Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.13, кандидат технических наук Халимова, Лилия Хамитяновна

• Халимова, Лилия Хамитяновна
• кандидат технических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат технических наук Халимова, Лилия Хамитяновна

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Экологический и биокаталитический потенциал микроорганизмов-деструкторов ЭПХГ и хлоргидринов глицерина 1О

1.1. Микробиологическая деградация ЭПХГ и хлоргидринов глицерина 1О

1.2. Микроорганизмы-деструкторы ЭПХГ и хлоргидринов глицерина - новые инструменты для получения оптически активных соединений

1.2.1. Применение микроорганизмов-деструкторов ХОС в синтезе оптически активных соединений. Альтернативные методы синтеза

1.2.2. Кинетическое разделение рацемических смесей 3-ХПД и 2,3-ДХП (или 2,3-дибромпропанола)

1.2.3. Трансформация 1,3-ДХП

1.2.4. Кинетическое разделение эпоксидов ■

1.3. Биотехнологические способы обезвреживания низкомолекулярных ХОС и эпоксидов

1.3.1. Использование локальных установок для детоксика-ции хлорорганических ксенобиотиков

1.3.2. Иммобилизация микроорганизов-деструкторов в процессах очистки сточных вод от ксенобиотиков

1.3.3. Биотестирование очищенных сточных вод

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Материалы исследования

2.2.1. Синтез (Я)- и/или (8)-ЭПХГ

2.2.2. Синтез (Я)- и/или (Б )-3-ХПД

2.3. Методы исследования

2.3.1. Культивирование микроорганизмов

2.3.2. Получение накопительных культур

2.3.3. Выделение чистых культур микроорганизмов-деструкторов ХОС

2.3.4. Идентификация микроорганизмов

2.3.5. Определения совместимости штаммов

2.3.6. Иммобилизация микроорганизмов на ПКА-волокне

2.3.7. Выделение и очистка ферментов

2.3.7.1. Получение клеточных экстрактов

2.3.7.2. Выделение и очистка ферментов из клеточных экстрактов АнЬ/оЬаМег яр. 15

2.3.7.3. Электрофорез клеточных экстрактов АпкоЬаМег Бр. 15-4 в агарозном геле

2.3.7.4. Определение концентрации белка

2.3.7.5. Определение концентрации ионов хлора 48 23.1 .в. Определение дегалогеназной и эпоксидгидролазной активности клеточных экстрактов

2.3.8. Обработка клеток микроорганизмов акридиновым оранжевым

2.3.9. Трансформация хлорорганических соединений покоящимися клетками микроорганизмов

2.3.9.1. Определение концентрации биомассы

2.3.9.2. Определение дегалогеназной активности клеток

2.3.9.3. Определение эпоксидгидролазной активности клеток

2.3.9.4. Определение концентрации хлорорганических субстратов и продуктов трансформации

2.3.9.4.1. Обнаружение 3-хлормолочной кислоты

2.3.9.4.2. Определение карбонилсодержащих соединений

2.3.9.5. Идентификация продуктов трансформации хлорорганических соединений

2.3.10. Определение оптической чистоты продуктов биотрансформации

2.3.11. Селекция устойчивых к повышенным концентрациям ХОС микроорганизмов

2.3.12. Определение ЭПХГ в отходящих газах из биореактора 53 2.3.1.3 Определение показателей качества воды (сточных вод производства эпоксидных смол)

2.3.13.1. Определение ХПК

2.3.13.2. Количественное определение натрия хлористого ( хлорид-ионов) в воде

2.3.13.3. Определение глицерина и хлоргидринов глицерина в воде

2.3.13.4. Определение токсичности воды 54 2.3.14. Математическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Скрининг микроорганизмов - деструкторов ХОС

3.1.1. Выделение микроорганизмов из природных источников

3.1.2. Исследование конверсии ХОС покоящимися клетками микроорганизмов

3.1.3. Исследование продуктов трансформации ХОС микроорганизмами

3.2. Разработка биокатализаторов для синтеза оптически активных веществ путем кинетичекого разделения рацемических смесей

3.2.1. Поиск стереоселективных эпоксидгидролаз и дега-логеназ

3.2.2. Идентификация штаммов ^продуцентов стереоселективных ферментов

3.2.3. Исследование продуктов трансформации рацемического 3-ХПД и ЭПХГ энантиоселективными штаммами

3.2.4. Исследование ассимиляции рацемического 3-ХПД и ЭПХГ энантиоселективными микроорганизмами

3.2.5. Генетическая модификация биокатализаторов синтеза оптически активного 3-ХПД из ЭПХГ

3.2.6. Исследование возможности многократного использования биокатализатора при трансформации ЭПХГ

3.2.7. Разработка биокатализаторов для синтеза оптически активных веществ из прохиральных соединений

3.3. Создание консорциума микроорганизмов для обезвреживания ХОС

3.3.1. Отбор прототрофных штаммов, ассимилирующих ХОС

3.3.2. Селекция штаммов, устойчивых к повышенным концентрациям ХОС

3.3.3. Оценка обезвреживающей активности микроорганизмов

3.3.4. Исследование совместимости и патогенности микроорганизмов консорциума

3.3.5. Исследование иммобилизации микроорганизмов консорциума на полиакриламидных волокнах

3.3.6. Исследование морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических свойств микроорганизмов - компонентов консорциума

3.4. Иммобилизация консорциума в биореакторе

3.5. Исследование условий очистки модельных стоков, содержащих ЭПХГ

3.6. Исследование работы биофильтра

3.7. Исследование очистки сточных вод производства эпоксидных смол

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина»

Актуальность проблемы. Сложная экологическая ситуация во многих регионах страны определяется отсутствием эффективных, надежных технологий обезвреживания выбросов промышленных предприятий, использующих или производящих хлорорганические соединения, а также длительным применением высокотоксичных хлорированных гербицидов в сельском хозяйстве.

Многолетнее воздействие хлорорганических соединений, многие из которых помимо токсического действия обладают еще и канцерогенным действием, приводит к значительному росту заболеваний, в том числе и онкологических. В связи с этим остро стает вопрос: как защитить природу от дальнейшего загрязнения хлорорганикой со стороны многочисленных предприятий.

Перспективным подходом для решения этого чрезвычайно сложного вопроса может служить использование биотехнологических методов деток-сикации вредных соединений. Однако применение традиционных технологий биологической очистки от хлорорганики, используемых на заводских биологических очистительных станциях, не дает требуемого качества. Снижение концентрации хлорорганических соединений в стоках зачастую происходит вследствие "отдувки" воздухом (для низкомолекулярных, летучих соединений), а также сорбции активным илом, что в свою очередь ведет к загрязнению воздушного пространства и образованию высокотоксичных свалок.

Весте с тем во многих странах (США, Япония, Германия, Финляндия, Россия, Казахстан, Украина и др.) ведутся работы по разработке современных технологий локальной детоксикации токсичных соединений с участием специализированных микроорганизмов-деструкторов. Создание высоких концентраций микроорганизмов за счет иммобилизации клеток на носителях, правильное сочетание аэробных и анаэробных стадий, а также реализация принципа "пространственной суксцессии" в прямоточной системе позволяет реализовать эффективную очистку сточной воды от токсичных соединений при образовании значительно меньшего избытка активного ила по сравнению с действующими биологическими очистными сооружениями.

Основная сложность в разработке эффективных методов локальной очистки связана с отсутствием высокоактивных микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к высоким концентрациям хлорорганических соединений.

Вместе с тем такие микроорганизмы представляют интерес для решения экологических проблем не только путем детоксикации ксенобиотиков, но и путем замены устаревших токсичных биоцидов (гербицидов, инсектицидов, пестицидов) на современные средства защиты растений, а также путем перехода на лекарственные препараты нового поколения. Такие вещества зачастую представляют собой хиральные молекулы, у которых физиологической активностью обладает только один из возможных стереоизомеров изомеров. Для синтеза таких соединений требуются оптически активные синтоны, с целью получения которых в последние годы интенсивно развиваются биокаталитические методы с применением ферментов и клеток микроорганизмов.

В этом плане микроорганизмы-деструкторы хлорорганических соединений могут служить источником уникальных ферментов, обладающих высокой активностью и стереоселективностью, которые могут синтезироваться в сверхколичествах.

Эпихлоргидрин (ЭПХГ) и хлоргидрины глицерина: 1,3-дихлорпропанол-2 (1,3-ДХП), 2,3-дихлорпропанол-1 (2,3-ДХП), 3-хлорпропандиол (3-ХПД), широко используются в химической промышленности. Эти соединения, в особенности ЭПХГ, хотя и не обладают кумулятивным действием, но в силу своей реакционной способности относятся к числу наиболее опасных ксенобиотиков, воздействующих на генетический аппарат человека.

Микроорганизмы, ассимилирующие эти соединения могут быть использованы для их обезвреживания в сточных водах и газо-воздушных выбросах промышленных предприятий, а также могут служить источником стереоселективных ферментов, в частности галогидрин-дегалогеназ и эпоксидгидролаз. Эти ферменты считаются наиболее перспективным инструментом для синтеза оптически активных эпоксидов, вицинальных диолов и галогидринов, являющихся важнейшими синтонами в синтезе ряда биологически активных веществ и жидких кристаллов.

Целью работы является поиск микроорганизмов-деструкторов ЭПХГ и хлоргидринов глицерина и оценка возможности их использования в биокатализе для синтеза оптически активных продуктов и очистке воды от хлорорганических ксенобиотиков.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов-деструкторов эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина;

• идентификация продуктов метаболизма хлорорганических соединений;

• поиск микроорганизмов для синтеза оптически активных ЭПХГ и 3-ХПД;

• создание консорциума микроорганизмов для обезвреживания хлорорганических соединений в сточной воде;

• исследование очистки иммобилизованным консорциумом модельной сточной воды от ЭПХГ на проточной лабораторной установке;

• оценка возможности использования консорциума микроорганизмов для очистки стоков производства эпоксидных смол;

• исследование морфологических, хемотаксономических и физиолого-биохимических свойств практически важных микроорганизмов.

Научная новизна. Выделены новые эффективные штаммы-деструкторы ЭПХГ и хлоргидринов глицерина, исследованы пути биодеградации этих ксенобиотиков и получены данные, указывающие на их отличие от известных путей.

Найдены новые биокатализаторы для синтеза оптически активных эпоксидов и диолов (в том числе галогенсодержащих), путем разделения их рацемических смесей или трансформацией прохирального предшественника. Впервые разработаны методы синтеза (R)- и (8)-ЭПХГ, а также (R)- и (8)-3-ХПД путем кинетического разделения рацемических смесей с помощью штаммов Rhodococcus sp. 18-19, Pseudomonas sp. 28-12 и Pseudomonas sp. 31-3, позволяющие получать продукты высокой энантиомер-ной чистоты (97 и 98 % ее).

Научно обосновано создание консорциума на основе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Microbacterium laevanifor-mans R27-33, Arthrobacter sp. 22-11 и Nocardioides simplex R50-5 для обезвреживания ЭПХГ и хлоргидринов глицерина в промышленных выбросах.

Практическая значимость. Разработаны стереоселективные биокатализаторы (.Pseudomonas sp. 31-3, Rhodococcus sp. 18-19 и Pseudomonas sp. 28-12) для получения оптически активных синтонов биологически активных веществ путем кинетического разделения рацемических смесей ЭПХГ и 3-ХПД. С помощью этих микроорганизмов созданы препаративные методы синтеза высокочистых (R)- и (8)-энантиомеров этих соединений (97 - 98 % ее) с выходом более 95 % (в расчете на конвертированный субстрат).

Создан новый эффективный консорциум микроорганизмов на основе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Microbacterium laevaniformans R27-33, Arthrobacter sp. 22-11 и Nocardioides R50-5 для очистки сточных вод от эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина.

Разработана установка локальной очистки сточной воды от ЭПХГ с помощью консорциума микроорганизмов, иммобилизованного на полика-проамидном носителе. Проведены производственные испытания установки для очистки сточных вод производства эпоксидных смол ОАО "Уфахим-пром" от ЭПХГ. Показано, что иммобилизованные микроорганизмы консорциума полностью разрушают ксенобиотик, содержащийся в воде в концентрации до 4 г/л, подвергнутой предварительной нейтрализации до pH 7,0-7,2 и разбавлению в два раза. При этом достигается снижение концентрации сопутствующих веществ (глицерина и хлоргидринов глицерина) на 96,5 % и уровня ХПК воды на 91,3 %. 9

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Международном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), XII Международной конференции по производству и применению химических реагентов "Ре-актив-99" (Москва, 1999), V международной конференции по интенсификации нефтехимических процессов "Нефтехимия-99" (Нижнекамск, 1999), II Международной конференции молодых ученых "Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге новой эры" (г. Санкт - Петербург, 1999), Международной научно-технической конференции, посвященной 50-летию УГНТУ (Уфа, 1998), Международной научно-практической конференции "Сервис большого города" (Уфа, 1999), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990), Всероссийской научно-технической конференции "Проблемы нефтегазового комплекса России" (Уфа, 1995), VII Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Екатеринбург, 1997), научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых (Уфа, 1989, 1990, 1994- 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), экспериментальную часть и обсуждение результатов (3 глава), выводы и список цитируемой литературы, содержащей 159 ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит 26 рисунков и 27 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Нефтехимия», Халимова, Лилия Хамитяновна

Выводы

1. Из природных источников выделены и идентифицированы штаммы Pseudomonas spp. 31-3, 28-12, 28-1, 28-21, Rhodococcus sp. 18-19, No-cardioides simplex 50-5, Arthrobacter spp. 22-11, 15-4, Microbacterium lae-vaniformans 27-33, способные деградировать эпихлоргидрин и хлоргидри-ны глицерина. Показано, что в ходе подготовительного метаболизма этих штаммов ХОС превращаются в глицерин.

2. Установлено, что деградация 3-ХПД штаммами Pseudomonas sp. 28-12, Pseudomonas sp. 31-3 и Rhodococcus sp. 18-19 осуществляется с помощью стереоселективной 3-ХПД-дегалогеназы. Показана возможность получения высокочистых энантиомеров (S)- или (Я)-З-ХПД (более 97 % ее) путем кинетического разделения рацемической смеси этого соединения с помощью клеток микроорганизмов.

3. Выявлено, что штаммы Pseudomonas sp. 28-12, Pseudomonas sp. 31-3 и Rhodococcus sp. 18-19 осуществляют стереоселективный гидролиз ЭПХГ с образованием оптически активных соединений - остаточного энантиомера (R)- или (8)-эпоксида и (R)- или (8)-3-ХПД соответственно. Показано, что дикие штаммы катализируют синтез диола с низким выходом, вследствие дальнейшей конверсии этого соединения. Получены мутанты бактерий Pseudomonas sp. 31-3 и Pseudomonas sp. 28-12, потерявшие способность дехлорировать 3-ХПД, синтезирующие (Я)-З-ХПД из ЭПХГ с выходом, близким к теоретически возможному.

4. Обнаружено, что штамм Arthrobacter sp. 15-4, трансформирует прохиральный 1,3-ДХП в 3-ХПД, содержащий около 91 % (Я)-изомера. Показано, что в клетках этого штамма присутствуют два фермента с 1,3-ДХП-дегалогеназной активностью, что может служить причиной снижения чистоты получающегося продукта.

5. Установлено, что штаммы Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Nocardioides simplex 50-5, Arthrobacter sp. 22-11, Microbacterium laevaniformans 27-33 проявляют высокую эпоксидгидролазную и дегало-геназную активность и устойчивость к ХОС и способны полностью их деградировать. Осуществлена селекция штаммов Nocardioides simplex R50-5, Microbacterium laevaniformans R27-33, обладающих сверхустойчивостью к ХОС. Показана способность микроорганизмов иммобилизоваться на по-ликапроамидных волокнах, достигая концентрации 8-10 мг (асв) на грамм носителя.

6. На базе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Nocardioides simplex R50-5, Arthrobacter sp. 22-11, Microbacterium laevaniformans R27-33, создан консорциум для детоксикации ЭПХГ и хлоргид-ринов глицерина в промышленных выбросах. Определены условия очистки модельного стока, содержащего ЭПХГ, на лабораторной установке с помощью иммобилизованного консорциума. Показано, что эффективная

111 детоксикация стока достигается при концентрации ксенобиотика не более 2 г/л и скорости разбавления 0,05 - 0,06 ч"1.

7. Установлено, что микроорганизмы консорциума способны расти и деградировать ЭПХГ даже в условиях высоких концентраций хлористого натрия (60 г/л) в присутствии глицерина (5,0 г/л), толуола (0,1 г/л) и дифе-нилолпропана (0,05 г/л).

8. Показана возможность использования иммобилизованного консорциума для локальной очистки сточных вод производства эпоксидных смол, содержащих до 4 г/л ЭПХГ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Халимова, Лилия Хамитяновна, 2000 год

1. Промышленные хлорорганические продукты. Справочник / под ред. Ошина JI.A. М: Химия - 1978. - 654 с.

2. Goldman, P., G.W.A. Milne, and D.B. Keister. Carbon-halogen bond cleav age. III. Studies on bacterial halidohydrolases. // J. Biol. Chem. -1968.-v.243 -p.428-434.

3. Ehrenberg L., and S. Hussain. Genetic toxicity of some important epoxides //. Mutat. Res. 1981. - v. 86, № 1 - p. 113.

4. Wade, D.R., S.C. Airy, and J.E. Sinsheimer. Mutagenicity of aliphatic epoxides. // Mutat. Res. 1978. - v. 58. - p. 217-223.

5. Neilson, A. H. The biodégradation of halogenated organic compounds // J. Appl. Bacteriol.- 1990. v.69 - p. 445-470.

6. Chaudhry C.R. and Shapalamadugu. Biodégradation of halogenated organic compounds. // Microbiol. Rev. 1991. v.55 - p.59- 79.

7. Hardman, D.J. Biotransformation of halogenated compounds. // Crit. Rev. Biotechnol. 1991. - v. 11 - p. 1 - 40.

8. Leisinger T., and R. Bader. Microbial dehalogenation of synthetic organohalogen compounds: hydrolytic dehalogenases. // Chimia.- 1993. -v. 47 p.116-121.

9. Van den Wijngaard, A. J. Prins, A. C. Smal, and D.B. Janssen. Degradation of 2-chloroethylvinylether by Ancylobacter aquaticus AD25 and AD27. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - v.59 - p.2777-2783.

10. Janssen. D.B., J. Gerritse, J. Brackman, C. Kalk, D. Jager, and B. Witholt. Purification and characterization of a bacterial dehalogenase with activity toward halogenated alkanes, alcohols and ethers. // Eur. J. Biochem. -1988. v.171 -p.67-72.

11. Fetzner S., F. Lingens. Bacterial dehalogenases ¡Biochemistry, Genetics and Biotechnological Application. // Microbiol. Rev. 1994. - v.58,4 p.641- 685.

12. Hardman, D. J., and J. H. Slater. Dehalogenases in soil bacteria. // J. Gen. Microbiol. 1981. - v. 123 - p. 117-128.

13. Nakamura T., F. Y.W. Mizunashi, and L. Watanabe. Microbial transformation of prochiral 1.3-dichloro-2-propanol into optically active 3-chloro-1.2-propanediol. // Agric. Biol. Chem.- 1991. v.55 - p.1931-1933.

14. Assis H. M. S, Sallis P. J., Bull A. T., Hardman D. J. Biochemical characterization of a Haloalcohol dehalogenase from Arthrobacter erithii HlOa. // Enz. And Microbiol. Tech. 1998. - v.22. - p.568 - 574

15. Suzuki, T., N. Kasai. R. Vamamoto. and N. Minamiura. Isolation of a bacterium assimilating (R)-3-chloro-l,2-propanediol and production of (S)-3-chloro-l,2-propanediol using microbial resolution. // J. Ferment. Bioeng. -1992. v.73 - p. 443-448.

16. Kasai, N., K. Tsujimura, K. Unoura, and T. Suzuki. Degradation of 2,3-dichloro-l-propanol by a Pseudomonas sp. // Agric. Biol. Chem-1990,- V.54 p.3185-3190.

17. Faber K. Biotransformations in organic chemistry. / Textbook.-Springer-Verlag.- 1995.- 356 p,

18. Bartnicki E.W. and Castro C.E. Biodegalogenation. The pathway for transhalogenation and the stereochemistry of epoxide formation from halogydrins // Biochemistry.- 1969,- v.8.- p.4677 4680.

19. Assis H.M.S., Bull A.T., Hardman D.J. Synthesis of chiral epihalohydrins using haloalcohol dehalogenase A from Arthrobacter erithii H 10a // Enzyme and Microbial Technology.- 1998.- V. 22.- p. 545 551.

20. Bull, A. T., Hardman, D. J, Sallis P.J. and Stubbs B.M. Dehalogenation of organohalogen containing compounds // U.S. patent P10504 SOL.-1992, April.

21. Семина И.Г., C.B. Беляева Микробиологическая трансформация 1-хлоргидрина глицерина в соокислительных условиях

22. Микробиол. 1997- т.66, № 5,- с.43- 48.

23. Nakamura Т., Nagasava Т., Fujio Yu, Watanabe I.,Yamada H. Purification and characterization of two epoxide hydrolases from Corynebacterium sp. strain TV-1074 // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -p. 4630-4633.

24. Jacobs, M. H. J., A. J. Van den Wijngaard, M. Pentenga, and D. B. Janssen. Characterization of the epoxide hydrolase from an epichlorohydrin-degrading Pseudomonas sp. // Eur. J. Biochem. -1991.-v. 202.-p.1217-1222

25. Kasai, N. K. Process for preparation by (R) -(-)-3-halogeno-l,2-propanedioL by treatment with microorganisms //U.S. patent5246843.-1993, September.

26. Japanese patent application 88/265,838. 20 October 1988./ European patent application EP 365.029 25 April 1990,- / Nakajima, H., M. Onda, R. Tsurutani, and K. Motosugi. Optically active B-halolactic acid or glicidic acid.

27. Small F. J., Tilley J.K., Ensign S. A. Characterization of a new pathway for epichlorohydrin degradation by whole cells of Xanthobacter strain Py2 //Appl. and Environ. Microbiol.- 1995,- 61,№4,-P. 1507 -1513

28. Meyer, D. J., B. Coles, S. E. Pemble, K. S. Gilmore, G. M. Eraser, and B. Ketterer. Theta, a new class of glutathione transferases purified from rat and man.//Biochem. J- 1991.-v.274- p.409-414.

29. Kasai N., Suzuki Т., Furukawa Y. Chiral C3 epoxides and halohydrins: Theie preparation and synthetic application // J. Mol. Cat. B: Enzymatic.- 1998,- V- 4, № 5-6.- P. 237 252

30. Hartmans. S., J. P. Smits, M. J, van der Werf, F. Volkering, and J. A. M. de Bont. Metabolism of styrene oxide and 2-phenylethanol in the styrene-degrading Xanthobacter strain 124X // Appl. Environ. Microbiol-1989 v.55. - p. 2850-2855

31. Haan Ardre de, Smith Mark, Voorhorst Wilfried GB, de Bont Jan A M Cofactor regeneration in the production of 1,2-epoxypropane by Mycobacterium strain E3 :The role of storage material // J. Gen.-Microbiol -1993,- v.139, №12 p.3017-30224

32. Христофоров B.JI., Серебрянный B.A. Методы получения оптически активных промежуточных продуктов для синтеза простагландинов // Хим.-фарм. журн,- 1994.- №6.- С.36 59

33. Cimetiere B., Jacob L. and Julia M. Resolution of oxiranes. Application to the synthesis of the platellet aggregation factor // Tetrahedron Lett.-1986,- V. 27,- P. 6329.

34. Golding B.T. Synthesis and reactions of chiral C3-units // Chemistry and industry.- 1988.- № 3.- P. 615- 621

35. Koden M.,Kuratate F., Funada K., Awane K.,Sakaguchi K., Shiomi Y. and Kitamura K. Ferroelectric liquid crystals incorporating the optically active S-lactone ring // Jpn. J. Applied Physics.- 1989.- V. 29,- P. 981 983

36. Koden M.,Kuratate F., Funada K., Awane K.,Sakaguchi K., Shiomi Y. and Kitamura K. Ferroelectric liquid crystals incorporating the optically active 5-lactone ring // Jpn. J. Applied Physics.- 1989,- V. 29,- P. 981 983

37. Takano S., Yanase M., Takahashi M. and Ogasawara K. Enantiodivergent synthesis of both enantiomers of sulcatol and matsutake alcohol from (R)-epichlorohydrin // Chem. Lett.-1987.p. 2017-2020.

38. Kitamura, M., Ohkuma, T., Takaya, H., and Noyori, N. A practical asymmetric synthesis of carnitine. // Tetrahedr. Lett. -1988 .- v.29 -p.1555-1556

39. Shimizu S./Yfttori S., Hata H., Yamada H. A novel fungal ensyme, NADPH-dependent carbonyl reductase, showing high specificity to conjugated polyketones .'purification and characterization // Eur.

40. J. Biochem. -1988.- V. 174.-P.37-44

41. Kawamura K., Ohta T. and Otani G. An efficient synthesis of the optical isomers of nipradiol // Chem. Pharm. Bull.- 1990.- V. 38.- P. 2092 2096.

42. Mc Clure D.E., Engelholdt E.L., Mensler K., King S., Saari W.S., Huff J.R. and Baldwin J.J. Chiral Heteroaryloxymethyloxiranes // J. Org. Chem.- 1979,- V. 44,- P. 1826 1831

43. Takano S., Yanase M., Sekiguchi Y. and Ogasawara K. Practical synthesis of a-amino-(3-hydroxybutanoic acid (GABOB) from (R)-epichlorohydrin // Tetrahedron. Lett.- 1987,- V. 28,- P. 1783 1784

44. Weijers C.A.G.M., de Bont J.A.M. Epoxide hydrolases from yeasts and other sources: versatile tools in biocatalysis // J. Mol. Cat. B: Enzymatic.- 1999,- V.6, №3. p. 199 214

45. Kagegama, Y., Nihira, T., and Yamada, Y. Lipase-catalyzed synthesis of macrocyclic lactones in organic solvents.// Ann. N. Y. Acad. Sci.1990 v.613 p.681-685

46. Baldwin J.J. et al. Synthesis of (R)-and-(S)-epichlorohydrin // J. Org. Chem.- 1978,- V.43, №25,- P. 4876 4878.

47. Nakamura. Т., F. Yu, W. Mizunashi, and I. Watanabe. Production of (R)-3-chloro-l,2-propanediol from prochiral l,3-dichloro-2-propanol by Corynebacterium sp. strain N-1074. // Appl. Environ. Microbiol.-1993,-v. 59-p.227-230.

48. Kasai, N., K. Tsujimura, K. Unoura, and T. Suzuki. Preparation of (,S)-2,3-dichloro-l-propanol by Pseudomonas sp. and its use in the synthesis of (S)-epiclorohydrin. //J. Ind. Microbiol-1992.- v. 9 p.97-101

49. Nakamura. T., T. Nagasawa, F. Yu, I. Watanabe, and H. Yamada. A new catalytic function of halohydrin hydrogen-halide-lyase, synthesis of p-hydroxynitriles from epoxides and cyanide. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991-V.180 - p. 124 -130

50. Archelas A., Furstoss R. Epoxide hydrolases: new tools for the synthesis of fine organic chemicals // Trends in Biotechnology.-1998.- V. 16, №3. . p. 108 116.

51. Whitesides, G. M. and Wong, C.-H. Enzymes as catalysts in synthetic organic chemistry. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.- 1985- 24. -617-638

52. Yamada, H. and Shimizu, S. Microbial and enzymatic processes for the production of biologically and chemically useful compounds.// Angew. Chem. Int. Ed. Engl. -1988 v.27 -p. 622 - 642.

53. Best D.J., Floyd N.C., Magalhaes A., Burfield A. and Rhodes P.M. Initial enzymatic steps in the degradetion of a-pinene by Pseudomonas fluorescens NCIMB 11671. //Biocatalysis. 1987.- v. 1,- 147-159.

54. Warhurst A.M., Fewcon C.A. Microbial metabolism and biotransformation of styrene. // J. Appi. Bacteriol.- 1994.-v. 77.-p.597-606.

55. Hartmans S., Microbial degradetion of styrene. In: Biotransformations: Microbial degradetion of health risk compaunds (Singh., V.P. ed.)./ Amsterdam, Elsevier science B.V.- 1995. p.227-238.

56. Griffiths E.T., Harries P.C., Jeffcoat R., Trudgill P.W. Purifications and proptties of a-pinene oxide lyase from Nocardia sp. strain PI8.3.// J. Bacteriol. -1987 v. 169,- p. 4980-4983.

57. Weijers C. de Haan A., de Bont J. Chiral resolution of 2,3-epoxyalcanes by Xanthobacter Py 2 II Appl. Microbiol. Biotechnol.-1988.-V.27.-p. 337-340.

58. Shirai K., Hitsasuka K. Production of 8-phenetyl alcohol from styrene by Pseudomonas 305-STR-1-4 // Agric. Biol. Chem.- 1979.- v. 43,p.1399-1406.

59. Mischits M., Faber К., Willetts A. Isolation of highly enantioselective epoxide hydrolase from Rhodococcus sp. NCIMB 11216// Biotechnol. Lett.- 1995. 17, № 9. - p. 893 - 898.

60. De Bont, J. A. M., J. P. Van Dijken, and C. G. Van Ginkel. The metabolism of 1,2-propanediol by the propylene oxide utilizing bacterium Nocardia A60 // Biochim. Biophys. Acta .- 1982. v.714 .p. 465-470.

61. Nakamura T., Yu F., Watanabe I. and Yamada H. Purification and characterization of two epoxide hydrolases from Corynebacterium sp. strain N-1074 II Appl. and Environ. Microbiol.- 1994.- V. 60.- P. 4630-4633.

62. Barbirato F., Verdoes J.C., J.A. de Bont, M.J. Van der Werf The Rhodococcus erythropolis DCL 14 limonene-l,2-epoxide hydrolase //

63. Furuhashi Keizo, Takagi Motoyoshi. Process for the preparation of epoxides by means of microorganisms: Пат. 5376539 США, МКИ5 C12P 17, C12P 13/00 Заявл.02.10.92, Опубл. 27.12.94.

64. Little, M., and P. A. Williams. A bacterial halidohydrolase: its purification, some properties and its modification by specific aminoacid reagents. // Eur. J. Biochem 1971. - v.21 - p.99-109

65. Hubert, J. В., Jacques, P., Bare, G., Dewulf, O., and Thonart, P. Bioconversion of 1 carnitine precursors by yeast.// Medet. Fac. Landbowwet. Rijuksuniv. Gent-. 1989,-v. 54,-p. 1287-1300.

66. Weijers Botes AL, Van Dyk and A.M. de Bont Enatioselective hydrolysis of unbranched aliphatic 1,2-epoxides by Rhodotorula glutinis // Tetrahedron: Assym. 1998. - v.9. - P. 467-473.

67. Ясикова Л.И. очистка сточных вод от перхлорэтилена // Хим. пром. 1976. - №10. - с.745-746.

68. Киевский М. И., Евстратов В. Н., Семенов В. Д. Очистка сточных вод предприятий хлорной промышленности. M : Химия. - 1978. - 192с.

69. Но Б. И., Ущенко В.П., Рухаков Г.Г. и др. Очистка сточных вод и газовых выбросов от дихлорэтана // Хим. пром. 1977. - № 4. -с.314-317.

70. Шахов А. И., Душкин С. С., Магнитная обработка промстоков хлорорганического производства / Известия ВУЗов. Химия и хим. технол. 1972,- т. 15, № 2. - с.273 - 275.

71. Карасевич Ю. Н. Основы селекции микроорганизмов,утилизирующих синтетические органические соединения— М.: Наука, 1982— 142 с

72. Могилевич Н.Ф. Микробная деструкция галогенсодержащих органических соединений // Хим. и технол. воды. 1982. - т.4, № 3.-с.264 -273.

73. Wilson В.H. Biorestoration of aquifers contaminated with organic compounds. // Crit. Rev. Environ. Control .-1988. -v. 18- p.29-89.

74. Vogel, T. M., C. S. Criddle, and P. L. McCarty. Transformations of halogenated aliphatic compounds. // Environ. Sci. Technol.- 1987.- v. 21-p.722 736.

75. Попов В.О., Безбородов A.M. Опыт создания промышленной технологии микробиологической очистки газо-воздушных выбросов. // Прикл. биох. и микробиол. 1999.- т.35, № 5,- с.570-577.

76. Goldstein, R. M., L. M. Mallory, and M. Alexander. Reasons forpossible failure of inoculation to enhance biodégradation. // Appl. Environ. Microbiol. -1985.-v.50-p.977-983

77. Печуркин H.C. Популяционная микробиология,- Новосибирск. -1978 г.- с. 36-37.

78. Neidleman, S. L., and J. Geigert. Biohalogenation: principles, basicroles and applications- Ellis Horwood Ltd., Chichester, United Kingdom.- 1986.-p. 156-171.

79. Janssen, D. В., R. Oldenhuis, and A. J. van den Wijngaard. Hydrolytic and oxidative degradation of chlorinated aliphatic compounds by aerobic microorganisms. // Adv. Appl. Biotechnol. Ser. Biotechnol. Biodegrad. -1990 -v.4- p. 105-125.

80. Ramachandra M., D.L.Grawford, G.Hertel Caracterization of an extracellular lignin peroxidase of the lignocellulolitic actinomycete Streptomyces viridosporus // Appl. Envirn. Microbiol.-1988.- v.54 .-p.3057-3063.

81. Hardman. D. J., and J. H. Slater. The dehalogenase complement of a soil pseudomonad grown in closed and open cultures on haloalkanoic acids.//J. Gen. Microbiol. 1981. - v. 127- p.399 - 405.

82. Galli R. Biodégradation of dichloromethane in waste water using a fluidized bed bioreaktor.// Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1987.v. 27, N2.-p.206-213.

83. Zaidi, B. R., Y. Murakami, and M. Alexander. Factors limiting success of inoculation to enhance biodégradation of low concentrations of organic chemicals. // Environ. Sci. Technol. -1988. -v.22- p.1419-1425.

84. И. А. Кривец, Т. Ю. Григорьева, А. Г. Севрук, С. С. Ставская. Получение активной биомассы Pseudomonas rathonii Т -деструктора анионных поверхностно-активных веществ // Химия и технол. воды. -1990- т. 12.- с.78 80.

85. Portier R. Bioreaktor to treat volatieles in ground water //

86. Bioprocess. Technol.-1990.- 12 N 4,- p 491-503.

87. Доронина H.B., В.А. Ежов, Ю.А. Троценко Аэробная биодеградация формальдегида, метанола и метиламина иммобилизированными клетками Methilobacterium extroguens II Прикл. биохим. и микробиол,- 1997.-т.ЗЗ N2.-с.162-165.

88. G.A.Hill, M.E.Tomusiak, B.Qual, К.М. van Cleave Bioreaktor design effects on biodégradation capabilities of VOCs in waste water // Environ.Progr.-l991 .-v. 10 N2.-p. 147-153.

89. Nelson, M. J. К., P. H. Pritchard, and A. W. Bourquin. Preliminary development of a bench-scale treatment system for aerobic degradation of trichloroethylene./ In G. S. Omenn. Environmental biotechnology.-Plenum Press, New York.- 1988,- p. 203-209.

90. Экологическая роль микробных метаболитов /под ред. Д. Г. Звягинцева М: изд-BoMfY, 1986.-е. 166-178.

91. Коваленко Г.А., Кузнецова Е.В., Ленская В.А. Углеродминеральные носители для адсорбционной иммобилизации нерастущих бактериальных клеток // Хим. и технол. воды,- 1996,-т. 18, N 2,-с. 193 195.

92. Никовская Г.Н. Адгезионная иммобилизация микроорганизмов в очистке воды //Химия и технология воды. 1989.- т. 11, №2, с.158-169

93. Боброва М.В., Л.И. Глоба Влияние природы на эффективность очистки // Химия и техн. воды,- 1995.- т. 17, N 4,- с.438 443

94. Истомина Л.П., И.В. Науменко, В.Г. Перевозный Применение плоскостной насадки для кнтесификации биологической очистки сточных вод // Химия и технол. воды 1990. т. 12 , №3. - с.272-275.

95. Гвоздяк П. И., Т. П. Чеховская, В. У. Никоненко, В. И. Рыбникова, M. Н. Закиева, К. С. Адамова .Биологическая очистка от фенола попутных вод газоконденсатных скважин Дмитровского месторождения // Химия и технол. воды 1990.-Т. 12.-С.43-48.

96. Гвоздяк П. И., Чеховская Т. П., Никоненко В. У. Микробное разрушение анилина // Химия и технол. воды.— 1985— т.7,2,—С. 84—87

97. Гвоздяк П. И., Дмитренко Г. Н., Куликов Н. И Очистка промышленных сточных вод прикрепленными микроорганизмами // Химия и технол. воды.— 1985—т. 7, № 1.—С. 64—68.

98. Волченко C.B., И.Н. Сингирцев, А.Ю. Федоров В.Н. Перспективы применения синтетического "Нитрон" как носителя при микробной очистке сточных вод // Химия и технол. воды.- 1996,- т. 18, № 2.1. С.216-220.

99. Friday D.D., R.J. Portier. Development of an immobilized microb bioreaktor for VOC applications // Environm. Progn.-1991.- V.10, №1.- p. 30-39.

100. Гвоздяк П.И., Н.Ф. Мочалевич, H.H. Куликов и др. Очистка фенилсодержащих сточных вод закрепленными микроорганизмами // Химия и технол. воды 1989.- т. 11, № 1,- с. 73 - 75.

101. Ставская С.С., Шамолина H.H., Никовская Г.Н. и др. Иммобилизация бактерий деструкторов на искусственных волокнах для очистки сточных вод от анионных ПАВ // Химия и технол. воды - 1991,- т. 13, № 6.- с. 548-554.

102. Корчак Г.И., М.М. Земляк, JI.B. Григорьева и др. Очистка и доочистка бытовых сточных вод иммобилизированными микроорганизмами // Хим. и техн. воды.-1996,- т. 18 , №2.- с. 187-192.

103. Контроль качества воды.- М.: Стройиздат.-1986.- 159 с.

104. Роговская И.И. Биохимический метод очистки производственных сточных вод // М.: Стройиздат.-1967.- 138 с.

105. Маслов А.П., А.З. Асадуллин, И.Г. Пеньковцева и др.// Химия и технол. воды 1987.- т. 9, № 3.- с. 263-265.

106. Усов Г.П., Тряхова Т.И , Г.Н. Светлакова, Л.И. Розанова Биотестирование промышленных сточных вод производства резины // Химия и техн. воды, 1987 т.9, №3 - с. 182-184

107. Вредные вещества в промышленности т. 1, 2. Органические вещества. -ЛенинградгХимия.- 1976.- 1 т.- 591 с, 2 т. 623 с.

108. Агрономов А.Е., Шабаров Ю.С. Лабораторные работы в органическом практикуме. Изд. 2-е. -М.: Химия 1974,- с.138-140.

109. Методы элементоорганической химии. Хлоралифатические соединения.- М.: Наука.- 1973.- т.2 462 с.

110. Методы получения химических реактивов и препаратов. М.: НИИТЭХИМ. -1970, №. 21.-C.36-37 .

111. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир - 1997. -Т1 -430 с.,Т2 - 800

112. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардта М.: Мир. - 1984,- Т.1 - с. 54-57, Т.З - с. 263.

113. Практикум по микробиологии. / под ред. Н.С. Егорова. М.:

114. Изд-во МГУ. 1976. - 306 с.

115. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука. - 1989. - с. 287.

116. Нестеренко О.А., Ногина Т.М, Квасников Е.Н. Хемотаксонометрические признаки некоторых коринеподобных бактерий и групп "Rhodochrous" // Микробиол. 1978. - т. 47, № 6 - с.1055-1062.

117. Нестеренко О.А., Квасников Е.Н., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев: Наука думка. 1980.-217 с.

118. И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, JI.B. Зверева, JI.B. Рыбалка, Е.А. Еловикова Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем. // Микробиология. 1995. -т.64, № 4. - с. 507-513.

119. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука - 1984. - 200 с.

120. Смирнова В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев: Наукова думка. 1990. - 263 с.

121. Lechevalier М.Р. Identification of aerobic actinomycetes of clinical importace // J. Lab. Clin. Med. 1968. - v/74. - p.934-944.

122. Becker B.M.P., Lechevalier R.N/, Gordon H.A., Lechevalier M.P. Rapid differentation betven Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolisates // Appl. Microbiol. -1964. -v.12,5. -p.421-423.

123. Практикум по биохимии / под ред. C.E. Северина, Г.А. Соловьева. М.: изд-во МГУ. - 1989. - с.93-96.

124. Скоупс Р. Методы очистки белков. М : Мир. - 1985. - с.358.

125. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии-М:Высш. школа. 1980. - с. 271.

126. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem 1976. - v.12. - p.248-254

127. Bergman J. G., Sanik J. Determination of frace amount of chlorine in naptha // Anal.Chem.-1957. v.29. - p.241-243

128. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардта М.: Мир, - 1984,- Т.2-с. 24-25.

129. Mori К. Synthesis of optically active pheromones // Tetrahedron. -1989.- V. 45, № 11,- P. 3233 3298.

130. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод.-М: Химия -1984. 447 с.

131. Методика определения глицерина в сточной воде производства эпоксидиановых смол / Сб. метод, определения орган, соединений,- М : ГосНИИхлорпроект,- 1974,- 26-28 с.123

132. Регламент производства эпоксидиановых смол.-М: ГОСНИИхлорпроект. 1972. - 157 с.

133. Крайнюкова А.И. Обзор копмлексных оценок токсичности сточных вод методом биотестирования // Комплексная оценка качества поверхностных вод.- М:Гидрометеоиздат.-1984. с.61-65

134. Воробьева Л.И. ГТропионовокислые бактерии.- М.:Изд-во МГУ,- 1995.-286 с.

135. Straus U.T., Felfer U., Faber K. Biocatalytic transformation of racematic into chiral building blocks in 100 % chemical yield and 100 % enantiomeric excess // Tetrahedron Assym. 1999.- v. 10. - 107-117.

136. Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека Лаборатория микробиологии1. ПРОТОКОЛ №2исследования патогенности культуры микроорганизма

137. Наименование культуры микроорганизма Nocardioides simplex 50-5

138. В результате выполненных исследований установлено, что исследуемая культура Nocardioides simplex 50-5 авирулентна для млекопитающих, не проявляет инфекционность, инвазивность, токсигенность.л \