Применение СRISPR-Cas9 для создания мышиной модели и генной терапии миодистрофии Дюшенна с делецией экзонов 8-34 гена DMD тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Егорова Татьяна Владимировна

• Егорова Татьяна Владимировна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Егорова Татьяна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи исследования

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

Научная новизна и практическая значимость исследования

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Апробация результатов

Личное участие автора в проведении исследований

Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Миодистрофия Дюшенна: общие сведения

2.2. Молекулярные механизмы развития заболевания

2.3. Терапевтические подходы для лечения МДД

2.3.1. Пропуск экзонов

2.3.2. Игнорирование нонсенс-мутаций

2.3.3. Вирусная доставка укороченных форм микродистрофина и микроутрофина

2.3.5. Клеточная тер апия

2.3.6. Другие подходы

2.4. Моделирование МДД

2.5. Редактирование генома с помощью Cas белков

2.6. CRISPR-Cas9 для создания моделей

2.7. CRISPR-Cas9 в качестве терапевтического агента

2.8. Аденоассоциированные вирусы для генной терапии

2.9. Особенности разработки генной терапии для уникальных мутаций в гене дистрофина

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Пациенты

3.2. Трансдифференцировка фибробластов в миоциты

3.3. Лабораторные животные

3.4. Микроинъекции, культивирование эмбрионов и перенос

3.5. Получение компонентов для редактирования генома в мышиных эмбрионах

3.6. Получение плазмид, продукция и очистка рекомбинантных

аденоассоциированных вирусов

3.7. Культура первичных миобластов из скелетных мышц модельных мышей и скрининг препаратов AAV для редактирования генома

3.8. Введение мышам вирусных препаратов

3.9. Выделение геномной ДНК, РНК, ПЦР-анализ, анализ последовательностей

3.10. Вестерн блоттинг

3.11. Иммунофлуоресцентный анализ криосрезов

3.12. Физиологические тесты

3.13. Биохимические тесты

3.14. Гистологический анализ

3.15. Статистический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Анализ уникальной мутации, выявленной у пациента с миодистрофией Дюшенна

4.2. Подбор РНК-гидов для внесения делеции экзонов 8-34 в мышиной ген Dmd

4.3. Получение мышей с делецией экзонов 8-34 в гене дистрофина

4.4. Выведение линии модельных мышей DMDdel8-34

4.5. Описание фенотипа линии мышей DMDdel8-34

4.6. Восстановление рамки считывания дистрофина в миоцитах мышей DMDdel8-34 c помощью комплексов CRISPR-Cas9 in vitro

4.7. Внутримышечное введение препаратов AAV-CRISPR приводит к восстановлению рамки считывания дистрофина и мышечной функции в мышах DMDdel8-34

4.8. Экспрессия укороченной формы дистрофина приводит к восстановлению DAGC у мышей DMDdel8-34

4.9. Целевое и нецелевое разрезание ДНК комплексом CRISPR-Cas9

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МДД - мышечная дистрофия Дюшенна

DAGC - дистрофин-ассоциированный комплекс гликопротеинов МДБ - мышечная дистрофия Беккера

AAV - аденоассоциированные вирусы (adeno-associated virus ) КФК - креатинфосфокиназа

MLPA - метод мультиплексной амплификации лигированных зондов (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Dp - промотор дистрофина (dystrophin promoter)

N-ABD - N-концевой актин-связывающий домен (N-terminal actin-binding domain)

CR - цистеин-богатый домен (Cysteine-rich) CT - C-концевой домен (С-terminal)

CH - домен, гомологичный кальпонину (calponin homology) nNOS - нейрональная NO-синтаза

FDA - управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов

и медикаментов (Food and Drug Administration)

O'-2MePS - 2'-0-метилфосфонат

PMO - олигомер фосфорамидат морфолино

АСО - антисмысловые олигонуклеотиды

мяРНК - малые ядерные РНК

GRMD - модель миодистрофии на золотистых ретриверах (Golden Retriever Muscular Dystrophy)

CXMDj - собачья модель миодистрофии сцепленной с Х-хромосомой, обнаруженная в Японии (Canine X-linked muscular dystrophy in Japan) CKCS-MD - модель миодистрофии на собаках породы кавалер-кинг-чарльз-спаниель (Cavalier King Charles Spaniels MD)

TALEN - эффекторные нуклеазы подобные активаторам транскрипции (transcription activator-like effector nucleases)

BAC - искусственная бактериальная хромосома (bacterial artificial chromosome)

CRISPR - регулярно расположенные группами короткие палиндромные повторы (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) Cas - CRISPR-ассоциированный белок (CRISPR-associated protein) PAM - мотив, прилегающий к протоспейсеру (protospacer adjacent motif) сNHEJ - классическое соединение негомологичных концов (classical non-homologous end joining)

MMEJ - соединение концов на основе микрогомологии (microhomology mediated end joining)

HITI - встраивание по месту разрыва без участия гомологичной

рекомбинации (homology independent targeted integration)

ITR - инвертированные концевые повторы (inverted terminal repeats)

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PBS - фосфатно-солевой буфер (phosphate-buffered saline)

GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein)

TIDE - отслеживания инделов с помощью декомпозиции (tracking indels by

decomposition)

ИПСК - индуцированные плюрипотентные клетки

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение СRISPR-Cas9 для создания мышиной модели и генной терапии миодистрофии Дюшенна с делецией экзонов 8-34 гена DMD»

Актуальность темы исследования

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) - самая распространенная форма прогрессирующей мышечной дистрофии. Среди 100000 новорожденных мальчиков МДД впоследствии обнаруживают у 20. Общее количество пациентов в мире на сегодняшний день оценивается в 300000. Заболевание приводит к прогрессирующей мышечной слабости, в возрасте 10-12 лет пациенты теряют способность самостоятельно ходить. Без поддерживающей терапии многие пациенты не доживают до 30 лет, смерть наступает из-за отказа дыхательных и сердечной мышц. Гормональная терапия, физиотерапия, хирургические вмешательства и соблюдение специальной диеты позволяют продлить амбулаторный период и улучшить качество жизни, но не останавливают прогрессирование заболевания. Причиной развития МДД являются мутации в гене DMD, приводящие к отсутствию мышечной формы белка дистрофина. В большинстве случаев это делеции одного или нескольких экзонов, реже - точечные замены, короткие делеции или инсерции. В настоящее время предлагается несколько инновационных методов лечения МДД, направленных на восстановление синтеза белка. На их основе уже зарегистрированы препараты для пропуска экзонов, игнорирования стоп-кодона и заместительной генной терапии. Препараты генной терапии для модуляции сплайсинга находятся на стадии клинических испытаний.

Ген дистрофина DMD кодирует несколько изоформ белка, которые отличаются между собой по месту экспрессии и выполняемым функциям. Одной из самых длинных является мышечная форма дистрофина Dp427m. Мышечный дистрофин имеет множество сайтов связывания с плазматическими и мембранными белками. К-концевой домен обеспечивает связывание дистрофина с актином. Цистеин-богатый и С-концевой домены связывают белки дистрофин-ассоциированного комплекса гликопротеинов,

выполняющие разные функции. Именно дистрофин обеспечивает сборку этого гликопротеинового комплекса на сарколемме, таким образом связывая через этот комплекс сократительный аппарат с внеклеточным матриксом. Известно, что мутации, затрагивающие только центральный домен и не приводящие к сдвигу рамки считывания, приводят к менее выраженным симптомам и служат причиной развития миодистрофии Беккера (МДБ). Пациенты с миодистрофией Беккера как правило сохраняют подвижность вплоть до преклонного возраста. Это наблюдение послужило началом для применения новых методов терапии МДД. У одного из пациентов с МДБ с протяженной делецией в центральной части гена был обнаружен укороченный, но функциональный дистрофин. На его основе был сконструирован первый вариант укороченной формы белка - минидистрофин. Позже были разработаны еще более короткие формы дистрофина для заместительной генной терапии с использованием рекомбинантных вирусных векторов, которые получили общее название- микродистофины. Такой метод подходит для пациентов с разными мутациями, что несомненно является огромным преимуществом метода. В настоящее время наибольший прогресс достигнут в применении заместительной генной терапии с помощью рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (рЛЛУ). Генетическая конструкция, доставляемая с помощью рЛЛУ способна долгое время персистировать в целевых клетках в виде эписомы. Низкая вероятность встраивания в геном обеспечивает безопасность разрабатываемых препаратов. Однако, по мере роста организма и обновления клеток концентрация вектора может снижаться, что приведет к снижению экспрессии терапевтического белка и, соответственно, снижению эффекта. Образующийся после однократного введения иммунный ответ на вектор не позволяет применять заместительную генную терапию повторно. В текущий момент длительность терапевтического эффекта для

рЛЛУ-микродистрофинов не определена на практике, однако снижение экспрессии белков в клинических испытаниях препаратов для других

наследственных заболеваний вместе с большим объемом мышечной ткани заставляет ученых разрабатывать альтернативные терапевтические подходы. Еще одним недостатком заместительной генной терапии является экспрессия микродистрофина с искусственного мышечно-специфического промотора. В отсутствие естественной регуляции экспрессии невозможно восполнить дефицит белка в нейрональных, иммунных, эндокринных и других клетках, где дистрофин выполняет важные функции. Методы терапии, сохраняющие естественную регуляцию экспрессии мышечной и других изоформ дистрофина обладают огромным преимуществом. Модуляция сплайсинга, индуцированная антисмысловыми олигонуклеотидами, блокирующими тот или иной активный сайт, известны под названием "exon-skippmg" (пропуск экзонов). Сердечная мышцы и диафрагма являются не самой простой мишенью для проникновения олигонуклеотидов, в то время как постепенное разрушение этих мышц и является основной причиной летального исхода при МДД. Кроме того, действие на уровне сплайсинга мРНК требует непрерывного введения препарата для поддержания терапевтического эффекта. Тем не менее, несколько препаратов для пропуска экзонов уже были одобрены для применения на пациентах. Среди них препараты для пропуска экзонов 51, 53 и 45 на основе морфолиновых олигонуклеотидов. Препараты для пропуска одного экзона продемонстрировали высокую эффективность в доклинических испытаниях. Для восстановления рамки считывания у некоторых пациентов требуется дополнительное удаление из мРНК двух или более экзонов. Одновременный пропуск нескольких экзонов менее эффективен, что затрудняет разработку аналогичных препаратов для некоторых групп пациентов. В настоящее время для восстановления рамки считывания предлагается удаление дополнительных экзонов из гена дистрофина методом редактирования генома. Восстановление рамки считывания дистрофина на уровне геномной ДНК обеспечивает длительную эффективность терапии, сохранение естественной регуляции экспрессии белка и требует однократного применения, перекрывая недостатки

предыдущих методов. Потенциал системы редактирования генома CRISPR^ Cas для генной терапии МДД был продемонстрирован в многочисленных клеточных и животных моделях заболевания in vitro и in vivo. Для доставки комплексов редактирования генома в скелетные мышцы, сердце и диафрагму животных моделей используют рААВ миотропных серотипов. Испытываемые в данный момент подходы для восстановления рамки считывания сконцентрированы в области "горячей точки" возникновения мутаций в районе экзонов 45-55, кодирующих часть центрального домена. Многочисленные работы на животных моделях демонстрируют смягчение симптомов заболевания и восстановление мышечных функций при пропуске экзонов в этой области. Вторая "горячая точка" затрагивает экзоны 2-20. Мутации в этой области приводят к разнообразным проявлениям. Встречаются как формы с тяжелым течением и характерной картиной МДД и более благоприятные проявления, описанные в литературе как случаи миодистрофии Беккера. Однако, четкой взаимосвязи между характером мутации и тяжестью заболевания выявлено не было. Для предсказания эффективности терапии и исследования функциональности белка при мутациях в данной области создаются персонализированные животные модели.

Среди российских пациентов с миодистрофией Дюшенна была выявлена уникальная мутация в гене дистрофина: делеция экзонов 8-34. Восстановление рамки считывания при такой делеции может быть осуществлено методом редактирования генома с помощью системы CRISPR ^Cas9. При редактировании гена дистрофина образуется укороченный белок, лишенный части структурных доменов. Для тестирования эффективности стратегии и подтверждения функциональности образованного белка требуется создание пациент-специфической животной модели.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение эффективности редактирования генома в пациент-специфической мышиной модели в качестве потенциальной терапии миодистрофии Дюшенна, вызванной делецией экзонов 8-34 в гене дистрофина.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать уникальный патогенный вариант гена дистрофина с делецией экзонов 8-34, обнаруженный у пациента с миодистрофией Дюшенна.

2. Применить систему редактирования генома CRISPR-Cas9 для получения линии мышей с экзон-интронной структурой гена Dmd, идентичной гену пациента.

3. Определить влияние делеции экзонов 8-34 в гене Dmd на фенотип мышей.

4. Выбрать стратегию редактирования генома CRISPR-Cas9 для восстановления рамки считывания в гене дистрофина с делецией экзонов 8-34.

5. Оценить влияние редактирования генома в модельных мышах при доставке CRISPR-Cas9 с помощью аденоассоциированных вирусов.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В данной работе впервые была охарактеризована большая делеция в гене дистрофина, обнаруженная у российского пациента с МДД. Делеция, возникшая у пациента de novo, приводит к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона в 35 экзоне и полному отсутствию мышечной формы дистрофина.

Для подбора терапии с использованием системы редактирования генома CRISPR-Cas9 создана персонализированная мышиная модель DMDdel8-34 с делецией экзонов 8-34 в гене дистрофина. Было продемонстрировано, что мыши данной линии имеют желаемую мутацию в

Х-хромосоме и не содержат мутаций в наиболее вероятных предсказанных сайтах неспецифического связывания использованных гидовых РНК. В мышцах мышей данной линии отсутствует мышечная форма белка дистрофина, что приводит к основным молекулярным, биохимическим и физиологическим проявлениям заболевания.

На первичных миобластах из модельных мышей in vitro и в ходе внутримышечных инъекций был проведен скрининг препаратов на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов для дополнительного удаления экзонов 6 и 7 методом геномного редактирования. Редактирующий комплекс в составе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов 9 серотипа продемонстрировал свою эффективность, успешно достигая целевых клеток. Продемонстрировано восстановление экспрессии белка и восстановление функции при дополнительном удалении экзонов 6 и 7 в гене дистрофина, кодирующих часть N-концевого актин-связывающего домена на мышиной модели DMDdel8-34. Было показано, что укороченная форма дистрофина, лишенная CH2 N-концевого актин-связывающего домена, первого и второго петлевых участков и 11 спектриновых повторов, сохраняет свою функциональность. Показана принципиальная применимость редактирования генома для восстановления рамки считывания пациентов с делецией экзонов 8-34 и перспективность подобного подхода для лечения миодистрофии Дюшенна у пациентов с обширными делециями, затрагивающими "горячую точку" мутаций в районе экзонов 2-20 в гене дистрофина.

Область экзонов с 2 по 20 является одной из двух горячих точек в гене дистрофина, где чаще других обнаруживают мутации у пациентов с МДД. Считается, что пропуск экзонов 6 и 7 мог бы потенциально быть применим для лечения 3% всех пациентов с МДД. В частности, такой подход может быть использован для лечения пациентов с делецией экзонов 8-34. В данной работе продемонстрировано, что дополнительное удаление экзонов 6 и 7 в гене дистрофина у мышей DMDdel8-34 приводит к образованию

функциональной укороченной формы дистрофина. Получен прототип препарата для лечения пациентов с мутациями, находящимися между интронами 5 и 34 в гене дистрофина.

Данная работа посвящена изучению молекулярных основ заболевания человека с помощью методов генной инженерии и редактирования генома, визуализации макромолекул и их комплексов в живых клетках и др. Таким образом, представленная работа соответствует паспорту специальности "Молекулярная биология".

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием методов молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии, клеточной биологии и гистологии. Для анализа экзонного состава сплайс-форм транскриптов и их представленности в норме и при патологии проводили полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией. Для анализа экспрессии белков и их внутриклеточной локализации использовали вестерн-блоттинг и иммунофлуоресцентное окрашивание тканей. Для доставки генетических конструкций в клетки и ткани использовали трансфекцию, лентивирусную и ААВ-трансдукцию. Для трансдифференцировки фибробластов пациента в миобласты использовали индуцируемую экспрессию транскрипционного фактора MyoD. Редактирование генома in vitro и in vivo проводили с помощью комплексов CRISPR-Cas9. Для дизайна редактирующих комплексов использовали биоинформатические методы. Для оценки эффективности генетических модификаций и исхода репарации ДНК использовали метод секвенирования по Сэнгеру с последующим биоинформатическим анализом. Достоверность результатов диссертации обеспечивается с корректным проведением статистической обработки данных. Эксперименты были повторены не менее трех раз, полученные результаты хорошо воспроизводились.

Положения, выносимые на защиту

1. Обнаруженная у пациента с миодистрофией Дюшенна de novo делеция экзонов 8-34 в гене DMD приводит к сдвигу рамки считывания и отсутствию белка дистрофина.

2. Получена линия мышей с делецией экзонов 8-34 в гене Dmd, повторяющая экзон-интронную структуру гена пациента ^ DMDdel8-34.

3. Фенотип мышиной модели DMDdel8-34 соответствует патогенезу миодистрофии Дюшенна.

4. При делеции экзонов 8-34 в гене Dmd, дополнительное удаление экзонов 6 и 7 с помощью CRISPR-Cas9 приводит к восстановлению рамки считывания дистрофина.

5. Редактирование гена дистрофина в мышцах модельных мышей приводит к улучшению мышечных функций и восстановлению сборки дистрофин-ассоциированного комплекса.

Апробация результатов

Основные положения и выводы исследования изложены в 4 статьях в международных рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данных WoS, Scopus, РИНЦ и рекомендованных для публикации основных научных результатов ВАК. Материалы работы представлены на 6 российских и международных научных конференциях.

Публикации:

1. Egorova T.V., Polikarpova A.V., Vassilieva S.G., Dzhenkova M.A., Savchenko I.M., Velyaev O.A., Shmidt A.A., Soldatov V.O., Pokrovskii M.V., Deykin A.V., Bardina M.V. CRISPR-Cas9 correction in the DMD mouse model is accompanied by upregulation of Dp71f protein // Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 2023. V.30. P. 161-180.

2. Egorova T.V., Zotova E.D., Reshetov D.A., Polikarpova A.V., Vassilieva S.G., Vlodavets D.V., Gavrilov A.A., Ulianov S.V., Buchman V.L., Deykin A.V. CRISPR/Cas9-generated mouse model of Duchenne muscular dystrophy recapitulating a newly identified large 430 kb deletion in the human DMD gene // Disease Models & Mechanisms. 2019. V. 12. P. dmm037655.

3. Димитриева (Егорова) Т.В., Решетов Д.А., Жерновков В.Е., Влодавец Д.В., Зотова Е.Д., Ермолкевич Т.Г., Дейкин А.В. Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2016. № 3. С. 16-22.

4. Зотова Е.Д., Решетов Д.А., Жерновков В.Е., Влодавец Д.В., Димитриева (Егорова) Т.В., Дейкин А.В. Анализ фенотипических проявлений делеций в гене дистрофина в контексте эффективности пропуска экзонов как метода терапии наследственных дистрофинопатий // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2016. № 3. С. 23-29.

Выступления на конференциях:

1. Dimitrieva T.V., Reshetov D.A., Vlodavets D.V., Zotova E.D., Deikin A.V. Novel mouse model of Duchenne muscular dystrophy with deletion of exons 8-34 // Journal of Neuromuscular diseases. ^ 2016. ^ Volume 3. ^ Supplement 1. ^ S142. 14th International Congress on Neuromuscular Diseases, Торонто, Канада, 2016г.

2. Egorova T., Vlodavets D., Reshetov D., Zotova E., Polikarpova A., Vassilieva S., Deikin A. Expression of dystrophin isoforms in new Duchenne muscular dystrophy mice model // Journal of Neuromuscular Diseases. ^ 2018. ^ V. 5. ^ Supplement 1. ^ S163. 15th International Congress on Neuromuscular Diseases, Вена, Австрия, 2018г.

3. Egorova T.V., Reshetov D.A., Polikarpova A.V., Vassilieva S.G., Vlodavets D.V., Deikin A.V. Exons 6 and 7 skipping test on new murine model of Duchenne

muscular dystrophy // Neuromuscular disorders. — 2018. — Vol.28. — S.94. 23d World Muscle society congress, Мендоза, Аргентина, 2018г.

4. Egorova T., Polikarpova A., Usachev E., Dzhenkova M., Smidt A., Vlodavets D., Vassilieva S., Deikin A., Bardina M. Different Approaches to Restore Dystrophin Expression on DMDdel8-34 Mice Model. Journal of Neuromuscular Diseases. — 2021. —8. —s1. —. S64. 16th International Congress on Neuromuscular Diseases. Онлайн, 2021г.

5. Egorova T., Polikarpova A., Savchenko I., Vassilieva S., Ivanova Y., Skopenkova V., Dzhenkova M., Tsvirkun D., Shmidt A., Khamatova A., Loginov V., Velyaev O., Deykin A., Soldatov V., Bardina M. Deletion of Exons 6 and 7 using AAV-CRISPR restores dystrophin expression and ameliorates dystrophic phenotype in DMD mouse model // Neuromuscular Disorders. —2021. — 31. — Supplement 1. — S73. World Muscle society congress 2021, онлайн, 2021г.;

6. Егорова Т.В., Решетов Д.А., Влодавец Д.В., Зотова Е.Д., Дейкин А.В.Российский опыт создания персонализированной модели миодистрофии Дюшенна // Российский вестник перинатологии и педиатрии. — 2018. — 63(4). ^—139. XVII Российский конгресс «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» с международным участием. Москва, Россия, 2018г.

Личное участие автора в проведении исследований

Автор внес основной вклад в получение и анализ представленных в работе данных. Личный вклад соискателя заключается в анализе литературных данных, планировании экспериментов, постановке экспериментов, обработке полученных экспериментальных данных и их интерпретации, подготовке публикаций, презентации данных на российских и международных конференциях. Автор внес Клеточные работы с первичными клетками пациента и модельных мышей, а также иммунофлуоресцентное окрашивание мышечных срезов были выполнены совместно с Васильевой Светланой (ИБГ РАН). Работы с мышиными

эмбрионами, в частности их получение и трансплантация были проведены в ЦКП ИБГ РАН. Внутримышечное введение препаратов аденоассоциированных вирусов и функциональные тесты на модельных мышах выполнены Поликарповой Анной (ИБГ РАН). Имена соавторов, участвовавших в проведении экспериментов, указаны в соответствующих опубликованных работах.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает разделы: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы из 182 источников, 3 приложения. Работа состоит из 149 страниц машинописного текста, содержит 32 рисунка, 5 таблиц.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Миодистрофия Дюшенна: общие сведения

Миодистрофия Дюшенна (МДД) - тяжелое нейро-мышечное заболевание, вызванное мутациями в гене DMD и дефицитом белка дистрофина. МДД характеризуется прогрессирующей мышечной слабостью, приводит к полному обездвиживанию пациентов и значительному сокращению продолжительности жизни. Заболевание имеет Х-сцепленный рецессивный тип наследования и обнаруживается у 1 из 5000 новорожденных мальчиков [1]. С учетом продолжительности жизни количество пациентов в общей популяции составляет менее 10 на 100000 мужчин. Реже встречается более мягкая форма заболевания - миодистрофия Беккера (МДБ), для которой характерны мутации с сохранением рамки считывания и экспрессия укороченных форм дистрофина. С среднем МДБ обнаруживают у 8 из 100000 новорожденных мальчиков. При этом количество пациентов в разных регионах не отличается [1]. Классическую форму МДД диагностируют по псевдогипертрофии мышц голени, особенностям походки, использованию приемов Говерса при подъеме из горизонтального положения (использование рук для распределения нагрузки) и другим характерным проявлениям. Также на причину заболевания указывают повышенные в крови уровни ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, креатинфосфокиназы. Уровень креатинфосфокиназы (КФК) в крови пациентов с МДД сильно повышен с самого рождения и зачастую превышает 20000 Ед/л при норме <300 Ед/л [2]. Уточнение мутации критически важно для назначения терапии из числа уже одобренных препаратов или принятия решения об участии в клинических испытаниях. При генетическом тестировании в первую очередь выясняют наличие протяженных мутаций, затрагивающих целые экзоны. Около 75% случаев МДД вызвано делециями или дупликациями одного или более экзонов в гене дистрофина [3]. В качестве дополнительного исследования могут быть назначены биопсия мышечной ткани с

последующим иммуногистохимическим анализом или с помощью Вестерн-блоттинга [3]. Цель данных исследований заключается в определении локализации дистрофина в мышечных волокнах, определении молекулярной массы и уровня экспрессии белка. Отсутствие белка в таких тестах свидетельствует в пользу МДД, снижение уровня экспрессии или изменение размера - в пользу МДБ. Сложные для диагностики случаи обычно связаны с точечными мутациями в кодирующей последовательности DMD или мутациями в интронах [3].

Чаще всего заболевание манифестирует в возрасте 3-5 лет и характеризуется хорошо известным профилем мышечной дегенерации и слабости, риском развития прогрессирующих деформаций и функциональных потерь, являющихся следствием дефицита дистрофина. Как правило пациенты начинают испытывать трудности в передвижении в среднем в возрасте 10-12 лет, что вынуждает их использовать инвалидное кресло [2]. В третьей декаде пациенты полностью теряют способность самостоятельно передвигаться. Зачастую им требуется поддержка дыхания в виде инвазивной вентиляции легких и установка гастростомы. Сердечная недостаточность может вызывать жизнеугрожающие нарушения ритма у пациентов. Причиной летального исхода чаще всего служит отказ дыхательной или сердечной мускулатуры [4]. С надлежащим уходом, в основном направленном на решение кардиологических и пульмонологических дисфункций, а также своевременным назначением глюкокортикоидов, пациенты с МДД могут достигать возраста 40 и более лет. Эпидемиологические наблюдения во Франции выявили увеличение медианной продолжительности жизни с 25,77 лет для пациентов рожденных до 1970 года до 40,95 лет для более молодых пациентов [5].

2.2. Молекулярные механизмы развития заболевания

Причиной развития миодистрофии Дюшенна являются мутации в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина. Ген DMD находится

в Х-хромосоме. Это огромный ген, протяженностью около 2,4 млн п.о. [6]. Он состоит из 79 экзонов и кодирует несколько изоформ белка, обладающих разными профилями экспрессии (Рис.1). К развитию МДД могут приводить различные мутации, список которых пополняется непрерывно. На сегодняшний день у пациентов с МДД и МДБ описаны тысячи различных мутаций в гене дистрофина. Около 70% мутаций, вызывающих МДД, представляют собой делеции, 5-15% - дупликации, 20% - точечные мутации, приводящие к образованию стоп-кодона, маленькие делеции или инсерции. Иногда к тяжелой патологии могут приводить миссенс-мутации и замены в некодирующих областях. Наиболее редкими являются случаи хромосомных перестроек [7]. При этом мутации распределены на протяжении гена неравномерно. Выявлены две так называемые "горячие точки" мутаций (mutation hotspot). Чаще других мутации обнаруживают в области экзонов 45-55. Около 75% всех делеций начинаются или заканчиваются в этом регионе. Вторая горячая охватывает экзоны с 2 по 20. Начинаются или заканчиваются в этой области 23 и 16% делеций соответственно [7]. Около 30% мутаций образуются у пациентов de novo, остальные наследуются от матери, которая является носителем [8].

В гене дистрофина по крайней мере 7 независимых тканеспецифических промоторов и два сигнала полиаденилирования [9]. Они обеспечивают экспрессию 8 изоформ белка, для некоторых из которых еще известны сплайс-варианты (Рис. 1). Три промотора в начале гена обеспечивают образование транскриптов длиной 11,4 т.п.о. и белков массой 427 кДа (Dp427b, Dp427m and Dp427p). Четыре внутренних промотора Dp260, Dp140, Dp116 and Dp71 управляют экспрессией укороченных с N-конца немышечных изоформ белка (Рис. 1А).

1-1-1-1-Г"

0 500 1000 1500 2000 2500 kb

С M P (Dp427) R (Dp260) B, (DpUO) S (Dpi 16) G (Dp71/Dp40)

T T T I III llliUliiiNllmilllJi Л шГшН III uiu I I

2 30 45 56 63

k N-ABD Rod-domain CR CT

("^](cH2]Lrr-nj__M_l_l I ■ I I I ■ I I I ГШ l I 1 Q X ) Dp427r

HI UO Ml ИЛ Dp427p нейроны

H1 Ш HJ H4 Пуркинье

! Dp427b ЦНС

7m мышць|

I I I ■ I I I H(J ]f ) Dp260 сетчатка

вп ][ ) Dpi 40 ЦНС, почки

JoP116

ПНС

Y 1 Dp71 ЦНС, ^--ПОВО

) Dp40 ЦНС,

повсеместно

повсеместно

Рисунок 1. Организация гена DMD и изоформ белка дистрофина. А. Ген DMD состоит из 79 экзонов. Экзоны обозначены вертикальными линиями. Стрелками обозначены промоторы разных изоформ. Б. Доменный состав различных изоформ дистрофина. Различающиеся аминокислотные участки, кодируемые первыми экзонами коротких изоформ обозначены синим, сиреневым, голубым и красным цветами. N-ABD - N-концевой актин-связывающий домен, Rod-domain - центральный стержневой домен, CR - цистеин-богатый домен, CT - С-концевой домен, H1-4 - петлевые домены 1-4, SR - спектриновый повтор. Адаптировано из [10].

Альтернативный сплайсинг и альтернативное полиаденилирование приводят к образованию еще одной изоформы Dp40 [9]. Мышечная форма массой 427 кДа Dp427m одновременно является самой большой и самой представленной. Кортикальная изоформа Dp427b обнаруживается в коре головного мозга и СА регионе гиппокампа. Изоформа Dp427p имеет два варианта, которые представлены в клетках Пуркинье мозжечка. Более

короткие изоформы Dp260 и Dp116 экспрессируются соответственно в сетчатке и периферических нервах. Об экспрессии изоформы Dp140 известно крайне мало. Считается, что она в основном присутствует на эмбриональной стадии развития. Изоформы Dp71 и Dp40 экспрессируются повсеместно, с преобладанием в центральной нервной системе (Рис. 1Б) [9].

Мышечный дистрофин Dp427m имеет сложную доменную структуру. Обычно в нем выделяют четыре больших домена: N-концевой (N-ABD, N-terminal actin binding domain), центральный или стержневой (Rod-domain), цистеин-богатый (CR, Cysteine rich) и С-концевой (CT, C-terminal) (Рис. 1Б). Гибкость громоздкой структуры обеспечивают петлевые домены (H, hinge). Два из них ограничивают стержневой домен от прилегающих, еще два входят в его состав [11]. N-концевой домен дистрофина состоит из двух актин-связывающих субдоменов CH1 и CH2, обладающих гомологией с кальпонином. Известно, что непосредственное взаимодействие с актином осуществляется через домен CH1. А второй домен, вероятно, необходим для стабилизации комплекса [12]. Центральный домен представлен 24 повторами (R1-24), гомологичными спектриновым повторам. Здесь располагается еще один участок, обеспечивающий связывание с актином за счет электростатических взаимодействий (R11-15). В поперечно-полосатых мышцах дистрофин напрямую или опосредованно связывается с сарколеммой, цитоскелетом, ионными каналами, сигнальными и структурными белками. Вместе со своими партнерами он образует на сарколемме дистрофин ассоциированный комплекс гликопротеинов (DAGC, dystrophin associated glycoprotein complex). Основными участниками этого комплекса помимо дистрофина являются а- и в-дистрогликаны, а-, в-, у- и 5-саркогликаны, саркоспан, а- и в-синтрофины, дистробревин и нейрональная NO-синтаза (Рис. 2). Состав DAGC может варьировать в зависимости от мышцы или даже в зависимости от локализации внутри одного миоцита [11]. Дистрофин в основном взаимодействует с участниками комплекса через цистеин-богатый и С-концевой домены. Взаимодействие дистрофина с

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Егорова Татьяна Владимировна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mah J.K., Korngut L., Dykeman J., Day L., Pringsheim T., Jette N. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy//Neuromuscular disorders: NMD, 2014, T. 24, N 6, C. 482-491.

2. Bushby K., Finkel R., Birnkrant D.J., Case L.E., Clemens P.R., Cripe L., Kaul A., Kinnett K., McDonald C., Pandya S., Poysky J., Shapiro F., Tomezsko J., Constantin C., DMD Care Considerations Working Group Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management//The Lancet. Neurology, 2010, T. 9, Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1, N 1, C. 77-93.

3. Birnkrant D.J., Bushby K., Bann C.M., Apkon S.D., Blackwell A., Brumbaugh D., Case L.E., Clemens P.R., Hadjiyannakis S., Pandya S., Street N., Tomezsko J., Wagner K.R., Ward L.M., Weber D.R. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and neuromuscular, rehabilitation, endocrine, and gastrointestinal and nutritional management//The Lancet. Neurology, 2018, T. 17, Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1, N 3, C. 251-267.

4. Birnkrant D.J., Bushby K., Bann C.M., Alman B.A., Apkon S.D., Blackwell A., Case L.E., Cripe L., Hadjiyannakis S., Olson A.K., Sheehan D.W., Bolen J., Weber D.R., Ward L.M. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: respiratory, cardiac, bone health, and orthopaedic management//The Lancet Neurology, 2018, T. 17, Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2, N 4, P. 347-361.

5. Kieny P., Chollet S., Delalande P., Le Fort M., Magot A., Pereon Y., Perrouin Verbe B. Evolution of life expectancy of patients with Duchenne muscular dystrophy at AFM Yolaine de Kepper centre between 1981 and 2011//Annals of Physical and Rehabilitation Medicine, 2013, T. 56, N 6, C. 443-454.

6. Koenig M., Hoffman E.P., Bertelson C.J., Monaco A.P., Feener C., Kunkel L.M. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals//Cell, 1987, T. 50, N 3, C. 509-517.

7. Neri M., Rossi R., Trabanelli C., Mauro A., Selvatici R., Ferlini A., h gp. The Genetic Landscape of Dystrophin Mutations in Italy: A Nationwide Study. The Genetic Landscape of Dystrophin Mutations in Italy.//Frontiers in Genetics, 2020, T. 11, C. 1-15.

8. Helderman-van den Enden A.T.J.M., de Jong R., den Dunnen J.T.,

Houwing-Duistermaat J.J., Kneppers A.L.J., Ginjaar H.B., Breuning M.H., Bakker E. Recurrence risk due to germ line mosaicism: Duchenne and Becker muscular dystrophy//Clinical Genetics, 2009, T. 75, Recurrence risk due to germ line mosaicism, N 5, C. 465-472.

9. Doorenweerd N., Mahfouz A., van Putten M., Kaliyaperumal R., t' Hoen P.A.C., Hendriksen J.G.M., Aartsma-Rus A.M., Verschuuren J.J.G.M., Niks E.H., Reinders M.J.T., Kan H.E., Lelieveldt B.P.F. Timing and localization of human dystrophin isoform expression provide insights into the cognitive phenotype of Duchenne muscular dystrophy//Scientific Reports, 2017, T. 7, N 1, C. 12575.

10. Muntoni F., Torelli S., Ferlini A. Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes//The Lancet Neurology, 2003, T. 2, Dystrophin and mutations, N 12, C. 731-740.

11. Gao Q.Q., McNally E.M. The Dystrophin Complex: Structure, Function, and Implications for Therapy//Comprehensive Physiology, 2015, T. 5, The Dystrophin Complex, N 3, C. 1223-1239.

12. Norwood F.L., Sutherland-Smith A.J., Keep N.H., Kendrick-Jones J. The structure of the N-terminal actin-binding domain of human dystrophin and how mutations in this domain may cause Duchenne or Becker muscular dystrophy//Structure, 2000, T. 8, N 5, C. 481-491.

13. Duan D., Goemans N., Takeda S., Mercuri E., Aartsma-Rus A. Duchenne muscular dystrophy//Nature Reviews Disease Primers, 2021, T. 7, N. 1, C. 13.

14. Mokri B., Engel A.G. Duchenne dystrophy: electron microscopic findings pointing to a basic or early abnormality in the plasma membrane of the muscle fiber//Neurology, 1975, T. 25, Duchenne dystrophy, N 12, C. 1111-1120.

15. Dubuisson N., Versele R., Planchon C., Selvais C.M., Noel L., Abou-Samra M., Davis-Lopez De Carrizosa M.A. Histological Methods to Assess Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Duchenne Muscular Dystrophy//International Journal of Molecular Sciences, 2022, T. 23, N 24, C.16080.

16. Johnson E.K., Zhang L., Adams M.E., Phillips A., Freitas M.A., Froehner S.C., Green-Church K.B., Montanaro F. Proteomic analysis reveals new cardiac-specific dystrophin-associated proteins//PloS One, 2012, T. 7, N 8, C. e43515.

17. Dombernowsky N.W., Olmestig J.N.E., Witting N., Kruuse C. Role of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in Duchenne and Becker muscular dystrophies - Still a possible treatment modality?//Neuromuscular disorders: NMD, 2018, T. 28, N 11, C. 914-926.

18. Mareedu S., Million E.D., Duan D., Babu G.J. Abnormal Calcium Handling in Duchenne Muscular Dystrophy: Mechanisms and Potential

Therapies//Frontiers in Physiology, 2021, T. 12, Abnormal Calcium Handling in Duchenne Muscular Dystrophy, C. 647010.

19. Yanay N., Rabie M., Nevo Y. Impaired Regeneration in Dystrophic Muscle—New Target for Therapy//Frontiers in Molecular Neuroscience, 2020, T. 13. N69. C.1-12.

20. Aartsma-Rus A., Krieg A.M. FDA Approves Eteplirsen for Duchenne Muscular Dystrophy: The Next Chapter in the Eteplirsen Saga//Nucleic Acid Therapeutics, 2017, T. 27, FDA Approves Eteplirsen for Duchenne Muscular Dystrophy, N 1, C. 1-3.

21. Aartsma-Rus A., Corey D.R. The 10th Oligonucleotide Therapy Approved: Golodirsen for Duchenne Muscular Dystrophy//Nucleic Acid Therapeutics, 2020, T. 30, The 10th Oligonucleotide Therapy Approved, N 2, C. 67-70.

22. Roshmi R.R., Yokota T. Pharmacological Profile of Viltolarsen for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy: A Japanese Experience//Clinical Pharmacology: Advances and Applications, 2021, T. 13, Pharmacological Profile of Viltolarsen for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy, C. 235-242.

23. Shirley M. Casimersen: First Approval//Drugs, 2021, T. 81, Casimersen, N 7, C. 875-879.

24. Ryan N.J. Ataluren: first global approval//Drugs, 2014, T. 74, Ataluren, N 14, C. 1709-1714.

25. Bylo M., Farewell R., Coppenrath V.A., Yogaratnam D. A Review of Deflazacort for Patients With Duchenne Muscular Dystrophy//The Annals of Pharmacotherapy, 2020, T. 54, N 8, C. 788-794.

26. Bez Batti Angulski A., Hosny N., Cohen H., Martin A.A., Hahn D., Bauer J., Metzger J.M. Duchenne muscular dystrophy: disease mechanism and therapeutic strategies//Frontiers in Physiology, 2023, T. 14, Duchenne muscular dystrophy, C. 1183101.

27. Shimizu-Motohashi Y., Murakami T., Kimura E., Komaki H., Watanabe N. Exon skipping for Duchenne muscular dystrophy: a systematic review and meta-analysis//Orphanet Journal of Rare Diseases, 2018, T. 13, Exon skipping for Duchenne muscular dystrophy, N 1, C. 93.

28. Arechavala-Gomeza V., Kinali M., Feng L., Guglieri M., Edge G., Main M., Hunt D., Lehovsky J., Straub V., Bushby K., Sewry C.A., Morgan J.E., Muntoni F. Revertant fibres and dystrophin traces in Duchenne muscular dystrophy: implication for clinical trials//Neuromuscular disorders: NMD, 2010, T. 20, Revertant fibres and dystrophin traces in Duchenne muscular dystrophy, N 5, C. 295-301.

29. Wang R.T., Barthelemy F., Martin A.S., Douine E.D., Eskin A., Lucas A., Lavigne J., Peay H., Khanlou N., Sweeney L., Cantor R.M., Miceli M.C., Nelson S.F. DMD genotype correlations from the Duchenne Registry: Endogenous exon skipping is a factor in prolonged ambulation for individuals with a defined mutation subtype//Human Mutation, 2018, T. 39, DMD genotype correlations from the Duchenne Registry, N 9, C. 1193-1202.

30. Duan D. Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy//Molecular Therapy, 2018, T. 26, N 10, C. 2337-2356.

31. Miyazaki D., Yoshida K., Fukushima K., Nakamura A., Suzuki K., Sato T., Takeda S., Ikeda S. Characterization of deletion breakpoints in patients with dystrophinopathy carrying a deletion of exons 45-55 of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene//Journal of Human Genetics, 2009, T. 54, N 2, C. 127-130.

32. Wein N., Dunn D.M., Waldrop M.A., Gushchina L.V., Frair E.C., Weiss R.B., Flanigan K.M. Absence of Significant Off-Target Splicing Variation with a U7snRNA Vector Targeting DMD Exon 2 Duplications//Human Gene Therapy, 2021, T. 32, N 21-22, C. 1346-1359.

33. Waldrop M.A., Lawlor M.W., Vetter T.A., Frair, E., Beatka, M., Meng, H., Iammarino, M., Sabo, B., Subramanian, S., Brown, K., Kaler, M., Simmons, T., McBride, K., Wein, N., Flanigan, K. Safety and Outcomes of Intravenous scAAV9.U7-ACCA for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy Caused by Exon 2 Duplications, 2022, T. 30, N 4S1, C. 26.

34. Hug N., Longman D., Caceres J.F. Mechanism and regulation of the nonsense-mediated decay pathway//Nucleic Acids Research, 2016, T. 44, N 4, C. 1483-1495.

35. Malik V., Rodino-Klapac L.R., Viollet L., Mendell J.R. Aminoglycoside-induced mutation suppression (stop codon readthrough) as a therapeutic strategy for Duchenne muscular dystrophy//Therapeutic Advances in Neurological Disorders, 2010, T. 3, N 6, C. 379-389.

36. Xue X., Mutyam V., Tang L., Biswas S., Du M., Jackson L.A., Dai Y., Belakhov V., Shalev M., Chen F., Schacht J., J. Bridges R., Baasov T., Hong J., Bedwell D.M., Rowe S.M. Synthetic Aminoglycosides Efficiently Suppress Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Nonsense Mutations and Are Enhanced by Ivacaftor//American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2014, T. 50, N 4, C. 805-816.

37. Muntoni F., Desguerre I., Guglieri M., Osorio A.N., Kirschner J., Tulinius M., Buccella F., Elfring G., Werner C., Schilling T., Trifillis P., Zhang O., Delage A., Santos C.L., Mercuri E. Ataluren use in patients with nonsense mutation Duchenne muscular dystrophy: patient demographics and characteristics from the STRIDE Registry/Journal of Comparative Effectiveness Research, 2019, T. 8,

Ataluren use in patients with nonsense mutation Duchenne muscular dystrophy, N 14, C. 1187-1200.

38. Manini A., Abati E., Nuredini A., Corti S., Comi G.P. Adeno-Associated Virus (AAV)-Mediated Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy: The Issue of Transgene Persistence//Frontiers in Neurology, 2022, T. 12, Adeno-Associated Virus (AAV)-Mediated Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy, C. 814174.

39. Harper S.Q., Hauser M.A., DelloRusso C., Duan D., Crawford R.W., Phelps S.F., Harper H.A., Robinson A.S., Engelhardt J.F., Brooks S.V., Chamberlain J.S. Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy//Nature Medicine, 2002, T. 8, Modular flexibility of dystrophin, N 3, C. 253-261.

40. Mendell J.R., Sahenk Z., Lehman K., Nease C., Lowes L.P., Miller N.F., Iammarino M.A., Alfano L.N., Nicholl A., Al-Zaidy S., Lewis S., Church K., Shell R., Cripe L.H., Potter R.A., Griffin D.A., Pozsgai E., Dugar A., Hogan M., Rodino-Klapac L.R. Assessment of Systemic Delivery of rAAVrh74.MHCK7.micro-dystrophin in Children With Duchenne Muscular Dystrophy: A Nonrandomized Controlled Trial//JAMA neurology, 2020, T. 77, Assessment of Systemic Delivery of rAAVrh74.MHCK7.micro-dystrophin in Children With Duchenne Muscular Dystrophy, N 9, C. 1122-1131.

41. Weber T. Anti-AAV Antibodies in AAV Gene Therapy: Current Challenges and Possible Solutions. Anti-AAV Antibodies in AAV Gene Therapy//Frontiers in Immunology, 2021, T. 12, N. 658399. C. 1-5.

42. Li N., Parkes J.E., Spathis R., Morales M., Mcdonald J., Kendra R.M., Ott E.M., Brown K.J., Lawlor M.W., Nagaraju K. The Effect of Immunomodulatory Treatments on Anti-Dystrophin Immune Response After AAV Gene Therapy in Dystrophin Deficient mdx Mice/Journal of Neuromuscular Diseases, 2021, T. 8, N s2, C. S325-S340.

43. Odom G.L., Gregorevic P., Allen J.M., Finn E., Chamberlain J.S. Microutrophin delivery through rAAV6 increases lifespan and improves muscle function in dystrophic dystrophin/utrophin-deficient mice//Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2008, T. 16, N 9, C. 1539-1545.

44. Sun C., Serra C., Lee G., Wagner K.R. Stem cell-based therapies for Duchenne muscular dystrophy//Experimental Neurology, 2020, T. 323, C. 113086.

45. Bouchentouf M., Benabdallah B.F., Mills P., Tremblay J.P. Exercise improves the success of myoblast transplantation in mdx mice//Neuromuscular Disorders, 2006, T. 16, N 8, C. 518-529.

46. Davis D.R. Cell therapy for patients with Duchenne muscular dystrophy//The Lancet, 2022, T. 399, N 10329, C. 1024-1025.

47. Miura Y., Sato M., Kuwahara T., Ebata T., Tabata Y., Sakurai H. Transplantation of human iPSC-derived muscle stem cells in the diaphragm of Duchenne muscular dystrophy model mice//PloS One, 2022, T. 17, N 4, C.e0266391.

48. McDonald C.M., Marban E., Hendrix S., Hogan N., Smith R.R., Rogers R.G., h gp. Repeated intravenous cardiosphere-derived cell therapy in late-stage Duchenne muscular dystrophy (HOPE-2): a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial//The Lancet, 2022, T. 399, Repeated intravenous cardiosphere-derived cell therapy in late-stage Duchenne muscular dystrophy (HOPE-2), N 10329, C. 1049-1058.

49. Tripodi L., Villa C., Molinaro D., Torrente Y., Farini A. The Immune System in Duchenne Muscular Dystrophy Pathogenesis//Biomedicines, 2021, T. 9, N 10, C. 1447.

50. McDonald C.M., Henricson E.K., Abresch R.T., Duong T., Joyce N.C., Hu F., Clemens P.R., Hoffman E.P., Cnaan A., Gordish-Dressman H., et al. Long-term effects of glucocorticoids on function, quality of life, and survival in patients with Duchenne muscular dystrophy: a prospective cohort study//The Lancet, 2018, T. 391, Long-term effects of glucocorticoids on function, quality of life, and survival in patients with Duchenne muscular dystrophy, N 10119, C. 451-461.

51. Nguyen Q., Yokota T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy//Journal of Personalized Medicine, 2017, T. 7, N 4, C. 13.

52. Kabadi A.M., Thakore P.I., Vockley C.M., Ousterout D.G., Gibson T.M., Guilak F., Reddy T.E., Gersbach C.A. Enhanced MyoD-Induced Transdifferentiation to a Myogenic Lineage by Fusion to a Potent Transactivation Domain//ACS Synthetic Biology, 2015, T. 4, N 6, C. 689-699.

53. Ghori F.F., Wahid M. Induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes from Duchenne Muscular Dystrophy patients in vitro//Pakistan Journal of Medical Sciences, 2021, T. 37, N 5, C. 1376-1381.

54. McGreevy J.W., Hakim C.H., McIntosh M.A., Duan D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy//Disease Models & Mechanisms, 2015, T. 8, Animal models of Duchenne muscular dystrophy, N 3, C. 195-213.

55. Wasala N.B., Chen S.-J., Duan D. Duchenne muscular dystrophy animal models for high-throughput drug discovery and precision medicine//Expert Opinion on Drug Discovery, 2020, T. 15, N 4, C. 443-456.

56. Barthélémy I., Calmels N., Weiss R.B., Tiret L., Vulin A., Wein N., Peccate C., Drougard C., Beroud C., Deburgrave N., Thibaud J.-L., Escriou C., Punzón I., Garcia L., Kaplan J.-C., Flanigan K.M., Leturcq F., Blot S. X-linked muscular dystrophy in a Labrador Retriever strain: phenotypic and molecular characterisation//Skeletal Muscle, 2020, T. 10, X-linked muscular dystrophy in a Labrador Retriever strain, N 1, C. 23.

57. Kornegay J.N. The golden retriever model of Duchenne muscular dystrophy//Skeletal Muscle, 2017, T. 7, N 1, C. 9.

58. Nghiem P.P., Bello L., Stoughton W.B., López S.M., Vidal A.H., Hernandez B.V., Hulbert K.N., Gourley T.R., Bettis A.K., Balog-Alvarez C.J., Heath-Barnett H., Kornegay J.N. Changes in Muscle Metabolism are Associated with Phenotypic Variability in Golden Retriever Muscular Dystrophy//The Yale Journal of Biology and Medicine, 2017, T. 90, N 3, C. 351-360.

59. Shimatsu Y., Katagiri K., Furuta T., Nakura M., Tanioka Y., Yuasa K., Tomohiro M., Kornegay J.N., Nonaka I., Takeda S. Canine X-linked muscular dystrophy in Japan (CXMDJ)//Experimental Animals, 2003, T. 52, N 2, C. 93-97.

60. Hildyard J., Rawson F., Harron R., Riddell D., Massey C., Taylor-Brown F., Wells D.J., Piercy R.J. Characterising the skeletal muscle histological phenotype of the DeltaE50-MD dog, a preclinical model of Duchenne muscular dystrophy//Neuromuscular Disorders, 2018, T. 28, C. S18.

61. Walmsley G.L., Arechavala-Gomeza V., Fernandez-Fuente M., Burke M.M., Nagel N., Holder A., Stanley R., Chandler K., Marks S.L., Muntoni F., Shelton G.D., Piercy R.J. A duchenne muscular dystrophy gene hot spot mutation in dystrophin-deficient cavalier king charles spaniels is amenable to exon 51 skipping//PloS One, 2010, T. 5, N 1, C. e8647.

62. Amoasii L., Hildyard J.C.W., Li H., Sanchez-Ortiz E., Mireault A., Caballero D., Harron R., Stathopoulou T.-R., Massey C., Shelton J.M., Bassel-Duby R., Piercy R.J., Olson E.N. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy//Science, 2018, T. 362, N 6410, C. 86-91.

63. Larcher T., Lafoux A., Tesson L., Remy S., Thepenier V., François V., Le Guiner C., Goubin H., Dutilleul M., Guigand L., Toumaniantz G., De Cian A., Boix C., Renaud J.-B., Cherel Y., Giovannangeli C., Concordet J.-P., Anegon I., Huchet C. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy//PloS One, 2014, T. 9, Characterization of dystrophin deficient rats, N 10, C. e110371.

64. Klymiuk N., Blutke A., Graf A., Krause S., Burkhardt K., Wuensch A., Krebs S., Kessler B., Zakhartchenko V., Kurome M., Kemter E., Nagashima H., Schoser B., Herbach N., Blum H., Wanke R., Aartsma-Rus A., Thirion C.,

Lochmüller H., Walter M.C., Wolf E. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle//Human Molecular Genetics, 2013, T. 22, N 21, C. 4368-4382.

65. Bladen C.L., Salgado D., Monges S., Foncuberta M.E., Kekou K., Lochmüller H., h gp. The TREAT-NMD DMD Global Database: analysis of more than 7,000 Duchenne muscular dystrophy mutations//Human Mutation, 2015, T. 36, The TREAT-NMD DMD Global Database, N 4, C. 395-402.

66. Araki E., Nakamura K., Nakao K., Kameya S., Kobayashi O., Nonaka I., Kobayashi T., Katsuki M. Targeted disruption of exon 52 in the mouse dystrophin gene induced muscle degeneration similar to that observed in Duchenne muscular dystrophy//Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, T. 238, N 2, C. 492-497.

67. Aoki Y., Nakamura A., Yokota T., Saito T., Okazawa H., Nagata T., Takeda S. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse//Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2010, T. 18, N 11, C. 1995-2005.

68. Aupy P., Echevarría L., Relizani K., Zarrouki F., Haeberli A., Komisarski M., Tensorer T., Jouvion G., Svinartchouk F., Garcia L., Goyenvalle A. Identifying and Avoiding tcDNA-ASO Sequence-Specific Toxicity for the Development of DMD Exon 51 Skipping Therapy//Molecular Therapy. Nucleic Acids, 2020, T. 19, C. 371-383.

69. Echigoya Y., Nakamura A., Nagata T., Urasawa N., Lim K.R.Q., Trieu N., Panesar D., Kuraoka M., Moulton H.M., Saito T., Aoki Y., Iversen P., Sazani P., Kole R., Maruyama R., Partridge T., Takeda S., Yokota T. Effects of systemic multiexon skipping with peptide-conjugated morpholinos in the heart of a dog model of Duchenne muscular dystrophy//Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, T. 114, N16, C. 4213-4218.

70. Aupy P., Zarrouki F., Sandro Q., Gastaldi C., Buclez P.-O., Mamchaoui K., Garcia L., Vaillend C., Goyenvalle A. Long-Term Efficacy of AAV9-U7snRNA-Mediated Exon 51 Skipping in mdx52 Mice//Molecular Therapy. Methods & Clinical Development, 2020, T. 17, C. 1037-1047.

71. Aoki Y., Yokota T., Wood M.J.A. Development of multiexon skipping antisense oligonucleotide therapy for Duchenne muscular dystrophy//BioMed Research International, 2013, T. 2013, C. 402369.

72. Echigoya Y., Aoki Y., Miskew B., Panesar D., Touznik A., Nagata T., Tanihata J., Nakamura A., Nagaraju K., Yokota T. Long-Term Efficacy of Systemic Multiexon Skipping Targeting Dystrophin Exons 45-55 With a Cocktail of Vivo-Morpholinos in Mdx52 Mice//Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2015, Vol. 4, C. e225.

73. 't Hoen P.A.C., de Meijer E.J., Boer J.M., Vossen R.H.A.M., Turk R., Maatman R.G.H.J., Davies K.E., van Ommen G.-J.B., van Deutekom J.C.T., den Dunnen J.T. Generation and characterization of transgenic mice with the full-length human DMD gene//The Journal of Biological Chemistry, 2008, T. 283, N 9, C. 5899-5907.

74. Goyenvalle A., Wright J., Babbs A., Wilkins V., Garcia L., Davies K.E. Engineering multiple U7snRNA constructs to induce single and multiexon-skipping for Duchenne muscular dystrophy//Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2012, T. 20, N 6, C. 1212-1221.

75. Echigoya Y., Lim K.R.Q., Melo D., Bao B., Trieu N., Mizobe Y., Maruyama R., Mamchaoui K., Tanihata J., Aoki Y., Takeda S., Mouly V., Duddy W., Yokota T. Exons 45-55 Skipping Using Mutation-Tailored Cocktails of Antisense Morpholinos in the DMD Gene//Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2019, T. 27, N 11, C. 2005-2017.

76. Jansen R., Embden J.D.A. van, Gaastra W., Schouls L.M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes//Molecular Microbiology, 2002, T. 43, N 6, C. 1565-1575.

77. Mojica F.J.M., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements/Journal of Molecular Evolution, 2005, T. 60, N 2, C. 174-182.

78. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies//Microbiology, 2005, T. 151, N 3, C. 653-663.

79. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin//Microbiology, 2005, T. 151, N 8, C. 2551-2561.

80. Brouns S.J.J., Jore M.M., Lundgren M., Westra E.R., Slijkhuis R.J.H., Snijders A.P.L., Dickman M.J., Makarova K.S., Koonin E.V., van der Oost J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes//Science (New York, N.Y.), 2008, T. 321, N 5891, C. 960-964.

81. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity//Science (New York, N.Y.), 2012, T. 337, N 6096, C. 816-821.

82. Pawelczak K.S., Gavande N.S., VanderVere-Carozza P.S., Turchi J.J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering//ACS chemical biology, 2018, T. 13, N 2, C. 389-396.

83. Zhang H., Qin C., An C., Zheng X., Wen S., Chen W., Liu X., Lv Z., Yang

P., Xu W., Gao W., Wu Y. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer//Molecular Cancer, 2021, T. 20, N 1, C. 126.

84. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J., Charpentier E., Cheng D., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J.M., Scott D., Shah S.A., Siksnys V., Terns M.P., Venclovas C., White M.F., Yakunin A.F., Yan W., Zhang F., Garrett R.A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E.V. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants//Nature Reviews. Microbiology, 2020, T. 18, Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems, N 2, C. 67-83.

85. Wang F., Wang L., Zou X., Duan S., Li Z., Deng Z., Luo J., Lee S.Y., Chen S. Advances in CRISPR-Cas systems for RNA targeting, tracking and editing//Biotechnology Advances, 2019, T. 37, N 5, C. 708-729.

86. Pinilla-Redondo R., Mayo-Muñoz D., Russel J., Garrett R.A., Randau L., S0rensen S.J., Shah S.A. Type IV CRISPR-Cas systems are highly diverse and involved in competition between plasmids//Nucleic Acids Research, 2020, T. 48, N 4, C. 2000-2012.

87. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems//Science (New York, N.Y.), 2013, T. 339, N 6121, C. 819-823.

88. Mojica F.J.M., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Almendros C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system//Microbiology (Reading, England), 2009, T. 155, N Pt3, C. 733-740.

89. Ran F.A., Cong L., Yan W.X., Scott D.A., Gootenberg J.S., Kriz A.J., Zetsche B., Shalem O., Wu X., Makarova K.S., Koonin E.V., Sharp P.A., Zhang F. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9//Nature, 2015, T. 520, N 7546, C. 186-191.

90. Walton R.T., Christie K.A., Whittaker M.N., Kleinstiver B.P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants//Science (New York, N.Y.), 2020, T. 368, N 6488, C. 290-296.

91. Chen H., Choi J., Bailey S. Cut Site Selection by the Two Nuclease Domains of the Cas9 RNA-guided Endonuclease*//Journal of Biological Chemistry, 2014, T. 289, N 19, C. 13284-13294.

92. Szczelkun M.D., Tikhomirova M.S., Sinkunas T., Gasiunas G., Karvelis T., Pschera P., Siksnys V., Seidel R. Direct observation of R-loop formation by single RNA-guided Cas9 and Cascade effector complexes//Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, T. 111, N 27, C. 9798-9803.

93. Dagdas Y.S., Chen J.S., Sternberg S.H., Doudna J.A., Yildiz A. A

conformational checkpoint between DNA binding and cleavage by CRISPR-Cas9//Science Advances, 2017, T. 3, N 8, C. eaao0027.

94. Shou J., Li J., Liu Y., Wu Q. Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-Mediated Nucleotide Insertion//Molecular Cell, 2018, T. 71, N 4, C. 498-509.e4.

95. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B., Scott D.A., Yan W.X., Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity//Science, 2016, T. 351, N 6268, C. 84-88.

96. Kleinstiver B.P., Pattanayak V., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T., Zheng Z., Joung J.K. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects//Nature, 2016, T. 529, N 7587, C. 490-495.

97. Yang Y., Wang L., Bell P., McMenamin D., He Z., White J., Yu H., Xu C., Morizono H., Musunuru K., Batshaw M.L., Wilson J.M. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice//Nature Biotechnology, 2016, T. 34, N 3, C. 334-338.

98. Ramakrishna S., Dad A.-B.K., Beloor J., Gopalappa R., Lee S.-K., Kim H. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA//Genome Research, 2014, T. 24, N 6, C. 1020-1027.

99. Hendel A., Bak R.O., Clark J.T., Kennedy A.B., Ryan D.E., Roy S., Steinfeld I., Lunstad B.D., Kaiser R.J., Wilkens A.B., Bacchetta R., Tsalenko A., Dellinger D., Bruhn L., Porteus M.H. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells//Nature Biotechnology, 2015, T. 33, N 9, C. 985-989.

100. Yin H., Song C.-Q., Dorkin J.R., Zhu L.J., Li Y., Wu Q., Park A., Yang J., Suresh S., Bizhanova A., Gupta A., Bolukbasi M.F., Walsh S., Bogorad R.L., Gao G., Weng Z., Dong Y., Koteliansky V., Wolfe S.A., Langer R., Xue W., Anderson D.G. Therapeutic genome editing by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system components in vivo//Nature Biotechnology, 2016, T. 34, N 3, C. 328-333.

101. Chang H.H.Y., Pannunzio N.R., Adachi N., Lieber M.R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair//Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 2017, T. 18, N 8, C. 495-506.

102. Mari P.-O., Florea B.I., Persengiev S.P., Verkaik N.S., Brüggenwirth H.T., Modesti M., Giglia-Mari G., Bezstarosti K., Demmers J.A.A., Luider T.M., Houtsmuller A.B., van Gent D.C. Dynamic assembly of end-joining complexes requires interaction between Ku70/80 and XRCC4//Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, T. 103, N 49, C. 18597-18602.

103. Niewolik D., Peter I., Butscher C., Schwarz K. Autoinhibition of the Nuclease ARTEMIS Is Mediated by a Physical Interaction between Its Catalytic and C-terminal Domains//The Journal of Biological Chemistry, 2017, T. 292, N 8, C. 3351-3365.

104. Sfeir A., Symington L.S. Microhomology-Mediated End Joining: A Back-up Survival Mechanism or Dedicated Pathway?//Trends in Biochemical Sciences, 2015, T. 40, Microhomology-Mediated End Joining, N 11, C. 701-714.

105. Ahmad A., Robinson A.R., Duensing A., van Drunen E., Beverloo H.B., Weisberg D.B., Hasty P., Hoeijmakers J.H.J., Niedernhofer L.J. ERCC1-XPF endonuclease facilitates DNA double-strand break repair//Molecular and Cellular Biology, 2008, T. 28, N 16, C. 5082-5092.

106. Shen M.W., Arbab M., Hsu J.Y., Worstell D., Culbertson S.J., Krabbe O., Cassa C.A., Liu D.R., Gifford D.K., Sherwood R.I. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants//Nature, 2018, T. 563, N 7733, C. 646-651.

107. Scully R., Panday A., Elango R., Willis N.A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells//Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 2019, T. 20, N 11, C. 698-714.

108. Peterson S.E., Li Y., Chait B.T., Gottesman M.E., Baer R., Gautier J. Cdk1 uncouples CtIP-dependent resection and Rad51 filament formation during M-phase double-strand break repair//The Journal of Cell Biology, 2011, T. 194, N 5, C. 705-720.

109. Stinson B.M., Moreno A.T., Walter J.C., Loparo J.J. A Mechanism to Minimize Errors during Non-homologous End Joining//Molecular Cell, 2020, T. 77, N 5, C. 1080-1091.e8.

110. Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-Target CRISPR/Cas9 Activity Can Cause Undesigned Large Deletion in Mouse Zygotes//International Journal of Molecular Sciences, 2020, T. 21, N 10, C. 3604.

111. Volobueva A.S., Orekhov A.N., Deykin A.V. An update on the tools for creating transgenic animal models of human diseases - focus on atherosclerosis//Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2019, T. 52. N. 5. C. 1-7.

112. Kouranova E., Forbes K., Zhao G., Warren J., Bartels A., Wu Y., Cui X. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos//Human Gene Therapy, 2016, T. 27, CRISPRs for Optimal Targeting, N 6, C. 464-475.

113. Lino C.A., Harper J.C., Carney J.P., Timlin J.A. Delivering CRISPR: a

review of the challenges and approaches//Drug Delivery, 2018, T. 25, Delivering CRISPR, N 1, C. 1234-1257.

114. Zhang X., Li T., Ou J., Huang J., Liang P. Homology-based repair induced by CRISPR-Cas nucleases in mammalian embryo genome editing//Protein & Cell, 2022, T. 13, N 5, C. 316-335.

115. Raveux A., Vandormael-Pournin S., Cohen-Tannoudji M. Optimization of the production of knock-in alleles by CRISPR/Cas9 microinjection into the mouse zygote//Scientific Reports, 2017, T. 7, N 1, C. 42661.

116. Lim K.R.Q., Nguyen Q., Dzierlega K., Huang Y., Yokota T. CRISPR-Generated Animal Models of Duchenne Muscular Dystrophy//Genes, 2020, T. 11, N 3, C. 342.

117. Min Y.-L., Li H., Rodriguez-Caycedo C., Mireault A.A., Huang J., Shelton J.M., McAnally J.R., Amoasii L., Mammen P.P.A., Bassel-Duby R., Olson E.N. CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells//Science Advances, 2019, T. 5, N 3, C. eaav4324.

118. Min Y.-L., Chemello F., Li H., Rodriguez-Caycedo C., Sanchez-Ortiz E., Mireault A.A., McAnally J.R., Shelton J.M., Zhang Y., Bassel-Duby R., Olson E.N. Correction of Three Prominent Mutations in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy by Single-Cut Genome Editing//Molecular Therapy, 2020, T. 28, N 9, C. 2044-2055.

119. Wong T.W.Y., Ahmed A., Yang G., Maino E., Steiman S., Hyatt E., Chan P., Lindsay K., Wong N., Golebiowski D., Schneider J., Delgado-Olguin P., Ivakine E.A., Cohn R.D. A novel mouse model of Duchenne muscular dystrophy carrying a multi-exonic Dmd deletion exhibits progressive muscular dystrophy and early-onset cardiomyopathy//Disease Models & Mechanisms, 2020, T. 13, N 9, C. dmm045369.

120. Flanigan K.M., Dunn D.M., von Niederhausern A., Soltanzadeh P., Gappmaier E., Howard M.T., Sampson J.B., Mendell J.R., Wall C., King W.M., Pestronk A., Florence J.M., Connolly A.M., Mathews K.D., Stephan C.M., Laubenthal K.S., Wong B.L., Morehart P.J., Meyer A., Finkel R.S., Bonnemann C.G., Medne L., Day J.W., Dalton J.C., Margolis M.K., Hinton V.J., United Dystrophinopathy Project Consortium, Weiss R.B. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort//Human Mutation, 2009, T. 30, Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients, N 12, C. 1657-1666.

121. Vulin A., Wein N., Simmons T.R., Rutherford A.M., Findlay A.R., Yurkoski J.A., Kaminoh Y., Flanigan K.M. The first exon duplication mouse model of Duchenne muscular dystrophy: A tool for therapeutic development//Neuromuscular disorders: NMD, 2015, T. 25, The first exon

duplication mouse model of Duchenne muscular dystrophy, N 11, C. 827-834.

122. Wein N., Simmons T., Gumienny F., Huang N., Heller K., Yurkoski J., Rodino-Klapac L., Muntoni F., Flanigan K. A single neonatal injection of an AAV9.U7snRNA virus mediating skipping of dmd exon 2 allows dystrophin expression preventing apparition of pathologic features in the Dup2 mouse one year post injection//Neuromuscular Disorders, 2017, T. 27, C. S187.

123. Sugihara H., Kimura K., Yamanouchi K., Teramoto N., Okano T., Daimon M., Morita H., Takenaka K., Shiga T., Tanihata J., Aoki Y., Inoue-Nagamura T., Yotsuyanagi H., Komuro I. Age-Dependent Echocardiography and Pathologic Findings in a Rat Model with Duchenne Muscular Dystrophy Generated by CRISPR/Cas9 Genome Editing//International Heart Journal, 2020, T. 61, N 6, C. 1279-1284.

124. Teramoto N., Sugihara H., Yamanouchi K., Nakamura K., Kimura K., Okano T., Shiga T., Shirakawa T., Matsuo M., Nagata T., Daimon M., Matsuwaki T., Nishihara M. Pathological evaluation of rats carrying in-frame mutations in the dystrophin gene: A new model of Becker muscular dystrophy//Disease Models & Mechanisms, 2020, Pathological evaluation of rats carrying in-frame mutations in the dystrophin gene, C. dmm.044701.

125. Yu H.-H., Zhao H., Qing Y.-B., Pan W.-R., JiaB.-Y., Zhao H.-Y., Huang X.-X., Wei H.-J. Porcine Zygote Injection with Cas9/sgRNA Results in DMD-Modified Pig with Muscle Dystrophy//International Journal of Molecular Sciences, 2016, T. 17, N 10, C. E1668.

126. Sui T., Lau Y.S., Liu D., Liu T., Xu L., Gao Y., Lai L., Li Z., Han R. A novel rabbit model of Duchenne muscular dystrophy generated by CRISPR/Cas9//Disease Models & Mechanisms, 2018, T. 11, N 6, C. dmm032201.

127. Oh H.J., Chung E., Kim J., Kim M.J., Kim G.A., Lee S.H., Ra K., Eom K., Park S., Chae J.-H., Kim J.-S., Lee B.C. Generation of a Dystrophin Mutant in Dog by Nuclear Transfer Using CRISPR/Cas9-Mediated Somatic Cells: A Preliminary Study//International Journal of Molecular Sciences, 2022, T. 23, Generation of a Dystrophin Mutant in Dog by Nuclear Transfer Using CRISPR/Cas9-Mediated Somatic Cells, N 5, C. 2898.

128. Erkut E., Yokota T. CRISPR Therapeutics for Duchenne Muscular Dystrophy//International Journal of Molecular Sciences, 2022, T. 23, N 3, C.1832.

129. Domenig S.A., Bundschuh N., Lenardic A., Ghosh A., Kim I., Qabrati X., D'Hulst G., Bar-Nur O. CRISPR/Cas9 editing of directly reprogrammed myogenic progenitors restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy//Stem Cell Reports, 2022, T. 17, N 2, C. 321-336.

130. Philippidis A. Brother of Cure Rare Disease CEO Dies in Trial of Duchenne Muscular Dystrophy Therapy//Human Gene Therapy, 2022, T. 33, N 23-24, C. 1224-1227.

131. Hakim C.H., Kumar S.R.P., Pérez-Lopez D.O., Wasala N.B., Zhang D., Yue Y., Teixeira J., Pan X., Zhang K., Million E.D., Nelson C.E., Metzger S., Han J., Louderman J.A., Schmidt F., Feng F., Grimm D., Smith B.F., Yao G., Yang N.N., Gersbach C.A., Chen S., Herzog R.W., Duan D. Cas9-specific immune responses compromise local and systemic AAV CRISPR therapy in multiple dystrophic canine models//Nature Communications, 2021, T. 12, N 1, C. 6769.

132. Amoasii L., Long C., Li H., Mireault A.A., Shelton J.M., Sanchez-Ortiz E., McAnally J.R., Bhattacharyya S., Schmidt F., Grimm D., Hauschka S.D., Bassel-Duby R., Olson E.N. Single-cut genome editing restores dystrophin expression in a new mouse model of muscular dystrophy//Science Translational Medicine, 2017, T. 9, N 418, C. eaan8081.

133. Wei T., Cheng Q., Min Y.-L., Olson E.N., Siegwart D.J. Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins for effective tissue specific genome editing//Nature Communications, 2020, T. 11, N 1, C. 3232.

134. Long C., Li H., Tiburcy M., Rodriguez-Caycedo C., Kyrychenko V., Zhou H., Zhang Y., Min Y.-L., Shelton J.M., Mammen P.P.A., Liaw N.Y., Zimmermann W.-H., Bassel-Duby R., Schneider J.W., Olson E.N. Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing//Science Advances, 2018, T. 4, N 1, C. eaap9004.

135. Maino E., Wojtal D., Evagelou S.L., Farheen A., Wong T.W.Y., Lindsay K., Scott O., Rizvi S.Z., Hyatt E., Rok M., Visuvanathan S., Chiodo A., Schneeweiss M., Ivakine E.A., Cohn R.D. Targeted genome editing in vivo corrects a Dmd duplication restoring wild-type dystrophin expression//EMBO Molecular Medicine, 2021, T. 13, N 5, C. 1-15.

136. Moretti A., Fonteyne L., Giesert F., Hoppmann P., Meier A.B., Bozoglu T., Baehr A., Schneider C.M., Sinnecker D., Klett K., Fröhlich T., Rahman F.A., Haufe T., Sun S., Jurisch V., Kessler B., Hinkel R., Dirschinger R., Martens E., Jilek C., Graf A., Krebs S., Santamaria G., Kurome M., Zakhartchenko V., Campbell B., Voelse K., Wolf A., Ziegler T., Reichert S., Lee S., Flenkenthaler F., Dorn T., Jeremias I., Blum H., Dendorfer A., Schnieke A., Krause S., Walter M.C., Klymiuk N., Laugwitz K.L., Wolf E., Wurst W., Kupatt C. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy//Nature Medicine, 2020, T. 26, N 2, C. 207-214.

137. Young C.S., Mokhonova E., Quinonez M., Pyle A.D., Spencer M.J. Creation of a Novel Humanized Dystrophic Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy and Application of a CRISPR/Cas9 Gene Editing Therapy//Journal of Neuromuscular Diseases, 2017, T. 4, N 2, C. 139-145.

138. Duchene B.L., Cherif K., Iyombe-Engembe J.-P., Guyon A., Rousseau J., Ouellet D.L., Barbeau X., Lague P., Tremblay J.P. CRISPR-Induced Deletion with SaCas9 Restores Dystrophin Expression in Dystrophic Models In Vitro and In Vivo//Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2018, T. 26, N 11, C. 2604-2616.

139. Maggio I., Stefanucci L., Janssen J.M., Liu J., Chen X., Mouly V., Gon5alves M.A.F.V. Selection-free gene repair after adenoviral vector transduction of designer nucleases: rescue of dystrophin synthesis in DMD muscle cell populations//Nucleic Acids Research, 2016, T. 44, Selection-free gene repair after adenoviral vector transduction of designer nucleases, N 3, C. 1449-1470.

140. Chen M., Shi H., Gou S., Wang X., Li L., Jin Q., Wu H., Zhang H., Li Y., Wang L., Li H., Lin J., Guo W., Jiang Z., Yang X., Xu A., Zhu Y., Zhang C., Lai L., Li X. In vivo genome editing in mouse restores dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy patient muscle fibers//Genome Medicine, 2021, T. 13, N 1, C. 57.

141. Bengtsson N.E., Hall J.K., Odom G.L., Phelps M.P., Andrus C.R., Hawkins R.D., Hauschka S.D., Chamberlain J.R., Chamberlain J.S. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy//Nature Communications, 2017, T. 8, N 1, C. 14454.

142. Pickar-Oliver A., Gough V., Bohning J.D., Liu S., Robinson-Hamm J.N., Daniels H., Majoros W.H., Devlin G., Asokan A., Gersbach C.A. Full-length dystrophin restoration via targeted exon integration by AAV-CRISPR in a humanized mouse model of Duchenne muscular dystrophy//Molecular Therapy, 2021, T. 29, N 11, C. 3243-3257.

143. Kim K., Ryu S.-M., Kim S.-T., Baek G., Kim D., Lim K., Chung E., Kim S., Kim J.-S. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos//Nature Biotechnology, 2017, T. 35, N 5, C. 435-437.

144. Ryu S.-M., Koo T., Kim K., Lim K., Baek G., Kim S.-T., Kim H.S., Kim D., Lee H., Chung E., Kim J.-S. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy//Nature Biotechnology, 2018, T. 36, N 6, C. 536-539.

145. Im W. Differential expression of dystrophin isoforms in strains of mdx mice with different mutations//Human Molecular Genetics, 1996, T. 5, N 8, C. 1149-1153.

146. Xu L., Zhang C., Li H., Wang P., Gao Y., Mokadam N.A., Ma J., Arnold W.D., Han R. Efficient precise in vivo base editing in adult dystrophic mice//Nature Communications, 2021, T. 12, N 1, C. 3719.

147. Chemello F., Wang Z., Li H., McAnally J.R., Liu N., Bassel-Duby R.,

Olson E.N. Degenerative and regenerative pathways underlying Duchenne muscular dystrophy revealed by single-nucleus RNA sequencing//Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2020, T. 117, N 47, C. 29691-29701.

148. Chemello F., Chai A.C., Li H., Rodriguez-Caycedo C., Sanchez-Ortiz E., Atmanli A., Mireault A.A., Liu N., Bassel-Duby R., Olson E.N. Precise correction of Duchenne muscular dystrophy exon deletion mutations by base and prime editing//Science Advances, 2021, T. 7, N 18, C. eabg4910.

149. Koo T., Lu-Nguyen N.B., Malerba A., Kim E., Kim D., Cappellari O., Cho H.-Y., Dickson G., Popplewell L., Kim J.-S. Functional Rescue of Dystrophin Deficiency in Mice Caused by Frameshift Mutations Using Campylobacter jejuni Cas9//Molecular Therapy, 2018, T. 26, N 6, C. 1529-1538.

150. Zhang Y., Long C., Li H., McAnally J.R., Baskin K.K., Shelton J.M., Bassel-Duby R., Olson E.N. CRISPR-Cpf1 correction of muscular dystrophy mutations in human cardiomyocytes and mice//Science Advances, 2017, T. 3, N 4, C.e1602814.

151. Nelson C.E., Hakim C.H., Ousterout D.G., Thakore P.I., Moreb E.A., Rivera R.M.C., Madhavan S., Pan X., Ran F.A., Yan W.X., Asokan A., Zhang F., Duan D., Gersbach C.A. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy//Science, 2016, T. 351, N6271, C. 403-407.

152. Li C., Samulski R.J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy//Nature Reviews. Genetics, 2020, T. 21, N 4, C. 255-272.

153. Hastie E., Samulski R.J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-- a personal perspective//Human Gene Therapy, 2015, T. 26, Adeno-associated virus at 50, N 5, C. 257-265.

154. Galibert L., Hyvonen A., Eriksson R.A.E., Mattola S., Aho V., Salminen S., Albers J.D., Peltola S.K., Weman S., Nieminen T., Yla-Herttuala S., Lesch H.P., Vihinen-Ranta M., Airenne K.J. Functional roles of the membrane-associated AAV protein MAAP//Scientific Reports, 2021, T. 11, N 1, C. 21698.

155. Large E.E., Silveria M.A., Zane G.M., Weerakoon O., Chapman M.S. Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Delivery: Dissecting Molecular Interactions upon Cell Entry//Viruses, 2021, T. 13, Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Delivery, N 7, C. 1336.

156. Crudele J.M., Chamberlain J.S. AAV-based gene therapies for the muscular dystrophies//Human Molecular Genetics, 2019, T. 28, N R1, C. R102-R107.

157. Tabebordbar M., Lagerborg K.A., Stanton A., King E.M., Ye S., Tellez

L., Krunnfusz A., Tavakoli S., Widrick J.J., Messemer K.A., Troiano E.C., Moghadaszadeh B., Peacker B.L., Leacock K.A., Horwitz N., Beggs A.H., Wagers A.J., Sabeti P.C. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species//Cell, 2021, T. 184, N 19, C. 4919-4938.e22.

158. Kupatt C., Windisch A., Moretti A., Wolf E., Wurst W., Walter M.C. Genome editing for Duchenne muscular dystrophy: a glimpse of the future?//Gene Therapy, 2021, T. 28, Genome editing for Duchenne muscular dystrophy, N 9,

C. 542-548.

159. Labun K., Montague T.G., Gagnon J.A., Thyme S.B., Valen E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering//Nucleic Acids Research, 2016, T. 44, N W1, C. W272-W276.

160. Starikova A.V., Skopenkova V.V., Polikarpova A.V., Reshetov D.A., Vassilieva S.G., Velyaev O.A., Shmidt A.A., Savchenko I.M., Soldatov V.O., Egorova T.V., Bardina M.V. Therapeutic potential of highly functional codon-optimized microutrophin for muscle-specific expression//Scientific Reports, 2022, T. 12, N 1, C. 848.

161. Sakurai T., Kamiyoshi A., Watanabe S., Sato M., Shindo T. Rapid zygosity determination in mice by SYBR Green real-time genomic PCR of a crude DNA solution//Transgenic Research, 2008, T. 17, N 1, C. 149-155.

162. Heigwer F., Kerr G., Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification//Nature Methods, 2014, T. 11, N 2, C. 122-123.

163. Brinkman E.K., Chen T., Amendola M., van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition//Nucleic Acids Research, 2014, T. 42, N 22, C. e168-e168.

164. Bloh K., Kanchana R., Bialk P., Banas K., Zhang Z., Yoo B.-C., Kmiec E.B. Deconvolution of Complex DNA Repair (DECODR): Establishing a Novel Deconvolution Algorithm for Comprehensive Analysis of CRISPR-Edited Sanger Sequencing Data//The CRISPR Journal, 2021, T. 4, N 1, C. 120-131.

165. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden C., Saalfeld S., Schmid B., Tinevez J.-Y., White

D.J., Hartenstein V., Eliceiri K., Tomancak P., Cardona A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis//Nature Methods, 2012, T. 9, N 7, C. 676-682.

166. Wang X., Zhao H., Ni J., Pan J., Hua H., Wang Y. Identification of suitable reference genes for gene expression studies in rat skeletal muscle following sciatic nerve crush injury//Molecular Medicine Reports, 2019. T. 19, C. 4377-4387.

167. Aartsma-Rus A., van Putten M. Assessing Functional Performance in the

Mdx Mouse Model/Journal of Visualized Experiments, 2014, N 85, C. 51303.

168. Burkholder T.J., Fingado B., Baron S., Lieber R.L. Relationship between muscle fiber types and sizes and muscle architectural properties in the mouse hindlimb//Journal of Morphology, 1994, T. 221, N 2, C. 177-190.

169. Slaoui M., Bauchet A.-L., Fiette L. Tissue Sampling and Processing for Histopathology Evaluation//Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2017, T. 1641, C. 101-114.

170. Chamberlain J.S., Metzger J., Reyes M., Townsend D., Faulkner J.A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma//The FASEB Journal, 2007, T. 21, N 9, C. 2195-2204.

171. Shen H., Strunks G.D., Klemann B.J.P.M., Hooykaas P.J.J., de Pater S. CRISPR/Cas9-Induced Double-Strand Break Repair in Arabidopsis Nonhomologous End-Joining Mutants//G3 (Bethesda, Md.), 2017, T. 7, N 1, C. 193-202.

172. Hollywood J.A., Lee C.M., Scallan M.F., Harrison P.T. Analysis of gene repair tracts from Cas9/gRNA double-stranded breaks in the human CFTR gene//Scientific Reports, 2016, T. 6, C. 32230.

173. Aartsma-Rus A., Fokkema I., Verschuuren J., Ginjaar I., van Deutekom J., van Ommen G.-J., den Dunnen J.T. Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy mutations//Human Mutation, 2009, T. 30, N 3, C. 293-299.

174. Nelson C.E., Wu Y., Gemberling M.P., Oliver M.L., Waller M.A., Bohning J.D., Robinson-Hamm J.N., Bulaklak K., Castellanos Rivera R.M., Collier J.H., Asokan A., Gersbach C.A. Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy//Nature Medicine, 2019, T. 25, N 3, C. 427-432.

175. Singh S.M., Kongari N., Cabello-Villegas J., Mallela K.M.G. Missense mutations in dystrophin that trigger muscular dystrophy decrease protein stability and lead to cross-ß aggregates//Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, T. 107, N 34, C. 15069-15074.

176. Talsness D.M., Belanto J.J., Ervasti J.M. Disease-proportional proteasomal degradation of missense dystrophins//Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, T 112, N 40, C. 12414-12419.

177. Kyrychenko V., Kyrychenko S., Tiburcy M., Shelton J.M., Long C., Schneider J.W., Zimmermann W.-H., Bassel-Duby R., Olson E.N. Functional correction of dystrophin actin binding domain mutations by genome editing//JCI Insight, 2017, T. 2, N 18, C. e95918.

178. Echigoya Y., Lim K.R.Q., Trieu N., Bao B., Miskew Nichols B., Vila M.C., Novak J.S., Hara Y., Lee J., Touznik A., Mamchaoui K., Aoki Y., Takeda S., Nagaraju K., Mouly V., Maruyama R., Duddy W., Yokota T. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy//Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2017, T. 25, N 11, C. 2561-2572.

179. Ousterout D.G., Kabadi A.M., Thakore P.I., Majoros W.H., Reddy T.E., Gersbach C.A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy//Nature Communications, 2015, T. 6, N 1, C. 6244.

180. Marchal G.A., van Putten M., Verkerk A.O., Casini S., Putker K., van Amersfoorth S.C.M., Aartsma-Rus A., Lodder E.M., Remme C.A. Low human dystrophin levels prevent cardiac electrophysiological and structural remodelling in a Duchenne mouse model//Scientific Reports, 2021, T. 11, N 1, C. 9779.

181. Egorova T., Reshetov D., Polikarpova A., Vassilieva S., Vlodavets D., Deikin A. DMD TREATMENT: ANIMAL MODELS//Neuromuscular Disorders, 2018, T. 28, DMD TREATMENT, C. S94.

182. Egorova T.V., Polikarpova A.V., Vassilieva S.G., Dzhenkova M.A., Savchenko I.M., Velyaev O.A., Shmidt A.A., Soldatov V.O., Pokrovskii M.V., Deykin A.V., Bardina M.V. CRISPR-Cas9 correction in the DMD mouse model is accompanied by upregulation of Dp71f protein//Molecular Therapy. Methods & Clinical Development, 2023, T. 30, C. 161-180.

+T7EI PC -T7EI

1и0 ^ 1 1000 я

's

200 в мо«

100 100 **

моим* ?4 ?& ?й 30 3? 35 до 59 6] 6! 64 66 68 73 r4 85 моиьея 92 95 101 юг t + к

с И

>

(Л

Mouson 24 25 26 J8 30 32 35 40 59 62 63 64 66 68 73 &4 85 92 95 101 107 К

Моим-» 26 28 30 31 15 40 59 Ь2 6] 64 66 68 73 «4 85 9? 95 "" "

Рисунок П1. Анализ сайтов не специфического узнавания гидами sg30 (А) и sg31 (Б) с помощью T7EI теста. Образцы, подвергнутые действию T7EI отмечены горизонтальной чертой. К- образец от контрольной мыши дикого типа. "+" - контрольный образец, представляющий собой смесь ампликонов с однонуклеотидной заменой и без в соотношении 1:1. "-" - контрольный образец не содержащий замен.

А. ТАЗ ипсбс Ртп2

Л«АСЛАГ«ЛбеТ«ССЛСИеТЛСТЛвТТТвМ6ТАТТ4.Т^ТТС< Т АСТЬТбТСССТССС АСАСТАА ТАйСТ ТВАЬС ААСААСТТСТА *ТТТСТС*СТ6ТТйОА А ТАСТ А ОТ АОТТТОТвСОАСССТ* АА А

к МУшУММУУ 11.. 1 \bj\lilb- 1Ш. иШШ1Ш

64 Ш1ШШШ2 Н ■ . 1 ЦиШжМ Щ

73 'Л'Д'/ ЪлШ* иЛ 1 л

95 ' ?! г 1 л , ) 1'л И ТДО Млш

101 Л 1 'А

Шт тшшижшШмы,

¿шь- ТШ

№Л>ШЦ1\Л

шШШы

107

Б. Ше12 Эк^б Зидр2

Т Ак>Ь Т Т СААСС£С6&А ЬА с СС ЛАСАСЛ Т Т а а 1С ТйС ААСйС А Т (;■ ГТСС ТТАС АА <СТ Т А Т [ Т(П ССС ТС 7С«С667 С Г АА АСССА С IС А С й IСТС ТТ 7 ТС Т 0А 7 (Ю й ГС ГГС йСМ» С Т СI ТС 10А

I | Л

Рисунок П2. Результаты секвенирования ампликонов потенциальных сайтов неспецифического узнавания гидами sg31 (А) и sg30 (Б). К- образец от контрольной мыши дикого типа.

145

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Таблица П3. Последовательности праймеров и проб, использованных в работе.

Название Последовательность, 5'-3'

SgR AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTG ATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAG СТСТААААС

Sg30F GAAATTAATACGACTCACTATAGGTGATCTGTTGG GTCTTCGGTTTTAGAGCTAGAAATA

Sg31F GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGGCAGACTA GTAGTTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Sg32F GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCAGTCAAC ACTTCAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Sg33F GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGACATATCC TTAGGCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Sg34F GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAAAGACTCG GCAGTTAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Sg35F GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGCAGGG GAGTCATTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

LbF GCGTTTCATTCACTTTCTGGATGTG

LbR AGTCACTTTAGGTGGCCTTGG

RbF GCCAAGAGTTGCCTGAGAGGAAC

RbR TGACAGTGAATAGTGACTCCAATGGC

Dmd_mus_sg3 0_fw ACTATTGTGGAACACAGCATACA

Dmd_mus_sg3 0_rev GAGAGAAAAGAGGCAGACTGTAG

Dmd_mus_sg31_fw TCAAACAAAAGGCAGAAGAGTAAG

Dmd_mus_sg31_rev GGTCCAAAGTAGGCCTCGTA

Dmd_mus_sg32_fw AGGCACATATAGTCAAGTTCAGTCA

Dmd_mus_sg32_rev TGCCATTCTGATCCTATTCATTTCC

Dmd_mus_sg33_fw GTTCTACTCTAAAACATCAGAGGCT

Dmd_mus_sg33_rev ACACATAGGACACATTCATGCAG

Dmd_mus_sg34_fw CAGTGCCCCACACACATACA

Dmd_mus_sg34_rev AGCAAAAGTTATTTTAGGGCATACT

Dmd_mus_sg3 5_fw CAGAGGTACTGGCATTTGGAAC

Dmd_mus_sg3 5_rev AAGTGGTATCCCCTTCTGCC

Tet_vF TTGTTCTCTCCTCTGACTGC

Tet_vR TGATTGATCAAATAGGCCTGC

DMD5inSaSg1F CACCGGTCAAAGATTGAAATGATAGA

DMD5inSaSg1R AAACTCTATCATTTCAATCTTTGACC

DMD5inSaSg2F CACCGCCAAATGTCAGGAGTGCTTGG

DMD5inSaSg2R AAACCCAAGCACTCCTGACATTTGGC

DMD5inSaSg3F CACCGCTAACAGGGTAATGATGAATA

DMD5inSaSg3R AAACTATTCATCATTACCCTGTTAGC

DMD34inSaSg1F CACCGGCCTGTCCTGCTGTGGTTCTA

DMD34inSaSg1R AAACTAGAACCACAGCAGGACAGGCC

DMD34inSaSg2F CACCGTAGGCTGTCTAGACTCCATCCC

DMD34inSaSg2R AAACGGGATGGAGTCTAGACAGCCTAC

DMD34inSaSg3F CACCGCTATATTACATTATGAAATGGA

DMD34inSaSg3R AAACTCCATTTCATAATGTAATATAGC

Fwd ITR GGAACCCCTAGTGATGGAGTT

Rev ITR CGGCCTCAGTGAGCGA

ITR-ROX ROX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ2

Grid2_fw TCATATTATGGAGACCCCAACCA

Grid2_rev GTGGCCAAGCAACTCCTTTT

Skint5_fw AAAGGGGACACCTGCTTCTG

Skint5_rev GCCTACCTGGCTGTTTCAAGG

Sugp2_fw GAGCCATCTAAACGGCTGTC

Sugp2_rev GCTCCATGACAGGTAGGACT

Tff3_fw TGCAGAGGTTTGAAGCACCA

Tff3_rev CCTGATGGCCAAGGGATGTT

Unc5c_fw GGGACTGGGTGTTTTTGCCT

Unc5c rev TCTCTGCCTCACTGTCACCT

Fmn2 fw GGGCTCGTAGGGGTTCTTTAG

Fmn2_rev GGCTAATGGGTACATGGTCTC

dmd_mus_sg 1 _fw AGTTTACAACCAAACATCAACCC

tet1_vF TTGTTCTCTCCTCTGACTGC

tet1_vR TGATTGATCAAATAGGCCTGC

Dmd mus g5in2F GTGGAGGGACCAGAGGTGTA

Dmd mus g5in3F ATCCACAAACCCCCACAAGG

Dmd mus g5in3R CCCAATGCGAATCCCACCTA

Dmd mus g34in2F TCAAACAAAAGGCAGAAGAGTAAG

Dmd mus g34in2R GAGAGAAAAGAGGCAGACTGTAG

Dmd mus g34in3R AGCAAAAGTTATTTTAGGGCATACT

g5in3_OT1_450Rev GCTTCCCCCACACCTGACTACA

g5in3_OT1_450Fw TGGTAACACAGAGCCCAAAAGACA

g5in3_OT2_257Rev AAAGTGGAAGCAGACAACGGGC

g5in3_OT2_257Fw ACCTCCAGGAGGAAAGCAAGCA

g5in3_OT3_564Rev TCCGTCCAGAGGAGTCATTGGT

g5in3_OT3_564Fw AGGCTTTGAAATGCATGAAAGCA

g5in3_OT4_507Rev AGCCCTGCCTAGGATCTGCCTA

g5in3_OT4_507Fw CCTCCTGGAGTCTGGCACTCTC

g5in3_OT5_500Rev ACAGCCAGGAGTGCGGTCTTAA

g5in3_OT5_500Fw TGTAGAACAGGGCAGGCCTCTG

g34in2_OT 1 _3 57Rev GGAGAGGAAGGAGGGAAGGAAGG

g34in2_OT1_357Fw TGTATGCAGAACCCACCCAGCT

g34in2_OT2_393Rev CACAAACCCGAGGAGTCTCCCA

g34in2_OT2_393Fw CCTGCTTCTGTTTGTGTGCCCA

g34in2_OT3_484Fw TGGAAATGCTGGGAGGCCTTCT

g34in2_OT3_484Rev TCCATCTGGTTCAGCCAAGGCT

g34in2_OT4_397Rev GGTGGTTGTGAGTCACCGTGTG

g34in2_OT4_397Fw TTGGAGGGAGGCCAAGTGTCTC

g34in2_OT5_465Fw TTAGGCCTTGCATCTGCTCCCA

g34in2_OT5_465Rev ACTGAAGCAGGGGCTCCATGAA

Mm_dmd_142F AATGTCAACAAGGCACTGCG

Mm_dmd_ex3 7R2 TGGTCACCGCGGTTTGCCAT

Mm_dmd_ex5/35F TCCTCCACTGGCAGGCTACTC

Mm_dmd_187F AGGGCAAAAACTGCCAAAAGA

Mm_dmd_ex5-81R TCCATCCACTATGTCAGTGCT

RPL13A_F CAACGGACTCCTGGTGTGAA

RPL13A_R GTGCGCTGTCAGCTCTCTAA

RPL13A-FAM FAM - AAAGACTGTTTGCCTCATGCCTGC - BHQ1

Ap3d1_F GCCCAGCGTGTGGACATTAT

Ap3d1_R GCCAGGGGTTTATCCAGGTC

Ap3a1-ROX ROX-CACTGAGGAGATGCCAGAGAATGCTT-BHQ2

Csnk2a2 F GGAGCTTGGGCTGCATGTTA

Csnk2a2_R CCCAGAACCTTGGCAATTCG

Csnk2a2-VIC VIC-TTCCACGGGCAGGACAACTATGAC-BHQ1

149

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность научному руководителю Алексею Васильевичу Дейкину за профессиональную поддержку, помощь в планировании исследований и интерпретации полученных результатов. Автор признателен каждому члену коллектива лаборатории Моделирования и терапии наследственных заболеваний ИБГ РАН, в особенности заведующей лабораторией Марьяне Владимировне Бардиной за создание рабочей атмосферы, ценные советы и продуктивные научные дискуссии. За помощь в выполнении экспериментов автор особенно благодарит Светлану Геннадьевну Васильеву, Анну Вадимовну Поликарпову, Олега Андреевича Веляева, Марину Александровну Дженкову, Ирину Михайловну Савченко. Отдельная благодарность сотрудникам Центра коллективного пользования ИБГ РАН за помощь в получении и поддержании новой линии мышей. Автор благодарит пациента с миодистрофией Дюшенна, его родителей и лечащих врачей, в частности Ященко Ивана Валериевича и Влодавца Дмитрия Владимировича за предоставление биологического материала, информации и согласия на проведение исследований. Огромная признательность семье и друзьям за неоценимую поддержку и опору в процессе выполнения работы и написания диссертации.