Ras-dva - новое семейство малых ГТФаз. Роль малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии шпорцевой лягушки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Терёшина, Мария Борисовна

• Терёшина, Мария Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Терёшина, Мария Борисовна

Введение

1. Обзор литературных данных 8 1.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной 8 эктодермы. h 1 í 1. Дифференцировка нервной пластинки.

1.1.2. Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы.

1.1.3 Дифференцировка области нервного гребня. 14 1.2. Гомеодоменный транскрипционный фактор Anf - регулятор 16 раннего развития переднего мозга позвоночных

1.3 Генетические мишени гомеодоменного транскрипционного 18 фактора Xanfl.

1.4 ГТФ-связывающие белки

1.5 Суперсемейство малых ГТФаз

1.5.1 Основные характеристики и свойства малых ГТФаз.

1.5.1.1 Цикл активации/инактивации малых ГТФаз

1.5.1.2 Строение и функция каталитического G-домена

1.5.1.2.1 Связывание ГТФ

1.5.1.2.2 Гидролиз ГТФ и вспомогательные GAP белки

1.5.1.3 Внутриклеточная локализация малых ГТФаз

1.5.2 Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе.

1.5.2.1 Ras семейство малых ГТФаз

1.5.2.2 Rho семейство малых ГТФаз

1.5.2.3 Rab семейство малых ГТФаз

1.5.2.4 Arf7 Sari семейство малых ГТФаз

1.5.2.5 Ran семейство малых ГТФаз

1.5.2.6 RGK семейство малых ГТФаз.

1.5.2.7 RJL семейство малых ГТФаз.

1.5.2.8 Gie семейство малых ГТФаз.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ras-dva - новое семейство малых ГТФаз. Роль малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии шпорцевой лягушки»

Изучение механизмов реализации информации, заложенной в геноме, в процессе онтогенеза является одной из фундаментальных проблем биологии. Важной задачей молекулярной биологии развития является поиск и исследование молекулярно-генетических механизмов и сигнальных каскадов, необходимых для нормального развития и регионализации головного отдела зародышей позвоночных животных. Особый интерес в этой области представляют исследования механизмов развития: головного мозга,-в частности, его переднего отдела, отвечающего за высшие формы нервной деятельности.

Известно, что важную роль в регионализации и клеточной дифференцировке в ходе развития головного мозга, играют гомеодоменные транскрипционные факторы и их геномные мишени [Ermakova et al., 1999; Boyl et al., 2001; Kiecker and Lumsden, 2005]. Так, одним из ключевых звеньев молекулярных механизмов, обеспечивающих развитие переднего мозга, у позвоночных является-гомеодоменный белок Anf. Ген Anf специфически экспрессируется на ранних, стадиях развития зародышей позвоночных в зачатке переднего мозга; из которого в ходе развития формируются большие полушария мозга (т.н. конечный; мозг); а также промежуточный отдел головного мозга, включая глаза [Zaraisky,1992, Kazanskaya et al., 1997]. В результате поиска геномных мишеней Anf "на: модели : эмбрионов Xenopus laevis был идентифицирован ген, кодирующий ранее неизвестную Ras-подобную малую ГТФазу. Было установлено,, что в раннем эмбриогенезе найденный ген экспрессируется вдоль границы, отделяющей-зачаток: переднего мозга, расположенный! в передней части спинной стороны, зародыша, от брюшной его части [Novoselov et al., 2003]. На основании подобной, пограничной, локализации экспрессии данного гена, а также принадлежности, кодируемой им малой ГТФазы к суперсемейству Ras ГТФаз,. он получил название - Ras-dva (последнее сокращенно - dorsal-ventral-anterior: спина-брюхо-перед).

Малые ГТФазы представляют собой суперсемейство регуляторных ГТФ-гидролаз, в котором выделяют 8 семейств: Ras, Rab, RJL, Ran, RGK, Rho/Rac/Cdc42, Arf/Sar и Gie. Белки этих семейств принимают участие в таких разнородных клеточных процессах, как трансдукция сигналов: и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), везикулярный (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматический транспорт (Ran) [Hall, 2000; Finlin et al., 2000; Takai et al, 2001; Nepomuceno-Silva et al., 2004; Okai et al., 2004].

Учитывая специфичную экспрессию Ras-dva вдоль границы зачатка переднего мозга, логично предположить, что малая ГТФаза Ras-dva может играть важную роль в сигнальных механизмах, регулирующих развитие мозга и прилежащих головных структур. В связи с этим, поиск гомологов Ras-dva и дальнейшее изучение их биологических функций представляется перспективным подходом для понимания механизмов раннего эмбрионального развития переднего мозга.

Кроме того, сравнительно низкая степень гомологии Ras-dva с представителями восьми других известных семейств малых ГТФаз делает изучение ГТФазы Ras-dva и ее гомологов важным как с классификационно-структурной точки зрения, так и с точки зрения выявления возможных новых типов внутриклеточных сигнальных каскадов

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Терёшина, Мария Борисовна

1.6 Заключение

Обзор литературных данных о разных семействах малых ГТФаз показывает, что белки каждого семейства, наряду с общими характеристиками, .имеют особенности в первичных аминокислотных последовательностях, в частности, в строении G1-G5 консенсусов, сайтов пост-трансляционных липидных модификаций, эффектор-связывающих доменов и специфических консервативных доменов. В результате этого, степень гомологии между белками разных семейств составляет менее 35%, а между белками> одного семейства - более 50%. При этом белки разных семейств выполняют различные важные функции в клетке: трансдукция сигналов и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), регуляция везикулярного (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматического транспорта (Ran). А, следовательно, малые ГТФазы играют важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности как клетки, так и многоклеточного^ организма. Многие малые ГТФазы вовлечены в процессы формирования и развития многоклеточных организмов на самых ранних этапах эмбриогенеза. В частности, была доказана важная роль малых ГТФаз в таких процессах, как созревание ооцитов, гаструляция, нейральная индукция, регионализация зародышевых тканей и их последующая дифференцировка. В тоже время, роль многих малых ГТФаз в развитии остается не изученной. Кроме того, остается актуальной задача поиска.и изучения функций новых членов этого суперсемейства белков - важных регуляторов эмбриогенеза.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Систематическое положение новой малой ГТФазы Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз.

2.1.1 Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей.

Известно, что более 200 малых ГТФаз, описанных на данный момент, формируют 8 семейств (Ras, Rab, Rho/Rac/Cdc42,Ran, RGK, RJL, Gie и Arf/Sar) внутри общего суперсемейства малых ГТФаз. Так как степень гомологии нового белка шпорцевой лягушки, малой ГТФазы Ras-dva, с белками известных семейств не превышает 35%, то поиск гомологов малой ГТФазы Ras-dva у разных живых организмов и их сравнение с другими малыми ГТФазами представляет интерес, как с классификационной точки зрения, так и с целью выявления их структурных особенностей.

С помощью пакета программ BLAST был проведен поиск гомологов, нового белка XIRas-dva (GenBank Accession Number: AF513854) у прокариот и эукариот (грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных) в разных базах данных: NCBI Genbank (http://ncbi.nlm.nih.gov), Saccharomyces http://www.yeastgenome.org/, The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/), Xenbase (http://www.xenbase.org), JGI (http://genome.jgi-psf.org), University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser Database (http://genome.ucsc.edu), Strongylocentrotus purpuratus sea urchin (морской ёж) genome project (http://sugp.caltech.edu), степень гомологии которых составляла 50% и более. В итоге было обнаружено и зарегистрировано 15 гомологов XIRas-dva у различных позвоночных огранизмов: 1 гомолог у бесчелюстной рыбы миноги (Petromyzon marinus, EU379655), 9 гомологов у костистых рыб: 2 - у D anio rerio (DQ278181, AY729884), 3 - у Takifugu rubipes

DQ278182, DQ278183, DQ278184) и по одному у Gasterosteus aculeatus (DQ278185), Oncorhynchus mykkis (ABB84863) и Ozyrias latipes (DQ278187), Tetraodon nigroviridis (CAG02679), 3 - у лягушек X. tropicalis (AY729885, DQ278180) и X. laevis (ABM63371), 1 гомолог у ящерицы Anolis carolinensis (EU380237) и 1 гомолог у курицы Galliis gallas (AY729886). Кроме того, среди программно-предсказанных кДНК был обнаружен гомолог Ras-dva у опоссума (класс. Млекопитающие, отр.Сумчатые) Monodelphis domestica (XP001377674). У прокариот и растений гомологов малой ГТФазы Ras-dva не было выявлено. Кроме того, недавно при анализе генома морского ежа Stongylocentrotus purpuratus Beane W.S. и коллеги нашли ген, кодирующий малую ГТФазу наиболее гомологичную белкам Ras-dva [Beane et al., 2006]. Однако, степень гомологии упоминаемого в статье белка с перечисленными выше составляет менее 45%, что может говорить о его принадлежности к какой-то отдельной группе малых ГТФаз, близкой к белкам Ras-dva. В связи с этим, вопрос о представленности малых ГТФаз Ras-dva у беспозвоночных животных остается открытым.

Проведенный анализ позволяет сделать следующие предварительные выводы.

- Вероятно, малые ГТФазы Ras-dva впервые появились в эволюции только у позвоночных организмов. В связи с этим важно отметить, что ген, кодирующий гомеодоменный белкок Anf, чьей мишенью является ген Ras-dva у шпорцевой лягушки X. laevis, также впервые появляется лишь у позвоночных животных, где он выполняет функцию регулятора развития переднего мозга. Можно предположить, что именно появление новых генов, очевидно возникших путем дупликаций и последующей быстрой дивергенции каких-то генов-предшественников, создало предпосылки для возникновения у позвоночных таких новых анатомических структур как передний мозг, нервный гребень и единая область зачатков органов чувств (пан-плакодная зона).

- Обнаружение гена Ras-dva у опоссума, сумчатого млекопитающего, позволяет предположить, что и у высших млекопитающих могут присутствовать гомологи Ras-dva. Возможно, найти ген малой ГТФазы Ras-dva, кодирующая рамка которого составляет всего лишь около 650 пар оснований (п.о.) и не содержит интронов, у высших млекопитающих организмов пока не удается из-за недостаточной полноты геномных баз данных.

С целью выявления функциональных участков, характерных для группы обнаруженных малых ГТФаз К.аэ-с1уа, нами было проведено множественное выравнивание их аминокислотных последовательностей (Рис.9).

На множественном выравнивании видно, что белки Яаэ-ёуа имеют консервативные участки в районах консенсусов С1-С5, входящих в состав каталитического в-домена ГТФаз (Рис.9, С1-С5 выделены красным). У малых ГТФаз 11аз-сЬ/а они имеют следующие консенсусные последовательности (Табл.3). Таблица 3. Консенсусные поледовательности С1-С5 участков белков Лаз-буа.

G1 G2 (switchl) G3(switch2) G4 G5

GAAGVGKT HRRTVEE YXDTSGS VGNKXD FXEXSAK

Кроме того, у всех Ras-dva белков было выявлено наличие С-концевого сайта пренилирования -СХАХ, где С- а.о. цистеина (Cys), -SH группа которого подвергается пренилированию, А - алифатический а.о., а X - любой а.о. (Рис.9, выделен желтым). Известно, что такие сайты пренилирования могут обусловливать связывание белков с мембранными структурами клетки [Pechlivanis and Kuhlmann,2006].

Рис.9 Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков Яаз-й\а (в программе СШБТАЬ (1.83)) в! 02 (switchl)

ТгИаз-С^аЗ МЭЬЕ - УКЕКТНУЯЬУП^еаАбУбкфЬ! 0ЕРЬ0РКРЕАКрШКТУЕЕ|МНЗКЕ УР1С - - СУК 57

GaRas-dva МЗЬЕ-УКЕКТ0УНЬУРЬСААСУСКТАЬ^РЬ0ОТГЕРКНККТУЕЕШЗКЕУВ1О--СУК 57

Оп&ав^уаЗ МЗЬУ-УКЕКТЕУНЬУРЬСААСУСКТАЫЗИГЬ0ВТГЕРКНГ®.ТУЕЕШЗКЕРШС--ИАК 57 МЗЬЕ-УКЕКТЕтаЬУГМСААСУСКТАЬ1КНЕЕ0РЗРЕРЮтКТУЕЕШЗКЕУЕУА--СУК 57

ТгЕав-^а1 МЗРК-УКЕКТЕтаЬУРЬС2^АОТСКТАЫОКРЬКСТРЕРКНКаТУЕЕ1лНМСЕУУУа--СУК 57

TnRas-dva МЗРК-УКЕКХЕУЕЬУРЬСААСУСКТАЫОНГЬКОТРЕРЮЮаТУЕЕЬНЯКЕУУУС--СУК 57

НЫ1ав-ауа НЗМЕ-УКЕЯТЕУНЬУРЕСААСУСКТА110НРЬКВТРЕРКШЖТУЕЕШНКЕУЕУС--СМК 57

01лаа-с^а М31А-УКЕКТВУЕЬУРЬСАССУСКТАЫНКРЬ0ВТГОРКНККТУЕЕ1НШСЕУЕУС--ОУК 57

АсИаз-^а МЗЬА-УКЕКЗОУКЬУРЬОААСУСКТАЫОНРЬОВТРЕРКНКНТУЕЕЬНЗКЕУОУЗ--САТ 57

G9Ras-dva МЗЬУ-СКЕКЗНУНЬУРЕСААСУаКТАЫЯИРЬЬОТРЕРКЮШ.ТУЕЕШЗКЕУЕУЗ- -йАТ 57

Х^ав-^Уа2 МБЕБ-ТКЕКК01РЬУРЬСААСУОКТЭЬ 11тГЕ0ОТтРК1ПШ.ТУЕЕЬНЗТЕУЕАТС-йТО 58

Хйиав-ауаг МЗЬЗ-ТКЕКНОШЬУРЬСААСУСКТЗЬХЗНРЬЬПТРВРКНШШ/ЕЕШЗТЕУЕАТС-СТО 58

ПгИав^а1 МЗЬЬ-У0ЕНКТУНРУРЬСААСУСКТАЫТНЕЬаОНГПЗКУТаТУЕЕи1АЬЕУПТЕС--ЛН 57

TrRas-dva2 МЗРР-ЛКТН-ТтаЬУРЬСААСУСКЗАЫННРЬИВЗРЕНКУТКТУБЕШУЬЕУАУТСЗССК 58

Х^аз^Уа ИЭ---У335ВТУРЬУРРСААСУСКТАЬ10НЕ12ГОЗРЕЕРУ1тТУЕЕМНСЕМРЕРС--ЕЕ0 55

ХЬНаз-йУа МЗЬЗ-УЗРЗПТУКЬУРРСЛАСУСКТАЫ0РР1ЛВНРППКУККГУЕЕМУСЬНРЕРС--АЕ0 57

ГЙНаз^Уа МАЕОРАКРКЗСУКЬУРРСААСУСКТЛЫ0РР1АПТРЕА0НКНТУЕЕЬУСЬЕУЕЬП- -ТОО 58

TrRas Саиав Отдав Е^ав ТгКав Тгтаз НЬиаз 01Иаз АсИав Сдйаз Х1иав ХСИаБ РгКав ТгИав Х1наэ XtRas ШЯав

ТгИаз GaRas ОтНав РгНав ТгИаз ТпИаз Н1Шаз 01Еав АоНав йдНав XlRas XtRas ИгНаа TrRas XlRas XtRas МйЛав

-dvaЗ ^уа dvaЗ уа1

Зуа уа

-йуа

-йуа йуа уа2

-йуа2 уа2 -dva

-dva dvaЗ

-йуа

-ёуаЗ

-dval ^уа ^уа -ёуа уа2

-dva2 уа1

-dva2 уа

-ауа1

-dva

1ТУЕ|и.РТЗСЗ|У5РРАМ1гКЬЗ ИЭМЗОЛРАЬУУАУЦОРЕЗЬЕУУКЗЬМЖIЬЕ1КЕБКРТР 117 1ТУЕ11Л)ТЗСЗУЗГРАЖКЪ510НЗРАРАЬУУАУБПРЕЗЬЕАУКТЬНШ1ЬЕ1КЕВКМТР 117 VTIHXMDTSGSYSFPAMRKLCIQNSDЛFALVYAINDPDSLEAVKSLRDEILAVKEDKFTP 117 УТ1Ы1МПТЗСЗУЗРРА1^1ЖЬ310КСОАРАЕУУЗУОЕРЕЗЬЕУУ13Г!Ъ1«гЕ1ЪЕУКЕОКРТР 117 УТ151№ТЗСЗУЗРРЛМЕКЬ510113РЛРЛЬУУАУЕРР03ЬЕЛУКЗЕНЕЕ1ЕЕУКЕПКРТР 117 VT1SIMDTSGSУSFPAMRKLSIQNSDAFALVYAVDDPQSЬEЛVKSLREEILEVKEDKFTP 117 УТ1ШМОТЗСЗУЗРРАМНКЬ310НЗВАРАЬУУАТООРЕЗЕУАУК31ЛУ)Е11,ЕУКЕПК:РТР 117 VTINIIDTSGSYSFPAMRKLSI^TGDAFALVYSVDDPDSLETVKRLRDEI 1ЕЬКЕВКНАР 117 IKУEILDTSGSYSFPAMRKЪSIQNSDAFALVYAVDDAESFECVKSLHEEILELKEDKFPP 117 УТЬЕХШТЗСЗУЗРРАтКЬЗХОЫЗОАРАЬУУЛУВПАЕЗРЕЗХКЗЬЕЕЕХЬЕУКЕПКРРР 117 VRIEILDTSGSYEFPAMRKIlNMKSGDAFALVYTHDDPDSFEMVKHLREEILEAKGDKSPP 118 VRVEI^ШTSGSYEFPAMRKLNMKSGDЛFALVYTMDDPDSFEMVИ^LREEILEЛKGDKSPP 118 УН1Е1ЬРТ363УРРРАМНАЬС1НТСПАРАЬУУЛАВЕРВЗЬЕЕУ0КЬНЕЕ1ЬЕЬКСЕЗРТС 117 УКЬЕ1ЫЭТЗСЗУЗЕРАМРЕЬС1Ш15РЛРЛЬУУАУРВРСЗЬАЕУ0НЬНГ)Е11|0ЬРССКСАР 118 LRIQILDTSGSYSFPAMRKLSI^QGDAFALVFSLSEPDSFQEVERLRSEI ЮУКСРАЕУР 115 ЬК1011£>ТЗС8УЗРРАМККЕ3100СВАРАЬУРЗЬЗЕРПЗР0ЕУЕК1ЛЗЕ11С>УКСПАЕУР 117 таЬЕ ХМОТБСБ УЭ РРАМККЬСI КНСОАРЛЬУУЗЬОЕРЕЗРОЕУГЖЕРЛЬаЬЕТКСЕЛРЗР 118

• ******

04 й5

--1УУ|УС:ЖТР[КЕО-ЕР0--УЗЗЕРУЬ5ТУЕЕРУгеЫЗ[У1ЕАБАК|Е11АМУУЕУРКЕЬЬ00У 172

-- IVWGNKTDREK-ERR- -УЗтеРУЬЗТУЕМЕНтЗТП/ЕАЗАКООТНУУЕУГКЕЬЬООА 172

--1УУУС1ЖТОННС-ЕНТ--УЗЗЕОУЬЗТУЕизНШЗГЬЕТЗАКЕ1ЛШУЬЕУГКЕЬЬ00А 172

- - ХУУУСШгаЖЫ -Еиг--УЗАРРУЬАКУЕХРЯЖСГМЕАЗАКЕ[)ЕМтаЕУЕКЕЫ00А 172 --цлшзтоижоз-^о- -ЬЗЗЕБУЪЗТУЕЬЕШНЗРМЕЗЗАК01Ш1УУЕЗРНЕЬЬЗОА 172 --1УУ1СНК10КОЗ-ЕЯО--ЕЕЗКВУЬЗТУЕЬЕ'ЛгаЗЕМЕ$ЗАКР111НУУЕЗЕКЕЬЬЗОА 172 --1УУ1СИКЮНдС-ВН0--УРЗга)УЬЗТУЕЬР'ЛШЗРЫ:ЗЗАКРИЮТЬЕАЕКЕЬЬЬ0А 172 --IWIGNKIDRHN-ERL--VSSRDVLAMVELDWDHIEVESSAKD1Ш1VLEAFMELL^QT 172

- -1VWGNKAEVGG-LRQ- -УЪРЕРАЬЗЬУЕЬР'лИЗНЕЬЕАЗАКЕ^ЕИУУЕУЕНЕЬЬООА 172

- - 1УУУСМКАЕЗСС-ЕЯ0- -УРАЕБА1,31|УЕ1ЛЭШЗНГУЕТЗАКИ1Е11УЬЕУЕНЕ1,ЬС0А 172

- - 1УУУашаш1/зо-Р1 к--узнееаьзтуеьето;гнн1ХЕтзак011Ъ11Утеуетеуенеу 173

--1УУУАИККЛ1/дС-1чМК- -УРНЕЕАЬЗТУЕЬЕНЫНЯЫ^ЕТЗАКЕПЪНУТЕУЕТЕУЬКЕУ 173

- - 1ТУ1ЕША0ЬСЗ-НЗК--дАТАЕАМРАУЕЕОКСАСГУЕТБАКТСРНУТАУГКРЬЬООМ 172 --МУУУСЗКАРЬЗЕ-ЕЕСКУЬРААВУМАТУЕООНРАЕЕУЕАЗАКТССМАУОУЕКАЬЬОНУ 175 --1УУУС№МОЗЕРСУЕАС0МУВЕЕАААТАЕЬЕШЗССУУЕТЗАКУРУКУ110УЕ0ЕЫККУ 173

- -1УУУОНОМОЬРРаЬЕАСООУРЬНАААТАЕЬЕИВССТУЕТЗАКУОУКТООУЕН0Ъ1ККУ 175 РР1УУУ&ЗКЗБЬАР---5СЗЕРН-АУ1ААУЕЬЕКСС1УЬЕАЗАКЯСЕ11УЬЗЬГ0ЕЬЬ0ЬУ 174

ТгЕаа GaRas Опдаав DrRas TrRas ТпНав НЬИав 01Нав АсНав СдНаэ Х1нав XtRas DrRaв ТгНав ХШав ХЬНав Гй^ав

•йуаЗ ^уа •йуаз ауа2 dva ^уа ^уа •йуа ■ёуа

-дуа2 с1уа2 ^уа ■с!уа1 ■с!уа сайт прекщшрования

НЬРЗНЬЗРАЬНННКЕТРРЮт^Р.-- - РМИКТИЭ^УЕЗ!.208

ИЬРЗКЬЗРА1^ии1НЕТРРКПЫШ1Р---------РМПК11НЗС1ЕЗ--------208

1Л.РЗЮ^ЗРА1Лиш*ЕТРР01ХЗНЮ1Р. .РМИКВНЗСЫЗЬСЕСАСаУ 216

NLPSRLSPALRRRRETFPKDLSLRP.-РМНКТНЗСЗУЗ---.208

ИЪРЗИ.ЗРА1ЛЗи«Ш- -ТУЕСЗООР.РЬНКЫНБСЗУЗ--------206

1ТЬРЗИ1ЛРАЬСКЯКЕ- -РАЕЗБННР---------БЬИКТИБСЗУЗ--------206

ИЬРЗИЬиРАЬСННКЕТРРКЕЗМЮП1.- -РМЫКТЫЗСПЗ-- -.208

Ш,Р301ЛРАЬСКККЕТЬРЕКСЗКНР---------РММКТИЗСЫЗ--------208

1ILPSRLSPALRRRRETLPKEPPLRP---------РМИКАИБСТУС--------208

НЬРИгЬЗРАХ^НРЕТРРЗЕНМЛР---------РМНКТИгСЗУС--------208

NLPSRLSPALRRRRETIPNGVKYKP---------РМ1ЖТНБС31С

NLPSRLSPALRRRRETIPKGGSFKP---------РМИКТИБСЗК!

KLPSRVSPALRRRTQTMSRELTEKRE------КРРМККННЗСХЬЗ

KSTERLSPAVWRRRGRQCTTSVTKR--------РРЬККИЗЗСХЕЗ

N3 PAWLSPALERRR---АЭАОРЕ------ЗИНКАОИЕКРОЗСТЕЗ

НЭ РАНЬЗРАЬЕНЕК- --АБАОРЕ------А1т300ЯНКР03СТ1,3

НЬРЗКЬЗРАЗЖККЕОТГРбСРРОЕАУбТУБТККАСТШаШЗСАУЗ

209 20Э 211 212 209 211 219

2.1.2 Филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз с новыми белками, Ras-dva.

С целью проверки нашего предположения об обособленности группы ГТФаз Ras-dva и определения их систематического положения в суперсемействе малых ГТФаз было построено филогенетическое древо этого суперсемейства.

Известно, что малые ГТФазы имеющие степень гомологии между собой более 50% относят к одному семейству, но при степени их гомологии менее 40% -к разным семействам [Macaluso et al., 2002]. Кроме того, для отнесения малой ГТФазы к тому или иному семейству достаточно информации заложенной* в аминокислотной последовательности ее каталитического G-домена- [Jiang, Ramachandran, 2006]. Исходя из этого, для построения филогенетического древа в базе данных National Center for Biotechnology Information (NGBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) были найдены аминокислотные последовательноти G-доменов малых ГТФаз представителей 8-ми уже описанных семейств (Ras, Rho, Rab, Ran, Arf, RJL, RGK и Gie). Далее при помощи программы Clustal W1.83 было проведено множественное выравнивание последовательностей G-доменов. малых I

ГТФаз уже известных семейств и найденных нами белков Ras-dva. На основании, данных этого множественного выравнивания в программе Mega 2.0 (http://megasofitware.net) по алгоритму «ближайшего соседа» (neighbour-joining algorithm with p-distance model) было построено неукорененное филогенетическое древо суперсемейства малых ГТФаз, которое показало, что белки Ras-dva формируют отдельный кластер того же ранга, что и ранее известные семейства. (Рис.10). При этом степень гомологии между белками, входящими bi Ras-dva кластер и белками других кластеров составляет 10-40%. Степень же гомологии внутри Ras-dva кластера - более 52%. Таким образом, можно сделать вывод, что белки Ras-dva составляют отдельное, девятое семейство малых ГТФаз. Заметим, что белки нового семейства Ras-dva наиболее гомологичны белкам семейства Ras, которые в свою очередь являются важными элементами сигнальных каскадов в клетке (подробнее см. литобзор).

Рис.10 Филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз, построенное при помощи программы MEGA 2.1, используя метод «ближайшего соседа» и модель попарных расстояний (neighbor-joining algorithm и p-distance model). Масштабный отрезок в левом нижнем углу соответствует значению параметра р равным 0.1 (p=nd/L, где nd -количество аминокислот различающихся у 2-х сравниваемых последовательностей и L — общее количество сравниваемых аминокислот). Hs - Homo sapiens (человек), Mm — Mus musculus (мышь), Md — Monoderphis domestica (опоссум), Gg - Gallus gallus (курица), Ас - Anolis carolinensis (ящерица), XI - X. laevis (лягушка), Tr — Takifugu rubripes (рыба), Eh - Entamoeba

При сравнении представленнности каждого семейства малых ГТФаз в разных царствах/классах живых существ (бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных), мы обнаружили, что семейство Яаз^уа- -единственное, присутствующее только в 1 классе - у позвоночных организмов. Все другие семейства были представлены в 2-х и более классах/царствах живых организмов.

2.1.3 Сравнительный анализ консенсусных аминокислотных последовательностей G-домена белков Ras-dva и других малых ГТФаз.

Как известно, все ГТФазы, имеют каталитический G-домен, который включает в себя пять консенсусных аминокислотных последовательностей Gl- G5 , отвечающих за взаимодействие белка с ГТФ и ГДФ, а также за его ГТФазную активность. Последние три свойства чрезвычайно важны для осуществления цикла активации/инактивации ГТФазы, который регулируется специфическими белками-помощниками GEP (guanine nucleotide exchange protein) и GAP (GTPase activating protein) соответственно (подробнее см. литобзор).

Ras

Суперсемейство малых ГТФаз

Rho/Rac/Cdc42

Ras-dva

RJL

Rab

Arf/Sar

Gie histolytica (амеба)

В составе консенсусных последовательностей G1-G5 выделяют как высококонсервативные аминокислотные остатки (а.о.), присутствующие у малых ГТФаз всех известных семейств, так и а.о., консервативные только внутри отдельных семейств малых ГТФаз. Для того чтобы выяснить, есть ли у малых ГТФаз Ras-dva какие-либо особенности в строении консенсусных участков G1-G5 по сравнению с таковыми малых ГТФаз уже описанных семейств, мы провели сравнительный анализ последовательностей Gl- G5, характерных для белков Ras-dva и малых ГТФаз семейств Ras, Rab, Ran, Rho, RJL, RGK, Arf и Gie (Табл.4).

В результате, было выяснено, что у малых ГТФаз Ras-dva в консенсусных последовательностях G1-G5 присутствуют все высоко-консервативные а.о., но кроме того, имеется несколько особенностей в строении наиболее важных для ГДФ/ГТФ обмена и гидролиза последнего консенсусов, G2 (он же switch 1) и G3 (он же switch2). В частности, было показано, что в консенсусе G2 малые ГТФазы Ras-dva, в отличие от всех остальных малых ГТФаз, перед высоко-консервативным остатком треонина имеют 1-2 положительно заряженных аминокислотных остатка аргинина (выделены синим в Таблице 4) или лизина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Терёшина, Мария Борисовна, 2008 год

1. Зарайский, А.Г. (2007) Нейрапьная индукция: новые достижения и перспективы. Молекулярная биология 41:2, 200-215

2. Зарайский А.Г. (2004) Изучение молекулярно-генетических механизмов развития мозга на модели эмбрионов шпорцевоя лягушки. Молекулярная биология 38:1,40-47 Степанов В.М. (1996) Молекулярная биология. Структура и функции белков. 335 (Высшая Школа, М)

3. Aberger, F., Weidinger, G., Grunz, H. and Richter, К. (1998). Anterior specification of embryonic ectoderm: the role of the Xenopus cement gland-specific gene XAG-2. Mech Dev 72, 115-30.

4. Adachi, M., Fukuda, M. and Nishida, E. (1999). Two co-existing mechanisms for nuclear import of MAP kinase: passive diffusion of a monomer and active transport of a dimer. Embo J 18, 5347-58.

5. Ahrens, K. and Schlosser, G. (2005). Tissues and signals involved in the induction of placodal Sixl expression in Xenopus laevis. Dev Biol 288, 40-59.

6. Alto, N. M., Shao, F., Lazar, C. S., Brost, R. L., Chua, G., Mattoo, S., McMahon, S. A., Ghosh, P., Hughes, T. R., Boone, C. et al. (2006). Identification of a bacterial type Ш effector family with G protein mimicry functions. Cell 124,133-45.

7. Baker, С. V. and Bronner-Fraser, M. (2001). Vertebrate cranial placodes I. Embryonic induction. Dev Biol 232,1-61.

8. Boyl, P. Pi, Signore, M., Annino, A., Barbera, J. P., Acampora, D. and Simeone, A\ (2001). Otx genes in the development and evolution of the vertebrate brain. Int J Dev Neurosci 19, 35363

9. Chalmers, A. D., Slack, J. M. and Beck, C. W. (2000). Regional gene expression in the epithelia of the Xenopus tadpole gut. Mech Dev 96,125-8.

10. Deardorff, M. A., Tan, C., Saint-Jeannet, J. P. and Klein, P. S. (2001). A role for frizzled 3 in neural crest development. Development 128, 3655-63.

11. Dickinson, A. and Sive, H. (2007). Positioning the extreme anterior in Xenopus: Cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol 19, 19.

12. Eagleson, G. W. and Harris, W. A. (1990). Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. JNeurobiol 21, 427-40.

13. Efimov, V. A., Buriakova, A. A., Chub, M. B. and Chakhmakhcheva, O. G. (1998). Peptide nucleic acids and their phosphonate analogues: synthesis and hybridization characteristics. BioorgKhim 24, 696-709.

14. Efimov, V. A., Klykov, V. N. and Chakhmakhcheva, O. G. (2003). Phosphono peptide nucleic acids with a constrained hydroxyproline-based backbone. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22, 593-9.

15. Ermakova, G. V., Solovieva, E. A., Martynova, N. Y. and Zaraisky, A. G. (2007). The homeodomain factor Xanf represses expression of genes in the presumptive rostral forebrain that specify more caudal brain regions. Dev Biol 307, 483-97.

16. Jiang, S. Y. and Ramachandran, S. (2006). Comparative and evolutionary analysis of genes encoding small GTPases and their activating proteins in eukaryotic genomes. Physiol Genomics 24,235-51.

17. Jordens, I., Marsman, M., Kuijl, C. and Neeljes, J. (2005). Rab proteins, connecting transport and vesicle fusion. Traffic 6, 1070-7.

18. Kauffmann-Zeh, A., Rodriguez-Viciana, P., Ulrich, E., Gilbert, C., Coffer, P., Downward, J. and Evan, G. (1997). Suppression of c-Myc-induced apoptosis by Ras signalling through PI(3)K and PKB. Nature 385, 544-8.

19. Kiecker, C. and Lumsden, A. (2005). Compartments and their boundaries in vertebrate brain development. Nat RevNeurosci 6, 553-64.

20. McGinnis, W. and Krumlauf, R. (1992). Homeobox genes and axial patterning. Cell 68,283302.

21. Morgan, R. and Sargent, M. G. (1997). The role in neural patterning of translation initiation factor eIF4AII; induction of neural fold genes. Development 124,2751-60.

22. Novoselov, V. V., Alexandrova, E. M., Ermakova, G. V. and Zaraisky, A. G. (2003). Expression zones of three novel genes abut the developing anterior neural plate of Xenopus embryo. Gene Expr Patterns 3, 225-30.

23. Okai, T., Araki, Y., Tada, M., Tateno, T., Kontani, K. and Katada, T. (2004). Novel small GTPase subfamily capable of associating with tubulin is required for chromosome segregation. J Cell Sci 117,4705-15.

24. Paduch, M., Jelen, F. and Otlewski, J. (2001). Structure of small G proteins and their regulators. Acta Biochim Pol 48, 829-50.

25. Pan, J. Y., Fieles, W. E., White, A. M., Egerton, M. M. and Silberstein, D. S. (2000). Ges, A human GTPase of the Rad/Gem/Kir family, promotes endothelial cell sprouting and cytoskeleton reorganization. J Cell Biol 149,1107-16.

26. Reynet, C. and Kahn, C. R. (1993). Rad: a member of the Ras family overexpressed in muscle of type II diabetic humans. Science 262,1441-4.

27. Ribisi, S., Jr., Mariani, F. V., Aamar, E., Lamb, T. M., Frank, D. and Harland, R. M.2000). Ras-mediated FGF signaling is required for the formation of posterior but not anterior neural tissue in Xenopus laevis. Dev Biol 227, 183-96.

28. Rocks, O., Peyker, A. and Bastiaens, P. I. (2006). Spatio-temporal segregation of Ras signals:one ship, three anchors, many harbors. Curr Opin Cell Biol 18, 351-7.

29. Rommel,* C. and Hafen, E. (1998). Ras-a versatile cellular switch. Curr Opin Genet Dev 8,412.8.

30. Sasaki, T. and Takai, Y. (1998). The Rho small G protein family-Rho GDI system as a temporal and spatial determinant for cytoskeletal control. Biochem Biophys Res Commun 245, 641-5.

31. Sebti, S. M: (2003). Blocked pathways: FTIs shut down oncogene signals. Oncologist 8 Suppl 3, 30-8.

32. Seewald; M. J., Korner, C., Wittinghofer, A. and Vetter, I. R. (2002). RanGAP mediates

33. GTP hydrolysis without an arginine finger. Nature 415, 662-6.

34. Sepp, K. J. and Auld, V. J. (2003). RhoA and Racl GTPases mediate the dynamicrearrangement of actin in peripheral glia. Development 130, 1825-35.

35. Shimamura, K. and Rubenstein, J. L. (1997). Inductive interactions direct earlyregionalization of the mouse forebrain. Development 124, 2709-18.

36. Sive, H.j Grainger, R. and Harland, R. (2000). Early Development of Xenopus laevis., 338 (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

37. Sokol, S. Y. (1999). Wnt signaling and dorso-ventral axis specification in vertebrates. Curr Opin Genet Dev 9; 405-10.

38. Spemann, H. and Mangold, H. (2001). Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. 1923. Int J Dev Biol 45j 13-38.

39. Spokony, R. F., Aoki, Y., Saint-Germain, N., Magner-Fink, E. and Saint-Jeannet, J. P. (2002). The transcription factor Sox9 is required for cranial neural crest development in Xenopus. Development 129,421-32.

40. Stenmark, H. and Olkkonen, V. M. (2001). The Rab GTPase family. Genome Biol 2, REVIEWS3007.

41. Takai, Y., Sasaki, T. and Matozaki, T. (2001). Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 81, 153-208.

42. Tríbulo, C., Aybar, M. J., Nguyen, V. H., Mullins, M. C. and Mayor, R. (2003). Regulation of Msx genes by a Bmp gradient is essential for neural crest specification. Development 130, 6441-52.

43. Tsai, 1. C., Amack, J. D., Gao, Z. H., Band, V., Yost, H. J. and Virshup, D. Mi (2007). A Wnt-CKIvarepsilon-Rapl pathway regulates gastrulation by modulating SIPA1L1, a Rap GTPase activating protein: Dev Cell 12,335-47.

44. Van Aelst, L. and Symons, M. (2002). Role of Rho family GTPases in epithelial morphogenesis. Genes Dev 16,1032-54.

45. Van Aelst, L. and D'Souza-Schorey, C. (1997). Rho GTPases and signaling networks. Genes Dev 11,2295-322.

46. Vernoud, V., Horton, A. C., Yang, Z. and Nielsen, E. (2003). Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis. Plant Physiol 131, 1191-208.

47. Wang, D. A. and Sebti, S. M. (2005). Palmitoylated cysteine 192 is required for RhoB tumor-suppressive and apoptotic activities. J Biol Chem 280, 19243-9.

48. Ward, Y., Yap, S. F., Ravichandran, V., Matsumura, F., Ito, M., Spinelli, B. and Kelly, K.2002). The GTP binding proteins Gem and Rad are negative regulators of the Rho-Rho kinase pathway. J Cell Biol 157,291-302.

49. Wettschureck, N. and Offermanns, S. (2005). Mammalian G proteins and their cell type specific functions. Physiol Rev 85; 1159-204.

50. Whitman, M. and Melton, D. A. (1992). Involvement of p21ras in Xenopus mesoderm induction. Nature 357,252-4.

51. Wunnenberg-Stapleton, K., Blitz, I. L., Hashimoto, C. and Cho, K. W. (1999). Involvement of the small GTPases XRhoA and XRndl in cell adhesion and head formation in early Xenopus development. Development 126, 5339-51.

52. Yamada, M., Tachibana, T., Imamoto, N. and Yoneda, Y. (1998). Nuclear transport factor plO/NTF2 functions as a Ran-GDP dissociation inhibitor (Ran-GDI). Curr Biol 8,1339-42".

53. Yamamoto, T. S., Takagi, C., Hyodo, A. C. and Ueno, N. (2001). Suppression of head formation by Xmsx-1 through the inhibition of intracellular nodal signaling. Development 128, 2769-79.

54. Ye, W., Shimamura, K., Rubenstein, J. L., Hynes, M. A. and Rosenthal, A. (1998). FGF and Shh signals control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. Cell 93, 755-66.

55. Zaraisky, A. G., Ecochard, V., Kazanskaya, O. V., Lukyanov, S. A., Fesenko, I. V. and Duprat, A. M. (1995). The homeobox-containing gene XANF-1 may control development of the Spemann organizer. Development 121, 3839-47.

56. Zaraisky, A. G., Lukyanov, S. A., Vasiliev, O. L., Smirnov, Y. V., Belyavsky, A. V. and Kazanskaya, O. V. (1992). A novel homeobox gene expressed in the anterior neural plate of the Xenopus embryo. Dev Biol 152, 373-82.