Видоспецифические антигенные эритроцитарные диагностикумы для определения антител к Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Ковалева, Татьяна Сергеевна

• Ковалева, Татьяна Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ковалева, Татьяна Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список основных сокращений

Введение

Глава I. Основные принципы конструирования

антигенных риккетсиальных эритроцитарных диагностикумов (обзор литературы)

1.1. Реакция непрямой гемагглютинации

1.2. Основные принципы приготовления АЭД

1.3. Особенности сенсибилизации эритроцитов

антигенами полисахаридной и белковой природы

1.4. Место РИГА среди регламентированных серологических тестов и ее диагностические возможности

1.5. Антигенная структура риккетсий группы СТ 28 Глава II. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.2. Методы 34 Глава III. Разработка методов конструирования АЭД

на основе разных сенситинов, полученных из риккетсиальной клетки

3.1. Выбор основы для получения

полноценных гемосенситинов

3.2. Приготовление поверхностных

риккетсиальных антигенов и их характеристика

3.2.1. Изучение иммунохимических свойств

поверхностных и мембранных антигенов

3.2.2. Оценка гемосенсибилизирующих свойств

поверхностных и мембранных антигенов

3.2.3. Определение серологических свойств СЭ

на основе поверхностных и мембранных антигенов

3.3. Разработка антигенного эритроцитарного

диагностикума на основе группового сенситина

3.3.1. Получение диагностических сывороток

и изучение динамики антителообразования с

помощью группового АЭД

3.4. Получение видоспецифического сенситина

3.4.1. Приготовление иммуносорбента для

адсорбции групповых специфических антител

3.4.2. Выделение видоспецифических антигенных

комплексов риккетсий (ВАКР) и их характеристика

3.5. Разработка видоспецифических АЭД на

основе ВАКР Rprowazekii и R. typhi

3.6. Оценка диагностических возможностей

полученных АЭД

3.7. Аспекты дальнейшего использования разработанной

методики получения видоспецифических АЭД

Глава IV. Заключение

Выводы

Библиографический список использованной литературы

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

АЭД - антигенный эритроцитарный диагностикум ВАЭД - видоспецифический антигенный эритроцитарный диагностикум

ВАКР - видоспецифические антигенные комплексы риккетсий

ГСА - гемосенсибилизирующая активность

ЖЭСД - жидкий эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум

ИЭД - иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум

КПЛ - клещевая пятнистая лихорадка

МАКР - мембранные антигенные комплексы риккетсий

нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител

ПАКР - поверхностные антигенные комплексы риккетсий

РА - реакция агглютинации

РНАг - реакция нейтрализации антигена

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РТНГА- реакция торможения непрямой гемагглютинации

СТ - сыпной тиф

СЭСД - сухой сыпнотифозный эритроцитарный диагностикум ФТЭБ - формалинизированные танизированные эритроциты барана

ХСВ - химическая сыпнотифозная вакцина ЭД - эритроцитарный диагностикум

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Видоспецифические антигенные эритроцитарные диагностикумы для определения антител к Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Сегодня все чаще отмечается рост количества случаев новых (emerging) и возвращающихся (re-emerging) риккетсиозных заболеваний, в том числе и эпидемического сыпного тифа (СТ) [92,176].

В прошлом постоянный спутник войн, голода и социально-экономических потрясений - СТ и в настоящее время тесно связан с политическими и экономическими катаклизмами. Подтверждением этому являются эпидемия СТ среди беженцев в Бурунди (заболело 33 тыс. человек с летальностью 30%), очаги тюремного СТ, вспышка СТ в психиатрической больнице Липецкой области, охватившая 29 человек [87,113,165].

В России в 1998 году заболеваемость сыпным тифом, по сравнению с предыдущим годом, возросла в 4 раза (ЗНиСО, №1, 1999). Наблюдаемое в наши дни ухудшение социально-экономического положения в стране, снижение материального благополучия населения, появление бездомных и рост педикулеза, локальные конфликты и поток беженцев значительно осложнили проведение контроля и слежение за этой инфекцией.

В создавшихся условиях проведение серологического мониторинга с целью активного выявления больных, переболевших СТ и болезнью Брилля-Цинссера, приобретает все большую значимость в эпиднадзоре за возвращающимися риккетсиозными инфекциями [176]. На примере локализации и ликвидации очага эпидемического СТ в Липецкой области наглядно продемонстрирована значимость различных серологических тестов (РНГА, РСК, РНИФ, ИФА) в распознавании этой инфекции [87]. Показано, что среди них высокой диагностической значимо-

стью при определении специфических антител в сыворотках больных и переболевших из очага сыпного тифа по чувствительности и выявляемое™ обладала реакция непрямой гемагглютинации. РИГА проста в постановке и не требует применения специального оборудования, что позволяет использовать ее в практических лабораториях любого уровня оснащенности.

Однако, применяемые для постановки РИГА эритроцитарные ди-агностикумы (ЭД) не удовлетворяют требованиям, предъявляемым ВОЗ к современным диагностическим препаратам, в частности, они непригодны для изучения напряженности иммунитета у лиц привитых сыпнотифозными вакцинами, для оценке уровня антител в период реконва-лесценции и внутригрупповой дифференциации риккетсиозов группы СТ. Последнее требование приобретает особую актуальность в настоящее время, в связи с появлением риккетсиозов, вызываемых новыми возбудителями этой группы: R.canada и R.felis [75,144,145,156,179].

Анализ литературы по изучению антигенной структуры риккетсий позволяет предположить, что решение этой проблемы возможно при использовании видоспецифических антигенов риккетсий [130,133,183].

В литературе нет данных, касающихся приготовления ЭД на основе видоспецифических антигенов риккетсий.

Цель настоящих исследований - выделение группо- и видоспецифических антигенов R.prowazekii и R. typhi и создание на их основе антигенных ЭД, обеспечивающих раннюю диагностику эпидемического и крысиного СТ, их межвидовую дифференциацию а также изучение иммунологической перестройки макроорганизма в период реконвалесцен-ции и вакцинации.

Основные задачи:

1.Разработать методику выделения поверхностных антигенов рик-кетсий группы СТ, изучить их иммунохимические и антигенные свойства.

2.Изучить гемосенеибилизирующие свойства поверхностных антигенов, сконструировать на их основе АЭД, провести оценку его специфических свойств.

3.Оптимизировать методику приготовления иммуносорбента для удаления группоспецифических антигенов риккетсий.

4.Изучить возможность получения видоспецифических антигенных комплексов риккетсий (ВАКР), определить их специфическую активность и гемосенеибилизирующие свойства.

5.Сконструировать видоспецифический антигенный эритроцитар-ный диагностикум (В АЭД) Кртоугагеки и В АЭД ЯЛурЫ, оценить их диагностические возможности.

Научная новизна работы.

Впервые разработана технология получения сенситинов из Я-ргоу/агеки, обладающих групповой и видоспецифической активностью. Использование аналитических методов сравнительного изучения периферических структур (поверхностных и "мембранных" антигенных комплексов) риккетсиальной клетки позволило выявить различия в содержании белков, фосфолипидов и гликолипидов. Установлено, что более высокой гемосенсибилизирующей активностью обладают поверхностные сенситины.

Приготовлен оригинальный иммуносорбент на основе геля гидроокиси алюминия и групповых перекрестно-реагирующих иммуноглобулинов, иммобилизованных с помощью глутарового альдегида. Показана его эффективность для удаления группоспецифических антигенов из поверхностных риккетсиальных препаратов.

Впервые разработана методика получения видоспецифических антигенов R.prowazekii и R. typhi. Эти антигены, по данным РИГА с видос-пецифическими F(ab)2 иммуноглобулиновыми ЭД R.prowazekii и R. typhi, не содержат групповых антигенных структур. Методом электрофореза в ПААГ у видоспецифических антигенов R.prowazekii зафиксировано наличие белков с молекулярной массой 100, 120 кД.

Установлена высокая гемосенсибилизирующая активность видоспецифических антигенов, что определило возможность их использования в качестве сенситинов для конструирования ВАЭД.

С помощью разработанных оригинальных ВАЭД показана возможность проведения полной межвидовой дифференциации риккетсиозов группы СТ в РЫТА.

Положения, выносимые на защиту:

1. Поверхностные солюбилизаты содержат групповые и видоспе-цифические антигены, а сенсибилизация ими ФТЭБ позволяет получать АЭД, обладающие широкими диагностическими возможностями, пригодные для ранней диагностики эпидемического и крысиного СТ, межвидовой дифференциации этих риккетсиозов, изучения иммунологической перестройки макроорганизма при реконвалесценции и при вакцинации.

2.Видоспецифические антигены R.prowazekii и R. typhi, выделенные из поверхностных сенситинов методом истощающей иммуно-сорбции, обладают высокими дифференцирующими свойствами и строгой специфичностью.

3.Конструирование ВАЭД на основе В АКР R.prowazekii и R. typhi позволяет не только повысить эффективность диагностики эпидемического и крысиного СТ, но и проводить полную межвидовую дифференциацию этих риккетсиозов в простом диагностическом тесте - РИГА.

4.Целесообразность сочетанного использования групповых и ви-доспецифических АЭД для диагностики риккетсиозов группы СТ, обеспечивающей на первом этапе установление принадлежности инфекции к заболеваниям группы СТ, на втором этапе -определение вида сыпнотифозной инфекции с целью проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В теоретическом плане проведенное исследование расширяет рамки существующих представлений о возможности создания препаратов нового типа, обеспечивающих внутригрупповую диагностику риккетсиозов в РНГА.

Полученный автором фактический материал может представлять интерес для конструирования высокочувствительных и специфичных АЭД для видоспецифической диагностики не только риккетсиозов группы СТ, но и риккетсиозов других таксономических групп.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология получения антигенных эритроцитарных диагностику-мов на основе группо- и видоспецифических антигенов R.prowazekii и R. typhi, позволяющих проводить в РНГА раннюю и внутригрупповую диагностику риккетсиозов группы СТ, определять уровень специфических антител на разных стадиях реконвалесценции и вакцинации.

На препарат составлена и оформлена нормативно-техническая документация в виде экспериментально-производственного регламента, Временной фармакопейной статьи и инструкции по применению на "Комплект эритроцитарных диагностикумов для выявления типо- и видоспецифических антител группы СТ в РНГА".

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на пленарном заседании Пермского общества микробиологов, эпидемиологов и инфекционистов 19 января 1999г.

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на заседании Научно-технического совета Пермского НПО "Биомед" и на расширенном заседании лаборатории экологической генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и кафедры микробиологии Пермской медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 12 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, главы экспериментальной части, заключения и общих выводов. Список литературы включает 183 наименования работ отечественных и зарубежных авторов.

Приведенные в диссертации материалы выполнены при непосредственном участии автора в лаборатории эндемических риккетсиозов ПНИИВС НПО "Биомед" в соответствии с "Отраслевой программой НИР по бактерийным и вирусным препаратам в институтах вакцин и сывороток" (номер государственной регистрации темы 01.958 005346).

Опыты по аминокислотному анализу Я.ргом'агекИ проведены совместно с к.м.н. Л.А.Баратовой (МГУ, НИИФХБ им.Белозерского), по изучению белкового состава антигенов методом электрофореза в ПААГ и специфической активности полученных белков в иммуноблоттинге - с д.м.н., профессором Н.М.Балаевой (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи), исследование полученных антигенов методом электронной микроскопии - с к.б.н. Л.В.Диденко (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи), изучение фосфолипид-ного и белкового состава антигенов - с к.м.н., с.н.с. В.П.Коробовым (ИЭГМ УрО РАН).

Приношу глубокую благодарность всем участникам совместных исследований.

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ АНТИГЕННЫХ РИККЕТСИАЛЬНЫХ ЭРИТРОЦИТАР-НЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ

Обзор литературы

1.1. Реакция непрямой гемагглютинации.

Среди современных методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний широко применяются тесты, основанные на феномене агглютинации эритроцитов, нагруженных антигенами или антителами с гомологичными сыворотками или антигенами [44,52,60,76]. Этот феномен получил название реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Высокая чувствительность и специфичность этой реакции, простота применения, минимум ингредиентов, необходимых для ее постановки, возможность визуальной регистрации - все это способствовало широкому использованию РНГА для выявления риккетсиозных антигенов и антител к ним [ 11,37,84,100,101].

Развитие и становление РНГА как метода серологического анализа тесно связано с работой А.Т.Кравченко и М.И.Соколова [55,89]. Они показали, что эритроциты, на которые предварительно адсорбированы полисахаридные антигены, приобретают способность агглютинироваться на предметном стекле в присутствии гомологичных сывороток.

Позднее Е.Кео^ е!а1 [149], а затем О.М1ск11еЬгоок, К.ОиЬоэ [157] видоизменили РНГА по Кравченко и Соколову, предложив пробирочный вариант реакции.

Однако, широкое использование РНГА в качестве диагностического теста было ограничено из-за слабой сенсибилизации нативных эрит-

роцитов иммунореагентами белковой природы (полноценными микробными антигенами, сывороточными иммуноглобулинами).

Позже, исследованиями S.Bojden [116] было установлено, что антигены белкового происхождения приобретают способность адсорбироваться на эритроцитах, предварительно обработанных таниновой кислотой. Таким образом, расширились возможности использования РИГА для выявления антител. В дальнейшем, в расширении сферы применения РИГА определенную роль сыграли исследования T.Rycaj [170]. Он предложил сенсибилизировать танизированные клетки красной крови сывороточными иммуноглобулинами, что позволило использовать РИГА для индикации антигенов в материалах различного происхождения.

На основе этих двух методических подходов РИГА были предложены ее многочисленные варианты [76].

Для всех предложенных модификаций РИГА необходимо иметь два типа диагностикумов, представляющих собой эритроциты, на поверхности которых экспонированы антигены или антитела.

Эти диагностикумы, в зависимости от иммунохимической природы сенситина, присоединенного к эритроцитам, обозначают "антигеннные" эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для выявления сне-цифических антител и " иммуноглобулиновые" эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для обнаружения микроорганизмов и их антигенов [11].

Впервые принципиальная возможность применения РИГА для диагностики ЭСТ была продемонстрирована S.Chang et al. [120,121]. Авторы на модели антигенов риккетсий различной таксономической принадлежности изучили процесс выделения полисахаридных антигенов, их прикрепления к эритроцитам человека и некоторых животных и детально разработали постановку РИГА при риккетсиозах.

В последующем, в качестве сенситина рядом авторов были использованы различные антигенные реагенты: фосфолипидные антигенные комплексы (ФЛАК), белковые антигены, ЛГТС [19,42,48,93,95].

Прежде, чем перейти к оценке таких зритроцитарных диагности-кумов, рассмотрим основные принципы их приготовления.

1.2. Основные принципы приготовления АЭД.

Разработка высокоспецифичных и чувствительных АЭД, стабильных при хранении, является важнейшим условием полной реализации потенциальных достоинств РИГА. Этот серологический тест относится к простым серологическим двухкомпонентным реакциям. В этой реакции участвуют искомые антитела и антиген, сорбированный на поверхности носителя-эритроцита[57].

Процесс приготовления АЭД состоит из ряда последовательных этапов, основными из которых являются:

- выбор эритроцитов;

- их фиксация;

- получение сенситина;

- сенсибилизация эритроцитов антигенами различной природы;

- стабилизация готового препарата.

Для конструирования диагностикумов большинство исследователей используют в качестве клеточной основы эритроциты [43,45,46,49,50,84,99]. По утверждению Н.Р.Линга и Д.Кетти [60], эритроцит является наиболее пригодным "корпускулярным" носителем и успешно конкурирует с искусственными частицами (полистирол, поли-акриламид и т.д.), поскольку, основанные на применении частиц, агг-лютинационные тесты оказываются менее чувствительными, чем РИГА. Это объясняется целым рядом преимуществ красных клеток крови:

- их общедоступностью и сравнительной простотой получения в "чистом" виде;

- примерно одинаковым размером клеток;

- их способностью образовывать стойкие суспензии в изотонических растворах;

- хорошо выраженной сорбционной способностью [153].

При изготовлении диагностикумов могут быть использованы эритроциты людей и различных животных. При сравнительной оценке устойчивости эритроцитов различного видового происхождения установлено, что в процессе обработки высокой резистентностью обладают эритроциты барана, кур и человека. Среди них наибольший выход эритроцитарной массы наблюдается у эритроцитов барана, наименьший - у эритроцитов кур. Из эритроцитов человека всех групп крови наиболее пригодны для сенсибилизации красные клетки крови 0(1) группы, так как АЭД, приготовленные на их основе, обладают большой специфичностью.

Следует отметить, что свежие эритроциты пригодны к употреблению весьма ограниченное время (4-7 дней) [51,76]. Для длительного сохранения красных клеток необходима была их стабилизация. Одним из методов стабилизации является использование презервируюхцих растворов 1.А1зеуег [103] и В.М.Мигулиной [69], при этом срок хранения эритроцитов увеличивается от 4-х недель до 3-х месяцев, соответственно.

Из методов консервации эритроцитов почти монопольное применение нашла формалинизация, которая насчитывает более 40 модификаций. Формальдегид (СН20) фиксирует строму эритроцитов, не нарушая клеточной организации. Эритроциты после такой обработки сохраняют свою сорбцирнную активность и становятся пригодными для длительного (1-2 года) хранения. Такая фиксация предохраняет эритроциты

от лизиса при различных химических и термических воздействиях. Так, например, эритроциты, фиксированные формалином становятся устойчивыми к нагреванию до 100-120°С, замораживанию и оттаиванию [138].

В литературе имеются описания многочисленных вариантов фор-малинизации эритроцитов, которые различаются между собой по ряду параметров: по видовому происхождению эритроцитов, температурному режиму, объемным соотношениям ингредиентов, по длительности фиксации, концентрации фиксатора и др. [43,45,139,181]. Например, диапазон конечной концентрации формалина в суспензии эритроцитов колеблется от 0,3-1,5% до 10-20% [169].

Ряд авторов считает, что формалин необходимо добавлять к суспензии эритроцитов постепенно в процессе обработки [58,68,139]. Другие считают, что формалин следует добавлять одномоментно [71,84,181].

Процесс формаликизации чаще всего рекомендуется проводить при температуре 1-4°С [148,152]. В отношении продолжительности фиксации эритроцитов формалином мнения исследователей неоднозначны. Длительность обработки эритроцитов фиксатором колеблется в довольно широком диапазоне от 2-х часов [128,139,154] до нескольких суток [43,71,84,146]. В нашей стране применяются, главным образом, следующие методы формалинизации эритроцитов: по 1.Рее1еу [139], по К. \У етЬасЬ [181], 1.1п§гаЬат [146] и его модификация по А.В.Мисенжникову [71], по Ь.СБШпаБ [128] и его модификации по М.И.Леви [58] и А.М.Оловникову [78]. Единого мнения о предпочтительности той или иной методики нет. Считается, что фиксированные по Рее1еу эритроциты могут сорбировать на себе только сенситины небелкового происхождения (полисахариды). Для белковой сенсибилиза-

ции необходимо формалинизировать клетки по методам L.Csizmas или А.М.Оловникова - более длительным и трудоемким.

Однако, диагностикумы приготовленные на основе формалинизи-рованных эритроцитов уступают по серологической активности натив-ным эритроцитам. Кроме того, в процессе хранения такие препараты могут спонтанно агглютинироваться, лизироваться и частично утрачивать активность [52,57,58,112].

Это стимулировало исследователей на поиски новых фиксаторов. Были предложены другие альдегиды алифатического ряда: пировино-градный альдегид [154], глутаровый альдегид [60,112], акролеиновый альдегид [50,77], ацетальдегид [44]. Сведения, имеющиеся в литературе по сравнительной оценке данных бифункциональных соединений, весьма противоречивы. По мнению Bing et al. [112], применение глута-ральдегида для фиксации методически проще формалинизации и обеспечивает получение более стабильных эритроцитов. Напротив, Б.В.Каральник [44] отмечал, что ацетальдегид обладает слабым дубящим действием и, как следствие, является слабым фиксатором эритроцитов.

В поисках универсального реагента для консервирования эритроцитов, Ф.С.Носков [76], Коникова P.E. и соавт.[52] обратили внимание на фиксирующие свойства акрилового альдегида. Эритроциты, обработанные акролеином сохраняли ярко-красный цвет, были стабильны при хранении на протяжении 3-х лет и позволяли получать стандартные клетки, пригодные для сенсибилизации антител различной специфичности и антигенами разной природы. Аналогичные результаты получены при фиксации акролеином эритроцитов человека 0(1) группы крови другими исследователями [50,99].

Оценивая качество полученных фиксированных красных клеток крови, авторы единодушно признают, что эритроциты, независимо от

метода фиксации, должны обладать рядом свойств: практически не отличаться по морфологии от нативных эритроцитов; быть устойчивыми в гипотонических растворах и при экстремальных воздействиях (замораживание, оттаивание); не изменять свойств при консервации методом лиофильного высушивания; сохранять способность поверхностных структур к модификации под влиянием химических реагентов; не утрачивать способности реагировать с антигенами и антителами. Главным из перечисленных свойств является возможность использования фиксированных эритроцитов для сенсибилизации их антигенами или иммуноглобулинами. Для определения антител используют эритроциты, нагруженные антигеном. Методы адсорбции антигенов на эритроцитах будут рассмотрены в следующем разделе настоящей главы.

1.3. Особенности сенсибилизации эритроцитов антигенами поли-сахаридной и белковой природы.

Как указывалось выше, поступательное развитие РИГА началось с основополагающих работ А.Т.Кравченко и М.И.Соколова, установивших, что нативные эритроциты адсорбируют бактериальные антигены полисахаридной природы [55,89].

Небелковые компоненты, например, липополисахариды, проявляют хорошую гемосенсибилизирующую активность. Поэтому предварительной обработки эритроцитов химическими соединениями не требуется, но она может помочь оптимизировать процесс сенсибилизации. Например, после танизации эритроцитов сенсибилизация Уьантигеном проходила за 10 минут, вместо 2-3 часов без нее [44].

Некоторые исследователи [60] указывают, что связывание эритроцитов с полисахаридами природных Л ПС, продуцируемых бактериями (например, ЛПС грамотрицательных бактерий), происходит через ли-

иофильную часть такой молекулы, которая приобретает способность прочно встраиваться в мембрану эритроцита при 37°С. Прикрепившиеся полисахариды экспонируются на поверхности эритроцита и, при постановке РИГА, взаимодействуют с гомологичными антителами. Таким образом, связывание полисахаридов и гаптенов с эритроцитами может происходить при непосредственной инкубации с бактериальным экстрактом.

Помимо этого существует способ связывания полисахаридов и гаптенов с эритроцитами с помощью периодата. При периодатном окислении некоторых групп Сахаров образуются альдегиды, которые в свою очередь ковалентно связываются с аминогруппами на поверхности эритроцитов.

Как показано в многочисленных исследованиях, при приготовлении эритроцитарных диагностикумов надо учитывать химическую природу сенситина. В отличие от ЛПС белки не сенсибилизируют как на-тивные, так и формалинизированные эритроциты без специальной обработки. Был предложен целый ряд соединений, с помощью которых можно присоединить белки к поверхности эритроцитов: танин [116], глутаральдегид [112], бисдиазотированный бензидин (БДБ) [163], диа-минодифениламин [78], дифтординитробензол [154], хлорный хром [147] и т.д.

Из них наибольшую популярность приобрел "одностадийный" реагент глутаровый альдегид. Перекрестное связывание, при добавлении глутаральдегида к смеси отмытых эритроцитов и белкового антигена, происходит быстро, в течение нескольких минут [ПО]. Моментом ограничивающим применение глутаральдегида является возможность модификации тирозольных, имидазольных и сульфгидрильных аминогрупп белка в результате взаимодействия с альдегидом.

Использование хлорного хрома, напротив, обеспечивая эффективное связывание белков с эритроцитами, практически не изменяет сенси-тин [147].

Бис-диазобензидин - один из "одностадийных" реагентов, который давно применяется для связывания антигенов с эритроцитами. БДБ имеет две активные диазогруппы, которые, с одной стороны соединяются с тирозольными и имидазольными группами клеточной поверхности, с другой стороны - с аналогичными группами антигена. Поскольку БДБ добавляют непосредственно к смеси эритроцитов с антигеном, то возникают нежелательные комплексы типа антиген-антиген или эритроцит-эритроцит. Кроме того, этот бивалентный сшивающий агент вызывает модификации антигенов. Поэтому поиски сшиваюших соединений были направлены на получение "двустадийных" реагентов.

Первым "двустадийным" реагентом, получившим наибольшее применение, стал танин (полифенилгликозид растительного происхождения). Механизм действия танина на эритроциты пока недостаточно ясен. Считалось, что он делает поверхность эритроцитов гидрофобной. Некоторыми исследователями установлены морфологические изменения эритроцитов [134], но образование у эритроцитов специфических рецепторов белков, после обработки танином [175], не подтверждено [134].

В исследованиях А.81а"\УЙ8ку [174,175] показано, что танин изменяет структуру и физико-химические свойства эритроцитов, в том числе их проницаемость для анионов, скорость оседания и осмотическую резистентность. Танизированные эритроциты становятся устойчивыми к гемолитическому действию сапонина, хлористого аммония, солей жирных кислот.

По мнению А.К.Адамова и В.И.Агафонова [2], танизация эритроцитов приводит к образованию на их поверхности пленки из молекул

танина, гидроксильные и карбоксильные группы которых придают эритроцитам способность связывать белки.

Исследования последних лет [60] позволяют считать, что добавленный к взвеси эритроцитов танин одной частью своей молекулы связывается с поверхностными протеинами эритроцитов, а другой, белок-связывающей частью, взаимодействует с растворимыми белковыми антигенами. При этом происходит лишь незначительная модификация антигена, либо она совсем отсутствует.

Следует подчеркнуть, что использование любого реагента, типа бифункциональных соединений, требует тщательного предварительного выбора рабочей дозы сенситина и конъюгирующего реагента. Несоблюдение этих условий приводит к снижению чувствительности или даже к негативным результатам РНГА.

Часть молекул сенситина связывается с поверхностью эритроцита прочно, часть - рыхло. Обстоятельные исследования, проведенные Б.В.Каральником [44] показали, что прочное связывание сенситина, которое может быть описано уравнением Лэнгмюра, определяется химическими процессами, тогда как рыхлое связывание обусловлено процессами физической адсорбции. Прочность связывания антигенов с эритроцитами во многом зависит от природы сенситина. По наблюдениям ряда авторов [80], сенсибилизирующая активность антигенов зависит от их структурных особенностей. Например, антигенные субстанции Крго^агеки, полученные солюбилизацией тритоном Х-100, являются универсальными сенситинами (аналогично можно получать сенси-тины других групп риккетсий).

Не менее важное значение на процесс сенсибилизации оказывают такие факторы, как температура, рН среды, концентрация бифункционального сшивающего реагента, концентрация эритроцитов [46,84,95,99].

Однако, выбор рациональных режимов приготовления эритроци-тарных диагностикумов до сих пор осуществляется, в основном, эмпирически и в каждом конкретном случае подбирается индивидуально.

Многими авторами отмечено, что с ростом температуры прочное связывание усиливается, а рыхлое - ослабляется. Поэтому гемосенсиби-лизацию выгоднее вести при высокой температуре. Применение фиксированных эритроцитов дает возможность использовать сравнительно высокую температуру сенсибилизации (до 55°С).

Одним из важных условий процесса сенсибилизации является присутствие электролитов. Данные различных исследователей об оптимальных значениях рН среды не совпадают [44,99]. Как правило, белковые сенситины связываются при рН 6,4 или чуть ниже, сенситины небелковой природы - в более широких пределах и, обычно, в нейтральной области. Поэтому для каждого исследуемого антигена этот показатель подбирается индивидуально. Необходимо отметить, что оценка сенсибилизирующих свойств проводится опосредовано, по активности полученного конечного препарата в РНГА.

Применительно к риккетсиям группы СТ и группы КПП специфическая субстанция, обладающая выраженной способностью сенсибилизировать эритроциты человека, впервые была получена S.Chang [120]. Антигенная субстанция была извлечена из R.prowazekii, R. typhi, R. conori, R.rickettsii, Rakari, очищенных путем щелочного гидролиза при 100°С с последующим освобождением от щелочи методом диализа. Изолированный сенситин не обладал комплементфиксирующей активностью, но адсорбированный на аутологичных эритроцитах, при введении их кроликам, вызывал образование специфических гемагглютини-нов, что позволило отождествить его со специфическим гаптеном.

Химическая природа данного сенситина окончательно не определена. По данным S.Chang, в нем, наряду с полисахаридами, обнаружены и белковые компоненты.

Эти данные получили свое развитие в исследованиях Мельникова [66,67], который, несколько видоизменив методику S.Chang, выделил гаптенные антигены из R.prowazekii, R. typhi, R.conori, R.sibirica, а, также, в работах J.Urvolgyi, который получил гаптен из нового представителя группы СТ R. canada [179].

Сконструированный пермскими исследователями [84] ЖЭСД значительно упростил методику постановки РИГА и сделал ее доступной для практических лабораторий любого уровня оснащенности. Основу этого препарата, который выпускается и в настоящее время, составляют формалинизированные по J.Feeley эритроциты человека 0(1) группы, на поверхности которых экспонированы полисахаридные антигены R.prowazekii, полученный по методике S.Chang.

Позднее специфические сенситины были выделены из "эфирных" и "неэфирных" растворимых антигенов [8], цитоплазмы и клеточных стенок R. typhi [9]. При этом наибольшая специфическая активность была отмечена у сенситинов, выделенных из клеточных стенок. Однако, эти препараты не вышли за рамки лабораторных исследований.

Эритроцитарные диагностикумы, сконструированные с использованием гаптенов, несущих групповую специфичность, оказались непригодными для внутригрупповой дифференциации риккетсиозов, а также тестирования иммунологической перестройки у привитых вакцинами, в частности, химической сыпнотифозной вакциной, и иммунологического мониторинга. Эти недостатки ЭД на основе гаптена послужили стимулом для поиска более совершенных сенситинов.

В 1981 году Е.М.Голиневич [19] предложила использовать в качестве сенсибилизирующего реагента протективный белковый антиген

R.prowazekii и разработала методику его адсорбции на формалинизиро-ванных по R.Weinbach [181] эритроцитах барана. При детальном анализе результатов неспецифических взаимодействий, вызванных использованием вышеупомянутого сенситина, было установлено наличие в нем неспецифических примесей. Удаление последних методом исключающей иммуносорбции значительно повысило результативность РИГА [42,48].

В более поздних исследованиях была установлена высокая гемо-сенсибилизирующая активность фосфолипидного антигенного комплекса риккетсий (ФЛАК) [93,95]. Указанные сенситины готовили по видоизмененной методике M.Volkert и M.Christensen из гомогенизированных инфицированных желточных оболочек куриных эмбрионов. Для этого инфицированную взвесь подвергали термообработке при 100°С и последовательной экстракции эфиром и ацетоном. Выделенными ФЛАК сенсибилизировали ФТЭБ. Результаты сравнительной оценки ЭД на основе ФЛАК с коммерческим ЖЭСД не выявили существенных различий в специфической активности данных препаратов.

1.4. Место РИГА среди регламентированных серологических тестов и ее диагностические возможности.

К регламентированным серологическим тестам относятся РА, РСК, нМФА, РИГА.

РА [162] получила широкое распространение после того, как благодаря методике Н.Сох [125] и J.Craigie [126] стало возможным получать большие количества очищенных риккетсий. РА привлекает своей простотой и доступностью[83]. Наблюдения ряда авторов о диагностической значимости этой реакции позволяют заключить, что РА обладает высокой специфичностью и обеспечивает более раннее выявление за-

болевания, чем РСК. Данная реакция положительна к 3-5-му дню болезни в 70-80% случаев, а к 20-му дню - в 90-100% [37]. Важной особенностью агглютинационного теста является возможность проведения дифференциации эпидемического и крысиного сыпных тифов [38]. Однако, эта реакция имеет и свои недостатки. РА не пригодна для ретроспективной диагностики СТ, так как агглютинины сохраняются в крови лишь на протяжении 5-8 месяцев [38]. Исследователи отмечают, что нечеткость положительных результатов реакции привносит элемент субъективизма. Но все это не умаляет диагностической значимости РА.

Позднее, Castañeda M.R. и Silva R. разработали микровариант реакции агглютинации на стекле. Различные варианты микроагглютинации приближались по чувствительности к РСК и позволяли достаточно четко проводить межвидовую дифференциацию в группе СТ [10].

Широкое применение для диагностики СТ получила РСК. Для исследования сывороток больных РСК впервые была применена в 1917 году. РСК обладает строгой специфичностью и достаточно высокой чувствительностью. Комплементсвязывающие антитела обнаруживаются в сыворотках сыпнотифозных больных с конца первой - начала второй недели болезни и сохраняются в течение нескольких десятков лет [38]. Поэтому РСК применяется для изучения иммунологической структуры населения и для ретроспективных исследований. С помощью этой реакции можно проводить дифференциацию риккетсиозов группы СТ по разнице в титрах между гомологичной и гетерологичной сыворотками (обычно в 2-4 раза). К недостаткам РСК можно отнести сложность и трудоемкость самой методики, необходимость большого количества ингредиентов и большой промежуток времени для прохождения реакции (около 18 часов).

В последние годы широкое применение получает метод флуоресцирующих антител (МФА), при котором в реакцию с антигеном всту-

пают антитела, меченные флуоресцирующим красителем. Под влиянием ультрафиолетового облучения они обеспечивают яркое свечение антигена. Непрямой вариант МФА позволяет выявлять сыпнотифозные антитела и не уступает по специфичности и чувствительности РА. В настоящее время МФА довольно широко используется при экспериментальном изучении почти всех видов риккетсиозов, но практическими лабораториями применяется мало из-за недостаточной оснащенности люминесцентно-микроскопической аппаратурой.

Принципиальное значение для развития РИГА, как метода серодиагностики риккетсиозов группы СТ и группы КПЛ, имели работы S. Chang, Е. Murray, J. Snyder [121]. Авторы на антигенах разных видов риккетсий подробно изучили процесс присоединения риккетсиальных полисахаридов к нативным эритроцитам и детально разработали методику постановки РИГА с полученными АЭД.

С этого времени РНГА с антигенными ЭД нашла широкое применение для обнаружения специфических антител при риккетсиозах, вызванных R.prowazekii, R. typhi, R. conori, R.sibirica, R.rickettsii, R.canada [38,67,101].

Практика применения РНГА позволила установить, что диагностические возможности РНГА ограничены. Как отмечали еще S. Chang и Е. Murray, этот серологический тест пригоден для межгрупповой дифференциации риккетсиозных заболеваний, но не обеспечивает внутри-групповой дифференциации сыпного и крысиного тифов.

В нашей стране этот метод впервые применил Л.А.Мельников [66,67]. По его наблюдениям РНГА отмечается строгой специфичностью. Отмечены лишь перекрестные реакции с родственными антигенами R.prowazekii и R. typhi, а с антигенами группы КПЛ и с сыворотками здоровых лиц и лиц, больных другими заболеваниями, реакция во всех случаях была отрицательной. Исходя из этих данных,

Л.А.Мельников рекомендовал РИГА с нолисахаридным АЭД для групповой диагностики указанных риккетсиозов.

РНГА оказывается положительной нередко уже на 3-4-й дни болезни, т.е. в период, когда комплементфиксирующие антитела еще не выявляются [100]. Гемагглютинины достигают высоких титров (1:20001:50000) на второй неделе заболевания [84].

Неоднозначны мнения о продолжительности регистрации сыпнотифозных антител в РНГА с применением эритроцитарного диагности-кума на основе специфического гаптена. По данным Е.М.Голиневич и В.А.Яблонской [20], выявление специфических антител в РНГА возможно на протяжении 1-3-6 месяцев, В.Ф.Игнатович, И.Н.Кокорин [42,48] указывают менее продолжительный срок обнаружения антител: 1-2 месяца, Л.Н.Астахова [5] - 6 месяцев, K.M.Лобан [61] - 6-8 месяцев. Полученные данные говорят о том, что АЭД на основе полисахаридных сенситинов вступают во взаимодействие со специфическими антителами, образующимися в активной фазе сыпнотифозной инфекции или в ближайший период реконвалесценции. Поэтому РНГА с указанным ди-агностикумом используется для дифференциации свежих случаев заболевания CT от ретроспективно распознаваемых в РСК форм [38].

Весьма ценным качеством этой диагностической пробы является то, обстоятельство, что она позволяет регистрировать не только типичные случаи сыпнотифозной инфекции, ко и все варианты стертого, атипичного, в том числе, бессимптомного течения заболевания и выявляет антитела в значительно более высоких разведениях сывороток, чем РСК.

В отношении определения специфических антител в РНГА у лиц, вакцинированных и ревакцинированных сыпнотифозными вакцинами, в литературе имеются противоречивые данные. По результатам Л.А.Мельникова [67], эритроциты, адсорбировавшие специфический

гаптен дают отрицательные результаты с сыворотками лиц, привитых сыпнотифозными вакцинами, при положительных результатах в РСК (1:10 - 1:160). Напротив, Е.М.Голиневич и В.А.Яблонская [20] отмечают появление гемагглютинов у привитых ЖКСВЕ в 87% случаев, а иммунологический ответ на вакцинацию ХСВ, регистрируемый в РНГА наблюдался в 96,7% случаев [18].

Как показали исследования ряда авторов, иммунологическая перестройка у привитых ХСВ характеризуется быстропроходящим появлением специфических антител (1 месяц), выявляемых в РСК и РНГА с полисахаридным антигеном К.ргомагеки [42,48]. При этом процент се-роположительных реакций при использовании указанных тестов колеблется от 53,8 до 82,8%. Результаты исследования сывороток крови людей, спустя 1-2 месяца после однократной прививки вакциной ХСВ в дозе 96 АЕ, в РНГА, были отрицательные [42,48]. Иные результаты были получены при диагностике СТ с помощью АЭД на основе "протеинового" антигена Я.ргом^агеки [18]. При тестировании иммунологической перестройки у лиц, привитых ХСВ, в РНГА с указанным АЭД были зарегистрированы положительные результаты во все сроки исследования вплоть до 6 лет после последней вакцинации [48].

ИН.Кокорин и соавт. [42] указывают, что РНГА с "протеиновым" АЭД положительна в 100% случаев, по чувствительности в 10 раз превышает РСК, достаточно специфична и остается положительной даже в случаях отрицательных результатов РСК. Авторы не приводят данные о дифференцирующих свойствах "протеинового" АЭД.

Наблюдаемые различия в РНГА с "протеиновым" и полисахаридным АЭД зависят от функциональных особенностей сенситинов, определяющих диагностические возможности препаратов.

Обобщая данные литературы по затронутым вопросам, можно выделить два основных направления совершенствования РНГА, как пер-

спективного метода серологического анализа. Одно из них связано с разработкой и получением сенситинов, расширяющих диагностические возможности АЭД. Другое направление связано с усовершенствованием методических основ получения высококачественных АЭД. Среди них выбор оптимального метода очистки сенситинов, способа сенсибилизации носителя (эритроцитов), повышение специфичности антигенов, вопросы унификации технологии выпуска АЭД.

1.5.Антигенная структура риккетсий группы СТ.

Вероятно, решение поставленных задач, следует искать, опираясь на современные знания об антигенной структуре риккетсий группы СТ, полученные с использованием методов молекулярной биологии.

У Кргоу^агекп методом электрофореза в ПААГ, с последующим проведением иммуноблоттинга с применением моноклональных антител были идентифицированы два вида антигенов: вид ©специфический и групповой [30,39,40,73,108,111,117,167]. Видоспецифический антиген отождествляется с белоксодержащей субстанцией [130,132,135,141, 159,161,173], а групповой антиген - с ЛПС [41,104,183]. Рядом исследователей [62,123,132] показано, что белковые антигены наружной мембраны К.ргомшгеки, с молекулярной массой 120-150 кД, обозначенные как 8РА-белок или основной белок I, обладают выраженными иммуно-генными и протективными свойствами.

Эти исследования представляют для нас особый интерес с точки зрения использования указанных белков для конструирования диагностических препаратов. По данным доступной нам литературы такие исследования не проводились. В исследованиях О.БазсЬ [131], М.Е.Еремеевой [35,137] для выделения основного белка I использовали живые риккетсии, что в условиях работы со значительным объемом

материала представляет определенную опасность в плане инфицирования персонала. Методы очистки риккетсий от клеток хозяина, применяемые авторами, требуют дорогостоящего оборудования и дефицитных реактивов, что также неприемлемо для промышленного выпуска диагностических препаратов. Все это явилось основанием для разработки иной методики получения видоспецифических антигенных комплексов риккетсий.

Именно эти задачи, применительно к диагностике СТ, нашли свое конкретное отражение в наших исследованиях, представленных в настоящей работе.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Ковалева, Татьяна Сергеевна

ВЫВОДЫ

1.Впервые разработана экспериментально-производственная технология получения поверхностного растворимого антигена R.prowazekii, максимально очищенного от компонентов среды культивирования и обладающего групповой и видоспецифиче-ской активностью. По аналитическим данным полученные антигены содержат белки, фосфолипиды и нингидрин-положи-тельные соединения кислого характера.

2.Установлена возможность использования полученного антигена для конструирования группового антигенного эритроцитарного диагностикума, обеспечивающего выявление специфических антител в сыворотках больных на разных стадиях заболевания, а также в сыворотках экспериментальных животных.

3.Разработана методика получения иммуносорбента в котором в качестве матрицы использован гель гидроокиси алюминия, а ли-ганда - групповые перекрестно-реагирующие иммуноглобулины, "сшитые" глутаровым альдегидом. Показана эффективность его использования для удаления группоспецифических детерминант из поверхностных антигенов.

4.Впервые экспериментально доказана возможность получения ви-доспецифических антигенных комплексов из поверхностных антигенов риккетсий. На основе этих комплексов были приготовлены видоспецифические антигенные эритроцитарные диагности-кумы R.prowazekii и R. typhi, обеспечивающие проведение межвидовой дифференциации риккетсиозов группы сыпного тифа в РИГА.

5.Экспериментально показано, что для проведения диагностики риккетсиозов группы сыпного тифа целесообразно использование группового диагностикума, с последующим определением этиологии заболевания с помощью видоспецифических диагно-стикумов.

Глава IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В задачи практического здравоохранения входит контроль за рик-кетсиозными заболеваниями в России, уменьшение возможности их распространения и разработка эффективных мер профилактики. Вы-полнеие этих функций возможно на основе раннего выявления случаев СТ с последующим проведением всего комплекса противоэпидемических мероприятий в очаге инфекции.

Раннее распознавание риккетсиозов должно проводиться с широким использованием простых, общедоступных и стандартных методов лабораторной диагностики. Из применяемых методов серологического анализа РИГА заслуженно занимает первое место. Однако, широкое внедрение этого теста в лабораторную практику для изучения иммунологической структуры населения ограничено по причине невозможности использования выпускаемых АЭД для ретроспективной диагностики , а также непригодности их для межвидовой дифференциации риккетсиозов группы СТ. Это требовало усовершенствования сыпнотифозных АЭД.

Качество диагностического препарата во многом определяется тем, насколько полно представлены в нем основные антигенные структуры, присущие исходному нативному возбудителю. Как свидетельствуют данные литературы, К.ргомгагеШ содержат групповые и видоспецифи-ческие антигены, ответственные за иммунитет, проявляющийся в выработке риккетсиальных антител в организме человека и животного и клеточную индукцию [39,62,73,123,130,132,160,161,167]. Установлено, что видоспецифический антиген является термолабильным антигеном, с молекулярной массой 120 кД, а групповой ангтиген - термостабилен, с молекулярной массой 30-31 кД [30,73,173,177].

До настоящего времени в качестве сенситина для приготовления АЭД использовался полисахаридный антиген (гаптен), полученный путем щелочного гидролиза при 100°С [66,120]. Авторами было отмечено, что полученный полисахаридный АЭД пригоден только для ранней диагностики риккетсиозов группы СТ. Наличие в гаптене групповых антигенов не позволяет проводить межвидовую дифференциацию заболеваний группы СТ.

Вместе с тем, в последние годы все большее внимание уделяется изучению видоспецифических антигенов риккетсий, как возможных кандидатов в вакцины молекулярного типа.

Учитывая исключительный интерес к этим антигенам, нами были проведены исследования по получению видоспецифических антигенных комплексов R.prowazekii и R. typhi, оценена их специфическая и иммунохимическая активность и изучена возможность их использования для конструирования эритроцитарных диагностических препаратов. Предпринимая эти попытки, мы учитывали результаты наблюдений Н.М.Балаевой [8], R.Anacker [105], D.Silverman [171], которые на примере овокультур R.prowazekii наглядно показали, что при простых лабораторных манипуляциях происходит элиминация микрокапсулы - поверхностной структуры возбудителя. Позднее Dasch[132] установил, что в этом слое локализуются иммунодоминантные видоспецифические антигены R.prowazekii белковой природы. Поэтому, нами в качестве исходного сырья были взяты единые корпускулярные антигены, полученные по оригинальной технологии с использованием дифференциального центрифугирования в сочетании с мембранной фильтрацией, которые сохраняли эти основные антигенные структуры.

Исходя из современных представлений о локализации серотипи-руемых антигенов риккетсий, основным объектом изучения были избраны периферические антигены R.prowazekii и R. typhi, а основным методом их выделения - еолюбилизация с помощью неионного детергента тритона Х-100

На основании детального изучения динамики выделения антигенов, экспонированных на поверхности наружной оболочки клеточной стенки Кргом^агекп, в зависимости от температуры, концентрации детергента, временного фактора, были выявлены такие закономерности. С повышением концентрации детергента происходил интенсивный переход в раствор серологически активной антигенной субстанции. Наибольший выход наблюдался при 2%-ной концентрации тритона Х-100 в растворе.

При изучении зависимости между количеством переходящего в раствор антигена и температурой было зафиксировано, что с понижением температуры выход антигена увеличивался, о чем свидетельствуют результаты серологического анализа в РИГА. Температура 0°С была выбрана как оптимальная.

В ходе выяснения зависимости процесса солюбилизации от экспозиции было определено, что контакт детергента с корпускулами риккет-сий в течение одного часа обеспечивает максимальную экстракцию поверхностного антигена.

Выбранные оптимальные параметры солюбилизации позволили выделить поверхностные антигены из наружной оболочки риккетсиаль-ной клетки без нарушения целостности самой клетки, что подтверждается данными электронной микроскопии и иммунофлуоресцентного анализа.

Наличие специфической флуоресценции у микробной клетки после обработки детергентом указывало на сохранение антигенных структур, которые были связаны с мембраной клетки. С целью их изоляции полученные осадки ресуспендировали в физиологическом растворе и выдерживали при низкой температуре. В результате этой операции происходило разрушение клетки на мицеллы и переход в раствор активной фракции (условное название - "мембранные" антигены).

Оба солюбилизата обладали высокой антигенной активностью и выраженной видоспецифичностью. Нами было показано, что полученные АЭД на основе поверхностных и "мембранных" антигенов обеспечивают относительную межвидовую дифференциацию сывороток группы СТ с индексом отношений гомологичной сыворотки к гетерологич-ной 9,48 и 16, соответственно.

Для проведения полной внутригрупповой дифференциации в РИГА, необходимо было освободиться от перекрестно-реагирующих антигенов. Удаление групповых антигенных комплексов с помощью общепринятых методов очистки бактериальных препаратов (осаждение этиловым спиртом, ацетоном) сопровождалось значительными потерями специфического компонента. Поэтому наиболее эффективным методом их устранения была признана истощающая сорбция с помощью иммуносорбента.

Нами был разработан оригинальный способ приготовления стабильного иммуносорбента на основе геля гидроокиси алюминия и гете-рологичного группового иммуноглобулина, прочно иммобилизованного вокруг матрицы с помощью глутарового альдегида.

Удаление групповых антигенов с помощью приготовленного иммуносорбента позволило получить видоспецифические антигенные комплексы риккетсий - ВАКР.

Дальнейшие исследования были посвящены конструированию эритроцитарных антигенных диагностикумов. В этой связи было проведено определение гемосенсибилизирующей активности поверхностных, "мембранных" антигенных комплексов и ВАКР. Было установлено, что все антигенные комплексы обладают высокой сорбционной способностью по отношению к ФТЭБ . Судя по величине оптимальной дозы, наибольшей ГСА обладали поверхностные антигены и ВАКР. "Мембранные" антигены обладали меньшей ГСА, хотя приготовленные на их основе препараты обеспечивали выявление специфических антител в диагностических сыворотках в высоких титрах.

Для объективной характеристики видоспецифических свойств разных АЭД был разработан тест-набор сывороток, включающий иммунные и реиммунные сыворотки группы СТ и группы клещевой пятнистой лихорадки.

На основании детального изучения влияния ряда факторов, определяющих эффективность сенсибилизации, были установлены оптимальные условия приготовления АЭД. Основными из них являются: формалинизация эритроцитов по Пп^аЬат в модификации А.В.Мисенжникова [71], обработка танином по 8.Воуёеп [116] в разведении 1:20000, сенсибилизация поверхностными риккетсиальными антигенами в дозе 1,25 мг/мл в течение 1 часа при температуре 50°С и рН среды 6,4.

Факт повышения ГСА "тритоновых" сенситинов по сравнению с традиционными сенситинами допускает предположение, что детергенты, вступая в реакцию с липидным комплексом поверхностных структур риккетсиальной клетки и дезагрегируя его, тем самым открывают участки, комплементарные рецепторам эритроцитов [44,64].

В литературе нет данных о существовании АЭД для проведения межвидовой дифференциации риккетсиозных сывороток в РНГА. Коммерческий АЭД на основе полисахаридного гаптена Я.ргом^агекп для этого непригоден, так как сенситин содержит групповые антигены.

Использование препаратов, сконструированных на основе ВАКР, позволило проводить не относительную, а полную межвидовую дифференциацию сывороток к риккетсиям группы СТ.

Определяющим для характеристики свойств приготовленных диаг-ностикумов являются результаты оценки их диагностических возможностей.

Препараты на основе "тритоновых" сенситинов обладали высокой серологической активностью в отношении иммунных и реиммунных сывороток диагностических сывороток животных, сывороток сыпнотифозных больных на всех этапах развития инфекции и лиц, вакцинированных химической сыпнотифозной вакциной в отличие от коммерческого препарата (ЖЭСД), выявляющего специфические антитела в диагностических титрах только у больных в активной фазе сыпнотифозной инфекции и в иммунных диагностических сыворотках. Особо следует подчеркнуть, что в сыворотках морских свинок специфические ге-магглютинины с помощью полисахаридного АЭД не определяются, а применение АЭД на основе поверхностных сенситинов позволило выявлять эти антитела в РИГА.

Результаты этих наблюдений позволили расширить рамки применения АЭД и рекомендовать препараты не только для выявления рик-кетсиозов у больных, но и изучения иммунологической структуры населения в очагах инфекции, оценки напряженности иммунитета у вакцинированных.

Расширение диагностических возможностей разрабатываемых АЭД мы связываем с наличием в сенситинах белковых компонентов риккетсиальных клетки, обладающих серологическими и иммуноген-ными свойствами. Это подтвердили и результаты химического, имму-нохимического и аминокислотного анализов, показавших, что сенсити-ны являются сложным высокомолекулярным комплексом, включающим белки, фосфолипиды, гликолипиды и нингидрин-положительные соединения кислого характера.

По данной технологии было приготовлено 42 серии группового АЭД на основе поверхностных антигенов Rprowazekii, 8 серий ВАЭД на основе ВАКР Rprowazekii и 4 серии ВАЭД на основе ВАКР R. typhi.

Полученные и подтвержденные на протяжении последних лет положительные результаты по конструированию видоспецифических ди-агностикумов послужили основанием для разработки и оформления научно-технической документации на "Комплект эритроцитарных диагно-стикумов для выявления типо- и видоспецифических антител группы СТ в РИГА".

Заключая проведенные исследования, хотим подчеркнуть, что они представляют интерес не только для создания эффективных АЭД по выявлению антител к Rprowazekii и R. typhi, но и для идентификации антител к риккетсиям других таксономических групп .

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ковалева, Татьяна Сергеевна, 1999 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ

1.Авакян A.A. Природа и место риккетсий в системе микроорганизмов // Известия АН СССР, Сер. Биол.-1971.-№5.-С.743-748.

2.Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антигены, антитела и иммуносорбенты.-М.: Медицина,1969.-175с.

3.Александрова Л.В. Усовершенствование технологии приготовления корпускулярного антигена риккетсий Провачека // Автореф. дисс. канд. биол. наук.-Пермь,1997.

4.Анискович Л.Л., Еремеева М.Е., Бадаева Н.М., Игнатович В.Ф., Артемьев М.И., Емельянов В.В., Смирнова Н.С. Методы выделения биологически активных риккетсий Провачека, полностью освобожденных от ткани хозяина, и их поэтапный анализ // Acta virologica.-1989.-33(4).-Р.361-370.

5.Астахова Л.Н., Матвеева М.В. Реакция гемагглютинации как ценный метод лабораторной диагностики сыпного тифа // Лаб. дело -1960.-№4.-С.34-36.

6.Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медгиз, 1962.-180 с.

7.Балаева Н.М. Единый корпускулярный антиген для реакции агглютинации и реакции связывания комплемента // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1960.-X29.-C.88-92.

8.Бадаева Н.М., Никольская В.Н. Иммунологическая характеристика растворимого антигена риккетсий Провачека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1966.-№6.-С.98-102.

9.Балаева Н.М., Гулевская С.А. Сравнительная характеристика "неэфирных" и "эфирных" растворимых антигенов риккетсий Провачека

и электронномикроскопические данные о морфологии риккетсий в процессе получения антигенов // Журн. гиг., эпидем., микробиол. и имму-нол. (Прага).-1972.-№16(1).-С.87-95.

Ю.Барбан П.С., Мирский В.Я. Иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации риккетсий. Сообщение 1. Микроагглютинация риккетсий Провачека и Музера // Лаб.дело.-1973.-№1.-С.28-30.

П.Барбан П.С., Мисенжников A.B. Некоторые технологические принципы конструирования стабильных иммуноглобулиновых эритро-цитарных диагностикумов // Вопр.риккетсиологии: Сб.научн.тр. -Пермь, 1974.-Т.124.-Вып. 1 .-С.66-70.

12.Барбан П.С., Пантюхина А.Н., Мисенжников A.B., Мирский В.Я. Производство антириккетсиозных сывороток на лошадях. Сообщение I. Получение и апробация иммунной сыворотки к R.prowazekii // Журн. микробиол., иммунобиол. и эпидемиол. -1974.-№8.-С.16-19.

П.Барбан П.С., Мисенжников A.B. Конструирование стабильных иммуно-глобулиновых эритроцитарных диагностикумов. Сообщение I. Фиксация эритроцитов и их сенсибилизация специфическими иммуноглобулинами // Журн. микробиол., иммунобиол. и эпидемиол. -1979.-№4.-С.50-56.

14. Барбан П.С., Ковязина Р.Н., Пантюхина А.Н., Бердичевская Л.И., Канина А.Г. К проблеме внутригрупповой дифференциации риккетсий группы сыпного тифа // Вопр. Риккетсиологиии: Мат. Всесоюзн. конф. "Эпидемиология, диагностика и профилактика риккетсиозов".-М.Д985.-С.5-7.

15.Барбан П.С., Пшеничнов P.A., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ// Свердловск, 1988.-С.46-75.

16.Блохин К.В., Гольдин Р.Б., Нгуен В.Н., Прусакова З.М. Опыт применения непрямого метода флуоресцирующих антител для изучения

и серодиагностики эндемических риккетсиозов // Вопр.риккетсиологии: Сб.научн.тр. -М.Д979.-Вып.2(1).-С.51-52.

17.Вайсман И.Ш., Барбан П.С., Сазонова JI.A., Мисенжников A.B., Мирский В.Я. Изучение реакции непрямой гемагглютинации на уровне ультраструктур // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1978.-№7.-С. 136-140.

18.Голиневич Е.М. Характеристика иммуногенной активности про-тективного антигена риккетсий Провачека (химической сыпнотифозной вакцины) в опытах на лабораторных животных // Вопросы инфекционной патологии и иммунологии. -М.: Медицина, 1976.-С.140-171.

19.Голиневич Е.М. Реакция непрямой гемагглютинации с протек-тивным антигеном риккетсий Провачека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1981.-№8.-С.58-62.

20.Голиневич Е.М., Яблонская В.А. Живая сыпнотифозная вакцина из штамма Е риккетсий Провачека // Журн. гиг. эпидемиол. микробиол. и иммунол. (Прага).- 1962.-7(3).-С. 220.

21.Голиневич Е.М., Воронова З.А. Поверхностный протективный антиген риккетсий Провачека // Журн. гиг. эпидемиол. микробиол. и иммунобиол. -1968.-Т.12.-С.23-30.

22.Голиневич Е.М., Воронова З.А., Гудима О.С. Химическая сыпнотифозная вакцина. Сообщение I. Иммуногенная субстанция риккетсий Провачека, ее получение и характеристика // Вестник АМН СССР. -1969.-Ш0.-С.63-77.

23.Голиневич Е.М., Воронова З.А., Дутова Г.М. и др. Химическая сыпно-тифозная вакцина. Сообщение II. Иммуногенные свойства // Вестник АМН СССР. -1969.-№10.-С.77-94.

24.Гольдин Р.Б., Амосенкова Н.И. Изучение и диагностика риккетсиозов при помощи метода флуоресцирующих антител // Методическое пособие. -Л., 1961.-С.50.

25.Гольдин Р.Б., Волкова JI.A. Унификация и повышение эффективности серологической диагностики риккетсиозов и орнитоза при помощи непрямого метода люминесцирующих антител // Военномед. журн. -1967.-№9.-С.74-79.

26.Гольдин Р.Б., Прусакова З.М., Красник Ф.Н. Принципы и методы получения риккетсиозных и орнитозных сывороток для приготовления из них стандартных флуоресцирующих конъюгатов. Сообщение II. Схемы и методы получения высокоактивных риккетсиозных сывороток // Паразитарные и природноочаговые инфекции. -1970.-№37.-С.164-170.

27.Гудима О.С. Особенности структурной организации риккетсий //Вестн. Акад. Мед.Наук -1969.-№10.-С.35-40.

28.Гудима О.С., Алимов Ж.А., Авакян А.А. Ультраструктура риккетсий Музера // Журн. микробиол., иммунобиол. и эпидемиол.-1973.-№10.-С.88-91.

29.Демкин В.В., Рыдкина Е.Б. Быстрый метод очистки риккетсий от тканей желточного мешка куриных эмбрионов для целей изучения хромосомной ДНК возбудителя методом ДНК-зондирования // Вопр. риккетсиологии: Сб. научн. тр. -М.Д994.-С.57-61.

30.Дробышевская Е.И., Недялков Ю.А., Спицын С.В., Макарова В.А., Дуйсалиева Р.Г., Тарасевич И.В., Нестеренко В.Г. Моноклональ-ные антитела к видоспецифическим и групповым антигенам Rickettsia prowazekii // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1990.-№10.-С.102-104

31.Дулатова М.В., Алексеева В.Н., Головачева С.Н., Савицкая О.В., Анфиногенова А.Н. Изучение причин неспецифических реакций с антигенными эритроцитарными диагностикумами // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1983.-№4.-С.67-71.

32.Емельянов В.В. Методы получения мембранных фракций и полипептидный состав внешней мембраны Rickettsia prowazekii // Вопро-

сы риккетсиологии: Матер.1У Всесоюзн.конф. "Актуальные вопросы эпид.диагностики, лечения и профилактики риккетсиозов". -М., 1980.-С.4-7.

33.Емельянов В.В. Селективная солюбилизация и биохимический анализ белков внешней мембраны Rickettsia prowazekii // Биохимия.-1992.-№8.-С.1196-1205.

34.Еремеева М.Е. Инактивация концентрированных суспензий Rickettsia prowazekii // Сб.: Вопр.риккетсиологии.-М., 1988.-С.25-29.

35.Еремеева М.Е., Лапина Е.Б., Балаева Н.М., Игнатович В.Ф., Бе-лоусова Л.С., Дмитриев Б.А. Электрофоретическая и иммунохимиче-ская характеристика белков штаммов Rickettsia prowazekii различной вирулентности //Молек. ген., микробиол., вирусол. -1989.-5.-Р.20-26.

Зб.Затуловский Б.Г., Бондаренко В.И. Сравнительная характеристика серологических методов диагностики сыпного тифа //Лаб. дело -1960.-№4.-С.36-41.

37.3дродовский П.Ф. Сыпной тиф и болезнь Брилля // М.: Медицина, 1965.

38.3дродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и рик-кетсиозах// 3-е изд. перераб. и доп. -М.: Медицина, 1972.-С.

39.3езеров Е.Г., Логинов B.C., Березнева A.C. Полипептидный и фосфолипидный состав оболочки Rickettsia prowazekii и ее иммуноген-ные свойства // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1985.-№6.-С.6-13.

40.3езеров Е.Г., Логинов B.C., Костюков В.И. Биохимиченское и иммунохимическое изучение антигенных препаратов риккетсий Прова-чека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1986.-№1.-С.77-81.

41.3езеров Е.Г., Логинов B.C., Еременко Ю.Д., Корнеев М.А., Про-скрякова О.Ф. Оболочка риккетсий Провачека: жирнокислотный состав

и некоторые иммунобиологические свойства // Вопр.риккетсиологии. -М.-1988.-С.43-46.

42.Игнатович В.Ф., Белоусова JI.C., Никольская В.Н., Кекчеева Н.Г. Применение РНГА с "протеиновым" антигеном риккетсий Прова-чека для определения иммунологической перестройки у привитых ХСВ // Вопр.риккетсиологии.-М., 1985.-С.22-24.

43.Каральник Б.В. Стабилизация и применение стабилизированных эритроцитов в лабораторной практике (обзор литературы). I. Методы стабилизации // Лаб.дело, - 1972.-№12.-С.723-726.

44.Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. -М.: Медицина, 1976.

45.Каральник Б.В., Канатов Ю.В., Трошина Г.И. Сравнение методов формалинизации бараньих эритроцитов по Фили и Чизмесу для приготовления стабильных эритроцитарных диагностикумов // Лаб.дело. -1968.-№11.-С.694.

46.Касатова O.A. Конструирование и испытание жидкого эритро-цитарного сыпнотифозного диагностикума для реакции непрямой ге-магглютинации // Автореф. дисс. канд. мед. наук. -Пермь, 1968.-15 с

47.Кейтс М. Техника липидологии: Пер. с англ. -М.: Мир, 1975.715 с.

48.Кокорин И.Н., Мискарова Э.Д., Абросимова Т.Е., Пушкарева В.И., Кекчеева Н.Г., Белоусова Л.С. Реакция непрямой гемагглютина-ции с очищенным протеиновым антигеном риккетсий Провачека // Вопр.риккетсиологии.-М., 1985.-С.28-29.

49.Колотов В.М. Разработка технологических принципов получения сухих диагностических препаратов для РТА, РНГА и их вариантов на основе фиксированных акролеином эритроцитов // Вопр. риккетсио-логии: Сб.научн.тр. -Пермь,1974.-Т.124.-Вып.1.-С.77-82.

50.Колотов В.М. Сравнительная оценка акролеинового и формалинового методов фиксации эритроцитов - клеточной основы диагностических препаратов для РГА, РТГА и их вариантов // Вопр. риккетсио-логии: Сб.научн.тр. -Пермь, 1974.-Т.124.-Вып.1.-С.82-87.

51.Коникова P.E., Баяр Г.А. К усовершенствованию методики консервирования эритроцитов для реакции непрямой гемагглютинации // Лаб. дело,-1967.-№4.-С.242-243.

52.Коникова P.E.,Носков Ф.С., Баяр Г.А. Разработка эритроцитар-ных препаратов для выявления антигенов и антител в РНГА. В кн.: Реакция непрямой гемагглютинации // Тр. инст. им.Пастера.-Л.,1981.-56.-С.13-31.

53.Кононова O.A., Тарасевич И.В., Помазанов В.В., Храмов E.H., Минаев В.А. Новый метод очистки риккетсий // Вопр.риккетсиологии: Сб.научн.тр. -М.Д994.-С.56-59.

54.Костромина Е.Е. Сравнительное изучение серологической активности корпускулярных и растворимых риккетсиозных антигенов // Вопр.риккетсиологии: Сб.научн.тр. -Пермь, 1974.-Т. 124.-Вып. 1 .-С.43-46.

55.Кравченко А.Т. Быстрый и ранний метод диагностики возбудителей инфекционных заболеваний в выделениях больного и окружающей среде // Журн. эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. -1947.-№2.-С.25.

56.Крю Ж. Биохимия. Медицинские и биологические аспекты.- М.: Медицина, 1979.

57.Леви М.И. Общие закономерности серологических реакций // В кн.: Практическая иммунология.-М.,1969.-С.20-45.

58.Леви М.И., Басова H.H., Сучков Ю.Г., Орлова Г.М., Герасюк Л.Г., Момот А.Г. Реакция пассивной гемагглютинации и реакция нейтрализации антител при некоторых инфекциях // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1962.-№10.-С.40-45.

59.Леви М.И., Поверенный A.M. Применение реакции пассивной гемагглютинации для обнаружения антител к ДНК // Журн. гиг., эпиде-миол., микробиол. и иммунол.(Прага). -1965.-№9.-С.418.

60.Линг Н.Р., Кетти Д. Гемагглютинация и реакция антителозави-симого гемолиза. В кн.: Антитела. Методы: Пер. с англ./ Под ред. Д.Кетти. -М.: Мир, 1991.-С.238-270.

61.Лобан K.M. Важнейшие риккетсиозы человека. -Л.Д980.-С.31-

218.

62.Логинов B.C., Зезеров Е.Г., Ереськин A.B. Изучение полипептидного состава и протективных антигенов риккетсий Провачека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1982.-№12.-С.78-83.

63.Лопаткина В.В. Анализ санитарно-эпидемиологических ситуаций в России в 1998 г. // ЗНиСО. -1999.-№1(70).-С.1-4

64.Мазрухо Б.Л., Поляков И.И. Получение и использование холерного антигенного эритроцитарного диагностикума // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1976.-№1.-С.26-30.

65.Марков В.И., Кругликовская С.П., Лазаренко В.Н., Корнеева М.А., Пшеничнов В.А. Получение и характеристика моноклональных антител к антигенам оболочки риккетсий Провачека // Вопросы риккет-сиологии. -М.,1989.-С.80-84.

66 .Мельников Л.А. серологическая диагностика рикетисозов группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки методом гемагглютинации. Сообщение Т. Методика приготовления антигена и постановка реакции // Вопр.вирусологии. -1957.-№1.-С.17-21.

67.Мельников Л.А. Серологическая диагностика риккетсиозов группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки методом гемагглютинации. Сообщение II. Специфичность реакции // Вопр.вирусологии. -1959.-№3.-С.268-272.

68.Меньшов П.Н., Шмутер М.Ф. Формалинизадия эритроцитов с помощью мешалки // Проблемы особо опасных инфекций.-] 969.-№5,-С.202.

69.Мигулина В.М. Применение сухого комплемента и консерванта бараньей крови в реакции Вассермана /./ Автореф. Дисс.канд.мед.наук,-Л.,1953.

70.Мирский В.Я.. Ильина М.И. Применение иммунофлуоресцент-ной реакции микроагглютинации для дифференциальной диагностики заболеваний группы сыпного тифа // Вопр.риккетсиологии: Сб.научн.тр. -Пермь, 1974.-Т.! 24,-Вып. 1 .-С. 105-108.

71 .Мисенжников А.В. К методике изготовления и лиофильного высушивания танизированных эритроцитов - клеточной основы эрит-роцитарных диагноста ку м ов // Клещевой энцефалит, нейроонкология, вопросы психиатрии. -Пермь, 1970.-Т.96.-С.57-59.

72.Мисенжников А.В., Лазаревич С.Н. К вопросу о приготовлении гемосенсибилизирующего антигена из риккегсий сибирика II Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии. -Пермь, 1994,-С.26-27.

73.Недялков Ю.А., Спицын С.В., Дробышевская Э.И., Гостева В.В., Клицунова Н.В.,Смирнова Н.С., Тарасевич И.В., Нестеренко В.Г. Изучение поверхностных антигенов Rickettsia prowazekii при помощи моноклональных антител // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. -1990.-№5.-С.94-97.

74.Недялков Ю.А., Дробышевская Э.Н., Климчук Н.Д., Нестеренко B.I ., Тарасевич И.В. Выявление Rickettsia prowazekii в переносчиках сыпного тифа Pediculus humantis с использованием препаратов на основе моноклональных антител // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. -1990. -№8. -С. 71 -74.

75.Никольская В.Н., Балаева Н.М. Серологический анализ антигенной структуры риккетсий Канада // Вопросы инфекционной патологии и иммунологии. -М.: Медицина, 1976.-С.200-208.

76.Носков Ф.С. Реакция непрямой гемагглютинации. В кн.: Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Перадзе Т.В.-М.: Медицина, 1985.-С.98-120.

77.Носков Ф.С., Лернер О.М., Эртте А.П. Применение РИГА для обнаружения вируса осповакцины // Вопр.вирусологии. -1970.-№5.-С.614-618.

78.0ловников A.M. Определение содержания антигенов по агглютинации эритроцитов, покрытых поликонденсированными тетразотатом диаминодифениламина белками антисыворотки // Докл.АН СССР. -1966.-Т. 169.-С. 1180.

79.0стерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.: Наука, 1985.-С.48-63, 221-224.

80.Пантюхина А.Н., Александрова Л.В., Петров В.Ф. Изучение диагностической ценности межвидового эритроцитарного сыпнотифозного диагностикума // Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии.-Пермь, 1994.-С .3 5-3 8

81.Пушкарева В.И., Кокорин И.Н. Антигенная структура риккетсий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1985.-№12.-С.73-78.

82.Пушкарева В.И., Кекчеева Н.Г., Кокорин И.Н. Иммуногенность ХСВ и корпускулярного радиоантигена, полученного из риккетсий Провачека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1986.-№1.-С.73-76.

83.Пшеничнов P.A., Райхер Б.И., Файдыш А.И. Реакция цветной микроагглютинации с риккетсиозным антигеном, как метод специфической диагностики сыпного тифа // Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол.-1954.-№7.-С.13-14.

84.Пшеничнов P.A., Колотов В.М., Касатова O.A. Жидкий эритро-цитариый сыпнотифозный диагностикум для реакции непрямой гемагг-лютинации // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1967.-№9.-С.62-64.

85.Райхер Л.И. К изучению риккетсиозных антигенов. Сообщение 2. Авидность растворимого и корпускулярного антигена риккетсий Провачека // Вакцины и сыворотки. Материалы по производству. -М.,1965.-Вып.3.-С. 103-106.

86.Рыдкина Е.Б., Артемьев М.И., Балаева Н.М., Игнатович В.Ф., Демкин В.В. Изучение генома риккетсий методом рестрикционного анализа ДНК // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1990.-№3.-С.85-89.

87.Савельев С.И., Щукина И.А., Мищук В.И., Тарасевич И.В. и др. Вспышка эпидемического сыпного тифа в Липецкой области // ЗНиСО. -1998.-№1.-С.7-11.

88.Снайдер Дж. Сыпнотифозные лихорадки. В кн.: Вирусные и риккетсиозные инфекции человека.- М.:Иностр.лит-ра.-1955.-С.645-682.

89.Соколов М.И. О способности эритроцитов адсорбировать полный антиген бактерий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1946.-№10.- С. 81.

90.Сомов Г.П., Виноградов В.Я. Методика приготовления сухого эритроцитарного диагностикума для непрямой реакции гемагглютина-ции // Тезисы докл. юбил. конф. Владивост. ИЭМ. -1966.- С.72.

91.Тарасевич И.В. Развитие учения о риккетсиозах // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1979.-№3.-С.3-8.

92.Тарасевич И.В. Введение // ЗНиСО. -1998.-№1.-С.З.

93.Тарасевич И.В., Фетисова Н.Ф. Сыпной тиф // ЗНиСО. -1995.-№2.-С.9-15.

94.Тимашева O.A. Фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа (экспериментальные материалы по выделению, характеристике и аспектам практического использования) // Автореф. дисс. док. мед. наук.-Челябинск,1997.-37с.

95.Тимашева O.A., Горовиц Э.С., Тупицын A.B. Химический состав и иммунохимическая характеристика фосфолипидных антигенных комплексов риккетсий группы сыпного тифа // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1990.-№2.-С. 109-110.

96.Тупицын A.B. Выделение и характеристика фосфолипидных антигенных комплексов риккетсий группы сыпного тифа. -Дисс. канд. мед. наук. -Пермь, 1986.

97.Финдлей Дж.Б. Выделение и модификация мембранных белков и пептидов: Биологические мембраны.Методы: Пер. с англ./ Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. -М.: Мир,1990.-С.251-308.

98.Царевский Ю.П., Каральник Б.В. Молекулярные аспекты взаимодействия альбумина и танизированных эритроцитов в процессе гемо-сенсибилизации. Сообщение Т // Журн.микробиол.,эпидемиол.и иммунобиол. -1975.-№4.-С.98-102.

99.Шустов А.Д. Сухой эритроцитарный сыпнотифозный диагнос-тикум для РИГА // Автореф. дисс. канд. мед. наук -Пермь, 1973.

ЮО.Эпштейн-Литвак Е.Ф., Васильева Л.К. Реакция гемагглютина-ции при сыпном тифе // Сб.: Риккетсиозы. -1958.-С.152-160.

101.Яблонская В.А. Диагностическая ценность реакции гемагглю-тинации при сыпном тифе // Журн.микробиол.,эпидемиол.и иммунобиол.-1959.-№5.-С.111-115.

102.Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Дюйсалиева Р.Г., Барбан П.С. Риккетсиозные антигены для нМФА // Вопр.риккетсиологии: Сб.научн. тр. -М, 1984.-Вып.З.-С.87-89.

103.Alsever J. A new method for the preparation of dilute blood plasma and the operation of a compete transfusion service // N.-J.State J.Med.-1945.-41(1).-P.126-131.

104.Amano K.-L, Williams J.C., Dasch G.A. Structural properties of the lipopolysaccharides from Rickettsia typhi and Rickettsia prowazekii and their chemical similarity to the lipopolysaccharide from Proteus vulgaris 0X19 used in the Weil-Felix test // Infection and Immunity. -1998.-V.66.-No.3.-P.923-926.

105.Anacker R.L., Pickens E.G., Lackman D.B. Details of the ultrastructure of Rickettsia prowazekii grown in the chick yolk sac // J. Bact. -1967.-№94.-P.260-262.

106.Anacker R.L., Philip R.N., Thomas L.A., Casper E.A. Indirect hemmagglutination test for detection of antibody to Rickettsia rickettsii in sera from humans and common laboratory animals // J. Clin. Microbiol. -1979.-10(5).-P.677-684.

107.Anacker R.L., List R.N., Mann R.E., Weidbrauk D.L. Antigenic heterogeneity in high- and low-virulence strains of Rickettsia rickettsii revealed by monoclonal antibodies // Infect. Immun. -1986.-51.-P.653-660/

108.Anderson B.E., Tzianabos T. Comparative sequence analysis of a genus-common rickettsial antigen gene // J. Bacteriol. -1989.-171(9).-P.5199-5201.

109.Artemev M.I., Ignatovich V.F.,Rydkina E.B., Lichoded L.J., Balayeva N.M., Demkin V.V. Restriction fragment length polymorphism of the DNA of typhus group Rickettsiae //Acta Virol. -1991.- 35(6).-P.526-530.

110.Avrameas S., Tandon B., Chullon S. Glutaraldehyde, cyanuric chlorid and tetraazotized-O-dianizidine (TOD) as coupling reagents on the passive haemagglutination test // Immunocytmistry.-1969.-6(l).-P.67-76.

11 l.Beati L., Kelly P.S., Mason P.R., Raoult D. Species-specific Balb/c mouse antibodies to rickettsia studied by Western blotting // FEMS" Microbiology Letters. -1994.-119.-P.339-344.

112.Bing D.H., Weyand J.G.M., Stavitsky A.B. Hemagglutination with aldegyde-fixed erythrocytes for assay of antigens and antibodies // Proc. Soc. exp. Biol. -1967.-124.-P.1166.

113.Bise G., Coninx R. Epidemic typhus in a prison in Burundi // Trans, of the R. Soc. ofTrop. Med. andHyg. -1997.-91(2).-P.133-134.

114.В1аск C.M., Tzianabos Т., Roumillat L.F., et al. Detection and characterization of mouse monoclonal antibodies to epidemic typhus rickett-siae//J. Clin. Microbiol. -1983.-18(3).-P.561-568.

115.BlighE.G., Dyer W.J. //Can. J. Biochem. Phisiol. -1959.-37.-P.911. - Цитируется по кн. Кейтса M. Техника липидологии -М.: Мир, 1975.

116.Boyden S.V. The adsorption of protein on erythrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera // J. Exp. Med. -1951 .-V.93.-№ 1 .-P. 107-120.

117.Carl M., Vaidya S., Robbins F.M., Ching W.-M., Hartzman R.J., Dasch G.A. Heterogeneity of CD4-pozitive human T-cell clones which recognize the surface protein antigen of Rickettsia typhi // Infect. Immun. -1989.-57(4).-P. 1276-1280.

118.Carl M., Dobson M.E., Ching W.M.,Dasch G.A. Characterization of the gene encoding the protective paracrystalline-surface-layer protein of Rickettsia prowazekii: presence of a truncated identical homolog in Rickettsia typhi//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990.-87(21).-P.8237-8241.

119.Carl M., Tibbs C.W., Dobson M.E., Paparello S., Dasch G.A. Diagnosis of acute typhus infection using the polymerase chain reaction //J. Infect. Dis. -1990.-I61(4).-P.791-793.

120.Chang S.M. A serologically active erythrocytes-sensitizing substance from typhus rickettsiae. 1. Isolation and titration// J. Immunol. -1953.-V.70.-P.212-214.

121.Chang S.M., Snyder J.C., Murray E.S. A serologically active eryth-rocyte-sensitizing substance from typhus rickettsiae. 2. Serological properties //J. Immunol. -1953.-V.70.-P.215-221.

122.Ching W.-M., Carl M., Dasch G.A. Mapping of monoclonal antibody binding sites on CNBr fragments of the S-layer protein antigens of Rickettsia typhi and Rickettsia prowazekii // Mol. Immunol. -1992.-29(1).-P.95-105.

123.Ching W.-M., Wang H., Jan B., Dasch G.A. Identification and characterization of epitopes on the 120-kilodalton surface protein antigen of Rickettsia prowazekii with synthetic peptides // Infect. Immun. -1996.- 64(4).-P. 1413-1419.

124.Coombs R.R.A. A new test for the detection of weak and "incomplete" RH agglutinins //Brit. J. Exp. Path. -1945.-V.26.-№4.-P.255-266.

125.Cox H.R. Use of yolk sac of developing chick embryo as medium for growing rickettsiae of Rocky Mountain fever and typhus groups // Pub.Health Rep.-193 8.-53 .-P.2241 -2247.

126.Craigie J. Application and control of ethylether-water interface effect to the separation of rickettsiae from yolk sac suspensions // Canad .J.Res.-1945.-23.-P. 104-114.

127.Craigie J., Watson D.W., Clark E.M., Malcomson M.E. The serological relationships of the rickettsiae of epidemic and murine typhus // Canad. J. Res. -1946.-24.-P.84-103.

128.Csizmas L. Preparation of formalinized erythrocytes // Proc. soc. exp. Biol.-1960.-V. 103 .-P. 157.

129.Mc Dade M.C., Black C.M., Redus M.A., Reimer C.B. Epitope mapping of typhus rickettsiae I I In: Kazar J. Rickettsia and rickettsial dis-eases.-Bratislava:Veda.-1985.-P.46-53.

130.Dasch G.A. Isolation of species-specific protein antigens of Rickettsia typhi and Rickettsia prowazekii for immunodiagnosis and immunopro-phylaxis // J. Clin. Microbiol. -1981.-14(3).-P.333-341.

131.Dasch G.A., Weiss E. Characterization of the Madrid E strain of Rickettsia prowazekii purified by renografin density gradient centrifugation // Infect. Immun. -1977.-15(l).-P.280-286.

132.Dasch G.A., Samms J.R., Williams J.C. Partial purification and characterization of the major species-specific protein antigens of Rickettsia prowazekii identified by rocket Immunoelectrophoresis // Infect. Immun. -1981.-31(l).-P.276-288.

133.Dasch G.A., Burans J.P., Dopson M.E., Jaffe R.I., Sewell W.G. Distinctive properties of components of the cell envelope of the typhus group rickettsia // In: Kazar J.(ed.), Rickettsiae and Rickettsial Diseases.-Slovac Academy of Sciences.-Bratislava.-1985.-P.54-61.

134.Deutsch H., Morton I. Human serum macroglobulins and dissociation unita // J. Biol. Chem. -1958.-231.-P. 1107.

135.Eisemann C.S., Osterman J.V. Proteins of typhus and spotted fever group // Infect, and Immun. -1976.-14(1).-P.155-162.

136.Eremeeva E.M., Roux V., Raoult D. Determination of genome size and restriction pattern polymorphism of Rickettsia prowazekii and Rickettsia typhi by pulsed field gel electrophoresis // FEMS Microbiology Letters.-1993.-V. 112.-Nol .-P. 105-112.

137.Eremeeva E.M., Ignatovieh V.F., Raoult D., Dasch G.A., Balayeva N.M. Genetic, biological and serological differentiation of Rickettsia prowazekii and Rickettsia typhi // Rickettsia and Rickettial diseases.-Bratislava: Veda.-1996.-P.43-51.

138.Fauconnier B. Utilisation des hematies hyperformolees en virologie I I Ann.Inst.Pasteur.-1958.-95(6).-P.777-783.

139.Feeley J.C., Sword C.P., Mac Clarck C.R. et al. The use of formalin-preserved erythrocytes in the enterobacterial hemagglutination test // Amer. J. Clin. Path. -1958.-30(1).-P.77.

140.Fulton F., Begg A.M. Chemotherapeutic and studies V. The antigenic structure of typhus rickettsia // Medical Research council. -London. -1946.-Special report-Series 355.-P.163-191.

141.Hahn M-J., Chang W-H. Expression and purification of the crystalline surface layer protein of Rickettsia typhi //Microbiol.and Immunol. -1996.-40(3).-P.233-236.

142.Halle S., Dasch G.A., Weiss E. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against typhus rickettsiae, Rickettsia prowazekii and Rickettsia typhi // J. Clin. Microbiol. -1977.-6(2).-P. 101-110.

143.Halle S., Dasch G.A. Use of a sensitive microplate enzyme-linked immunosorbent assay in a retrospective serological analysis of a laboratory population at risk to infection with typhus group rickettsia // J. Clin. Microbiol. -1980.-12(3).-P.343-350.

144.Higgins J.A., Radulovic S., Schriefer M.E., Azad A.F. Rickettsia felis: A new species of pathogenic rickettsia isolated from cat fleas // J.of Clin. Microbiol. -1996.-34(3).-P.671-674.

145.Ignatovich V.F. Antigenic relations of Rickettsia prowazekii and Rickettsia Canada, established in the study of sera of patients with Brill's disease // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. -1977.-21(l).-P.55-60.

146.1ngraham J.S. The preparation and of foraialinized erythrocytes with attached antigens or haptens to titrate antibodies // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1958.-V.99.-№2.-P.452-458.

147.Jandl J., Simmons R. The agglutination and sensitization of red cells by metallic cations : interactions between multivalent metals and the red-cells membrane // Brit.J.Heamat.-1957.-3(l).-P.19-38.

148.Jensen K., Francis T. The antigenic composition of influença virus measured by antibody-absorption // J.exp.Med.-1953 .-98(3).-P.619-624.

149.Keogh E., North E., Warburton M. Haemagglutinins of the Haemo-phylus group //Nature.-1947.-160(422l).-P.63-64.

150.Kokorin I.N., Pushkareva V.I., Miskarova E.D. Immunogenicity of Rickettsia prowazekii antigens // Rickettsia and Rickettsial diseases.-Bratislava: Veda.-1985.-P.254-258.

151.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Tu // Nature.-1970.-227.-P.680-685.

152.Levlis J. Serological detection of desoxiribonucleic acid (DNA) adsorbed to formalinized // Proc.soc.exp.Biol.Med.-1959.-98(2).-P.303-305.

153.Ling N.R. The attachment of proteins to aldehyde- tanned cells. // Brit. J. Hematol. -1961.-V.7.-P.259.

154.Ling N.R. The coupling of protein antigens to erythrocytes with difluorodinitrobenzene // Immunology.-1961.-4(l).-P.49-55.

155.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Raudall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J.Biol.Chem.-1951.-V. 193.-№l.-P.265-275.

156.Mc Kiel J.A., Bell E.J., Lackman D.B. Rickettsia Canada: a new member of the typhus group of Rickettsia isolated from Haemaphysalis lepo rispalustris ticks in Canada // Canad. J. Microb. -1967.-15(5).-P.503-510.

157.Middlebrook G., Dubos R. Specific serum agglutination of erythrocytes sensitized with extracts of tubercle bucilli // J. Exp. Med. -1948.-V.88.-P.521-528.

158.Myers W.F., Wisseman C.-L.J. Genetic relatedness among the typhus group of Rickettsia//Int. J. Syst. Bacteriol. -1980.-30(1).-P.143-150.

159.0aks E.V. Identification and characterization of R.prowazekii protein involved in Rickettsia-host interactions // Dissert. Abs. Internatl. -1983.-44(4).-P. 1012-1013.

160.0sterman J.V., Eisemann C.S. Rickettsial indirect hemmagglutination test: isolation of erythrocyte-sensitizing substance // J. Clin. Microbiol. -1978.-8(2).-P. 189-196.

161.0sterman J.V., Eisemann C.S. Surface proteins of typhus and spotted fever group riekettsiae // Infect. Immun. -1978.-2l(3).-P.866-873.

162.0tto R., Dietrich A. Beitrage zur "Ricketsien" // Frage. Deut. med. Wchnchr. -1917.-43.-P.577-580. Цитируется по Риверсу Т. Вирусные и риккетсиозные инфекции человека.-М.: Иностранная литература.-1955.

163.Pressman D., Campbell D.H., Pauling L. The agglutination of intact azo-erythrocytes by antisera homologous to the attached groups // J. Immunol. -1942.-44.-P. 101.

164.Raoult D., Arzouni J.P., Jambon M.C., Beytont J., Ramousse O. Western blot as a seroepidemiologic tool for detecting foci of Mediterranean spotted fever (MSF) // Eur. J. Epidemiol. -1994.-10.-P.37-40.

165.Raoult D. et al. Epidemic typhus in Burundi // Abst.the Sesqui-Annual meeting of the ASR. -1997.

166.Regnery R.L., Tzianabos Т., Espozito J J., Mc Dade J.E. Strain difFerentiationof epidemic typhus riekettsiae (R.prowazekii) by DNA restriction endonuclease analysis // Current Microbiol..-1983.-8.-P.355-358.

167.Rodionov A.V., Eremeeva M.E., Balayeva N.M. Isolation and partial characterization of the Mr 100 kD protein from Rickettsia prowazekii strains of different virulence // Acta virol. -1991.-35.-P.557-565.

168.Russo P.K., Mendelson D.C., Etkind P.H., et al. Epidemic typhus (Rickettsia prowazekii) in Massachusetts: evidence of infection // N. Engl. J. Med.-I981.-304(19).-P.l 166-1168.

169.Ryan W., Severens J. The stabilization and staining of erythrocytes for heterophil testing // AmerJ.clin.Path. -1960.-34.-P.569-574.

170.Rycaj T. Specific agglutination of red cells covered with absorbed antibodies // Bull.Acad.pol.Sci.-1956.-2(4).-P.335-339.

171.Silverman D.J., Wisseman C.L. Comparative ultrastructural studies on the cell envelopes of Rickettsia prowazekii, R.rickettsii and R.tsutsugamushi //Infect.and Immun. -1978.-21.-P.1020-1023.

172.Smith D.K., Winkler H.H. Radiodination of an outer membrane protein in intact Rickettsia prowazekii // Infect. Immun. -1980.-29.-P.381-834.

173.Shepard C.C., Wickoff R.W.G. The nature of the soluble antigen from typhus rickettsiae // Public. Health. Rept. U. S. -1946.-61(22).-P.761-767.

174.Stavitsky A.B. Micromethods for the study of proteins and antibodies //J. Immunol. -1954.-72(5).-P.360-367.

175.Stavitsky A.B. Hemagglutination and hemagglutination-inhibition reactions with tannic acid- and bis-diazotized benzidine-protein-conjugated erythrocytes // Immunol.methods.-Ed. Ackroyd J. F. Oxford, 1964.

176.Tarasevich I.V. Louse-borne typhus fever in Russia: yesterday, today and tomorrow // Asilomar. Conf. Center, USA. Pacific Grove, CA, 1996.

177.ToppingN.H., Bengtson I.A., Henderson R.G., Shepard C.C., Shear MJ. Studies of typhus fever//National Inst. Of Health Bull. -1945.-183.

178.Tselentis Y., Psaroulaki A., Maniatis J., Spyridaki I., Babalis T. Genotypic identification of murine typhus rickettsia in rats and their fleas in an endemic area of Greece by the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism // Amer. J.of Trop. Med.and Hyg. -1996.-54(4).-P.413-417.

179.Urvolgyi J., Brezina R., Valkova E. New Erithrocite-sensiti sub-stanse from Rickettsia Canada // Acta virol.-1975.-19(3).-P.255-257.

180. Walker D.H. Advances in understanding of typhus group rickettsial infections // Rickettsia and Rickettial diseases.-Bratislava: Veda. -1996.-P. 1627.

181. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelter Erythrocyten als Antigentrager in der indirecten Haemagglutination. 2. // Schweiz. Z.allg. Path. -1958.-21.-P.1043.

182.Weiss E., Coolbaugh J.C., Williams J.C. Separation of viable Rickettsia typhi from yolk sac and L cell host component by renografin density gradient centrifiigation // Apple Microbiol. -1975.-30.-P.456-463.

183.Weiss E., Dobson M.E., Dasch G.A. Biochemistry of rickettsia - recent advances // Acta virol. -1987.-31.-P.271-286.

Приношу глубокую благодарность моим научным руководителям: Вениамину Филипповичу Петрову, за предоставление возможности выполнять диссертационную работу на базе нашего предприятия, за всестороннюю помощь и оперативное решение любых вдпросов, а также Анне Николаевне Пантюхиной, заведующую лабораторией эндемических риккетсиозов, за научное руководство, за помощь в овладении тонкостями работы риккетсиолога, за внимание и заботу.

Выражаю глубокую благодарность всем участникам совместных исследований: А.В.Тупицыну и сотрудникам цеха риккетсиозно-диагностических препаратов; Л.В.Александровой за предоставление исходного корпускулярного антигена риккетсий Провачека и моральную поддержку; сотрудникам лаборатории эндемических риккетсиозов за ежедневную помощь и внимание; Н.П.Ефимовой и З.В.Кочуровой за предоставленные для опытов высококачественные серии геля гидроокиси алюминия; В.П.Коробову и Л.М.Лемкиной за биохимические исследования полученных антигенов и консультативную помощь.