Получение полигидроксиалканоата с помощью детергент-устойчивого штамма Pseudomonas helmanticensis P1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Зубков Илья Николаевич

• Зубков Илья Николаевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Зубков Илья Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Общая характеристика полигидроксиалканоатов

1.2 Детергент-устойчивые продуценты полигидроксиалканоатов

1.3 Оценка метаболического состояния клеток под действием стресса, вызванного детергентом

1.4 Оптимизация условий культивирования

1.5 Выделение и очистка полигидроксиалканоатов

1.6 Анализ мономеров полигидроксиалканоатов в биомассе

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Реактивы и оборудование

2.2 Приготовление сред

2.3 Выделение изолята из образцов почвы, загрязненной додецилсульфатом натрия

2.4 Молекулярно-генетический анализ полученного изолята

2.5 Хранение Pseudomonas helmanticensis P1

2.6 Культивирование Pseudomonas helmanticensis P1 для изучения метаболического состояния клеток

2.7 Измерение содержания додецилсульфата натрия в культуральной жидкости

2.8 Оценка активности эстераз в культуральной жидкости

2.9 Эпифлуоресцентная микроскопия

2.10 Определение жирнокислотного состава

2.11 Анализ мономеров полигидроксиалканоата в образцах биомассы

2.12 Статистическая обработка результатов анализа жирных и гидроксижирных кислот

2.13 Метагеномный анализ

2.14 Влияние параметров периодического культивирования на выход полигидроксиалканоата

2.15 Построение функции отклика

2.16 Выделение полигидроксиалканоатов из сухой биомассы

2.17 Определение молекулярно-массовых характеристик полимера методом

эксклюзионной хроматографии

2.18 Получение наночастиц полигидроксиалканоата, содержащих пальмитат ретинола и стабилизированных Tween

2.19 Анализ трансфекции и токсичности наночастиц полигидроксиалканоата. 64 ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Адаптация Pseudomonas helmanticensis P1 к различным средам

3.2 Оптимизация методики количественного определения мономеров полигидроксиалканоата

3.3 Культивирование в неаксеничных условиях

3.4 Свойства наночастиц полигидроксиалканоата, стабилизированных Tween

ВЫВОДЫ

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

Приложение Д

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение полигидроксиалканоата с помощью детергент-устойчивого штамма Pseudomonas helmanticensis P1»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Поли-3-гидроксиалканоаты (ПГА) представляют собой полиэфиры, получаемые биосинтетическим путем с помощью бактерий Bacillus, Cupriavidus, Pseudomonas и т.д. [1] Они обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными полимерами, получаемыми путем переработки нефти. В частности, они быстро разлагаются как в природных экосистемах, так и в организме человека без образования токсичных продуктов [2]. Полигидроксиалканоаты обладают множеством применений как в качестве упаковочных материалов, так и при производстве изделий медицинского назначения (например, протезов костной ткани, помогающих при восстановлении после переломов или средств доставки лекарственных препаратов) [3 - 5]. Однако высокая стоимость производства ПГА значительно ограничивает их использование. Большие производственные издержки связаны, среди прочего, с высокими энергозатратами. Неотъемлемой стадией большинства процессов производства ПГА служит паровая стерилизация сред. Для получения нескольких килограмм полимера требуется не менее тонны стерильной среды. Очевидно, что при стерилизации культуральных сред в промышленных масштабах расходуется значительное количество электроэнергии, стоимость которой постоянно возрастает. Избежать паровой стерилизации можно при использовании селективных сред, которые способен метаболизировать исключительно продуцент ПГА. Повысить селективность среды можно добавлением в нее какого-либо антимикробного агента, к которому у продуцента имеется толерантность. Таким агентом может быть поверхностно-активное вещество (ПАВ), например, додецилсульфат натрия (SDS) [6]. SDS предотвращает рост большинства микроорганизмов, однако некоторые продуцирующие полигидроксиалканоаты бактерии Pseudomonas устойчивы к действию этого ПАВ. Таким образом, добавление додецилсульфата в среду позволяет проводить культивирование в неаксеничных условиях и, тем самым, снизить стоимость производства ПГА.

Степень разработанности темы. С момента открытия полигидроксиалканоатов прошло около века [7]. Множество ученых подробно исследовали процессы биосинтеза ПГА, их биоразложение и метаболизм штаммов-продуцентов. Наибольший вклад в изучение этой тематики внесли Justyna Mozejko-Ciesielska, Warren Blunt, Jose Manuel Borrero-de Acuna и др. Устойчивость бактерий Pseudomonas к додецилсульфату натрия также хорошо изучена. Исследования Janosch Klebensberger, Brendan Colley, John Fitzgerald позволили существенно улучшить понимание процесса адаптации бактерий Pseudomonas к SDS-содержащим средам. Однако культивирование бактерий Pseudomonas в нестерильных средах, содержащих додецилсульфат, для получения полигидроксиалканоатов изучается автором диссертации впервые.

Цель и задачи работы. Цель работы - изучить процессы адаптации и накопления полигидроксиалканоатов почвенными бактериями Pseudomonas в средах, содержащих додецилсульфат натрия, при периодическом культивировании.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- выделить устойчивый к SDS изолят из образца почвы;

- провести генотипирование выделенной культуры по гену 16S рРНК;

- изучить адаптацию изолята к средам, содержащим помимо субстрата (углевода, липида или глицерина) додецилсульфат натрия;

- оптимизировать условия проведения анализа мономеров ПГА в биомассе методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии;

- оптимизировать условия получения полигидроксиалканоатов путем периодического культивирования в неаксеничных условиях;

- выделить и охарактеризовать готовый полимер (установить его мономерный состав и молекулярно-массовое распределение).

Методология и методы исследования. Механизмы адаптации Pseudomonas helmanticensis P1 к SDS-содержащим средам изучались с помощью современных методов, таких как эпифлуоресцентная микроскопия и газовая хроматография - масс-спектрометрия. Анализ содержания мономеров ПГА в

биомассе методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии проводился с помощью методики, разработанной автором и его коллегами. Оптимизация параметров культивирования проводилась с помощью эксперимента, составленного по центральному композиционному ротатабельному плану, и построения функции отклика в среде программирования R. Положения, выносимые на защиту:

- механизмы адаптации P. helmanticensis P1 к средам, содержащим додецилсульфат натрия;

- модифицированная методика количественного определения остатков гидроксижирных кислот в сухой биомассе;

- методика препаративного получения полигидроксиалканоатов путем ферментации нестерильной SDS-содержащей среды P. helmanticensis P1;

- видовой состав культуры, получаемой при ферментации среды, содержащей 0,5 г/л додецилсульфата натрия и не прошедшей паровую стерилизацию;

- свойства готового полимера;

- методика синтеза наночастиц ПГА, стабилизированных Tween 80 -перспективной матрицы для внутриклеточной доставки некоторых гидрофобных лекарственных препаратов.

Научная новизна работы. Для бактерий рода Pseudomonas впервые определена роль жирнокислотного состава мембран клеток в адаптации к воздействию додецилсульфата натрия. Установлено, что природа субстрата оказывает значительное влияние на способность P. helmanticensis P1 адаптироваться к высоким (более 0,1 г/л) концентрациям додецилсульфата, добавленного к среде для культивирования.

Показана возможность накопления полигидроксиалканоата SDS-устойчивым изолятом P. helmanticensis P1 . Подтверждено, что ограничение количества источника азота в среде является эффективной стратегией максимизации выхода ПГА. Определены оптимальные условия культивирования P. helmanticensis P1 на глицерине в присутствии додецилсульфата. Доказано, что при ферментации нестерильной среды, содержащей глицерин и 0,5 г/л SDS, не

наблюдается рост посторонней микрофлоры и не уменьшается выход полигидроксиалканоата.

Теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что устойчивость P. helmanticensis P1 к додецилсульфату натрия обусловлена наличием трех защитных механизмов: образованием агрегатов, окруженных внеклеточным матриксом, который затрудняет диффузию SDS к клетке, изменением состава мембранных липидов и расщеплением додецилсульфата. Показано, что существующие данные об адаптации к SDS, полученные в первую очередь для синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, также применимы и для P. helmanticensis P1. Доказано, что в присутствии SDS цис-изомеры ненасыщенных жирных кислот, находящихся преимущественно в мембранных структурах клеток, замещаются на насыщенные аналоги. При этом текучесть мембран, напрямую связанная с их растворимостью в гидрофобных ядрах мицелл ПАВ, значительно снижается. Таким образом, модификация мембранных липидов является важным механизмом адаптации к додецилсульфату натрия. Доказано, что добавление глюкозы к среде для культивирования значительно снижает толерантность P. helmanticensis P1 к SDS. Исходя из имеющихся литературных данных можно сделать вывод, что это связано с угнетением синтеза сульфатаз. Глицерин, напротив, снижает устойчивость к додецилсульфату в меньшей мере. Показано, что среды, содержащие глицерин и SDS, можно использовать для получения ПГА с помощью P. helmanticensis P1 . Установлено, что додецилсульфат натрия с концентрацией 0,5 г/л предотвращает рост посторонней микрофлоры при культивировании в нестерильных средах, содержащих глицерин.

Разработан процесс препаративного получения полигидроксиалканоата путем культивирования P. helmanticensis P1 в нестерильных SDS-содержащих средах. Показано, что этот процесс можно использовать для получения ПГА с характеристиками, сравнимыми с описанными в литературе аналогами.

Оптимизирована методика анализа мономеров ПГА в сухой массе клеток методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии. В частности, показано,

что 2-гидроксибензойная кислота может использоваться как внутренний стандарт, а дихлорметан обеспечивает высокую степень экстракции аналитов из образцов.

Предложена методика синтеза наночастиц ПГА, способных доставлять внутрь клетки некоторые гидрофобные лекарственные средства.

Исследования по диссертационной работе выполнялись в рамках государственного задания «Исследовать биотехнологический потенциал микроорганизмов, выделенных из микробных сообществ побочного сельскохозяйственного, пищевого и природного сырья в процессах его переработки и синтеза в целях создания ингредиентов функционального назначения, продуктов «зеленого бренда» и снижения экологической нагрузки и повышения устойчивости экосистем» (проект FGUS 2022-0003). Результаты исследований внедрены в работу федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России (Приложение Д).

Степень достоверности. Обоснованность и достоверность результатов проведенных исследований базируется на анализе большого количества литературных источников. Большая часть приведенных в диссертации измерений и анализов проводились с использованием трех параллельных экспериментов. Статистическая значимость измеренных величин и построенных моделей оценена с использованием t-критерия и F-критерия. Ключевые характеристики культур клеток (жирнокислотный состав липидов и содержание мономеров ПГА) рассматривались только в сочетании с их доверительными интервалами, рассчитанными для р-уровня значимости 0,95.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих всероссийских и международных конференциях: XIX International scientific and practical conference "Current trends of agricultural industry in global economy" (Кемерово, 2020), X, XI и XII Конгрессы молодых ученых НИУ ИТМО (Санкт-Петербург, 2021-2023), Международная научно-практическая конференция «Инновационные решения актуальных вопросов биобезопасности»

(Казань, 2021), Международная конференция «Микробиология: вчера, сегодня, завтра» (Казань, 2021).

Публикация результатов исследований. Результаты исследований опубликованы в 2 статьях в журналах международной базы данных Web of Science и 1 статье из списка ВАК РФ. Опубликован 1 патент РФ (№ 2802498).

Личный вклад автора работы заключается в проведении и обсуждении экспериментов. Кроме того, автор самостоятельно планировал работу, интерпретировал и представлял результаты исследования на конференциях. Опубликованные статьи были подготовлены при непосредственном участии автора.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 12 таблиц, 29 рисунков и 5 приложений. Работа содержит три содержательные части. В первой части приводится систематический обзор литературы, во второй описаны методики проведения экспериментов. В третьей части работы приводятся результаты и их обсуждение. Завершается работа списком цитируемой литературы (178 наименований, в том числе 178 на иностранном языке).

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Общая характеристика полигидроксиалканоатов

Поли-3-гидроксиалканоаты (ПГА) представляют собой полиэфиры, состоящие из остатков 3-гидроксикарбоновых кислот. Общая формула ПГА представлена на рисунке 1. В отличие от других полиэфиров, таких как поликапролактон, полигидроксиалканоаты получают преимущественно путём микробиологического синтеза. Ряд бактерий способны продуцировать ПГА в качестве резервного источника углерода и энергии. Внутри клетки полигидроксиалканоаты находятся в форме аморфных включений. В ряде случаев содержание ПГА в биомассе достигает 80% от сухого веса [8].

Я О

Я - СН3, С2Н5, С3Н7 ... СцН^з, с12н25...

8с1-РНА шс1-РНА 1с1-РНА

Рисунок 1. Структура поли-3-гидроксиалканоатов

По сравнению с традиционными пластиками, получаемыми из нефтепродуктов, ПГА обладают множеством преимуществ. Главное из них -полная биоразлагаемость. Попадающие в почву изделия из полигидроксиалканоатов полностью разлагаются бактериями в течение нескольких недель [9]. Кроме того, ПГА являются биосовместимыми полимерами, благодаря чему их можно использовать для медицинских целей.

В зависимости от длины углеродной цепи мономера различают короткоцепочечные полигидроксиалканоаты (вс1-ПГА), в которых углеродная цепь состоит из 4-5 атомов, среднецепочечные (ше1-ПГА) с 6-14 атомами углерода в цепи мономера и длинноцепочечные (1с1-ПГА) с более чем 14 атомами

углерода (Рисунок 1). Свойства полимера в значительной степени зависят от длины углеродной цепи мономера. Scl-ПГА - полгидроксибутират, полигидроксивалерат и их сополимеры - обладают высокими температурами плавления (до 180°^ [10]. При комнатной температуре они представляют собой твердые и хрупкие кристаллы, которые плохо поддаются механической обработке. Mcl-ПГА и Ы-ПГА, напротив, часто находятся в вязкотекучем состоянии при комнатной температуре и плавятся при 40-50^ [11]. Можно предположить также, что свойства полигидроксиалканоатов также зависят и от их молекулярной массы. Зависимости температур фазовых переходов и показателей прочности от степени полимеризации систематически не изучались, однако известно, что молекулярный вес mcl-ПГА чаще всего находится в пределах 50500 кДа [12, 13]. Кроме того, показано, что показатель полидисперсности биогенных mcl-ПГА, выраженный как отношение средневесовой и среднечисловой молекулярной массы, находится в пределах 1,3-2,6 [13, 14].

Применение полигидроксиалканоатов в качестве упаковочных и конструкционных материалов на сегодняшний день не представляется возможным ввиду их высокой стоимости. Получаемые путём микробного синтеза полимеры не выдерживают конкуренции с традиционными пластиками, синтезируемыми из продуктов нефтепереработки. Тем не менее, биоразлагаемые пластики, такие как ПГА, востребованы во многих отраслях.

Твёрдые и прочные scl-ПГА применяются преимущественно в медицине для изготовления протезов и трубок, заменяющих часть кровеносного сосуда [5]. Mcl-ПГА более эластичны, что позволяет использовать их для производства пленок и упаковки [3]. Смеси scl-ПГА и mcl-PHA обладают свойствами, сравнимыми с традиционными пластиками, получаемыми путем нефтехимического синтеза [4].

Используемые в медицине и пищевой промышленности полигидроксиалканоаты должны быть химически чистыми. Наибольшая опасность загрязнения ПГА заключается в использовании неочищенного сырья для культивирования продуцентов. Например, отработанные масла, которые часто

применяются в качестве источника углерода в питательных средах, могут содержать большое количество примесей - альдегидов, полиароматических углеводородов, гетероциклических соединений, которые представляют значительную опасность для здоровья человека [15]. Нормировать содержание такого большого круга примесей сложно, и существует вероятность их экстракции из биомассы вместе с полимером. Следовательно, ПГА для исользования в пищевой промышленности должны быть получены из химически чистого сырья, которое расщепляется продуцентами до нетоксичных метаболитов.

Что касается термических и химических свойств готового полимера, как было отмечено выше, более предпочтительны полигидроксиалканоаты с 6-14 атомами углерода в цепи мономера. Влияние степени полимеризации на свойства готового полимера пока не изучено, однако очевидно, что ПГА с высокой молекулярной массой будут обладать большей температурой плавления. Также общепринято, что полимеры с узким молекулярно-массовым распределением (с коэффициентом полидисперсности, близким к 1) обладают лучшими механическими свойствами.

Возможные пути биосинтеза полигидроксиалканоатов подробно изучены и описаны в литературе [16]. Основным прекурсором для de novo синтеза ПГА служат молекулы ацетилкофермента А, которые с помощью цикла синтеза жирных кислот преобразуются в (R)^-3-ацилкофермент А. (Rj-3-ацилкофермент А, в свою очередь, с помощью специфической синтазы phaC конденсируется в полигидроксиалканоат (Рисунок 2). Образование (Rj-3-ацилкофермента А может происходить и альтернативным путем, через окисление (последовательное дегидрирование-гидратацию) незамещенного ацилкофермента А, который образуется при метаболизме жирных кислот и триацилглицеридов (Рисунок 2).

Синтез полигидроксиалканоатов при культивировании на всех возможных субстратах можно свести к описанным двум метаболическим путям. Если в качестве источника углерода используется липид, то преобладает окисление

ацилкофермента А. В остальных случаях прекурсором служит ацетилкофермент А, который, как правило, образуется при декарбоксилировании пирувата [17].

: я - сн3, с3н7, с5нп ... :

о

к

Б-СоА

БАБ

¥АОЯ2

К

н,о

О

8-СоА

Л

ОН о

АТР

АБР + Р

© о

Б-СоА

АСР —. СоА-БН Л

© О

АСР

С02; АСР ^г

КАБРН; Н+ 9 9

ОН о

"АСР

АСР СоА-БН

О

н,о

к

АСР

О

Я АСР КАБР+

7

КАБРН; Н

Рисунок 2. Биосинтез поли-3-гидроксиалканоатов

1.2 Детергент-устойчивые продуценты полигидроксиалканоатов

Первоначально полигидроксиалканоаты были обнаружены как резервный источник углерода и энергии у Bacillus megaterium в 1926 году [7]. За почти вековую историю исследования ПГА было найдено множество продуцентов, принадлежащих родам Azotobacter, Cupriavidus, Ralstonia, Pseudomonas и т. д. [1] Все они обладают разными преимуществами, однако бактерии рода Pseudomonas на сегодняшний день являются наиболее перспективными. Некоторые бактерии Pseudomonas способны усваивать широкий круг субстратов [18], они устойчивы к действию многих стресс-факторов [19], а также продуцируют mcl-ПГА, обладающие большей ценностью по сравнению полигидроксибутиратом и полигидроксивалератом.

Необходимо подчеркнуть, что разные штаммы Pseudomonas продуцируют различные типы полигидроксиалканоатов. В частности, P. aeruginosa, P. pseudoflava и P. palleronii синтезируют в основном короткоцепочечные ПГА (scl-PHA) [20 - 22]. Другие же штаммы, такие как P. putida, P. chlororaphis, P. mediterranea и P. corrugata способны накапливать mcl-ПГА [23 - 25].

Способность некоторых штаммов рода Pseudomonas расти и развиваться в присутствии детергентов открывает возможность их культивирования в средах, не прошедших паровую стерилизацию. Общеизвестно, что ионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ), такие как алкилсульфаты и четвертичные аммониевые соли, токсичны для широкого круга микроорганизмов. Добавление ионогенного ПАВ в среду для культивирования позволяет предотвратить рост нежелательных бактерий и микромицетов. При этом детергент не подавляет рост продуцента ПГА, что позволяет исключить стадию стерилизации.

Выделено множество бактерий Pseudomonas, толерантных как к алкилсульфатам, так и к четвертичным аммониевым солям. К ним относятся синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas

jesseni и т.д. [19, 26, 27]. Выделяют такие штаммы обычно из образцов почвы и донных осадков, загрязнённых соответствующим детергентом, с помощью селективных сред, содержащих ПАВ. Так как многие бактерии способны использовать, например, додецилсульфат натрия (SDS) в качестве единственного источника углерода, их можно культивировать на средах, содержащих SDS в качестве субстрата [28].

Додецилсульфат натрия, в отличие от других органических сульфатов, фосфатов, четвертичных аммониевых солей и прочих классов синтетических ПАВ, обладает сравнительно низкой стоимостью, поэтому его применение в качестве бактерицидного агента при культивировании наиболее оправдано. Кроме того, он легко деградирует при попадании в окружающую среду и не представляет значительной опасности для водных и почвенных организмов. Следовательно, SDS-устойчивые бактерии наиболее перспективны для создания технологических процессов получения mcl-ПГА.

Причина, которая побудила множество учёных исследовать SDS-деградирующие бактерии, — это широкое распространение детергент-устойчивой палочки P. aeruginosa в медицинских учреждениях. Эта бактерия способна вызывать множество заболеваний и быстро становится резистентной к антимикробной терапии. Удаление P. aeruginosa с различных поверхностей - это актуальная проблема гигиены. Следовательно, большая часть исследований, посвященных устойчивости бактерий Pseudomonas к SDS, относится к биомедицинской отрасли. Механизмы, которые позволяют штаммам Pseudomonas выживать в присутствии алкилсульфатов, подробно изучены, в том числе на генетическом уровне. Большая часть опубликованных статей относится к P. aeruginosa, однако имеющиеся данные позволяют предположить, что обнаруженные закономерности во многом применимы и к другим бактериям [29, 30].

Механизмы устойчивости штаммов Pseudomonas к алкилсульфатам можно условно разделить на три «уровня». Первый - это способность бактерий к образованию агрегатов, окруженных защитным матриксом, который затрудняет

диффузию SDS к клеточной стенке [19]. Другой способ адаптации к токсическому действию детергента заключается в модификации структур клеточной стенки, например, клеточной и плазматической мембран [31]. Наконец, третий «уровень» толерантности к SDS - это способность клетки его расщеплять с помощью соответствующих ферментов, тем самым защищая компоненты цитозоля от денатурации и деструкции [19]. Несмотря на то, что толерантность бактерий Pseudomonas к детергентам хорошо изучена, эту способность по-прежнему сложно контролировать: трудно подавить или, наоборот, стимулировать клетку продуцировать вещества, обеспечивающие защиту от SDS.

Первая публикация, в которой рассматривалась роль агрегатообразования в устойчивости к SDS, была опубликована в 2006 г Клебенсбергером и его коллегами [19]. Установлено, что образование агрегатов представляет собой энергозависимый процесс, обеспечивающий рост культуры P. aeruginosa в присутствии додецилсульфата. В дальнейших исследованиях было показано, что в агрегатах наблюдается дифференциация клеток на внутренние и внешние. Клетки, находящиеся в центре скопления, менее метаболически активны, и гораздо более подвержены действию детергента [32]. Внешние клетки при этом, напротив, более устойчивы к SDS [33]. Роль такой дифференциации до сих пор не ясна. Однако, можно предположить, что внутренние клетки просто не получают достаточного количества кислорода и питательных веществ, чтобы продуцировать эндогенные сульфатазы. Если их перенести из ядра агрегата в раствор, содержащий SDS, они не успевают выработать необходимые для устойчивости к детергенту метаболиты и погибают.

В состав матрикса, который окружает клетки в биопленках, входят сразу несколько групп веществ. Основными его компонентами являются полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты [34].

В составе экзогенных биополимеров бактерий Pseudomonas обнаружено несколько полисахаридов, например, альгинат [34], Pel (сополимер ^-ацетилгалактозамина и ^-ацетилглюкозамина [35]) и Pls, который состоит из мономеров маннозы, рамнозы и глюкозы в мольном отношении 3:1:1 [36]. Все эти

компоненты способны связываться с другими веществами, входящими в состав матрикса, и адгезинами клеточных стенок.

Наличие внеклеточных нуклеиновых кислот в матриксе долгое время объяснялось тем, что они высвобождаются при лизисе клеток. Однако, в последствии было показано, что ДНК усиливает связывание в матриксе, образуя комплексы с Pel [37].

Наибольшую роль в стабильности агрегатов играют различные белки и пили. Было показано, что P. aeruginosa продуцирует пять различных пилей (CupA/B/C/D/E). Сборка CupA/B/C/D/E и процессы, регулирующие синтез соответствующих белков, подробно описаны в [38]. Связывание клеток с матриксом также обеспечивается адгезином CdrA, который образует комплекс с остатками маннозы в Pls [36]. Регуляция этого адгезина обеспечивается транспортным белком cdrB и протеазой LapG [39].

Каскад агрегации у бактерий Pseudomonas начинается только при достижении достаточной концентрации клеток в среде [38]. Сигналы, инициирующие синтез компонентов матрикса, передаются путём трансдукции SiaABCD. Важную роль также играет циклический дигуанозин монофосфат (c-di-GMP), который является основной сигнальной молекулой [40]. Таким образом, образование биопленки является многостадийным процессом, в котором многие метаболиты способны влиять на синтез матрикса и адгезинов [41, 42]. Необходимо отметить, что агрегатообразование - это обратимый процесс. После уменьшения концентрации SDS в культуральной жидкости клетки переходят в планктонную форму [29].

Агрегаты более устойчивы к комбинации действия додецилсульфата с другими стрессовыми факторами, такими как кислородное голодание [19] и деформация в быстром турбулентном потоке [43]. Образование агрегатов часто обеспечивает устойчивость и к другим ПАВ, таким как четвертичные аммониевые соли [44, 45]. В прочем, устойчивые к SDS биопленки иногда подвержены действию бромида цетилтриметиламмония (CTAB) [46].

Мембранные липиды могут растворяться (солюбилизироваться) в мицеллах некоторых ПАВ [47, 48]. Солюбилизация особенно сильна в случае сильных ионогенных детергентов, таких как SDS. Очевидно, что одним из основных механизмов адаптации клетки к ионным детергентам (в частности, к додецилсульфату) является модификация структуры мембранных липидов, в результате которой понижается их растворимость в мицеллах SDS.

Важным свойством липидного бислоя является его текучесть. Текучесть определена как температура фазового перехода липида из твердого состояния в вязкую жидкость и наоборот. Эта температура, в свою очередь, зависит от жирнокислотного состава липида, а точнее от соотношения между содержанием «изогнутых» и «прямых» жирных кислот (ЖК). К «изогнутым» относят циклопропановые и цис-изомеры непредельных ЖК, алкильные заместители которых не образуют линейных конформеров, и, следовательно, не могут быть упакованы в регулярную кристаллическую структуру. Липиды, содержащие такие жирные кислоты, имеют более низкую температуру фазового перехода и легче солюбилизируются растворами ПАВ. «Прямые» ЖК, напротив, легко образуют прочные кристаллы и обладают более высокими температурами фазового перехода. К ним относят насыщенные жирные кислоты и транс-изомеры ненасыщенных. Липиды, состоящие из «прямых» ЖК, хуже солюбилизируются. Таким образом, можно предположить, что у клетки под действием SDS будет снижаться текучесть мембраны, благодаря замещению «изогнутых» жирных кислот «прямыми».

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зубков Илья Николаевич, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zinn, M. Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate / M. Zinn, B. Witholt, T. Egli // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2001. -V. 53, N. 1. - P. 5-21.

2. Bonartsev, A.P. Application of polyhydroxyalkanoates in medicine and the biological activity of natural poly(3-hydroxybutyrate) / A.P. Bonartsev, G.A. Bonartseva, I.V. Reshetov, M.P. Kirpichnikov, K.V. Shaitan // Acta Naturae. - 2019. - V. 11, N. 2. -P. 4-16.

3. Perez-Araur, A.O. Production and characterization of biodegradable films of a novel polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesized from peanut oil / A.O. Perez-Arauz, A.E. Aguilar-Rabiela, A. Vargas-Torres, A.-I. Rodriguez-Hernandeza, N. Chavarria-Hernandez, B. Vergara-Porras, M.R. Lopez-Cuellar // Food Packag. Shelf Life. - 2019. - V. 20. - 100297.

4. Rebocho, A.T. Preparation and characterization of films based on a natural P(3HB)/mcl-PHA blend obtained through the co-culture of Cupriavidus necator and Pseudomonas citronellolis in apple pulp waste / A.T. Rebocho, J.R. Pereira, L.A. Neves, V.D. Alves, C. Sevrin, C. Grandfils, F. Freitas, M.A.M. Reis // Bioeng. - 2020. - V. 7, N. 2. - 34.

5. Puppi, D. Biomedical processing of polyhydroxyalkanoates / D. Puppi, G. Pecorini, F. Chiellini // Bioeng. - 2019. - V. 6., N. 4. - 108.

6. Johnston, M.D. One explanation for the variability of the bacterial suspension test / M.D. Johnston, E.-A. Simons, R.J.W. Lambert // J. Appl. Microbiol. - 2000. - V. 88, N. 2. - P. 237-242.

7. Lemoigne, M. Produits de deshydratation et de polymersation de la acideoxybutyrique / M. Lemoigne // Bull. Soc. Chim. Biol. - 1926. - V. 8. - P. 770782.

8. Campos, M.I. The influence of crude glycerin and nitrogen concentrations on the production of PHA by Cupriavidus necator using a response surface methodology and

its characterizations / M.I. Campos, T.V.B. Figueiredo, L.S. Sousa, J.I. Druzian // Ind. Crops Prod. - 2014. - V. 52. - P. 338-346.

9. Volova, G.V. Biodegradation of polyhydroxyalkanoates in natural soils / T.G. Volovaa, A.N. Boyandin, S.V. Prudnikova // J. Sib. Fed. Univ. Biol. - 2015. - V. 8, N. 2. - P. 152-167.

10. Owen, A.J. Crystallization and melting behaviour of PHB and PHB/HV copolymer / A.J. Owen, J. Heinzel, Z. Skrbic, V. Divjakovic // Polymer. - 1992. - V. 33, N. 7. - P. 1563-1567.

11. Dartiailh, C. The thermal and mechanical properties of medium chain-length polyhydroxyalkanoates produced by pseudomonas putida LS46 on various substrates / C. Dartiailh, W. Blunt, P.K. Sharma, S. Liu, N. Cicek, D.B. Levin // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2021. - V. 8. - 617489.

12. Pappalardo, F. Production of filmable medium-chain-length polyhydroxyalkanoates produced from glycerol by Pseudomonas mediterranea / F. Pappalardo, M. Fragala, P.G. Mineo, A. Damigella, A.F. Catara, R. Palmeri, A. Rescifina // Int. J. Biol. Macromol. -2014. - V. 65. - P. 89-96.

13. Borrero-de Acuna, J.M. Fed-batch mcl- polyhydroxyalkanoates production in Pseudomonas putida KT2440 and AphaZ mutant on biodiesel-derived crude glycerol / J.M. Borrero-de Acuna, M. Rohde, C. Saldias, I. Poblete-Castro // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2021. - V. 9. - 642023.

14. Liu, M.-H. Characterization of medium-chain-length polyhydroxyalkanoate biosynthesis by Pseudomonas mosselii TO7 using crude glycerol / M.-H. Liua, Y.-J. Chena, C.-Y. Lee // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2018. - V. 82, N. 3. - P. 532-539.

15. Ganesan, K. Deep frying cooking oils promote the high risk of metastases in the breast-A critical review / K. Ganesan, B. Xu // Food Chem. Toxicol. - 2020. - V. 144. -111648.

16. Mozejko-Ciesielska, J. Pseudomonas species as producers of eco-friendly polyhydroxyalkanoates / J. Mozejko-Ciesielska, K. Szacherska, P. Marciniak // J. Polym. Environ. - 2019. - V. 27. - P. 1151-1166.

17. Blunt, W. Efficacy of medium chain-length polyhydroxyalkanoate biosynthesis from different biochemical pathways under oxygen-limited conditions using Pseudomonas putida LS46 / W. Blunt, A. Lagasse, Z. Jin, C. Dartiailh, R. Sparling, D.J. Gapes, D.B. Levin, N. Cicek // Process Biochem. - 2019. - V. 82. - P. 19-31.

18. Ruiz, C. Conversion of waste cooking oil into medium chain polyhydroxyalkanoates in a high cell density fermentation / C. Ruiz, S.T. Kenny, T. Narancic, R. Babu, K. O' Connor // J. Biotechnol. - 2019. - V. 306. - P. 9-15.

19. Klebensberger, J. Cell aggregation of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 as an energy-dependent stress response during growth with sodium dodecyl sulfate / J. Klebensberger, O. Rui, E. Fritz, B. Schink, B. Philipp // Arch. Microbiol. - 2006. - V. 185, N. 6. - P. 417-427.

20. Sohail, R. Animal fat and glycerol bioconversion to polyhydroxyalkanoate by produced water bacteria / R. Sohail, N. Jamil, I. Ali, S. Munir // e-Polymers. - 2020. -V. 20, N. 1. - P. 92-102.

21. Reddy, M.V. Polyhydroxyalkanoates production from synthetic waste using Pseudomonas pseudoflava: Polyhydroxyalkanoate synthase enzyme activity analysis from P. pseudoflava and P. palleronii / M.V. Reddy, Y. Mawatari, R. Onodera, Y. Nakamura, Y. Yajima, Y.-C. Chang // Bioresour. Technol. - 2017. - V. 234. - P. 99105.

22. Wei, X. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) by recombinant pseudomonas stutzeri 1317 from unrelated carbon sources / X. Wei, F. Liu, J. Jian, R. Wang, G. Chen // Chin. J. Chem. Eng. - 2013. - V. 21, N. 9. - P. 1057-1061.

23. Borrero-de Acuna, J.M. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoate in metabolic flux optimized Pseudomonas putida / J.M. Borrero-de Acuna, A. Bielecka, S. Haussler, M. Schobert, M. Jahn, C. Wittmann, D. Jahn, I. Poblete-Castro // Microb. Cell Factories. - 2014. - V. 13. - 88.

24. De Meneses, L. Pseudomonas chlororaphis as a multiproduct platform: Conversion of glycerol into high-value biopolymers and phenazines / L. de Meneses, J.R. Pereira, C. Sevrin, C. Grandfils, A. Paiva, M.A.M. Reis, F. Freitas // N. Biotechnol. - 2020. - V. 55. - P. 84-90.

25. Palmeri, R. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) production through conversion of glycerol by selected strains of Pseudomonas mediterranea and Pseudomonas corrugate / R. Palmeri, F. Pappalardo, M. Fragala, M. Tomasello, A. Damigella, A.F. Catara // Chem. Eng. Trans. - 2012. - V. 27. - P. 121-126.

26. Kahnert, A. Characterization of a sulfur-regulated oxygenative alkylsulfatase from Pseudomonas putida S-313 / A. Kahnert, M.A. Kertesz // Int. J. Biol. Chem. - 2000. -V. 275, N. 41. - P. 31661-31667.

27. Furmanczyk, E.M. Genomic and functional characterization of environmental strains of SDS-degrading Pseudomonas spp., providing a source of new sulfatases / E.M. Furmanczyk, L. Lipinski, A. Dziembowski, A. Sobczak // Front. Microbiol. -2018. - V. 9. - 1795.

28. Jovcic, B. Dynamics of sodium dodecyl sulfate utilization and antibiotic susceptibility of strain Pseudomonas sp. ATCC19151 / B. Jovcic, J. Begovic, J. Lozo, L. Topisirovic, M. Kojic // Arch. Biol. Sci. - V. 61, N. 2. - P. 159-164.

29. Chaturvedi, V. Diversity of culturable sodium dodecyl sulfate (SDS) degrading bacteria isolated from detergent contaminated ponds situated in Varanasi city, India / V. Chaturvedi, A. Kumar // Int. Biodeterior. Biodegradation. - 2011. - V. 65, N. 7. - P. 961-971.

30. Kharadi, R.R. Cyclic-di-GMP regulates autoaggregation through the putative peptidoglycan hydrolase, EagA, and regulates transcription of the znuABC zinc uptake gene cluster in Erwinia amylovora / R.R. Kharadi, G.W. Sundin // Front. Microbiol. -2011. - V. 11. - 605265.

31. Nyberg, H. The influence of ionic detergents on the phospholipid fatty acid compositions of Porphyridium purpureum / H. Nyberg // Phytochemistry. - 1985. -V.24, N. 3. - P. 435-440.

32. Ciofu, O. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents — How P. Aeruginosa can escape antibiotics / O. Ciofu, T. Tolker-Nielsen // Front. Microbiol. - 2019. - V. 10. - 913.

33. Haagensen, J.A.J. Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms / J.A.J. Haagensen, M.

Klausen, R.K. Ernst, S.I. Miller, A. Folkesson, T. Tolker-Nielsen, S. Molin // J. Bacteriol. - 2007. - V. 189, N. 1. - P. 28-37.

34. Flemming, F.-S. The biofilm matrix / H.-C. Flemming, J. Wingender // Nat. Rev. Microbiol. - 2010. - V. 8. - P. 623-633.

35. Friedman, L. Two genetic loci produce distinct carbohydrate-rich structural components of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix / L. Friedman, R. Kolter // J. Bacteriol. - 2004. - V. 186, N. 14. - P. 4457-4465.

36. Borlee, B.R. Pseudomonas aeruginosa uses a cyclic-di-GMP-regulated adhesin to reinforce the biofilm extracellular matrix / B.R. Borlee, A.D. Goldman, K. Murakami, R. Samudrala, D.J. Wozniak, M.R. Parsek // Mol. Microbiol. - 2010. - V. 75, N. 4. - P. 827-842.

37. Jennings, L.K. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix / L.K. Jennings, K.M. Storeka, H.E. Ledvina, C. Coulon, L.S. Marmont, I. Sadovskaya, P.R. Secor, B.S. Tseng, M. Scian, A. Filloux, D.J. Wozniak, P.L. Howell, M.R. Parsek // Microbiology. - 2015. -V. 112, N. 36. - P. 11353-11358.

38. Colley, B. Regulatory mechanisms involved in the aggregation of Pseudomonas aeruginosa cells: диссертация PhD. University of New South Wales, Сидней, Австралия, 2014.

39. Rybtke, M. The LapG protein plays a role in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by controlling the presence of the CdrA adhesin on the cell surface / M. Rybtke, J. Berthelsen, L. Yang, N. Hoiby, M. Givskov, T. Tolker-Nielsen // MicrobiologyOpen. - 2015. - V. 4, N. 6. - P. 917-930.

40. Chen, G. The SiaA/B/C/D signaling network regulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa / G. Chen, J. Gan, C. Yang, Y. Zuo, J. Peng, M. Li, W. Huo, Y. Xie, Y. Zhang, T. Wang, X. Deng, H. Liang // EMBO J. - 2020. - V. 39, N. 6. -e103412.

41. Irie, Y. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa / Y. Irie, B.R. Borlee, J.R. O'Connor, P.J. Hill,

C.S. Harwood, D.J. Wozniak, M.R. Parsek // PNAS. - 2012. - V. 109, N. 50. -P. 20632-20636.

42. Colley, B. SiaA/D interconnects c-di-GMP and RsmA signaling to coordinate cellular aggregation of Pseudomonas aeruginosa in response to environmental conditions / B. Colley, V. Dederer, M. Carnell, S. Kjelleberg, S.A. Rice, J. Klebensberger // Front. Microbiol. - 2016. - V. 7. - 179.

43. Simoes, M. Sodium dodecyl sulfate allows the persistence and recovery of biofilms of Pseudomonas fluorescens formed under different hydrodynamic conditions / M. Simoes, L.C. Simoes, M.O. Pereira, M.J. Vieira // Biofouling. - 2008. - V. 24, N. 1. - P. 35-44.

44. Langsrud, S. Intrinsic and acquired resistance to quaternary ammonium compounds in food-related Pseudomonas spp. / S. Langsrud, G. Sundheim, R. Borgmann-Strahsen // J. Appl. Microbiol. - 2003. - V. 95, N. 4. - P. 874-882.

45. Sousa-Silva, M. Pseudomonas fluorescens tolerance to benzyldimethyldodecyl ammonium chloride: Altered phenotype and cross-resistance / M. Sousa-Silva, M. Simoes, L. Melo, I. Machado // J. Glob. Antimicrob. Resist. - 2018. - V. 15. - P. 188195.

46. Rajagopal, S. Eight Gram-negative bacteria are 10,000 times more sensitive to cationic detergents than to anionic detergents / S. Rajagopal, N. Eis, K.W. Nickerson // Can. J. Microbiol. - 2003. - V. 49, N. 12. - P. 775-779.

47. Henriksen, J.R. Understanding detergent effects on lipid membranes: A model study of lysolipids / J.R. Henriksen, T.L. Andresen, L.N. Feldborg, L. Duelund, J.H. Ipsen // Biophys. J. - 2010. - V. 98, N. 10. - P. 2199-2205.

48. Heerklotz, H. Detergent interactions with lipid bilayers and membrane proteins / H. Heerklotz, A. Blume // Comprehensive Biophysics. - 2012. - V. 5. - P. 63-91.

49. Janse, J.D. Classification of fluorescent soft rot Pseudomonas bacteria, Including P. marginalis strains, using whole cell fatty acid analysis / J.D. Janse, J.H.J. Derks, B.E. Spit, W.R. Van Der Tuin // System. Appl. Microbiol. - 1992. - V. 15, N. 4. - P. 538553.

50. Heipieper, H.J. The cis-trans isomerase of unsaturated fatty acids in Pseudomonas and Vibrio: biochemistry, molecular biology and physiological function of a unique stress adaptive mechanism / H.J. Heipieper, F. Meinhardt, A. Segura // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - V. 229, N. 1. - P. 1-7.

51. Shanklin, J. Evidence linking the Pseudomonas oleovorans alkane ©-hydroxylase, an integral membrane diiron enzyme, and the fatty acid desaturase family / J. Shanklin, E. Whittle // FEBS Lett. - 2003. - V. 545, N. 2-3. - P. 188-92.

52. Tattawasart, U. Outer membrane changes in Pseudomonas stutzeri resistant to chlorhexidine diacetate and cetylpyridinium chloride / U. Tattawasart, J.-Y. Maillard, J.R. Furr, A.D. Russell // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2000. - V. 16, N. 3. - P. 233238.

53. Guerin-Mechin, L. Quaternary ammonium compound stresses induce specific variations in fatty acid composition of Pseudomonas aeruginosa / L. Guerin-Mechin, F. Dubois-Brissonnet, B. Heyd, J.Y. Leveau // Int. J. Food Microbiol. - 2000. - V. 55, N. 1-3. - P. 157-159.

54. Carmona-Salazar, L. Fatty acid profiles from the plasma membrane and detergent resistant membranes of two plant species / L. Carmona-Salazar, M. El Hafidi, N. Gutierrez-Najera, L. Noyola-Martinez, A. Gonzalez-Solis, M. Gavilanes-Ruiz // Phytochemistry. - 2015. - V. 109. - P. 25-35.

55. Nixdorff, K. Interaction of lipopolysaccharide with detergents and its possible role in the detergent resistance of the outer membrane of gram-negative bacteria / K. Nixdorff, J. Gmeiner, H.H. Martin // Biochim. Biophys. Acta. - 1978. - V. 510, N. 1. -P. 87-98.

56. White, G.F. A Survey of sodium dodecyl sulphate (SDS) resistance and alkylsulphatase production in bacteria from clean and polluted river sites / G.F. White, N.J. Russell, M.J. Day // Environ. Pollut. - 1985. - V. 37, N. 1. - P. 1-11.

57. Chaturvedi, V. Presence of SDS-degrading enzyme, alkyl sulfatase (SdsA1) is specific to different strains of Pseudomonas aeruginosa / V. Chaturvedi, A. Kumar // Process Biochem. - 2013. - V. 48, N. 4. - P. 688-693.

58. Hagelueken, G. The crystal structure of SdsA1, an alkylsulfatase from Pseudomonas aeruginosa, defines a third class of sulfatases / G. Hagelueken, T.M. Adams, L. Wiehlmann, U. Widow, H. Kolmar, B. Tummler, D.W. Heinz, W.-D. Schubert // PNAS. - 2006. - V. 103, N. 20. - P. 7631-7636.

59. Muller, I. Crystal structure of the alkylsulfatase AtsK: Insights into the catalytic mechanism of the Fe(II) a-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily / I. Muller, A. Kahner, T. Pape,| G.M. Sheldrick, W.Meyer-Klaucke, T. Dierks, M. Kertesz, I. Uson // Biochemistry. - 2004. - V. 43, N. 11. - P. 3075-3088.

60. Boltes, I. 1.3 A structure of arylsulfatase from Pseudomonas aeruginosa establishes the catalytic mechanism of sulfate ester cleavage in the sulfatase family / I. Boltes, H. Czapinska, A. Kahnert, R. von Bulow, T. Dierks, B. Schmidt, K. von Figura, M.A. Kertesz, I. Uson // Structure. - 2001. - V. 9, N. 6. - P. 483-491.

61. Knaus, T. Structure and mechanism of an inverting alkylsulfatase from Pseudomonas sp. DSM6611 specific for secondary alkyl sulfates / T. Knaus, M. Schober, B. Kepplinger, M. Faccinelli, J. Pitzer, K. Faber, P. Macheroux, U. Wagner // FEBS. J. - 2012. - V. 279, N. 23. - P. 4374-4384.

62. Panasia, G. Sulfate ester detergent degradation in Pseudomonas aeruginosa is subject to both positive and negative regulation / G. Panasia, S. Oetermann, A. Steinbuchel, B. Philipp // Appl. Environ. Microbiol. - 2019. - V. 85, N. 23.

63. Gadler, P. Highly enantioselective biohydrolysis of sec-alkyl sulfate esters with inversion of configuration catalysed by Pseudomonas spp. / P. Gadler, K. Faber // Eur. J. Org. Chem. - 2007. - V. 2007, N. 33. - P. 5527-5530.

64. Ellis, A.J. Novel alkylsulfatases required for biodegradation of the branched primary alkyl sulfate surfactant 2-butyloctyl sulfate / A.J. Ellis, S.G. Hales, N.G.A. Ur-Rehman, G.F. White // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - V. 68, N. 1. - P. 31-36.

65. Li, S. Preparation and characterization of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of recombinant thermostable alkylsulfatase (SdsAP) from Pseudomonas sp. S9 / S. Li, Y. Su, Y. Liu, L. Sun, M. Yu, Y. Wu // Process Biochem. - 2016. - V. 51, N. 12. - P. 2084-2089.

66. Sun, L. Crystal structure of thermostable alkylsulfatase SdsAP from Pseudomonas sp. S9 / L. Sun1, P. Chen, Y. Su, Z. Cai, L. Ruan, X. Xu, Y. Wu // Biosci. Rep. - 2017.

- V. 37, N. 3. - BSR20170001.

67. Davison, J. Cloning and sequencing of Pseudomonas genes determining sodium dodecyl sulfate biodegradation / J. Davison, F. Brunel, A. Phanopoulos, D. Prozzia, P. Terpstra / Gene. - 1992. - V. 114, N. 1. - P. 19-24.

68. Jovcic, B. Regulation of the sdsA alkyl sulfatase of Pseudomonas sp. ATCC19151 and its involvement in degradation of anionic surfactants / B. Jovcic, V. Venturi, J. Davison, L. Topisirovic, M. Kojic // J. Appl. Microbiol. - 2010. - V. 109, N. 3. - P. 1076-1083.

69. Kostal, J. Pseudomonas C01B, an SDS degrading strain, harbours a plasmid coding for degradation of medium chain length n-alkanes / J. Kostal, M. Suchanek, H. Klierova, K. Demnerova, B. Kralova, D.L. McBeth // Int. Biodeterior. Biodegradation.

- 1998. - V. 42. - P. 211-228.

70. Shin, S. A microfluidic approach to investigating a synergistic effect of tobramycin and sodium dodecyl sulfate on Pseudomonas aeruginosa biofilm / S. Shin, I. Ahmed, J. Hwang, Y. Seo, E. Lee, J. Choi, S. Moon, J.W. Hong // Anal. Sci. - 2016. - V. 32, N. 1.

- P. 67-73.

71. Fitzgerald, J.W. Reversal of succinate-mediated catabolite repression of alkylsulfatase in Pseudomonas aeruginosa by 2,4-dinitrophenol and by sodium malonate / J.W. Fitzgerald, L.C. Kight-Olliff, G.J. Stewart, N.F. Beaucham // Can. J. Microbiol. -1978. - V. 24, N. 12. P. 1567-1573.

72. Kight-Olliff, L.C. Inhibition of enzyme induction in Pseudomonas aeruginosa by exogenous nucleotides / L.C. Kight-Olliff, J.W. Fitzgerald // Can. J. Microbiol. - 1978.

- V. 24, N. 7. - P. 811-817.

73. Fitzgerald, J.W. Stimulation of arylsulphatase synthesis in Pseudomonas aeruginosa by exogenous nucleotides / J.W. Fitzgerald, R.B. Kellogg, G.J. Stewart // FEMS Microbiol. Lett. - 1981. - V. 11, N. 1. - P. 93-96.

74. Fitzgerald, J.W. Physiological control of alkylsulfatase synthesis in Pseudomonas aeruginosa: effects of glucose, glucose analogs, and sulfur / J.W. Fitzgerald, L.C. Kight // Can. J. Microbiol. - 1977. - V. 23. - P. 1456-1464.

75. Collier, D.N. Catabolite repression control in the Pseudomonads / Collier, D.N., Hager, P.W., Phibbs, P.V. Jr. // Res. Microbiol. - 1996. - V. 147, N. 6 -7. - P. 551-561.

76. Hayashi, K. A rapid determination of sodium dodecyl sulfate with methylene blue / K. Hayashi // Anal. Biochem. - 1975. - V. 67. - P. 503-506.

77. Pinkart, H.C. Phospholipid biosynthesis and solvent tolerance in Pseudomonas putida strains / H.C. Pinkart, D.C. White // J. Bacteriol. - 1997. - V. 179, N. 13. - P. 4219-4226.

78. O'Leary, W.M. The fatty acids of bacteria / W.M. O'Leary // Bacteriol. Rev. - 1962. - V. 26, N. 4. - P. 421-447.

79. Syakti, A.D. Influence of growth phase on the phospholipidic fatty acid composition of two marine bacterial strains in pure and mixed cultures / A.D. Syakti, N. Mazzella, F. Torre, M. Acquaviva, M. Gilewicz, M. Guiliano, J.-C. Bertrand, P. Doumenq // Res. Microbiol. - 2006. - V. 157, N. 5. - P. 479-486.

80. Shishlyannikov, S.M. Fatty acid trophic markers in Lake Baikal phytoplankton: A comparison of endemic and cosmopolitan diatom-dominated phytoplankton assemblages / S.M. Shishlyannikov, A.A. Nikonova, Y.S. Bukin, A.G. Gorshkov // Ecol. Indic. - 2018. - V. 85. - P. 878-886.

81. Methods in membrane lipids / ed. A.M. Dopico - Berlin: Springer, 2007. - 621 p.

82. Reviews in fluorescence / ed. C.D. Geddes - Berlin: Springer, 2007. - 400 p.

83. Owen, D.M. Imaging lipid domains in cell membranes: the advent of superresolution fluorescence microscopy / D.M. Owen, K. Gaus // Front. Plant Sci. - 2013. -V. 4. - 503.

84. Kitamura, S. staining method of poly(3-hydroxyalkanoic acids) producing bacteria by nile blue / S. Kitamura, Y. Doi // Biotechnol. Tech. - 1994. - V. 8., N. 5. - P. 345350.

85. Canovas, V. Analysis of polyhydroxyalkanoates granules in haloferax mediterranei by double-fluorescence staining with nile red and SYBR green by confocal fluorescence

microscopy / V. Canovas, S. Garcia-Chumillas, F. Monzo, L. Simo-Cabrera, C. Fernandez-Ayuso, C. Pire, R.M. Martinez-Espinosa // Polymers. - 2021. - V. 13, N. 10. - 1582.

86. Mravec, F. Accumulation of PHA granules in Cupriavidus necator as seen by confocal fluorescence microscopy / F. Mravec, S. Obruca, V. Krzyzanek, P. Sedlacek, K. Hrubanova, O. Samek, D. Kucera, P. Benesova, J. Nebesarova // FEMS Microbiol. Lett. - 2016. - V. 363, N. 10. - fnw094.

87. Aneesh, B.P. Evaluation of short-chain-length polyhydroxyalkanoate accumulation in Bacillus aryabhattai / B.P. Aneesh, J.K. Arjun, T. Kavitha, K. Harikrishnan // Braz. J. Microbiol. - 2017. - V. 48, N. 3. - P. 451-460.

88. Maheshwari, N. Production, process optimization and molecular characterization of polyhydroxyalkanoate (PHA) by CO2 sequestering B. cereus SS105 / N. Maheshwari, M. Kumar, I.S. Thakur, S. Srivastava // Bioresour. Technol. - 2018. - V. 254. - P. 7582.

89. Gomes, C.J. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy / C.J. Gomes, M.W. Harman, S.M. Centuori, C.W. Wolgemuth, J.D. Martinez // Cell Div. -2018. - V. 13. - 6.

90. Kensche, A. Fluorescence microscopic visualization of non-cellular components during initial bioadhesion in situ / A. Kensche, S. Basche, W.H. Bowen, M. Hannig, C. Hannig // Arch. Oral Biol. - 2013. - V. 58, N. 10. - P. 1271-1281.

91. Suzuki, T. DNA Staining for fluorescence and laser confocal microscopy / T. Suzuki, K. Fujikura, T. Higashiyama, K. Takata // J. Histochem. Cytochem. - 1997. -V. 45, N. 1. - P. 49-53.

92. Damas-Souza, D.M. An improved acridine orange staining of DNA/RNA / D.M. Damas-Souza, R. Nunes, H.F. Carvalho // Acta Histochem. - 2019. - V. 121, N. 7. - P. 450-454.

93. Name, N. Acridine orange staining reaction as an index of physiological activity in Escherichia coli / G.A. McFeters, A. Singh, S. Byun, P.R. Callis, S. Williams // J. Microbiol. Methods. - 1991. - V. 13, N. 2. - P. 87-97.

94. Braunegg, G. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects / G. Braunegg, G. Lefebvre, K.F. Genser // J. Biotechnol. - 1998. - V. 65, N. 2-3. - P. 127-161.

95. Sabapathy, P.C. Recent developments in polyhydroxyalkanoates (PHAs) production in the past decade - A review / P.C. Sabapathy, S. Devaraj, K. Meixner, P. Anburajan, P. Kathirvel, Y. Ravikumar, H.M. Zabed, X. Qi // Bioresour. Technol. - 2020. - V. 306. - 123132.

96. Name, N. Title / H. Moralejo-Garate, R. Kleerebezem, A. Mosquera-Corral, M.C.M. van Loosdrecht // Water Res. - 2013. - V. 47, N. 3. - P. 1209-1217.

97. Jiang, G. Carbon sources for polyhydroxyalkanoates and an integrated biorefinery /

G. Jiang, D.J. Hill, M. Kowalczuk, B. Johnston, G. Adamus, V. Irorere, I. Radecka // Int. J. Mol. Sci. - 2016. - V. 17, N. 7. - 1157.

98. Choi, T.-R. Fructose-based production of short-chain-length and medium-chain-length polyhydroxyalkanoate copolymer by arctic Pseudomonas sp. B14-6 / T.-R. Choi, Y.-L. Park, H.-S. Song, S.M. Lee, S.L. Park, H.S. Lee, H.-J. Kim, S.K. Bhatia, R. Gurav, K.-Y. Choi, Y.K. Lee, Y.-H. Yang // Polymers. - 2021. - V. 13, N. 9. - 1398.

99. Kato, M. Production of a novel copolyester of 3-hydroxybutyric acid and medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids by Pseudomonas sp. 61-3 from sugars / M. Kato,

H.J. Bao, C.-K. Kang, T. Fukui, Y. Doi // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1996. - V. 45, N. 3. - P. 363-370.

100. Wang, Q. Monitoring differences in gene expression levels and polyhydroxyalkanoate (PHA) production in Pseudomonas putida KT2440 grown on different carbon sources / Q. Wang, C.T. Nomura // J. Biosci. Bioeng. - 2010. - V. 110, N. 6. - P. 653-659.

101. Phukon, P. Biosynthesis and characterization of a new copolymer, poly(3-hydroxyvalerate-co-5-hydroxydecenoate), from Pseudomonas aeruginosa / P. Phukon, B. Pokhrel, B.K. Konwar, S.K. Dolui // Biotechnol. Lett. - 2013. - V. 35, N. 4. - P. 607-611.

102. Palmonari, A. Short communication: Characterization of molasses chemical composition / A. Palmonari, D. Cavallini, C.J. Sniffen, L. Fernandes, P. Holder, L.

Fagioli, I. Fusaro, G. Biagi, A. Formigoni, L. Mammi // J. Dairy Sci. - 2020. - V. 103, N. 7. - P. 6244-6249.

103. Jiang, Y. High poly(ß-hydroxybutyrate) production by Pseudomonas fluorescens A2a5 from inexpensive substrates / Y. Jiang, X. Song, L. Gong, P. Li, C. Dai, W. Shao // Enzyme Microb. Technol. - 2008. - V. 42, N. 2. - P. 167-172.

104. Tripathi, A.D. Utilizing of sugar refinery waste (cane molasses) for production of bio-plastic under submerged fermentation process / A.D. Tripathi, A. Yadav, A. Jha, S. K. Srivastava // J Polym. Environ. - 2012. - V. 20, N.2. - P. 446-453.

105. Koller, M. Polyhydroxyalkanoate production from whey by Pseudomonas hydrogenovora / M. Koller, R. Bona, E. Chiellini, E.G. Fernandes, P. Horvat, C. Kutschera, P. Hesse, G. Braunegg // Bioresour. Technol. - 2008. - V. 99. - P. 48544863.

106. Li, R. Psychrotrophic Pseudomonas mandelii CBS-1 produces high levels of poly-ß-hydroxybutyrate / R. Li, Y. Jiang, X. Wang, J. Yang, Y. Gao, X. Zi, X. Zhang, H. Gao, N. Hu // SpringerPlus. - 2013. - V. 2, N. 1. - 335.

107. Sun, Z. Fermentation process development for the production of medium-chain-length poly-3-hyroxyalkanoates / Z. Sun, J.A. Ramsay, M. Guay, B.A. Ramsay // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - V. 75, N. 3. - P. 475-485.

108. Guo, J. Conversion of waste frying palm oil into biodiesel using free lipase A from Candida antarctica as a novel catalyst / J. Guo, S. Sun, J. Liu // Fuel. - 2020. - V. 267. -117323.

109. Zhou, J. High Di-rhamnolipid production using Pseudomonas aeruginosa KT1115, separation of mono/di-rhamnolipids, and evaluation of their properties / J. Zhou, R. Xue, S. Liu, N. Xu, F. Xin, W. Zhang, M. Jiang, W. Dong // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2019. - V. 7. - 245.

110. Tanikkul, P. Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates (mcl-PHAs) from palm oil / P. Tanikkul, G.L. Sullivan, S. Sarp, N. Pisutpaisal // CSCEE. -2020. - V. 2. - 100045.

111. Abid, S. Production kinetics of polyhydroxyalkanoates by using Pseudomonas aeruginosa gamma ray mutant strain EBN-8 cultured on soybean oil / S. Abid, Z.A. Raza, T. Hussain // 3 Biotech. - 2016. - V. 6, N. 2. - 142.

112. Mahato, R.P. Optimization of growth conditions to produce sustainable polyhydroxyalkanoate bioplastic by Pseudomonas aeruginosa EO1 / R.P. Mahato, S. Kumar, P. Singh // Front. Microbiol. - 2021. - V. 12. - 711588.

113. Cromwick, A.M. The microbial production of poly(hydroxyalkanoates) from tallow / A.-M. Cromwick, T. Foglia, R.W. Lenz // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1996. - V. 46, N. 5-6. - P. 464-469.

114. Simon-Colin, C. A novel mcl-PHA produced on coprah oil by Pseudomonas guezennei biovar. tikehau, isolated from a "kopara" mat of French Polynesia / C. Simon-Colina, G. Raguenes, P. Crassous, X. Moppert, J. Guezennec // Int. J. Biol. Macromol. - 2008. - V. 43, N. 2. - P. 176-181.

115. Song, J.H. Polyhydroxyalkanoate (PHA) production using waste vegetable oil by Pseudomonas sp. strain DR2 / J.H. Song, C.O. Jeon, M.H. Choi, S.C. Yoon, W. Park // J. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - V. 18, N. 8. - P. 1408-1415.

116. Chen, Y.J. Production and characterization of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas mosselii TO7 / Y.-J. Chen, Y.-C. Huang, C.Y. Lee // Journal. - 2014. - V. 118, N. 2 - P. 145-152.

117. Impallomeni, G. Synthesis and characterization of poly(3-hydroxyalkanoates) from Brassica carinata oil with high content of erucic acid and from very long chain fatty acids / G. Impallomeni, A. Ballistreri, G. M. Carnemolla, S.P.P. Guglielmino, M.S. Nicolo, M.G. Cambria // Int. J. Biol. Macromol. - 2011. - V. 48, N. 1. - P. 137-145.

118. Liu, Q. Biosynthesis of poly(3-hydroxydecanoate) and 3-hydroxydodecanoate dominating polyhydroxyalkanoates by ß-oxidation pathway inhibited Pseudomonas putida / Q. Liu, G. Luo, X.R. Zhou, G.-Q. Chen // Metab. Eng. - 2011. - V. 13, N. 1. -P. 11-17.

119. Wang, H.-H. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate homopolymers by Pseudomonas putida / H.-H. Wang, X.-R. Zhou, Q. Liu, G.-Q. Chen // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - V. 89, N. 5. - P. 1497-1507.

120. Chanasit, W. Efficient production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from Pseudomonas mendocina PSU using a biodiesel liquid waste (BLW) as the sole carbon source / W. Chanasit, B. Hodgson, K. Sudesh, K. Umsakul // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2016. - V. 80, N. 7. - P. 1440-1450.

121. Ashby, R.D. Efficient utilization of crude glycerol as fermentation substrate in the synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers / R.D. Ashby, D.K.Y. Solaiman, G.D. Strahan // J. Am. Oil. Chem. Soc. - 2011. - V. 88, N. 7. - P. 949-959.

122. Szacherska, K. Volatile fatty acids as carbon sources for polyhydroxyalkanoates production / K. Szacherska, P. Oleskowicz-Popiel, S. Ciesielski, J. Mozejko-Ciesielska // Polymers. - 2021. - V. 13. - 321.

123. Yang, S. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoate from acetate by engineered Pseudomonas putida KT2440 / S. Yang, S. Li, X. Jia // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2019. - V. 46, N. 6. - P. 793-800.

124. Marang, L. Combining the enrichment and accumulation step in non-axenic PHA production: Cultivation of Plasticicumulans acidivorans at high volume exchange ratios / L. Marang, M.C.M. van Loosdrecht, R. Kleerebezem // J. Biotechnol. - 2016. - V. 231. - P. 260-267.

125. Cerrone, F. Medium chain length polyhydroxyalkanoate (mcl-PHA) production from volatile fatty acids derived from the anaerobic digestion of grass / F. Cerrone, S.K. Choudhari, R. Davis, D. Cysneiros, V. O'Flaherty, G. Duane, E. Casey, M.W. Guzik, S.T. Kenny, R.P. Babu, K. O'Connor // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2014. - V. 98, N. 2. - P. 611-620.

126. Satoh, Y. Isolation of a thermotolerant bacterium producing medium-chain-length polyhydroxyalkanoate / Y. Satoh, K. Tajima, S. Nakamoto, H. Xuerong, T. Matsushima, T. Ohshima, S. Kawano, T. Erata, T. Dairi, M. Munekata // J. Appl. Microbiol. - 2011. - V. 111, N. 4. - P. 811-817.

127. Lageveen, R.G. Formation of polyesters by pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and composition of poly-(R)-3- hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates / R.G. Lageveen, G.W. Huisman, H. Preusting, P. Ketelaar, G. Eggink, B. Witholt // Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - V. 54, N. 12. - P. 2924-2932.

128. Goudarztalejerdi, A. Evaluation of bioremediation potential and biopolymer production of pseudomonads isolated from petroleum hydrocarbon-contaminated areas / A. Goudarztalejerdi, M. Tabatabaei, M.H. Eskandari, D. Mowla, A. Iraji // Int. J. Environ. Sci. Technol. - 2015. - V. 12, N. 9. - P. 2801-2808.

129. Chayabutra, C. Polyhydroxyalkanoic acids and rhamnolipids are synthesized sequentially in hexadecane fermentation by Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 / C. Chayabutra, L.-K. Ju // Biotechnol. Prog. - 2001. - V. 17, N. 3. - P. 419-423.

130. Narancic, T. Medium-chain-length polyhydroxyalkanoate production by newly isolated Pseudomonas sp. TN301 from a wide range of polyaromatic and monoaromatic hydrocarbons / T. Narancic, S.T. Kenny, L. Djokic, B. Vasiljevic, K.E. O'Connor, J. Nikodinovic-Runic // J. Appl. Microbiol. - 2012. - V. 113, N. 3. - P. 508-520.

131. Ni, Y.-Y. Biosynthesis of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates) by volatile aromatic hydrocarbons-degrading Pseudomonas fulva TY16 / Y.-Y. Ni, Do Y. Kim, M.G. Chung, S.H. Lee, H.-Y. Park, Y.H. Rhee // Bioresour. Technol. - 2010. - V. 101, N. 21. - P. 8485-8488.

132. Kumar, M. Lignin valorization by bacterial genus Pseudomonas: State-of-the-art review and prospects / M. Kumar, S. You, J. Beiyuan, D.C.W. Tsang, G. Luo, J. Gupta, S. Kumar, L. Singh, S. Zhang // Bioresour. Technol. - 2021. - V. 320, Part B. - 124412.

133. Mannina, G. Recovery of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from wastewater: A review / G. Mannina, D. Presti, G. Montiel-Jarillo, J. Carrera, M.E. Suarez-Ojeda // Bioresour. Technol. - 2020. - V. 297. - 122478.

134. Saranya, V. Effect of nitrogen and calcium sources on growth and production of PHA of Pseudomonas sp. LDC-5 and its mutant / V. Saranya, R. Shenbagarathai // Curr. Res. J. Biol. Sci. - 2010. - V. 2, N. 3. - P. 164-167.

135. Kourmentza, C. Production of PHAs from mixed and pure cultures of Pseudomonas sp. using short-chain fatty acids as carbon source under nitrogen limitation / C. Kourmentza, I. Ntaikou, M. Kornaros, G. Lyberatos // Desalination. -2009. - V. 248, N. 1-3. - P. 723-732.

136. Xu, Z. Kinetic understanding of nitrogen supply condition on biosynthesis of polyhydroxyalkanoate from benzoate by Pseudomonas putida KT2440 / Z. Xu, X. Li,

N. Hao, C. Pan, L. de la Torre, A. Ahamed, J.H. Miller, A.J. Ragauskas, J. Yuan, B. Yang // Bioresour. Technol. - 2019. - V. 273. - P. 538-544.

137. Mozejko-Ciesielska, J. Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates synthesis by Pseudomonas putida KT2440 relA/spoT mutant: bioprocess characterization and transcriptome analysis / J. Mozejko-Ciesielska, D. Dabrowska, A. Szalewska-Palasz, S. Ciesielski // AMB Express. - 2017. - V. 7. - 92.

138. Ciesielski, S. The influence of nitrogen limitation on mcl-PHA synthesis by two newly isolated strains of Pseudomonas sp. / S. Ciesielski, J. Mozejko, G. Przybylek // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V. 37, N. 5. - P. 511-520.

139. Lee, S.Y. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by high-cell-density cultivation of Pseudomonas putida under phosphorus limitation / S.Y. Lee, H.H. Wong, J.-I. Choi, S.H. Lee, S.C. Lee, C.S. Han // Biotechnol. Bioeng. - 1999. - V. 68, N. 4. - P. 466-470.

140. Reddy, M.V. Effect of substrate load and nutrients concentration on the polyhydroxyalkanoates (PHA) production using mixed consortia through wastewater treatment / M.V. Reddy, S.V. Mohan // Bioresour. Technol. - 2012. - V. 114. - P. 573582.

141. Tu, W. Polyhydroxyalkanoates (PHA) production from fermented thermalhydrolyzed sludge by mixed microbial cultures: The link between phosphorus and PHA yields / W. Tu, D. Zhang, H. Wang // Waste Manage. - 2019. - V. 96. - P. 149-157.

142. Wen, Q. Effects of phosphorus and nitrogen limitation on PHA production in activated sludge / Q. Wen, Z. Chen, T. Tian, W. Chen // Res. J. Environ. Sci. - 2010. -V. 22, N. 10. - P. 1602-1607.

143. Blunt, W. Microaerophilic environments improve the productivity of medium chain length polyhydroxyalkanoate biosynthesis from fatty acids in Pseudomonas putida LS46 / W. Blunt, C. Dartiailh, R. Sparling, D. Gapes, D. Levin, N. Cicek // Process Biochem. - 2017. - V. 59, Part A. - P. 18-25.

144. Wang, X. Application of dissolved oxygen (DO) level control for polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulation with concurrent nitrification in surplus

municipal activated sludge / X. Wang, S. Bengtsson, A. Oehmen, G. Carvalho, A. Werker, M.A.M. Reis // N. Biotechnol. - 2019. - V. 50. - P. 37-43.

145. Li, Y. Optimization of medium-chain-length polyhydroxyalkanoate production by Pseudomonas putida KT2440 from co-metabolism of glycerol and octanoate / Y. Li, S. Yang, D. Jin, X. Jia // Can. J. Chem. Eng. - 2021. - V. 99, N. 3. - P. 657-666.

146. Allen, A.D. Biosynthesis and characterization of copolymer poly(3HB-co-3HV) from saponified Jatropha curcas oil by Pseudomonas oleovorans / A.D. Allen, W.A. Anderson, F.O. Ayorinde, B.E. Eribo // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V. 37, N. 8. - P. 849-856.

147. Sun, Z. Increasing the yield of MCL-PHA from nonanoic acid by co-feeding glucose during the PHA accumulation stage in two-stage fed-batch fermentations of Pseudomonas putida KT2440 / Z. Sun, J.A. Ramsay, M. Guay, B. Ramsay // J. Biotechnol. - 2006. - V. 132, N. 3. - P. 280-282.

148. Preusting, H. Continuous production of poly(3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas oleovorans in a high-ceil-density, two-liquid-phase chemostat / H. Preusting, W. Hazenberg, B. Witholt // Enzyme Microb. Technol. - 1993. - V. 15, N. 4. - P. 311-316.

149. Gamal, R.F. Semi-scale production of PHAs from waste frying oil by Pseudomonas fluorescens S48 / R.F. Gamal, H.M. Abdelhady, T.A. Khodair, T.S. El-Tayeb, E.A. Hassan, K.A. Aboutaleb // Braz. J. Microbiol. - 2013. - V. 44, N. 2. - P. 539-549.

150. Le Meur, S. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by sequential feeding of xylose and octanoic acid in engineered Pseudomonas putida KT2440 / S. Le Meur, M. Zinn, T. Egli, L. Thony-Meyer, Q. Ren // BMC Biotechnol. -2012. - V. 12. - 53.

151. Durner, R. Accumulation of poly(r)-3-hydroxyalkanoates. in Pseudomonas oleovorans during growth with octanoate in continuous culture at different dilution rates / R. Durner, B. Witholt, T. Egli // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - V. 66, N. 8. - P. 3408-3414.

152. Zinn, M. Growth and accumulation dynamics of poly(3-hydroxyalkanoate) (PHA) in Pseudomonas putida GPo1 cultivated in continuous culture under transient feed conditions / M. Zinn, R. Durner, H. Zinn, Q. Ren, T. Egli, B. Witholt // Biotechnol. J. -2011. - V. 6, N. 10. - P. 1240-1252.

153. Sharma, P.K. Synthesis of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from vegetable oils and free fatty acids by wild-type and mutant strains of Pseudomonas chlororaphis / P.K. Sharma, R.I. Munir, T. de Kievit, D.B Levin // Can. J. Microbiol. - 2017. - V. 63, N. 12. - P. 1009-1024.

154. Tan, D. Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01 / D. Tan, Y.-S. Xue, G. Aibaidula, G.-Q. Chen // Bioresour. Technol. - 2011. - V. 102, N. 17. - P. 8130-8136.

155. Cavaille, L. Understanding of polyhydroxybutyrate production under carbon and phosphorus-limited growth conditions in non-axenic continuous culture / L. Cavaille, M. Albuquerque, E. Grousseau, A.-S. Lepeuple, J.-L. Uribelarrea, G. Hernandez-Raquet, E. Paul // Bioresour. Technol. - 2016. - V. 201. - P. 65-73.

156. Munir, S. Polyhydroxyalkanoate (PHA) production in open mixed cultures using waste activated sludge as biomass / S. Munir, N. Jamil // Arch. Microbiol. - 2020. - V. 202, N. 7. - P. 1907-1913.

157. Ojhaa, N. A Statistical approach to optimize the production of polyhydroxyalkanoates from Wickerhamomyces anomalus VIT-NN01 using response surface methodology / N. Ojhaa, N. Das // Int. J. Biol. Macromol. - 2018. - V. 107, Part B. - P. 2157-2170.

158. Pokoj, T. Interactive effect of crude glycerin concentration and C:N ratio on polyhydroxyalkanoates accumulation by mixed microbial cultures modelled with response surface methodology / T. Pokoj, E. Klimiuk, S. Ciesielski // Water Res. -2019. - V. 156. - P. 434-444.

159. Priyanka, K. Polyhydroxyalkanoate biosynthesis and characterization from optimized medium utilizing distillery effluent using Bacillus endophyticus MTCC 9021: a statistical approach / K. Priyanka, M. Umesh, B. Thazeem, K. Preethi // Biocatal. Biotransformation - 2020. - V. 39, N. 1. - P. 16-28.

160. Zain, N.F.M. Response surface methodology optimization of polyhydroxyalkanoate (PHA) production by Burkholderia cepacia BPT1213 using waste glycerol from palm oil-based biodiesel production / N.F.M. Zain, M. Paramasivam, J.S. Tan, V. Lim, C.K. Lee // Biotechnol. Prog. - 2021. - V. 37, N. 1. -e3077.

161. Rajendran, D. Response surface methodology: optimisation of antifungal bioemulsifier from novel Bacillus thuringiensis / D. Rajendran, P. Venkatachalam, J. Ramakrishnan // Sci. World J. - 2014. - V. 2014. - 423289.

162. Xu, Z. Enhancement of polyhydroxyalkanoate production by co-feeding lignin derivatives with glycerol in Pseudomonas putida KT2440 / Z. Xu, C. Pan, X. Li, N. Hao, T. Zhang, M.J. Gafrey, Y. Pu, J.R. Cort, A.J. Ragauskas, W.-J. Qian, B. Yang // Biotechnol. Biofuels. - 2021. - V. 14. - 11.

163. Pagliano, G. Recovery of polyhydroxyalkanoates from single and mixed microbial cultures: A review / G. Pagliano, P. Galletti, C. Samori, A. Zaghini, C. Torri // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2021. - V. 9. - P. 624021.

164. Koller, M. Strategies for recovery and purification of poly(R)-3-hydroxyalkanoates. (PHA) biopolyesters from surrounding biomass / M. Koller, H. Niebelschutz, G. Braunegg // Eng. Life Sci. - 2013. - V. 13, N. 6. - P. 549-562.

165. Jiang, X. Acetone extraction of mcl-PHA from Pseudomonas putida KT2440 / X. Jiang, J.A. Ramsay, B.A. Ramsay // J. Microbiol. Methods. - 2006. - V. 67, N. 2. - P. 212-219.

166. Wampfler, B. Isolation and purification of medium chain length poly(3-hydroxyalkanoates) (mcl-PHA) for medical applications using nonchlorinated solvents / B. Wampfler, T. Ramsauer, S. Rezzonico, R. Hischier, R. Kohling, L. Thony-Meyer, M. Zinn // Biomacromolecules. - 2010. - V. 11, N. 10. - P. 2716-2723.

167. Burniol-Figols, A. Polyhydroxyalkanoate (PHA) purification through dilute aqueous ammonia digestion at elevated temperatures / A. Burniol-Figols, I.V. Skiadas, A.E. Daugaard, H.N. Gavala // J. Chem. Technol. Biotechnol. - 2020. - V. 95, N. 5. -P. 1519-1532.

168. Saavedra del Oso, M. Evaluation and optimization of the environmental performance of PHA downstream processing / M. Saavedra del Oso, M. Mauricio-Iglesias, A. Hospido // Chem. Eng. J. - 2021. - V. 412. - P. 127687.

169. Colombo, B. Recovering PHAs from mixed microbial biomass: using non-ionic surfactants as a pretreatment step / B. Colombo, J. Pereira, M. Martins, M.A. TorresAcosta, A.C.R.V. Dias, P.C. Lemos, S.P.M. Ventura, G. Eisele, A. Alekseeva, F. Adani, L.S. Serafim// Sep. Purif. Technol. - 2020. - V. 253. - 117521.

170. De Souza Reis, G.A. Optimization of green extraction and purification of PHA produced by mixed microbial cultures from sludge / G.A. De Souza Reis, M.H.A. Michels, G.L. Fajardo, I. Lamot, J.H. De Best // Water. - 2020. - V. 12, N. 4. - 1185.

171. Helisto, P. Effects of detergents on activity of microbial lipases as measured by the nitrophenyl alkanoate esters method / P. Helisto, T. Korpela // Enzyme Microb. Technol. - 1998. - V. 23, N. 1-2. - P. 113-117.

172. Statistical Methods in Analytical Chemistry / ed. P.C. Meier, R.E. Zund - Berlin: Springer, 2005. - 456 p.

173. R: A language and environment for statistical computing Электронный ресурс. // R Foundation for Statistical Computing. URL : https://www.R-project.org/ (дата обращения: 8.12.21)

174. Rebocho, A.T. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas citronellolis grown in apple pulp waste / A.T. Rebocho, J.R. Pereira, F. Freitas, L.A. Neves, V.D. Alves, C. Sevrin, C. Grandfils, M.A.M. Reis // Appl. Food Biotechnol. - 2019. - V. 6, N. 1. - P. 71-82.

175. Greenspan, P. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red / P. Greenspan, S.D. Fowler // Journal. - 1985. - V. 26, N. 7. - P. 781-789.

176. Pseudomonas / ed. T.C. Montie - Berlin: Springer, 1998. - 335 p.

177. Poblete-Castro, I. Biochemistry, genetics and biotechnology of glycerol utilization in Pseudomonas species / I. Poblete-Castro, C. Wittmann, P.I. Nike // Microb. Biotechnol. - 2020. - V. 13, N. 1. - P. 32-53.

178. Schlusselhuber, M. Characterization of milkisin, a novel lipopeptide with antimicrobial properties produced by Pseudomonas sp. UCMA 17988 isolated from

bovine raw milk / M. Schlusselhuber, J. Godard, M. Sebban, B. Bernay, D. Garon, V. Seguin, H. Oulyadi, N Desmasures // Front. Microbiol. - 2018. - V. 9. - 1030.

Таблица А. Анализ результатов определения стеариновой кислоты С[18: 0] в нескольких образцах биомассы. Построение доверительного интервала

Группа образцов Результаты анализа (% от сухой массы клеток) Дисперсия среднего результата

1 2 3 Среднее

1 4,29 4,00 4,60 4,30 0,0903

2 8,15 7,98 8,48 8,20 0,0649

3 25,87 25,23 26,29 25,80 0,2850

4 2,41 2,59 2,52 2,51 0,0077

5 3,42 3,42 3,14 3,33 0,0249

0 285 ^тах — £п52 — 04728 — 0,6027< ^ (0,05;5;2) — 0,68 Стах < С(0 05;5;2) - дисперсии можно усреднить 51 — 0,0946 ^ ЛС — Г(0,05;2) х — 2,1514 х ~ °,1

Исходный код программы для расчета коэффициентов уравнения множественной

нелинейной регрессии и оценки их значимости

library(tidyverse)

library(caret)

library(readxl)

PHA <- read_excel("exp_data.xls", sheet = "List", col_names = TRUE, na = "NA") #Quadratic model with an interaction

QIA <- lm(yeild ~ C + C_N + I(CA2) + I(C_NA2) + C*C_N, data = PHA)

summary(QIA)

anova(QIA)

#Quadratic additive model

QA <- lm(yeild ~ C + C_N + I(CA2) + I(C_NA2), data = PHA)

summary(QA)

anova(QA)

#Quadratic model without an intercept, but with an interaction

QI <- lm(yeild ~ 0 + C + C_N + I(CA2) + I(C_NA2) + C*C_N, data = PHA)

summary(QI)

anova(QI)

#Quadratic additive model without an intercept

Q <- lm(yeild ~ 0 + C + C_N + I(CA2) + I(C_NA2), data = PHA)

summary(Q)

anova(Q)

Таблица В. Характеристики полиномиальных моделей, описывающих зависимость степени конверсии глицерина в ПГА ^рна) от концентрации глицерина (С, г/л) и отношения концентраций глицерина и источника азота (С/Ы).

р - уровень значимости. Коэффициенты с р > 0,05 выделены полужирным

Коэффициент | Стандартное отклонение Означение р

Чрна = + ас^С + ас/м • С/И + аС2 • С2 + ас/ы2 • {С/И)2 + ас<ст • С • (С/К)

Свободный член 0,369 0,837 -0,44 0,689

С 0,389 0,108 3,62 0,036

еж 0,830 0,109 7,71 0,005

С2 -0,0237 0,005 -4,83 0,017

(С/Ы)2 -0,0314 0,005 -6,38 0,008

C•(C/N) 0,0018 0,004 0,43 0,696

Б 75,7

Бтабл(3; 4; 0,05) 6,59

Скорректированный Я2 0,56

Чрна = ^ + ас • С + аС/к • С/И + аС2 • С2 + ас/м2 • (С/И)2

Свободный член -0,549 0,647 -0,85 0,444

С 0,407 0,088 4,60 0,010

еж 0,848 0,088 9,58 0,001

С2 -0,024 0,004 -5,42 0,006

(С/Ы)2 -0,031 0,004 -7,16 0,002

Б 1,25

Бтабл(4; 4; 0,05) 6,39

Скорректированный Я2 0,99

Чрна = ас • С + аС/и • С/И + ас2 • С2 + ас/м2 • {С/И)2 + ас<с/т • С • (С/Ы)

С 0,347 0,042 8,20 0,001

С/К 0,788 0,042 18,6 <0,001

С2 - 0,022 0,029 -7,57 0,002

(С/Ы)2 - 0,030 0,029 -10,2 0,001

C•(C/N) 0,003 0,003 0,84 0,448

Б 1,27

Бтабл(4; 4; 0,05) 6,39

Скорректированный Я2 0,99

Чрна = ас • С + ас/ы • С/И + ас2 • С2 + ас/м2 • {С/И)2

С 0,341 0,040 8,42 <0,001

С/К 0,781 0,040 19,3 <0,001

С2 -0,021 0,002 -9,50 <0,001

(С/Ы)2 -0,028 0,002 -13,0 <0,001

Б 2,16

Бтабл(5; 4; 0,05) 6,26

Скорректированный Я2 0,99

Рисунок Г. Справка о депонировании P. helmanticensis P1

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» __(ФГБНУ ВНИИСХМ)

196608 Санкт-Петербург, Пушкин,

шоссе Подбельского, 3 Выдано во ВНИИПД

Телефон [phone]

о депонировании культуры микроорганизмов в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства

(RCAM)

1. Депозитор: Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М.Горбатова» РАН (ВНИИЛД), 191014, Санкт-Петербург, Литейный пр., д. 55.

2. Авторы: Зубков И.Н., Непомнящий А.П., Шишлянников С.М., Шарова

3. Штамм Pseudomonas helmanticensis PI является продуцентом поли-3-гидроксиалканоатов, устойчивым к додецилсульфату натрия.

4. Штамм Pseudomonas helmanticensis PI депонирован с целью проведения патентной процедуры 24 августа 2022 г. под регистрационным номером RCAM05967.

5. Адрес коллекции: 196608, Санкт - Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3, ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии;

тел. [phone], факс [phone] e-mail: [e-mail], сайт: http://www.arriam.ru/

на №

СПРАВКА

н.ю.

д.б.н.

Директор института,

В.И. Сафронова

Рисунок Д. Акт о внедрении результатов диссертационной работы

Настоящий акт составлен о том, что результаты диссертационной работы «Детергент-устойчивый штамм Pseudomonas helmanticensis PI как продуцент полигидроксиалканоата», представленной на соискание ученой степени кандидата технических наук, использованы в работе федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа имени A.A. Смородинцева» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИ гриппа им. A.A. Смородинцева» Минздрава России) при разработке средств доставки лекарственных препаратов на основе наночастиц полигидроксиалканоата.

Использование полученных наночастиц позволяет повысить эффективность трансфекции и устойчивость лекарственных препаратов к действию ферментов.

Результаты внедрялись при выполнении научно-исследовательской работы по государственному заданию «Исследование противовирусного потенциала препарата на основе мРНК, кодирующих антитела к нуклеопротеину вируса гриппа» (регистрационный номер в ЕГИСУ НИОКТР №121052400146-0).

Заведующий отделом молекулярной биологии вирусов, заведующий лабораторией системной вирусологии ФГБУ «НИИ гриппа им. A.A. Смородинцева»

УТВЕРЖДАЮ Директор федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева»

АКТ

о внедрении результатов кандидатской диссертационной работы Зубкова Ильи Николаевича

Минздрава России, д-р биол. наук, профессор РАН

«jj» .у_2023 гоДа