Применение спектрофотометрии для диагностики лейкоза крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Божко, Сергей Петрович

• Божко, Сергей Петрович
• кандидат ветеринарных наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Божко, Сергей Петрович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Сущность лейкоза крупного рогатого скота

1.2. Источники, пути и факторы, способствующие

распространению гемобластозов

крупного рогатого скота

1.3 Гематологический метод диагностики лейкоза

крупного рогатого скота

1.4 конформационные изменения крови

под влиянием различного микроокружения

1.5 Влияние температуры на физико-химические

свойства водных растворов гемоглобина крови

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

2.2. Разработка методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики лейкоза

2.2.1. Подбор оптимальных разведений гемолизата крови крупного рогатого скота для спектрофотометрии

2.2.2. Показатели коэффициентов поглощения спектра гемолизата крови от РИД - позитивных и

больных лейкозом коров

2.2.3. Сравнительное изучение спектров гемолизата крови

коров при лейкозе и маститах разных форм

2.2.4. Изучение влияния времени и разных температур на результаты исследования проб крови от

РИД - позитивных и больных лейкозом животных

2.3. Сравнительная оценка эффективности традиционного и предлагаемого методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота

в хозяйствах Омской области

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение спектрофотометрии для диагностики лейкоза крупного рогатого скота»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Лейкоз является одной из наиболее распространенных инфекционных болезней крупного рогатого скота. Изучению эпизоотической ситуации по данной болезни в разных регионах России, в том числе и в областях Западной Сибири, посвящено значительное число публикаций (А.Ф. Валихов, В.П. Шишков, Л.Г. Бурба 1980; В.М. Нахман-сон, 1986; П.Н. Смирнов, 1989, 1991, 1996; А.Т. Левашов, 1994; А.Г. Неза-витин, 1995; В.И. Околелов, Ю.С. Притужалов, 1995; B.C. Федоров, 1996 и

ДР-)-

С момента открытия вируса лейкоза крупного рогатого скота (Miller J. et al., 1969) и до настоящего времени получено довольно много данных, касающихся характеристики возбудителя: по морфологии, биохимии, кон-тагиозности и другим свойствам (Л.Г. Бурба, 1977; В.Г. Шишков, 1979; В.А. Бусол, 1982; В.М. Нахмансон, 1986; П.Н. Смирнов, 1987; Г.Ф. Коро-мыслов, 1989; В.В. Смирнова, 1992 и др.). Разработаны и апробированы клинико-морфологические и иммунологические методы диагностики, в том числе реакция иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле, которая включена в методические рекомендации по диагностики лейкоза крупного рогатого скота (1985), радиоиммунный (РИА) и иммунофлюоресцентный (МФА) анализ (K.M. Jacobson et al, 1985; 1988; В.Г. Арутюнян, 1992; A.B. Киселев 1992; D.R. Monke et al., 1992).

В настоящее время широко применяется гематологический метод диагностики лейкоза, включающий в себя несколько этапов: подсчет лейкоцитов в камере Горяева, изготовление мазков крови, их окраска и дифференциальный подсчет лимфоцитов, выведение лейкоформулы по «лейкоз-ному ключу». Данный метод диагностики лейкоза крупного рогатого скота требует от врача - гематолога определенных знаний и навыков, все манипуляции довольно продолжительны. К этому следует добавить, что пока еще недостаточно полно изучены вопросы, касающиеся качественного из-

менения в составе крови крупного рогатого скота при развитии лейкоза и их оценки. Поэтому возникает необходимость в накоплении информации об изменениях как морфологического, так и химического, иммунобиологического статуса клеток под влиянием патогенных факторов (Г.Ф. Коро-мыслов, 1976; A.B. Чучунов, 1993; А.Г. Незавитин, 1994; И.М. Донник, 1995, 1997 и др.).

Данные последних лет показали, что в патогенезе лейкоза существует стадия, когда комплекс «антиген + антитело» сорбируется на поверхности эритроцита и затем разносится в кроветворные органы (красный костный мозг, печень), где происходит воздействие на стволовые клетки, В - лимфоциты. Имеются также публикации, в которых раскрывается природа и прочность связей в гемопротеиде, зависящих от действия ряда факторов: гомеостаза, температуры, давления, pH среды, интенсивности солнечного света и УФ излучения (М. Петуц, 1966; Б.Ф. Сухомлинов, 1972; О.М. Пол-торак, Е.С. Чухрай, 1971; M.F. Pezutz, 1976; Л.А. Блюменфельд, 1977; Г.А. Харбури, Р.Г. Маркс, 1978; Д.М. Рифкинд, 1978).

Молекулы гемопротеидов служат удобными модельными системами для биофизических исследований: в области фотофизики и фотохимии гемоглобина, изменений энергии между гемом и глобином, взаимовлияний изменений структурного, электронного состояния, а так же фотозащитных и фотосенсибилизирующих эффектов гемопротеидов (Ю.А. Владимиров, 1965; К. Смит, Ф. Хонсуолт, 1972; O.A. Азизова, 1975; И.Д. Волотовский, 1979; K.M. Львов, 1979; Д.И. Дошулкин, 1979; И.И. Сапежский, 1988; Н.Л. Векшин, 1988; Ю.А. Владимиров, А .Я. Потапенко, 1989; В.Г. Артюхов, 1995).

Одним из важных вопросов, связанным с выяснением механизмов повреждений Q-связывательных способностей гемосодержащих белков в условиях развития острых и хронических инфекционных заболеваний, ведущих к изменению в составе крови, является качественное и количествен-

ное взаимодействие иммунных и ферментных комплексов с эритроцитами. В связи с этим возникает необходимость установления достоверной закономерности конформационых изменений, возникающих в структурах гемоглобина при развитии лейкоза у крупного рогатого скота. Осуществление таких исследований возможно при наличии современных спектрофо-тометрических приборов.

Тема диссертационной работы вошла самостоятельным разделом в комплексную тему Института ветеринарной медицины ОмГАУ и имеет номер государственной регистрации 01.83.0057603

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить оптимальные условия подготовки гемолизата для проведения спектрофотометрических исследований;

- выявить зависимость между коэффициентами поглощения интенсивности излучения световых волн длинной от 264 до 610 нм в гемолизате РИД - позитивных и больных лейкозом коров;

- изучить влияние сроков исследования и разных температур на показатели крови животных при спектрофотометрии;

- провести сравнительную оценку эффективности спектрофотометри-ческого и традиционного гематологического методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области.

Научная новизна. На базе спектрофотометрических исследований гемолизата крупного рогатого скота разработаны методологические подходы к новому гематологическому методу диагностики лейкоза животных. Выявлена положительная корреляция между коэффициентами поглощения светового излучения в гемолизате крови от РИД - позитивных и больных

лейкозом коров. Проведена сравнительная оценка традиционного и предлагаемого методов по выявлению больных лейкозом крупного рогатого скота в экспериментальных и производственных условиях. За счет изменения объекта исследования - гемолизата вместо клеток крови, стало возможным проводить исследования в течение 96 часов при хранении проб крови в интервале температур от +10 °С до + 20 °С и до 3 месяцев при температуре от - 6 °С до - 18°С.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая ценность работы заключается в том, что расшифрованы молекулярно-клеточные механизмы изменений, происходящие в эритроцитах РИД-позитивного и больного лейкозом крупного рогатого скота. Выявлены различия коэффициентов поглощения световых волн гемолизатов в спектрах при фотометрии с учетом влияния температуры и срока хранения проб крови на физико-химические свойства водных растворов гемоглобина.

Практическая значимость работы состоит в том, что изысканы методологические подходы использования спектрофотометрии, позволившие предложить новый метод экспресс - диагностики лейкоза крупного рогатого скота, который дает возможность качественно, с высокой достоверностью за счет автоматизации процесса исследований с помощью ПЭВМ ставить диагноз на данное заболевание.

На защиту выносится:

1. Экспериментальное обоснование нового гематологического метода (спектрофотометрический) диагностики лейкоза коров.

2. Сравнительная оценка эффективности традиционного и разработанного гематологического метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на научно-практической конференции в ОмГАУ (г. Омск 1997); на научно-практической конференции, посвященной 80 - летию ОмГАУ (г. Омск. 1998); на заседании кафедры эпизоотологии инфекционных болезней с.-х. животных ИВМ ОмГАУ (1998); на ученом совете ВНИИБТЖ (г. Омск 1998).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 3 научные работы и подана заявка на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 8-ю таблицами, 7-ю рисунками и одной схемой. Список литературы включает 178 источников, в том числе 51 зарубежных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Сущность лейкоза крупного рогатого скота

Учение о лейкозе связано с именем Рудольфа Вирхова, известного немецкого морфолога, который в 1845 г. впервые описал болезнь у человека и выделил ее в самостоятельную нозологическую единицу под названием "лейкемия". Несколько позднее появились сообщения по лейкозу животных.

Первый случай лейкемии у животных описал патологоанатом Дрезденского ветеринарного института Ье1зепп§ в 1858 году. О. 81ес1апщго12к1 в 1871 г. сделал сообщение о лейкозе у свиней и собак, а в 1878 г. он же впервые описал лейкоз у крупного рогатого скота. И. Добберштейн в 1958 г. отметил, что лейкозом болеют 29 видов животных и 15 видов домашних и диких птиц. В процессе изучения эту болезнь называли по разному - белокровие, лейкемия, рак крови, лейкоз, гемобластоз.

В. Эллерман в 1921 г. предложил заменить название заболевания "Лейкемия" термином "Лейкоз", который более полно характеризовал патологический процесс, развивающийся в кроветворной ткани, независимо от изменений, наблюдаемых в периферической крови.

В 1953 г. X. X. Владос, Н. А. Краевский и другие исследователи предложили новое название болезни "гемобластозы", так как при лейкозе наблюдали гиперплазию клеток кроветворной и лимфоидной тканей с развитием злокачественных опухолей.

Веские доказательства в пользу вирусной этиологии лейкоза были получены в 1969 г. Дженисом Миллером с сотрудниками, которые обнаружили в культурах лимфоцитов периферической крови больных лейкозом коров большое количество зрелых вирусных частиц типа С и описали его морфологию. Поддержали мнение о вирусной этиологии данной болезни: L. D. Miller, С. Olson, (1972); В. П. Шишков, (1979); Р. А. Кукайн, Р. В. Свирска, М. Ф. Моровская, А. Г. Татосян, Ф. JI. Киселев, (1982) и др.

Согласно современной классификации, вирус лейкоза крупного рогатого скота, принадлежит к семейству Retroviridae, подсемейству Onkoviridae. Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота относится к группе онкогенных РНК-содержащих вирусов, обладает тропизмом к лим-фоидным клеткам и размножается в них. Основным биохимическим признаком для всех представителей семейства Retroviridae является наличие в вирионе обратной транскриптазы. В состав подсемейства Onkoviridae входит три рода: вирусы С, В и Д.

Значительный вклад в изучение этиологии лейкоза крупного рогатого скота внесли: R. Rademacher., A.Tesar, J. Hafman, (1971); M. Mammerickx, (1972); P. А. Кукайн, JI. И. Нагаев, С. В. Чапенко, (1973); В. М. Жданов, М. И. Парфанович, (1974); D. А. Abt, R. R. Marshak, J. F. Ferrer, G. E. Piper, D. M. Bhatt, (1976); В. M. Жданов, M. И. Парфанович, Э. M. Ныым, (1978); Р. А. Кукайн, Л. И. Нагаев, С. В. Чапенко, (1979).

Вирусы типа С, выделенные от млекопитающих, составляют две самостоятельные группы: вирусы мышей, крыс, хомяков, кошек, норок, свиней, обезьян и вирус лейкоза крупного рогатого скота (R. J. Huebner, G. J. Todaro, 1969; R. J. Huebner, G. J. Todaro, 1969; M. К. Тамаускас, 1971; L. D. Miller, J. M. Miller, C. Olson, 1972; В. M. Жданов, М. И. Парфанович, 1974; Н. Е. Hoss, С. Olson, 1974; Л. А. Зильбер, И. С. Ирлин, Ф. Л. Киселев,

___ л.

1975; Л. Г. Бурба, 1979), для овец (Н. Е. Hoss, С. Olson, 1974; А. Е. Пракин,

Л. Ф. Силкин, Н. Н. Котляров, 1981; J. М. Diashop, 1982) и коз (М. Mammerickx, D. Portetelle, A. Burny, 1981; С. А. Мурватулоев, 1998).

Зрелый вирион ВЛКРС имеет эллипсовидную форму и состоит из центрально-расположенного нуклеоида, диаметр которого варьирует от 40 до 90 нм, что связано с методом фиксации и обработки препарата. Центральная часть нуклеоида отделена от внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. Внешняя вирусная оболочка представлена двухконтур-ной мембраной, отличающейся лабильностью. На поверхности внешней оболочки выявляют выросты длиной 8-11 нм (П. Виттман, П. Венкер, 1977).

В краткосрочных культурах лимфоцитов вирус располагается в виде скоплений вне клеток, окруженных клеточным детритом. Внутриклеточный вирус локализуется в цитоплазматических вакуолях. Размножается путем почкования от цитоплазматических мембран через 10 часов после начала культивирования лимфоцитов. Формирование вирионов осуществляется в гиалоплазме у клеточной поверхности или на концах клеточных отростков (R. J. Huebner, G. J. Todaro, 1969; А. М. Temin, D. Baltimore, 1972; P. А. Кукайн, P. В. Свирска, M. Ф. Моровская, А. Г. Татосян, Ф. Л. Киселев, 1982; R. Doolittle, M. Hunkapilir, L. Heod, S. Devare, S. Ranonson, H. Antoniades, 1983). Вирусные белки вириона ВЛКРС, вызывающие иммунологический ответ макроорганизма, подразделяются на две основные группы: гликолизированные (поверхностные, оболочечные белки), в состав которых входит углеводный компонент (гликопротеид - гп 51 и гп 30) и негликолизированные полипептиды. Основным вирусным протеином является белок с молекулярной массой 24000 дальтон, который реагирует в реакциях иммунодиффузии, иммунофлюоресценции и связывания комплемента с сыворотками животных, больных лейкозом.

Устойчивость вируса во внешней среде невысокая. Нагревание до 74 °С убивает его через 20 секунд. В клеточных культурах при нагревании до

60 °С вирус погибает через минуту. При низкой температуре и глубоком замораживании жизнеспособность вируса сохраняется. Он чувствителен к дезосредствам, быстро обезвреживается 2-3% растворами едкого натра, формальдегида и другими дезинфицирующими веществами в общепринятых концентрациях (В. М. Жданов, М. И. Парфанович, Э. М. Ныым, 1978; В. М. Нахмансон, 1986).

В соответствии с методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота от 1989 г., в зависимости от характера распространения опухолевых клеток лейкоз классифицируют на две группы опухолей - системные и опухолевые. Первая отличается системностью поражения кроветворной и лимфоидной тканей с вовлечением в процесс костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и включает: лимфоидный, миелоидный лейкозы и злокачественный гистиоцитоз. Болезни второй группы: лимфосаркома, плазмоцитома, ретикулосаркома и лимфогранулематоз характеризуются первичным поражением лимфоидной ткани (лимфатические узлы, селезенка). Опухоли, состоящие из клеточных элементов, природу которых пока трудно установить, относят к числу недифференцированных лейкозов, или недифференцированных лимфом.

После проникновения вируса в здоровый организм, он внедряется в субпопуляцию В-лимфоцитов. Геном возбудителя интегрируется с геном лимфоцита, вирус не является патогенным для клетки. Происходит репродукция вируса и выделение вирионов из клетки путем почкования от клеточной мембраны и отделением от лимфоидной клетки в межклеточное пространство. Лимфоидные клетки могут передавать геном вируса дочерним клеткам во время деления лимфоцита. Передача вируса из клетки в клетку может происходить и без продуцирования вирионов. Через 3-8 недель после заражения животных в сыворотке крови появляются антитела против ВЛКРС (L. D. Miller, J. М. Miller, С. Olson 1972; В. М. Жданов, М. И. Парфанович 1974; В. П. Шишков; Л. Г. Бурба 1979; А. Ф. Валихов, В. П.

Шишков, JI. Г. Бурба 1980; А. П. Мазуренко; А. П. Мазуренко 1981; Р. А. Кукайн, Р. В. Свирска, М. Ф. Моровская, А. Г. Татосян, Ф. Л. Киселев 1982; R. Doolittle, М. Hunkapilir, L. Heod, S. Devare, S. Ranonson, H. Anto-niades 1983; В. П. Шишков 1985).

По данным P. Ф. Аверкина (1956); Г. И. Абелева (1970, 1974), перси-стентный лимфоцитоз характеризуется бесконтрольной пролиферацией и увеличением в крови B-лимфоцитов. Эта субпопуляция B-лимфоцитов составляет 40-80% от общей популяции лимфоцитов. Тогда как у РИД -позитивных животных B-лимфоциты составляют 15-20%. В-лимфоциты при персистентном лимфоцитозе представляют собой моноклональные опухолевые клетки. Инициаторами клеточных механизмов противоопухолевой защиты являются Т-лимфоциты. В стадии лимфоцитоза их количество и функциональная активность резко снижается. У больных лейкозом коров отмечено увеличение в циркулирующей крови числа ДНК-синтезирующих клеток. Развитие большинства форм гемобластозов, особенно в опухолевой стадии лейкозного процесса, сопровождается гипоаль-буминемией и гипергаммаглобулинемией.

Экспериментально это было подтверждено рядом ученых (С. Olson, L. Miller, J. Miller, H. Hoss, 1972; A. M. Шиков, В. А. Андриян, P. H. Ава-несов, 1977; P. А. Кукайн, Л. И. Нагаев, С. В. Чапенко, 1979; X. С. Сали-мов, В. А. Крикун, 1985). Опухолевая трансформация кроветворных клеток при лейкозе крупного рогатого скота представляет собой сложный процесс, проявляющийся изменениями на молекулярном, субклеточном, клеточном уровнях, который обусловливается вирусным, генетическим и иммунологическим факторами (С. С. Muscoplat, J. Alhajl, D. W. Johnson, K. A.Pomery, J. M. Olson, V. L. Larson, J. B. Stevens, D. K. Sorensen, 1974 ; B. Б. Бронштейн, M. H. Данилова, 1982; П. H. Смирнов, 1983; Л. Г. Бурба, А. Н. Федорченко, 1984; В. И. Ефимов, А. А. Дрингляне, П. Б. Садаускас, 1984; В. В. Федоров, 1984). Нарушение гуморального иммунитета при лей-

козе крупного рогатого скота, приводит к нарушению способности антите-лообразования (В. А. Мартынова, Е. М. Абакумов, М. Г. Севастьянова, 1975). Наличие в крови специфических антител способно проявлять не только цитотоксическое, но и блокирующее действие, оказывая тем самым эффект утомления опухолевого роста (Ю. А. Уманский, 1974). Это подтверждает то, что лейкоз ассоциирован с иммунологическим дефектом (В. М. Бергольц, Н. С. Кисляк, В. С. Еремеев, 1974).

С учетом своевременного уровня знаний об этиопатогенезе целесообразно называть последовательные периоды течения лейкоза: инкубационный период, бессимптомную, клинико-гематологическую и опухолевую стадию проявления болезни.

Продолжительность инкубационного периода, по данным В. Б. Бронштейн, М. Н. Данилов, (1982); П. Н. Смирнов, (1983); Л. Г. Бурба, А. Н. Федорченко, (1984), при экспериментальном заражении может быть 814 суток, в естественных условиях - 60-90 и более суток. Бессимптомная стадия при лейкозе определяется временем обнаружения антител ВЛКРС до появления гематологических изменений, характерных для начала развития патологического процесса. Животных, находящихся в этой стадии, определяют при помощи серологических или вирусологических исследований. Состояние антителоносительства ВЛКРС не вызывает у животных видимых физиологических или патологических отклонений. Этот период может длиться от нескольких месяцев до 3-х и более лет (Л. Г. Бурба, А. Н. Федорченко, 1984). Период клиническо-гематологического проявления болезни характеризуется гематологическими изменениями и клиническими признаками. Гематологические изменения могут протекать на алейкемиче-ском, суб- и лейкемических уровнях (В. М. Нахмансон, 1986). Алейкеми-ческая картина крови устанавливается по процентному содержанию лимфоцитов, обычно протекает без изменений общего количества лейкоцитов. У животных с сублейкемической картиной крови отмечают постепенное

нарастание количества лейкоцитов (до 40 тыс. в единице объема крови) с преобладанием лимфоидных форм. Лейкемическая фаза характеризуется гиперлейкоцитозом (более 40 тыс. в 1 мкл) и повышением содержания в лейкоцитарной формуле молодых малодифференцированных клеток. Аналогичные данные опубликованы в работах Л. Г. Бурба и А. Н. Федорченко, (1984).

Клинические признаки при лейкозе не всегда характерны и проявляются чаще у животных 4 -7-летнего возраста. Наиболее характерным признаком является увеличение поверхностных и внутренних лимфатических узлов. Иногда в области шеи или голодных ямок могут быть увеличены подкожные лимфатические узлы (В. М. Жданов, М. И. Парфанович, 1974).

Патологоанатомические изменения при лейкозе обычно проявляются у животных, находящихся в опухолевой стадии болезни и характеризуются очаговыми, диффузными патологическими разростами клеток кроветворной ткани в гемопоэтических и других органах и образованием опухолей или увеличением органов в объеме при диффузной пролиферации клеток. При вскрытии трупов и послеубойной экспертизе туш и органов отмечают симметричное увеличение лимфатических узлов, которые у отдельных животных достигают размеров 16 х 6 см. (предлопаточные), 12 х 7 (коленной складки), 20 х 10 см (надвыменные). При лимфолейкозе они увеличены равномерно, не сращены с окружающими тканями, капсула снимается легко, на разрезе узлы серо-белого цвета, сочные и саловидные (В. В. Смирнова, 1984).

Селезенка, по данным ряда авторов (И. Гламба, 3. Букене, К. Яну-шаускас, 1970; В. А. Буссол, 1973; А. Ф. Валихов, В. П. Шишков, Л. Г. Бурба, 1980; П. Н. Смирнов, 1983; В. В. Смирнова, 1984) увеличена при всех случаях системного лейкоза и в 40 - 60% случаев лимфогранулематоза. Значительное увеличение селезенки наблюдается при лимфоидном и

миелоидном лейкозах. Иногда она достигает размеров 100x29x10 см. и массой до 20-30 и даже до 50 кг. В начальной стадии структура органа сохранена. Края селезенки закруглены, капсула гладкая, блестящая, напряженная, фолликулы гиперплазированы. При всех формах лейкоза исследователи отмечали очаговые или диффузные разрастания серо-белого или серо-розового цвета в печени, почках, в толще сердечной мышцы, органах пищеварения (в т.ч. в 90% случаев отмечают патологоанатомические изменения в сычуге), матке, скелетной мускулатуре, диафрагме и других органах.

Гистологические изменения при лимфоидном лейкозе характеризуются диффузной пролиферацией в селезенке клеток лимфоидного ряда, в лимфатических узлах - гиперплазией фолликулов. При миелоидном лейкозе в селезенке и костном мозге обнаруживают незрелые элементы грану-лоцитарного ряда. В лимфатических узлах, печени, почках и других органах очаговые, диффузные разрастания миелоидных элементов. При лим-фосаркоме в лимфоузлах, органах пищеварения, сердечной, скелетной мышцах и др. органах и тканях отмечают разрастание опухолей из недифференцированных и слабо дифференцированных клеток лимфоидного ряда, при этом селезенка и костный мозг не изменены. При лимфогранул'ома-тозе выявляют изменения опухолевого и воспалительного характера, гиперплазию лимфоидных клеток, нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов (В. В. Смирнова, 1991).

У зараженных ВЛКРС животных через 3-8 недель после проникновения возбудителя в организм в сыворотке крови обнаруживают антитела. В крови животного ВЛКРС и противовирусные антитела персистируют в течение нескольких лет. Установлено, что В-лимфоциты, продуцирующие антитела не содержат антигенов вируса лейкоза. Антитела к гликопроте-идному антигену ВЛКРС обладают вируснейтрализующими свойствами, подкласс этих антител связан с цитолитической активностью (В. М. Жда-

нов, М. И. Парфанович, 1974; С. М. Федорова, Т. М. Виль, Т. П. Сторжи-лова. 1982; В. И. Ефимов, А. А. Дрингляне, П. Б. Садаускас, 1984; В. М. Нахмансон, 1986).

Телята, родившиеся от серопозитивных коров, в подавляющем большинстве являются свободными от ВЛКРС. У таких телят, после скармливания им молозива матери, развивается пассивный иммунитет, обусловленный антителами против вируса лейкоза, приобретенными с молозивом коров-матерей. Пассивный иммунитет в течение нескольких месяцев предохраняет телят от заражения ВЛКРС (Л. К. Эрнст, П. Г. Клабу-ков, Д. В. Карликов, 1973; А. Р. Слепченко, 3. Ф. Радугина, О. А. Трофимова, 1976; В. П. Шишков, 1986, В. М. Нахмансон, 1986).

Изложенные данные свидетельствуют о существовании связи генетической предрасположенности, уровня иммунологической реактивности с гематологическими и клиническими проявлениями болезни.

1.2. Источники, пути и факторы способствующие распространению лейкоза крупного рогатого скота

Распространение гемобластозов крупного рогатого скота необходимо рассматривать не только по данным клинико-гематологическим и пато-логоанатомической диагностики, но и важно учитывать результаты серологических исследований. Результаты, как в нашей стране, так и за рубежом показывают широкое распространение лейкоза крупного рогатого скота. Так, с помощью специального анализа в Германии ежегодно у 10,000 голов крупного рогатого скота устанавливают опухолевое проявление лейкоза (К. М1еШ, Н. 8ЬМег, 1971^. ^УШтапп, А. ЫеЬгтапп, 1980).

В Венгрии лейкоз регистрируется в южной части страны и имеет в настоящее время стабильную тенденцию распространения (V. НогуаЛ, Ь. гБак, 1979).

В Дании, в результате проведения комплекса оздоровительных мероприятий число случаев заболеваний заметно сократилось (J. Flensuburg, В. Streyffert, 1977).

В Канаде, в среднем, ежегодно выявляют 1000 случаев лейкозного процесса у крупного рогатого скота (G. Mikalauskiene, N. Dikiniene N, М. Makricas, V. Tamosinas, 1984).

В Англии лейкоз крупного рогатого скота относят к наиболее распространенным злокачественным заболеваниям (L. J. Anderson, N. W. Jarre, Е. W. A. Drighton, 1969).

Литературные сообщения свидетельствуют о том, что лейкоз крупного рогатого скота получил значительное распространение в Польше (Т. Przytulski, 1976; М. Grundboeck, J. Grundboeck-Insko, 1982), Чехословакии и Румынии (R. Rademacher, A. Tesar, J. Hafman. A. Krans, 1971), Италии (F. Montemagne, V. Paparella, G. Catellni, 1957), Турции (F. Hakioglu, 1964), Франции (С. Lombard, 1968), CILLA (G. Mikalauskiene, N. Dikiniene, M. Makricas, V. Tamosinas, 1984; W. Wittmann, A. Liebrmann, 1980) и других странах мира.

В России изучению эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота посвящено много работ (П. В. Филатова, 1965; В. М. На-хмансон, 1972; Н. F. Бочарников, А. Т. Шабалов, Л. Г. Бурба, В. М. На-хмансон, 1974; П. В. Филатов, Л. А. Князева, В. Г. Баранов, 1975; А. А. Кунаков, А. М. Никитенко, 1977; А. Т. Шиков, А. Ф. Бабкин, С. И. Луто-хин, 1980). По данным П. В. Филатова, Л. А. Князева, В. Г. Баранова, (1975), А. А. Кунакова, А. М. Никитенко, (1977), гемобластозы крупного рогатого скота регистрируются на территории Украины, Белоруссии. Наиболее широкое распространение лейкоз крупного рогатого скота получил в прибалтийских государствах. Так, в Эстонии в 12 хозяйствах у 0,4 - 13 % животных гематологическими методами диагностируется лейкоз (Т. И. Лахт, Э. М. Ныым, 1982). В среднем по прибалтийским государствам серо-

логическими исследованиями крупного рогатого скота в РИД было выявлено от 64 % до 70 % положительно реагирующих животных (X. Т. Аарт, 1978; В. Л.Иванов, 1972).

В Белоруссии по данным В. А. Бусол (1983), во всех исследуемых хозяйствах у животных выявляли от 0 - 14 % до 0 - 28 % случаев антитело-носительства к полипептидному антигену.

В Узбекистане самый низкий процент вирусоносительства крупного рогатого скота 2,8 % - 6 %, выявляется в хозяйствах Андижанской области, а самый высокий 11,0 % - 18 % в Ферганской области (X. С. Салимов, В. А. Крикун, 1985).

С. Я. Логановский, О. К. Пиедниекс, В. Я. Мозгис, Л. Г. Чернобаева, (1982) провели сравнительные серологические и гематологические исследования животных в хозяйствах с различной степенью поражения лейкозом. Наибольшее распространение ВЛКРС-инфекция получила в зоне Нечерноземья.

Г. Ф. Коромыслов, Н. М. Климов, И. И. Яременко, Г. Л. Коромысло-ва, (1979), В. А. Крикун, В. Т. Кумков, Л. И. Нагаева, (1979), проводили серологические исследования сыворотки крови крупного рогатого скота на лейкоз, выявили 13 -53 % животных антителоносителей к ВЛКРС.

А. Т. Шиков, А .Ф. Бабкин, С. И. Лутохин, (1980) в своих публикациях свидетельствует о том, что в хозяйствах неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота выявляются до 25 % совпадений клинико-гемато-логического и серологического диагноза.

А. Ф. Валихов, (1977) при исследовании крупного рогатого скота в центральных районах России на лейкоз обнаружил вирусоносительство у 57 % взрослых коров. Гематологические изменения выявлены при этом у 20 % инфицированных животных.

Лейкоз крупного рогатого скота получил широкое распространение в районах Западной и Восточной Сибири. По результатам П. Н. Смирнова,

(1983), В. В. Смирновой, (1984) в районах Западной Сибири в неблагополучных по лейкозу стадах выявляется от 26 % до 40 % коров - онковирусо-носителей. Вероятно, распространения гемобластозов крупного рогатого скота в Западной Сибири, как и в других зонах нашей страны, обусловлены влиянием целого ряда различных качественных и количественных экзо - и эндогенных факторов. Нет достаточно четких данных о распространении лейкоза крупного рогатого скота в южных областях России.

Для развития лейкозного процесса необходимо действие как вируса лейкоза крупного рогатого скота, так и других экзо - и эндогенных факторов (В. М. Нахмансон, 1986). У крупного рогатого скота ведущим фактором, влияющим на злокачественную трансформацию клеток, является иммунологическое состояние организма и генетическая предрасположенность животного (В. П. Шишков, 1986).

Некоторые авторы выделяют территориальную предрасположенность заболевания (В. В. Смирнова, 1984). Необходимо анализировать не только отдельные причины, приводящие к заболеванию, но и тесное взаимодействие совокупных причин (С. М. Федорова, Т. М. Виль, Т. П. Сто-ржилова, 1982). Особое место отводится кормлению и содержанию животных (Н. Н. Доронин, В. А. Бусол, Г. X. Субаев, 1976; В. М. Лемеш, В. П. Лучко, 1979; В. Ф. Поляков, В. С. Егоров, И. И. Баранов, 1987; Кп^ег, 1984).

По мнению большинства исследователей кормление животных не является эпизоотологически значимым фактором, хотя и может играть способствующую роль в возникновении и распространении болезни.

Есть противоречия в результатах, касающихся роли почвенных факторов. Так, Н. В. Румянцев, X. С. Салимов, В. А. Буссол В. А. Крикун, (1985), не отмечают определенной зависимости между ландшафтно-географическими особенностями и частотой заболевания крупного рогато-

го скота. Такое же мнение имеет еще ряд ученых (В. М. Ярчук, 1972; Н. Н. Доронин, В. А. Бусол, Г. X. Субаев, 1976; В. М. Лемеш, В. П. Лучко, 1979).

Противоположное мнение высказывают следующие ученые: В. М. Велик и соавт. (1983) которые находят зависимость между повышенным содержанием в почве магния, нитратов и нитритов в воде и наибольшим распространением лейкоза.

Противоречивы такие мнения о зависимости между продуктивностью животных и восприимчивостью к лейкозу (В. М. Нахмансон, 1971). Одни ученые считают, что между такими показателями как удой, жирность молока и заболеваемость лейкозом имеется прямая связь (Э. Я. Яунслей-кис, Р. О. Гримберг, 1974; В. Я. Дескене, К. Я. Кяуне, П. А. Сороковой, А. М. Машурова, 1978). Другие, напротив считают что лейкозом заболевают все животные, независимо от молочной продуктивности (П. В. Филатов, 1965; F. W. Schmidt, 1970; П. В. Филатов, Л. А. Князева, В . Г. Баранов, 1975). По данным этих ученых, больных лейкозом среди высокомолочных животных было в 5 раз больше. Данного мнения придерживается Л. К. Эрнст, П. Г. Клабуков, Д. В. Карликов, (1973) и другие (Э. О. Альбере, 1958).

Поражение животных помесных пород лейкозом отмечается чаще, чем беспородных животных (Е. Wierner, 1967; М. Mammerickx, 1972). Дальнейшее изучение данного вопроса позволило сделать вывод о том, что заболеванию лейкозом подвержен скот черно-пестрой, красно-степной, галштино-фризской породы (Э. М. Ныым, 1970; М. К. Тамаускас, 1971; Л. Г. Бурба, В. Ф. Валиханов, Г. А. Надточей, Б. И. Сурин, 1976; Т. П. Кудрявцева, 1977; В. М. Нахмансон, 1986).

Широкие исследования проведены и по выяснению роли быков-производителей в распространении лейкоза. Большинство авторов считают возможным передачу вируса лейкоза крупного рогатого скота со спермой (А. Ф. Валихов, В. П. Шишков, Л. Г. Бурба, 1980; В. М. Нахмансон, 1986).

Передача быками-производителями потомству наследственной предрасположенности к лейкозу доказана генетическим анализом, проведенным на большом поголовье крупного рогатого скота (И. Гламба, 3. Букене, К. Янушаускасю, 1970; В. А. Бусол, 1973; Л. К. Эрнст, П. Г. Клабуков, Д. В. Карликов, 1973; С. В. Федорова, Т. М. Виль, Т. П. Сторжилова, 1982; В. М. Нахмансон, 1986).

Изучением влияния роли коров-матерей в передаче потомству предрасположенности к лейкозу занимались А. С. Емельянов, К. А. Смолина, Г. К. Сметанина, (1967). Авторы пришли к выводу, что устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу определяется одним доминантным геном и заболевают животные, несущие его рецессивные алели (Л. Г. Бурба, В. Ф. Валиханов, Г. А. Надточей, Б. И. Сурин, 1976).

В литературе опубликованы данные о проявлении лейкозной патологии у животных в зависимости не только от возраста (Н. Н. Доронин, В. А. Бусол, Г. X. Субаев, 1976; А. Ф. Валихов, В. П. Шишков, Л. Г. Бурба, 1980; В. В. Федоров, 1984), но и роли химических агентов бластомогенной природы (В. А. Сахно, 1981), радиоактивного излучения (С. М. Федорова, А. В. Стельмах, Т. П. Сторожилова, Т. М. Виль, Е. М. Прохорова, 1978; И. М. Донник, 1997), плотности и величины стад животных (Э. М. Ныым, 1970), хронических инфекций парралельно протекающих с лейкозом (Э. М. Ныым, 1970, В. М. Лемеш, В. П. Лучко, 1979).

Таким образом, отечественными и зарубежными учеными, применяющими в своих работах иммунологические, серологические и патомор-фологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота, были показаны особенности распространения этого заболевания в разных кли-матогеографических и территориальных зонах таких стран, как Россия, США, Канада, Чехословакия, Румыния, Польша, Бельгия, Италия, Франция, Дания, Англия и других.

Многие авторы обращают внимание на неравномерное распространение болезни. Особенности распространения выражаются приуроченностью не только к определенным зонам, но и к отдельным хозяйствам.

Успех в борьбе с гемобластозами крупного рогатого скота определяется в своевременном выявлении больных и инфицированных животных; для этого недостаточно использовать только существующие серологические и гематологические методы диагностики, необходимо разрабатывать новые.

1.3 Гематологический метод диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Заболевание развивается постепенно и незаметно. По мере прогрес-сирования, в зависимости от локализации и степени поражения органов, появляются разнообразные клинические симптомы. Многочисленность пораженных животных лейкозом стало основанием для разработки гематологических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Периферическая кровь отражает многие патологические процессы, протекающие в организме. R. Götze и соавт. (1954) установили, что при лейкозе увеличение количества лейкоцитов в большинстве своем происходит за счет лимфоцитов. Ими была создана схема лейкоза крупного рогатого скота, названная "лейкозным ключом" Гетце. Сущность ее заключается в оценке двух показателей крови: количества лейкоцитов в 1 мкл крови и процента лимфоидных клеток в лейкоцитарной формуле. Авторы предлагали свою схему для постановки диагноза по стаду. При этом они не рекомендовали применять лейкозный ключ для больных в опухолевой стадии болезни.

За время, прошедшее после разработки "лейкозного ключа" Гетце, многими исследователями внесены существенные изменения. Так, Н. Bendixen (1960) и G. Wihquist (1961) предложили диагностировать лейкоз

по абсолютному количеству лимфоцитов в 1 мкл крови. Данный метод предусматривал определение количественных показателей лимфоцитов, характерных для РИД - позитивных, подозрительных и лейкозных животных. Основываясь на принципе подсчета абсолютного количества лимфоцитов в 1 мкл крови, во многих странах были созданы "лейкозные ключи": метод Розенбергера (1961), геттингенский ФРГ (1965), чешский (1970), вустерхаузенский (1970) и др. В 1965 г. разработан отечественный метод. В 1989 г. он был включен в инструкцию о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Этот метод основан на подсчете абсолютного количества лимфоцитов в 1 мкл крови. Учитывая большую вариабельность гематологических показателей молодняка, М. 8ее1етапп и др. (1963) считали, что данный метод можно применять только для взрослых животных. О. ТЬеНеп и соавт. (1961), исследуя кровь здоровых животных в возрасте от 2 до 17 лет, не установили повышенного количества лимфоцитов, характерного для подозрительных или больных животных.

Совершенствование отечественного гематологического метода проводилось путем изучения крови крупного рогатого скота различных пород в различных природно-климатических зонах страны, изменений показателей крови при физиологических и патологических состояниях организма. Результаты проведенных исследований позволили Л. Г. Бурба, А. Ф. Вали-ханову и соавт. (1976) разработать более совершенный "лейкозный ключ", чем он был ранее.

Его отличие в том, что абсолютное количество лимфоцитов в 1 мкл крови определяют путем умножения количества лейкоцитов на процент лимфоцитов в лейкоформуле. Данный "лейкозный ключ" включен в стандарт СЭВ "Методы лабораторной диагностики лейкозов крупного рогатого скота", используемый при импорте и экспорте животных и в Государственный стандарт СССР "Крупный рогатый скот, методы лабораторной диагностики лейкозов" (ГОСТ 25382 - 82). С помощью таких методов не уда-

ется обнаружить случаи с лейкопеническим и алейкопеническим проявлением болезни. Так, М. 8ее1етапп и др. (1964) ставят под сомнение существование лейкоза с алейкопеническим количеством лейкоцитов в крови. Лейкоз с алейкопеническим составом крови Г. Розенберг (1979) наблюдал в 5 - 10 %, а Э. Визнер (1961) в 20 - 30 % случаев. Истинные алейкемиче-ские изменения в периферической крови наблюдаются очень редко.

Гематологический метод "лейкозный ключ" - сравнительно достоверный метод прижизненной диагностики лейкоза. Все лейкозные диагностические ключи основаны на количественных показателях лимфоидных формул лейкоцитов в 1 мкл крови, которые можно считать критерием заболевания животных лейкозом. Отличием является лишь степень жесткости диагностических критериев. Методика диагностики лейкоза крупного рогатого скота по качественным показателям крови с помощью "лейкозных ключей" используется на практике. Некоторые исследователи (Г. А. Симонян 1971, О.Ч. Парчинский 1979), пользуясь этой методикой, пришли к мнению, что, с помощью ее можно поставить диагноз если животное болеет лимфолейкозом и нельзя поставить диагноз, если животное имеет алейкемическую картину крови. Для более точной постановки диагноза вместе с данным методом необходимо проводить исследования по морфологической идентификации клеток крови.

1.4 Конформационные изменения крови под влиянием различного микроокружения

Фотохимические процессы имеют огромное значение для жизни на Земле. Природные фотохимические явления влияли на эволюцию жизни и продолжают оказывать влияние на ее нынешнее существование на Земле. Образование из простейших элементов сложных биоорганических соединений, а затем и возникновение самой жизни тесно связаны с фотохимическими процессами (Р. Уэйн, 1991).

Формирование любого организма происходит под воздействием различных факторов внешней среды (атмосферного давления,температуры, УФ - радиации, пиков солнечной активности и т. п.) и факторов, обуславливающих в дальнейшем способность организма животного противостоять различным инфекционным заболеваниям (передача специфических антител вертикальным путем, приобретение специфических и неспецифических средств защиты организма в течение жизни). Умеренные дозы УФ-радиации необходимы для нормального функционирования и жизнедеятельности живых организмов. Поэтому вопрос о механизме воздействия различных экологических факторов, в том числе воздействие вирусов, различных микроорганизмов, УФ-света и температуры на биополимеры, их надмолекулярные комплексы, клетки и ткани находится в центре внимания биофизики, биохимии и молекулярной биологии (В. Г. Артюхов, 1995).

В свете сказанного одной из главнейших задач современной биологии является исследование электромагнитных полей в широком диапазоне частот, физических и физико-химических механизмов действия на биомакромолекулы, в частности на белки с помощью УФ-излучение различных длин волн (фотохимия).

Фотохимические реакции в белках и ферментах возникают под влиянием естественных факторов внешней среды, это сыграло по-видимому, решающую роль и в самом появлении, и в эволюции живых существ (Р. Уэйн, 1991).

Изучение молекулярных механизмов тех или иных фотохимических изменений в клетках - одна из задач исследования биологических эффектов.

Фотобиологические исследования дают возможность найти связь между изменениями в энергетике молекул и химическими свойствами изучаемой системы (А. Н. Теренин, 1967). Этот факт является наиболее инте-

ресным при изучении механизма фотохимических реакций, индуцируемых патогенным воздействием, как инфекционного, так и инвазионного начала в белковых молекулах.

Изучение фотофизических и фотохимических изменений белковых молекул необходимо также для разработки надежных средств защиты живых систем от повреждающего действия инфекционного и инвазионного начала.

В связи с отмеченным, изучение механизма биологического воздействия вирусов, микроорганизмов, следует считать актуальной проблемой биофизики, требующей дальнейшей детальной разработки.

К числу жизненно необходимых белков и основных биологически активных комплексов железопорфиринов со специальными белками являются гемоглобин, миоглобин, каталаза, пероксидаза, цитохром С и др. Эти гемопротеиды характеризуются близкими по составу темами и значительно отличаются аминокислотными составами, первичными структурными и физико-химическими свойствами белковых частей.

Природа и прочность связей гем + белок в указанных гемопротеидах также различны (М. Петуц, 1966; Б. Ф. Сухомлинов, Н. Б. Сухомлинова 1972; Б. Ф. Сухомлинов, В. Е. Кащенко, 1974; Б. Ф. Сухомлинов и др., 1978; О. М. Полторак, Е. С. Чухрай, 1971; М. Б. РепИг, 1976; Л. А. Блю-менфельд, 1977; Г. А. Харбурин, Р Г. Маркс, 1978; Д. М. Рифкинд, 1978).

Молекулы гемопротеидов состоят из двух частей: простетической группы (гема) и апобелка.

Структура, физико-химические свойства и функции указанных гемопротеидов, особенно гемоглобина и цитохрома С, достаточно хорошо изучены и подробно изложены в литературе.

Гемоглобин - основной компонент эритроцитов крови, переносит молекулярный кислород от легких к тканям, а углекислоту - от тканей к легким.

Наряду с транспортной функцией, гемоглобин выполняет роль внутриклеточного буфера в эритроцитах. Примерно 75% буферной емкости крови обусловлено этим гемопротеидом ( Е. Б. Бабский и др, 1966).

Гемоглобин - сложная молекула, состоящая из двух частей (гема и глобина), каждая из которых имеет свои полосы и максимумы поглощения. Для выяснения локализации нарушений, возникающих в гемопротеиде; под воздействием УФ-излучения, необходимо исследовать его спектры поглощения в области 200 - 700 нм; в спектральном диапазоне 200 - 900 нм све-топоглощение обусловлено преимущественно хромофорами глобиновой, а в области 290 - 750 нм порфириновой частей гемоглобина.

Известно, что на состояние хромофоров, в том числе и белковых, заметное влияние оказывают условия, в которых они находятся (Ю. А. Владимиров, 1965; К. Хигаси и др., 1976; Э. А. Бурштейн, 1976; Д. М. Риф-кинд, 1978).

Глобула гемоглобина млекопитающих с размерами 6,4 х 5,5 х 5,0 нм состоит из четырех субъединиц, причем связь между ними не ковалентная, а ионная. По паре из этих субъединиц одинаковы, им соответствуют и полипептидные цепи. Каждая из четырех отдельных цепей свернута нерегулярным образом и примерно на 70 - 75 % состоит из аспиральных участков, чередующихся с неспиральными сегментами (Н. МшгЬеас!, М. Р. Репйг, 1963: О. Вгаип^ег а1., 1964; А. КоБзьГапеШ & а1., 1964; М. Пе-рутц, 1966; М. Б. Реггйг, 1970, 1972, 1976, 1980; М. С. Кушаковский, 1968; М.Ыогтап, 1978; Д. М. Рифкинд, 1978; А. 8сЬгоеёег, Т. Н. Нигтап, 1980; Н. Ф. Стародуб, В. И. Назаренко, 1987: Б. М. Еп§е1тап, 1990). Каждая группа гема окружена либо а-, либо |3- цепью. Эти четыре полипептидные цепи (субъединицы) в пространстве расположены в виде тетраэдра, и в плотной упаковке образуют сфероидную макромолекулу, в которой каждая субъединица имеет контакт с тремя другими.

Молекулярные массы тетрамерных гемоглобинов составляют 64 -f- 68

кД.

Гем, по мнению Л. А. Блюменфельда (1957), существует в двух формах: мономерной и агрегированной. Агрегированная форма характеризуется максимальным светопоглощением при 390 нм (полоса Соре).

В работах (О. Warburg, 1946) была рассчитана молекулярная масса белковой частицы цитохромоксидазы и сделан вывод о том, что свет, поглощенный апоферментом, также эффективен для отщепления окиси углерода от гема, как свет, поглощенный только гемом.

Полоса Соре с Хтах = 416 нм характерна для неполностью восстановленного гема. Авторы считают, что гем с полосой Соре 420 - 432 нм является полностью восстановленным.

Изучение действия света на комплексы цианида с молекулами гемоглобина показало, что эти комплексы также обратимо отщепляют цианид (D. Keilin, Е. Hartree, 1955). Обратимую фотодиссоциацию комплексов кислорода и окиси азота с молекулами гемоглобина, миоглобина и перокси-

т

дазы наблюдали Q. Н. Gibson, S. Ainaworth,(1957). В названных работах вычисляются квантовый выход фотодиссоциации групп координированных с железом. О влиянии электронного состояния гема (при сдвигах рН среды, изменении температуры) на конформационные свойства белковых частей миоглобина и гемоглобина сообщили Б. А. Атанасов и др., (1967); М. В. Волькенштейн и совт. (1968).

Действие кислой среды на НЬОг проявляется в исчезновении длинноволновых полос поглощения, смещении полосы Соре в сторону более коротковолновых длин волн с одновременным падением ее интенсивности (JI. А. Блюменфельд 1957).

Изучая кинетику разрушения водных растворов дезоксигемоглобина, авторы установили, что оксигенация на воздухе, продолжительностью 20 -

30 часов, индуцирует такие же изменения в спектре поглощения белка, что

2 2

и УФ-облучение их в течении 1 минуты (1,15 - 10 Жд/м ).

С помощью различных методов (ЯМР, ДОВ и КД) установлено, что конформационные изменения гемоглобина происходят под влиянием связывания Ог, причем эти изменения не ограничиваются превращениями, происходящими в локальном окружении гема и лиганд (S. Beychok et al., 1967; D. W. Urry, 1067; Д. M. Рифкинг, 1978).

Смещение максимума полосы Соре в коротковолновую область и уменьшение интенсивности поглощения длинноволновых полос поглощения при 540 и 570 нм в обоих случаях свидетельствует об образовании окисленного фотопродукта оксигемоглобина - метгемоглобина.

В ультрафиолетовой области спектра (250 - 400 нм) оксигемоглобин имеет две полосы поглощения: полоса 270 - 275 нм обусловлена светопо-глощением остатков ароматических аминокислот; полоса 340 - 345 нм -поглощением порфириновых частей молекулы НЬСЬ

Дезоксигемоглобин - высокоспиновая нелигандированная форма белка. Спектр дезоксигенированного гемоглобина характеризуется в видимой области двумя полосами поглощения: полосой Соре высокой интенсивности при 430 нм и широкой полосой при 555 - 560 нм. В диапазоне длин волн 580 - 590 нм в его спектре имеются небольшие перегибы.

После облучения водного раствора (2 * 104 моль/л) УФ-светом лампы ПРК - 4 в спектре дезоксигемоглобина исчезает полоса при 555 - 560 нм и обнаруживаются две длинноволновые полосы поглощения, присущие оксигемоглобину. При этом происходит перенос молекул гемоглобина из Т - состояния в К - состояние.

Полоса Соре сдвигается сильнее в область более коротковолновых длин волн: интенсивность ее падает с ростом дозы облучения. Одновременно с этими изменениями появлялась полоса поглощения метгемоглобина (628 - 630 нм).

Карбоксйгемоглобин переходит не в дезоксигемоглобин - в этом случае полоса Соре белка должна была бы сдвигаться в длинноволновую область спектра, а в другой фотохимический продукт, по своей природе более близкий к продуктам УФ-превращения оксигемоглобина - метгемог-лобину. Данные изменения растворов карбоксигемоглобинов являются отражением конформационных превращений белка вследствие его фотоденатурации и другйх фотореакций (Q. Н. Gibson, 1959; В. Н. Кулаков, 1961; A. Witma Saffran, 1977; Л. А. Блюменфельд и др., 1977; Q. Н. Gibson, 1978 и др.).

Оксигемоглобин - порфириновая часть гемоглобина регистрируется преимущественно длиной волны 300 нм.

Описанные спектральные отклонения связаны с переходом белковой молекулы в высокоспиновое состояние, сопровождающееся модификацией как глобинового, так и гемового ее компонентов (Д. М. Рифкинд 1978).

Цитохром С является переносчиком электронов в дыхательной цепи. Он встречается практически у всех известных науке организмов, от примитивных хемосинтезирующих бактерий до высших животных, что говорит об универсальности однажды созданного в эволюции механизма передачи энергии. ЦитохрОмы С функционируют на терминальных участках дыхательных цепей, являясь последним или предпоследним акцептором электрона.

Все цитохромы С млекопитающих содержат одну ковалентно связанную с полипептидной цепью группу гема. Молекулярная масса фермента 12 20 кД. Молекула цитохрома С напоминает сфероид с размерами 3,0 х 3,4 х 3,4 нм. Первичная структура цитохромов различается в зависимости от источника выделения. В настоящее время известны аминокислотные последовательности более 80 видов цитохрома С.

Впервые была определена аминокислотная последовательность цитохрома С сердца лошади (Е. Margoliash et al., 1961: Е. Margoliash, А.

Schejter, 1966; R. E. Dickerson et al., 1967, 1968, 1971; R. E. Dirson, 1974; R. E. Dickerson, R. Timkovich, 1975; J. A. Mc Cray, P. D. Smith, 1977; Г. A. Харбури, P. Г. Маркс, 1978: Г. В. Петтигрю. Дж. Мур, 1987).

Структура цитохрома С (как и гемоглобина) удивительно приспособлена для выполнения своей биологической функции. Его молекула содержит много лизинов, которые распределены в виде кластеров положительного заряда на поверхности молекулы, так же, как и глутаминовая и аспарагиновая аминокислоты, формирующие кластеры отрицательного заряда. Эти кластеры составляют центры взаимодействия цитохрома С партнерами по дыхательной цепи. Кольца ароматических остатков гембелка формируют канал, по которому электрон транспортируется к гему и обратно. Гем упакован в полипептидной цепи энергетически невыгодно: его гидрофобный край экспонирован в водную среду. Тем не менее именно такая структура, наиболее благоприятная с точки зрения биологического предназначения, сохранилась в процессе эволюции.

Структурные превращения гемопротеидов, в частности цитохрома С, может индуцировать видимый свет, что продемонстрировано в работе Е. Scoffone et al. (1970); они определили положение окисляющихся в присутствии фотосенсибилизатора аминокислотных остатков в цитохроме С, после нахождения раствора на видимом свете. Фотовостоновлению подвергаются молекулы цитохрома С помещенные в анаэробные условия под видимый свет (С. Yu et al., 1975).

Самая характерная функция каталазы заключается в высокоэффективном катализе разложения пероксида водорода на воду и кислород. Кроме того, каталаза проявляет умеренную пероксидазную активность: катализирует реакции окисления спиртов и некоторых других доноров водорода пероксидом водорода.

Каталазы обнаружены во всех растениях и в большинстве аэробных бактерий; в анаэробных бактериях их обычно не находили.

Структура каталазы так же, как и гемоглобина, состоит из четырех субъединиц: каждой группе гема, точнее гематина с трехвалентным атомом железа соответствует связанная с нею полипептидная цепь.

Каталазы, полученные из разных источников, имеют молекулярные массы от 225 до 251 кД (Т. Higaschi, S. Schibata, 1964; М. Hiraga et al., 1964; К. S. Holmens, С. I. Masters, 1965; В. Л. Шпицберг, 1965: О. M. Пол-торак, Е. С. Чухрай, 1971; Н. Aebi et al., 1974; В. П Комов, 1978). По-видимому, белковые компоненты каталаз животных специфичны для соответствующих видов. По вопросу о механизме действия каталазы уже накоплен большой экспериментальный материал. Показано, что разложение пероксида водорода этим ферментом не является цепным процессом: данная реакция не имеет индуктивного периода, а обычные реагенты для обрыва цепи не оказывают на нее влияния. Молекула каталазы бактериального происхождения способна вызвать распад 6*10 молекул 14202 в секунду. Это самый быстрый из биохимических процессов, скорость которых удалось непосредственно измерить.

М. А. Коломийченко (1958, 1960) методами спектрофотометрии и светорассеяния изучал нарушения, возникающие в гемоглобине и каталазе под влиянием УФ-излучения различных длин волн. Обнаружено, что после облучения наблюдается снижение специфического поглощения световой энергии в полосе Соре при 405 нм. Это уменьшение поглощения свидетельствует о повреждении простетической группы (гема) белковых молекул. Инактивация каталазы происходила при больших дозах УФ-света, порядка (15,0 - 25,0) х 104 Дж/м2. Определение молекулярной массы гемоглобина и каталазы, проведенное методом светорассеивания, показало, что она увеличивается с ростом дозы УФ-излучения. Этот факт был объяснен агрегацией молекул гемопротеидов вследствие УФ-облучения.

Молекулы гемопротеидов служат удобными модельными системами для проведения биофизических исследований: изучения связи между

структурой и функциями белков, фотофизики и фотохимии гемов и апо-белков, миграции энергии между этими компонентами; влияния изменения структурного (электронного) состояния одного из компонентов на структурное состояние другого; фотозащитных и фотосенсибилизирующих эффектов апобелков и простетических групп; выяснения роли фотореакций в обеих частях и нарушении структуры и функций гемопротеидов при воздействии УФ-света различных длин волн и для решения других задач.

Сейчас можно констатировать, что фотофизические и фотохимические превращения однокомпонентных (более простых по сравнению с ге-мопротеидами) белков хорошо изучены. Этому вопросу посвящены обзорные и диссертационные работы, а также фундаментальные монографии (Ю. А. Владимиров, 1965; Ю. А. Владимиров и др., 1970; К. Смит, Ф. Хэн-суолт, 1972; О. А. Азизова, 1979; И. Д. Волотовский, 1979; К. М. Львов, 1979; Д. И. Рошупкин, 1979; И. И. Сапсжинский, 1980, 1988; Н. Л. Вскшпн, 1988; Ю. А. Владимиров, А. Я. Потапенко, 1989).

Методами спектрофотометрии и ЮЗ исследовано влияние видимого света на структурное состояние молекул феррицитохрома с (М. РоНп е! а1., 1972). Установлено, что при фотоокислении метионина-80 происходит сдвиг полосы Соре, исчезает максимум на 690 нм и появляется полоса поглощения с А,тах = 750 нм. Фотомодификация гистидина-18 также приводит к пертрубации спектра поглощения фермента в видимой области. Фотомодификация метионина-80 и гистидина-18 индуцирует, по мнению авторов, конформационные превращения феррицихрома С, на что указывают соответственно усиление и ослабление всех максимумов спектра ЫЭ в видимой и ближней УФ-области и изменение величины молекулярной эллиптичности белка при 220 нм.

О конформационных изменениях, претерпеваемых ферри- и ферри-цитохромами С под действием видимого света, сообщили также И. Табагуа и Л. А. Сибельдина (1977). С помощью метода ПМР высокого расщепле-

ния они показали, что свет вызывает фотоокисление пятого и шестого ли-гандов гемового железа в фероцитохроме С: в обоих случаях изменялась электронная структура гемового кольца молекул фермента.

Представляется целесообразным проанализировать и главное фотохимическое изменение свободных железопорфиринов.

Основными фотореакциями железопорфиринов в растворах как и ге-мопротеидов, являются окисление и восстановление центрального атома железа, при фотовосстановлении выделяются только в отсутствии кислорода (В. И.аскоу^ ег а1., 1957). Авторы считают, что эти фотореакции протекают за счет энергетических квантов света, поглощенных сопряженной к-электронной системой связей порфйринового кольца. Изменение валентности атома железа осуществляется в результате переноса энергии к нему от порфиринового кольца.

На возможность переноса электрона от порфиринового кольца к атому железа указывал позже А. Н. Теренин (1960). По мнению В. 11аско\у е! а1. (1957), фотоокисление и фотовосстановление железопорфиринов происходит следующим образом: тс-электроны пиррольных колец обобществлены в сопряженной 7Г-электронной системе. Однако два 45 электрона иона Бе2+ и один 43 электрон иода Ре3+ не включены в эту сопряженную систему (48-уровень железа находится между основным и возбужденным уровнями сопряженной электронной системы порфирина).

Подготовив квант света, л-электрон сопряженной системы переходит на возбужденный уровень. При фотоокислении гема осуществляется перенос электрона с 43-уровня железа на основной уровень порфирина на место возбужденного электрона, а при фотовосстановлении - с возбужденного уровня сопряженной системы на 45-уровень железа.

Механизм двухстадийного (обратимого) фотохимического восстановления порфиринов изучен А. А. Красновским (1960). В качестве первой стадии этого процесса предполагается перенос электрона от донора к оп-

тически возбужденной молекуле порфирина и переход последней в ион-радикальное соединение. На второй стадии восстановления, определяемой кислотно-основными свойствами среды, происходит перенос протона. При низких температурах, когда затормаживается реакция переноса протона, наблюдается лишь перенос электрона.

Факт миграции энергии в гемопротеидах был обнаружен О. Warburg, Е. Negelein (1928, 1929). Авторы измерили спектр действия фотохимического расщепления комплекса цитохромоксидазы с окисью углерода. В этом спектре появлялись большие максимумы при 280 нм.

Эффективность переноса энергии в пределах молекулы феррицихро-ма С зависит от взаимной ориентации и относительного расстояния между триптофаном-59 и гемином (Т. Y. Tsong 1976). Геминовая группа, как показал автор, тушит флюоресценцию данной ароматической аминокислоты. Это подтверждают результаты опытов Е. Veber, F. J. W. Teale (1959), которые сообщили об увеличении выхода ультрафиолетовой флюоресценции триптофановых остатков цитохрома С последующим удалением гема из молекулы фермента.

Рентгеноструктурные исследования позволили выяснить, что присоединение кислорода к гемоглобину может вызвать перемещение атома железа внутри молекулы белка (М. Перутц, 1966; М. F. Perutz, 1970).

Фотоокисление порфирина IX синглетным кислородом происходит по винильным группам и гидроксиальдегиду в положениях 1, 4 (Н. Н. 1п-hoffen et al., 1969). И. М. Бытева и др. (1975) предложили схему реакции фотоокисления мезо- и протопорфиринов для случая, когда концентрация порфиринов невелика и интенсивность света небольшая, т. е. в этих условиях, по мнению авторов, можно не учитывать взаимодействия возбужденных молекул.

Фотоокисление пигмента по этой схеме является сенсибилизированным процессом: энергия света идет на образование синглетного возбуж-

денного кислорода, окисляющего невозбужденную молекулу пигмента.

Порфирины способны при воздействии видимого света обратимо восстанавливаться как в кислой, так и в щелочной средах. При этом обнаружены две спектрально различающиеся фотовосстановленные формы с полосами поглощения на 450 и 500 нм (А. А. Красновский, А. В. Умрихи-на, 1958; Ю. Е. Ерохин, А. А. Красновский, 1961; Г. П. Гуринович и др., 1964).

Известно, что на интенсивность светорассеяния вещества, в частности гемолизата крови, сильно влияют посторонние частицы (В. Н. Цветков и соавт., 1964; Р. Мартин, 1966).

В настоящее время хорошо изучены структура и функции сложных белков - гемопротеидов (гемоглобина, цитохрома С, катал азы). Выявлены особенности структурно-функциональных изменений молекул гемопротеидов в условиях различного микроокружения. Фотопревращения молекул сложных белков изучили Q. Н. Gibson, S. Ainaworth,(1957); N. S. & anadivi, M. В. Sahasrabudhe, (1958); Ю. М. Торчинский, О. JJ. Поляновский, (1964); М. И. Амирагова и др., (1964); М. Жоли, (1968) Ю. М. Торчинский, (1971); Л. П. Каюшин и др., (1973); Л. П. Каюшин и др., (1973); П. Л. Привалов, Н. Н. Хеченашвилли, (1971, 1974); В. Я. Александров, (1975); Л. А. Блюменфельд, (1977); Л. А. Блюменфельдом и соавт. (1977); В. А. Умри-хин, (1978); М. Brian Hoffman, Q. Н. Gibson (1978); М. Brunori et al., (1980); С. В. Степанов и др., (1980); А. Н. Леденев и др., (1981); А. Н. Леденев (1982). Вместе с тем необходимо отметить, что недостаточно изучены вопросы, касающиеся влияния на структуры гемопротеидов инфекционных, инвазионных, паразитарных болезней животных, различных физиологических состояний. Данные вопросы представляют большой интерес с научной точки зрения и требуют дальнейшего изучения.

1.5 Влияние температуры на физико-химические свойства водных растворов гемоглобина крови

До сих пор дискутируется вопрос о процессе конформационных изменений и денатуративных изменений белковой молекулы (М. Жоли 1968; П. JT. Привалов, H. Н. Хечинашвили, 1971, 1974; В. Я. Александров, 1975; JI. А. Блюменфельд, 1977). Недостаточно изученными остаются вопросы связанные с характером конформационных изменений в структуре гемо-протеидов белков: гемоглобина, цитохрома С и др. Так, в работах С. В. Конева и соавт. (1975) были раскрыты некоторые конформационные изменения макромолекул фибриногена. Учеными применялся флуоресцентный метод. Ими было установлено, что увеличение температуры от 20 -т- 40 °С для водных растворов с pH 4,5 - 9,3 не сопровождается изменениями, а увеличение температуры от 40 -ь 50 °С вызывает конформационные изменения в гемопротеидах эритроцита неденатуративного характера. Увеличение температуры выше + 50 °С приводит к значительным структурным повреждениям молекул гемопротеидов эритроцита и фибриногена денату-ративного характера. Авторы отмечают сходство структурных повреждений в гемопротеиде эритроцита, в частности цитохрома С, и фибриногена под влиянием повышенных температур. При всех значениях температур (40 ч- 50 °С) исследователи отмечали увеличение оптической плотности растворов гемолизатов на длинах волн от 340 до 500 нм. Это указывало на монотонный характер структурных изменений, возникающих в порфирине гемоглобина, хромопротеидах апобелков и геме. В работе J. F. Brandt et al., (1975) был раскрыт механизм денатуративных изменение гемопротеидов и лизоцима. Разворачивание глобулы белка, по мнению автора, представляет собой цис-транс-изомерацию.

В. Н. Дубровин (1971) обнаружил обратимые изменения, обусловленные окислительно-восстановительными превращениями в структуре гемоглобина при возбуждении водных растворов клеток Eté. Shaposhnikovi

вспышкой света. В области 420 нм исследователь отмечал увеличение- све-топоглощения данного раствора из за повреждения в цитохроме С. Аналогичное светопоглощение отмечали М. И. Табагуа, JT. А. Сибельдин, (1977) при воздействии видимым светом на раствор ферицихрома С. Учеными выявлено фотоокисление пятого и шестого оксиальгных лиганд гема, сопровождающихся повреждением электронной структуры гемового кольца.

В работе В. Г. Артюхова и соавт. (1995) описаны результаты исследования, касающиеся влияния продолжительного воздействия света и УФ -лучей на гемоглобин. Автором установлено, что увеличение светопогло-щения при 405 нм обусловлено повреждением п - электронных двойных связей порфирина, в результате изменяется порфириновое кольцо структуры гемоглобина. Наблюдаемое с ростом температуры увеличение оптической плотности растворов гемоглобина, регистрировалось на спектре в области характерной цитохрому С. При более низких температурах (ниже 0 °С) появляются скрытые повреждения, которые усиливаются с повышением температуры исследуемых растворов. Автором было раскрыто то, что при нагревании раствора гемоглобина до + 20 °С в структуре феррицихро-ма С понижается стабильность молекулы, результатом чего является разворачивание белковой глобулы. Это обусловлено ослаблением и разрывом не ковалентных связей (водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимодействия), стабилизирующих пространственную структуру белка. Артюховым В. Г. и соавт. (1995) было высказано предположение, что зависимость изменения светопоглощения растворов гемопротеидов, в частности цитохрома С при различных температурах объясняется процессами повреждения белковой и порфириновой частей, имеющих сходную направленность. Изменения в белковом комплексе вызывают перестройку микроокружения гема, что сказывается на значениях оптической плотности. Данное заключение несколько противоречит G. Joli, (1973), который утверждал, что при воздействии света на раствор гемоглобина происходит

фотоокисление аминокислот цитохрома С, его порфириновых групп, и не подвержены повреждению гемовые группы гемоглобина.

Под влиянием повреждающего фактора ( солнечного света, УФ - облучения) наблюдаются повреждения в структуре гемоглобина. Повышение интенсивности оптической плотности зависит от степени конформациии структур белковых комплексов, его молекул и хромофоров апобелков. Низкие температуры замедляют процессы, протекающие в структуре гемоглобина, но температуры ниже О °С повреждают структурные элементы гемопротеидов (цитохрома С, гемовую и глобиновую части структуры гемоглобина). При нагревании до 20 ч- 50 °С усиливается процесс конформа-ции, выражающийся увеличением оптической плотности водных растворов гемоглобина Артюхов В. Г. и соавт. (1995).

Разработка новых методов прижизненной диагностики, основанных на функциональных, биохимических, пролиферативных особенностях, составных элементов крови, имеющих место в лейкозном процессе крупного рогатого скота позволили бы своевременно выявлять не только больных, но и повышенного риска заболевания лейкозом животных, особенно в тех хозяйствах, где данное заболевание имеет широкое распространение.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Спектрофотометрические исследования проб крови крупного рогатого скота проводили в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИИБТЖ (Омск) на приборе "SPECORD М-400", для сопоставления получаемых результатов использовали спектрофотометр "HITACHI - 557" в лаборатории биофизических методов исследования Биологического факультета МГУ (Москва).

Показатели уровня коэффициентов поглощения крови крупного рогатого скота исследовали на ультрафиолетовом, видимом, инфракрасном спектрофотометре "SPECORD М-400". Данный прибор оснащен двумя каналами исследований и лампами: для ультрафиолетовой области дейтерие-вой (типа D2E) и видимой области, предварительно отъюстированной га-логеновой (6В/20Вт).

Установка имеет монохроматор Эберта, с фокусным расстоянием f = 250 мм. и голографической решеткой, имеющей 1400 линий/мм, приемника излучения - 11-каскадный фотоумножитель (типа M11FUC 520) с многощелевым поверхностным катодом. "SPECORD М-400» имеет модулятор с рабочей частотой 40 Гц, оснащен аналого-цифровым преобразователем. Дисплей представлен в виде электронно-лучевой трубки с растром из 256 х 512 точек для вывода буквенно-цифровой и графической информации.

Клавиатура прибора представлена в виде кнопок управления с жесткими функциями и диалоговыми кнопками с переменными функциями. Прибор имеет дисководы для гибких мини дисков 5 1/4.

Рабочий диапазон длин волн: 185 - 900 нм, погрешность длины волны не более 0,3 нм. Погрешность фотометрии не более 0,003 ABS. Время интегрирования при одном измерении 0,1 - 100 с. Диапазон полос поглощения SSW монохроматора 0,1-5 нм. Диапазон спектрального шага 0,05 -5 нм Скорость исследования 0,1 - 10 нм/с.

Формы вывода информации: текст, таблица, ломаная линия, кривая, квазирельефное семейство. Диапазон возможных абсцисс 185,0 - 900,0 нм, диапазон возможных ординат 0,00 - 800,0 % Т.

Прибор оснащен стандартными программами для вывода на печать, накопления информации на гибких дисках (около 500 спектров), индикации и вывода накопленной информации, циклического повторения измерений, статистической оценки, распечатки экстремулов, операциями над файлами (копирование, перемещение, стирание).

Прибор оснащен матричным печатающим устройством для получения печатных копий, показываемых на экране монитора.

Информацию со "SPECORDA" можно заносить на гибкие мини диски (типа DOUBLE-SIDED, DOUBLE-DENSITY, SOFT-SECTOR) емкостью по 640 кбайт. Системный диск работает автономно. Спектрофотометр имеет два дисковода (DRIVE 0, DRIVE 1). При работе с прибором дисководы, в которых находятся диски, запираются стопором. Во время работы диска на соответствующем дисководе светится красный светодиод.

Прибор имеет камеру проб, состоящую из большого и малого отсеков. Большой отсек камеры проб способен принимать универсальные кю-ветодержатели, которые закрепляются на четырех опорных скалках. Малый отсек ограничен колпаком и находится перед катодом приемника излучения.

Спектрофотометр оснащен различными принадлежностями, которые позволяют использовать различные среды при разных температурах. Универсальный кюветодержатель используется для фиксации кювет типа Е и ES и проб толщиной 10 мм.. Проточная кювета используется для измерения в ней мало вязкой жидкости. Терморегулирующий кюветодержатель применяется для поддержания определенной температуры исследуемой пробы. Держатель твердых проб может принимать пробы диаметром не менее 16 мм и толщиной 27 мм максимально.

В приборе имеются отверстия для продувания азота, так как при работе спектрофотометра в диапазоне волн меньше 200 нм можно получить значительно большее отношение сигнал / шум.

Режим вывода запускали так, чтобы ось ординат была обозначена коэффициентом поглощения (А), с корректировкой по стандарту калибровки от 0 до 100 (CALIBR. MODE : NO 0 % Т / 100 % - STEND), без обработки результатов измерения (DATA HANDEL : NO). В инструкции относительно вывода на дисплей задавали графический вывод результатов измерений в виде кривой (CURVE) или семейства кривых (SIMPLECT), на полный экран (FULL).

Параметрами вывода задавали ось ординат (Y (MIN) = 0,0 A, Y (МАХ) = 2,5000 А). Масштаб шкалы абсцисс задавали из распечатываемых диаграмм (0,50 DOTS/hm).

До запуска программы измерений вводили дополнительную информацию, облегчающую будущую идентификацию и интеграцию накопленных на диски или распечатанных результатов измерений, таких как дата, время, фамилия оператора, краткие комментарии.

После получения информации на экране монитора о результатах измерений проводили распечатку актуальной информации на печатающем устройстве и заносили имеющуюся информацию на гибкий диск.

В процессе работы исследовали кровь от крупного рогатого скота с антикоагулянтом (трилон - Б).

В стеклянные флаконы разливали по 16 мл дистиллированной воды. Стеклянным капилляром отбирали перемешанную кровь до метки 0,04 мл. Марлевой салфеткой протирали капилляр от крови и выпускали кровь на дно флакона. Содержимое флакона перемешивали путем взбалтывания.

В кювету (4 мл) переливали из флакона приготовленный гемолизат крови. Фотометрирование гемолизата цельной крови животных проводили на длинах волн 264 - 610 нм, при спектральном шаге 1,00 нм, скорости ин-

тегрирования 2,00 нм/с, с временем интегрирования 0,5 с, шириной поглощения монохроматора 2,0 нм.

По окончании измерений, пробы извлекали из кюветодержателя, содержимое переливали во флаконы. Кюветы тщательно промывали дистиллированной водой, протирали от капель специальной фильтровальной бумагой фирмы GALUS. В приготовленные кюветы переливали следующие пробы из флаконов.

В целом, на подготовку одной пробы и работу на спектрофотометре затрачивали 10 минут.

Измерение показателей коэффициентов поглощения гемолизатов проб крови, проводили в течение 96 часов при хранении проб крови в температурных режимах от +10 до + 20 °С и до 3 месяцев при хранении проб от - 6 °С до - 18°С. Параллельно пробы крови исследовали с помощью существующего гематологического метода фазового контраста (по методике С. С. Бирбина) в модификаций, представленной П. Н. Смирновым и соавт. (1990). Антикоагулированная кровь исследовалась нами при комнатной температуре в течение 36 часов с момента взятия. По истечении этого времени пробирки Флоринского с кровью, закрытые резиновой пробкой, помещали в морозильную камеру (t - 18°С). Через 3 месяца пробы крови размораживали при комнатной температуре и исследовали. Изменения в спектре крови регистрировали путем спектрофотометрии на длинах волн 284, 358, 422, 546, 581 нм.

Подсчет клеток крови (лимфоцитов) проводили в камере Горяева. В лунки полистироловых пластин разливали по 0,4 мл жидкости Тюрка (ледяная уксусная кислота 1 - 3 мл; 1 % раствор метиленовой сини 1мл; дистиллированная вода до 1000 мл). Стеклянным капилляром набирали предварительно перемешанную кровь до метки 0,02 мл. Марлевой салфеткой протирали наружную поверхность капилляра от крови и плавно выдували содержимое на дно лунки с жидкостью Тюрка. Несколько раз его промы-

вали, насасывая и выдувая содержимое лунки, на эту работу затрачивали 10- 15 минут.

В подготовленную для работы камеру Горяева вносили с помощью глазной пипетки разведённые пробы крови.

Подготовка камеры Горяева: притирали к камере покровные или кварцевые шлифованные стекла 26 х 24 х 3, на эту работу было затрачено 0,5 минут.

Подсчет клеток крови проводили под микроскопом при увеличении 10 х 10. Клетки подсчитывали в 25 больших квадратах. В каждом квадрате считали клетки, находящиеся внутри, а также лежащие на левых и нижних линиях квадрата. Для подсчета содержания лейкоцитов в 1 мкл крови число подсчитанных клеток в 25 квадратах умножали на 200; на эту работу затрачивали 5-10 минут.

При постановке диагноза на лейкоз проводили дифференциальный подсчет лимфоцитов, лейкоцитов и других клеток крови. Для этого готовили мазки из стабилизированной крови на предметных стеклах, их фиксировали и окрашивали.

На предметное стекло наносили каплю крови, шлифованным стеклом, одним движением растирали каплю. Хорошо приготовленный мазок -тонкий, ровный, при просмотре в проходящих лучах света заметны различные оттенки цвета. На эту работу затрачивали 2-5 минут.

Мазки фиксировали с помощью метилового спирта в течение 5 минут.

Окрашивали мазки по Романовскому - Гимзе (мазок фиксировали спиртом, помещали на дно чашки Петри на подставке, и наносили рабочий раствор краски (3,8 г краски растворяли в 250 мл метилового спирта, добавляли 250 мл глицерина), через 15-20 мин мазок промывали водой и высушивали (общее время окраски 20 - 30 мин).

Лейкоцитарную формулу выводили по результатам подсчета клеток под микроскопом при увеличении объектива х 90 с масляной иммерсией.

Показатель абсолютного содержания лимфоцитов оценивали по "лейкозному ключу" (5-7 мин). Таким образом, на постановку диагноза традиционным методом (одной пробы) уходит 43 - 68 минут.

Лейкозный ключ

Возраст, лет Здоровые животные, лейкоциты Подозрительные в заболевании, лимфоциты Больные животные, лимфоциты

От 2 до 4 до 11000 8000 - 10000 Свыше 10000

От 4 до 6 до 10000 6500 - 9000 Свыше 9000

От 6 и старше до 9000 5500 - 8000 Свыше 8000

Следовательно, используемый способ трудоемок и, главное, длителен по времени.

Специфические противовирусные антитела в сыворотке крови крупного рогатого скота выявляли с помощью реакции иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле с антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота, используя диагностические тест - наборы Курской биофабрики.

Методика постановки РИД была рекомендована к использованию ГУВ МСХ СССР и впоследствии включена в "Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота" (1989).

Сравнительное испытание разработанного и традиционного методов гематологической диагностики лейкоза проводили в 12 хозяйствах Омской области. В этих хозяйствах подвергали обследованию РИД - позитивных и больных лейкозом животных черно-пестрой и красно-степной пород в количестве 23058 голов, При проведении исследований от животных получали кровь и сыворотку для серологических и гематологических исследований.

Для достоверной оценки предлагаемого метода провели контрольный убой 13 коров, давших положительный результат при спектрофото-метрии.

Биометрическую проверку результатов спектрофотометрического, гематологического и серологического исследований проводили на кафедре эпизоотологии ИВМ ОмГАУ, данные обрабатывали с помощью адаптированных программ персональных компьютеров на базе процессора пентиум с учетом критерия Стьюдента.

2.2. Разработка методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики лейкоза

2.2.1. Подбор оптимальных разведений гемолизата крови крупного рогатого скота для спектрофотометрии

Определение оптимальных условий для подготовки гемолизата крови

при проведении спектрофотометрических исследований проводили следующим образом. В работе использовали разведение гемолизата из расчета стандартного титра разведения, применяемого в гематологическом методе диагностики (0,02 мл стабилизированной (трилоном Б) крови и 0,4 мл жидкости Тюрка 1:20).

Кровь гемолизировали дистиллированной водой, к 0,04 мл крови добавляли соответственно 4 мл воды и с помощью титрования получали разведения в титрах 1 : 100, 1 : 200, 1 : 300, 1 : 400, 1 : 500 (рис. 1).

В ходе спектрофотометрии гемолизатов, взятых для исследования в разных разведениях (1 : 100, 1 : 200, 1 : 300, 1 : 400, 1 : 500) (табл. 1), было определено, что разведение 1:400 является оптимальным, так как дает возможность регистрировать коэффициенты поглощения световых волн в наиболее удобных для обработки значениях от 1,6636 ± 0,14 до 2,1584 ± 0,11. Показатели разведения 1:100, 1:200 находились выше предела максимальных возможностей спектрофотометра. Разведения 1:500, напротив, давали возможность регистрировать показатели лишь в очень низких зна-

чениях, что тоже затрудняло регистрацию различий в показателях гемолизата РИД - позитивных и больных животных. При разведении гемолизата 1:300 необходим слишком малый объемом крови или большое количество дистиллированной воды, что дает большую погрешность измерений.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Божко, Сергей Петрович

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методологические подходы для внедрения в ветеринарную практику нового, эффективного экспресс-метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота, основанного на спектрофотометрии гемоли-зата.

2. При развитии лейкозного процесса происходят конформационные изменения в гемоглобине, что позволяет с помощью спектрофотометрии проводить их автоматическую регистрацию в пробах гемолизата крови крупного рогатого скота, получать спектры (коэффициенты поглощения) и по ним оценивать инфекционный статус животных.

3. При исследовании гемолизата на спектрофотометре установлено 5 пиков поглощения: 284; 385; 422; 546 и 581 нм. Выявлена закономерность, что в гемолизате крови у РИД - позитивных животных спектр полосы Соре (422 нм) имеет коэффициент поглощения - 1,6636 ± 0,14; а у больных -2,1584 ± 0,11. Разница статистически достоверна. Для выявления этих различий разведение гемолизата 1:400 является наиболее оптимальным.

4. Использование предлагаемого метода диагностики лейкоза дает возможность увеличения сроков хранения исследуемой крови с 36 до 96 часов при температуре от +10 до + 20°С и до 3 месяцев при замораживании проб крови.

5. Основу возникающих молекулярных изменений в гемоглобине больного лейкозом крупного рогатого скота составляет механизм воздействия специфического комплекса «антиген + антитело» на структуру и функции эритроцита.

6. Обнаружено различие между спектрами гемолизата РИД - позитивных и больных лейкозом животных при интенсивности поглощения 581 нм, что указывает на конформационные изменения нелигандирован-ных форм гема. Выявленные изменения в коэффициентах поглощения в области полосы 358 нм в спектре гемолизатов РИД - позитивных и больных лейкозом коров свидетельствуют о разнице в составе ароматических аминокислот гемопротеида эритроцитов. Наиболее информативные различия в спектре гемолизата РИД - позитивных и больных лейкозом животных регистрировались при 422 нм.

7. Проведение сравнительной диагностики лейкоза коров традиционным гематологическим методом и с помощью спектрофотометрии показало преимущество последней благодаря высокой чувствительности, использования математической обработки получаемых спектров на ПЭВМ и сокращения времени исследования в 3 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Материалы диссертации доложены на ученом совете ВНИИБТЖ. Рекомендованы к производственному испытанию. Протокол совета № 5, от 28.10.98.

2. На основании результатов проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по использованию спектрофотометрии для диагностики лейкоза коров», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ВНИИБТЖ от 11.11.98., протокол № 7. Документы направлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ и ПРФ № 201-01 от 12.11.98.

3. Подготовлен видеофильм «Применение спектрофотометрии в диагностике лейкоза крупного рогатого скота» для использования в учебном процессе на ветеринарных и биологических факультетах высших учебных заведений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Божко, Сергей Петрович, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аарт X. Т. О распространении гемобластозов по зонам разведения крупного рогатого скота на территории Эстонской ССР // Теоретические и практические вопросы ветеринарии. - Тарту, 1978. - С. 150 - 152.

2. Абелев Г. И. Эмбриональный сывороточный а-глобулин при злокачественных опухолях // Вестн. АМН СССР. -1970. - № 7. - С. 49 - 57.

3. Абелев Г. И. Иммунология злокачественных опухолей // Вестн. АМН СССР. - 1974. № 2. - С. 23 - 29.

4. Аверкина Р. Ф. Сравнительное изучение антигенных свойств тканей животных различных видов на разных стадиях развития // Бюл. экспе-рим. Биологии и медицины. - 1956. - 41, № 2 - С. 70 - 73.

5. Александров В. Я. Клетки макромолекулы и температура. Л., 1975. 323 с.

6. Альбере Э. О. О распространении лимфоденита крупного рогатого скота в Эстонской ССР в последние годы // Сб. науч. тр. Эстонской с- х академии. - Тарту, 1958. - Т. 8 - С. 152 - 159.

7. Амирагова М. И., Савич А. В. Превращение гемоглобина под действием ионизирующей радиации // Облучение крови вне организма. М., 1980. С. 24-37.

8. Артюхов В. Г. Гемопротеиды: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения. - Воронеж: Изд. -во. ВГУ, 1995.-280 с.

9. Артюхов В. Г., Бутурлакин С. М., Шмелев В. П. Оптические методы исследования биологических систем и объектов. Воронеж, 1980. 116 с.

10. Бакулов И. А. Некоторые результаты исследований по проблеме эпизоотологического прогнозирования // Тр. ВИЭВ. - М., - 1982. - Т. 55. -С. 10-13.

п. Велик В. М. Влияние некоторых факторов среды на проявление лейкоза крупного рогатого скота // Лейкоз крупного рогатого скота. - Пер-сиановка, 1983. - С. 68 - 71.

12. Бергольц В. М., Кисляк Н. С., Еремеев В. С. Иммунология и иммунотерапия лейкозов. - М.: Медицина, 1974. - 404 с.

13. Блюменфельд Л. А. Проблемы биологической физики. М. 1977.

336 с.

14. Химические характеристики конформационно-неравновесных состояний металлсодержащих белков / Блюменфельд Л. А., Давыдов Р. М., Куприн С. П., Степанов С. В. // Биофизика. 1977. Т. 22. вып. 6. С. 977 - 994.

15. Блюменфельд Л. А., Ермаков Ю. А., Пасечник В. И. Кинетика реакции гемоглобина с окисью углерода. III. О существовании конформационно-неравновесных молекул НЬ в процессах присоединения и диссоциации СО // Биофизика. 1977. Т. 22, вып. 1. С. 8 - 14.

16. Бочарников Н. Г., Шабалов А. Т., Бурба Л. Г., Нахмансон В. М. К изучению лейкоза крупного рогатого скота в Таджикской ССР // Бюл. ВИ-ЭВ. - М., 1974. - Вып. 17. - С. 125 - 126.

17. Бреслер С. Е. Введение в молекулярную биологию М., 1966. 514 с.

18. Бронштейн В. Б., Данилова М. Н. Иммунологическая характеристика лимфоцитов крупного рогатого скота, инфицированного и свободного от онковирусной инфекции // Распознавание и меры борьбы с лейкозами человека и животных: Тез. докл. Всесоюзн. конф. / Белая Церковь, 1982. -М., - 1982. -С. 51.

19. Бурштейн Э. А. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования) // Итоги науки и техники. Биофизика. М., 1976. Т. 6. С. 15 - 38.

20. Бурба Л. Г., Валиханов В. Ф., Надточей Г. А., Сурин Б. И. Роль вирусов в этиологии лейкозов крупного рогатого скота. - М., 1976. - С. 5 -6.

21. Бурба Л. Г. Экспериментальное воспроизведение лейкоза у сельскохозяйственных животных // Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупного рогатого скота. - Рига, 1979. - С. 62 - 66.

22. Бурба Л. Г., Федорченко А. Н. Комплексная оценка иммунологического состояния больного лейкозом крупного рогатого скота // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез. докл. Всесо-юзн. конф / Ташкент. - 1984. - С. 39 - 40.

23. Бусол В. А. О генетической предрасположенности к лейкозу, внутриутробной и горизонтальной передаче его у крупного рогатого скота // Лейкоз крупного рогатого скота. - Рига: Зинатне, 1973. - С. 38 - 40.

24. Бусол В. А. Эпизоотология гемобластозов крупного рогатого скота: Авторев. дис. д-ра вет. наук. - М., 1983. - 24 с.

25.Бытева И. М., Гуринович Г. П., Пецольд О. М. О механизме фотоокисления порфиринов кислородом // Биофизика. 1975. Т. 20. вып. 1. С. 51 - 55.

26. Валихов А. Ф. Современное состояние изученности онкорновиру-са крупного рогатого скота // Бюл, ВИЭВ. - М.: 1977. - Т. XXX. - С. 16 - 17.

27. Валихов А. Ф., Шишков В. П., Бурба Л. Г. Лейкоз крупного рогатого скота (Вирусологические аспекты) // Обзорная информация ВИИТЭ-ИСХ, - М.: 1980.-80 с.

28. Виттман П., Венкер П. Исследование морфологии и ревертазной активности онкорнавирусов, выделенных от крупного рогатого скота, больного энзоотическим лейкозом // Бюл. ВИЭВ. - М., - 1977. - № 30. - С. 13-14.

29. Владимиров Ю. А., Потапенко А. Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М. 1989. 199 с.

30. Волькенштейн М. В. Биофизика. М., 1981. 575 с.

згВолькенштейн М. В., Шаронов Ю. А., Исследование ос- и Р-цепей

гемоглобина методом магнитооптического вращения // Молекул, биология. 1968. Т. 2, вып. 6. С. 864 - 868.

зг.Гламба И., Букене 3., Янушаускас К. Данные по изучению роли больных быков -производителей в передаче лейкоза потомству // Тр. Ли-тов. НИИВ. - Рига. - 1970. - Т. 4. - С. 79 - 85.

33.Громов А. Е., Соколовский В. В. К механизму образования метге-моглобина// Биохимия. 1968. Т. 33, вып. 5. С. 976 - 980.

34. Гуринович Г. П., Гуринович И. Ф., Шульга А. М. Спектрально-люминесцентное изучение продуктов фотохимических реакций порфири-нов // Доклады АН БССР. 1964. Т. 8. № 5. С. 292 - 295.

35. Дескене В. Я., Кяуне К. Я., Сороковой П. Ф., Машурова А. М. Анализ молочной продуктивности бурого латвийского скота в связи с заболеванием лейкозом и группами крови // Генетические аспекты устойчивости с\х животных к лейкозу крупного рогатого скота. - 1978. - № 16. - С. 10-18.

36. Донник И. М. Биологические особенности и устойчивость к лейкозу крупного рогатого скота в разных экологических условиях Урала. Новосибирск, 1997.

37. Доронин Н. Н., Бусол В. А. Субаев Г. X. Лейкоз крупного рогатого скота. - Киев: Урожай, 1976. - 199 с.

38. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота // Рекомендации / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1989. -48 с.

39. Емельянов А. С., Смолина К. А., Сметанина Г. К. Зоотехнические меры борьбы с заболеванием крупного рогатого скота лейкозом // Проблемы лейкозов. - М.: Колос, 1967. С. 42 - 54.

40. Ерохин Ю. Е., Красновский А. А. Спектры люминесценции фото-востановленных форм хлорофила, его производных и аналогов // Биофизика. 1961. Т. 6, вып. 4. С. 392 - 403.

41. Ефимов В. П., Дрингляне А. А., Садаускас П. Б. Содержание разных популяций лимфоцитов и их функциональная активность в крови здоровых и больных хроническим лимфолейкозом животных // Иммунология

и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Ташкент. - 1984. - С. 77 - 78.

42. Жданов В. М., Парфанович М. И. Исследование возможности культивирования вируса, выделенного из первичных культур органов больных лейкозом коров в перевиваемых клеточных линиях коровьего происхождения // Вирусы рака и лейкоза. - М.: 1974. - С. 41 - 45.

43. Жданов В. М., Парфанович М. И., Ныым Э. М. Положительные итоги многолетнего опыта по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота на телятах очищенным онковирусом и другими онкорнавируссодержащими материалами // Теоретические и практические вопросы ветеринарии. - Тарту, 197 8.-С.35 -44.

44. Жоли М. Физическая химия денатурации белков. М., 1968. 364 с.

45. Затула Д. Г. Сходство антигенов у микроорганизмов и клеток злокачественных опухолей. - Киев: Наукова Думка, 1982. - С. 90 - 95.

46. Зильбер Л. А. Вирусная теория происхождения злокачественных опухолей. - М.: Метгиз, 1946.

47. Зильбер Л. А., Ирлин И. С., Киселев Ф. Л. Эволюция вирусогене-тической теории возникновения опухолей. - М.: Наука, 1975. - С. 7 - 33.

48. Иванов В. Л. Некоторые иммунологические аспекты диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Уч. записки Казанского вет. ин - та. -1972.-Т. 113.-С. 117-120.

49. Каюшин Л. П., Грибова 3. П., Азизова О. А. Электронный парамагнитный резонанс фотопроцессов биологических соединений. М., 1973. 304 с.

50. Коломийченко М. А. Изменение физико-химических и биологических свойств белков под действием ультрафиолетового и рентгеновского облучения // Действие ионизирующих излучений на животный организм: Тез. докладов. Киев, 1958. С. 69 -'71.

51. Коломийченко М. А. Изменение физико-химических и биологических свойств белков под действием ультрафиолетового и рентгеновского облучения // Действие ионизирующих излучений на животный организм: Тез. докладов. Киев, 1960. С. 53 - 58.

52. Коромыслов Г. Ф., Климов Н. М., Яременко И. И., Коромыслова Г. JI. Биохимические и иммунологические тесты для прижизненной диагностики лейкозов крупного рогатого скота // Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупного рогатого скота. - Рига: Зинатне. 1979. - С. 84 - 88.

53. Костромитинов Н. М. Лимфоидный лейкоз крупного рогатого скота. - Казань, 1978.-40 с.

54. Красновский А. А., Умрихин А. В. Использование двухвалентного железа и аскорбиновой кислоты в качестве доноров электрона при фотохимических реакциях порфирина и хлорофилла в водных средах // Доклады АН СССР. 1958. Т. 122, № 6. С. 1061 - 1064.

55. Крикун В. А., Кумков В. Т., Нагаева Л. И. Эффективность реакции иммунодиффузии с двойным антигеном онкорнавируса типа С при оценке эпизоотологического состояния хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота // Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупного рогатого скота. -Рига: Зинатне, 1979. - С. 131 - 135.

56. Кудрявцева Т. П. Патоморфология и клинико-гематологические показатели при гемобластозах крупного рогатого скота // Материал 6 Все-союзн. конф. патанатомии животных. - Тарту, 1977. - С. 244 - 246.

57. Кукайн Р. А., Нагаева Л. И., Чапенко С. В. Выявления онкорнави-русов типа С у крупного рогатого скота со спонтанным и экспериментально производимым лимфолейкозом // Вопр. онкологии. - 1973. - Т. 19, № 7. -С. 44 - 49.

58. Кукайн Р. А., Нагаева Л. И., Чапенко С. В. Итоги многолетних наблюдений развития экспериментального индуцированного хронического лимфолейкоза крупного рогатого скота. - Рига: Зинатне, 1979. - С. 36.

59. Кукайн Р. А., Свирска Р. В., Моровска М. Ф., Татосян А. Г., Киселев Ф. Л. Поиск БЛВ -специфических последовательностей в клетках овец // Этиология, диагностика и эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота. - Рига: Зинатне, 1982. - С. 32 - 37.

60. Кулаков В. Н. Исследование реакции рекомбинации гемопротеи-дов с окисью углерода методом импульсного фотолиза // Молекул, биология. 1975. Т. 9. вып. 2. С 246 - 251.

61. Кунаков А. А., Никитенко А. М. Лейкозы сельскохозяйственных животных в Ставропольском крае // Сб. научн. тр. / Северо - Кавк. НИВИ. -1977.-Вып. 19.-С. 69 - 73.

62. Лахт Т. И., Ныым Э. М. О распространении онковирусной инфекции среди крупного рогатого скота в Эстонской ССР / Этиология, диагностика и эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота. - Рига: Зинатне, 1982.-С. 101 - 105.

63. Лебедев А. Н., Давыдов Р. М., Блюменфельд Л. А. Кинетика рекомбинации пероксидазы с окисью углерода в интервале температур от + 20 до - 70° С//Биофизика. 1981. Т. 26. вып. 5. С. 782 - 785.

64. Левашев А. Т., Смирнов П. Н. Хронобиологический переход к изучению лейкоза крупного рогатого скота. // Сиб. вестник с.-х. Науки, 1994 № 1-2, с. 58-69.

65. Лемеш В. М., Лучко В. П. Влияние некоторых экзогенных и эндогенных факторов на заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом // Ветеринарная наука - производству. Минск: «Урожай», 1979. - С. 23 - 25.

66. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. М., 1974. 957 с.

67. Логановский С. Я., Пиедниекс О. К., Мозгис В. Я., Чернобаева Л. Г. Распространение инфекции онковируса в неблагополучных по лейкозу стадах крупного рогатого скота // Этиология, диагностика и эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота. - Рига: Зинатне, 1982. - С. 106 - 112.

68. Мазуренко А. П. Что дала онкологии вирусная теория происхождения опухолей // Вопро. онкологии. - 1981. - № 5. - С. 7 - 12.

69. Манойлов С. Е. Первичные механизмы биологического действия проникающей радиации М., 1968. 184 с.

70. Манойлов Ю. С. Изменение физических свойств гемопротеидов при действии ионизируючего излучения // Проблемы энергетики в облученном организме. М., 1977. С. 10 - 96.

71. Мартынова В. А., Абакумов Е. М., Севастьянова М. Г. // Лаб. дело. - 1975.-№7.-С. 31-33.

72. Мурватулоев С. А. Влияние природно-хозяйственных и территориальных факторов на эпизоотологию и характер проявления лейкоза крупного рогатого скота./ Автореф. канд. дис. вет. наук. Москва, 1998.

73.Нахмансон В. М. О молочной продуктивности коров при лейкозе //Тр. ВИЭВ. - М., 1971.-Т. 39. -С. 65 - 69.

74. Нахмансон В. М. Эпизоотологические аспекты лейкоза крупного рогатого скота: Тез. докл. Всесоюз. симпоз. по пробл. лейкозов е.- х. животных. - Харьков, 1972. - С. 127 - 129.

75. Нахмансон В. М. Лейкоз крупного рогатого скота. - М.: Россель-хозиздат, 1986. - 221 с.

76. Незавитин А. Г. Ветеринарные аспекты концепции селекционно-племенной работы.// Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 1995 256 с.

77. Ныым Э. М. О распространении онковирусной инфекции среди крупного рогатого скота в Эстонской ССР // Распространение, вирусология и иммунология лейкоза человека и животных. - Рига: Зинатне, 1970. - С. 27 -30. ' _

78. Околелов В. И., Притужалов Ю. С. Особенности краевой эпизоотологии лейкоза и инфекции ВЛКРС в Омской области.// Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 1995 -С. 256.

79. Пакош М. П., Карбач Я. И. Некоторые физико-химические свойства гемоглобина, облученного in vitro высокими дозами рентгеновских лучей // Механизмы биологического действия ионизирующих излучений: Тез. докладов. Львов 1969. С. 222.

80. Перрутц М. Молекула гемоглобина // Молекулы и клетки. М., 1966. С. 7-29

81. Петтигрю Г. В., Мур Дж. Цитохром с. Биологические аспекты. Берлин - Хайдельберг, 1987. 228 с.

82. Парфанович М. И., Ныым Э. М., Лемеш В. М. Исследование возможности экспериментального воспроизведения ретровирусной инфекции и лейкоза у овец ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота // Вирусы рака и лейкоза. - М., 1980. - С. 125 - 127.

83.Парчинский О. Ч. Взаимосвязь между распространенностью лейкоза крупного рогатого скота и видами коров / Лейкоз крупного рогатого скота. - Рига: «Зинатне», 1974. - С. 75 - 77.

84.158 Полторак О. М., Чухрай Е. С. Физико-химические основы ферментативного катализа. М., 1971. 312 с.

85. Поляков В. Ф., Егоров В. С., Баранов И. И. Морфологический состав крови молодняка крупного рогатого скота при содержании его на интенсивно удобряемых, орошаемых пастбищах // Тр. ВИЭВ. - М., 1987 - Т. 48.-С. 3- 10.

86. Пракин В. К., Сйлкин Л. Ф., Котлярова Н. Н. Экспериментальный лейкоз овец//Тр. ВИЭВ.-М., 1981.-Т. 54. - С. 19-23.

87. Привалов П. Л., Хечинашвили Н. Н. Калориметрическое исследование тепловой денатурации цитохрома с // Биофизика. 1974. Т. 19, вып. 1. С. 14-18.

88. Привалов П. Л., Хечинашвили Н. Н. Калориметрическое исследо- ■ вание тепловой денатурации химотрипсиногена // Молекулярная биология. 1971. Т. 5. вып. 5. С. 718 - 725. -

89. Рифкинд Д. М. Гемоглобин и миоглобин // Неорганическая биохимия. М., 1978. Т. 2. С. 256 - 338.

90. Румянцев Н. В. Лейкозы с. - х. животных. - М.: Колос, 1966. - 157

с.

91. Салимов X. С., Крикун В. А. Иммунологические аспекты изучения лейкозов крупного рогатого скота // Вести, с. - х. наун. - 1985. - № 6. - С. 121 - 124.

92. Сахно В. А. Лейкоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним. - Кайнар, 1981. - С. 23.

93. Сивец Е. Ф. Изменение оптической плотности и вязкости гемоли-затов под действием ультрафиолетового облучения и нагревания // Бюл. эксперим. биологии и медеЦины. 1966. № 9. С. 62 - 65.

94. Сивец Е. Ф. Об изменениях, наступающих в гемоглобине под влиянием ультрафиолетового излучения: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 1968.34 с.

95. Слепченко А. Р., Радугина 3. Ф., Трафимова О. А. Генетический анализ популяций холмогорского и черно-пестрого скота в связи с устойчивостью к лейкозам // Лейкозы крупного рогатого скота. - Новочеркасск, 1976.-С. 42.

96. Смирнов П. Н., Смирнова В. В., Петухов В. А., Панков Б. Г. Диагностика распространения гемобластозов крупного рогатого скота в Новосибирской области./Юсобенности эпизоотологии и профилактики инфекционных болезней животных. Сб. науч. Тр. / ВССХНИЛ Сиб. отд.-ние. ИЗВСиДВ - Новосибирск, 1989.

97. Смирнов П. Н., Левашев А. Т., Незавитин А. Г., Лапшин А. И. и др. Система борьбы с лейкозом крупного рогатого скота (принципиальная схема организации оздоровительной работы) / Рекомендации. ИЭВСиДВ Новосибирск, 1991.-31 с.

98. Смирнов П. Н. Динамика Т - и В - лимфоцитов периферической крови телят от больных лимфолейкозом и здоровых коров // Сб. науч. тр., ВАСХНИЛ. - Новосибирск, 1983. - С. 73 - 74.

99. Смирнова В. В. Патоморфология, эпизоотология и вопросы иммунологии гемобластозов крупного рогатого скота в Западной Сибири: Авто-реф. дис. канд. вет. наук. - М., 1984. - 24 с.

100. Стародуб Н. Ф., Рекун Г. М., Шурьян И. М. Радиационное поражение гемоглобина. Киев, 1976. 130 с.

mi. Степанов С. В., Давыдов Р. М., Блюменфельд Л. А. Неравновесные состояния в гемопротеидах, возникающие при импульсном фотолизе их карбоксикомплексов в растворах // Конформационные изменения полимеров в растворах. Тбилиси, 1980. С. 68 - 70.

102. Сухомлинов Б. Ф. Физико-химические свойства, химическая структура индивидуальных белков при лучевой патологии // Механизмы биологического действия ионизирующих излучений: Тез. докладов. Львов, 1969. С. 292.

юз. Гетерогенная природа гемоглобинов животных с повышенной устойчивостью к гипоксии / Сухомлинов Б. Ф., Коробов В. Н., Юкало В. Г., Демчук В. В. // Укр. биохим. журн. 1978. Т. 50, № 2. С. 171 - 173.

104. Сухомлинов Б. Ф., Столяр О. Б., Эль Саадани С. С. Исследование кислородсвязывающих свойств гемоглобина крови // Республ. конференция биохимия медицине: Тез. докладов. Одесса, 1981. С. 156 - 157.

ios. Сухомлинов Б. Ф., Столяр О. Б. Исследование механизмов регуляции кислород-транспортной функции гемоглобина у облученных животных // Укр. биохим. журн. 1982. Т. 54. № 2. С. 129 - 133.

106. Табагуа М. И., Сибельдина Л. А. Исследование методом ПМР высокого разрешения активности двух ко-ферментов феррицитохрома С в реакции его восстановления НАДН // Биоорганическая химия. 1977 б. Т. 3. №1. С. 94-98.

107. Тамаускас М. К. Некоторые закономерности распространения лейкоза крупного рогатого скота в Лит. ССР // Патогенез, лечение и эпидемиология лейкоза. - Рига, 1971. - С. 36.

ios. Торчинский Ю. М., Поляновский О. Л. О роли SH-групп в тран-саминазах и некоторых других ферментах // Механизм и кинетика ферментативного катализаМ., 1964. С. 107 - 118.

109. Уманский Ю. А. Иммунологическая реактивность при каре. - Киев: Здоровье, 1974. - 238 с.

по. Умрихин В. А. Исследование фотоокисления хлорофилла и пор-фиринов методами ЭПР и УФ - спектроскопии: Автореф. дис. ... канд. физ. мат. наук. М., 1978. 21 с.

Ш.Федоров В. В. Механизм иммунологической противоинфекцион-ной защиты у животных: Тез. Всесоюзн. конф. // Ташкент, 1984. - С. 77 -78.

112. Федорова С. М., Виль Т. М., Сторжилова Т. П. Генетический контроль предрасположенности к лейкозам крупного рогатого скота // Распознавание и меры борьбы с лейкозами человека и животных. - М., 1982. - С. 200-201.

из. Федоров В. С., Игнатов А. Г. Распространение и территориальная приуроченность лейкоза крупного рогатого скота в Курганской области. // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 1995 256 с.

114. Федорова С. М., Стельмах А. В., Сторожилова Т. П., Виль Т. М., Прохорова Е. М. О влиянии факторов внешней среды на распространение лейкозов крупного рогатого скота // Матер. Респ. науч. - теорет. конф. по пробл. борьбы с инфекционными и незаразными болезнями с. - х. животных. - Тарту. - 1978. - С. 140 - 141.

115. Филатова П. В. Современные данные о лейкозе крупного рогатого скота. - М.: Колос, 1965. - С. 3 -19.

116. Филатов П. В., Князева Л. А., Баранов В. Г. К вопросу распространения лейкоза и методах оздоровления неблагополучных хозяйствах в Краснодарском крае // Лейкозы сельскохозяйственных животных. - М., 1975.-С. 230-232.

П7.Харбури Г. А., Маркс Р. Г. Цитохромы Ь и с // Неорганическая биохимия. М., 1978. Т. 2. С. 339 - 396.

118. Хаитов Р. М. Патология иммунной системы при опухолевом росте // Итоги науки и техники. - М., 1979. - Т. 8. - С. 92.

119. Хигаси К., Баба X., Рембаум А. Квантовая органическая химия. М, 1967. 379 с.

ш.Шикова А. Т., Андриян В. А., Аванесов Р. Н. Данные воспроизведения лейкоза крупного рогатого скота на гомо - и гетерологичных животных в эксперименте // Ветеринария. - Киев: Урожай, 1977. - С. 51 - 54.

121.Шиков А. Т., Бабкин А. Ф., Лутохин С. И. Клинико-гематологическое, серологическое и патоморфологическое исследование при лейкозе крупного рогатого скота // Патоморфология, патогенез и диагностика болезней с. - х. животных. - М.: Колос, 1980. - С. 195 - 196.

122. Шишков В. П. Иммунологические аспекты ветеринарной лейко-зологии // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез. Всесоюз. конф. - Ташкент, - С. 3 - 5.

123.Шишков В. П. Новые перспективы // Будущее науки. - М.: Знание, 1985. - С. 90 - 107.

124. Шишков В. П. Ветеринарная наука в условиях научно-технического прогресса // Вестник с. - х. науки. - 1986. - № 2. - С. 133 - 141.

125. Эрнст Л. К., Клабуков П. Г., Карликов Д. В. Генетический анализ популяций Бурого латвийского скота в связи с устойчивостью к лейкозу // Исследования по генетической устойчивости к лейкозу // Исследования по генетической устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу. - Дуброви-цы. 1973. - С. 19.

126. Ярчук В. М. Содержание меди, марганца и железа в крови крупного рогатого скота при лейкозе // Научн. записки Б-Церковского с. - х. инта. - Белая Церковь, 1972. - Т. 20. - С. 34 - 38.

127. Яунслейкис Э. Я., Гримберг Р. О. Связь между заболеваемостью лейкозом и продуктивностью дойных коров бурой латвийской породы в стадах Валмиерского района Латв. ССР // Лейкоз крупного рогатого скота. - Рига: «Знатне», 1974. - С. 94 - 98.

128. Abt. D. A., Marshak R. R., Ferrer J. F., Piper G. E., Bhatt D. M. Studies on the development of persistent lymphocytosis and infection with the bovine С - type leukemia virus (BVL) in cattele. - Vet. microbiol, 1976, v. 1, p. 287 - 300.

129. Anderson L. J., Jarre N. W., Drighton E. W. A. Classification of Cymphod neoplsms of domestic mammals. J. Nat. Cfncer Inst., Monogr. 1969, vol. 32, p. 343 - 353.

130. Brandts J. F., Halverson H. R., Brennan M. Consideration of the possibility thet the slow step in protein denaturaition reaction is due to cis-trans isomerism of protein residues // Biochemistry. 1975. V. 14, N 22. P.. 4953 -4963.

131.Dauhoff M. O. Atlas of protein sequence and stmsture. Silver spring: Nat. Biomed. Res. Found; 1972 V. 5. 542 p.

132. Diashop J. M. Reteoviruses and cancer genes. - Abv. Cancer Res., 1982, vol. 37, p. 1-32.

133. Cox G. S., Whitten D. G. Mechanisms for the photooxudation of pro-toporphurin IX in soution // J. Amer. Chem. Soc. 1982. V. 104. N 2. P. 516 -521.

134. Gibson Q. The photochemical formation of a quickly reacting from of haemoglobin//Biochem. J. 1959. V. 71. P. 293 - 303.

135. Gibson Q., Ainsverth S. Photosensitivity of haem compounds // Nature. 1957. V. 180. P. 1416 - 1417.

136. Clen A. C. A. Measurement of DNA and RNA in human peripheral blood limphocytes. - Clin. Chem., vol. 13, p. 299.

137. Doolittle R., Hunkapilir M., Heod L., Devare S., Ranonson S., Anto-niades H. Simian sarcoma viruscuc-gene, v-sis, is derived from the gene (or genes) encoding on plateled-derived drowth factor. - Science, 1983, vol. 221, № 4607, p, 275 - 277.

138. Flensuburg J., Streyffert B. The control of bovine leukosis in Demmar K. - Hord. Veter. Med., 1977, vol. 29, (2), p. 49 - 67.

139. Gilbden R. V., Long C. W., Hanson M. Charakteristios of the major internal protein and RNA - dependent DNA polymerase of bovine leukemia virus. - J. Gen. Virol., 1975, vol. 29, p. 305.

140. Gotze R., Rosenbergen. G. Ziegenhagen G. Uber Urrachen and Bekampfung der Kinderleukose. IV. Ubtrtragbarkeit. Dautsche fierarztl. Wo-chensehr. 1956, Bd. 63, p. 105 - 108.

141. Grundboeck M., Grundboeck-Insko J. Serologilzne rozpoznawanie bi-alaczki bydla w kraju i ocena metody i pierwszych wynikow. Med. Vet., 1982, 38, № 1 -3,p. 19-24.

142. Hakioglu F. Bovine leukosis in Turkey. - B ull. Offic. internat. Epizootics, 1964, v. 62, p. 711 - 720.

143. Hoffman B. M., Gibson Q. H. On the photosensitivity of liganded he-moproteins and their metal - substituted analogues // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 21 -25.

144. Horvath V. Zsak L. The releability of the immunodiffusionprecipita-tion test in enzootic bovine leucosis. - Acta Veter. Acad. Scient. Hung., 1979, v. 27, № 1/2, p. 145 -150.

145. Hoss H. E., Olson C. Infectivity of bovine C-type (leukemia) virus for sheep and goats. - Amer. J. Veterinary Research., 1974, vol. 35, № 5, p. 633 -637.

146. Huebner R. J., Todaro G. J. Oncogenes of RNA tumor viruses as determinate of cancer. - Proc. Net. Acad. Sei. USA, 1969, vol. 64, p. 1087 - 1091.

147. Inhoffen H. H., Brockman H., Bliesener K. M. Zur weiteren kennthis des chlerophylles und des hamins. XXX. Photoprotoporphyrine und ihre Umwandlung in spirographis - sowie isospirographisporphyrin // Liebigs Ann. Chem. 1969. Bd. 730. S. 173 - 185.

148. Keilin D., Hartree B. Cyanide compounds of ferroperoxidase. ahd myoglobine and theiling photodinamical // Biochem. J. 1955. V. 61. P. 153 -171.

149. Kruger W. Ist dis Rinder leukose eine Mineralst mangelkrankkeit. Berliner Munchener itrarztl. Wschr., 1984, v. 67, p. 149.

150. Lombard C. Les Leucoses Animales. Inst. Natl. Rech. Agron., Paris, 1968, p. 24.

151.Maksimov G. V., Orlov S. N. Effect of the volume of human and rat erythrocytes on the structure of haemoglobin protoporphyrin / Biophysics., № 5, 1992. pp. 827-831.

152. Mammerickx M. Etude epizootopigne sur les leucoses des animaux do mestignes en Belgigne de 1961 a 1970. - Ann. med. veterinarie, 1972, vol. 116, №2, p. 157- 166.

153. Mammerickx M., Porteteile D., Burny A. Experimental crosstranamission of bovine leukemia virus (BVL) between several animel apecies. Lbl. Vet. Med., 1981, b. 28, p. 69 - 81.

154. Marshak R. R., Abt D. A. Bovine leukemia, In: Experimental Leukemia sbuted dy M. A. Rich, Appleton-Gtntury-Crofts,Ntw York, 1968, p. 191 -204.

155.Mieth K., Shlufer H. Der gegenwarting in der DDR angewandte Beurteilungs schlussel der hamatologischen Leukosediagnostik. Mh. Vet. Med., 1971, v. 26, № 15, p. 563 - 567.

156. Mikalauskiene G., Dikiniene N., Makricas M., Tamosinas V. Vet. Immunol. Immunopathol., 1984, v. 7, p. 275 - 283.

157. Miller L. D., Miller J. M., Olson C. Inocuiation of calves with particles resemblung C-type virus from cultures of bovine lyphosarcoma. -J.Nat. Cancer Inst., 1972, vol. 48, № 2, p. 423 - 428.

158.Montemagne F., Paparella V., Catellni G. Contributio alle stubie dell eziologie della leucosi dei Bovine. Acta Vtdica Vet., 1957, v. 3, p. 185.

159. Muscoplat C. C., Alhajl J., Johnson D. W., Pomery K. A., Olson J. M., Larson V. L., Stevens J. B., Sorensen D. K. Characteristics of lymphocyte responses to phytomitogenes comparison of responses of limphocytes from normal and lympocytotic cows. Am. J.Vet. Res., 1974, v. 35, № 8, p. 1053 -1055.

160. Olson C., Miller L., Miller J., Hoss H. Transmission of lymphosarcoma from cattle to shee. J. Nat. Cancer Inst., 1972, v. 49, p. 1463 -1467.

161. Olson C., Miller L., Miller J. Role of C-type virus in bovine lymphosarcoma. - Bibl. Haemat., 1973, v. 39, p. 198 - 205.

162. Padlan E. A., Love W. E. Structure of haemoglobin of the marihe Ann elid worm, glycers dibranchiata at 5,5 A resolution // Nature. 1968. V. 220, N 5165. P. 376-378.

163. Perutz M. F. Structure and mechanism of haemoglobin // Brit. Med. Bull. 1976. V. 32, N3. P. 195 -208.

164. Przytulski T. Bialaczki lydla. - Prregl. hdowl, .1976, v.44, № 3, p. 13 -

14.

165. Rademacher R., Tesar A., Hafman J. a Krans. IC problematke Leukosy skotw. Veterinarstvi, 1971, R., 21, p. 260 - 262.

166. Racow B., Heldish L., Junghkhnel G. Photochemische reaktionen des hemins // Ztsch. fur Electrochemie, Beriche der' Bunsengesellschaft fur Phusikalische Chemie. 1957. V. P. 1339 - 1343.

167. Roberts D. EBL testeng programme likely to be carried out. - Scottish Farmer, 1980, p. 34.

168. Saffran W. A., Gibson Q. H. Photo-dissociation of ligands from heme and heme proteins. Effect of temperature and organic phosphate // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. P. 7955 - 7958.

169. Schuberth I. Reduction of some haemo proteins by ultraviolet light // Acta. Chem. Scand. 1956. V. 10. P. 338 - 339.

170. Schmidt F. W. Tierarztl Vmsch., 1970, № 27, p. 5.

i7i.Scoffone E., Jori G., Galiazzo G. Selective photo-oxidation of amine acids in proteins, Chem. Reactiv. and Biol. Role, Func. Grups Enzymes // Biochem. Soc. Symp. N31. London - NY, 1970. P. 163 - 165.

172. Temin A. M., Baltimore D. RNA-directed DNA systhesis and RNA tumor viruses.- Advances on virus Research. 1972, v. 17, p. 129 - 186.

173. Tsong T. Y. Ferricytochrome c chain folding measured by the energy transfer of tryptofan 59 to the heme group // Ibid. 1976. V. 19. P. 5467 - 5473.

174. UrryD. W. The heme chromophore in the ultraviolet // J. Biol. Chem. 1967. V. 242, N19. P. 4441 - 4448.

175. Warburg O. Schwermetalle als wirkungsgruppen von fermenten. Berlin - Dahlem, 1946 b. 195 s.

176. Wierner E. Die Leukose des Kinder, Jena, 1967, p. ,164.

177. Wittmann W., Liebrmann A. Enzoot., schekinderlekose. - Arch. Geschwulstforsch, 1980, Bd 50, № 7 , S. 686 - 695.

178.Photoreduction of cutochrome C! / Yu C. A., Chiang Y. L., Yu L., KingT. E. //J. Biol. Chtm. 1975. V. 250. P. 6218 - 6221.