Получение и иммунохимическое исследование полимерной фракции столбнячного анатоксина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Бинима Сагу

• Бинима Сагу
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бинима Сагу

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая историческая справка

1.2. Особенности эпидемиологии столбняка

1.2.1. Состояние заболеваемости столбняком в странах Африки

1.3. Особенности профилактики столбняка

1.4. Столбнячный токсин

1.4.1. Получение нейротоксина, его характеристика и структура

1.4.2. Фрагментация ТС

1.4.3. Взаимодействие ТС с рецепторами и физиологическая 28 роль фрагментов ТС

1.4.4. Способ получения С А 3

1.5. Методы очистки С А

1.5.1. Характеристика метода мембранной диафильтрации для 34 очистки СА

1.5.2. Очистка С А с помощью гель-фильтрации 3 7 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.1.1. ТС и СА

2.1.2. Сыворотки

2.1.3. Диагностикумы

2.1.4. Лабораторные животные

2.1.5. Буферные растворы, реагенты, хроматографические 41 носители

2.1.6. Оборудование

2.2 Методы

2.2.1. Диафильтрация

2.2.2. Спектрофотометрия

2.2.3. Хроматография

2.2.4. Определение бежа

2.2.5. Иммунохимическая характеристика препаратов

2.2.6. Определение удельной антигенной активности препаратов

2.2.7. Определение иммунизирующей активности препаратов

2.2.8. Определение ревакцинаторного эффекта препаратов

2.2.9. Определение белкового азота

2.2.10 Приготовление эритроцитарных диагностикумов

2.2.11 Получение латексного диагностикума и контрольного ла- 50 текса

2.2.12 Постановка реакции агглютинации латекса

2.2.13 Статистическая обработка результатов 51 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБ- 52 СУЖДЕНИЕ

3.1. Очистка СА с использованием ступенчатой диафильтра-

нии

3.1.1. Одноступенчатая диафильтрация С А 5

3.1.2. Двухступенчатая диафильтрация СА

3.1.3. Использование технологии мембранной "рехроматогра- 62 фии"при производственной очистке СА

3.2. Исследование иммуногенной активности высокоочшцен- 64 ной полимерной фракции СА

3.3 Выделение и очистка полимерной фракции СА методами 67 колоночной гель-хроматографии

3.4. Изучение сенситивных свойств молекулярно-однородных 72 фракций препарата СА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ОСНОВНЫЕ ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АДС - адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина АС - адсорбированный столбнячный анатоксин АУФ-аппарат ультрафильтрационный (коммерческое название) АТ - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения ВПУ - половолоконный ультрафильтрационный модуль (коммерческое название)

ВФС - временная фармакопейная статья

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЕС - единица связывния

кД - килоДальтон

- лимит флокуляции МЕ - международная антитоксическая единица МИЕ - международная иммунизирующая единица Мм - молекулярная масса НКС -нормальная кроличья сыворотка ОБК - отдел биологического контроля ОСО - отраслевой стандартный образец РАЛ - реакция агглютинации латекса РПГА - реакция пассивной гемагглютинации СА - столбнячный анатоксин ТС- тетаноспазмин

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и иммунохимическое исследование полимерной фракции столбнячного анатоксина»

ВВЕДЕНИЕ

Возбудитель столбняка - Clostridium tetani распространен повсеместно в почве и других объектах внешней среды на различных территориях Земного шара, в связи с чем проблема столбняка имеет глобальное значение. Но в развивающихся странах она стоит наиболее остро, так как процент заражения столбняком значимо выше, чем в развитых странах, где заболеваемость в мирное время носит спорадический характер.

В некоторых Европейских странах, в том числе в России, резкое снижение случаев болезни началось с плановой иммунизации населения. Так по данным В. Ф. Рудниченко и соавторов снижение заболеваемости столбняком в России произошло в 4,6 раза за десятилетие (1971-1980) [52], а смертность снизилась к концу 60-х годов в 2,6 раза [6]. На Европейском континенте в таких странах, как Португалия, Франция, Италия, Австрия, Румыния, Болгария самая высокая смертность от столбняка составляет от 1,0 до 3,3% на 100 тысяч населения, тогда как в других странах Европы она не превышает 1,0% [47].

Столбняк имеет преимущественно зональное распространение и чаще регистрируется в регионах с жарким и тропическим климатом [7, 8, 33, 34, 90, 141]. Развивающиеся страны, в разряд которых входит большинство государств африканского континента, отнесены в зону повышенной заболеваемости столбняком, где болезнь принимает эндемичный характер [8, 9, 33, 73, 138, 32]. Столбняк в странах Африки до настоящего времени является одной из десяти главных причин смертности населения, в том числе и детской. К этим странам относится и Мали. В чем причина? Проблема состоит в том, что в развивающихся странах, в частности, в Мали нет возможности прививать все население, 80% которого занимается

сельским хозяйством и животноводством. Это животноводы и овощеводы, механизаторы и рабочие лесозаготовительной промышленности, строители и многие профгруппы сферы коммунального обслуживания, то есть люди, имеющие тесный контакт с почвой. Наряду с военнослужащими этот контингент можно отнести к так называемой ' группе риска по отношению к столбнячной инфекции.

Отсутствие плановой иммунизации населения связано с тем, что в стране нет местного производства профилактических препаратов и их приходится закупать за границей. Именно поэтому вакцинируют только детей, беременных женщин и солдат. Но даже среди этого контингента смертность от столбняка остается высокой, так как за качеством вакцинации этих людей наблюдений не ведется.

Особенно серьезную проблему представляет столбняк новорожденных. Несмотря на неполные данные, до настоящего времени эта форма болезни составляет 40-60% от общего числа заболевших столбняком, а умирает во всех развивающихся странах ежегодно более 1 миллиона детей [7, 148, 149] и в Мали, по данным ВОЗ [147], имеется тенденция к увеличению числа умерших. В столице Мали Бамако 60% смертности детей до одного года обусловлено пятью основными инфекционными заболеваниями, где наряду с корью, острыми кишечными инфекциями, малярией и пневмонией важную роль играет столбняк. Улучшение ситуации по столбняку возможно лишь путем создания активного напряженного иммунитета у населения через вакцинации, ревакцинации и путем последующего наблюдения за уровнем коллективного иммунитета, особенно среди контингента, составляющего группу риска.

В связи с вышеизложенным проблема столбняка для Мали является очень актуальной, а выбор диссертационной темы "Получение и иммуно-

химическое исследование полимерной фракции столбнячного анатоксина (СА)" не был случайным.

Цель настоящих исследований заключалась в разработке технологии получения высокоочшценной полимерной фракции СА методом ступенчатой диафильтрации и изучении ее иммунохимических свойств, антигенной и иммуногенной активности.

По ходу достижения цели последовательно решались следующие задачи:

¡.Получение производственных серий высокоочшценной полимерной фракции СА методом ступенчатой диафильтрации на половолоконных ультрафильтрационных модулях (ВПУ) МВ-100 и мембранах ХМ-300.

2.Исследование фракционного состава производственных серий СА методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3.Выделение и очистка полимерной фракции СА методами колоночной гель-хроматографии;

4.Изучение иммунохимических свойств полимерной фракции СА.

5.Оценка иммунизирующей активности сорбированной высокоочи-щенной полимерной фракции СА в опытах на мышах.

6.Изучение иммуногенности полимерной фракции СА в опытах ревакцинации на морских свинках.

7.Исследование возможности использования полимерной фракции СА как сенситина при изготовлении эритроцитарного и латексного диаг-ностикумов.

Научная новизна. Впервые в условиях производства разработана технология очистки некондиционных серий СА с использованием ступенчатой диафильтрации, позволяющая получить на основе полимерного компонента коммерческие серии с нагрузкой более 1000 единиц связыва-

ния (ЕС)/мг белкового азота, т.е. удовлетворяющие критериям Фармакопейной статьи РФ и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).

Практическая значимость. Разработанная технология использования ступенчатой мембранной диафильтрации для доочистки СА внедрена на предприятии АО "Биомед" им. И. И. Мечникова. Производственные серии препаратов, дополнительно очищенные по указанной технологии, прошли комиссионную проверку в Государственном институте стандартизации и контроля (ГИСК) им. Л. А. Тарасевича. Подтверждена их высокая удельная специфическая и протективная активность. ГИСК им. Л .А. Тарасевича согласовал дополнение к регламенту производства СА, предусматривающее возможность использования ступенчатой мембранной диафильтрации для доочистки препаратов.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Краткая историческая справка

Столбняк известен с древнейших времен. Развитие бактериологии с середины 70-х годов прошлого века помогло изучить болезнь с научных позиций. Инфекционная природа столбняка доказана Н. И. Пироговым [50] и Н. Д. Монастырским [38], который впервые обнаружил столбнячную палочку в трупах людей, погибших от столбняка. В 1884 году А. Ни-колайер воспроизвел болезнь в эксперименте, заражая подкожно кроликов и морских свинок садовой землей. Итальянские ученые Калре (Caire) и Раттон (Rattone) воспроизвели болезнь на кроликах путем введения в мышцы, спинномозговой канал и в оболочку седалищного нерва эмульсии из раны ноги больного, умершего от столбняка. Чистую культуру возбудителя получил в 1889 году С. Китазато. Он же совместно с Э. Берингом в 1890 году получил столбнячный токсин и предложил использовать для лечения столбняка антитоксическую противостолбнячную сыворотку. В 1923-26 годах французскому исследователю Г. Рамону [122] удалось получить СА путем длительного воздействия на столбнячный токсин формалином при температуре 39-40° С, который в дальнейшем стали применять для профилактики заболевания. Этот же автор использовал СА совместно с вакциной против брюшного тифа и паратифов, что способствовало усилению иммунитета против столбняка. Линкольн и Гринвальд (1933) иммунизировали 18 добровольцев 3 дозами анатоксина с недельным интервалом с хорошим прививочным результатом. Широко использовал иммунизацию СА железнодорожных рабочих Бази (1934), Син-Сасский и Стетке-вич (1934) проводили прививки солдатам. Сравнительное изучение защит-

ного эффекта при иммунизации двумя и тремя дозами СА проводил Лаги-ри (1942), Фрезер, Маклеан, Орр, Плуммер и Уимарт (1942).

В России проблема профилактики столбняка изучалась в работе К. И. Матвеева [31]. Вопросы дифференцированного лечения больных столбняком представлены в трудах К. М. Лобана [27]. Материалами советских (российских) и зарубежных ученых подтверждено широкое распространение столбняка и необходимость проведения плановой и экстренной иммунизации как единственно надежного способа профилактики заболевания [2, 9, 10, 35, 37, 62, 63, 67, 69, 141].

1.2.0собенности эпидемиологии столбняка

Возбудитель столбняка широко распространен в природе. Он является постоянным обитателем кишечника многих травоядных животных (лошадей, коров, овец, коз, свиней, кроликов, обезьян, морских свинок, мышей, крыс). Возбудитель встречается также в кишечнике здоровых людей, инфицированность которых варьирует от 5 до 40%. Столбнячная палочка, попадая с фекалиями в почву, надолго инфицирует ее, преобразуясь в споровую форму. В районах с развитым животноводством и благоприятными почвенно-климатическими условиями обсемененность почв возбудителем колеблется в среднем от 25 до 100%.

Жаркий и тропический климат является наиболее благоприятным для роста и размножения С1Ле1аш в почве. Некоторые растения, по данным Е. Н. Мишустина с соавторами [37], например, пшеница, способствует размножению в почве столбнячной палочки. Вместе с пылью, частичками почвы, предметами хозяйственной деятельности возбудитель переносится на одежду, обувь, кожу человека. За исключением столбняка новорожденных существует параллелизм между обсемененностью почв столбнячной палочкой и уровнем заболеваемости [39, 67]. По мнению В. Ф. Рудниченко

с соавторами [52], почвенные факторы являются моментом, способствующим выживанию инфекционного начала. Авторы считают, что выявление почвенных факторов может определять географию заболеваемости столбняком и делает возможным составление эпидемиологических прогнозов.

Болезнь развивается лишь при проникновении возбудителя через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки. Входными воротами служат различные раны: огнестрельные, колотые, резаные, ожоги, обморожения, травмированные родовые пути, операционные раны при инфицировании их руками, инструментами или перевязочным материалом. Вот почему столбняк обычно сопровождает все воины и связан прежде всего с травматизмом. Ежегодно 10% населения развивающихся стран и более 5 % населения развитых стран подвергаются риску получения травмы. Наиболее часто (до 30% случаев) инфекция проникает через крупные кожные повреждения. В зависимости от геоклиматических и социально-экономических условий вероятность заболевания составляет от 1 до 40 случаев на 1000 ранений [8].

Как уже указывалось, наибольшая заболеваемость столбняком регистрируется у жителей сельской местности. Это объясняется особенностями быта населения, контактом с животными, сельскохозяйственным травматизмом, большим соприкосновением с удобренными почвами. Основная масса населения тропических стран, занятая сельскохозяйственным трудом, не пользуется обувью, ходит босиком или носит кустарную открытую или полуоткрытую обувь. Это приводит к постоянному контакту ног с почвой и частому их травмированию. Жители села при мелких ранениях, связанных с бытовыми травмами обычно не обращаются за медицинской помощью. В развивающихся странах эта группа населения чаще всего не охвачена медицинской помощью из-за слабо развитой сети лечебно-профилактических учреждений, отсутствия медицинских кадров. В хирур-

гической практике описаны случаи послеоперационного столбняка из-за обсеменения спорами перевязочного материала, кетгута [91]. При анализе входных ворот инфекции у 2337 больных столбняком в Парагвае, установлено, что в 7,7% случаев поражение возникало вследствие повреждения кожи после удаления паразитов при дракункулезе, в 5,14% - после инфекций, в 2,74% - после плановых операций. Как важный фактор в возникновении столбняка следует выделить хронические гнойные заболевания ушей [ИЗ].

В развивающихся странах важное место занимает столбняк новорожденных, у которых входными воротами возбудителя служит пупочная рана. Связано это с тем, что в 90% случаев принятие родов на дому проводится лицами без специальной подготовки. Используется нестерильный материал, перерезание пуповины грязными ножницами, ножами, лезвием. К тому же практикуется присыпание пуповины землей, золой, конским пометом.

В мирное время до 85% случаев столбняка обусловлено бытовыми травмами, особенно сельскохозяйственными. Роды, криминальные аборты, хирургические вмешательства в антисанитарных условиях, т.е. с нарушением правил асептики и антисептики, особенно в развивающихся странах, в 60% случаев провоцируют развитие столбняка.

В военное время ситуация меняется. В результате больших ранений и загрязнения ран почвой резко возрастает заболеваемость столбняком. Из истории известно, что все крупные военные действия дают повышение заболеваемости и сопровождаются значительной летальностью от столбняка. Так, в период наполеоновских войн летальность среди заболевших столбняком составляла 82,5%, во время гражданской войны в США (186165 гг.) - 89,3%, в период русско-японской войны (1904-1905 гг.) - 92%, в первую мировую войну - 84,5%. Во вторую мировую войну в связи с при-

менением лечебной сыворотки летальность от столбняка резко снизилась [39].

Столбняком чаще болеют дети в возрасте 3-7 лет, когда они особенно подвижны и многие из них получают травмы. Дети до 14 лет болеют в 2,5 раза чаще, чем лица от 14 до 50 лет [70].

Восприимчивость к столбняку всеобщая, естественного иммунитета не существует. После перенесенного заболевания не происходит развития иммунитета ввиду малого антигенного раздражения, вызываемого токсином и поэтому может быть повторное заражение. Лишь активная иммунизация столбнячным анатоксином или комбинированным препаратом ведет к развитию стойкого иммунитета.

1.2.1. Состояние заболеваемости столбняком в странах Африки

Во многих странах Африки, Азии и Латинской Америки (Филиппины, Таиланд, Сомали, Кения, Ангола, Мали, Никарагуа, Парагвай, Мексика и др.), где вакцинация против столбняка проводится частично, это заболевание является острой проблемой и число больных ежегодно достигает одного миллиона, а летальность колеблется от 40 до 78%.

По официальным статистическим данным за 8 лет (1945-1952) в Африке болели столбняком более 22 тысяч человек. В период с 1951 по 1974 годы в 32 странах Африки с населением около 258 миллионов ежегодно погибало не менее 60 тысяч человек, а если представить материал в интенсивных показателях, то на африканском континенте встречается 1015 заболевших на 100 тысяч населения [93]. По данным ВОЗ, в 1979 г. в мире зарегистрировано 99 тысяч случаев столбняка, в 1980 - более 107 тысяч, в 1981 - около 93 тысяч, в 1982 - чуть более 85 тысяч, а в 1983 -около 69 тысяч [26]. В 1979 году сообщения были получены из 157 стран мира, в 1980 - из 164, в 1981 - из 161, в 1982 - из 143, а в 1983 - лишь из

123 стран. Как известно, столбняк новорожденных регистрируется преимущественно среди сельского населения Африки, в районах, где практически отсутствуют структуры медицинских служб и доступ медработников к населению затруднен, а подчас и невозможен. Смертность в этих условиях достигает от 1 до 18 на 1000 родившихся, по данным исследований, осуществленных в 13 странах африканского региона [147].

Таким образом, диагностика, лечение и профилактика столбняка на африканском континенте остаются актуальной проблемой. Если считать население Африки равным приблизительно около 330 миллионов человек, то число умерших от столбняка должно превышать 80 тысяч в год.

Подводя итог вышеизложенному материалу, можно отметить, что в странах с жарким и тропическим климатом эпидемический процесс при столбняке характеризуется рядом особенностей. В тропиках среди многочисленных факторов, способствующих распространению столбняка, следует отметить прежде всего почвенно-климатические и санитарно-гигиенические. Более разнообразными являются пути и факторы передачи возбудителя. Неблагоприятно сказывается на заболеваемости столбняком низкий экономический уровень стран, войны, разруха, слабо развитая сеть медицинских учреждений.

1.3.0собенности профилактики столбняка

Хорошо известно, что только массовая активная иммунизация против столбняка является единственным и надежным методом снижения уровня заболеваемости [9, 31, 47, 84, 133]. Выявляется четкая зависимость начала снижения заболеваемости столбняком, как и другими инфекциями, от времени введения в массовую практику соответствующих прививок [4, 5]. Высокая эффективность иммунизации населения прослеживается на характере заболеваемости в некоторых Европейских странах,

в том числе России. В СССР в допрививочный период (1945-1950) зарегистрирован некоторый рост заболеваемости столбняком, в основном за счет ужесточения системы учета случаев болезни [40, 67]. По данным авторов, резкое снижение заболеваемости началось в период с 1962 по 1966 годы в связи с введением системы плановой иммунизации населения. Сравнительное изучение заболеваемости столбняком за десять допрививочных лет и за такой же период после введения массовой иммунизации населения СА (1951-60 гг. и 1971-80 гг. соответственно) показывает снижение заболеваемости в 4,6 раза [6]. По данным Бургасова П.Н. и соавт. [6], смертность от столбняка снизилась к концу 60-х годов в 2,6 раза. Все сказанное свидетельствует, что разработанные методы специфической профилактики вполне себя оправдывают и позволяют контролировать уровень инфекции.

Заболеваемость столбняком в России снизилась благодаря иммунизации населения, однако, летальность при столбняке остается высокой и поэтому весьма актуальной является проблема профилактики этого заболевания. Изучение состояния антитоксического иммунитета к столбняку позволяет не только оценить защищенность населения от этой инфекции, но и определить иммунологический эффект вакцинации, выявить потенциально восприимчивые контингенты и территории, а также осуществить коррекцию иммунитета к этой инфекции.

Исследования, проведенные Никулиной Н.В. и соавт. в Свердловской области показали, что уровень защищенности от столбняка в целом по области достаточно высок во всех возрастных группах, как детского, так и взрослого населения. У городского населения в старших возрастных группах число серонегативных лиц к столбняку составило у 31-40-летних -25%, а в возрастной группе старше 40 лет - 42,6%. У сельского населения, занятого в животноводстве, уровень защищенности от столбняка был выше, чем у городского населения во всех возрастных группах. Напряжен-

ность антитоксического иммунитета, выявленная в реакции непрямой ге-магглютинации со столбнячным эритроцитарным диагностикумом, снижалась с увеличением возраста. Проведенная ревакцинация СА оказалась для взрослых эффективной и повысила уровень защищенности до 95100%.

В настоящее время специфическая профилактика столбняка должна осуществляться по двум направлениям: экстренная профилактика (при травмах с нарушением целостности кожных покровов и слизистых, обморожениях и ожогах любой степени, внебольничных абортах и родах, гангрене и некрозе тканей, проникающих ранениях желудочно-кишечного тракта, укусах животных) и плановая активная иммунизация. При использовании высококачественных бактерийных препаратов, правильном проведении прививок активная иммунизация против столбняка позволяет создать у большинства людей иммунитет высокой напряженности, который обеспечит защиту на срок не менее 5-10 лет. Анамнестическая реакция на СА сохраняется пожизненно, и в случае необходимости (при ранениях) титры антител могут быть восстановлены путем введения одной дозы СА [9]. В то же время известно, что уровень антитоксина в крови может быть подвержен различным колебаниям в зависимости от качества препарата, дозы, интервалов введения, состояния здоровья и возраста прививаемого, характера питания, сезона [74, 88, 95, 135,137].

Общепризнанным является использование для плановой активной иммунизации населения монопрепарата СА или его же, но в ассоциации с другими препаратами. Идея иммунизации ассоциированными препаратами принадлежит \¥1<М и Бюеагс! и была высказана ими еще в 1897 году. Создание АКДС-вакцины позволило иммунизировать детей сразу против трех инфекций: коклюша, дифтерии и столбняка. С 1964 года АКДС-вакцина начала широко и успешно применяться в СССР [51, 59]. Сроки проведения

плановых профилактических прививок против столбняка следующие. Первичная вакцинация АКДС-вакциной осуществляется с 3-5-месячного возраста трехкратно с интервалом 4-6 недель. Первую ревакцинацию проводят через 12-18 месяцев с последующими ревакцинациями через каждые 5-10 лет, используя или один адсорбированный СА, или же ассоциированные препараты [66].

Доказано, что продолжительность иммунитета после основного курса иммунизации сохраняется в течение 10 лет. Вот почему в настоящее время ставится вопрос о разработке более щадящих схем прививок как в отношении уменьшения доз препаратов, так и уменьшения их количества в ассоциации [148].

Зарубежными и российскими исследователями доказана возможность ревакцинации малыми дозами СА с хорошим иммунологическим эффектом [148]. В США и Канаде уже принято предложение о включении в календарь иммунизации проведение ревакцинации не ранее, чем через 10 лет. В России по-прежнему повторная ревакцинация проводится с коротким интервалом в 3-5 лет [29]. Для исключения возможных аллергических реакций при проведении прививок ослабленным детям и подросткам предложен АДС-М анатоксин с уменьшенным содержанием дифтерийного и столбнячного компонентов [30, 68].

В период резкого снижения инфекционной заболеваемости и активной разработки вакцин нового поколения чрезвычайно возрастают требования к качеству вакцинных препаратов и в первую очередь к их безвредности. Существующая в настоящее время система оценки вакцин не позволяет оценить их иммунологическую безвредность, т.е. степень их неспецифического воздействия на иммунную систему в целом. Публикации, посвященные этой проблеме, касаются в основном ограниченного числа вакцин из рекомендованных ВОЗ для широкого применения и затрагивают

лишь один-два показателя иммунного статуса или иммунологической реактивности без оценки состояния иммунной системы в целом [64, 71, 121, 139].

Борьба со столбняком является государственной задачей. В зависимости от социально-экономического состояния страны выбирается та или иная программа профилактики болезни. Однако, до сих пор в большинстве стран иммунизация против коклюша и столбняка является необязательной и проводится на добровольных началах [25].

Различные схемы иммунизации используются в 182 странах мира. Большинство стран вакцинацию детей проводят с трехмесячного возраста, в Дании - с 5-9 недель, в США - с 2-месячного возраста, в Сенегале и в Мали - с 4-х месяцев. Первичная ревакцинация осуществляется в разные сроки во всех странах, кроме Швеции. Вторая ревакцинация не проводится в Польше, Японии, Англии, Франции, Швеции, Италии, Дании, США и т.д. [5, 23].

Несмотря на то, что активная иммунизация СА или комбинированным препаратом ведет к развитию стойкого иммунитета, известны случаи заболевания столбняком у привитых [96, 120, 124]. По данным 1.Мазаг [114], в Словакии 6,7% больных столбняком в прошлом были иммунизированы, в Болгарии - 23,4% [42]. Работами Меренковой А.М. с соавт. [35] установлено, что у 33% заболевших столбняком уровень антитоксинов в крови был равен или превышал защитный.

По Российской Федерации удельный вес привитых среди заболевших составлял в 1970 г. - 11,7%, в 1973 г. - 18%, в 1976 г. - 25,5% [72]. Этот факт можно объяснить по разному. Особенности развития иммунного ответа связаны с возрастными и половыми различиями, состоянием здоровья в момент иммунизации, а в странах с жарким и тропическим климатом

имеет особое значение достоверность учета прививок и кратность их проведения.

Возможен слабый иммунный ответ даже на ревакцинацию. По данным Осовцевой О.И. [45], у 5% ревакцинированных титр антитоксина был ниже 0,01 МЕ/мл. Заболеваемость столбняком привитых детей в определенной степени зависит от снижения иммунитета под воздействием перенесенных острых инфекционных заболеваний, хотя, по некоторым данным, умеренная форма недостаточности питания африканских детей, зараженных малярией, заметно не влияет на уровень гуморального иммунитета в относительно короткие сроки после введения одной или двух доз вакцины [9].

Следовательно, каждый случай столбняка привитых требует тщательного эпидемиологического и серологического обследования для выяснения причин снижения иммунитета и принятия мер к изучению путей их преодолевания.

В развивающихся странах профилактика столбняка входит в общую программу борьбы с другими инфекционными заболеваниями: дифтерией, коклюшем, корью, полиомиелитом, туберкулезом, желтой лихорадкой. Однако, ее организация требует больших экономических затрат. Необходимы финансовые средства для производства вакцинных препаратов и их транспортировки. Важно также отметить, что в развивающихся странах отсутствует специальная служба, способная обеспечивать систематические прививки населения, а фактически проводятся лишь кампании по вакцинации. Решение всех этих вопросов зависит от санитарно-экономического состояния страны, уровня развития здравоохранения, наличия квалифицированного медицинского персонала. Усилия медиков должны быть направлены прежде всего на определение групп населения, подверженных риску заболеваемости столбняком. Для этого необходимо уточнить наибо-

лее неблагоприятные районы. Высокая заболеваемость столбняком новорожденных и рожениц в развивающихся странах диктует необходимость дальнейшего совершенствования родовспомогательных и детских медицинских учреждений, обязательного включения в группу риска женщин детородного возраста [73, 92].

Профилактика столбняка заключается и в предупреждении травматизма, криминальных абортов, родов на дому без медицинской помощи, борьбе с кожными инфекциями и глистными инвазиями, ритуальными надрезами кожи и обрезанием.

Одним из направлений работы ВОЗ является создание и проведение в жизнь Расширенной программы иммунизации (РПИ, Expanded programme on Immunization) населения против наиболее распространенных инфекционных болезней [104], которая была создана по решению 27-й сессии Всемирной Ассамблеи Здравоохранения (1974) в целях профилактики прежде всего дифтерии, коклюша, кори, полиомиелита, туберкулеза и столбняка.

Известно, что от этих инфекций в мире умирает до 5 млн. детей в возрасте до 5 лет, причем наибольшую смертность в развивающихся странах вызывают корь, коклюш, столбняк [24].

Таким образом, профилактика столбняка на африканском континенте имеет ряд особенностей, существенно зависит от социально-экономического уровня страны и характера организации медицинской службы. Только правильно организованная плановая профилактика от столбняка является единственно надежным способом защиты населения от этого заболевания.

1.4.Столбнячный токсин

Главным фактором патогенности Clostridium tetani, определяющим патогенез и клинику столбняка, является вырабатываемый им сильнейший экзотоксин. Смертельная доза его для человека составляет менее 2 нг/кг массы тела. Экзотоксин включает в себя две фракции - тетаноспазмин (ТС) [нейротоксин] и тетанолизин (токсин разрушающий эритроциты). Те-танолизин выделяется из клеток с первых дней развития культуры с помощью механизма активного транспорта. ТС через клеточную стенку кло-стридий не проходит, а выделяется в культуральную жидкость лишь при распаде микробных клеток, главным образом, в фазе их ускоренной гибели, поэтому он накапливается в бульонной культуре к 5-7 дню инкубации. ТС синтезируется внутриклеточно в виде неактивного протоксина - одно-цепочечного полипептида, имеющего молекулярный вес 150 кД. Превращение протоксина в активный нейротоксин происходит после лизиса микробной клетки и осуществляется бактериальной протеазой, которая разрезает полипептид на дву части. Активный внеклеточный ТС состоит из двух связанных между собой дисульфидными связями фрагментов: легкого (около 50 кД) и тяжелого (около 100 кД) [24].

1.4.¡.Получение нейротоксина, его характеристика и структура

В последние 15-20 лет разработаны методы выделения ТС, получены данные о его структуре, фрагментах, образующихся при диссоциации и ограниченном протеолизе, молекулярных механизмах взаимодействия ТС и его фрагментов с нейронами.

В настоящее время внимание исследователей привлекают причины высокой токсичности ТС, а также механизм его действия.

ТС - простой белок, продуцируемый Clostridium tetani [17, 20, 28, 140, 144]. Его извлекают из клеток, находящихся в логарифмической фазе,

или из фильтратов более старых культур. ТС выделяют из клеток в виде одноцепочечиого полипептида, а из фильтратов - в форме "надкусанного" белка, образующегося в результате ограниченного протеолиза полипептидной цепи собственными протеазами. В культуральном фильтрате наряду с ТС были найдены три протеазы, одна из которых вызывает ограниченный его протеолиз [17, 20, 101]. В сводках методов получения ТС в чистом виде показано, что токсичность очищенных препаратов равна (8-48)х106 БЬт/мг белка в опытах на мышах. Из клеточного экстракта был получен ТС с наибольшей удельной активностью 104x106 БЬт/мг белка.

Из последних публикаций следует отметить способ выделения гомогенного при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) ТС с помощью градиентной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и последующей

гель-фильтрации на колонке с ультрагелем АсА-34 [140]. Для очистки ТС, 1

меченного I, применяют аффинную хроматографию на колонке из си-наптосом мозга крыс, ковалентно связанных с ацетилцеллюлозой [97]. Оказалось, что высокоочшценный ТС, а также 1251- ТС разделяются на сферазил-ДЭАЭ-декстранполисиалганглиозидных колонках на две фракции. Обе они имеют одинаковую антигенность и токсичность, но одна из них слабее связывается с ганглиозидами, синаптосомными препаратами, нейронами [109,110].

Для выделения интактного ТС и его фрагментов был использован препаративный электрофарез в ПААГ. Чтобы сохранить нативность ТС при очистке, целесообразно подавить активность эндогенных протеаз [85]. Показано, что одноцепочечный ТС можно выделить из молодых бактериальных клеток. В фильтратах же обнаруживаются, главным образом, "надкусанные" молекулы и отчасти субъединицы [86]. Описан быстрый и простой метод получения гомогенного ТС из бактериальных клеток, в ко-

тором наряду с улътрацентрифугированием применена высокоэффективная жидкостная хроматография [119].

Молекулярная масса ТС, определенная с помощью ульрацентрифу-гирования, электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия и гель-фильтрации, равна 150 кД. Следует отметить, что в ряде случаев значения, получаемые исследователями, отличаются друг от друга вследствие агрегации и фрагментации молекул ТС [17, 20, 76, 132, 144]. В молекуле ТС найдено шесть свободных SH-групп и две дисульфидные связи. В зависимости от применяемых сульфгидрильных и денатурирующих агентов в ней обнаруживают от 3 до 10 полуцистиновых остатков [78, 79].

Экстрагированный из клеток ТС при обработке диэтилтриэтолом в растворе мочевины обратимо диссоциирует на два антигенно различных полипептидных фрагмента с молекулярной массой ~53 кД и ~107 кД. До диссоциации эти фрагменты связаны между собой дисульфидным мостиком [115, 117]. Helting T.B. и соавторы [100] рассмотрели условия препаративного выделения фрагментов ТС.

Данные о N-концевых аминокислотных остатках внутриклеточного и экстрацеллюлярного ТС весьма противоречивы. Установлено, что в молекуле ТС имеется несколько пептидных связей, чувствительных к расщеплению эндогенными протеазами. Вследствие этого при частичном проте-олизе возникает молекулярная неоднородность ТС. Показано, что в одно-цепочечном ТС N-концевой аминокислотой является пролин, а в "надкусанном" - пролин, аспарагин, серин и несколько минорных аминокислот: треонин, аланин и др. Пролин является N-концевой аминокислотой фрагмента массой 53 кД, остальные - N-концевыми аминокислотами тяжелого фрагмента [86,118,130, 140].

Аминокислотный состав ТС, определенный в различных лабораториях сходен [79]. По данным Dimari S.J. и соавторов [85], ТС содержит в

своем составе 880 аминокислот. По другим данным в молекуле ТС насчитывается до 1320 остатков.

Установлена последовательность ДНК, содержащая одну рамку считывания, которая кодирует белок с молекулярной массой 150,494 кД [89]. Одновременно в другой лаборатории также на основании идентификации нуклеотидной последовательности ДНК определена сходная аминокислотная последовательность ТС, состоящего из 1315 аминокислот с массой 150,7 кД [83]. Сравнение N-терминальных последовательностей фрагментов ТС с частичной последовательностью соответствующих цепей ботули-нических токсинов типов А, В и Е указывает на их гомологию.

Пространственная ультраструктура кристаллов ТС изучена оптическим дифракционным анализом микрофотографий, полученных в электронном микроскопе. Кристаллический ТС, имеющий вид тонких пластинок, по аминокислотному составу , иммунологическим свойствам, токсичности сходен с ТС, выделенным и очищенным с применением хромато-графических колонок. Токсичность кристаллического препарата равна 10x106 DLm/мг бежа [83].

Из спектров кругового дихроизма (КД) высокоочшценного ТС следует, что молекула построена из а-(20%) и ß-спиралей (23%) и апериодич-ных структур (57%), образующих стабильную третичную конформацию [131]. КД-спектры внутри- и внеклеточного ТС подобны, что свидетельствует об отсутствии конформационных изменений в процессе ограниченного протеолюа. При получении фрагментов ТС в них происходит конфор-мационная перестройка, в результате чего в субъединицах изменяется микроокружение ароматических групп [118,131].

Электрофорез ТС, проведенный с детергентом и без него, показывает, что ТС и его легкий фрагмент мигрируют как гидрофильный белок. Тяжелый фрагмент, видимо, имеет на поверхности молекулы гидрофобные

области, что способствует ее растворению в липидной мембране и взаимодействию лигандов с рецепторами [143].

1.4.2. Фрагментация ТС

При протеолитическом действии папаина на ТС были получены фрагменты В и С, обладающие различным биологическим действием. Фрагментом С (молекулярная масса 47 кД) был назван участок, начинающийся с С-конца, который образуется после ограниченного протеолиза [80]. Он обладает антигенными и иммуногенными свойствами, стимулирует образование нейтрализующих ТС антител, не токсичен. Фрагмент В (молекулярная масса 95 кД) - двухцепочечный полипептид, который содержит Ь-цепь, связанную дисульфидным мостиком примерно с половиной Н-цепи, начиная с Ы-конца. Он почти не токсичен и серологически отличен от фрагмента С.

Из замороженного ТС, в котором под воздействием эндогенных про-теаз прошел гидролиз, был выделен фрагмент В-ПЬ с молекулярной массой 46 кД. Он дает единственную полосу в ПААГ с додецилсульфатом натрия и по своим свойствам подобен фрагменту С [80]. При мягком протео-лизе ТС трипсином получен фрагмент рь также серологически идентичный и близкий по другим свойствам фрагменту С [116]. После гидролиза кристаллического ТС субтилизином выделен нетоксичный фрагмент Б (молекулярная масса 50 кД), соответствующий, вероятно, фрагменту С [134]. При гидролизе ТС папаином в условиях несколько иных, чем описано НеШп^ Т.В. и соавторами [103], был изготовлен атоксический фрагмент II (молекулярная масса 59 кД). Фрагмент II состоит из двух полипептидных цепей, соединенных -Б-Б-связью и, по-видимому, представляет часть фрагмента В [129]. КД-спектр фрагмента П отличается от КД-

спектра ТС. Фрагмент состоит в значительной степени из (3-структур и почти не содержит Ь-спиралей.

Фрагменты, полученные после ограниченного гидролиза ТС папаи-ном, внутриклеточными протеазами, трипсином, химотрипсином, были охарактеризованы серологически методом иммуноблоттинга с помощью моноклональных антител кЬ-и Н-цепям, фрагменту С (РО и комплиментарной части (Рг) тяжелой цепи [94]. Оказалось, что наиболее однородно протекает ограниченный протеолиз ТС при действии папаина. При гидролизе химотрипсином, а также трипсином получаются не воспроизводимые результаты.

Исследователи неодинаково обозначают фрагменты ТС даже изготовленные в сходных условиях, а поэтому предложено унифицировать их номенклатуру: легкий фрагмент обозначить как фрагмент А, тяжелый -как фрагмент ВС, фрагмент В - фрагментом А-В, сохранив прежнее обозначение фрагмента С [128].

При изучении действие пепсина при рН 3,0 -7,2 на меченные 1251 ТС и фрагменты В и С в присутствии искусственных азолектиновых везикул, установлено, что только в присутствии липидов не гидролизуются полипептиды с молекулярной массой 27, 21 и 15,5 кД [128]. Первые два идентифицированы как часть фрагмента В, последний полипептид представляет собой часть фрагмента С, образовавшегося в результате воздействия пепсина. Липидные везикулы не защищают фрагмент А от протеолиза. Эти данные следует учитывать при рассмотрении транспорта ТС в везикулах в процессе эндоцитоза в эукариотические клетки.

1.4.3. Взаимодействие ТС с рецепторами и физиологическая роль

фрагментов ТС

О механизме действия ТС известно очень мало. Многоэтапность процесса интоксикации ТС выявлена in vitro, например, на нервно-мышечном препарате диафрагмы мыши [136]. Установлено, что интоксикация происходит по крайней мере в три стадии: связывание, транслокация и паралич.

Фрагменты молекулы ТС, полученные восстановительной диссоциацией и ограниченным протеолизом, охарактеризованы по их антигенным, иммуногенным, ферментативным свойствам и токсичности. Исследовано участие отдельных доменов молекулы в процессе интернализации ТС нейронами: в связывании их с ганглиозидами, синаптосомами, культурой ткани мозга, в создании пор (каналов) в мембранах везикул после опосредованного эндоцитоза токсина в клетки.

Установлено, что фрагменты А и ВС серологически отличаются друг от друг а. Фрагмент С имеет общие детерминанты с ВС-фрагментом на участке С-конца полипепгидной цепи. Эпитопы фрагмента С не идентичны эпитопам фрагмента ((32). Фрагмент АВ реагирует с антителами к фрагменту А или фрагменту р2, но не дает реакции преципитации с антителами к фрагменту С [80, 94, 98, 106, 116, 117, 134, 142]. Фрагменты А и ВС практически нетоксичны. После смешивания нетоксичных растворов препаратов цепей наблюдается реассоциация молекулы ТС и восстановление токсичности [116]. Фрагмент В при введении мышам в количестве в 10 тысяч раз большем, чем смертельная доза ТС, оказался нетоксичным [134]. Доза фрагмента, которая необходима, чтобы убить мышь (~200 мкг белка), была на несколько порядков больше, чем доза ТС (-0,08 нг). У животных никогда не наблюдались конвульсии, спастический паралич, характерный для столбняка, а отмечалось затруднение дыхания, потеря в

весе, сокращение мускул живота, спастический паралич лап и, наконец, смерть. Антитела к фрагменту С не преципитируют фрагмент В, а потому не способны влиять на его действие. Антитела к фрагменту В защищают мышей от интоксикации при одновременном введении сыворотки и препаратов фрагмента. Helting Т. В. и соавторы [102] полагают, что следовые количества ТС в препаратах фрагмента В не могут вызывать такое патологическое действие. Антитела к фрагменту С нейтрализуют ТС при введении его мышам [134]. Токсичность ТС и его фрагментов равна (DL м/мг белка: ТС -30000000; ВС - фрагмента >2200; А - фрагмента <250; фрагмент В-5; фрагмент С<0,1 [100].

Титр антител к фрагментам В и С зависит от вида животного [100]. У мышей оба фрагмента вызывают более интенсивный ответ, чем у морских свинок. При совместном введении фрагментов образуется больше антител, чем при иммунизации эквивалентным количеством анатоксина.

Общеизвестно, что столбнячный анатоксин вызывает образование антител у человека и животных. Однако ранее считалось, что сыворотка иммунизированных людей не содержит антител к А - фрагменту ТС. Им-муноферментным методом удалось показать наличие в сыворотках крови людей антител к А - фрагменту, которые, по-видимому, наряду с другими антителами играют существенную роль в защите от ТС при столбняке [111].

Успехи в изучении структуры ТС и фрагментов его молекулы, образующихся при ограниченном протеолизе и восстановительной диссоциации, создают предпосылки для выяснения молекулярных механизмов интоксикации животных и человека. Получение функционально активных доменов ТС открывают возможности разработки новых лечебных, профилактических и других препаратов, в частности, нейтрализующих, диагностических, антирецепторных мАТ; вакцин со сниженной реактивностью и

конкуренцией антигенов; фрагментов, синтезируемых штаммами Escherichia coli , в плазмиды которых включены части ДНК Clostridium tetani, кодирующих их синтез.

1.4.4. Способ получения CA

Технологические схемы производства CA регламентируются и контролируются ВОЗ и с незначительными вариантами используются в большинстве стран мира с 30 - х годов [127, 145].

Как известно, для получения CA используют токсинсодержащий фильтрат Clostridium tetani штамма Копенгаген 471.

Суммарно стандартная технология получения CA включает несколько основных стадий [146].

1. Обезвреживание нативного токсинсодержащего фильтрата формалином в течение 2 суток.

2. Осаждение фракции частично обезвреженного ТС в изоэлектри-ческой точке.

3. Дообезвреживание частично обезвреженного ТС при 37°С в течение 18 суток.

4. Стерилизацию, проверку на реверсию, определение специфической активности.

Обработка токсинсодержащих фильтратов на стадии частичного обезвреживания токсина формалином в основе своей преследует решение 2 главных задач:

1 .Проведение полной детоксикации молекулы ТС при сохранении ее антигенных свойств в условиях, обеспечивающих относительную однородность реакционной фазы. Способ Рамона, предложенный в 1923 г. [123] и основанный на формалинизации ТС в течение длительного времени при 37°С, хотя и применяется практически без изменения до сего

дня на ряде производств, но не предусматривает соблюдения этого условия.

Горфункель-Кошкина Д.М. и Воробьева Н.Д. [12] предложили ускорить процесс детоксикации. По разработанному способу к нативному ТС добавляют 0,5% формалина и выдерживают 4-5 суток при 37°С и 2-3 суток при 30°С. Далее ТС прогревают 20-25 минут при 60-62°С.

2. Очистку СА и достижение величины удельной антигенной специфической активности препарата, оговоренной требованиями ВОЗ.

Необходимо напомнить, что ТС представляет единую полипептидную цепь олигомера с молекулярной массой -150 кД.

Кроме этого культуральный фильтрат может содержать:

1 .Продукты автолиза биомассы.

2.Токсическую фракцию гемолизинов.

3.Остатки полипептидов питательной среды.

4.Продукты протеолиза ТС.

В процессе обезвреживания формалином и переосаждения возможна полимеризация фракции СА до конгломератов с молекулярной массой (Мм) более 300 кД.

Таким образом нативный препарат СА представляет гетерогенную смесь биополимеров в диапазоне Мм от > 300 до < 1кД.

1.5. Методы очистки С А

Освобождение СА от азотсодержащих и других низкомолекулярных примесей повышает удельную специфическую активность препарата, облегчает его стандартизацию и позволяет снять общественное напряжение в связи со случаями аллергических реакций при вакцинациях, которые как известно, ассоциируются в массовом сознании с плохим качеством прививочных препаратов [125].

Известно, что в производственных условиях возможна полимеризация фракции С А до конгломератов с молекулярной массой более 300 кД, и что такой препарат является высокоиммуногенным и более эффективным для ревакцинации с использованием жидкой (неадсорбированной) лекарственной формы [75, 107].

В мировой практике общая технология очистки анатоксинов строится по следующим принципам:

Разделение по размеру:

- диализ

- ультрафильтрация - концентрирование

- гель-хроматография

Разделение по заряду:

- ионный обмен

- изоэлектрическое осаждения

- изоэлектрофокусирование

Разделение по другим факторам:

- высаживание сульфатом аммония, сульфатом магния, гексамета-фосфатом натрия;

- осаждение спиртами

Специальные методы очистки:

- афинная хроматография на специфических рецепторах

- иммунноафинная хроматография

Спектр методов очистки анатоксинов широко представлен в литературе. Так B.Bizzini с соавторами очищали СА с использованием колонок, заполненных гелем Sephadex G-200 и Biogel ASM [77, 81]. S. Heyningen использовал как гель-хроматографию на Ultragel AsA-34, так и ионнообменную хроматографию на ДЭАЕ-целлюлозе [105]. Описаны также последовательные методы переосаждения сульфатом аммония при

определенных значениях рН и ультрафильтрации на половолоконных ультрафильтрах с пределом исключения 10000 Д [87, 126].

Очистку препарата проводят как на стадии частично обезвреженного, так и дообезвреженного анатоксина, и хотя, на сегодняшний день аргументы в пользу очистки на стадии концентрированного дообезвреженного анатоксина выглядят убедительней [99]: (- белковые молекулы более стабильны; - риск реверсии минимален; - формальдегид препятствует контаминации в процессе очистки; - возможность работать с малыми объемами), опыт использования в качестве полупродуктов для очистки анатоксинов на стадии частичного обезвреживания убеждает, что и в этих случаях получаются стабильные по антигенным свойствам и не подверженные реверсии анатоксины.

В России стандартная технология разрабатывалась в 40-х годах в ряде институтов. Затем в разные годы в развитие производства столбнячного анатоксина внесли свой вклад Воробьев А.А., Закгейм Д.А., Голдшмидт В.К. и другие [56]. С тех пор технология этого производства кардинальным изменениям в своей основе не подвергалась. Однако, в дополнение к действующей нормативно-технической документации постоянно проводились исследования по усовершенствованию этапов очистки анатоксина [60 ]. Поликаром А.Ч., Далиным М.В. и соавторами запатентован способ повышения удельной специфической активности СА с использованием плоских мембран типа В1айо [14]. В работах Огняно-вой М. О. (1974г.) показана возможность использования ионнообменной хроматографии [44]. Перепечкиной Н.П. продемонстрирована принципиальная возможность использовать половолоконные ультрафильтры для фракционирования СА [48].

1.5.1. Характеристика метода мембранной диафильтрации для

очистки С А

В последние десятилетия метод диафильтрации зарекомендовал себя, как надежный, эффективный и экономичный способ молекулярного разделения и очистки широкого спектра биополимеров. Разработка новых фильтрующих материалов с контролируемым размером пор и увеличение производительности рабочих модулей позволили использовать диафильтрацию (наряду с гель- и ионнообменной хроматографией, переосаждением, градиентным сепарированием и т.д.), как один из универсальных методов получения высокоочищенных биопрепаратов и совершенствования технологии уже существующих схем производств.

В ряду диафильтрационных мембран особое место занимают полые волокна, в которых роль разделителя выполняют стенки волокна с эффективным размером пор 0,001 - 0,1 мкм. Аппаратура на полых волокнах выгодно отличается простотой конструкции, развитой поверхностью фильтрации, малой материалоемкостью, компактностью, отсутствием застойных зон, меньшей степенью явлений концентрационной поляризации, облегченной сменой фильтров [1].

Однако, многие годы распространение этого метода в медицинской и микробиологической промышленности сдерживалось отсутствием как высокоэффективных диафильтров отечественных марок, разрешенных к применению в этих отраслях, так и соответствующих аппаратурных модулей.

В начале 90-х годов НПО "Химволокно" (г. Мытищи) и организованная на его базе научно-производственная фирма "МемТекс" разработали и наладили выпуск половолоконных диафильтров серии ВПУ, получаемых на основе ароматического полиамида марок ВПУ-15, ВПУ-

50, ВПУ-100 с соответствующими номинальными пределами разделения биополимеров в килодальтонах [1].

В 1993 году в результате работ по совершенствованию таких ультрафильтров появились новые модифицированные половолоконные модули ВПУ(МВ)-15М, ВПУ-50М и ВПУ-ЮОМ. В качестве модифицирующего (композиционного) слоя в них был использован природный полисахарид - декстран, который обладает высокой химической стойкостью, гидрофильностью и инертностью по отношению к белкам [1, 13].

Предварительные испытания, показали, что модифицированные диафильтры серии ВПУ-М имеют пониженную сорбционную активность поверхности, позволяют с большей скоростью и стабильностью разделять биополимеры и легко регенерируются [15].

При производстве очищенного концентрированного СА не редки случаи, когда итоговые серии не соответствуют требованиям ВОЗ по показателям специфической активности, которые составляют для столбнячного анатоксина - 1000 ЕС/мг белкового азота. В таких ситуациях рекомендуется прибегать к дополнительной очистке.

В 1974-1975 годах на предприятии "Биомед" им. И. И. Мечникова проводились исследования по применению метода диафильтрации для дополнительной очистки СА. Было показано что таким путем можно повысить удельную активность некондиционных серий до показателей, требуемых ВОЗ. Авторы запатентованного в то время способа располагали только плоскими мембранами типа В1айо: ХМ-300, ХМ-100, РМ-30 и РМ-3, с соответствующими эксклюзионными пределами [16 ]. Однако, мембраны и установки этого типа, как известно, не обладают свойствами, необходимыми для ведения процессов диафильтрации в промыш-

л

ленных масштабах ( небольшая, порядка 150 см площадь фильтрации, явления концентрационной поляризации, малый объем диафильтраци-

онных ячеек).

В 1994 году Ермолаевым А.В. и соавторами [20] был разработан способ получения полимерной и олигомерной фракций СА предусматривающий их освобождение от антигенно-неактивных примесей методом ультрафильтрации на полых волокнах на основе полиметафенилентеизоф-таламида с содержанием концевых карбоксильных групп -(6,2 - 14,8) хЮ"5 г/моль/г, модифицированное декстранами с молекулярной массой 50-500 кД и эпоксидной смолой (УАВ-0,2 100 м), после чего дополнительно очищают полимерную фракцию диафильтрацией через мембрану на основе полиакрилонитрила с эксклюзионным пределом до 300 кД.

Известен способ разделения СА, полученного при культивировании Clostridium tetani штамма Колле, позволяющий в некоторых случаях получать необходимую удельную активность во фракции концентрата ХМ-300 (молекулярная масса 300 кД).

Однако, воспроизведение такого способа диафильтрационной очистки СА из фильтрата культуры Clostridium tetani штамма Копенгагена, выращенного на отличающихся питательных средах, не привело к достижению желаемого результата.

Этой цели удалось, однако, достигнуть путем выделения полимерной и олигомерной фракций СА способом двухступенчатой диафильтра-ции с использованием мембран в виде полых волокон, на первой стадии на основе полиметафенилентереизофталамида модифицированных декстранами с молекулярной массой 50-500 кД и эпоксидной смолой, на второй -на основе полиакрилонитрида с эксклюзионным пределом до 300 кД.

Таким образом, мембранное разделение является наиболее технологичным и доступным для освобождения препаратов от неспецифических примесей

1.5.2.Очистка СА с помощью гель-фильтрации.

Очистка анатоксинов возможна с помощью гель-фильтрации, которая обеспечивает разделение веществ в соответствии с размерами их молекул. В 70-е годы опубликовано значительное количество работ по изучению фракционного состава С А [11, 18, 61, 82, 108]. Было показано, что эти препараты неоднородны, при этом высокомолекулярные белки являются иммуногенными, а низкомолекулярные белки - неактивны [65]. Предлагались способы очистки анатоксинов, позволяющие получать препараты с удельной активностью до 2000 единиц связывания на 1 мг азота [21, 22]. В дальнейшем публикаций, посвященных этой проблеме, не было. Выпускаемые в настоящее время препараты существенно различаются по иммуногенным свойствам и степени очистки.

Рунова В.Ф. и соавторы [57, 58] провели сравнительное изучение фракционного состава СА, приготовленных различными предприятиями России, оценку их химического состава и специфической активности отдельных фракций с целью последующего выпуска более очищенного СА, близкого по структуре к молекулярно-однородным препаратам.

С помощью гель-хроматографии на ультрагеле АсА-34 был изучен фракционный состав СА, производимых тремя предприятиями страны: НПО "Иммунопрепарат" (Уфа), НПО "Биомед" (Пермь), НПО "Биомед" (Москва). Результаты исследований показали, что эти препараты гетеро-генны и содержат 2 или 3 основные фракции, четко разделяющиеся при гель-фильтрации в зависимости от их молекулярной массы: первая фракция с молекулярной массой порядка 600 кД (Пермского и Московского предприятий); содержание 3-й фракции, не обладающей специфической активностью, с молекулярной массой 9-12 кД, значительно колебалось в зависимости от места производства (наибольшее содержание неактивной

фракции было в сериях СА, изготовленных Московским предприятием (39-72%)); основная фракция СА (вторая фракция), обладающая специфической активностью для Пермского и Уфимского предприятия составила 77-93%, в препаратах, выпущенных Московским предприятием, она находилась в пределах 24-58%. Вторая фракция в зависимости от места производства и испытанных серий более или менее четко разделялись на 2-3 подфракции (А,Б,В), каждая из которых обладала специфической активностью. Так, фракция 2А СА всех 3 предприятий содержала 10-20 ЕС/мл и 0,08-0,12 мг/мл белка. Фракция 2В характеризовалась незначительным увеличением концентрации белка и специфической активностью по сравнению с фракцией 2А. Таким образом, увеличение белка во фракциях сопровождалось повышением специфической активности.

Исходя из вышеизложенного следует, что метод гель-фильтрации может быть использован для оценки качества СА и очистки препаратов от неспецифических веществ.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2Л. Материалы

2ЛЛ. ТС и CA

2.1.1.1. ТС - отраслевой стандарт, содержащий L+ (вытитрованный к 0,1 ME) использовали для определения удельной антигенной активности (нагрузки) CA (ЕС/мг белкового азота).

2.1.1.2. CA - отраслевой стандартный образец (ОСО), содержащий 32 МИЕ в 1 мл (в основном разведении), применяли как референс-препарат для исследования иммуногенной активности CA.

2.1.1.3. 17 производственных серий CA [17], полученных на предприятии АО "Биомед" по регламентной технологии из токсинсодержа-щих фильтратов Clostridium tetani штамма Копенгаген 471. CA имели по удельной специфической активности нагрузку менее 1000 ЕС/мг белкового азота и не удовлетворяли требованиям ФС и ВОЗ.

2Л.2. Сыворотки

2.1.2.1. Стандартная лошадиная противостолбнячная сыворотка ГИСК им. Л.А. Тарасевича, содержащая 4 МБ в 1 мл, применялась для титрования при определении антигенной активности CA в реакции антитоксинсвязывания и в РПГА для исследования иммунизирующей активности CA (в опытах на морских свинках) [36] и контроля эритроцитарных столбнячных диагностикумов.

2.1.2.2. Нормальная кроличья сыворотка (НКС) использовалась в качестве поддерживающей среды (1%) в реакции агглютинации латекса (РАЛ).

2.1.2.3. Для изучения специфичности и чувствительности эритро-цитарных диагностикумов на основе молекулярно-однородных фракций препарата СА использовали 9 сывороток морских свинок, иммунизированных стандартным препаратом СА.

2.1.3. Диагностикумы

2.1.3.1. Диагностикум эритроцитарный, столбнячный, антигенный жидкий - стандартный коммерческий препарат, выпускаемый АО "Биомед" им. И.И. Мечникова использовали в РПГА с исследуемыми сыворотками морских свинок.

2.1.3.2. Эри троци тарные и латексные диагностикумы, приготовленные нами на основе молекулярно-однородных фракций препарата СА.

Для приготовления эритроцитарных диагностикумов в качестве носителя использовали 50% формалинизированные эритроциты.

При изготовлении латексных диагностикумов в качестве носителя антигенов использовали окрашенные жирорастворимыми красителями полистирольные суспензии с диаметром частиц 2,0 мкм, содержащие на своей поверхности реакционноспособные эпоксидные группы.

Работу по синтезу полимерных микросфер проводили на кафедре синтеза полимеров МАТХТ им. М. В. Ломоносова.

2.1.4. Лабораторные животные

2.1.4.1. Белые беспородные мыши массой 15-17 грамм в количестве 1000 голов использовались для исследования иммуногенных свойств и определения удельной антигенной активности СА.

2.1.4.2. Морские свинки массой 300-350 грамм в количестве 50 голов использовались для определения иммунизирующей и ревакцинатор-

ной активности СА (по динамике накопления специфических АТ в сыворотке животных).

2.1.5. Буферные растворы, реагенты, хроматографнческие носители

2.1.5.1. Фосфатно-солевые буферные растворы (ФСБ) с различными значениями рН. Готовили раствор калия фосфорнокислого одно-замещенного (КН2РО4) концентрацией 1/15 моль/л. Для этого навеску 9,078 г растворяли в 1 л дистиллированной воды. Таким же образом готовили раствор натрия фосфорнокислого двузамещенного (Na2HP04x2H20) концентрацией 1/15 моль/л. Навеску 11,876 г растворяли в 1 л дистиллированной воды. Для получения фосфатно-буферных растворов с определенными значениями рН смешивали раствор Na2HP04 х2Н20 и КН2Р04 в следующих соотношениях:

рН 8,0+0,1 - 0,947 л и 0,053 л соответственно;

рН 7,2±0,1 - 0,720 л и 0,280 л соответственно;

рН 6,4+0,1 - 0,320 л и 0,680 л соответственно. К полученным растворам добавляли равный объем 0,85%-ного раствора натрия хлорида (NaCl).

2.1.5.2. Глицино-солевой буферный раствор (рН 7,8±0,1). Навеску глицина 7,505 г и навеску натрия хлорида 5,85 г растворяли в 1 л дистиллированной воды. РН коррегировали до 7,81+0,1 раствором натрия гидроокиси концентрацией 0,1 Моль/л.

2.1.5.3. Фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий бычий сывороточный альбумин (БСА) и НКС (рН 8,1±0,1) - поддерживающая среда для постановки РАЛ. К 100 мл ФСБ добавляли 1 мл НКС и 50 мг БСА.

2.1.5.4. Фосфатно-солевые буферные растворы с теином и без теина, входящие в комплект стандартного коммерческого препарата -диагностикума эритроцитарного столбнячного антигенного жидкого, использовали в РПГА.

2.1.5.5. Раствор азида натрия в конечной концентрации 0,05% использовали в качестве консерванта.

2.1.5.6. Бычий сывороточный альбумин коммерческий препарат фирмы Serva, использовали как калибрант для определения белка методом Лоури и в качестве поддерживающей среды (0,05 %) в РАЛ.

2.1.5.7. Хроматографические носители: 1) TSK-GEL TOY-OPEARL, марки HW-60 (Япония); 2) Sephadex G-200 - коммерческий препарат фирмы Pharmacia Fine Chemicals.

2.1.6. Оборудование

Для диафильтрации использовали установки АУФ нижегородского завода НИЦ "Биоавтоматика" укомплектованные половолоконными диафильтрационными колонками (картриджами) Мытищенского предприятия "Химволокно" и диафильтрационные системы Amicon (4 аппарата емкостью 2 литра каждый), укомплектованные плоскими мембранами фирмы Diaflo (США) марки ХМ-300 с эксклюзионным пределом 300 кД.

Анализ фракционного состава осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе HPLC модели 3500 фирмы Spectra Phisics (США), укомплектованном колонками Ultropack TSKG 3000 (голубых) фирмы LKB (Швеция) с эффективным диапазоном разделения белковых молекул от 1 до 300 кД.

Получение молекулярно-однородных препаратов осуществляли методом эксклюзионной хроматографии на колонках с гелями TSK-GEL

ТОУОРЕАКЬ и 8ерЬаёех 0-200. Отбор фракций выполняли на автоматическом коллекторе фракций Б1а&ас 0-002. Оптическую плотность на выходе элюента из колонки регистрировали на приборе 1Мсогс1 -III (ЬКВ, Швеция).

Концентрирование препаратов осуществляли в ячейках Атшсоп на мембране Б1аАо марки 11М-05.

Оптическую плотность при анализе препаратов на содержание в них белка определяли на фотоколориметре модели КФК-2МП.

Спектрофотометрию осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-46.

2.2. Методы

2.2.1. Диафильтрация

Установки АУФ-0,1 нижегородского завода НИЦ "Биоавтоматика" укомплектованные половолоконными диафильтраци-онными колонками (картриджами) Мытищенского предприятия "Химволокно" использовались в процессе диафильтрации по нескольким отработанным схемам, представленным в Главе 3.

Установка позволяет проводить процесс диафильтрации при постоянном заданном давлении, величина которого поддерживается автоматически.

Автоматическое отключение насоса при отклонении давления от заданного значения более чем на 30% (при разрыве соединительных шлангов или окончании процесса фильтрации) осуществляются при заданном значении поддерживаемого давления от 0,02 до 1,5 МПа. Общий вид установки и ее основных узлов представлен на рисунке 2.2.1.

Рис.2.2.1. Автоматизированная установка для мембранной фильтрации АУФ-0,1

Выделение очищенных высокомолекулярных фракций СА проводили по схеме, представленной в Главе 3, на диафильтранионных системах Апнсоп (4 аппарата емкостью 2 литра каждый) укомплектованные плоскими мембранами фирмы Б1аАо (США) марки ХМ-300 с эксклюзионным пределом 300 кД.

2.2.2. Снектрофотометрия

Контроль за эффективностью процесса мембранного диализа (отмывок препаратов ) осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-46 при длине волны 280 нм. Для каждой серии препарата строили кривые мембранного диализа, отражающие динамику падения концентрации диализабельиых компонентов в фильтрате в зависимости от кратности отмывок,

2.2.3. Хроматография

Анализ фракционного состава исходных СА и очищенных препаратов проводили методом ВЭЖХ.

Фракционирование проводили на приборе ВЭЖХ (HPLC) модели 3500 В фирмы Spectra Phisics (США), укомплектованном колонками Ultropack TSKG 3000 (голубых) фирмы LKB (Швеция) с эффективным диапазоном разделения белковых молекул от 1 до 300 кД. В качестве элюента использовали 0ДМ фосфатный буфер рН 7,2 с 0Д5М раствором NaCI и 0,1% азида натрия. Скорость протока составляла 0,55 мл/мин с давлением в колонке р-ЗО атм. Оптическая плотность определялась автоматически при длинах волн 254 и 280 нм. Для построения калибровочной кривой (график зависимости молекулярной массы от объема собранного элюента) использовали коммерческий набор высокоочищен-ных калибрантов, состоящих из голубого декстрана, тириглобулина, альдолазы, бычьего сывороточного альбумина, овальбумина, химот-рипсиногена А и витамина Bi2, с молекулярными массами соответственно 2 тыс., 669, 158, 67, 43, 25 и 1,3 кД. Калибровочная кривая представлена на рисунке 2.2.2.

Рис.2.2.2. График зависимости объема элюента в ВЭЖХ от молекулярной массы калибрантов

Получение молекулярно-однородных препаратов осуществляли методом эксклюзионной хроматографии [46] на колонках с гелями TSK-GEL TOYOPEARL и Sephadex G-200. Колонки уравновешивали 0,9%-ным раствором NaCl pH 7,2, содержащим 0,02% азида натрия. Элюцию проводили тем же раствором. Скорость элюции составляла 8 мл/час. Во всех вариантах на колонку наносили одинаковое количество материала 0,8-1,2 мкг по белку.

Отбор фракций выполняли на автоматическом коллекторе фракций Diafrac D-002.

Оптическую плотность на выходе элюента из колонки регистрировали на приборе Uvicord -III при длине волны 280 нм.

Калибровку колонок по молекулярной массе осуществляли, используя коммерческий набор высокоочищенных калибрантов, состоящий из голубого декстрана, ферритина, каталазы, альдолазы, бычьего сывороточного альбумина, химотрипсиногена А, цитохрома С и витамина В12, молекулярные массы которых составляют 2000, 440, 240, 158, 67, 25, 12,5 и 1,3 кД соответственно.

Препараты концентрировали в ячейках Amicon на мембране Diaflo марки UM-05.

2.2.4. Определение белка

Определение количества общего белка во всех исследуемых препаратах осуществляли микрометодом по методу Лоури [112]. Калибровочные графики строили по бычьему сывороточному альбумину. Оптическую плотность определяли на КФК-2МП при длине волны 750 нм, кюветы 5,08 мм (рис.2.2.3).

Все взятые в работу препараты при проведении последующих исследований уравнивали по содержанию в них белка.

Рис.2.2.3. Калибровочный график определения общего белка методом Лоури (по БСА)

2.2.5. Иммунохимическая характеристика препаратов

Антигенные свойства препаратов и выделенных фракций оценивали в реакции двойной диффузии (РДД) по Оухтерлони [41]. РДД ставили в 1,5% агаровом геле ( агар Б11со), приготовленном на ФСБ рН 7,2.

Сенситивную активность препаратов определяли путем установления оптимальной сенсибилизирующей дозы, используя танизирован-ные формалинизированные эритроциты барана и полистирольные суспензии. Для оценки сенсибилизирующих свойств препаратов исследовали интервал доз от 100 мкг до 3 мкг по белку на 1 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов и 1%-ной полистирольной суспензии.

2.2.6. Определение удельной антигенной активности

препаратов

Антигенную активность СА вытитровывали на белых мышах в реакции антитоксинсвязывания по Бехеру [55]. Удельную активность рассчитывали с учетом концентрации белка в анализируемом препарате и выражали соотношением ЕС/мг белкового азота.

2.2.7. Определение иммунизирующей активности препаратов

Иммунизирующую активность СА исследовали в прямых опытах определения количества международных иммунизирующих единиц (МИЕ) с использованием референс препаратов ГИСК им Л.А. Тарасеви-ча, в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева. [3].

2.2.8. Определение ревакцинаторного эффекта препаратов

Ревакцинаторный эффект препаратов СА по динамике накопления антител в сыворотках иммунизированных морских свинок оценивали в РПГА [36].

2.2.9. Определение белкового азота

Содержание белкового азота определяли методом Кьельдаля [36].

2.2.10. Приготовление эритроцитарных диагностикумов

Для получения антигенных эритроцитарных диагностикумов использовали способ иммобилизации антигенов на поверхности формали-низированных эритроцитов после их обработки танином. 50%-ую суспензию формалинизированных эритроцитов барана отмывали 1 раз 0,85%-ным раствором ИаС1, после чего суспензию эритроцитов доводили до 2,5% концентрации фосфатно-буферным раствором рН 7,2, смешивали с равным объемом 0,5%-ного раствора танина и инкубировали в течение 12 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем эритроциты отмывали от танина 0,85%-ным раствором ЫаС12 раза и инкубировали с препаратом СА в термостате при температуре 37°С 19 часов при периодическом перемешивании (1 раз в час в течение первых 7 часов, затем через каждые 3 часа). Процесс сенсибилизации останавливали добавлением к инкубационной смеси формалина до конечной концентрации 1% и оставляли в термостате при 37°С на 1 час. Сенсибилизированные эритроциты отмывали от избытка антигена 0,85%-ным раствором ЫаС1, содержащим 1% формалина, после чего ди-агностикум доводили до рабочей концентрации 0,4%.

Активность полученных диагностикумов оценивали в РПГА [41] со стандартной лошадиной противостолбнячной сывороткой.

2.2.11. Получение латексного диагностикума и контрольного латекса

Процесс иммобилизации антигенов на латексы осуществляли следующим образом. Исходную взвесь частиц монодисперсного полисти-рольного латекса отмывали ФСБ рН 8,0, доводили их концентрацию до 1% и смешивали с равным объемом раствора антигена. Смесь инкубировали в течение 1,5 часов при температуре 37°С и при постоянном перемешивании. Для получения контрольной суспензии латекса вместо раствора антигена использовали ФСБ. Диагностику^ и контрольную суспензию латекса отмывали несколько раз ФСБ и инкубировали в 0,1 М глициновом буфере рН 7,8 еще 1 час для инактивации оставшихся свободных групп. По окончании инкубации частицы латекса переводили в ФСБ и добавляли азид натрия в конечной концентрации 0,05%. Диаг-ностикум и контрольную суспензию латекса хранили в холодильнике при температуре +4°С.

2.2.12. Постановка реакции агглютинации латекса

Активность полученных диагностикумов и контрольного латекса оценивали в РАЛ со стандартной лошадиной противостолбнячной сывороткой в планшетах для иммунологических реакций. В качестве поддерживающей среды, с целью исключения спонтанной агглютинации, использовали ФСБ, содержащий 1% ИКС и 0,5 мг/мл БСА.

Рабочая концентрация диагностикума и контрольного латекса для реакции в планшетах составляла 0,05%.

Реакцию учитывали визуально через 16-20 часов по 4-х крестовой системе:

"4+" - все частицы латекса агглютинируются и равномерно выстилают дно лунки (форма "зонтика");

"3+" - частицы латекса почти все агглютинируются, по центру агглютината намечается небольшое окрашенное кольцо неагглютиниро-ванных частиц ( "зонтик" несколько спавший);

"2+" - агглютинат в виде широкой окрашенной зоны вокруг интенсивно окрашенного кольца неагглютинированных частиц латекса;

"1+" - узкий слабо окрашенный ободок агглютината вокруг широкого интенсивно окрашенного кольца неагглютинированных частиц латекса;

"-" - агглютинат отсутствует, частицы латекса оседают в виде "пуговки" в центре лунки.

За титр сыворотки принимали максимальное ее разведение, при котором наблюдалась агглютинация латекса на "2+". При титровании сывороток с контрольным латексом наблюдали полное отсутствие агглютинации латекса ("-").

2.2.13. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов реакции связывания СА антитоксином (по Бехеру) и исследования иммуногенной активности препаратов проводили, рассчитывая среднюю геометрическую титра (X). Оценку реакции флокуляции проводили по средней арифметической титра и ее квадратичного отклонения [3].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Бинима Сагу

ВЫВОДЫ

1.Разработан метод ступенчатой диафильтрации для производственной очистки СА. Отработаны режимы и условия процесса диафильтра-ции: скорости потока, кратность мембранного диализа, состав буферных растворов.

2. Технология дополнительной очистки препарата С А с использованием диафильтрации на мембранах МВ-100 и ХМ-300 позволяет вернуть производству формольный дериват олигомера с нагрузкой более 1000 ЕС/мг белкового азота, т.е. удовлетворяющей критериям Фармста-тьи РФ.

3. Полимерная фракция С А может быть очищена до удельной специфической активности более 1000 ЕС/мг белкового азота, даже если в работу взят материал с исходными нагрузками в пределах 400-500 ЕС/мг белкового азота.

4. Иммунизирующая активность вакцинных препаратов (МИЕ на 1 ЕС), составленных преимущественно из полимерной фракции, оказалась не ниже протективной активности препаратов, приготовленных из СА, полученных традиционным способом.

5. В процессе диафильтрации С А разработан полный цикл ступеней доочистки (мембранной "рехроматографии"), позволяющей сократить потери с 25-40% до 5%.

6. Полимерная фракция СА может быть использована в качестве сенситина при получении эритроцитарных и латексных диагностикумов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Профилактика столбняка сохраняет свою актуальность во всем мире. В ряде стран, в том числе в России, заболеваемость столбняком снизилась, благодаря плановой иммунизации населения, в то время как в развивающихся странах, куда относится большинство государств Африканского континента, вакцинация против столбняка проводится выборочно. Как известно, столбняк чаще всего регистрируется в регионах с жарким и тропическим климатом. В странах Африки до настоящего времени это заболевание является одной из главных причин смертности населения, в том числе и детского. Эпидемический процесс при этом характеризуется рядом особенностей. В тропиках среди многочисленных факторов, способствующих распространению столбняка, следует отметить прежде всего поч-венно-климатические и санитарно-гигиенические. Более разнообразными являются пути и факторы передачи возбудителя. Важно также и то, что 80% населения этих стран заняты сельским хозяйством и животноводством. Неблагоприятно сказываются на заболеваемости столбняком и низкий экономический уровень стран третьего мира, войны, разруха, слабо развитая сеть медицинских учреждений.

В связи с этим, только массовая активная иммунизация против столбняка может быть единственным целесообразным и надежным способом снижения уровня заболеваемости.

Изготовляемые в России и широко используемые в практике здравоохранения СА, в том числе являющиеся компонентом комбинированных АКДС- и АДС-вакцин, обеспечивают высокую эффективность иммунизации.

Постоянная потребность в профилактических препаратах тем не менее не снижает требований к их качеству, которые регламентируются критериями ВФС и ВОЗ.

Действующие производственные регламенты не всегда позволяют получать СА, удовлетворяющие этим требованиям. Часть полученных с использованием традиционных технологий препаратов требуют дополнительной очистки, которая позволяет снять проблему, связанную с развитием аллергических реакций при вакцинациях, что, как известно, ассоциируется в массовом сознании с плохим качеством прививочных препаратов [125].

Выпускаемые в настоящее время СА существенно различаются по иммуногенным свойствам и степени очистки. При изучении их фракционного состава было показано, что они неоднородны; высокомолекулярные компоненты иммуногенны, а низкомолекулярные белки - неактивны [65].

Известно также и то, что в производственных условиях возможно формирование С А в полимерной форме с молекулярной массой более 300 кД [107]. Такой препарат рассматривается как высокоиммуногенный и более эффективный для ревакцинации при использовании жидкой (неадсорбированной) лекарственной формы [75, 107].

Учитывая изложенное, настоящая работа, была посвящена разработке технологии получения высокоочшценной полимерной фракции СА методом ступенчатой диафильтрации и изучению ее антигенной и иммуно-генной активности.

В последние десятилетия метод диафильтрации зарекомендовал себя как надежный, эффективный и экономичный способ молекулярного разделения и очистки широкого спектра биополимеров. Разработка новых фильтрующих материалов с контролируемым размером пор и увеличение производительности рабочих модулей позволили использовать диафильтрацию (наряду с гель- и ионнообменной хроматографией, переосаждением, градиентным сепарированием и т.д.), как один из универсальных методов получения высокоочищенных биопрепаратов в условиях производства.

В результате проведенных исследований впервые на базе предприятия АО "Биомед" им. И. И. Мечникова разработана технология очистки некондиционных серий препарата СА с использованием ступенчатой диа-фильтрации на мембранах МВ-100 и ХМ-300, позволяющая получить коммерческие серии с нагрузкой более 1000 ЕС/мг белкового азота, т.е. удовлетворяющие критериям Фармакопейной статьи РФ и ВОЗ.

Используя метод одноступенчатой мембранной диафильтрации для очистки препаратов СА, удалось в 6 сериях повысить нагрузку в концентратах МВ-100 и вернуть производству суммарно 41 млн. ЕС коммерческого препарата.

Последовательная диафильтрация с использованием половолоконно-го модуля МВ-100 и мембраны ХМ-300 позволила в 6 сериях препарата поднять удельную специфическую активность до значений, удовлетворяющих требованиям ВОЗ и получить в концентрате ХМ-300 (по данным хроматографического анализа) практически гомогенный препарат высокомолекулярного полимера СА.

В процессе диафильтрации СА разработан полный цикл ступенчатой доочистки (мембранной "рехроматографии"), позволяющий сократить потери антигенноактивного материала с 25-40% до 5%.

Результаты оценки иммуногенной активности препаратов (МИЕ на 1 ЕС), составленных преимущественно из полимерной фракции, показывают, что последняя не уступает по протективной активности стандартному препарату СА.

Многократная фильтрация концентрата МВ-100 препарата СА через колонки с гелями ТБК-ТОУОРЕАКЬ и БерЬаёех 0-200 позволила получить фракции I, II и III относительно однородные и имеющие молекулярные массы в 1200 кД, 300 кД и 150 кД соответственно. Фракции эти использованы нами в качестве сенситина при разработке диагностических препаратов.

Разработанная технология ступенчатой мембранной диафильтрации для доочистки СА внедрена на преприятии АО "Биомед" им. И. И. Мечникова. Производственные серии препаратов, дополнительно очищенные по указанной технологии, прошли комиссионную проверку в ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Подтверждена их высокая удельная специфическая и про-тективная активность.

Полученные результаты позволяют считать, что наиболее технологичным и доступным для дополнительной очистки препаратов СА от неспецифических веществ является метод ступенчатой диафильтрации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бинима Сагу, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Айзешптейн Э.М. Химические волокна. 1995. - № 5. - С. 19-25.

2. Акулиничева К.В., Мигалев В.А., Шульга O.E. и др. Теоретические и практические аспекты ликвидации столбняка на Украине. - М., 1989.

3. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медицина. - 1962.

4. Бароян О.В., Портер Д.Р. Международные и национальные аспекты современной эпидемиологии и микробиологии. - М., 1975. - С. 123131.

5. Брагинская В.Д., Соколова А.Ф. Активная иммунизация и профилактика поствакцинальных осложнений у детей. М., 1977. - 191 с.

6. Бургасов П.Н., Румянцев С.Н. Эволюция клостридиозов. - М., 1974. -38 с.

7. Быченко Б.Д. Мировое распространение столбняка и его профилактика //Автореф. дис. докт. мед. наук -М., 1970. - 44 с.

8. Быченко Б.Д. Смертность от столбняка новорожденных в мире и ее приблизительная оценка //Современные проблемы специфической профилактики столбняка и дальнейшего снижения заболеваемости -М., Львов, 1975 . - С. 19-22.

9. Быченко Б.Д. Столбняк. М„ 1982. - С.6-33.

10. Гиль И.В. Об иммунитете против столбняка у больных хроническими заболеваниями//Врач. дело. - 1989. - № 5. -121 с.

11. Голшмид В.К. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография в изучении и очистке бактериальных токсинов и анатоксинов //Автореф. Дис. докт. - М. - 1974.

12. Горфункель-Кошкина Д.М. и Воробьева Н.Д. Способ получения столбнячного анатоксина. //Микробиологии вакцин . - Описание изобретения 03.09.76.

13. Гусев В.К., Дюмаев K.M., Айзенштейн Э.М., Боршев А.П. Половоло-конные ультрафильтры как перспективные системы при разделении биологически активных веществ. //ВСБ. Медицинские технологии. Москва. -1994. - С.48-53.

14. Далин М.В. Метод получения очищенного дифтерийного и столбнячного анатоксина //Автор.свидетельство № 22924. - НРБ. - 1975.

15. Далин М.В. с соавт. Новые половолоконные ультрафильтры в медицине. //Тез.докл. "Мембраны" - 95.- М. Окт. 1995 г. -195 с.

16. Далин М.В. с соавт. Способ получения дифтерийного или столбнячного анатоксина//Авт. свидетельство № 915856. - 1976.

17. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов //М., Медицина, 1980. - 192 с.

18. Далин М.В., Фиш Н.Г, Антигенные и иммуногенные свойства дифтерийного анатоксина (обзор литературы) //Сб. научн. трудов "Токсины-анатоксины и антитоксические сыворотки" - М. - 1972,-Вып. №11. -С.68-184.

19. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул //М., Медицина, 1985. - 204 с.

20. Ермолаев A.B. с соавт. Способ получения полимерной и олигомерной фракций столбнячного анатоксина //Авт. свидетельство № 2065765. -1996.

21. Ефимова Н.П. Фракционирование белков столбнячного анатоксина посредством фильтрации через гель сефадекс // Тез. докл. к итог, научн. конф. (Пермский НИИ вакцин и сывороток). - Пермь. - 1967. -с.9-10.

22. Ефимова Н.П. Разработка и экспериментальное обоснование производства против анаэробных инфекций: Автореф. дис. д-ра мед. наук. -Пермь. -1971.

23. Захарова М.С. Влияние вакцинации на мировое распротранение коклюша. // Актуальные вопросы эпидемиологии и иммунологии коклюша.-М., 1997.-С.5-16.

24. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология , иммунология и вирусология. //Санкт-Петербург, 1998. - С.427-430.

25. Либов А.Л. Проблемы иммунизации.Сообщ.2. Международная практика иммунизации против дифтерии, коклюша и столбняка. //ЖМЭИ. -1968. - № 4. - С.57-63.

26. Литвинов С.К., Лобанов A.B. Опыт расширенной программы ВОЗ по иммунизации против столбняка //Журн. Микробиол., эпидемиол. и иммун. - 1985. -№ 11.-97 с.

27. Лобан K.M. Лечение больных столбняком. - М., Медицина. - 1965. -

28. Луценко В.К. Молекулярные механизмы действия ботулинового и столбнячного нейротоксинов //Успехи современной биологии. -1981. -Т. 91. - Вып.1. - С.99-113.

29. Максимова П.М., Сухорукова К.Л., Финкель М.И. Специфическая профилактика инфекции у детей. - Л., 1986. - С.21-24.

30. Манвелова М.А., Черткова P.A., Чеботарева С.В. и др. Опыт применения малых доз при плановой иммунизации детей -11 лет //ЖМЭИ. - 1975.-М 5.-С.26-31.

31. Матвеев К.И. Эпидемиология и профилактика столбняка. М., 1960. -338 с.

32. Матвеев К.И., Кашинцева H.A., Петрова П.И. и др. Эффективность пассивной и активно-пассивной профилактики столбняка //Столбняк. Кишинев., 1967. - С.47-52.

33. Матвеев К.И., Сергеева Т.И. Эпидемиология столбняка в мирное время в СССР и зарубежных странах //ЖМЭИ, 1959. - № 2. - С.134-142.

34. Матвеев К.И., Сергеева Т.И. Эпидемиология столбняка в мирное время в СССР и зарубежных странах //Тез. докл. межинститутск. научн. конф. по проблеме "Анаэробы". - М., 1956. - С.23-44.

35. Меренкова A.M., Сергеев Т.К., Литус З.В., Акулиничева К.В. Опыт работы по профилактике столбняка в Украинской ССР и перспективы дальнейшего снижения заболеваемости //Современные проблемы специфической профилактики столбняка и дальнейшего снижения заболеваемости. - М., - Львов., -195. - С.7-9.

36. Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов ГКИ им.Тарасевича / Под ред.Дзагурова С.Г. - М. - 1972. - 228 с.

37. Мишустин E.H., Перцовская М.И. Микроорганизмы и самоочищение почв. - М.: АМН СССР, 1954. - С.3-18.

38. Монастырский Н.Д. Наблюдения и исследования о травматическом столбняке //Международ. Клиника. СПБ. - 1885.

39. Моргунов И.И., Соколовская Г.Г. К вопросу об источнике инфекции при столбняке. //Столбняк. - Кишинев. - 1967. - С. 105-108.

40. Моргунов И.Н., Соколовская Г.Г. Эпидемиологические особенности столбняка на Украине в условиях массовой иммунизации //Современные проблемы специфической профилактики столбняка и дальнейшего снижения заболеваемости, - М., Львов, 1975. - С.9-12.

41. Никитин В.М. Справочник серологических реакций. - Кишинев. -1977. - 206 с.

42. Николов 3. Тетанусьт в НРБ през периода 1963-1974 г. Специфичната профилактика и заболеваниата от тетанус //Современа мед. - 1976. -т.27, № 11. - С.42-45.

43. Никулина Н.В., Ивченко О.И., Лисицина Т.С. и др. Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов. - 1988. - С.47-48.

44. Огниянов М.А. Очистка столбнячного токсина и анатоксина методом ионообменной хроматографии//ЖГЭМИ. -1974. - 18(3). - С.342-346.

45. Осовцева О.И. Опыт организации массовой активной иммунизации против столбняка //ЖМЭИ. - 1968. - № 3. - С.144-147.

46. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.:Наука. - 1985. - 536 с.

47. Пасечник А.Л. Эпидемиологическое обоснование путей совершенствования профилактики столбняка в эндемичном по этой инфекции Краснодарском крае //Дис. канд. мед. наук. - М., 1983. -С.5-35.

48. Перепечкина Н.П. с соавт. Улучшение показателей качества столбнячного анатоксина с помощью мембранного разделения //ЖМЭИ. -1993. -№6. -С.78-79.

49. Перепечкина Н.П., Плющ Л.И., Селезнева В.П. Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов //Тез. докл. научн. Конф. Пермского НИИ вакцин и сывороток. - Пермь. - октябрь 1988. - С.42-43.

50. Пирогов Н.И. Начало общей военно-полевой хирургии. - Дрезден., 1986.-№2.-337 с.

51. Резник Б .Я. Сравнительная характеристика КД, КДС и сорбированной КДС-вакцины при иммунизации детей //ЖМЭИ. -1963. - № 12. -С. 13-15.

52. Рудниченко В.Ф., Ярошенко М.Н., Пархоменко Т.О. и др. Связь между уровнем заболеваемости столбняком и свойствами почв //Ж. Врач. дело. - 1982. - № 11. -108 с.

53. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. Бурга-соваП.Н.-М.- 1978.- 121 с.

54. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. Бурга-соваП.Н. М., 1978. - 150 с.

55. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. Бурга-соваПЛ. М., 1978.- 129 с.

56. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. Бурга-соваПЛ. М., 1978. - С.103-175.

57. Рунова В.Ф., Резепов Ф.Ф., Каргина Т.М и др. Оценка качества столбнячных анатоксинов методом гель-фильтрации //Матер, научн. конф. "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии". - Часть 1. -Томск.-1991,-С.114-115.

58. Рунова В.Ф., Каргина Т.М., Резепов Ф.Ф. и др. Оценка качества столбнячных анатоксинов методом гель-фильтрации //ЖМЭИ. - 1992. - № 2. - С.38-40.

59. Сапожников И.И., Димова Н.В., Котрелева Н.В. и др. Сравнительное изучение реактогенности коклюшно-дифтерийной, коклюшно-дифте-рийно-столбнячной и адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины //ЖМЭИ. -1966. -№ 2. - С.22-26.

60. Селезнева В.П., Перелыгина О.В. Анатоксины столбнячный и дифтерийный //В сб. "Актуальны проблемы создания и применения иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней" 1993. - Т. 1. Пермь. - 1993. - С. 142-157.

61. Смышлаева В.И. Иммунохимическая характеристика столбнячных токсинов и анатоксинов, полученных от разных штаммов: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Ставрополь. - 1970.

62. Тарков М.И. Почва театра военных действий -1941-44 гг. как хранилище патогенных микроорганизмов из рода клостридий //Труды

Молд. НИИ ЭМГ "Патогенные клостридии". -Кишинев: Штиин-ца,1961. - № 5. - С.15-21.

63. Тарков М.И., Волкова Д.А., Соболева К.П., Тимченко JI.A. Токсикоз почвы как один из факторов, определяющих распространение Cl.tetani в природе //Столбняк. - Кишинев., 1967. - С. 113-116.

64. Тихонова Н.Т. Противокорьевый иммунитет и некоторые механизмы его формирования. //Автореф. дис. докт. - М., 1981.

65. Хаустова И.М., Углева А.И., Рождественская В.О. О зонах флокуля-ции столбнячных антигенов //ЖМЭИ. - 1970. - № 11. - С.86-88.

66. Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека. -М.: Медицинская газета. - 1994. - С.465-466.

67. Черная Л.А., Ковтунович Т.П. Столбняк. //Киев: Здоровье. - 1968. -С.3-11.

68. Шабад А.Т., Брагинская В.Л., Зыбина Т.М. и др. Применение АДС -анатоксина с уменьшенным содержанием антигенов для иммунизации детей, имеющих противопоказания к введению АКДС-вакцин. //ЖМЭИ. -1977. - № 7. - С.126-131.

69. Шварц С.А., Букова В.Е., Стовбун С.Ф. Столбняк (эпидемиология, вакцинация, профилактика, контроль иммунитета). - Кишинев: Шти-инца.. 1986. - 199 с.

70. Шляхов Э.Н. Практическая эпидемиология. - Кишинев: Штиинца. -1981.-С.З-60.

71. Шуйкина Э.Е., Триере И.И., Чередеев А.Н. и др. Оценка иммунного статуса у привитых против зоонозного кожного лейшманиоза //Ж. Микробиология. - 1986. - № 6. -С. 104-105.

72. Ясинский A.A., Тымчаковская И.М. Методические рекомендации МЗ РСФСР по совершенствованию мероприятий при профилактике столбняка. - М., 1981. - 27 с.

73. Agonia A.O., Jaiycoba В.О., Tumwashe O.Z. Tetanus in lagos. A review of 228 adult Nigerian patiento //J. Trop. Med. Hyg. - 1973. - V.76, № 7. -P.171-174.

74. Barr M., Sachs A. Reporton the investigation in to the prevention of tetanus in the british army //The war office, London, S. W. - 1955. - October. -364 p.

75. Bezzini B. Structure, composition and principles of detoxification of Diphtheria and Tetanus toxin //В книге: Proceedings of an informal consultation on the WHO requirements of Diphtheria, Tetanus, Pertussis and combined vaccines. -1991. - P.3-6.

76. Bizzini B. Properties of the binding to gangliosides and synaptosomes of a fragment of the tetanus toxin molecule //Toxicon Suppl. - 1978. - V.l. -P.961-969.

77. Bizzini B. The chemistry of tetanus toxin. /Лп: Veronesi R, ed. Tetanus: Important New Concepts. Amsterdam: Excerpta Medica. - 1981. - P.8-17.

78. Bizzini B. The specifity and action of animal, bacterial plant toxins. Receptor and recognetion //Ser. B. - V.l, № 9. - L: Chapman and Hall. -1976.- 177 p.

79. Bizzini В., Blass J., Raynaud M. Etude sur le mecanisme de la detoxification des toxines proteiques par le formol. II. Fixation quantitative du formol l4C //Ann. Inst. Pasteur (Paris). - 1969. - V. 116. - P.501-521.

80. Bizzini В., Stoeckel K., Schwab M.J. An antigenic polypeptide fragment isolated from tetanus toxin: chemical characterization, briding to gangliosides and retrograde axonal transport in variores neuron systems //J. Neurochem. - 1977. - V.28, № 3. - P.529-542.

81. Bizzini B. Tetanus //In: Gennanier R. ed. Bacterial Vaccines. Orlando: Academic Press. - 1984. - P.37-68.

82. Bizzini B., Turpin A., Raynaud M. Pouvoir immunogene d'anatoxines tetaniques de divers degre de purete et de polymerisation //Ann. Inst. Pasteur (Paris). -1971. - V.120. - P.791-799.

83. Chin W., Rankert D., Cumming M.A., Robinson J.P. Characterization of crystalline filtrate tetanus toxin //J. Ultrastruct. Res. - 1982. - V. 79., № 3. -P.285-293.

84. Cole L.B. Tetanus immunization //Practconner. - 1951. - V.157., № 8. -P.638-644.

85. DiMari S.J., Cumming M.A., Hash J.H., Robinson J.P. Purification of tetanus toxin and its peptide components by preparative Polyacrylamide gel electrophoresis //Arch. Biochem. Biophys. - 1982. - V.214, № 1. - P.342-353.

86. DiMari S.J., Hash J.H., Robinson J.P. Characterization of tetanus toxin and toxin components by amino terminal analyses //Arch. Biochem. Biophys. - 1982. - V.214, № 1. - P.354-365.

87. Donikian R.. An example of industrial purification of diphtheria and tetanus toxoids // In book: Proceedings of an informal consultation on the WHO requirements of Diphtheria, Tetanus, Pertussis and combined vaccines. -1991. -P.26-31.

88. Edsall G. Immunological principles in active immunisation against tetanus //Principles on tetanus. - Bern. - 1967. - P.225-236.

89. Fariweather N.F., Lyness V.A., Pickard D.J., Allen G., Thomson R.O. Cloning, nucleoside sequencing and expression of tetanus toxin fragment C inEcherichiacoli //J. Bacteriol. - 1986. - V.165, № i. . p.21-27.

90. Forge F.M., Young L.S., Bennett J.V. Tetanus in the United states (19651966): Epidemiological and clinical features //N.Engl. J. Med. - 1969. -Vol.280., №11. - P.569-574.

91. Furste W. Tetanus toxoid immunisation in Ohio //Ohio St. Med. J. - 1974. -V. 60. -№l.-P.56-57.

92. Gala F., Okeramo V. La prevention du tétanos neonatal par immunisation active des femmes enceints a Brazzaville. Evaluation pratique et comparaison entre la vaccination par dose inuque et la vaccination par trois doses //Bul. Soc. Path. exot. - 1980. - V.73, № 1. - P.51-52.

93. Gentilini M. Duflo B., Corlon C. Medicine Tropicale le Tétanos //Med.Trop.Paris - 1972. - V.32. -P.241.

94. Goretzki K., Habermann E. Enzymatic hydrolysis of tetanus toxin by intrinsic and extrinsic proteases. Characterization of the fragments by monoclonal antibodies //Med. Microbiol. Immunol. - 1985. - V.174, № 3. -P.139-150.

95. Gottlied S., Martin M., Mclaughlin F.X. et al. Long-term immunity to diphtheria and tetanus: a mathematical model //Principles on tetanus. -Bern, Stuttgart, 1967. - P.307-315.

96. Gwee A.L., Nadarazan I. A survey of tetanus in Singapore // Singapore Med. J. - 1960. - V.I., № 4. - P.164-166.

97. Habermann E., Dimpfel W., Neale J.H. 1251-Labelled tetanus toxin as a neuronal marker in tissue cultures derived from embrionic CNS //Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. - 1975. - V.290., № 2-3. - P.329-333.

98. Habermann E., Goretzki K. Monoclonal antibodies against bacteria //L.: Acad. Press. - 1985. - V.l -191 p.

99. Habig W.H. Purification of diphtheria and tetanus toxoids //In book: Proceedings of an informal consultation on the WHO requirements of Diphtheria, Tetanus, Pertussis and combined vaccines. 1991. - P. 21-25.

100. Helting T.B., Habig W.H. Bacterial protein toxins //L.: Acad. Press. -1984.-413 p.

101. Helting T.B., Parschat S., Engelhardt H. //J. Biol. chem. - 1979. - V.254, №18.-P. 10728.

102. Helting T.B., Ronneberger H, Vollerthun R., Neubauer V. Toxicity of pa-pain-digested tetanus toxin. Pathological effect of fracment B in the absence of spastic paralysis // J. Biol. chem. - 1978. - V.253, № 1. - P. 125129.

103. Helting T.B., Zwisler O. Structure of tetanus toxin. I. Breakdown of the toxin molecule and discrimination between polypeptide fragments // J. Biol. chem. - 1977. - V.252, № 1. - P.194-198.

104. Henderson R.H. The challenge of E.P.I. //World. Health. Feb. - 1979. -March. - P.32-35.

105. Heyningen S. Tetenus toxin //In: Pharmac. Ther., Gr. Br. 1980. - V.ll. -P. 141-157.

106. Kenimer J.G., Habig W.H., Hardegree M.C. Monoclonal antibodies as probes of tetanus toxin structure and function //Infect, and immunity . -1983. - V.42, № 3. - P.942-948.

107. Knight P.A. Can the determination of antigen content be used for insuring that potency of Diphtheria and Tetanus toxoids in vaccines in adequate? //In book: Proceedings of an informal consultation on the WHO requirements of Diphtheria, Tetanus, Pertussis and combined vaccines. - 1991 -P.45-52.

108. Lamanna C., Spero L., Schantz E. //Infect, and Immun. - 1970. - V.l. -423 p.

109. Lazarovici P., Tayot J.L., Yavin E. Affinity chromatographia purification and characterization of two iodinated tetanus toxin fractions exhibiting different binding properties //Toxicon. - 1984. - V.22, № 3. - P.401-413.

110. Lazarovici P., Yavin E. Tetanus toxin interaction with human erytrocytes. I. Properties of polysialoganglioside association with the cell surface. II.

Kinetic properties of toxin association and evidence for a damglioside-toxin macromolecular complex formation //Biochim. Biophis. Acta. - 1985. - V.812, № 2. - P.523-542.

111. Lin C.S., Habig W.H., Hardegree M.C. Helting T.B., Zwister O. Antibodies against the light chain of tetanus toxin in human sera //Infect. Immun. -1985. - V.49, № 1. -P.lll-115.

112. Lowry O.at al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J.Biol.Chem. -1951. - V.193, № 1. -P.265-275.

113. Mamtani R., Malhotra P., Gupta P.S., Jain B.K. A comparative study of urban and rural tetanus in adults //Int. J. Epid. - 1978. - V.7., № 3. - P. 185188.

114. Masar J. Analyza vyskytu tetanu na slovensku (II cast: 1956-1964) //Csl. Epidem. - 1966. - V.15, № 3. - P. 147-159.

115. Matsuda M., Yoneda M. Reconstitution of tetanus neurotoxin from two antigenically active polypeptide fragments //Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1976. - V.68, № 3. - P.668-674.

116. Matsuda M., Yoneda M. Antigenic substructure of tetanus neurotoxin //Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1977. - V.77, № 1. - P.268-274.

117. Matsuda M., Yoneda M. Isolation and purification of two antigenically active, "complementary" polypeptide fragments of tetanus neurotoxin //Infect, and immunity. - 1975. - V.12, № 5. - P. 1141-1153.

118. Neubauer V., Helting T.B. Structure of tetanus toxin: The arrangement of papain digestion products within the hearry chain-light chain framework of extracellular toxin //Biochim. Biophys. Acta. - 1981. - V.668, № 1. -P.141-148.

119. Otzutsumi K., Srigimoto N., Matsuda M. Rapid, simplified method for production and purification of tetanus toxin //Appl. Environ. Microbiol. -1985. - V.49, № 4. - P.939-943.

120. Patel J.C., Menta B.C. Tetanus: study of 8697 cases //Compte rendus de la quatrième conference internationale sur le tetanus. Dakar, Senegal, 6-12 april, 1975. - Lyon: Fondation Mervieux, 1975. - V.l. - P.233-241.

121. Peltola H., Heinonen O.P. Frequency of true adverse reactions to measles-mumps-rubella vaccine. A double-blind placebo-controlled trial in twins //Lancet. - 1986. - V.l, № 8487. - P.939-942.

122. Ramon G. La vaccination antidiphtherique et la vaccination antitétanique au moyen des anatoxines spécifiques et les vaccinations dans la pratique //Rev.d'Immun. - 1935. - V.l, № 1. - P.37-73.

123. Ramon G. Sur la production desantitoxines. CTAcorf Sei. - 1925.- V.181. -P.157-159.

124. Rapini M., Amstutz Ph. Epidemiologie et prophylaxie du tetanus //Rev. Hyg. Med. Soc. - 1963. - V.ll, № 1. -P.33-45.

125. Relyveld E.H, Henocq E. Bizzini B. Studies on untoward reactions to diphtheria and tetanus toxoids //Dev Biol Stand. - 1979. - V.43. - P.33-37.

126. Relyveld E.H. A history of toxoids. "Vaccinia, vaccination, vaccinology", International meeting on the history of vaccinology. - 1995. - Paris, France.

- P. 95-105.

127. Relyveld E.H. Current developments in production and testing of tetanus and diphtheria vaccines. In: Mizrahi A. Henman T. Klungberg MA. Kohn A. eds. New Developments with Human and Veterinary Vaccines. New York: Alan R Liss. - 1980. - P.51-76.

128. Roa M., Boquet P. Interaction of tetanus toxin with lipid vesicles at low pH. Protection of specific polypeptides against proteolysis //J. Biol. chem.

- 1985. - V.260, № 11. - P.6827-6835.

129. Robinson J.P., Chem H., Hash J.H., Puett D. //Med. microbiol. and immunol- 1985.-V. 174, №3.-139 p.

130. Robinson J.P., Holladay L.A., Hash J.H., Puett D. Conformational and molecular weight studies of tetanus toxin and its major peptides //J. Biol, chem. - 1982. - V.257, № 1. - P.407-411.

131. Robinson J.P., Holladay L.A., Picklesimer J.B., Puett D. Tetanus toxin conformation //Mol. Cell. Biochem. - 1974. - V.5, № 3. - P. 147-151.

132. Robinson J.P., Picklesimer J.B., Puett D. Tetanus toxin. The effect of chemical modifications on toxicity, immunogenicity and conformation //J. Biol. chem. - 1975. - V.250, № 18. - P.7435-7442.

133. Rose E. Der Starrkrampf bein Menschen. Stuttgart, 1973. - 24 s.

134. Sato H., Ito A., Yamakawa Y., Murata R. Toxin-neutralizing effect of antibody against subtilisin-digested tetanus toxin //Infect. Immun. - 1979. -V.24, № 3. -P.958-961.

135. Scheibel I., Benzon M.W. Duration of immunity after tetanus immunization. -1967. - P.245-251.

136. Schmitt A., Dreyer F., John C. At least three sequential steps are involved in the tetanus toxin - induced block of neuromuscular transmission //Naunyno-schmiedeberg Arch. Pharmacol. - 1981. - V.317, № 4. - P.326-330.

137. Tasman A., Bangma P.J., Smith L. Immunological reactivity of tuberculosis patients // Antonie Van Leenwenhoek, 1961. - V.27. - P.367-385.

138. Tomaszunas S. Urgent problem of south-East Asia: Wideseale immunisation //Bui. World Health org. - 1979. - V.33, № 10. - P.486-490.

139. Urbanyi B., Mietke G., Gonzales J. Spillner G., Schlosser V. Tetanus bei chronisch arterieller Verschlusskrankheit und ischämischen ulzerationen //Med. Welt. - 1982. - Bd.33, № 38. - S. 1295-1296.

140. Van Heyningen S. Tetanus toxin //Pharmacol, and ther. - 1980. - V.ll, № 1. - P.141-157.

141. Veronesi R., Correia A., Alterio D. Single-dose immunization against tetanus. Promising results in human trials //Rev. Inst. Med. Trop. S.Paulo. -1975.-V.12.-P.46-54.

142. Volk W.A., Bizzini B., Snayder R.M., Bernhard E., Wagner R.R. Neutralization of tetanus toxin by elistinct monoclonal antibodies binding to multiple epitopes on the toxin molecule //Infect. Immun. - 1984. - V.45, № 3. -P.604-609.

143. Ward W., Britton P., Van Heyningen S. The hydrophobicities of cholera toxin, tetanus toxin and their components //Biochem. J. - 1981. - V.199, № 2. - 457 p.

144. Wellhoner N.H. Tetanus neurotoxin //Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. -

1982. -V.93. - P. 1-68.

145. WHO. Manual for the production and control of vaccines: diphtheria toxoid. (BLG) UNDP(77.1 Rev 1).

146. WHO. Manual for the production and control of vaccines: tetanus toxoid. (BLG/UND P/77.2 Rev 1).

147. WHO. Neonatal tetanus control //Wkly. Epid. Rec. - 1988. - № 3. - P. 1113.

148. WHO. Neonatal tetanus mortality survey in Malasia //Wkly. Epid. Rec. -

1983. - № 42. - P.326-327.

149. WHO. Expanded program on immunization tetanus surveillance //Wkly. Epid. Rec. - 1988. - № 34. - P.258-259.