации микроорганизмов путем, анализа летучих компонентов (ЛК) бактерий. Принцип определения бактерий основан на анализе: воздушного пространства над образцом- для определения ЛК компонентов с помощью системы искусственного носа. Разработаны два метода неконтактного определения' бактерий. Первый — простой анализатор летучих, компонентов (термостатируемый и для постоянного мониторинга) для определения бактерий-, и грибов, по анализу газов над микробными культурами. Метод основан на анализе спектральной оптической плотности сольвента после пропускания через него газовой смеси, образовавшейся над микробными культурами: Показана принципиальная возможность использования простой модификации, метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими ЛК, либо по их поглощению из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты Кеигоярога сгаяБа, дефектные-по метаболизму азота, от штаммов дикого типа. По-видимому, пИ-2 и пЫ-б гены гриба связаны с образованием ЛК у этого организма. Второй метод - система искусственного носа на основе оптических волокон высокой плотности, позволяющая определять бактерии. Пористые силиконовые микросферы с флуоресцентным красителем, инкорпорированные в оптоволоконные системы, использовали для оценки изменения их флуоресценции после взаимодействия с ЛК. Анализ достоверности результатов эксперимента показал возможность применения системы искусственного носа на основе оптоволоконной системы для определения бактерий.

Известно, что максимальный выход антибиотика авермиктина наблюдается при полном потреблении глюкозы в среде роста микроорганизма. Биосенсор на глюкозу позволяет оперативно контролировать уровень содержания глюкозы в среде культивирования. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения антибиотика авермиктина.

Известно, что применение микроорганизмов в качестве узнающего элемента биосенсора широко практикуется при анализе окружающей среды и пищи. Однако- микроорганизмы представляют собой- сложные полиферментные системы, а наличие сложных метаболических процессов мешает интерпретации сигнала. Поэтому разработка узнающего элемента биосенсора на основе цитоплазматической мембраны» микроорганизмов позволяет увеличить специфичность и чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании» можно получить биосенсор на определенный субстрат.

Важным условием оценки качества биосенсора является повышение-стабильности биомодуля. Показано, что применение криоиммобилизации позволяет увеличить срок действия биомодуля. Использование другого подхода, основанного на получении мембран из дорматных бактерий, не привело к существенному улучшению стабильности биомодуля.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиоксидантной активности. Влияние антиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не установлено. Поэтому применение биосенсора является удобным инструментом оценки антиоксидантной активности соединений для выяснения их роли в процессах переживания микроорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии - современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микроскопии позволило визуализаровать такие процессы, как реакция гемагглютинации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, данный подход с использованием антител позволил специфически визуализировать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых областях с применением наноподходов требует хотя бы предварительного изучения возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наночастиц.

В заключение хочется сказать, что полученные результаты являются определенным этапом при изучении электрооптики, биосенсоров и наноподходов в микробиологии и могут являться отправной точкой для дальнейших исследований в данном направлении.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Игнатов, Сергей Георгиевич, 2010 год

1. Аненко М. И., Дубовик А. С. Прикладная оптика.-М.: Наука, 1971.-250 с.

2. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.-М.: Наука, 1985.-291 с.

3. Борн М., Вольф Э. Основы оптики.-М.: Наука, 1960.-415 с.

4. Брезгунов В. Н., Бунин В. Д., Швец Н. В., Волошин А. Г., Светогоров Д. Е., Щепкина А. Н. Определение электрооптическим методом числа неповрежденных бактериальных клеток после экстремальных воздействий. // Микробиология.-1985.-Т.54.- № 4.- С. 616-620.

5. Войтылов В. В., Какорин С. А., Трусов А. А. Исследование анизотропии электропроводности коллоидов и суспензий, наведенной внешним электрическим полем. //Колл. журн.-1986.-Т.48.- № 1.-С. 139-141.

6. Войтылов В. В., Рудакова Е. В., Спартаков А. А., Толстой Н. А. Электрооптические явления в лиофобных коллоидах. Развитие метода вращающегося-поля, //Колл. журн.-1981.-Т.45.-№ 1.- С. 107-112

7. Войтылов В! Bs, Спартаков А. А., Трусов А. А. Электрооптический метод определения распределения дихроичных коллоидных частиц по размерам, учитывающий их коэффициенты ослабления. // Колл. журн.-1978.-Т.44.-№ З.-С. 604-606.

8. Войтылов В. В., Трусов А. А. Электрооптика и кондуктометрия полидисперсных систем.-Л: Изд. Ленинградского ун-та, 1989.-88 с.

9. Голубев О. А., Груббер И. М. Исследование ^-потенциала и иммуногенных свойств Salmonella typhi при различных условиях культивирования. // ЖМЭИ.-1972.- № 1.-С. 121-125.

10. Гузев В. С., Голубев В. И., Звягинцев Д. Г. Обнаружение микрокапсул у микроорганизмов и контролирование полноты их декапсулирования методом микроэлектрофореза. // Микробиология.-1972.-Т.41.-№ 1.- С. 115-120.

11. Гузев В. С., Звягинцев Д. Г. Микроэлектрофорез в микробиологии: Сб. Микробные метаболиты.-М., 1979.-С. 150-164.

12. Духин С. С. Электрооптика коллоидов.-Киев: Наукова думка, 1977.- 246 с.

13. Дягтерева Т. В., Кузнецова А. Н., Степанов Г. В., Терешкова Г. М. Поведение клеток хлореллы в неоднородном переменном электрическом поле: Сб. Управляемый биосинтез и биофизика популяции-Красноярск, 1969.-С. 68-70.

14. Дятлов И. А., Филиппов А. Ф., Космаенко О. М. Контроль биотехнологических процессов с использованием новых физико-химических методов анализа биообъектов: Сб. Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу-Черновцы, 1991.-Т.2.-С. 160.

15. Емельянов В. М., Котов Н. В., Сахно Т. В., Чугунов А. В. Исследование движения дрожжевых клеток под действием электрического поля впрямоугольной ячейке замкнутого типа-Казан, хим.- технол. ин-т.- Казань, 1989.-С. 11.

16. Иванов А. И., Угодчиков Г. Н. Гетерогенность клеточных популяций М.: Наука, 1989.-266 с.

17. Кривошеин Ю. С., Федорина О. А., Сергиева В. И., Сарачан Т. А. Использование электрофореза в борат-полиольной системе для изучения гетерогенности популяции Escherichia coli. П Биофизика микробных популяций.-Красноярск, 1987.-С. 120.

18. Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г. Определение анизотропии поляризуемости бактериальных клеток при средней степени ориентации.// Коллоидный журнал. 1991. Т. 55. С. 365-367.

19. Леви А., Сикевиц Ф. Структура и функции клетки.-М.: Мир, 1971.-383 с.

20. Лопатин В. Н., Сидко Ф. Я. Введение в оптику клеточных суспензий — Новосибирск: Наука, 1988.- 202 с.

21. Мирошников Ф. И., Фомченков В:, М. Иванов А. Ю: Электрофизический анализ и разделение клеток-М^: Наука, 1986.- С.181

22. Октябрьский О; Н., Смирнова Г. В: Зависимость изменения редокс-потенциала среды при* остановке роста бактерий от характера клеточной поверхности и параметров среды. // Известия АН СССР; серия биологическая-1986.-№ 4.-С. 616-619.

23. Позмогова И. Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях-М.: Наука, 1983.-104с.

24. Рабинович Ф. М. Кондуктометрический метод дисперсного анализа.- Л: Химия, 1970.-135 с.

25. Сигал В. Л. Количественная- интерпретация экспериментальных данных клеточного^электрофореза. //Лаб. Дело.-1985.-№2.-С. 123*.

26. Тамм И. Е. Основы теории электричества.-М.: Наука, 1976.-380 с.

27. Фомченков В. М., Денисюк А. И. Теоретическая модель высокочастотной релаксации электроориентации бактериальных клеток. // Электрон, обр. материалов-1980.-№ 2.-С. 65-70.

28. Фомченков В. М., Иванов А. Ю., Ажермачев А. К. Влияние поверхностно-активных веществ на электрические свойства бактериальных клеток. // Микробиология.-1986:-Т.55.-№ 4.-С.01-606.

29. Фомченков В. М.,. Мазанов А. Л., Брезгунов В. Н. Влияние дисперсии электрических параметров клеток на их ориентацию в переменном электрическом поле. // Биофизика.-1982.-Т.27.-С. 445-669.

30. Фомченков В. М., Мазанов А. Л., Брезгунов В. Н. Влияние дисперсии электрических параметров клеток на их ориентацию в переменном электрическом поле. //Биофизика.-1982.-Т.27.-С. 445-669.

31. Фролов Ю. Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы.-М.: Химия, 1988.-464 с.

32. Хамер Г. Химическая технология и биотехнология. Принципы и применение.-М.: Мир, 1988.-С.395-465.

33. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л.,. Мальцева Е.В. Методы определения антиоксидантов. //Химия раст. Сырья, 2004. Т.З. С. 63-75.

34. Хлебцов Н. Г. Матрица рассеяния для анизотропных эллипсоидов сравнимых с длиной волны света. // Оптика и спектроскопия.-1979.-Т.46.-№ 2.-С. 341-346.

35. Хлебцов Н. Г. Теоретическая интерпретация исследования электрического пробоя клеточных мембран электрооптическим методом. // Биолог, мембраны.-1993.-Т. 10.-№ 1.-С. 88-93

36. Хлебцов Н. Г. Теория дихроизма и двулучепреломления в аксиально ориентированных дисперсных системах: Препринт.-Ин-т биохимии и микробиол. раст. и микроорг. АН СССР-Саратов: изд. Саратовского ун-та.-1988.-34 с.

37. Хлебцов Н. Г., Кутузов*Ю. И. Угловые функции светорассеяния сфероидов в приближении Релея-Ганса-Стивенсона. // Оптика и спектроскопия.-1980.-Т.49:-№ 2.-С. 341-346.

38. Челидзе Т. Д., Кикнадзе В. Д., Кевлишвили Г. Е. Диэлектрическая спектроскопия крови. 1 Диэлектрические спектры нормальной крови человека. //Биофизика-1973 -Т. 18.-С. 932-935.

39. Шван Г. Диэлектроскопия биологических веществ в поле переменного тока. // Электроника и кибернетика в биологии и медицине.-М., 1963.- С. 71-108.

40. Швец Н'. В., Волошин А. Г., Брезгунов В. Н. Электрооптический метод оценки жизнеспособности микроорганизмов после сублимационной сушки. // Биотехнология.-1987.-Т.З.-№ 4.-С. 528-531.

41. Шифрин К. С. Введение в оптику океана.-Л: Гидрометеоиздат, 1983.- 180 с.

42. Эккерт Р. Разделение клеток иммунной системы. // Иммунологические методы. / Под ред. Г. Фримеля.-М.: Медицина, 1987.-С. 226-254.

43. Abdel-Hamid I., Ivnitski D., Atanasov P., Wilkins E. (19990 Flow-through immunofiltration assay system for rapid detection of E. coli 0157:H7. Biosens. Bioelectron. -1999.-V. 14.- P: 309-316.

44. Albert K.J., Lewis N.S., Schauer C.L., Sotzing G.A., Stitzel S.E., Vaid T.P., Walt D.R. Cross-reactive sensor arrays. Chem. Rev.- 2000.- V.100.- P. 2595-2626.

45. Allen P. M., Allen H., Hill O., Walton N. J. Surface modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytochrome с J. Electroanal. Chem.-1984.-V. 178,-N. l.-P. 69-86.

46. Armstrong F.A. Probing metalloproteins by voltammetry. Structure & Bonding, Springer Berlin / -Heidelberg.-1990.-V.72.-P. 137-221.49.