Применение фотолюминесцентных наноматериалов и лазерных технологий для оптической визуализации биологических систем тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, доктор наук Звягин Андрей Васильевич

  • Звягин  Андрей Васильевич
  • доктор наукдоктор наук
  • 2015, ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского»
  • Специальность ВАК РФ03.01.02
  • Количество страниц 198
Звягин  Андрей Васильевич. Применение фотолюминесцентных наноматериалов и лазерных технологий для оптической визуализации биологических систем: дис. доктор наук: 03.01.02 - Биофизика. ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского». 2015. 198 с.

Оглавление диссертации доктор наук Звягин Андрей Васильевич

Введение

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Гибридные биомолекулярные фотолюминесцентные на-нокомплексы

1.1 Введение

1.2 Флуоресцентные наноалмазы

1.2.1 Электронная структура и свойств излучения азотно-вакансионного (МУ) центра

1.2.2 Интерконверсия ЫУ центра

1.2.3 Недавний прогресс в производстве и изучении сверхмалых (ультрадисперсных) МУ наноалмазов

1.2.4 Оптический имиджинг наноалмазов в биологических системах

1.3 Нанорубины

1.3.1 Методы синтеза нанорубинов

1.3.2 Квантовый выход

1.4 Антистоксовые нанофосфоры

1.4.1 Фотофизика антистоксовых нанофосфоров

1.4.2 Синтез антистоксовых нанофосфоров

1.4.3 Преимущества антистоксовых нанофосфоров

1.4.4 Ограничения антистоксовых нанофосфоров

1.4.5 Получение оптических изображений биоструктур, маркированных антистоксовыми нанофосфорами

1.5 Процедуры поверхностной модификации наночастиц. Коллоидная стабильность

1.5.1 Поверхностная модификация наноалмаза

1.5.2 Коллоидные свойства нанорубинов

1.5.3 Методы поверхностной модификации гидрофобных антистоксовых на-нофосфоров

1.6 Биоконъюгация наночастиц

1.7 Заключение главы

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Нанотоксикология и трансдермальная кинетика оксида цинка

2.1 Введение

2.2 Солнцезащитные свойства наночастиц ZnO

2.2.1 Общие аспекты защиты от УФ-излучения

2.3 Пути проникновения наночастиц

2.3.1 Структура кожи - слои и функции

2.3.2 Пути проникновения веществ через кожу

2.3.3 Физиологические факторы, влияющие на проникновение молекул и частиц в кожу

2.3.4 Факторы, повышающие проницаемость

2.4 Методы оценки проницаемости кожи для наночастиц

2.4.1 Экспериментальные модели проницаемости кожи

2.4.2 Оценка проницаемости и методы анализа

2.4.3 Нелинейная оптическая микроскопия

2.5 Биотоксичность наночастиц ZnO

2.5.1 Оценка токсичности

2.5.2 Механизмы токсичности

2.6 Заключение главы

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Флуоресцентные наноалмазы

3.1 Введение

3.2 Оптический контраст светорассеяния наноалмазов

3.2.1 Использование светорассеяния для определения размеров наноалмазов

3.2.2 Светорассеивающие наноалмазы в клетках

3.3 Флуоресцентные наноалмазы

3.3.1 Обнаружение активных азотно-вакансионных центров в сверхмалых НА

3.3.2 Регистрация и исследование одиночных ЫУ- центров в одиночных НА

3.3.3 "Мерцание" одиночных ЫУ- центров в одиночных НА

3.3.4 Влияние среды на свойства флуоресценции и мерцание одиночных ЫУ-центров в одиночных наноалмазах

3.4 Биоконъюгация флуоресцентных наноалмазов

3.4.1 Модульная биоконъюгация НА

3.4.2 Визуализация ФНА комплексов в клетках

3.5 Заключение главы

4 Нанорубины

4.1 Введение

4.2 Производство и характеризация нанорубинов

4.2.1 Производство нанорубинов методом фемтосекундной лазерной абляции

4.2.2 Производство нанорубинов и нанокорундов в шаровой мельнице

4.2.3 Коллоидная стабильность нанорубинов и нанокорундов

4.2.4 Поверхностная модификация нанокорундов

4.2.5 Тестирование цитотоксичности нанокорундов

4.3 Фотолюминесцентные свойства нанорубинов

4.4 Демонстрация применений нанорубинов в биологии

4.4.1 Бесфоновая визуализация нанорубинов

4.4.2 Динамический имиджинг нанорубинов в клетке. Трекинг

4.5 Заключение главы

5 Антистоксовые нанофосфоры

5.1 Введение

5.2 Синтез и измерения характеристик антистоксовых нанофосфоров

5.2.1 Синтез антистоксовых нанофосфоров

5.2.2 Измерение коэффициента конверсии НАФ

5.3 Получение гибридных комплексов на основе антистоксовых нанофосфоров

5.3.1 Модификация поверхности антистоксовых нанофосфоров

5.3.2 Цитотоксичность поверхностно-модифицированных антистоксовых на-нофосфоров

5.3.3 Биоконъюгация антистоксовых нанофосфоров

5.4 Изучение границ применений антистоксовых нанофосфоров в биологическом зондировании и имиджинге

5.4.1 Визуализация одиночного антистоксового нанофосфора в крови

5.4.2 Чувствительность зондирования опухоли, маркированной НАФ

5.4.3 Применение НАФ для изучения трансдермальной диффузии наночастиц 126 5.5 Заключение главы

6 Трансдермальный транспорт наночастиц оксида цинка

6.1 Введение

6.2 Прижизненная нелинейная оптическая микроскопия наноразмерного оксида цинка

6.2.1 Флуоресцентная микроскопия времени жизни, как метод контрастирования НЧ ZnO

6.2.2 Количественная оценка распределения НЧ ZnO в коже

6.2.3 Флуоресцентная микроскопия других НЧ в коже in vitro: квантовые точки

6.2.4 Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для оценки локальной диффузии в коже

6.3 Возможные токсикологические последствия растворения наночастиц ZnO на поверхности кожи

6.4 Заключение главы

7 Маркирование и оптический имиджинг клеточных структур и процессов с использованием фотолюминесцентных наночастиц

7.1 Введение

7.2 Разработка подходов для сборки гибридных биомолекулярных фотолюминесцентных нанокомплексов

7.3 Неспецифическое накопление наночастиц (квантовых точек) в клетках

7.4 Специфическая интернализация в клетках на примере активации лигандом со-матостатином

7.5 Специфическая иммобилизация на клетках гибридных сборок антистоксовых нанофосфоров-мини-антител

7.6 Специфическая интернализация на клетках гибридных сборок нанорубин-DARPin-miniSOG

7.7 Предварительные результаты применения фотолюминесцентных наносборок

для оптического имиджинга в животных моделях

7.7.1 Модель куриного эмбриона

7.7.2 Визуализация накопления БиоНАФ в опухоли мыши

Заключение

Благодарности

Литература

8 ПРИЛОЖЕНИЯ

8.1 Определение концентрации наночастиц в коллоидах

8.2 Протоколы химических реакций, использованных в работе

8.3 Протокол синтеза антистоксовых нанофосфоров

8.4 Протокол покрытия поверхности антистоксовых нанофосфоров

8.4.1 Протокол покрытия амфифильным полимером малеинового ангидрида

и октадецена (PMAO)

8.4.2 Протокол гидрофилизации антистоксовых нанофосфоров с помощью тетраметиламмоний гидроксида (ТМАГ)

8.4.3 Протокол покрытия антистоксовых нанофосфоров полиэтиленимином

8.4.4 Протокол стабилизации модифицированных полиэтиленимином антистоксовых нанофосфоров декстраном

8.4.5 Протокол импрегнации антистоксовых нанофосфоров в латексные субмикронные частицы

8.4.6 Выделение и очистка белков барназа и барстар

8.4.7 Протокол конъюгации нанорубинов с рекомбинантной спайкой DARPin-miniSOG

8.5 Инструментальные решения и методики измерений, использованных в работе

8.5.1 Измерение абсолютного коэффициента конверсии антистоксовых нано-фосфоров с помощью интегрирующей сферы

8.5.2 Схема эпилюминесцентного микроскопа с осветительным модулем Кёлера194

8.5.3 Процедуры оптического имиджинга раковой опухоли, привитой на хо-рионаллантоисной мембране куриного эмбриона

8.6 Квантовый выход нанорубина

СПИСОК ОСНОВНЫХ НАИМЕНОВАНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

НЧ - наночастица

ФЛ - фотолюминесценция

УФ - ультрафиолетовый спектральный диапазон ИК - инфракрасный спектральный диапазон НА - наноалмаз

ФНА - флуоресцентный наноалмаз

УНА - ультрадисперсный наноалмаз

НАФ - наноразмерный антистоксовый нанофосфор

Бн - Барназа - белок класса рибонуклеазы

Бс - Барстар - белок, обладающий высокой аффинностью к белку Барназа

КТ - квантовая точка

КК - коэффициент конверсии

НЛОМ - нелинейная оптическая микроскопия

АФК - активные формы кислорода

ПЭГ - полиэтиленгликоль

Б - биотин

SC - stratum corneum, роговой слой кожи

NV - азотно-вакансионный центр окраски в алмазе (nitrogen vacancy) FRET - эффект Фёрстеровской резонансной передачи энергии (Foster resonance energy transfer)

EPR - эффект увеличенной проницаемости и удержания (enhanced permeability and retention)

'q - квантовый выход или коэффициент конверсии аа - сечение поглощения a s - сечение светорассеивания г - время жизни излучения

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение фотолюминесцентных наноматериалов и лазерных технологий для оптической визуализации биологических систем»

Введение

Актуальность темы. Супрамолекулярные комплексы живой природы сложны и многофункциональны. Их составной органический материал, включающий в себя аминокислоты и нуклеиновые кислоты, позволяет создавать уникальное многообразие форм жизни. Вместе с тем, возможности органической природы ограничены. Например, трудно представить биомолекулы, клетки, живые организмы устойчивыми к агрессивным химическим средам, механическим стрессам и интенсивному электромагнитному облучению. Пополнение арсенала органической мастерской неорганическими наноматериалами позволяет создавать гибридные комплексы нового поколения. Исследование различных типов наночастиц (НЧ) для применений по всему спектру наук о жизни от фундаментальных биологических исследований до клинической терапии является одним из основных направлений новейшей нанотехнологии.

Одним из примеров такого развития является разработка биосовместимых фотолюминесцентных (ФЛ) наноматериалов с их уникальными физико-химическими и оптическими свойствами, которые позволяют существенно расширить возможности традиционных методов биомедицинского оптического имиджинга, основанных на использовании органических красителей [90] и флуоресцентных белков [63] (называемых флуоресцентными зондами) в качестве маркеров для визуализации биологических структур и процессов в клетках и тканях, что является очевидным способом улучшения локализации исследуемых клеток или диагностируемой ткани. Например, спектрально-селективная регистрация позволяет уменьшить фоновую аутофлуоресценцию ткани и улучшить локализацию маркированного очага. Важно отметить возможность специфической регистрации патологических очагов, если флуоресцентная молекула спаяна (биоконъюгирована) с направляющей молекулой, такой как антитело, пептид или метаболит. В идеальном сценарии адресной доставки флуоресцентные маркеры накапливаются исключительно в целевых клетках и патологических очагах, тем самым делая их контрастными, а значит, регистрируемыми оптическими методами. Однако существует несколько серьёзных недостатков данной методологии.

1. Подавляющее большинство флуоресцентных маркеров возбуждается светом ультрафиолетового (УФ) или видимого диапазона, переизлучая сигнал флуоресценции в видимом спектральном диапазоне. Именно в этом спектральном диапазоне происходит сильное поглощение и рассеяние возбуждающего оптического излучения биологической тканью и клетками.

2. При облучении (живой) биологической ткани возбуждается сигнал аутофлуоресценции, обусловленный флуоресцентными свойствами ткани, определяемыми такими биомолекулами как никотинамидадениндинуклеотид (НАДФ или NADH), флавинадениндинук-леотид (ФАД или FAD), кератины, порфирины и др. Хотя разделение сигналов аутофлуоресценции биологической ткани и флуоресцентного зонда осуществляется спектральными методами, эффективность этих методов ограничена [91].

3. Многократное рассеяние света накачки в толще сильнорассеивающей биоткани приводит к возвращению части света в фотоприёмник, в то время как спектральные светофильтры самого высокого качества способны подавить эту интенсивную засветку толь-

ко тысячекратно. Таким образом, чувствительность метода оптического зондирования с использованием флуоресцентных зондов оказывается существенно ограничена фоновыми засветками исследуемой живой (или иными словами, in vivo) биологической ткани, оставляя возможности сверхчувствительной оптической регистрации (вплоть до регистрации отдельных фотонов!) невостребованными.

4. Кроме того, флуоресцентные зонды являются "малогабаритными транспортными средствами" для адресной доставки. Один или в редких случаях несколько терминалов позволяют конъюгацию одного, или в редких случаях, нескольких направляющих агентов. Создание многофункциональных комплексов, включающих в себя направляющие средства адресной доставки, терапевтические средства, средства защиты от ферментной деградации и т.д., является очень серьёзным вызовом технологии флуоресцентных зондов.

ФЛ наноматериалы позволяют преодолеть ограничения оптического имиджинга, связанные со свойствами органических флуорофоров. Множество неорганических ФЛ НЧ отличаются исключительной фотостабильностью, "настраиваемыми" узкими спектрами фотолюминесценции и высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, в том числе рН и температуры, что вытекает из их неорганической природы. Эти свойства оказались востребованными для визуализации молекулярного трафика в клетках [114]. Важным примером является оптический имиджинг в режиме непрерывного слежения (трекинг) активации рецепторов клеток лигандами и дальнейшая эволюция связки рецептор-лиганд в цитоплазме клетки [112]. Несмотря на то, что возможности трекинга рецепторов были продемонстрированы посредством использования квантовых точек (КТ) [64], такие ограничения КТ, как прерывистая ФЛ и цитотоксичность, требуют использования ФЛ НЧ нового поколения. В более широкой перспективе неинвазивная визуализация редких биологических событий на самом чувствительном уровне отдельных биомолекул в течение биологически значимого интервала времени представляется грандиозной задачей, которая может быть выполнена посредством применения биогибридных фотолюминесцентных нанотехнологий, основанных на соединении неорганического наноматериала (наночастиц) с молекулами биополимеров.

Наиболее перспективной платформой для создания соединений для диагностики представляются наночастицы различной природы, обладающие уникальным набором свойств, привлекательным для получения биогибридных ФЛ наносборок с желаемой избирательностью действия. Это составляет основу конструирования биогибридных ФЛ нанокомплексов для применений в диагностике и терапии живых организмов, в своей совокупности получившей название тераностика.

Интенсивные и всесторонние разработки в области нанотехнологий не могли пройти мимо публичного внимания, озабоченного возможными рисками для здоровья, связанными с проникновением наноматериалов в организм человека - предмет исследований недавно появившейся дисциплины Нанотоксикологии. Токсикологические последствия применений косметических и фармацевтических продуктов на основе наноматериалов на коже человека находятся в зоне пристального внимания данной дисциплины. Современное состояние исследований не даёт однозначного ответа на вопрос о цитотоксичности таких наноматериалов, как оксид цинка (ZnO) и диоксид титана (TiO2), которые составляют неорганическую основу современных солнцезащитных кремов [119]. При этом научное токсикологическое сообщество придерживается той точки зрения, что лучшей стратегией предотвращения рисков, связанных с использованием нанотехнологических продуктов на коже, является предотвращение проникновения НЧ в слой живых клеток кожи (эпидермис) через тонкий роговой слой эпидермиса (stratum corneum, SC). Детальные исследования в этой области не смогли дать убедительного заключения в отношении проницаемости человеческой кожи для различного типа и размеров наноча-стиц. Одной из причин является отсутствие метода прижизненной оптической визуализации НЧ. Применение нелинейной оптической томографии для прижизненной визуализации НЧ

ZnO на поверхности человеческой кожи и в свежих биопсийных образцах позволило решить эту проблему. Нелинейный оптический имиджинг также позволил расширить возможности диагностики и классификации биологических тканей.

Целью данной работы является разработка основных концепций, методов и экспериментальная реализация функционального биомедицинского оптического имиджинга на основе фотолюминесцентных нанотехнологий.

Из широкого спектра ФЛ наноматериалов, составляющих основу молекулярных зондов, в настоящем труде представлены такие перспективные наночастицы, как флуоресцентные на-ноалмазы (ФНА), нанорубины, наноразмерные антистоксовые фосфоры (НАФ) и наночастицы оксида цинка. В работе были также использованы получившие широкое распространение квантовые точки (КТ). На реализацию полномасштабной сборки и применение многоцелевых биогибридных нанокомплексов на основе этих НЧ в области биомедицинского оптического имиджинга и зондирования и направлена настоящая работа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методы и подходы для получения и характеризации фотолюминесцентных наночастиц с заданными оптическими свойствами, а также оптимизации их физических и химических свойств. В число исследованных в работе частиц входят флуоресцентные наноалмазы, нанорубины, антистоксовые нанофосфоры и наночастицы оксида цинка.

2. Детальное изучение физико-химических и оптических свойств НЧ оксида цинка с целью изучения их возможностей для биомедицинских применений.

3. Адаптировать подходы модульной сборки биоконъюгатов наночастиц и функциональных биомолекул, где ключевой методикой является использование высокоаффинного молекулярного линкера. Отработать процедуру модульной сборки с использованием флуоресцентных наноалмазов, нанорубинов, антистоксовых нанофосфоров и таких функциональных биомолекул, как мини-антитело (фрагмент антитела), лиганды - пептиды соматостатин, энкефалин и его синтетический аналог БАМОО

4. Продемонстрировать и исследовать особенности адресной доставки биоконъюгатов на-ночастиц с нацеливающими биомолекулами к целевым клеткам.

5. Создание и оптимизация систем оптического фотолюминесцентного имиджинга для получения изображений фотолюминесцентных наночастиц: эпилюминесцентного микроскопа, обеспечивающего регистрацию с предельной чувствительностью, т.е. регистрацию одиночных наночастиц в клетках и тонких тканевых срезах; а также оптической имиджинговой системы, позволяющей зондирование локализованных участков ткани, маркированных фотолюминесцентными нанокомплексами.

6. Разработать методы нелинейного оптического имиджинга, дающие количественные оценки архитектоники структур биоткани и распределения фотолюминесцентных на-ночастиц. Исследовать проницаемость человеческой кожи для наночастиц на примере наночастиц оксида цинка ^пО), входящих в состав косметических и фармакологических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны инновационные методы производства фотолюминесцентных (ФЛ) наноча-стиц (НЧ).

(а) Получены стабильные водные коллоиды наноалмазов путём кислотного и термокислородного травления агрегатов. Контроль размера, состава поверхностных

групп и окружающей среды позволяют задавать флуоресцентные свойства азотно-вакансионного центра окраски (NV) наноалмаза. Высокий коэффициент преломления нанокристалла алмаза nND = 2, 4 в видимом спектральном диапазоне, а также

(NV) о 1П-17 2

высокие значения сечения поглощения а а = 3 х 10 см2 и квантового выхода ^NV ~ 0, 8 обеспечивают хороший оптический контраст наноалмазов в клетках.

(b) Отработана технология воспроизводимого получения наноразмерных частиц рубина с высокой фотостабильностью, высоким квантовым выходом и узкой спектральной линией излучения. Амфотерный характер кристаллической матрицы нанору-бина (Al2O3) и ионный состав буферного раствора определяют содержание ионных групп на поверхности, который остаётся нескомпенсированным, поддерживая диспергированное состояние наночастиц за счёт электростатического отталкивания.

(c) Продемонстрирован успешный метод синтеза перспективного класса НЧ, наноразмерных антистоксовых фосфоров (НАФ), обеспечивающий получение монодисперсного коллоида в размерном диапазоне от 15 до 100 нм. Абсолютный коэффициент конверсии НАФ (КК или ^ue), характеризующий преобразование мощности возбуждающего инфракрасного (ИК) излучения в мощность ФЛ видимого и ближнего ИК спектрального диапазона оказался сравнимым с лучшими мировыми показателями (^ue < 2 %). Изменение легирующего соотношения активных излучающих ионов НАФ привело к беспрецедентно высокому увеличению КК НАФ до 8 %. Покрытие поверхности НАФ амфифильным полимером, а также обработка поверхности тетраметиламмонием гидроксидом представляет собой надёжный метод гидрофилизации наночастиц, обеспечивая при этом наличие на поверхности карбоксильных групп, облегчающих дальнейшую процедуру биоконъюгации.

(d) Наночастицы (НЧ) оксида цинка со средним размером около 25 нм демонстрируют высокий оптический контраст на фоне аутофлуоресценции биологической ткани (кожи). Контрастная визуализация НЧ ZnO в живой коже и биопсийных образцах с помощью нелинейной оптической томографической системы обусловливается высокими значениями нелинейной восприимчивости 2-го и 3-го порядка (соответ-

(2) (3)

ственно, XznO и XznO), а также спектральным положением основной полосы излучения ZnO в стороне от интенсивного сигнала аутофлуоресценции. Так, XznO было пересчитано в двухфотонное сечение поглощения НЧ ZnO диаметром 18 нм, aZnO = 0, 26 GM, которые превышало аналогичные показатели эндогенных флуо-рофоров, определяющих сигнал аутофлуоресценции биологической ткани. Это позволило получить численные оценки концентрации и распределения НЧ ZnO в коже человека с помощью нелинейной оптической томографии.

Разработана универсальная платформа биоконъюгации, в основе которой лежит модульная самосборка биогибридных ФЛ нанокомплексов. Одним из модульных компонентов выступает поверхностно-модифицированная НЧ, другим - нацеливающая биомолекула, характеризующаяся высокой аффинностью к целевым клеткам. Комплементарным модульным компонентом может быть терапевтический агент, например, фототоксичный флуоресцентный белок Killer Red. Самосборка модуля осуществлялась посредством молекулярных адапторов - молекулярных пар стрептавидин:биотин и барназа:барстар.

Адресная доставка биогибридного ФЛ нанокомплекса в целевые клетки обеспечивается выбором нацеливающих биомолекул - пептид соматостатин (SST) - лиганд соматоста-тиновых рецепторов (e.g. sst2^) клеток эндокринной системы, нейронов, а также раковых клеток; пептид энкефалин или его синтетический аналог DAMGO - лиганды к опиоидному рецептору; фрагмент антитела 4D5scFv, аффинный к рецептору семейства эпидермального фактора роста HER2/neu.

4. Некоторые типы наночастиц предоставляют возможности оптического имиджинга, неосуществимые с помощью традиционных флуорофоров, включая значительное увеличение чувствительности регистрации/контрастности изображения в биоткани вследствие длительного времени жизни ФЛ в сравнении с временем жизни аутофлуоресцен-ции биоткани, и/или "антистоксового" характера фотолюминесценции, где возбуждение происходит при более низкой энергии фотона, нежели энергия фотона фотолюминесценции. Был разработан метод отложенной оптической регистрации, позволивший получить бесфоновые изображения наночастиц рубина в клетках и НАФ в биоткани, полностью подавив сигналы возбуждающего лазерного излучения и аутофлуоресценции клеток.

5. Были разработаны, построены и опробованы уникальные системы оптической микроскопии для сверхчувствительной визуализации наночастиц: (а) дискретных одиночных наночастиц алмаза, используя высокий показатель преломления алмаза и захват изображения камерой с электронным умножением (EMCCD), работающей в режиме счёта одиночных фотонов; (б) дискретных флуоресцентных наноалмазов и нанорубинов с использованием лабораторной системы лазерно-сканирующего конфокального микроскопа; (в) одиночных антистоксовых нанофосфоров с помощью эпилюминесцентного микроскопа, позволяющего регистрацию с предельной чувствительностью в клетках и тонких тканевых срезах. Также созданы системы оптического фотолюминесцентного имиджинга, позволяющие зондирование локализованных участков ткани, маркированных биогибридными ФЛ нанокомплексами. Были продемонстрированы сверхчувствительные сенсоры одиночных ФЛ частиц НАФ на основе микроструктурированного оптоволокна. Было продемонстрировано использование метода FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) для определения локального коэффициента диффузии в биологических тканях.

Научная новизна:

1. Разработаны новые методы получения наночастиц для биомедицинского имиджинга. Монодисперсные коллоиды наноалмазов получены оригинальным методом кислотной очистки. Доказано существование азотно-вакансионных центров окраски в наноалмазах детонационного происхождения, размером около 5 нм. Также продемонстрирован метод термокислородного травления частиц алмазов, позволяющий производить наноалмазы с контролируемыми размерами. Показано, что оксидирование поверхности увеличивает квантовый выход NV-центров, в то время как гидрогенизация - подавляет.

Предложены два оригинальных подхода к получению наноразмерных частиц рубина: метод лазерной абляции и метод шаровой мельницы высокой энергии. Впервые использованы нанорубины в качестве ФЛ частиц, позволяющих добиться предельно возможного оптического контраста на фоне, создаваемом аутофлуоресценцией клеток и све-торассеиванием возбуждающего лазерного излучения. Ионизация поверхностных групп кристаллической матрицы нанорубина А120з в воде создаёт поверхностный заряд, стабилизирующий нанорубины; а хемосорбция ионов буферного раствора перезаряжает нанокристалл А1203, оставляя поверхностный заряд нескомпенсированным, тем самым стабилизируя нанорубины в буферах и биологических жидкостях.

Впервые было получено самое высокое на сегодняшний день значение коэффициента конверсии гцис < 8 % наноразмерных антистоксовых нанофосфоров за счёт увеличения концентрации легирования ионов активаторов (тулия, Tm) и увеличения интенсивности возбуждающего излучения.

2. Впервые было продемонстрировано, что, несмотря на низкий квантовый выход, нано-частицы оксида цинка производят оптически-контрастные изображения на фоне пара-

зитного оптического фона от биологической ткани при нелинейном оптическом возбуждении ультракороткими (~ 100 фемтосекунд) импульсами. Посредством прижизненной визуализации показано, что НЧ ZnO остаются на поверхности нормальной человеческой кожи, не проникая в эпидермальный слой живых клеток. Развит метод нелинейной оптической томографии для оценки распределения в биологических тканях наночастиц ZnO, антистоксовых нанофосфоров, квантовых точек и эндогенных меланосом. Численные оценки концентрации и распределения НЧ ZnO в коже человека с помощью нелинейной оптической томографии были также получены впервые.

3. Продемонстрировано применение технологии модульной самосборки для создания фотолюминесцентных нанокомплексов на основе наноалмазов и антистоксовых нанофосфоров (НАФ). К поверхности НЧ, покрытой амфифильным полимером, был пришит белковый адаптор барстар, связывающийся с высокой аффинностью с комплементарным белком барстар, входящим в комплекс рекомбинантной сборки барназа-(красный флуоресцентный белок), барназа-(фрагмент антитела 4D5scFv). Продемонстрировано присоединение терапевтического агента, фототоксичного флуоресцентного белка Killer Red к НАФ. Впервые было проведено сравнительное исследование иммуннохимических свойств молекулярных адапторов стрептавидин:биотин и барназа:барстар, где был выявлен нежелательный фон в случае использования стрептавидин:биотин из-за неспецифического связывания с подложкой и эндогенным биотином, и его подавление в случае использования адапторов барназа.барстар.

4. Впервые был продемонстрирован метод измерения диаметра диэлектрических наночастиц на базе оптической микроскопии одиночных наноалмазов. Была создана оригинальная гибридная атомно-силовая/конфокальная система, позволяющая осуществлять визуализацию, спектрально-оптические и квантовые измерения одиночных наноалмазов и нанорубинов, одиночных центров окраски наноалмазов. С помощью эпилюминесцент-ного микроскопа была впервые продемонстрирована предельная чувствительность регистрации одиночного антистоксового нанофосфора, изображение которого было получено через 250 мкм крови, что позволило оценить возможность прижизненного имиджинга одиночных ФЛ НЧ в клетках и тонких тканевых срезах. Впервые была показана возможность оптического зондирования рака молочной железы на глубине 5 мм, маркированного биоконъюгатами НАФ. Был впервые продемонстрирован метод отложенной оптической регистрации, инкорпорированный в конфигурации как лазерно-сканирующего конфокального, так и эпилюминесцентного микроскопов. При получении изображения нанорубина с временем жизни ФЛ t^r = 3, 3 мс был полностью подавлен фон возбуждающего лазерного излучения и аутофлуоресценции, показав улучшение соотношения сигнал-шум, как минимум, в 100 раз.

Научная и практическая значимость Научная значимость работы имеет несколько важных аспектов.

1. Были раздвинуты границы понимания фотофизики наноматериалов на примере изучения свойств азотно-вакансионных центров в наноалмазах, Cr3+ излучателей в наноруби-нах и комбинации сенсибилизаторов (Yb3+)+ активаторов (Er3+ или Tm3+) в антистоксовых нанофосфорах;

2. была разработана методология полномасштабной сборки биогибридных ФЛ наноком-плексов, начиная с производства/синтеза НЧ до сборки и тестирования функциональных модулей;

3. были исследованы механизмы рецептор-зависимого эндоцитоза наночастиц;

4. были введены в практику методики неинвазивного оптического имиджинга НЧ для исследования проницаемости кожи, классификации физиологического состояния биоткани на основе анализа её коллагенового матрикса.

Практическая значимость данных разработок заключается в их использовании в медицинской диагностике, а также в новой научной дисциплине, называемой тераностикой, объединяющей в единое процедурное целое диагностику и терапию. Возможность адресной доставки биогибридного наночастичного комплекса к патологически изменённым клеткам, дающая возможность визуализации патологии, а также терапевтического воздействия на неё, является новым, перспективным направлением в наномедицине. Практическая значимость представленной работы также заключается в новых методиках, позволяющих систематически исследовать проницаемость человеческой кожи для наночастиц, приводящих к созданию нетоксичных косметических и фармакологических препаратов, таких как солнцезащитных кремов на основе наночастиц оксида цинка, а также дермальных и трансдермальных средств доставки терапевтических препаратов.

Степень достоверности полученных результатов обеспечивается следующими показателями:

• Строгостью применяемых экспериментальных методик и анализов полученных данных. Результаты получены на современном сертифицированном оборудовании.

• Все заявленные результаты опубликованы в солидных научных журналах, пройдя строгую критическую оценку рецензентов.

• Результаты находятся в соответствии с результатами, полученными другими авторами.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на:

1. Серии семинаров в научно-исследовательских учреждениях, в которых выполнялась работа:

• Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, в рамках семинаров Лаборатории Оптической Тераностики;

• Университет Маккуори (Сидней, Австралия), в частности на семинарах MQ Biofocus Research Centre;

• Институт проблем лазерных и информационных технологий российской академии наук (ИПЛИТ);

• Институт биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова Российской академии наук (ИБХ).

2. Приглашённых докладах в рамках международных конференций: 1. The 4th International Conference on Science and Applied Research, Post-Genome Methods of Analysis in Biology and Laboratory and Clinical Medicine, 29.10 - 1.11.2014, Kazan; 2. XII International Conference on Nanostructured Materials (NANO 2014), 13.07 - 18.07.2014, Moscow; 3. Science for Future, 17.09 - 20.09.2014, St. Petersburg; 4. International Symposium Topical Problems of Biophotonics (TPB), July 2013, Nizhniy Novgorod; 5. Optics in Life Sciences, OSA Topical meeting, Monterey, April 2011, CA, USA; 6. Laser Applications in Life Sciences (LALS) 2010, Oulu, Finland; 7. III Nanotechnology International Forum (Rusnano), 2010, Moscow; 8. Laser Applications in Life Sciences (LALS) 2008, Taiwan; 9. Australian Institute of Physics Forum, December 2008, Adelaide; 10. International Conference on Coherent and Nonlinear Optics/International Conference on Lasers, Applications, and Technologies,

ICONO/LAT 2007, Minsk, Belarus, 28.05 - 1.06.2007; Advanced Optical Imaging Workshop, Melbourne, 20.11 - 21.11.2006; 11. 5th International Symposium "Laser Technologies and Lasers", Smolyan, Bulgaria, 4.10 - 7.10.2006.

3. Международных конференциях с полномасштабным рецензированием трудов конференции: 1. NanoScience + Engineering, SPIE Optics+Photonics, 19.08 - 21.08.2014, San-Diego, USA; 2. Conference on Novel Biophotonic Techniques and Applications II (NBTA), Munich, Germany, 12.05 - 14.05.2013 (Novel Biophotonic Techniques and Applications II Book Series: Proceedings of SPIE vol. 8801, 88010C, 2013); 3. Novel Biophotonic Techniques and Applications II, Munich, Germany, 12.05.2013; 4. Novel Biophotonics Techniques and Applications, 22.05 - 24.05.2011, Munich, Germany (Proc. SPIE, vol. 8090, 80900V, 2011); 5. Photonics 2010, Tenth International Conference on Fiber Optics and Photonics (Proceedings of SPIE Vol. 8173, 2011); 6. Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering, vol. 7715 (2010); 7. SPIE Photonics Europe 2010. Biophotonics: Photonic Solutions for Better Health Care, 12.04 - 16.04.2010, Brussels, Belgium; 8. Optical methods and Optical Coherence Tomography in Biomedicine IX Conference, 23.01 - 26.01.2005, San Jose, CA, USA; 9. Optical methods and Optical Coherence Tomography in Biomedicine IX Conference, 27.01 - 30.01.2004, San Jose, CA, USA

4. В общей сложности, по результатам представленной работы сделано более 80 докладов различных форматов.

Личный вклад. Автор принимал активное участие в получении всех перечисленных выше результатов. Были подготовлены и опубликованы следующие монографии: [230, 229, 223, 224, 225].

Похожие диссертационные работы по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Звягин Андрей Васильевич, 2015 год

Литература

1. Standards australia limited/standards new zealand, as/nzs 60825. sydney, au and Wellington, nz: Sai global limited. p. 1-48.

2. A. S. Akhmanov, A. V. Zvyagin, A. V. Nechaev, V. Ya. Panchenko, V. N. Seminogov, V. A. Semchishen, V. I. Sokolov, and E. V. Khaydukov. Fibre-optic imaging modality allows high-contrast infrared visualisation of biological structures labelled with upconversion nanoparticles NaYF4:Yb3+Tm3+. Perspective Materials, 14, 2013.

3. S. A. Alexandrov, R. Meredith, T. J. Mclntyre, and A. V. Zvyagin. Holographic digital Fourier microscopy for selective Imaging of biological tissue. International Journal of Imaging Systems and Technology, 14(6):253-258, 2004.

4. S. A. Alexandrov, A. V. Zvyagin, K. K. M. B. D. Silva, and D. D. Sampson. Bifocal-optical coherenc refractometry of turbid media. Optics Letters, 28(2):117-119, 2003.

5. Y. G. Anissimov, X. Zhao, M. S. Roberts, and A. V. Zvyagin. Fluorescence recovery after photo-bleaching as a method to determine local diffusion coefficient in the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics, 435(1):93-97, 2012.

6. J. J. Armstrong, M. S. Leigh, I. D. Walton, A. V. Zvyagin, S. A. Alexandrov, S. Schwer, D. D. Sampson, D. R. Hillman, and P. R. Eastwood. In vivo size and shape measurement of the human upper airway using endoscopic long-range optical coherence tomography. Optics Express, 11(15):1817-1826, 2003.

7. F. Auzel. Upconversion and anti-stokes processes with f and d ions in solids. Chemical Reviews, 104(1):139-173, 2004.

8. D. Axelrod, D. E. Koppel, J. Schlessinger, E. Elson, and W. W. Webb. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal, 16(9):1055 - 1069, 1976.

9. A. S. Barnard and M. Sternberg. Substitutional nitrogen in nanodiamond and bucky-diamond particles. Journal Of Physical Chemistry B, 109(36):17107-17112, 2005.

10. A. Batalov, C. Zierl, T. Gaebel, P. Neumann, I. Y. Chan, G. Balasubramanian, P. R. Hemmer, F. Jelezko, and J. Wrachtrup. Temporal coherence of photons emitted by single nitrogen-vacancy defect centers in diamond using optical Rabi-oscillations. Physical Review Letters, 100(7), 2008.

11. M. Benezra, O. Penate-Medina, P. B. Zanzonico, D. Schaer, H. Ow, A. Burns, E. DeStanchina, V. Longo, E. Herz, S. Iyer, J. Wolchok, S. M. Larson, U. Wiesner, and M. S. Bradbury. Multimodal silica nanoparticles are effective cancer-targeted probes in a model of human melanoma. Journal Of Clinical Investigation, 121(7):2768-2780, 2011.

12. J. M. Berg and Y. .G Shi. The galvanization of biology: A growing appreciation for the roles of zinc. Science, 271(5252):1081-1085, 1996.

13. S.-W. Bian, I. A. Mudunkotuwa, T. Rupasinghe, and V. H. Grassian. Aggregation and dissolution of 4nm ZnO nanoparticles in aqueous environments: influence of pH, ionic strength, size, and adsorption of humic acid. Langmuir, 27(10):6059-6068, 2011.

14. P. Blazkiewicz, K. Blazkiewicz, A. Verhaege, Y. G. Anissimov, M. S. Roberts, and A. V. Zvyagin. Dialysis-assisted fiber optic spectroscopy for in situ biomedical sensing. Journal of Biomedical Optics, 11(1), 2006.

15. P. Blazkiewicz, M. Gourlay, J. R. Tucker, A. D. Rakic, and A. V. Zvyagin. Signal-to-noise ratio study of full-field Fourier-domain optical coherence tomography. Applied Optics, 44(36):7722-7729, 2005.

16. N. Bogdan, F. Vetrone, G. A. Ozin, and J. A. Capobianco. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Letters, 11(2):835-840, 2011.

17. J. A. Bouwstra and M. Ponec. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1758(12):2080-2095, 2006.

18. J.n-C. Boyer, M.-P. Manseau, J. I. Murray, and F. C. J. M. van Veggel. Surface Modification of upconverting NaYF4 nanoparticles with PEG-phosphate ligands for NIR (800 nm) biolabeling within the biological window. Langmuir, 26(2):1157—1164, 2010.

19. Boyer, J.-C. and van Veggel, F. C. J. M. Absolute quantum yield measurements of colloidal NaYF4: Er3+, Yb3+ upconverting nanoparticles. Nanoscale, 2(8):1417-1419, 2010.

20. C. Bradac, T. Gaebel, N. Naidoo, M. J. Sellars, J. Twamley, L. J. Brown, A. S. Barnard, T. Plakhotnik, A. V. Zvyagin, and J. R. Rabeau. Observation and control of blinking nitrogen-vacancy centres in discrete nanodiamonds. Nature Nanotechnology, 5(5):345-349, 2010.

21. C. Bradac, T. Gaebel, C. I. Pakes, J. M. Say, A. V. Zvyagin, and J. R. Rabeau. Effect of the Nanodiamond Host on a Nitrogen-Vacancy Color-Centre Emission State. Small, 9(1):132-139, 2013.

22. A. V. Bykov, A. P. Popov, M. Kinnunen, T. Prykari, A. V. Priezzhev, and R. Myllyla. Skin phantoms with realistic vessel structure for OCT measurements. In Kinnunen, M. and Myllyla, R., editor, Laser Applications in Life ScienceS, volume 7376 of Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering. Univ. Oulu, Optoelectron & Measurement Tech Lab; Moscow State Univ., Int Laser Ctr; VTT Tech Res Ctr Finland; Bioctr Oulu; Univ E Finland; European Phys. Soc.; Fed. Finish Learned Soc.; SPIE, 2010. Conference on Laser Applications in Life Sciences, Oulu, FINLAND, JUN 09-11, 2010.

23. W. C. W. Chan and S. M. Nie. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science, 281(5385):2016-2018, 1998.

24. Y.-R. Chang, H.-Y. Lee, K. Chen, C.-C. Chang, D.-S. Tsai, C.-C. Fu, T.-S. Lim, Y.-K. Tzeng, C.-Y. Fang, C.-C. Han, H.-C. Chang, and Wu.n Fann. Mass production and dynamic imaging of fluorescent nanodiamonds. Nature Nanotechnology, 3(5):284-288, 2008.

25. G. Chen, J. Shen, T. Y. Ohulchanskyy, N. J. Patel, A. Kutikov, Z. Li, J. Song, R.a K. Pandey, H. Agren, P. N. Prasad, and G. Han. (alpha-NaYbF4 :Tm3+)/CaF2 core/shell nanoparticles with efficient near-infrared to near-infrared upconversion for high-contrast deep tissue bioimaging. ACS Nano, 6(9):8280-8287, 2012.

26. Y.-Y. Chen, H.n Shu, Y. Kuo, Y.-K. Tzeng, and H.-C. Chang. Measuring Forster resonance energy transfer between fluorescent nanodiamonds and near-infrared dyes by acceptor photobleaching. Diamond and Related Materials, 20(5-6):803-807, 2011. 21st European Conference on Diamond, Diamond-Like Materials, Carbon Nanotubes, and Nitrides, Budapest, HUNGARY, SEP 05-09, 2010.

27. X. Cheng, R. Gondosiswanto, S. Ciampi, P. J. Reece, and J. J. Gooding. One-pot synthesis of colloidal silicon quantum dots and surface functionalization via thiol-ene click chemistry. Chemical Communications, 48(97):11874—11876, 2012.

28. H. Chew. Radiation And Lifetimes of Atoms inside Dielectric Particles. Physical Review A, 38(7):3410-3416, 1988.

29. P.-H. Chung, E. Perevedentseva, and C.-L. Cheng. The particle size-dependent pbotoluminescence of nanodiamonds. Surface Science, 601(18):3866-3870, 2007. 24th European Conference on Surface Science (ECOSS-24), Paris, FRANCE, SEP 04-08, 2006.

30. F. Cichos, C. von Borczyskowski, and M. Orrit. Power-law intermittency of single emitters. Current Opinion In Colloid & Interface Science, 12(6):272-284, 2007.

31. J. C. Clements, A. V. Zvyagin, K. K. M. B. D. Silva, T. Wanner, D. D. Sampson, and W. A. Cowling. Optical coherence tomography as a novel tool for non-destructive measurement of the hull thickness of lupin seeds. Plant Breeding, 123(3):266-270, 2004.

32. Y. Colpin, A. Swan, A. V. Zvyagin, and T. Plakhotnik. Imaging and sizing of diamond nanoparticles. Optics Letters, 31(5):625-627, 2006.

33. Cross, S. E. and Innes, B. and Roberts, M. S. and Tsuzuki, T. and Robertson, T. A. and McCormick, P. Human skin penetration of sunscreen nanoparticles: In-vitro assessment of a novel micronized zinc oxide formulation. Skin Pharmacology and Physiology, 20(3):148-154, 2007.

34. B. O. Dabbousi, J. Rodriguez-Viejo, F. V. Mikulec, J. R. Heine, H. Mattoussi, R. Ober, K. F. Jensen, and M. G. Bawendi. (CdSe)ZnS core - - shell Quantum dots: Synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. The Journal of Physical Chemistry B, 101(46):9463-9475, 1997.

35. D. C. Dai, S. J. Xu, S. L. Shi, M. H. Xie, and C. M. Che. Efficient multiphoton-absorption-induced luminescence in single-crystalline ZnO at room temperature. Optics Letters, 30(24):3377-3379, 2005.

36. Y. Dancik, A. Favre, C. J. Loy, A. V. Zvyagin, and M. S. Roberts. Use of multiphoton tomography and fluorescence lifetime imaging to investigate skin pigmentation in vivo. Journal of Biomedical Optics, 18(2), 2013.

37. G. Davies and M.F. Hamer. Optical studies of the 1.945 eV vibronic band in diamond. Proc. Royal Soc. London Ser. A, 348:285 - 298, 1976.

38. M. Del Nero, C. Galindo, R. Barillon, E. Halter, and B. Made. Surface reactivity of alpha-Al2O3 and mechanisms of phosphate sorption: In situ ATR-FTIR spectroscopy and zeta potential studies. Journal of Colloid and Interface Science, 342(2):437-444, 2010.

39. S. M. Deyev, R. Waibel, E. N. Lebedenko, A. P. Schubiger, and A. Pluckthun. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module. Nature Biotechnology, 21(12):1486-1492, 2003.

40. V. Y. Dolmatov. Detonation synthesis ultradispersed diamonds: Properties and applications. Uspekhi Khimii, 70(7):687-708, 2001.

41. A. M. Edmonds, M. A. Sobhan, V. K. A. Sreenivasan, E. A. Grebenik, J. R. Rabeau, E. M. Goldys, and A. V. Zvyagin. Nano-Ruby: A Promising Fluorescent Probe for Background-Free Cellular Imaging. Particle & Particle Systems Characterization, 30(6):506-513, 2013.

42. Feltis, B.e N. and OKeefe, S. J. and Harford, A. J. and Piva, T. J. and Turney, T. W. and Wright, P. F. A. Independent cytotoxic and inflammatory responses to zinc oxide nanoparticles in human monocytes and macrophages. Nanotoxicology, 6(7):757-765, 2012.

43. N. M. Franklin, N. J. Rogers, S. C. Apte, G. E. Batley, G. E. Gadd, and P. S. Casey. Comparative toxicity of nanoparticulate ZnO, bulk ZnO, and ZnCl2 to a freshwater microalga (Pseudokirchneriella subcapitata): The importance of particle solubility. Environmental Science & Technology, 41(24):8484-8490, 2007.

44. P. Frantsuzov, M. Kuno, B. Janko, and R. A. Marcus. Universal emission intermittency in quantum dots, nanorods and nanowires. Nature Physics, 4(7):519-522, 2008.

45. T. J. Franz. Percutaneous absorption. On the relevance of in vitro data. Journal of Investigative Dermatology, 64:190-195, 1975.

46. C.-C. Fu, H.-Y. Lee, K. Chen, T.-S. Lim, H.-Y. Wu, P.-K. Lin, P.-K. Wei, P.-H. Tsao, H.-C. Chang, and W. Fann. Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(3):727-732, 2007.

47. C. F. Gainer, U. Utzinger, and M. Romanowski. Scanning two-photon microscopy with upconverting lanthanide nanoparticles via richardson-lucy deconvolution. Journal of Biomedical Optics, 17(7):076003-1-076003-7, 2012.

48. A. O. Gamer, E. Leibold, and B. van Ravenzwaay. The in vitro absorption of microfine zinc oxide and titanium dioxide through porcine skin. Toxicology in vitro, 20(3):301-307, 2006.

49. A. N. Generalova, I. K. Kochneva, E. V. Khaydukov, V. A. Semchishen, A. E. Guller, A. V. Nechaev, A. B. Shekhter, V. P. Zubov, S. M. Deyev, and A. V. Zvyagin. Submicron polyacrolein particles in situ embedded with upconversion nanoparticles for bioassay. Nanoscale, in press, 2014.

50. A. N. Generalova, S. V. Sizova, T. A. Zdobnova, M. M. Zarifullina, M. V. Artemyev, A. V. Baranov, V. A. Oleinikov, V. P. Zubov, and S. M. Deyev. Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays. Nanomedicine, 6(2):195-209, 2011.

51. K. W. Goyne, A. R. Zimmerman, B. L. Newalkar, S. Komarneni, S. L. Brantley, and J. Chorover. Surface charge of variable porosity Al2O3(s) and SiO2(s) adsorbents. Journal of Porous Materials, 9(4):243-256, 2002.

52. E. A. Grebenik, A. Nadort, A. N. Generalova, A. V. Nechaev, V. K. A. Sreenivasan, E. V. Khaydukov, V. A. Semchishen, A. P. Popov, V. I. Sokolov, A. S. Akhmanov, V. P. Zubov, D. V. Klinov, V. Y. Panchenko, S. M. Deyev, and A. V. Zvyagin. Feasibility study of the optical imaging of a breast cancer lesion labeled with upconversion nanoparticle biocomplexes. Journal of Biomedical Optics, 18(7), 2013.

53. A. Gruber, A. Drabenstedt, C. Tietz, L. Fleury, J. Wrachtrup, and C. von Borczyskowski. Scanning confocal optical microscopy and magnetic resonance on single defect centers. Science, 276(5321):2012-2014, 1997.

54. A. Gruber, A. Drabenstedt, C. Tietz, L. Fleury, J. Wrachtrup, and C. vonBorczyskowski. Scanning confocal optical microscopy and magnetic resonance on single defect centers. Science, 276(5321):2012-2014, 1997.

55. A. E. Guller, A. N. Generalova, E. V. Petersen, A. V. Nechaev, I. A. Trusova, N. N. Landyshev, A. Nadort, E. A. Grebenik, S. M. Deyev, A. B. Shekhter, and A. V. Zvyagin. Cytotoxicity and non-specific cellular uptake of bare and surface-modified upconversion nanoparticles in human skin cells. Nano Research, in press, 2014.

56. Gulson, B. and McCall, M. and Korsch, M. and Gomez, L. and Casey, P. and Oytam, Y. and Taylor, A. and McCulloch, M. and Trotter, J. and Kinsley, L. and Greenoak, G. Small amounts of zinc from zinc oxide particles in sunscreens applied outdoors are absorbed through human skin. Toxicological Sciences, 118(1):140-149, 2010.

57. L. Guo, S. H. Yang, C. L. Yang, P. Yu, J. N. Wang, W. K. Ge, and G. K. L. Wong. Highly monodisperse polymer-capped ZnO nanoparticles: Preparation and optical properties. Applied Physics Letters, 76(20):2901-2903, 2000.

58. C. Hanley, A. Thurber, C. Hanna, A. Punnoose, J. Zhang, and D. G. Wingett. The influences of cell type and ZnO nanoparticle size on immune cell cytotoxicity and cytokine induction. Nanoscale Research Letters, 4(12):1409-1420, 2009.

59. C. Hariharan. Photocatalytic degradation of organic contaminants in water by ZnO nanoparticles: Revisited. Applied Catalysis A - General, 304(1):55-61, 2006.

60. K. B. Hartman, L. J. Wilson, and M. G. Rosenblum. Detecting and treating cancer with nanotechnology. Molecular Diagnosis & Therapy, 12(1):1-14, 2008.

61. M. V. Hauf, B. Grotz, B. Naydenov, M. Dankerl, S. Pezzagna, J. Meijer, F. Jelezko, J. Wrachtrup, M. Stutzmann, F. Reinhard, and J. A. Garrido. Chemical control of the charge state of nitrogen-vacancy centers in diamond. Physical Review B, 83(8), 2011.

62. M. P. Hehlen, G. Frei, and H. U. Gudel. Dynamics of infrared-to-visible up-conversion in Cs3Lu-2Br9: 1% Er3+. Physical Review B, 50(22):16264-16273, 1994.

63. R. Heim, A. B. Cubitt, andR. Y. Tsien. Improved Green Fluorescence. Nature, 373(6516):663-664, 1995.

64. M. Howarth, W. Liu, S. Puthenveetil, Y. Zheng, L. F. Marshall, M. M. Schmidt, K. D. Wittrup, M. G. Bawendi, and A. Y. Ting. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nature Methods, 5(5):397-399, 2008.

65. L. C. L. Huang and H. C. Chang. Adsorption and immobilization of cytochrome c on nanodiamonds. Langmuir, 20(14):5879-5884, 2004.

66. X. H. Huang, I. H. El-Sayed, W. Qian, and M. A. El-Sayed. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods. Journal of the American Chemical Society, 128(6):2115—2120, 2006.

67. Y. Y. Hui, B. L. Zhang, Y. C. Chang, C. C. Chang, H. C. Chang, J. H. Hsu, K. Chang, and F. H. Chang. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy of lipid-encapsulated fluorescent nanodiamonds in living cells. Optics Express, 18(6):5896-5905, 2010.

68. K. Iakoubovskii and G. J. Adriaenssens. Luminescence excitation spectra in diamond. Physical Review B, 61(15):10174-10182, 2000.

69. N. Yu. Ignatieva, A. E. Guller, O. L. Zakharkina, B. Sandnes, A. B. Shekhter, V. A. Kamensky, and A. V. Zvyagin. Laser-induced modification of the patellar ligament tissue: comparative study of structural and optical changes. Lasers in Medical Science, 26(3):401-413, 2011.

70. F. A. Inam, M. D. W. Grogan, M. Rollings, T. Gaebel, J. M. Say, C. Bradac, T. A. Birks, W. J. Wadsworth, S. Castelletto, J. R. Rabeau, and M. J. Steel. Emission and Nonradiative Decay of Nanodiamond NV Centers in a Low Refractive Index Environment. ACS Nano, 7(5):3833-3843, 2013.

71. E. A. Ivukina, V. K. A. Sreenivasan, O. A. Stremovskiy, B. V. Veryugin, S. V. Lukash, A. V. Zvyagin, S. M. Deyev, and R. V. Petrov. Fluorescent Nanodiamond Bioconjugates on the Base ofBarnase: Barstar Module. Doklady Biochemistry and Biophysics, 440(1):231-233, 2011.

72. S.-R. Ji, C. Liu, B. Zhang, F. Yang, J. Xu, J. Long, C. Jin, D.-L. Fu, Q.-X. Ni, and X.-J. Yu. Carbon nanotubes in cancer diagnosis and therapy. Biochimica et Biophysica Acta-Reviews On Cancer, 1806(1):29-35, 2010.

73. W. Jiang, H. Mashayekhi, and B. Xing. Bacterial toxicity comparison between nano- and micro-scaled oxide particles. Environmental PollutioN, 157(5):1619-1625, 2009.

74. M. E. Johnson, D. A. Berk, D. Blankschtein, D. E. Golan, R. K. Jain, and R. S. Langer. Lateral diffusion of small compounds in human stratum corneum and model lipid bilayer systems. Biophysical Journal, 71(5):2656-2668, 1996.

75. N. Jones, B. Ray, K. T. Ranjit, and A. C. Manna. Antibacterial activity of ZnO nanoparticle suspensions on a broad spectrum of microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 279(1):71-76, 2008.

76. Y.-W. Jun, J.-H. Lee, and J. Cheon. Chemical design of nanoparticle probes for highperformance magnetic resonance imaging. Angewandte Chemie - International Edition, 47(28):5122-5135, 2008.

77. N. W. S Kam, M. O'Connell, J. A. Wisdom, and H. J. Dai. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, 102(33):11600-11605, 2005.

78. T. A. Kelf, M. Gosnell, B. Sandnes, A. E. Guller, A. B. Shekhter, and A. V. Zvyagin. Scar tissue classification using nonlinear optical microscopy and discriminant analysis. Journal of Biophotonics, 5(2):159-167, 2012.

79. T. A. Kelf, V. K. A. Sreenivasan, J. Sun, E. J. Kim, E. M. Goldys, and A. V. Zvyagin. Non-specific cellular uptake of surface-functionalized quantum dots. Nanotechnology, 21(28), 2010.

80. R. A. Khan, J. A.and Kudgus, A. Szabolcs, S. Dutta, E. Wang, S. Cao, G. L. Curran, V. Shah, S. Curley, D. Mukhopadhyay, J. D. Robertson, R. Bhattacharya, and P. Mukherjee. Designing nanoconjugates to effectively target pancreatic cancer cells in vitro and in vivo. PLOS ONE, 6(6), 2011.

81. E. V. Khaydukov, V. V. Rocheva, V. A. Semchishen, A. V. Nechaev, A. N. Generalova, V. N. Seminogov, A. B. Shekhter, V. I. Sokolov, A. V. Zvyagin, A. S. Akhmanov, and V. Ya. Panchenko. Applications of Upconversion Nanoparticles in Optical Bioimaging of the Tumor Tissue. Journal RFBR, 3:32 - 41, 2014.

82. E. V. Khaydukov, V. A. Semchishen, V. N. Seminogov, A. V. Nechaev, A. V. Zvyagin, V. I. Sokolov, A. S. Akhmanov, and V. Ya Panchenko. Visualization of upconverting nanoparticles in strongly scattering media. Biomedical Optics Express, 5(6):1952-1964, 2014.

83. E. V. Khaydukov, V. A. Semchishen, V. N. Seminogov, V. I. Sokolov, A. P. Popov, A. V. Bykov, A. V. Nechaev, A. S. Akhmanov, V. Ya Panchenko, and A. V. Zvyagin. Enhanced spatial resolution in optical imaging of biotissues labelled with upconversion nanoparticles using a fibre-optic probe scanning technique. Laser Physics Letters, 11(9), 2014.

84. W. Koechner. Solid-state laser engineering. Springer, 6th edition, 2006.

85. H. Koo, H. Lee, S. Lee, K. H. Min, M. S. Kim, D. S. Lee, Y. Choi, I. C. Kwon, K. Kim, and S. Y. Jeong. In vivo tumor diagnosis and photodynamic therapy via tumoral pH-responsive polymeric micelles. Chemical Communications, 46(31):5668-5670, 2010.

86. A. Kruger, F. Kataoka, M. Ozawa, T. Fujino, Y. Suzuki, A. .E Aleksenskii, A. Y. Vul', and E. Osawa. Unusually tight aggregation in detonation nanodiamond: Identification and disintegration. Carbon, 43(8):1722-1730, 2005.

87. A. Kruger, Y. J. Liang, G. Jarre, and J. Stegk. Surface functionalisation of detonation diamond suitable for biological applications. Journal of Materials Chemistry, 16(24):2322-2328, 2006.

88. A. Kulinkin, S. Feofilov, and R. Zakharchenya. Luminescence of impurity 3d and 4/ metal ions in different crystalline forms of Al2O3. Physics of the Solid State, 42:857-860, 2000.

89. T.-R. Kuo, C.-L. Wu, C.-T. Hsu, W. Lo, S.-J. Chiang, S.-J. Lin, C.-Y. Dong, and C.-C. Chen. Chemical enhancer induced changes in the mechanisms of transdermal delivery of zinc oxide nanoparticles. Biomaterials, 30(16):3002-3008, 2009.

90. J.R. Lakowicz. Principles of fluorescence spectroscopy. Springer, 3 edition, 2006.

91. F. Leblond, S. C. Davis, P. A. Valdes, and B. W. Pogue. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B - Biology, 98(1):77-94, 2010.

92. S. Lee, E.-J. Cha, K. Park, S.-Y. Lee, J.-K. Hong, I.-C. Sun, S. Y. Kim, K. Choi, I. C. Kwon, K. Kim, and C.-H. Ahn. A near-infrared-fluorescence-quenched gold-nanoparticle imaging probe for in vivo drug screening and protease activity determination. Angewandte Chemie -International Edition, 47(15):2804-2807, 2008.

93. J. Lekki, Z. Stachura, W. Dabros, J. Stachura, F. Menzel, T. Reinert, T. Butz, J. Pallon, E. Gontier, M. D. Ynsa, P. Moretto, Z. Kertesz, Z. Szikszai, and A. Z. Kiss. On the follicular pathway of percutaneous uptake of nanoparticles: Ion microscopy and autoradiography studies. Nuclear Instruments & Methods In Physics Research Section B-Beam Interactions with Materials and Atoms, 260(1):174-177, 2007. 10th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications held in Conjunction with the 2nd International Workshop on Proton Beam Writing, Singapore, SINGAPORE, JUL 09-14, 2006.

94. I. Levin and D. Brandon. Metastable alumina polymorphs: Crystal structures and transition sequences. Journal of the American Ceramic Society, 81(8):1995-2012, 1998.

95. D. Li, B. A. Dong, X. Bai, Y. Wang, and H. W. Song. Influence of the TGA modification on upconversion luminescence of hexagonal-phase NaYF4:Yb3+, Er3+ nanoparticles. Journal of Physical Chemistry C, 114(18):8219-8226, 2010.

96. X. W. Liang, Z. P.g Xu, J. Grice, A. V. Zvyagin, M. S. Roberts, and X. Liu. Penetration of Nanoparticles into Human Skin. Current Pharmaceutical Design, 19(35):6353-6366, 2013.

97. L. L. Lin, J. E. Grice, M. K. Butler, A. V. Zvyagin, W. Becker, T.s A. Robertson, H. P. Soyer, M. S. Roberts, and T. W. Prow. Time-Correlated Single Photon Counting For Simultaneous Monitoring Of Zinc Oxide Nanoparticles And NAD(P)H In Intact And Barrier-Disrupted Volunteer Skin. Pharmaceutical Research, 28(11):2920-2930, 2011.

98. Q. Liu, Y. Sun, T. Yang, W. Feng, C. Li, and F. Li. Sub-10nm hexagonal lanthanide-doped NaLuF4 upconversion nanocrystals for sensitive bioimaging in vivo. Journal of the American Chemical Society, 133(43):17122-17125, 2011.

99. S. R. Luthi, M. Pollnau, H. U. Gudel, and M. P. Hehlen. Near-infrared to visible upconversion in Er3+-doped Cs3Lu2Cl9, Cs3Lu2Br9, and Cs3Y2I9 excited at 1.54 mum. Physical Review B, 60(1):162-178, 1999.

100. H. Maeda. Tumor-selective delivery of macromolecular drugs via the EPR effect: Background and Future Prospects. Bioconjugate Chemistry, 21(5):797-802, 2010.

101. H. Maeda, G. Y. Bharate, and J. Daruwalla. Polymeric drugs for efficient tumor-targeted drug delivery based on EPR-effect. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 71(3):409-419, 2009.

102. H. X. Mai, Y. W. Zhang, L. D. Sun, and C. H. Yan. Highly efficient multicolor up-conversion emissions and their mechanisms of monodisperse NaYF4 : Yb,Er core and core/shell-structured nanocrystals. Journal of Physical Chemistry C, 111(37):13721-13729, 2007.

103. T. H. Maiman. Stimulated optical radiation in ruby. Nature, 187(4736):493-494, 1960.

104. A. Mandelis, Z. H. Chen, and R. Bleiss. Quantum efficiency and metastable lifetime measurements in solid-state laser materials via lock-in rate-window photothermal radiometry -technique and application to ruby (Cr3+Al2O3). Optical Engineering, 32(9):2046-2053, 1993.

105. A. Mandelis, Z.-H. Chen, and R. Bleiss. Quantum efficiency and metastable lifetime measurements in solid state laser materials via lock-in rate-window photothermal radiometry: technique and application to ruby (cr3+:al2o3). Optical Engineering, 32(9):2046-2053, 1993.

106. N. B. Manson and J. P. Harrison. Photo-ionization of the nitrogen-vacancy center in diamond. Diamond and Related Materials, 14(10):1705-1710, 2005.

107. B. R. Masters and P. T. C. So. Confocal microscopy and multi-photon excitation microscopy of human skin in vivo. Optics Express, 8(1):2-10, 2001.

108. T. Mauro, S. Grayson, W. N. Gao, M. Q. Man, E. Kriehuber, M. Behne, K. R. Feingold, and P. M. Elias. Barrier recovery is impeded at neutral pH, independent of ionic effects: implications for extracellular lipid processing. Archives of Dermatological Research, 290(4):215-222, 1998.

109. J. R. McCarthy. The future of theranostic nanoagents. Nanomedicine, 4(7):693-695, 2009.

110. L. P. McGuinness, Y. Yan, A. Stacey, D. A. Simpson, L. T. Hall, D. Maclaurin, S. Prawer, P. Mulvaney, J. Wrachtrup, F. Caruso, R. E. Scholten, and L. C. L. Hollenberg. Quantum measurement and orientation tracking of fluorescent nanodiamonds inside living cells. Nature Nanotechnology, 6(6):358-363, 2011.

111. X. Mi, X. Zhang, X. Ba, Z. Bai, L. Lu, X. Wang, and Q. Liu. Preparation and luminescent properties of Cr3+:Al2O3 nano-powders by low-temperature combustion synthesis. Advanced Powder Technology, 20(2):164-168, 2009.

112. X. Michalet, F. F. Pinaud, L. A. Bentolila, J. M. Tsay, S. Doose, J. J. Li, G. Sundaresan, A. M. Wu, S. S. Gambhir, and S. Weiss. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science, 307(5709):538-544, 2005.

113. K. E. Mironova, G. M. Proshkina, A. V. Ryabova, O. A. Stremovskiy, S. A. Lukyanov, R. V. Petrov, and S. M. Deyev. Genetically encoded immunophotosensitizer 4d5scfv-minisog is a highly selective agent for targeted photokilling of tumor cells in vitro. Theranostics, 3(11):831-840, 2013.

114. W. E. Moerner. New directions in single-molecule imaging and analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences OF the United States of America, 104(31):12596-12602, 2007.

115. P. Moreno, C. Mendez, A. Garcia, G. Torchia, D. Delgado, Javier R. Vazquez, A., I. Arias, and L. Roso. Synthesis of ceramic nanoparticles by ultrafast laser ablation of solid targets in water. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 6(7):1961-1967, 2006.

116. K. Moser, K. Kriwet, A. Naik, Y. N. Kalia, and R. H. Guy. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 52(2):103-112, 2001.

117. A. Nadort, V. K. A. Sreenivasan, Z. Song, E. A. Grebenik, A. V. Nechaev, V. A. Semchishen, V. Y. Panchenko, and A. V. Zvyagin. Quantitative Imaging of Single Upconversion Nanoparticles in Biological Tissue. PLOS ONE, 8(5), 2013.

118. M. P. Nikitin, T. A. Zdobnova, S. V. Lukash, O. A. Stremovskiy, and S. M. Deyev. Proteinassisted self-assembly of multifunctional nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(13):5827-5832, 2010.

119. G. J. Nohynek, J. Lademann, C. Ribaud, and M. S. Roberts. Grey goo on the skin? Nanotechnology, cosmetic and sunscreen safety. Critical Reviews in Toxicology, 37(3):251-277, 2007.

120. N. Omenetto, J. M. Mermet, G. C. Turk, D. S. Moore, T. Vo-Dinh, L. R. P. Butler, A. M. Ure, G. Gauglitz, W. H. Melhuish, J. N. Miller, N. S. Nogar, B. Schrader, C. Senemaud, N. H. Velthorst, M. Zander, F. Adams, A. M. Andreani, J. R. Bacon, H. J. Coufal, G. M. Hieftje, T. Imasaka, W. Lukosz, R. Sturgeon, N. L. Velthorst, J. Wilkinson, J. P. Willis, E. Yeung, K. Danzer, M. Valcarcel, B. Gilbert, I. Rubeska, L. Bezur, A. K. De, A. Ulubelen, P. S. Zacharias, C. J. Rademeyer, K. Volka, A. J. Curtius, J. Park, K. Zimmer, L. Pszonicki, and D. Z. Batistoni. Nomenclature, symbols, units and their usage in spectrochemical analysis - XIV - laser-based atomic spectroscopy: A new notation for spectrochemical processes -(IUPAC recommendations 1997). Pure and Applied Chemistry, 70(2):517-526, 1998.

121. I. F. Osman, A. Baumgartner, E. Cemeli, J. N. Fletcher, and D. Anderson. Genotoxicity and cytotoxicity of zinc oxide and titanium dioxide in HEp-2 cells. Nanomedicine, 5(8):1193-1203, 2010.

122. S. A. Osseni, S. Lechevallier, M. Vereist, C. Dujardin, J. Dexpert-Ghys, D. Neumeyer, M. Leclercq, H. Baaziz, D. Cussac, V. Santran, and R. Mauricot. New nanoplatform based on Gd2O2S:Eu3+ core: synthesis, characterization and use for in vitro bio-labelling. Journal of Materials Chemistry, 21(45):18365-18372, 2011.

123. S. Osswald, G. Yushin, V. Mochalin, S. O. Kucheyev, and Y. Gogotsi. Control of SP2/SP3 carbon ratio and surface chemistry of nanodiamond powders by selective oxidation in air. Journal of the American Chemical Society, 128(35):11635-11642, 2006.

124. A. D. Ostrowski, E. M. Chan, D. J. Gargas, E. M. Katz, G. Han, P. J. Schuck, D. J. Milliron, and B. E. Cohen. Controlled synthesis and single-particle imaging of bright, sub-10nm lanthanide-doped upconverting nanocrystals. ACS NanO, 6(3):2686-2692, 2012.

125. R. H. Page, K. I. Schaffers, P. A. Waide, J. B. Tassano, S. A. Payne, W. F. Krupke, and W. K. Bischel. Upconversion-pumped luminescence efficiency of rare-earth-doped hosts sensitized with trivalent ytterbium. Journal of the Optical Society of America B-Optical Physics, 15(3):996-1008, 1998.

126. C. Pan, S.-Y. Chen, and P. Shen. Photoluminescence and transformation of dense Al2O3:Cr3+ condensates synthesized by laser-ablation route. Journal of Crystal Growth, 310(3):699-705, 2008.

127. A. Patra, R. E. Tallman, and B.A. Weinstein. Effect of crystal structure and dopant concentration on the luminescence of Cr3+ in Al2O3 nanocrystals. Optical Materials, 27(8):1396-1401, 2005.

128. D. Peer, J. M. Karp, S. Hong, O. C. FaroKHzad, R. Margalit, and R. Langer. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology, 2(12):751-760, 2007.

129. T. Pellegrino, L. Manna, S. Kudera, T. Liedl, D. Koktysh, A. L. Rogach, S. Keller, J. Radler, G. Natile, and W. J. Parak. Hydrophobic nanocrystals coated with an amphiphilic polymer shell: A general route to water soluble nanocrystals. Nano Letters, 4(4):703-707, 2004.

130. X. Peng, M. C. Schlamp, A. V. Kadavanich, and A. P. Alivisatos. Epitaxial growth of highly luminescent CdSe/CdS core/shell nanocrystals with photostability and electronic accessibility. Journal of the American Chemical Society, 119(30):7019-7029, 1997.

131. X. G. Peng, M. C. Schlamp, A. V. Kadavanich, and A. P. Alivisatos. Epitaxial growth of highly luminescent CdSe/CdS core/shell nanocrystals with photostability and electronic accessibility. Journal of the American Chemical Society, 119(30):7019-7029, 1997.

132. C. Pflitsch, R. A. Siddiqui, and B. Atakan. Phosphorescence properties of sol-gel derived ruby measured as functions of temperature and Cr3+ content. Applied Physics A: Materials Science & Processing, 90:527-532, 2008.

133. C. Pflitsch, R. A. Siddiqui, and B. Atakan. Phosphorescence properties of sol-gel derived ruby measured as functions of temperature and Cr3+ content. Applied Physics A-Materials Science & Processing, 90(3):527-532, 2008.

134. S. R. Pinnell, D. Fairhurst, R. Gillies, M. A. Mitchnick, and N. Kollias. Microfine zinc oxide is a superior sunscreen ingredient to microfine titanium dioxide. Dermatologic Surgery, 26(4):309-313, 2000. 60th Annual Meeting of the Society-for-Investigative-Dermatology, CHICAGO, ILLINOIS, MAY 05-09, 1999.

135. T. Plakhotnik, A. Chennu, and A. V. Zvyagin. Statistics of single-electron signals in electron-multiplying charge-coupled devices. IEEE Transactions on Electron Devices, 53(4):618-622, 2006.

136. A. P. Popov, J. Lademann, A. V. Priezzhev, and R. Myllyla. Effect of size of TiO2 nanoparticles embedded into stratum corneum on ultraviolet-A and ultraviolet-B sun-blocking properties of the skin. Journal of Biomedical Optics, 10(6), 2005.

137. A. P. Popov, A. V. Zvyagin, J. Lademann, M. S. Roberts, W. Sanchez, A. V. Priezzhev, and R. Myllyla. Designing Inorganic Light-Protective Skin Nanotechnology Products. Journal of Biomedical Nanotechnology, 6(5, SI):432-451, 2010.

138. T. W. Prow, N. A. Monteiro-Riviere, A. O. Inman, J. E. Grice, X. Chen, X. Zhao, W. H. Sanchez, A. Gierden, M. A. F. Kendall, A. V. Zvyagin, D. Erdmann, J. E. Riviere, and M. S. Roberts. Quantum dot penetration into viable human skin. Nanotoxicology, 6(2):173-185, 2012.

139. R. S. Quimby and W. M. Yen. Photoacoustic measurement of the ruby quantum efficiency. Journal of Applied Physics, 51(3):1780-1782, 1980.

140. J. R. Rabeau, A. Stacey, A. Rabeau, S. Prawer, F. Jelezko, I. Mirza, and J. Wrachtrup. Single nitrogen vacancy centers in chemical vapor deposited diamond nanocrystals. Nano Letters, 7(11):3433-3437, 2007.

141. A. P. Raphael, T. A. Kelf, E. M. T. Wurm, A. V. Zvyagin, H. P. Soyer, and T. W. Prow. Computational characterization of reflectance confocal microscopy features reveals potential for automated photoageing assessment. Experimental Dermatology, 22(7):458-463, 2013.

142. W. A. W. Razali, V. K. A. Sreenivasan, E. M. Goldys, and A. V. Zvyagin. Large-Scale Production and Characterization of Biocompatible Colloidal Nanoalumina. Langmuir, 30(50):15091-15101, 2014.

143. K. M. Reddy, Kevin Feris, Jason Bell, Denise G. Wingett, Cory Hanley, and Alex Punnoose. Selective toxicity of zinc oxide nanoparticles to prokaryotic and eukaryotic systems. Applied Physics LetterS, 90(21), 2007.

144. D. Ribatti, B. Nico, A. Vacca, and M. Presta. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature Protocols, 1(1):85-91, 2006.

145. M. S. Roberts, M. J. Roberts, T. A. Robertson, W. Sanchez, C. Thoerling, Y. Zou, X. Zhao, W. Becker, and A.i V. Zvyagin. In vitro and in vivo imaging of xenobiotic transport in human skin and in the rat liver. Journal of Biophotonics, 1(6):478-493, 2008.

146. E. Rohrer, C. F. O. Graeff, R. Janssen, C. E. Nebel, M. Stutzmann, H. Guttler, and R. Zachai. Nitrogen-related dopant and defect states in CVD diamond. Physical Review B, 54(11):7874-7880, 1996.

147. L. Rondin, G. Dantelle, A. Slablab, F. Grosshans, F. Treussart, P. Bergonzo, S. Perruchas, T. Gacoin, M. Chaigneau, H. C. Chang, V. Jacques, and J. F. Roch. Surface-induced charge state conversion of nitrogen-vacancy defects in nanodiamonds. Physical Review B, 82(11), 2010.

148. J. A. Ross, A. V. Zvyagin, N. R. Heckenberg, J. Upcroft, P. Upcroft, and H. Rubinsztein-Dunlop. Measurement of action spectra of light-activated processes. Journal of Biomedical Optics, 11(1), 2006.

149. N.a N. Rozhkova, L. E. Gorlenk, G. I. Emel'yanova, A. Jankowska, M. V. Korobov, V. V. Lunin, and E. Osawa. Effect of ozone on the structure and physicochemical properties of ultradisperse diamond and shungite nanocarbon elements. Pure and Applied Chemistry, 81(11):2093—2105, 2009.

150. J. P. Ryman-Rasmussen, J. E. Riviere, and N. A. Monteiro-Riviere. Penetration of intact skin by quantum dots with diverse physicochemical properties. Toxicological Sciences, 91(1):159-165, 2006.

151. B. Sandnes, T. A. Kelf, H. Liu, and A. V. Zvyagin. Retroemission by a glass bead monolayer for high-sensitivity, long-range imaging of upconverting phosphors. Optics Letters, 36(15):3009-3011, 2011.

152. C. Santori, P. E. Barclay, K.-M. C. Fu, and R. G. Beausoleil. Vertical distribution of nitrogen-vacancy centers in diamond formed by ion implantation and annealing. Physical Review B, 79(12), 2009.

153. C. M. Sayes, K. L. Reed, and D. B. Warheit. Assessing toxicity of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences, 97(1):163-180, 2007.

154. Robert J. Scheuplein. Permeability of the skin. John Wiley and Sons, Inc., 2010.

155. A. M. Schrand, S. A. Ciftan Hens, and O. A. Shenderova. Nanodiamond particles: properties and perspectives for bioapplications. Critical Reviews in Solid State and Materials Sciences, 34(1-2):18-74, 2009.

156. A. M. Schrand, H. Huang, C. Carlson, J. J. Schlager, E. Osawa, S. M. Hussain, and L. Dai. Are diamond nanoparticles cytotoxic? The Journal of Physical Chemistry B, 111(1):2—7, 2006.

157. K. Y. T. Seet, P. Blazkiewicz, P. Meredith, and A. V. Zvyagin. Optical scatter imaging using digital Fourier microscopy. Journal of Physics D - Applied Physics, 38(19):3590-3598, 2005.

158. K. Y. T. Seet, T. A. Nieminen, and A. V. Zvyagin. Refractometry of melanocyte cell nuclei using optical scatter images recorded by digital Fourier microscopy. Journal of Biomedical Optics, 14(4), 2009.

159. K. Y. T. Seet, R. Vogel, T. A. Nierninen, G. Knoner, H. Rubinsztein-Dunlop, M. Trau, and A. V. Zvyagin. Refractometry of organosilica microspheres. Applied Optics, 46(9):1554-1561, 2007.

160. A. I. Shames, A. M. Panich, W. Kempinski, A. E. Alexenskii, M. V. Baidakova, A. T. Dideikin, V. Y. Osipov, V. I. Siklitski, E. Osawa, M. Ozawa, and A. Y. Vul'. Defects and impurities in nanodiamonds: EPR, NMR and TEM study. Journal of Physics and Chemistry Of Solids, 63(11):1993—2001, 2002.

161. V. Sharma, D. Anderson, and A. Dhawan. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria mediated apoptosis in human liver cells (HepG2). Apoptosis, 17(8):852-870, 2012.

162. T.-J. S. Shi, Q.g Xiang, M.-D. Zhang, S. Barde, Y. Kai-Larsen, K. Fried, A. Josephson, L. Glueck, S. M. Deyev, A. V. Zvyagin, S. Schulz, and T. Hokfelt. Somatostatin and its 2A receptor in dorsal root ganglia and dorsal horn of mouse and human: expression, trafficking and possible role in pain. Molecular Pain, 10, 2014.

163. J. Shim, H. S. Kang, W. S. Park, S. H. Han, J. Kim, and I. S. Chang. Transdermal delivery of mixnoxidil with block copolymer nanoparticles. Journal of Controlled Release, 97(3):477-484, 2004.

164. R. A. Shimkunas, E. Robinson, R. Lam, S. Lu, X. Xu, X.-Q. Zhang, H. Huang, E. Osawa, and D. Ho. Nanodiamond-insulin complexes as pH-dependent protein delivery vehicles. Biomaterials, 30(29):5720-5728, 2009.

165. K. K. M. B. D. Silva, A. V. Zvyagin, and D. D. Sampson. Extended range, rapid scanning optical delay line for biomedical interferometric imaging. Electronics Letters, 35(17):1404-1406, 1999.

166. M. A. Sirotkina, M. V. Shirmanova, M. L. Bugrova, V. V. Elagin, P. A. Agrba, M. Yu. Kirillin, V. A. Kamensky, and E. V. Zagaynova. Continuous optical coherence tomography monitoring of nanoparticles accumulation in biological tissues. Journal ofNanoparticle Research, 13:283— 91, 2011.

167. B. R. Smith, D. W. Inglis, B. Sandnes, J. R. Rabeau, A. V. Zvyagin, D. Gruber, C. J. Noble, R. Vogel, E. Osawa, and T. Plakhotnik. Five-nanometer diamond with luminescent nitrogen-vacancy defect centers. Small, 5(14):1649-1653, 2009.

168. B. R. Smith, M. Niebert, T. Plakhotnik, and A. V. Zvyagin. Transfection and imaging of diamond nanocrystals as scattering optical labels. Journal of Luminescence, 127(1):260-263, 2007. 9th International Meeting on Hole Burning, Single Molecule, and Related Spectroscopies, Aussois, FRANCE, JUN 24-29, 2006.

169. E. D. J. Smith, A. V. Zvyagin, and D. D. Sampson. Real-time dispersion compensation in scanning interferometry. Optics Letters, 27(22):1998-2000, 2002.

170. W. Song, J. Zhang, J. Guo, J. Zhang, F. Ding, L. Li, and Z. Sun. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters, 199(3):389-397, 2010.

171. Z. Song, Y. G. Anissimov, J. Zhao, A. V. Nechaev, A. Nadort, D. Jin, T. W. Prow, M. S. Roberts, and A. V. Zvyagin. Background free imaging of upconversion nanoparticle distribution in human skin. Journal of Biomedical Optics, 18(6), 2013.

172. Z. Song, T. A. Kelf, W. H. Sanchez, M. S. Roberts, J. Ricka, M. Frenz, and A. V. Zvyagin. Characterization of optical properties of ZnO nanoparticles for quantitative imaging of transdermal transport. Biomedical Optics Express, 2(12):3321-3333, 2011.

173. V. K. A. Sreenivasan, E. A. Ivukina, W. Deng, T. A. Kelf, T. A. Zdobnova, S. V. Lukash, B. V. Veryugin, O. A. Stremovskiy, A. V. Zvyagin, and S. M. Deyev. Barstar:barnase - a versatile platform for colloidal diamond bioconjugation. Journal of Materials Chemistry, 21(1):65-68, 2011.

174. V. K. A. Sreenivasan, T. A. Kelf, E. A. Grebenik, O. A. Stremovskiy, J. M. Say, J. R. Rabeau, A. V. Zvyagin, and S. M. Deyev. A modular design of low-background bioassays based on a high-affinity molecular pair barstar.barnase. Proteomics, 13(9):1437-1443, 2013.

175. V. K. A. Sreenivasan, E. J. Kim, A. K. Goodchild, M. Connor, and A. V. Zvyagin. Targeting somatostatin receptors using in situ-bioconjugated fluorescent nanoparticles. Nanomedicine, 7(10):1551-1560, 2012.

176. V. K. A. Sreenivasan, O. A. Stremovskiy, T. A. Kelf, M. Heblinski, A. K. Goodchild, M. Connor, S. M. Deyev, and A. V. Zvyagin. Pharmacological Characterization of a Recombinant, Fluorescent Somatostatin Receptor Agonist. Bioconjugate Chemistry, 22(9):1768-1775, 2011.

177. V. K. A. Sreenivasan, A. V. Zvyagin, and E. M. Goldys. Luminescent nanoparticles and their applications in the life sciences. Journal of Physics - Condensed Matter, 25(19), 2013.

178. I. Staude, V. K. A. Sreenivasan, I. Shishkin, K. Samusev, M. Decker, D. N. Neshev, A. V. Zvyagin, and Y. S. Kivshar. Selective placement of quantum dots on nanoscale areas of metal-free substrates. Physica Status Solidi-Rapid Research Letters, 8(8):710-713, 2014.

179. F. D. Stefani, J. P. Hoogenboom, and E. Barkai. Beyond quantum jumps: Blinking nanoscale light emitters. Physics Today, 62(2):34-39, 2009.

180. J. F. Suyver, A. Aebischer, D. Biner, P. Gerner, J. Grimm, S. Heer, K. W. Kramer, C. Reinhard, and H. U. Gudel. Novel materials doped with trivalent lanthanides and transition metal ions showing near-infrared to visible photon upconversion. Optical Materials, 27(6):1111-1130, 2005.

181. Z. Szikszai, Z. Kertesz, E. Bodnar, I. Borbiro, A. Angyal, L. Csedreki, E. Furu, Z. Szoboszlai, A. Z. Kiss, and J. Hunyadi. Nuclear microprobe investigation of the penetration of ultrafine zinc oxide into human skin affected by atopic dermatitis. Nuclear Instruments & Methods In Physics Research Section B-Beam Interactions with Materials and Atoms, 269(20):2278-2280, 2011. 12th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications (ICNMTA), Leipzig, GERMANY, JUL 26-30, 2010.

182. C. A. Thorling, Y. Dancik, C. W. Hupple, G. Medley, X. Liu, A. V. Zvyagin, T. A. Robertson, F. J. Burczynski, and M. S. Roberts. Multiphoton microscopy and fluorescence lifetime imaging provide a novel method in studying drug distribution and metabolism in the rat liver in vivo. Journal of Biomedical Optics, 16(8), 2011.

183. P. Thune, T. Nilsen, I. K. Hanstad, T. Gustavsen, and H. L. Dahl. The water barrier function of the skin in relation to the water-content of stratum-corneum, pH and skin lipids - the effect of alkaline soap and syndet on dry skin in elderly, non-atopic patients. Acta Dermato-Venereologica, 68(4):277-283, 1988.

184. S. S. Tinkle, J. M. Antonini, B. A. Rich, R. Roberts, J. R .and Salmen, K. DePree, and

E. J. Adkins. Skin as a route of exposure and sensitization in chronic beryllium disease. Environmental Health Perspectives, 111(9)."1202-1208, 2003.

185. J. Tisler, G. Balasubramanian, B. Naydenov, R. Kolesov, B. Grotz, R. Reuter, J. P. Boudou, P. A. Curmi, M. Sennour, A. Thorel, M. Borsch, K. Aulenbacher, R. Erdmann, P. R. Hemmer,

F. Jelezko, and J. Wrachtrup. Fluorescence and Spin Properties of Defects in Single Digit Nanodiamonds. ACS Nano, 3(7):1959-1965, 2009.

186. R. Toll, U. Jacobi, H. Richter, J. Lademann, H. Schaefer, and U. Blume-Peytavi. Penetration profile of microspheres in follicular targeting of terminal hair follicles. Journal of Investigative Dermatology, 123(1):168-176, 2004.

187. V. P. Torchilin. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical Research, 24(1):1-16, 2007.

188. M. L. Tran, A. V. Zvyagin, and T. Plakhotnik. Synthesis and spectroscopic observation of dendrimer-encapsulated gold nanoclusters. Chemical Communications, (22):2400-2401, 2006.

189. H. Trommer and R. H. H. Neubert. Overcoming the stratum corneum: The modulation of skin penetration - A review. Skin Pharmacology and PhysiologY, 19(2):106-121, 2006. Joint Meeting of the International-Society-of-Skin-Pharmacology/Society-for-Cutaneous-Ultrast ructure-Research, Hamburg, GERMANY, JUN 01-04, 2005.

190. K. J. Trouton and C. J. Mills. A place in the shade: Reducing the risks of UV exposure. Canadian Medical Association Journal, 157(2):175-176, 1997.

191. Valery V. Tuchin. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. SPIE Press, Bellingham, WA, 1st edition, 2007.

192. J. R. Tucker, A. D. Rakic, C. J. O'Brien, and A. V. Zvyagin. Effect of multiple transverse modes in self-mixing sensors based on vertical-cavity surface-emitting lasers. Applied Optics, 46(4):611-619, 2007.

193. B. E. Urban, P. B. Neogi, S. J. Butler, Y. Fujita, and A. Neogi. Second harmonic imaging of plants tissues and cell implosion using two-photon process in ZnO nanoparticles. Journal of Biophotonics, 5(3):283-291, 2012.

194. A. Vailionis, E. G. Gamaly, V. Mizeikis, W. Yang, A. V. Rode, and S. Juodkazis. Evidence of superdense aluminium synthesized by ultrafast microexplosion. Nature Communications, 2:445-447, 2011.

195. C. Vinegoni, D. Razansky, S. A. Hilderbrand, F. W. Shao, V. Ntziachristos, and R. Weissleder. Transillumination fluorescence imaging in mice using biocompatible upconverting nanoparticles. Optics Letters, 34(17):2566-2568, 2009.

196. A. Vogt, B. Combadiere, S. Hadam, K. M. Stieler, J. Lademann, H. Schaefer, B. Autran, W. Sterry, and U. Blume-Peytavi. 40 nm, but not 750 or 1,500 nm, nanoparticles enter epidermal CD1a+ cells after transcutaneous application on human skin. Journal of Investigative Dermatology, 126(6):1316-1322, 2006.

197. C. Wang, L. Cheng, and Z. Liu. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics, 3(5):317-330, 2013.

198. F. Wang, Y. Han, C. S. Lim, Y. H. Lu, J. Wang, J. Xu, H. Y. Chen, C. Zhang, M. H. Hong, and X. G. Liu. Simultaneous phase and size control of upconversion nanocrystals through lanthanide doping. Nature, 463(7284):1061-1065, 2010.

199. F. Wang, J. Wang, and X. Liu. Direct evidence of a surface quenching effect on size-dependent luminescence of upconversion nanoparticles. Angewandte Chemie - International Edition, 49(41):7456-7460, 2010.

200. X. Wang, X. Ren, K. Kahen, M. A. Hahn, M. Rajeswaran, S. Maccagnano-Zacher, J. Silcox, G. E. Cragg, A. L. Efros, and T. D. Krauss. Non-blinking semiconductor nanocrystals. Nature, 459(7247):686-689, 2009.

201. Y. Wang, L. Tu, J. Zhao, Y. Sun, X. Kong, and H. Zhang. Upconversion luminescence of beta-NaYF4: Yb3+, Er3+/beta-NaYF4 core/shell nanoparticles: excitation power, density and surface Dependence. Journal of Physical Chemistry C, 113(17):7164-7169, 2009.

202. P. C. Weber, D. H. Ohlendorf, J. J. Wendoloski, and F. R. Salemme. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science, 243(4887):85, 1989.

203. T.-L. Wee, Y.-W. Mau, C.-Y. Fang, H.-L. Hsu, C.-C. Han, and H.-C. Chang. Preparation and characterization of green fluorescent nanodiamonds for biological applications. Diamond and Related Materials, 18(2-3):567-573, 2009. 2nd International Conference on New Diamond and Nano Carbons, Taipei, TAIWAN, MAY 26-29, 2008.

204. R Weissleder. A clearer vision for in vivo imaging. Nature Biotechnology, 19(4):316-317, 2001.

205. V. Westphal, S. O. Rizzoli, M. A. Lauterbach, D. Kamin, R. Jahn, and S. W. Hell. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science, 320(5873):246-249, 2008.

206. A. C. Williams. Transdermal and topical drug delivery: from theory to clinical practice. Pharmaceutical Press, London, 1st edition, 2003.

207. J. Wu, W. Liu, C. Xue, S. Zhou, F. Lan, L. Bi, H. Xu, X. Yang, and F.-D. Zeng. Toxicity and penetration of TiO2 nanoparticles in hairless mice and porcine skin after subchronic dermal exposure. Toxicology Letters, 191(1):1-8, 2009.

208. S. W. Wu, G. Han, D. J. Milliron, S. Aloni, V. Altoe, D. V. Talapin, B. E. Cohen, and P. J. Schuck. Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(27):10917-10921, 2009.

209. B. Yu, K. H. Kim, P. T. C. So, D. Blankschtein, and R. Langer. Visualization of oleic acid-induced transdermal diffusion pathways using two-photon fluorescence microscopy. Journal of Investigative Dermatology, 120(3):448-455, 2003.

210. J. Yuan and G. Wang. Lanthanide-based luminescence probes and time-resolved luminescence bioassays. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 25(5):490-500, 2006.

211. T. A. Zdobnova, S. G. Dorofeev, P. N. Tananaev, R. B. Vasiliev, T. G. Balandin, E. F. Edelweiss, O. A. Stremovskiy, I. V. Balalaeva, I. V. Turchin, E. N. Lebedenko, V. P. Zlomanov, and S. M. Deyev. Fluorescent immunolabeling of cancer cells by quantum dots and antibody scFv fragment. Journal of Biomedical Optics, 14(2):-, 2009.

212. L. W. Zhang, W. W. Yu, V. L. Colvin, and N. A. Monteiro-Riviere. Biological interactions of quantum dot nanoparticles in skin and in human epidermal keratinocytes. Toxicology and Applied Pharmacology, 228(2):200-211, 2008.

213. J. Zhao, D. Jin, E. P. Schartner, Y. Lu, Y. Liu, A. V. Zvyagin, L. Zhang, J. M. Dawes, P. Xi, J. A. Piper, E. M. Goldys, and T. M. Monro. Single-nanocrystal sensitivity achieved by enhanced upconversion luminescence. Nature Nanotechnology, 8:729-734, 2013.

214. J. Zhou, Z. Liu, and F. Li. Upconversion nanophosphors for small-animal imaging. Chemical Society Reviews, 41(3):1323-1349, 2012.

215. H. J. M. A. A. Zijlmans, J. Bonnet, J. Burton, K. Kardos, T. Vail, R. S. Niedbala, and H. J. Tanke. Detection of cell and tissue surface antigens using up-converting phosphors: A new reporter technology. Analytical Biochemistry, 267(1):30-36, 1999.

216. W. R. Zipfel, R. M. Williams, and W. W. Webb. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology, 21(11):1368-1376, 2003.

217. W. Zou, C. Visser, J. A. Maduro, M. S. Pshenichnikov, and J. C. Hummelen. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nature Photonics, 6:560-564, 2012.

218. A. V. Zvyagin. Fourier-Domain Optical Coherence Tomography: Optimization of Signal-to-Noise Ratio in Full Space. Optics Communications, 242(1-3):97-108, 2004.

219. A. V. Zvyagin, P. Blazkiewicz, and J. Vintrou. Image reconstruction in full-field Fourierdomain optical coherence tomography. Journal of Optics A-Pure and Applied Optics, 7(7):350-356, 2005.

220. A. V. Zvyagin, I. Eix, and D. D. Sampson. High-speed, high-sensitivity, gated surface profiling with closed-loop optical coherence topography. Applied Optics, 41(11):2179-2184, 2002.

221. A. V. Zvyagin, J. B. FitzGerald, K. K. M. B. D. Silva, and D. D. Sampson. Real-time detection technique for Doppler optical coherence tomography. Optics Letters, 25(22):1645-1647, 2000.

222. A. V. Zvyagin, M. G. Garcia-Webb, and D. D. Sampson. Semiconductor line source for low-coherence interferometry. Applied Optics, 40(6):913-915, 2001.

223. A. V. Zvyagin and N. B. Manson. Optical and spin properties of nitrogen-vacancy colour-centres in diamond crystals, nanodiamonds and proximity to surfaces. Elsevier, 2 edition, 2012.

224. A. V. Zvyagin and T. Plakhotnik. Optical scatter imaging: Detection limits. TPDSci Inc, 2007.

225. A. V. Zvyagin and T. Plakhotnik. Video-enhanced contrast optical microscopy. TPDSci Inc, 2007.

226. A. V. Zvyagin and D. D. Sampson. Achromatic optical phase shifter-modulator. Optics Letters, 26(4):187-189, 2001.

227. A. V. Zvyagin, K. K. M. B. D. Silva, S. A. Alexandrov, T. R. Hillman, J. J. Armstrong, T. Tsuzuki, and D. D. Sampson. Refractive index tomography of turbid media by bifocal optical coherence refractometry. Optics Express, 11(25):3503-3517, 2003.

228. A. V. Zvyagin, E. D. J. Smith, and D. D. Sampson. Delay and dispersion characteristics of a frequency-domain optical delay line for scanning interferometry. Journal Of the Optical Society of America A - Optics Image Science and Vision, 20(2):333-341, 2003.

229. A. V. Zvyagin, Z. Song, A. Nadort, V. K. A. Sreenivasan, and S. M. Deyev. Luminescent nanomaterials for molecular-specific cellular imaging, page 563. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2013.

230. A. V. Zvyagin, V. K. A. Sreenivasan, E. M. Goldys, V. Ya. Panchenko, and S. M. Deyev. Nanoparticle Biocomplexes for Luminescence Imaging and Sensing in-vivo and in vitro. RSC, 2014.

231. A. V. Zvyagin, X. Zhao, A. Gierden, W. Sanchez, J. A. Ross, and M. S. Roberts. Imaging of zinc oxide nanoparticle penetration in human skin in vitro and in vivo. Journal of Biomedical Optics, 13(6), 2008.

Глава 8

ПРИЛОЖЕНИЯ

8.1 Определение концентрации наночастиц в коллоидах

Определение распределения размера частиц наряду с абсолютной концентрацией в коллоидах является распространённой задачей многих процедур в нанотехнологии, осуществление которых на доступных в химической лаборатории приборах весьма желательно. Простой метод, предложенный соискателем и коллегами, основан на записи спектра оптического тушения коллоидного образца, в дополнение к определению относительного размерного распределения образца. Обработка этих двух измерений позволяет определить как абсолютную концентрацию коллоидных частиц, так и их распределение по размерным выборкам. Этот метод был реализован с помощью коммерческого инструмента спектрофотометра (Carry) и прибора динамического светорассеяния (Zetasizer, Malvern). Прецизиозность метод была протестирована несколькими способами:

1. посредством приготовления известных концентраций полистиреновых наношариков в различных соотношениях и в различных концентрациях и сравнения этих концентраций с результатами, полученными с помощью предложенного метода.

2. Были приготовлены коллоиды нанокремния с известной концентрацией и известными размерами, которые были потом измерены, во-первых, гравиметрическим методом, а во-вторых, предложенным методом.

3. Были также проведены сравнения двух методов определения концентрации неизвестного образца коллоидного нанорубина. Образец исследовался и анализировался методом ТЭМ, а также предложенным методом.

Было показано, что в большинстве случаев метод позволяет определить концентрацию НЧ в растворе с точностью до 50%. Точность метода существенно ухудшается в случае ухудшения соотношения сигнал-шум, а также в случае существенного полидисперсного образца, доходя в предельных случаях до 300%. Даже такая точность вполне приемлема во многих применениях, включая синтез наночастиц, когда требуется быстро определить концентрацию и размеры образующихся наночастиц.

Метод реализовывался следующим образом. Во-первых, требуется определить (относительное) размерное распределение частиц в коллоидах. Одним - но далеко не единственным - из таких методов является метод динамического светорассеяния. Во-вторых, требуется определить полную эффективность оптического тушения es образца, которая, предполагается, определяется исключительно светорассеивающими свойствами коллоидных частиц1. Резуль-

1 Требование ограничить свойства коллоидных частиц только светорассеивающими свойствами необязательно. Представляется возможным обобщить метод на коллоидные частицы с оптическим поглощением. Ещё одним

таты двух измерений служат исходными данными для разработанного в лаборатории соискателя алгоритме, вместе с параметрами частиц, такими как показатель преломления и т.д. Точность метода определяется дисперсностью образца, соотношением сигнал-шум, а также точностью оптических констант.

Сущность метода можно представить фигурально следующим образом (см. Рисунок 8.1). Если требуется определить общее количество детей в большой толпе, можно вначале определить распределение детей по каким-либо признакам, скажем, по возрасту. А затем попросить детей выбранной возрастной категории громко кричать так, чтобы их можно было сосчитать. Потом попросить кричать всех детей, так чтобы зарегистрировать общий сигнал шума. Зная популяцию детей определённого возраста, уровень производимого ими шума, а также уровень шума от всех детей, легко посчитать общее число детей. Пользуясь этой аналогией, динамическое светорассеяние определяет "распределение детей по возрасту", или распределение коллоидных частиц по размеру. Спектрофотометрия определяет "общий уровень шума от общего числа детей", или интегральный сигнал тушения из-за светорассеяния. Алгоритм определяет "общее число детей" по "шуму от детей определённой возрастной категории", "общему шуму" и "распределению детей по возрасту", или общую концентрацию частиц в тестируемом объёме.

Рисунок 8.1: Характеризация частиц нанорубинов, приготовленных на покрывном стекле

микроскопа. (a) показывает изображение, полученное с помощью флуоресцентного лазерно-сканирующего микроскопа (ФЛСМ), с возбуждением от лазера на 532 нм (Iex = 1,5 х 105 Вт/см2) и (b) показывает соответствующее изображение, полученное с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ), где кружками обозначены общие черты изображений.

На (c) области АСМ изображения увеличены, чтобы позволить измерение размера НЧ. Фотолюминесцентные (ФЛ) спектры частиц 1 и 2 показаны на (d), их кривые насыщения представлены на вставке. График ФЛ от времени представлен на (e), который интерполирован одиночной экспонентой для частицы 1 и двойной экспонентой для частицы 2. Яркость ФЛ частиц в продолжении времени наблюдения при непрерывном возбуждении Iex = 1,5х 105 Вт/см2 представлена на (f). Воспроизведено по Ссылке [41].

Метод реализуется следующим образом. Коллоидный раствор помещается в кювету и его оптическое пропускание измеряется спектрофотометром, который считывает коэффициент тушения ts, определяющийся следующим выражением:

е, = - log(Pt/Po), (8.1)

ограничением метода по умолчанию является моделирование частиц как рассеивателей Ми, что необязательно и может быть обобщено на светорассеяние частиц больших субмиллиметровых размеров. Также возможно принять во внимание многократное светорассеяние в кювете.

где Р0, Pt - падающая и прошедшая мощность светового потока. Предполагается, что световой поток тушится только за счёт рассеивания, где мощность рассеянного света Ps, рассеянная во все углы, определяется как:

Ps = Nsds Io, (8.2)

где I0 - интенсивность падающего излучения, а Ns - общее количество рассеивателей в тестируемом объёме с концентрацией Cs [particles/см3]. Таким образом:

6 s = CsosL/ln(10), (8.3)

L - толщина кюветы. В случае полидисперсного образца

'f = • (8.4)

I 0 о

где ISi - интенсивность света, рассеянная в размерной выборке (size bin) i. Ni, oi - соответственно, полное число и сечение рассеивания частиц в размерной выборке i.

Интенсивность рассеянного света относится к полной интенсивности рассеянного света как:

Is, = Шг Is (8.5)

Проведя алгебраические преобразования можно придти к следующему выражению для общей концентрации частиц в тестируемом объёме коллоида C:

с £ O, (8.6)

L Oi

i=1

Nb - общее количество бинов.

8.2 Протоколы химических реакций, использованных в работе

8.3 Протокол синтеза антистоксовых нанофосфоров

Смесь оксида иттрия III (0,78 мМ), оксида иттербия III (0,2 мМ), оксида эрбия III (0,02 мМ) суспендировались в 20 мл 70% трифторуксусной кислоты и кипятились при перемешивании до полного растворения (~6 ч). Растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный осадок сушили при 50 °C в вакууме масляного насоса (0,1 мм. рт. ст.) в течение 3 ч. Полученную смесь соответствующих трифторацетатов тщательно перетирали в ступке, смешивали с 1 мМ трифторацетата натрия и добавляли к смеси 10 мМ олеиновой кислоты, 10 мМ олейламина и 10 мМ октадецена в трёхгорловой колбе, оснащённой термометром и магнитной мешалкой. Затем смесь перемешивали при 120 °C в вакууме в течение 30 мин для удаления кислорода и воды. Далее, реакционную массу перемешивали в токе аргона 30 мин при 310°C. Смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли двукратный объём изо-пропанола и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок ß-NaYF4:Yb3+:Tm3+ нанокристаллов промывали этанолом, сушили, суспендировали в смеси 10 мМ олеиновой кислоты и 10 мМ октадецена и перемешивали в токе аргона при 330°C в течение 20 мин. Массу остужали до комнатной температуры, разбавляли двукратным объёмом изопропанола, и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок трижды промывали этанолом, сушили, растворяли в 10 мл гексана, фильтровали, и осаждали

трёхкратным объёмом абсолютного этанола. Смесь центрифугировали, полученный осадок промывали этанолом и сушили при комнатной температуре.

На этапе синтеза структуры "ядро/оболочка" (core/shell) NaYF4 :Yb3+:Tm3+/NaYF4 в трёх-горловую колбу к ресуспендированным НАФ частицами структуры добавляли следующие реагенты: YCl3, олеиновую кислоту, октадецен, NaOH, NH4F. Реагенты нагревали до температуры 290 °C. и перемешивали в токе аргона в течение 20 мин. Массу остужали до комнатной температуры, разбавляли двукратным объёмом изопропанола, и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок трижды промывали этанолом, сушили, растворяли в 10 мл гексана, фильтровали, и осаждали трёхкратным объёмом абсолютного этанола. Смесь центрифугировали, полученный осадок промывали этанолом, и сушили при комнатной температуре.

Сравнение результатов синтеза НАФ структур ядро и ядро/оболочка показывает (см. Рисунок 8.2):

1. Увеличение размеров частиц с 30±2нм до 37±2нм (нижний ряд Рисунка 8.2), что демонстрирует успешное наращивание оболочки толщиной примерно 3,5 нм.

2. Увеличение эффективности фотоконверсии Еи с примерно в 10 раз в случае солегиро-ванных тулием и примерно, в 3 раза в случае НАФ, солегированных эрбием.

Рисунок 8.2: ТЭМ изображения, цифровые снимки хода луча через кювету с коллоидом НАФ, (внизу) гистограммы распределения размеров НАФ в случае следующей архитектуры нанокристаллов: (левая панель) ядро (core); (правая панель) ядро/оболочка (core/shell). НЧ архитектуры ядро/оболочка отличаются большими размерами, интенсивность сигнала ФЛ

заметно улучшена.

8.4 Протокол покрытия поверхности антистоксовых нанофосфоров

8.4.1 Протокол покрытия амфифильным полимером малеинового ангидрида и октадецена (PMAO)

Модификация НАФ чередующимся амфифильным сополимером малеинового ангидрида и октадецена (PMAO): 0.1 мл раствора чередующегося сополимера малеинового ангидрида и 1-октадецена (8мг/мл) в хлороформе добавляли к 0,02 мл дисперсии НАФ (4мг/мл) в хлороформе. Выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 5мкл раствора сшивающего агента 1,6-диаминогексана (3мг/мл) в хлороформе и дважды повторяли процедуру ультразвуковой обработки (5 мин) с последующим перемешиванием в течение 30 мин. После испарения растворителей к полученному осадку добавляли 500 мкл дистиллированной воды. Далее проводили ультразвуковую обработку полученной дисперсии и выдерживали при перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мкл циан-боргидрида натрия (1 мг/мл) и выдерживали при перемешивании в течение 1,5 ч. После этого трижды центрифугировали при 11000 об/мин и промывали осадок дистиллированной водой. При модификации происходит гидролиз ангидридной группы с образованием карбоксильной группы, которая благодаря отрицательному заряду стабилизирует полученные НАФ.

8.4.2 Протокол гидрофилизации антистоксовых нанофосфоров с помощью тетраметиламмоний гидроксида (ТМАГ)

Гидрофилизация НАФ с помощью тетраметиламмоний гидроксида (ТМАГ): К 1мл 1% водного раствора ТМАГ добавляли 20 мкл дисперсии НАФ (4 мг/мл) в хлороформе. Выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Процедуру повторяли до полного осветления дисперсии. Затем центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин, осадок промывали водой и после последнего центрифугирования добавляли 1 мл дистиллированной воды.

8.4.3 Протокол покрытия антистоксовых нанофосфоров полиэтилени-мином

Модификация НАФ полиэтиленимином (ПЭИ): 0,25 мл раствора ПЭИ с молекулярной массой 25000 (15 мг/мл) в хлороформе добавляли к 0,02 мл дисперсии НАФ (4 мг/мл) в хлороформе. Выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. После испарения растворителя к полученному осадку добавляли 1 мл дистиллированной воды. Далее проводили ультразвуковую обработку полученной дисперсии и выдерживали при интенсивном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре, при этом положительный заряд аминогрупп (составляет ~38% в молекуле ПЭИ) стабилизирует полученные НАФ.

8.4.4 Протокол стабилизации модифицированных полиэтиленимином антистоксовых нанофосфоров декстраном

Стабилизация НАФ, модифицированных полиэтиленимином, декстраном: К 0,2 мл образцу НАФ(0,2 мг/мл), модифицированному ПЭИ и стабилизированному натриевой солью сополимера акриловой и малеиновой кислот, добавляли 0,2 мл водного раствора декстрана с

молекулярной массой 110000 (2мг/мл). Выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин, осадок промывали водой и после последнего центрифугирования добавляли 0,2 мл дистиллированной воды.

8.4.5 Протокол импрегнации антистоксовых нанофосфоров в латексные субмикронные частицы

В основе методики лежит инкапсуляция НАФ в заранее синтезированные полимерные частицы, разбухшие в органическом растворителе. Более подробно, для синтеза полимерных частиц использовались два сополимера: акролеин Н2С=СН-СНО и стирол. Частицы получаются безэмульгаторной радикальной сополимеризацией акролеина и стирола при объёмном соотношении фаз мономеры:вода, 1:9 в присутствии инициатора персульфата калия. Используются мольные соотношения акролеин.стирол, 1:1. Полимеризация проводится в трёхгорлой колбе, снабжённой механической мешалкой, в течение 6 часов при температуре 65°C в атмосфере инертного газа. Полученная дисперсия трижды промывается дистиллированной водой, центрифугируется, диспергируется в воде до 5%-ой концентрации, и хранится при температуре 4-8°C. Реакция инкапсуляции начинается добавлением 500 мкл изопропилового спирта (ИС) к 50 мкл полимерной дисперсии (5%). Полученная надосадочная жидкость сливается и добавляется 500 мкл ИС, 50 мкл хлороформа. После выдерживания в ультразвуковой ванне в течение 5 минут перемешивается в течение 1ч при комнатной температуре. НАФ, 15 мкл с концентрацией 4 мг/мл в гексане добавляется к полимерной дисперсии в ИС. После ультразвуковой обработки полученная дисперсия выдерживается при перемешивании в течение 20 мин при комнатной температуре. Процедура повторяется 5 раз. Затем центрифугируется в течение 10 минут при 8000 об/мин, осадок промывается 3 раза ИС и 5 раз дистиллированной водой. Предварительные результаты описанного синтеза следующие: Около 10% полимерных сфер диаметром 200 нм оказались связаны с частицами НАФ, локализованных в приповерхностном слое.

Антистоксовые нанофосфоры, покрытые чередующимся сополимером по-ли(малеинового ангидрида-1-октадецена) были ковалентно пришиты к барста-ру через карбоксильные группы с использованием системы кросс-линкеров ББАС(гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида)/КБ^(натриевая

соль N-гидроксисульфосукцинимида). Реакцию проводили на холоде в два этапа. На первом этапе частицы активировали раствором EDAC/NHSS в массовом соотношении 1:2:3 в фосфатном буфере (20 мМ NaCl; 6,5 мМ NaH2PO4; 41 мМ Na2HPO4; pH 5,8) в течение 15 мин с периодическим озвучиванием в ультразвуковой бане. Затем избыток реагентов был удалён с помощью двух процедур центрифугирования при 14000 g в течение 5 мин. На втором этапе активированные частицы были диспергированы в PBS с помощью озвучивания и инкубированы с барстаром в массовом соотношении 1:40 в течение ночи. На следующий день избыток глицина был внесён в суспензию с целью блокировки свободных центров связывания на поверхности частиц. Избыток белка отделяли серией центрифугирований при 9000-14000 g в присутствии 0.1% tween-20.

8.4.6 Выделение и очистка белков барназа и барстар

Выделение и очистку белка слияния 4D5scFvс Барназой и пятью гистидиновыми остатками на C-конце проводили согласно методу, описанному в работе [39] с небольшими модификациями. Клетки E. coli штамм SB536 трансформировали плазмидой pSD 4D5 Bn His5, содержащей гены целевого белка под контролем 1ас-промотора и Барстара для подавления токсического эффекта барназы, входящей в состав конструкции, под контролем собственного про-

мотора. Свежетрансформированные бактерии культивировали в среде УРТБ (1% дрожжевого экстракта; 1% триптона; 150мМ №С1; 40мМ К2НР04; 10мМ КН2Р04; 2мМ MgCl2; 0,1 г/л ампициллина; рН7,5) при +37°С до достижения А550 ~0,6 и индуцировали 1ас-промотор добавлением ГРТО (изопропил-1-тио-^-О-галактозид) до конечной концентрации 1 мМ. Затем трансформанты культивировали при интенсивном перемешивании в течение 5 часов при температуре +37°С и осаждали центрифугированием при 7000 g в течение 10 мин при +4°С. Все дальнейшие процедуры проводили при +4°С. Клеточный осадок ре суспендировали в буфере I (5 мМ Тп8-НС1; 40 мМ КН2Р04; 500 мМ ЫаС1; рН 8,2) и разрушали обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе. Клеточный дебрис отделяли от растворимого материала центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин и последующей фильтрацией надосадочной жидкости через одноразовый мембранный фильтр с диаметром пор 220 нм. Целевой белок изолировали с помощью нанесения осветлённого лизата на колонку "Н1вТгар БЕ 1 мл" содержащую М2+-МТА-сефарозу. Иммобилизированный на колонке белок промывали буфером I и отделяли от барстара в денатурирующих условиях в присутствии 6 М гуанидина с последующей ренату-рацией градиентом гуанидина (8-0 М). Ренатурированный белок иллюировали 225 мМ ими-дазолом в буфере I и переводили в фосфатный буфер (20 мМ ЫаС1; 6,5 мМ №Н2Р04; 41 мМ №2НР04; рН6,5) с помощью гель-фильтрации на колонке РБ-10 с сорбентом БерИадех в-25. Доочистку белка проводили на катионообменной колонке "Н1Тгар БР ББ, 1 мл". Элюцию белка осуществляли градиентом ЫаС1.

225 тм [NaCfl 275 350 500 м

и imidgiol тм

№ кОа

бДкра I • 405-Ёп JOS-Bn т

23 кОа 28 кОа

(а) <Ь}

Рисунок 8.3: Электрофорез белка 4D5-Bh в полиакриламидном геле после двухступенчатой процедуры очистки: (a) Ni2+ аффинная- и (b) ионнообменая хроматографии.

8.4.7 Протокол конъюгации нанорубинов с рекомбинантной спайкой DARPin-miniSOG

Первичные нанорубины со средним диаметром 65 нм, полученные методом высокоэнергетического помола, были промыты водой за три цикла, затем отцентрифугированы и суспендированы при ускорении 6000 g за 5 мин, а затем диспергированы в 95% спирта, после чего было добавлено 100 мкл АРТЕБа (Sigma, США) и выдержано в течение 1 ч в ультразвуковой ванне. Таким образом аминированные НЧ были затем отмыты от избытка реагента и высушены. 3,5 мг нанорубинов были диспергированы в 1,4 мл DMF в ультразвуковой ванне с добавлением 0,75 мг янтарной кислоты (succinic anhydride, Sigma, США) и инкубированы в течение 20 ч на шейкере для того, чтобы получить карбоксильные группы на поверхности НЧ. Непрореагировавший ангидрид был удалён промывкой и центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин; процедура повторялась трижды. DARPin-miniSOG связывался с кабоксили-

рованными нанорубинами посредством карбодиимидной реакции (EDC/NHS). С этой целью 1 мг NHS растворённого в DMSO, используя несколько циклов соникации. 150 мкл DARPin-miniSOG было разведено в 1050 мкл боратного буфера, рН8.2 и затем добавлено в раствор и инкубирован в течение всей ночь при 4 °C. На следующий день несвязанные терминалы на поверхности НЧ были заблокированы с 0.1% BSA и затем промыты в PBS с 0.1% BSA посредством центрифугирования при 7000 g в течение 5 мин.

Выход реакции биоконъюгации нанорубина с DARPin-miniSOG был проверен с использованием следующей процедуры. Биоконъюгаты промыли три раза с применением центрифугирования и ресуспендирования в буфере PBS с 0.1% BSA. Полученный супернатант и промытые биогибридные сборки нанорубины DARPin-minoSOG были исследованы с помощью флуориметра Eclipse. В случае исследования биогибридных сборок был хорошо различим пик флуоресценции около 530 нм при возбуждения на длине волны 450 нм, характерный для спектра испускания miniSOGа. В то время как флуоресценция супернатанта была незначительной.

8.5 Инструментальные решения и методики измерений, использованных в работе

8.5.1 Измерение абсолютного коэффициента конверсии антистоксовых нанофосфоров с помощью интегрирующей сферы

Образец НАФ в виде сухого порошка помещался внутрь 4'' сферы (Labsphere), стенки которой покрыты сильно рассеивающим материалом, а фотоприёмник (Thorlabs, PDA-55) смонтирован на боковом фланце, и оснащён спектральными светофильтрами [125]. Держатель образца заклонялся, сзади образца была смонтирована алюминиевая фольга для того, чтобы свет накачки делал два прохода через образец. Свет накачки доставляется к образцу с помощью многомодового оптоволокна (диаметр жилы 400 мкм, NA 0,22). Фотоприёмник подключался к синхронному усилителю (Stanford Research Systems, модель SR830). Возбуждающий лазер (LD980-01CW CXCH-Photonics) модулировался (генератор импульсов, Stanford research systems, модель DG535), так что на выходе получались импульсы длительностью 4 мс с частотой повторения 125 Гц. Система позволяла регистрацию мощности излучения с чувствительностью 1 мкВт. В результате тщательной калибровки системы на различных длинах волн, оценивалась мощность фотолюминесценции по отношению к поглощённой мощности, т.е. 'Цис. Нами собрана подобная система, и проведены предварительные измерения. Например, 'Цис образца, электронная микрофотография которого представлена на Рисунке 8.2, было измерен как 2% при значении интенсивность 100Вт/см2, что является очень высоким значением, сравнимым с 'que микроразмерных фосфоров, и показывает высокий уровень технологии, достигнутый командой проекта в сравнении с общемировыми показателями.

Рисунок 8.4: Схема системы измерений коэффициента конверсии антистоксовых нанофосфоров с помощью интегрирующей сферы. Воспроизведено по Ссылке [213]

8.5.2 Схема эпилюминесцентного микроскопа с осветительным модулем Кёлера

Оптический микроскоп Olympus IX70 модифицирован, чтобы реализовать широкополь-ное равномерное освещение предметной плоскости лазерным светом на длине волны 978 нм, исходящим из торца многомодового оптоволоконного кабеля. Схема микроскопа показана на Рисунке 8.5. Использовалась схема освещения Кёлера. Вместо стандартного осветительного блока ртутной или ксеноновой лампы использовался блок лазер на длине волны 980 нм, излучение которого было введено в многомодовый оптоволоконный кабель. На 8.5(k-1) кол-лимированный лазерный пучок падает на регулируемую ирисовую диафрагму, которая расположена в задней фокальной плоскости полевой линзы (field lens), которая в свою очередь, располагается на одном фокусном расстоянии от задней фокальной плоскости объектива, давая однородное освещение предметной плоскости квази-параллельными лучами. На 8.5(k-1)(k-2) представлено формирование изображения с помощью модуля Кёлера: изображение ирисовой диафрагмы расположено в заднем фокусе полевой линзы, так что изображение диафрагмы формируется в задней фокальной плоскости объектива. Увеличение изображения ирисовой диаграммы - отношение фокусов объектива и полевой линзы (~28 в собранной установке).

Рисунок 8.5: Схема широкопольного эпилюминесцентного микроскопа с водоиммерсионным

объективом (40х, NA 1,15, Olympus). На нижней панели показан ход лучей. (a) Схема освещения Кёлера. Две диаграммы лучей схемы освещения показаны, соответственно, на (b) и (c), демонстрируя, соответственно, ход лучей, создающих однородное освещение предметной плоскости и ход лучей, формирующих изображение. Оптически сопряжённые плоскости обозначены пунктирной линией. Компоненты устройства: CCD камера с

электронным умножением (EMCCD) (Andor iXon DU-885) и акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) (LSi-300 Hyperspectral Imaging System, Gooch and Housego), смонтированные на левом порту микроскопа; фильтры возбуждения и испускания; лазер на 978 нм (LD980-01CW, CXCH-Photonics), а также механический вибратор для усреднения лазерных спеклов. Воспроизведено по Ссылке [213].

8.5.3 Процедуры оптического имиджинга раковой опухоли, привитой на хорионаллантоисной мембране куриного эмбриона

В лаборатории соискателя на основе опубликованных протоколов [144] была разработана методика инкубации эмбриона цыплёнка, прививки раковой опухоли на хорионаллантоисную мембрану эмбриона и оптическую визуализацию развития опухоли, в том числе после введения ФЛ НЧ в кровеносную систему разработанной животной модели.

Прививка опухоли на хорионаллантоисной мембране куриного эмбриона

Свежие оплодотворенные куриные яйца доставлялись с птицефермы в Сиднее (Австралия) и отлёживались в течение 2 - 24 ч после перевозки, после чего помещались в инкубатор, температура и влажность поддерживались, соответственно, около 37,5 °С и 60%. После 72 ч инкубации яйца извлекались из инкубатора, открывались и их содержимое перемещалось в пластиковый контейнер, как это показано на Рисунке 8.6(а), после чего быстро возвращались в инкубатор. Мы использовали различные контейнеры для изучения выживаемости, где метод "гамака" показал лучшие результаты. Также хорошие результаты были получены путём размещения зародышей в лодочках для взвешивания [Рисунок 8.6(а)]. Оба контейнера имели отверстия для воздуха и были покрыты фольгированный или парафинированной пластиковой плёнкой для предотвращения высыхания. Опухоли прививались на 8-й день. Инъекции ФЛ НЧ и оптический имиджинг проводились в период от 14 до 18 дней. Куриные эмбрионы должны были быть выведены из эксперимента на 18-й день посредством обезглавливания согласно протоколу, одобренному этическим комитетом Университета Маккуори.

Рисунок 8.6: (а) Фотография зародыша цыплёнка, извлечённая из яйца и помещённая в пластиковый контейнер. (Ь) Микрофотография опухоли, полученная посредством прививки раковых клеток на хорионаллантоисную мембрану зародыша цыплёнка. Хорошо заметны морфологические изменения в месте прививки, а также хорошо развитый ангиогенез. Масштабный отрезок 250 мкм. (с) Фотография оптической имиджинговой системы для получения светлопольных и фотолюминесцентных (РЬ) изображений хорионаллантоисной

мембраны зародыша цыплёнка.

Тестировались три метода получения васкуляризированных опухолей на САМ: с использованием сфероидов, желатиновых губок и Matrigel; следующие линии раковых клеток человека: молочной железы: SK-BR-3, MDA-MB-231, MCF-7; линия клеток прямой кишки человека HT-29.

Сфероиды являются 3Д-клеточными структурами, выращенными в клеточной среде за 4 - 6 дней в 96-луночном планшете, с дном, покрытым агарозой для предотвращения адгезии клеток. Сфероиды прививались на мембрану (САМ) посредством проделывания небольшого отверстия в верхней поверхности САМ (эктодермы эпителия) иглой с помещением сфероида на её кончике. Время прививки оценивалось в 3 дня.

Стерильные желатиновые губки (Gelfoam, Pfizer) были разрезаны на кусочки размером до 1-3 мм3 и предварительно пропитаны в 5-мкл клеточном растворе (2,5 х104 клеток в PBS) до их помещения на САМ, причём в этом случае не требовалось разрыва мембраны. Мы также добавляли фактор VEGF (0,1 мкг на губку), чтобы вызвать неоваскуляризацию. Отметим, что прививка контрольной губки с добавкой фактора VEGF (без предварительного пропитывания в клеточной культуре) не приводила к развитию абнормальной кровеносной сети. Была зарегистрирована хорошо различимая неоваскуляризация в случае использования культур SK-BR-2 и MDA-MB-231.

Matrigel (25 мкл на опухоль) размороживался на льду в холодильнике за ночь. Клетки (из расчёта 4х 104 клеток на опухоль) центрифугировались и ресуспендировались в Matrigel-е на льду, а затем добавлялись покапельно (25 мкл) в чашку Петри до затвердевания при температуре 37 °C. Твёрдый гель с опухолевыми клетками помещался на САМ, не требуя предварительного повреждения мембраны. На Рисунке 8.6(b) хорошо различима неоваскуляризация.

Инъекция контрастных агентов в кровеносную сеть куриного эмбриона

Инъекции контрастных агентов проводились в кровеносную систему куриного эмбриона возрастом от 14 до 17 дней, а процедура имиджинга проводилась от 3 до 24 ч после инъекции. В качестве контрастных агентов использовались коммерчески-доступный биоконъюгат лецитин-Родамин, аффинный к эндотелию кровеносных сосудов, флуоресцентные белки, такие как фотосенсибилизатор miniSOG, а также антистоксовые нанофосфоры (НАФ) или биогибридные комплексы на их основе, например, НАФ-miniSOG. Инъекции делались с помощью микроиглы, сделанной в нашей лаборатории из стеклянных капилляров с наконечником размером около 50 нм. Обычно инъекция делалась разом со включением следующих компонентов: 200-300 мкг НАФ, 10 - 30 мкл miniSOG и 2,5 мкл лецитин-Родамин - всё смешанное в растворе PBS.

Оптический имиджинг

Оптическая имиджинговая система была собрана на основе вертикального стереомикро-скопа (Olympus MVX10) с объективом с большим рабочим расстоянием (Olympus PLAPO 0,63 х NA0,15). На верхнем порту микроскопа была смонтирована сверхчувствительная CCD камера с электронным умножением (EMCCD) (Андор, iXon), как это показано на Рисунке 8.6(c). В случае получения ФЛ изображений возбуждающее излучение на длине волны 975 нм освещало образец куриного эмбриона со стороны после фильтрации интерференционным светофильтром, пропускающим длинноволновое излучение, с длиной волны отсечки 850 нм (Edmund Optics). Для этого использовалось многомодовое волокно, система из 2-х линз для фокусировки излучения в нужной локальности образца и зеркала, чтобы направлять световой пучок. Диаметр освещаемого пятна на образце составлял, примерно, 1,5 мм, а поле зрения варьировалось от 2х2мм2 до 6х6мм2. Мощность лазер на длине волны 975 нм составляла 1 Вт, интенсивность возбуждения - 60Вт/см2. Излучение попадающее в канал регистрации пропускалось через интерференционный фильтр низких частот с длиной волны

отсечки 842 нм (Semrock) и полосковый фильтр из цветного стекла (330 - 665 нм), чтобы подавить возбуждающее излучение. Во флуоресцентном режиме возбуждение реализовалось с помощью ксеноновой лампы, смонтированной на входе микроскопа.

8.6 Квантовый выход нанорубина

Здесь представлен расчёт нижней границы rqruby для наночастиц рубина с обнаруженными бесфононными линиями R1 и R2. Часть анализа представлена в Разделе 1.3.2.

Известно, что т(^)=2,7мс при комнатной температуре для объёмного рубина при легирующем молярном соотношении хрома менее 1% [133]. Для квантовый выход ФЛ рубина самые последние эксперименты дали результат 0,90±0,05 [104]. Используя эти значения скорость излучения в объёме рубина, kbuik, может быть определена как (опуская в дальнейшем индекс ruby):

кыш = 'Ч{Шк)/т(Шк) = 333 с-1, (8.7)

В случае уменьшения размера кристаллической матрицы до диаметра много меньше длины волны испускания, требуется применять коэффициент коррекции локального поля, чтобы оценить эффект подавления к [28].

fcNP 9 (8.8)

^Ъи1к (б +

В этом выражении е равен п2, где п - коэффициент преломления материала. Используя значение п = 1, 76 для рубина, можно оценить фактор подавления скорости испускания как 0,197. Умножая этот фактор на скорость испускания, определённого Формулой 1.1 получаем скорость испускания в наночастице рубина 65, 6 с-1.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.