Интеграция процессов культивирования микроводоросли Chlorella vulgaris на муниципальных сточных водах и биосинтеза молочной кислоты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Маркин Илья Владимирович

• Маркин Илья Владимирович
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Маркин Илья Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….………………

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

СТОЧНЫХ ВОД………………………………....….….….….….….….….….…

1.1 Микроводоросли – перспективный возобновляемый источник биомассы……

1.2 Морфологические и биохимические особенности микроводорослей Chlorella

vulgaris….………………………………………………………………………...…..…

1.3 Обзор технологий очистки сточных вод с применением микроводорослей…

1.4 Аппаратурно-технологическое оформление процессов культивирования и

переработки микроводорослей……………………………………………………..…

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ…

2.1 Молочная кислота как сырье для производства биополимеров…………………

2.2 Морфологические и биохимические особенности молочнокислых бактерий Bacillus

coagulans……………………………………………………………………………......…

2.3 Сырье для микробиологического синтеза молочной кислоты………………..…

2.4 Обзор технологий биосинтеза молочной кислоты………………………………

2.5 Аппаратурно-технологическое оформление микробиологического синтеза

молочной кислоты………………………………………………………………………

2.6 Задачи диссертационной работы………………………………………….……

ГЛАВА 3. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ……………………….………………

3.1 Экспериментальные методы анализа сточных вод……………………………..…

3.2 Подсчет клеток………………………………………………………………...……

3.3 Разделение клеток и культуральной жидкости………………………………….…

3.4 Экстракция внеклеточных метаболитов …………………………………………

3.5 Анализ экзометаболитов методом тонкослойной хроматографии……………

3.6 Определение чувствительности микроорганизмов к экзометаболитам

микроводорослей………………………………..………………………………………

3.7 Количественное определение глюкозы и лактата………………………………

3.8 Выделение молочной кислоты из культуральной жидкости……………………

3.9 Фотобиореактор…………………………..………………………………………

3.10 Материалы………………………………………………………………….………

3

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

СТОЧНЫХ ВОД …...……………………………………………………………

4.1 Исследование процесса культивирования микроводорослей на сточных

водах……………………………………………………………………………………

4.2 Сравнение эффективности очистки сточных вод активным илом и

микроводорослями………………………………………………………………………

4.3 Влияние условий культивирования клеток микроводорослей на процесс

очистки сточных вод ……………………………………………………………………

4.4 Исследование экзометаболитов микроводорослей……………………………

4.5 Математическое моделирование кинетики процесса культивирования

микроводорослей на сточных водах……………………………………………………

ГЛАВА 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТОЧНЫХ ВОД……………………………………

5.1 Исследование процесса культивирования молочнокислых бактерий на

очищенных сточных водах……………………….….…….…….…….…….…….……

5.2 Математическое моделирование процесса культивирования молочнокислых

бактерий на очищенных сточных водах……………………………………………...…

ГЛАВА 6. АППАРАТУРНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ОФОРМЛЕНИЕ

ИНТЕГРИРОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНОЙ

КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТОЧНЫХ ВОД, ОЧИЩЕННЫХ

МИКРОВОДОРОСЛЯМИ………………………………

6.1 Разработка схемы интегрированного производства молочной кислоты с

использованием сточных вод……………………………………………………...……

6.2 Материальный баланс производства…………………………………………….…

6.3 Подбор и расчёт технологического оборудования для производства молочной

кислоты. Практические рекомендации по проектированию интегрированного

производства молочной кислоты………………………………………………………

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ.….………………………………

ПРИЛОЖЕНИЕ А. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ…………………...………………

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. АКТ О НАМЕРЕНИИ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

РАБОТЫ……...........................................................................................................……

4

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интеграция процессов культивирования микроводоросли Chlorella vulgaris на муниципальных сточных водах и биосинтеза молочной кислоты»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Проблема загрязнения окружающей

среды выбросами углекислого газа все активнее обсуждается в современном

обществе, в частности, в 2015 году было достигнуто Парижское соглашение в

рамках Рамочной конвенции Организации Объединенных Наций (ООН) об

изменении климата, регулирующее меры по снижению углекислого газа в

атмосфере с 2020 года. Одновременно с ростом численности людей происходит

увеличение потребления воды и, как следствие, увеличение количества

образующихся сточных вод. Согласно докладу, опубликованному ООН в 2017

году только 20 % стоков подвергается очистке, остальные же 80 % сбрасываются

в окружающую среду без предварительной обработки.

Бурный рост потребительской активности человека является основной

причиной увеличивающегося загрязнения окружающей среды. Одним из

компонентов, оказывающих серьезное влияние на ухудшающуюся (особенно в

развивающихся странах) экологическую обстановку, является рост пластиковых

отходов, имеющих длительный срок естественного разложения. Решением этой

проблемы может быть использование биоразлагаемых полимеров, но их широкое

применение сдерживается высокой стоимостью. В связи с этим, актуален поиск

решений, направленных на повышение эффективности технологий производства

биоразлагаемых полимеров и снижение их себестоимости. Одним из

перспективных источников сырья для производства биоразлагаемых полимеров

является молочная кислота L-формы, спрос на которую ежегодно растет на

5 – 8 %.

Для решения этих проблем актуальным является проведение исследований,

направленных на создание интегрированной технологии микробиологического

синтеза молочной кислоты с использованием сточных вод, очищенных с

применением микроводорослей вида Chlorella vulgaris (С. vulgaris).

 5

В работе рассматриваются прикладные аспекты процессов очистки

муниципальных сточных вод с использованием микроводорослей и разработка

ресурсосберегающей технологии производства молочной кислоты с

использованием в качестве основы питательной среды очищенных сточных вод,

содержащих стимулирующие биосинтез молочной кислоты экзометаболиты

микроводорослей. Работа выполнялась на кафедре "Технологии и оборудование

пищевых и химических производств" Тамбовского государственного

технического университета при финансовой поддержке Министерства науки и

высшего образования РФ в рамках базовой части государственного задания

№1983 «Разработка технологии комплексной переработки биоразлагаемых

отходов», №14.5059.2017 БЧ «Кинетика процессов технологии очистки сточных

вод с использованием микроводорослей».

Целью работы является формирование научно-технического задела для

интеграции процессов культивирования микроводоросли C. vulgaris на

муниципальных сточных водах и биосинтеза молочной кислоты.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1) изучение особенностей культивирования микроводорослей вида

С. vulgaris на муниципальных сточных водах;

2) исследование кинетики снижения поллютантов и микрофлоры

муниципальных сточных вод в процессе культивирования микроводорослей;

3) определение состава экзометаболитов микроводорослей С. vulgaris и их

антибиотического действия на микрофлору сточных вод;

4) исследование экзометаболитов микроводорослей С. vulgaris и их

стимулирующего действия;

5) экспериментальное изучение особенностей биосинтеза молочной

кислоты бактериями вида Bacillus coagulans (B. coagulans) с использованием

сточных вод, очищенных микроводорослями;

6) разработка математических моделей процессов накопления биомассы

микроводорослей и микробиологического синтеза молочной кислоты;

 6

7) разработка технологической схемы интегрированного производства

молочной кислоты с использованием сточных вод, очищенных с помощью

микроводорослей, в качестве основы для питательной среды.

Научная новизна. Экспериментально определены кинетические

параметры: а) процесса культивирования микроводорослей С. vulgaris на

муниципальных сточных водах в качестве основы для питательной среды:

удельные скорости роста клеток (0,18; 0,44) сут-1, убыли азот- и

фосфорсодержащих субстратов (-8,5; -3,6) мг/л и (-4,0; -1,9) мг/л соответственно,

микрофлоры сточных вод (-0,13; -0,16) сут-1; б) процесса микробиологического

синтеза молочной кислоты с использованием сточных вод, очищенных с

применением микроводорослей: начальное содержание соединений азота (1,5 мг

катионов аммония/л) и фосфора (3,5 мг фосфат-анионов/л), микрофлоры сточных

вод (общее микробное число (ОМЧ)) не более 0,3 млн КОЕ/мл.

Исследован состав экзометаболитов микроводорослей, полученных в

процессе очистки муниципальных сточных вод, обладающих антибиотическим

эффектом (триглицериды; О-диалкилмоноглицериды; жирные кислоты

(миристиновая (С 14:0); пальмитиновая (С 16:0); стеариновая (С 18:0); олеиновая

(С 18:1); эруковая (С 22:1)); длинноцепочечные спирты; 1-О-диалкиловые эфиры

глицерина), предложен механизм их действия на микрофлору сточных вод.

Определены условия культивирования микроводорослей, позволяющие накопить

наибольшее количество экзометаболита (индолил-3-уксусная кислота (ИУК) –

9,510-8 М), оказывающего стимулирующее действие на рост молочнокислых

бактерий: стационарная фаза роста клеток микроводорослей (8 – 10 сутки),

уровень освещенности – 7 клк в течение 24 ч, температура – 30 °С.

Разработана математическая модель кинетики процесса культивирования

микроводорослей С. vulgaris на муниципальных сточных водах, позволяющая

рассчитывать изменение массы микроводорослей, концентрации катионов

аммония и фосфат-анионов в сточных водах. Разработана математическая модель

кинетики процесса культивирования молочнокислых бактерий с использованием

очищенных сточных вод, позволяющая рассчитывать изменение массы клеток

 7

молочнокислых бактерий, концентрацию углеродсодержащего субстрата и

молочной кислоты в культуральной жидкости.

Теоретическая и практическая значимость. Определены режимы

процесса культивирования микроводорослей С. vulgaris на муниципальных

сточных водах, обеспечивающие остаточное содержание в воде катионов

аммония, фосфат-анионов и микрофлоры на уровне 1,5 мг/л; 3,5 мг/л и

0,3 млн КОЕ/мл, соответственно. Установлены режимы процесса

микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием сточной воды,

очищенной микроводорослями вида С. vulgaris, обеспечивающие выход молочной

кислоты на уровне 119 г/л.

На основе теоретического и экспериментального исследования влияния

химического состава питательной среды и условий культивирования на кинетику

процесса накопления внеклеточных метаболитов микроводорослей разработан

новый способ микробиологического синтеза молочной кислоты (патент РФ

№ 2569149).

По итогам проведенных исследований предложено решение по созданию

новой ресурсосберегающей, малоотходной и экологически чистой технологии

микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием сточных вод,

очищенных микроводорослями, в качестве основы питательной среды. Проведена

серия лабораторных испытаний предлагаемой технологии на базе Тамбовского

государственного технического университета и ООО «Экотехнологии» г. Тамбов

(Приложение Б).

Научные положения, выносимые на защиту:

– результаты теоретических и прикладных исследований технологических

режимов выращивания микроводоросли С. vulgaris и молочнокислых бактерий

B. coagulans для получения биомассы, ее компонентов, продуктов метаболизма и

способы их применения в технологии очистки сточных вод и

микробиологического синтеза молочной кислоты;

– закономерности протекания процесса культивирования микроводоросли

С. vulgaris на муниципальных сточных водах при различных технологических

 8

режимах и выводы относительно возможных механизмов очистки сточных вод и

культивирования молочнокислых бактерий;

– результаты математического моделирования кинетики процессов

культивирования микроводорослей и молочнокислых бактерий, очистки сточных

вод и микробиологического синтеза молочной кислоты;

– технологическая схема ресурсосберегающего, малоотходного и

экологически чистого микробиологического производства молочной кислоты с

использованием очищенных сточных вод в качестве основы питательной среды.

Методология и методы исследования. Культивирование микроорганизмов

осуществляли с применение стандартных методов, применяемых в биотехнологии

и микробиологии. В работе использованы современные методы

физико-химического анализа: спектрофотометрия, тонкослойная хроматография.

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета

прикладных программ Matlab.

Степень достоверности. Достоверность и обоснованность основных

положений и выводов диссертации подтверждаются: 1) корректным

использованием методологии научного исследования, объективных законов

природы, методов физического и математического моделирования;

2) согласованностью теоретических результатов и экспериментальных данных,

полученных с использованием современных методов измерения и

сертифицированных приборов, с известными литературными данными.

Апробация результатов. Основные положения диссертации

докладывались и обсуждались на международных и российских научных

конференциях: 14th International Conference on Chemical and Process Engineering

(Bologna, 2019), Международная научно-техническая конференция «Инженерия

техники будущего пищевых технологий» (Воронеж, 2018), 6th International

Conference on Industrial Biotechnology (Venice, 2018), 13th International Conference

on Chemical and Process Engineering (Milan, 2017), Международная

научно-практическая конференция «Innovation in food technology» (Саратов,

2017), Международная научно-практическая конференция студентов, аспирантов

 9

и молодых ученых «Молодежь и научно-технический прогресс» (Губкин, 2017),

Международная научно-практическая конференция студентов, аспирантов и

молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биотехнологической

и пищевой промышленности» (Бийск, 2017), Международная научно-

практическая конференция «В.И. Вернадский: Устойчивое развитие регионов»

(Тамбов, 2016), 68-научно-практическая конференция студентов и аспирантов

(Мичуринск, 2016), Международная конференция молодых ученых «Пищевые

технологии и биотехнологии» (Казань, 2015) и др.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Проведенное исследование соответствует формулам научных

специальностей: 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) по

пунктам 2, 3.

Публикации результатов работы. По теме диссертации опубликовано

17 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, индексируемых в Web of

Science и Scopus, 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах,

рекомендованных ВАК для публикации результатов кандидатских и докторских

диссертаций, 1 патент на изобретение, 1 свидетельство о государственной

регистрации программ для ЭВМ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из

введения, шести глав, выводов, списка используемых источников (162 работы

отечественных и зарубежных авторов) и двух приложений. Содержание

диссертации изложено на 160 страницах машинописного текста, включает

47 рисунков и 35 таблиц.

 10

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

СТОЧНЫХ ВОД

1.1 Микроводоросли – перспективный возобновляемый источник биомассы

Микроводоросли – перспективный возобновляемый источник биомассы.

Они широко распространены в природе и имеют большое значение в общем

балансе фотосинтетической продукции на Земле. Первые эксперименты по

культивированию клеток микроводорослей были проведены в 1871 г.

профессором Санкт-Петербургского университета А. С. Фаминцыным.

Голландский микробиолог М. Бейеринк в 1890 году получил первые чистые

культуры микроводорослей [1].

Масштабные исследования культивирования микроводорослей в

лабораторных условиях начались в 40-е годы двадцатого века. Биомасса

микроводорослей привлекла ученых из-за высокого количества белковых

соединений (50 – 60 % от сухого вещества клеток), содержащих все незаменимые

аминокислоты. Белок микроводоросли C. vulgaris признают равноценным белку

сухого молока [1].

В настоящее время биомасса микроводорослей считается одним из самых

перспективных источников сырья для получения пищевых продуктов,

медицинских препаратов, возобновляемых источников энергии, так как клетки

этих микроорганизмов обладают способностью накапливать в зависимости от

режимов культивирования повышенное количество различных ценных

компонентов (каротиноиды, хлорофилл, омега-3 жирные кислоты, фосфолипиды,

белки, полярные и неполярные липиды, витамины, углеводы) [2].

Химический состав клеток микроводорослей зависит от условий

культивирования и может варьироваться в широком диапазоне [2]. При

выращивании на обычных минеральных средах в сухой биомассе содержится

 11

40 – 55 % белка, 35 % углеводов, 5 – 10 % липидов, до 10 % минеральных

веществ. Изменяя химический состав питательной среды, можно воздействовать

на метаболизм клеток и получать целевые продукты в большей концентрации.

Согласно данным современных исследований [2] микроводоросли рода

Chlorella, Botryococcus, Scenedesmus хорошо адаптируются к изменяющимся

условиям окружающей среды, но при этом, представители рода Chlorella

обладают самыми хорошими показателями скорости накопления биомассы. Также

клетки этого рода микроорганизмов обладают исключительной способностью к

адаптации при изменении условий культивирования, высоким содержанием

ценных компонентов и «пластичным» метаболизмом [2, 3].

Клетки C. vulgaris, культивируемые на среде с высоким содержанием

азотсодержащих веществ, будут синтезировать преимущественно белки, при

дефиците азотсодержащих веществ метаболизм будет смещаться в сторону

образования липидов или углеводов [4].

При изменении режима освещения и температуры будут изменяться

физические и химические свойства синтезируемых веществ, например,

повышение температуры приводит к увеличению количества насыщенных

жирных кислот в составе липидов [5], а увеличение уровня освещенности

приводит к уменьшению синтеза полярных липидов, но значительному

накоплению нейтральных липидов.

При этом, широкое использование микроводорослей тормозится высокой

себестоимостью продуктов переработки микроводорослей, которая складывается

из затрат на культивирование (минеральные соли, источники освещения),

дезинтеграцию (разрушение клеток) и экстракцию целевых продуктов.

Большинство ученых сходится во мнении, что создание интегрированных

биотехнологических экологически чистых и ресурсосберегающих технологий,

использующих вторичные сырьевые ресурсы и микроводоросли, позволит

достигнуть наибольшей экономической выгоды.

 12

1.2 Морфологические и биохимические особенности микроводорослей

Chlorella vulgaris

C. vulgaris – это вид одноклеточных микроорганизмов из отдела зеленых

водорослей. Морфологические признаки этого вида микроводорослей:

1) молодые клетки слабоэллипсоидные (1,5 – 2,0 мкм), взрослые –

шаровидные (6 – 9 мкм);

2) пигментная система представлена хлорофиллом, каротиноидами и

ксантофиллами: лютеином, неоксантином, виолаксантином, зеаксантином,

антераксантином;

3) запасной углевод зеленых водорослей – это крахмал, который

накапливается внутри хлоропласта: вокруг пиреноида и в строме;

4) клеточная стенка представителей отдела Chlorophyta чаще всего

цельная, но в оболочке имеются поры, через которые внутренняя система клетки

взаимодействует с внешней средой, также через поры наружу выделяется слизь,

которая позволяет клетке передвигаться в пространстве.

Живые клетки микроводорослей этого вида отрицательно заряжены, потому

для их концентрирования из культуральной среды можно использовать метод

электрофлотации [6, 7]. При достижении плотности клеток 3 млн/мл проявляются

хорошо выраженные антагонистические свойства к прочей альгофлоре, бактериям

и инфузориям. Лизис альгофлоры в культуре штамма наступает через 4 – 8 часов,

гибель бактерий и инфузорий через 6 – 10 часов культивирования [8].

Размножение C. vulgaris происходит делением содержимого каждой клетки

на несколько частей, от 2 до 16, которые остаются некоторое время окруженными

материнской оболочкой, а после разрыва и ее исчезновения оказываются

свободно двигающимися, быстро увеличиваются в размерах и через некоторый

промежуток времени повторяют тот же цикл развития [1].

Микроводоросли C. vulgaris для питания используют окисленные вещества,

как углекислота и вода, и синтезируют из них органические соединения. Этот

 13

процесс – фотосинтез осуществляется за счет использования энергии солнца,

побочным продуктом процесса является кислород. Клетки микроводорослей

способны использовать световую энергию благодаря наличию у них комплекса

поглощающих свет пигментов (хлорофилл). Суммарно уравнение фотосинтеза

можно представить следующим образом:

6 СО2  12 H 2 O свет

   С6 H 12 O6  6 H 2 O  6O2  2815880 Дж .

, хлорофилл

Синтез органических соединений за счет процесса фотосинтеза – основной

способ питания микроводорослей, при этом, многие микроводоросли имеют

способность легко переключаться в определенных условиях с фотоавтотрофного

способа питания на ассимиляцию различных органических соединений и

осуществлять гетеротрофный или миксотрофный тип питания или сочетать эти

способы питания с фотосинтезом [1]. Способность клеток микроводорослей

усваивать органические вещества в процессе гетеротрофного питания зависит от

генетических свойств штамма, например, для большинства штаммов

микроводорослей C. vulgaris наилучшим источником углерода является глюкоза.

При этом важно учитывать, что гетеротрофный тип питания клеток

микроводорослей в темноте обеспечивает значительно медленный рост, чем

автотрофный рост на свету.

При использовании освещения и питательных сред с глюкозой для

культивирования микроводорослей, но без подачи углекислого газа наблюдается

повышение скорости роста клеток и усвоения глюкозы. Обеспечение же клеток

микроводорослей углекислым газом позволяет клеткам перейти к миксотрофному

типу питания: скорость роста клеток микроводорослей, которые культивируются

при таких условиях, превышает их скорость роста при автотрофном питании [1].

Многие штаммы микроводорослей вида C. vulgaris способны к усвоению

азота из органических соединений (мочевины, аминокислот, амидов). Эта

способность также определяется генетическими свойствами штаммов: все

штаммы рода Chlorella способны к усвоению азота из аргинина, глицина,

орнитина, а из аланина, аспарагина, серина, цистеина – только отдельные

культуры. Чаще всего в лабораторных условиях клетки микроводорослей

 14

культивируются в условиях, когда они усваивают азот, серу, фосфор, калий и

другие минеральные элементы в виде ионов минеральных солей (NО3-, SО42-,

РО43-, К+ и др.) и используют их для синтеза внутриклеточных и внеклеточных

метаболитов: аминокислот, белков, нуклеиновых кислот, АТФ, алкалоидов,

терпенов, фенольных соединений, различных витаминов, фитогормонов.

Как правило, внеклеточные метаболиты представлены углеводами, белками,

полипептидами, нуклеиновыми кислотами, органическими кислотами,

витаминами, веществами липидной природы, которые могут в результате

гидролитического расщепления и свободнорадикального окисления

трансформироваться в соединения, обладающие ингибирующими свойствами:

кетоны, перекиси и гидроперикиси, которые могут угнетать рост как самих

организмов-продуцентов, так и других организмов в среде.

В работе [9] описано ингибирующее действие метаболитов

микроводорослей на сопутствующую микрофлору: экстракты метаболитов

проявляли бактериостатическую или бактерицидную активность, подавляя рост

микроорганизмов.

В работах [10–12] исследовано похожее действие экстрактов культуральной

жидкости микроводорослей C. vulgaris на рост условно-патогенной микрофлоры

Staphylococcus aureus, Citrobacter sp., Pseudomonas sp., Klebsiella sp.

В обзоре [13] отмечено, что вещества, обуславливающие антимикробную

активность микроводорослей, представлены такими классами соединений, как

индолы, терпены, ацетогенины, фенолы, жирные кислоты и летучие

галогенуглеводороды. Индол и терпены входят в состав эфирных масел и

используются при синтезе биологически активных соединений и лекарственных

средств. Ацетогенины представляют собой поликетиды – вторичные метаболиты,

образующиеся в клетках бактерий, грибов, животных и растений. Наиболее

важными группами поликетидов являются антибиотики и токсины. Фенолы

являются токсичными веществами и проявляют антисептические свойства,

поэтому часто используются в сельском хозяйстве в качестве пестицидов и

бактерицидов, в медицине – в составе антимикробных, противовоспалительных,

 15

спазмолитических, жаропонижающих и других лекарственных средств, а также

витаминов Е и Р.

В связи с множественной лекарственной устойчивостью некоторых

штаммов Staphylococcus aureus продолжаются исследования по выявлению новых

антибактериальных соединений. Была отмечена активность клеточных лизатов

диатомовых водорослей Phaeodactylum tricornutum даже в микромольных

концентрациях, которая связана с полиненасыщенными жирными кислотами

(омега-3) – эйкозапентаеновой и гексадекатриеновой [14] – против

грамположительных патогенных бактерий. Они встречается в структурных

клеточных компонентах микроводорослей в виде полярных липидов,

выполняющих защитную функцию.

При этом точные механизмы действия жирных кислот остаются

малоизученными. Имеются предположения, что их свойства зависят от длины

углеродной цепи и степени их ненасыщенности. Возможно, они повреждают

клеточную мембрану или изменяют ее проницаемость за счет диссоциации

фикобиллиновых комплексов в мембранах тилакоидов, ответственных за

световые реакции фотосинтеза, что приводит к потере клеткой цитоплазмы и

снижению возможности поглощения питательных веществ и клеточного дыхания.

Также имеется утверждение о том, что жирные кислоты имеют прямое отношение

к пероксидативному процессу, вызывая старение митохондрий и нарушая работу

дыхательной цепи [15].

Способность жирных кислот ингибировать рост и выживание бактерий

известна уже давно, но недавние исследования зависимости структуры и

функциональных свойств этих экзометаболитов предполагают, что указанная

способность зависит как от длины цепи, так и от степени ненасыщенности кислот.

Первые исследования антибиотических свойств культур микроводорослей

проводил Р. Прэтт. Он обнаружил, что экстракты культур микроводорослей

C. vulgaris проявляют антибиотическую активность против грамположительных и

грамотрицательных организмов, таких как Staphylococcus aureus (золотистый

стафилококк), Streptococcus pyogenes (возбудители скарлатины), Bacillus subtilis

 16

(сенная палочка), Bacterium coli и Pseudomonas pyocyanea (Ps. aeruginosa, или

синегнойная палочка) и заметил зависимость появления антибактериальных

свойств от освещения. Выделенная им группа веществ, обладающих

антибиотическим действием, получила название «хлореллин». Он уникален тем,

что его можно получить из автотрофного организма практически на любой среде,

которая содержит неорганические соли, под воздействием углекислого газа и

освещения [16].

Р. Прэтт проводил ряд исследований, направленных на выяснение хода

накопления хлореллина с целью определения возраста культур, при котором

концентрация антибиотического агента максимальна. В результате проведенных

исследований Прэтт сделал вывод о том, что клетки микроводоросли Chlorella в

фазе активного роста и деления могут разрушать или дезактивировать

токсический эффект хлореллина, в то время как культура, вошедшая в

стационарную фазу роста, обладает такой способностью лишь незначительно,

либо не обладает ею вообще. Хлореллин легко диффундирует через клеточные

мембраны во внешнюю среду и распределяется в ней в соответствии с градиентом

концентрации. С другой стороны, хлореллин может быть важным метаболитом

для жизнедеятельности клетки, поэтому в период активного роста происходит

почти полное исчезновение его из культуральной среды, в то время как, на

стационарной фазе клетки активно его производят, а избыток выходит в

культуральную среду [17].

В исследовании [18] изучалась антибактериальная активность

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Маркин Илья Владимирович, 2020 год

Источник

Источник Источник Соотношение

№ стимулирующих Вода pH

углерода азота С:N

веществ

Экстракт

Стерильная

1 солодовых 7:1 7

вода

ростков 25 % (об.)

Меласса – 300 мл

Сточные воды, Сточные воды,

(сбраживаемые Меласса

очищенные очищенные

2 сахара, в (общее

активным илом активным илом

7:1 7

пересчете на содержание

(350 мл) (350 мл)

глюкозу – азота 2 %

Сточные воды, Сточные воды,

концентрация (масс.))

очищенные очищенные

140 г/л)

3 штаммом штаммом 7:1 7

C. vulgaris Beijer C. vulgaris Beijer

(IPPAS C-2) (IPPAS C-2)

 83

Анализ результатов исследования (рис. 5.2) позволил сделать вывод, что

наибольшая концентрация молочнокислых бактерий вида B. сoagulans

(900 млн кл/мл) была достигнута на 60 ч культивирования на питательной

среде, в которой в качестве стимулирующих веществ использовалась

культуральная жидкость микроводорослей C. vulgaris (очищенные сточные

воды).

Концентрация клеток в среднем в 1,5 – 1,9 раза выше, чем в контрольном

образце, в котором в качестве источника стимулирующих веществ

использовался экстракт солодовых ростков. После 40 ч культивирования рост

клеток молочнокислых бактерий замедлялся, так как к этому времени в

культуральной жидкости наблюдалось значительное содержание молочной

кислоты 20 – 45 г/л, ингибирующей рост клеток.

Максимальная концентрация целевого продукта (рис. 5.3) наблюдалась

на 90 – 100 ч культивирования с фильтратом культуральной жидкости

C. vulgaris и составила – 112 г/л. В среднем при использовании в качестве

источника стимулирующих веществ фильтрата культуральной жидкости

микроводорослей по сравнению с контролем (солодовые ростки) концентрация

молочной кислоты в культуральной жидкости возрастает на 10 % масс.). Это

можно объяснить тем, что в фильтрате культуральной жидкости

микроводорослей присутствуют вещества, стимулирующие рост

молочнокислых бактерий (вещества индольной природы), витамины группы

В – пиридоксин, тиамин, рибофлавин [45, 149], которые интенсифицируют

реакции синтеза белков и образование пирувата, что позволяет клеткам

активнее делиться и накапливать молочную кислоту. При этом подавления

роста молочнокислых бактерий из-за действия экзометаболитов

микроводорослей не наблюдается, так как антимикробный эффект

экзометаболитов (веществ липидной природы) микроводорослей проявляется

при воздействии электромагнитного излучения (светового излучения), в

частности излучение стимулирует перекисное окисление липидов в

культуральной жидкости, в результате образуются активные молекулы

 84

(гидроперекиси липидов и др.), которые атакуют молекулы белков и

нуклеиновых кислот, окисляют липиды цитоплазматической мембраны, что

приводит к нарушению метаболизма и гибели клетки. Культивирование

молочнокислых бактерий осуществляется без светового излучения, так как эти

микроорганизмы – гетеротрофы.

Анализ кинетики убыли глюкозы (рис. 5.4) позволяет сделать вывод, что

этот углеродный субстрат усваивается клетками приблизительно с одинаковой

скоростью в течение всего времени культивирования.

1000 120

B. coagulans (солод.рост.)

Количество клеток, млн кл/мл

B. coagulans (C-2)

100

800 B. coagulans (солод. рост

B. coagulans (ак. ил)

Молочная кислота, г/л

B. coagulans (C-2)

B. coagulans (ак. ил) 80

600

60

400

40

200 20

0 0

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Время культивирования, ч Время культивирования, ч

Рисунок 5.2 – Кинетика Рисунок 5.3 – Кинетика

накопления биомассы накопления молочной кислоты

140

Общее микробное число, млн КОЕ/мл

B. coagulans (солод.рост.) 2.5

120 B. coagulans (C-2)

B. coagulans (ак. ил) 2

100

Глюкоза, г/л

1.5

80 B.coagulans (ак.ил)

B.coagulans (солод. рост)

1

60 B.coagulans (С-2)

40 0.5

20 0

0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4

Время культивирования, ч Время культивирования, сутки

Рисунок 5.4 – Кинетика убыли Рисунок 5.5 – Изменение ОМЧ

углеродсодержащего субстрата

Это объясняется тем, что глюкоза необходима как для размножения

клеток и поддержания их нормальной жизнедеятельности, так и для синтеза

 85

молочной кислоты. Максимальное усвоение глюкозы наблюдалось при

культивировании вида B. сoagulans на сточных водах, очищенных

микроводорослями, и составляло 76 %, что в среднем в 1,3 – 1,4 раза выше по

сравнению с контрольным образцом (таблица 5.1).

При культивировании В. сoagulans на питательной среде с

использованием муниципальных сточных вод после биологической очистки

активным илом наблюдается процесс ингибрования роста молочнокислых

бактерий. Это можно объяснить тем, что в муниципальных сточных водах,

очищенных активным илом, присутствуют колиформные и патогенные

бактерии (ОМЧ = 2 – 2,5 млн КОЕ/мл), которые подавляют жизнедеятельность

молочнокислых бактерий, при этом, накопление молочной кислоты в

культуральной жидкости не происходило, а ОМЧ увеличивалось в 1,25 раза

(рис. 5.5) [144, 154].

Использование для культивирования вида В. сoagulans сточных вод,

очищенных микроводорослями C. vulgaris, позволяет сохранить

жизнедеятельность штаммов, обеспечить их нормальный рост и накопление

молочной кислоты. Данный факт объясняется тем, что микроводоросли

способны выделять внеклеточные метаболиты, имеющие антибиотическое

действие и подавляющие жизнедеятельность условно патогенной и патогенной

микрофлоры, в связи с этим ОМЧ сточных вод после культивирования на них

микроводорослей C. vulgaris Beijer (IPPAS C-2) в 6,7 – 8,3 раза ниже по

сравнению с ОМЧ муниципальных сточных вод после биологической очистки

активным илом и составляет 0,3 млн КОЕ/мл.

По результатам проведенных экспериментальных исследований

установлено, что использование в качестве стимулирующих веществ

муниципальных сточных вод, очищенных клетками микроводорослей

C. vulgaris (штамм Beijer (IPPAS C-2)) позволяет: повысить концентрацию

клеток молочнокислых бактерий вида B. сoagulans в среднем в 1,5 раза,

концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости на 10 % (масс.) по

сравнению с контрольным образцом. Использование для культивирования

 86

штамма В. coagulans питательной среды с использованием муниципальных

сточных вод после биологической очистки активным илом приводит к гибели

молочнокислых бактерий из-за наличия в воде колиформных и патогенных

бактерий, которые подавляют жизнедеятельность молочнокислых бактерий.

5.1.2 Культивирование молочнокислых бактерий на сточных водах,

очищенных с помощью микроводорослей

Целью эксперимента являлся подбор «критического» ОМЧ в очищенных

сточных водах, при которых молочнокислые бактерии выживают и

синтезируют наибольшее количество молочной кислоты.

Культивирование молочнокислых бактерий осуществлялось в шейкере-

инкубаторе «BIOSEN SHAKER ES-20/60» (при температуре 52 °С и скорости

перемешивания 100 об/мин) на питательной среде, содержащей мелассу и

сточные воды после вторых, четвертых и восьмых суток очистки

микроводорослями (образцы №2, 3, 4, соответственно). В качестве

контрольного образца использовали сточные воды, не подвергшиеся очистке

(образец №1).

Исходные характеристики питательных сред представлены в таблице 5.2.

Количество посевного материала составляло 20 % (об.) от культуральной

среды, а титр посевного материала 700 – 900 кл/мл. Концентрация

молочнокислых бактерий определялась методом прямого подсчета в камере

Горяева. Уровень рН определялся потенциометрическим методом с

использованием pH-метра «Эксперт-001 Эконикс». Концентрация глюкозы и

молочной кислоты в культуральной жидкости определялась с использованием

прибора «Biosen С-line». Удаление клеток микроводорослей из очищенных

сточных вод осуществлялось с использованием центрифуги «Sigma».

Определение общего микробного числа осуществлялось с использованием

метода Коха.

 87

Таблица 5.2 – Исходные характеристики питательных сред, использованных

для культивирования молочнокислых бактерий штамма B. coagulans B-10468

Общее микробное число

№ образца Источник углерода и азота

сточных вод (млн КОЕ/мл)

1 Меласса – 300 мл 3

2 (сбраживаемые сахара, в пересчете 0,8

3 на глюкозу – концентрация 140 г/л); 0,6

4 (общее содержание азота 2 % (масс.)) 0,3

Изменение уровня pH, концентрации глюкозы и молочной кислоты,

представлены на рисунках 5.6 – 5.8.

7 140

1 1

6.5 2 120 2

3 3

4 100 4

6

Глюкоза, г/л 80

pH

5.5

60

5

40

4.5 20

4 0

0 5 10 15 0 5 10 15

Время, сутки Время культивирования, сутки

Рисунок 5.6 – Кинетика изменения Рисунок 5.7 – Кинетика убыли

уровня рН глюкозы

140

1

120 2

3

Молочная кислота, г/л

100 4

80

60

40

20

0

0 5 10 15

Время, сутки

Рисунок 5.8 – Кинетика накопления

молочной кислоты

Максимальное количество молочной кислоты (119 г/л) наблюдалось при

культивировании штамма B. сoagulans ВКПМ В-10468 на сточных водах после

очистки микроводорослями в течение 8 суток (образец №4), обладающих

 88

наибольшей концентрацией экзометаболитов стимулирующего действия и

наименьшим ОМЧ.

Коэффициенты конверсии глюкозы в молочную кислоту представлены в

таблице 5.3.

Таблица 5.3 – Результаты эксперимента по биосинтезу молочной кислоты на

сточных водах, очищенных с помощью микроводорослей вида C. vulgaris

№ образца Концентрация глюкозы, Концентрация Коэффициент конверсии

сточных вод г/л молочной глюкозы в молочную кислоту,

кислоты, г/л % (масс.)

1 8,1 5,8

2 88 62,9

140

3 103 73,6

4 119 85

Максимальный коэффициент конверсии глюкозы в молочную кислоту –

85 % (масс.) был получен при использовании сточных вод - образец № 4 [144].

Результаты эксперимента позволили установить, что для максимального

накопления молочной кислоты (119 г/л) культивирование необходимо

осуществлять при достижении ОМЧ 0,3 млн КОЕ/мл, концентрации катионов

аммония ≈ 1,5 мг/л, фосфат-анионов ≈ 3,5 мг/л. Соблюдение этих условий

позволяет накопить максимальное количество молочной кислоты и достигнуть

максимального коэффициента конверсии глюкозы в молочную кислоту 85 %

[145, 146].

5.1.3 Исследование стрессовых условий культивирования молочнокислых

бактерий на очищенных сточных водах

Целью эксперимента было исследование эффективности процесса

накопления биомассы молочнокислых бактерий и биосинтеза молочной

кислоты при введении стадии накопительного культивирования

молочнокислых бактерий (аэробных условий).

 89

Для достижения поставленной цели был спланирован и проведен

эксперимент согласно следующему алгоритму:

1. очистка сточных вод осуществлялась микроводорослями штамма

C. vulgaris Beijer (IPPAS C-2) до достижения следующих параметров:

концентрация катионов аммония – 1,5 мг/л; концентрация фосфат-анионов –

3,5 мг/л; величина общего микробного числа – 0,3 млн КОЕ/мл.

2. В качестве источника углерода и азота использовалась свекловичная

меласса (300 мл; соотношение углерода к азоту: 7:1 (масс.), концентрация

сбраживаемых сахаров в пересчете на глюкозу: 140 г/л), в качестве основы для

создания питательной среды и источника стимулирующих веществ (вещества

индольной природы) использовалась сточная вода, очищенная

микроводорослями и взятая в количестве 100 % (об.) или 20 % (об.) от общего

объема воды (350 мл).

3. В качестве продуцента молочной кислоты использовали штамм

B. coagulans B-10468.

4. Получение молочной кислоты осуществлялось в режиме глубинного

культивирования без нейтрализации молочной кислоты при следующих

фиксированных условиях:

1) объем посевного материала – 20 % (об.), титр клеток – 900 кл/мл;

2) активная кислотность (pH) – 6,98…7,09;

3) температура культивирования – 52 оС.

Культивирование бактерий в образцах питательной среды №1 и №3 в

течение первых двух дней осуществляли с использованием аэрации

газовоздушной смесью (80 л/ч). Характеристика образцов приведена в

таблице 5.4.

Таблица 5.4 – Характеристика образцов питательной среды

№ образца Содержание фильтрата, % (об.) Активная кислотность

1 100 7,09

2 100 7,06

3 20 6,98

4 20 7,08

 90

По полученным экспериментальным данным были построены графики,

описывающие кинетику накопления биомассы B. coagulans В-10468

(рис. 5.9) и молочной кислоты (рис. 5.10), динамику потребления глюкозы

(рис. 5.11) и изменения pH (рис. 5.12). Динамика роста бактерий,

представленная на рисунке 5.1, соответствует классической S-образной кривой

роста микроорганизмов (лаг-фаза, лог-фаза, стационарная фаза и фаза

отмирания). Наибольшее количество клеток наблюдалось в аэрируемом образце

питательной среды с 100 %-ным содержанием фильтрата (160 млн. кл/мл на 2

сутки, что больше на 88,8 % чем в таком же образце без аэрации). Наиболее

долгая экспоненциальная фаза наблюдалась в образце №3 (20 % содержание

фильтрата), который также культивировался в присутствии воздуха. Данный

факт можно объяснить тем, что в присутствии кислорода факультативные

анаэробы B. сoagulans получают энергию за счет клеточного дыхания, а не

брожения. В результате химических реакций, сопровождающих дыхание,

образуется большое количество промежуточных соединений, из которых могут

синтезироваться различные соединения, входящие в состав клетки.

140

100% аэрация 100% аэрация

Концентрация клеток, млн кл/мл

100% 120 100%

200 20% аэрация

20% аэрация

Молочная кислота, г/л

20% 100 20%

150

80

60

100

40

50

20

0

0 0 2 4 6 8

0 2 4 6 8 Время культивирования, сутки

Время культивирования, сутки

Рисунок 5.9 – Кинетика накопления Рисунок 5.10 – Кинетика накопления

биомассы молочной кислоты

 91

140 7.5

100% аэрация 100% аэрация

120 100% 7 100%

20% аэрация 20% аэрация

100 20% 20%