Разработка комплексных препаратов для профилактики и диагностики газовой гангрены тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Грязнова, Диана Васильевна

• Грязнова, Диана Васильевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Грязнова, Диана Васильевна

Оглавление

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.2 Методы

Глава 3. Разработка унифицированной технологии изготовления гагреноз-ных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения и иммунобиологическая оценка полученных препаратов

3.1. Разработка технологии получения анатоксина септикум

3.2. Усовершенствование технологии получения анатоксина эдематиенс

3.3. Получение анатоксина гистолитикум

3.4. Получение тетраанатоксина 47 глава 4. Получение антительных препаратов

4.1. Получение иммунной лошадиной сыворотки

4.2. Получение иммунных кроличьих сывороток

4.3. Выделение Р(аЬ)2-фрагментов очищенных антител кролика

и лошади

Глава 5. Разработка иммуноферментных тест-систем для экспрессного

определения гангренозных токсинов-анатоксинов (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум)

5.1. Конструирование иммуноферментных тест-систем

5.2. Авидин-биотиновый вариант ИФТС для индикации гангренозных токсинов-анатоксинов

5.3. Применение ИФА для оценки гангренозных токсинов-анатоксинов в условиях производства

5.4. Оценка авидин-биотинового варианта ИФА при экспериментальной газовой гангрене у животных

Заключение

Выводы

Список литературы

список основных сокращений

ЕС - единица связывания МЕ - международная единица

НОММ - номинально отсекаемая молекулярная масса

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФТС - иммуноферментная тест-система

ВМП - высокомолекулярные пептиды

СМП - среднемолекулярные пептиды

НМП - низкомолекулярные пептиды

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка комплексных препаратов для профилактики и диагностики газовой гангрены»

Введение

Широко распространенные во внешней среде клостридии являются возбудителями различных инфекционных заболеваний человека и животных [25,37, 95, 97, 181, 191 240, 241, 284].

Анаэробная газовая инфекция относится к числу травматических кло-стридиозов и характеризуется высокой степенью летальности [41, 267, 268]. Предрасполагающими к развитию газовой гангрены являются открытые травмы, трудно поддающиеся хирургической обработке (размозженные раны с явлениями ишемии, некроза, наличием инородных тел и загрязнения почвой, огнестрельные раны, открытые переломы и т.п.), а также послеоперационные раны на толстой кишке или на «ишемических конечностях» на фоне облите-рирующего эндартериита [3,70,112,220,221,271].

Газовая гангрена относится в основном к инфекциям военного времени, когда при массовом травматизме создаются благоприятные условия для инфицирования ран. Вместе с тем, анаэробная газовая инфекция не утратила своего значения и в мирное время, особенно в современных условиях, когда наблюдается повышение уровня дорожно-транспортного, производственного, бытового травматизма, а также ранений и ожогов в результате региональных конфликтов и стихийных бедствий [25,87,176,177,205].

В связи с этим проблема диагностики, лечения и предупреждения кло-стридиозов у людей остается актуальной для здравоохранения.

Анаэробная инфекция является полимикробным заболеванием и вызывается С. рег£г^еп8 типа А, С. оеёетайеш типа А, С. Берйсит, С. Ыз1:о1у1:]1С1Ш1, С. БОгс1еШ, С. fallax и др. Причем, большинство исследователей в качестве главных называют только первые четыре вида возбудителей. Флора при анаэробной инфекции чаще всего носит полимикробный характер и представляет различные ассоциации самих возбудителей газовой гангрены или же их сочетание с аэробными микроорганизмами [25, 37.111,113,268 ]. При смешанном характере

инфекции отмечается потенциирующее действие основных возбудителей газовой гангрены [113,115,119,120,192]. Учитывая то, что в этиологии газовой гангрены ведущее место принадлежит в убывающей последовательности 4 видам клостридий (С. регШ^еш, С. оеёетайепБ, С. Берйсит, С. ЫбШ^Исшп), представляется важной проблема создания комплексных препаратов для иммунодиагностики, лечения и предупреждения клостридиозов, вызываемых возбудителями всей этой группы. Решение этой проблемы возможно только при условии получения высокоактивных гангренозных моноанатоксинов, которые можно использовать как для включения в комплексный прививочный препарат (тет-раанатоксин), так и при конструировании иммуноферментных тест-систем, предназначенных для иммунодиагностики газовой гангрены. Цель работы:

Получение гангренозных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения и создание на их основе комплексных препаратов для профилактики и диагностики газовой гангрены. Основные зада чи исследования:

1. Экспериментальная разработка унифицированного способа получения гангренозных анатоксинов (эдематиенс, септикум, гистолитикум) с использованием мембранных методов разделения.

2. Изучение возможности использования полученных анатоксинов в составе комплексного препарата - тетраанатоксина. Оценка иммунобиологических свойств тетраанатоксина.

3. Получение поливалентной противогангренозной сыворотки (противопер-фрингенс, противоэдематиенс, противосептикум, противогистолитикум) с использованием в качестве иммунизирующего препарата - тетраанатоксина.

4. Получение противогангренозных антительных препаратов (перфрингенс, эдематиенс, септику^, гистолитикум) на основе Р(аЬ)г-фрагментов аффин-ноочищенных антител для конструирования иммуноферментных тест-систем (ИФТС).

5. Разработка иммуноферментных тест-систем для экспрессного определения гангренозных токсинов-анатоксинов (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум).

6. Оценка чувствительности и специфичности разработанных тест-систем в условиях производства гангренозных анатоксинов и на модели экспериментальной газовой гангрены у животных.

На учная новизна и практическая ценность:

1. Показана перспективность использования анатоксинов, полученных с использованием мембранных методов разделения в составе комплексного препарата - тетраанатоксина.

2. Впервые получена поливалентная (тетра-) противогангренозная лошадиная сыворотка с высоким содержанием антител (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум).

3. Впервые получены и оценены в условиях производства высокочувствительные ИФТС на основе Р(аЬ)2-фрагментов аффинноочищенных противоган-гренозных антител (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум).

4. Разработана методика количественного иммуноферментного определения гангренозных токсинов-анатоксинов, обеспечивающая получение результатов, сравнимых с результатами реакции нейтрализации на белых мышах.

5. Впервые для выявления экзоантигенов основных возбудителей анаэробной газовой инфекции предложен быстрый и легко воспроизводимый вариант иммуноферментного анализа, основанный на использовании сэндвич-модификации, усиленной за счет авидин-биотинового взаимодействия. Метод позволяет воспроизводимо выявлять до 0,02 нг антигенов при высокой специфичности иммуноанализа.

6. Показана возможность использования авидин-биотинового варианта ИФА для обнаружения токсинов 4 видов клостридий при экспериментальной газовой гангрене у морских свинок.

7. Разработана унифицированная технология изготовления гангренозных анатоксинов (эдематиенс, септикум, гистолитикум) с использоваанием мембранных методов разделения, обеспечивающая получение монопрепаратов, обладающих высокой удельной и иммуногенной активностью.

8. Оформлена нормативно-техническая документация, утвержденная НТС НПО «Биомед» и прошедшая экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича (экспериментально-производственные регламенты на анатоксин септикум очищенный сорбированный и анатоксин гистолитикум очищенный сорбированный).

9. На основании проведенных исследований разработана технология изготовления иммуноферментных тест-систем для определения экзоантигенов основных возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регМпёепБ типа А, С. оеёетайепБ типа А, С. Берйсшп, С. 1ш1:о1у1:1сит).

10. Оформлена нормативно-техническая документация, утвержденная НТС НПО "Биомед": инструкция по изготовлению и контролю "Тест-система иммуноферментная для выявления экзоантигенов возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регМ^епя типа А, С. оедета^еш типа А, С. зерйсит, С. Ыз1:о1уйсит).»

Положения, выносимые на защиту:

1. Унифицированная технология получения гангренозных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения.

2. Гангренозный тетраанатоксин - базовый препарат для осуществления системы иммунопрофилактики и получения антительных препаратов.

3. Технология изготовления ИФТС (сэндвич-вариант и авидин-биотиновая модификация сэндвич-варианта) для выявления экзоантигенов возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регйтг^епБ, С. оеёетаиеш, С. Берй-сит, С. ЬпзиЯуйсит).

4. Методика количественного иммуноферментного определения гангренозных токсинов-анатоксинов, обеспечивающая получение результатов, сопоставимых с результатами реакции нейтрализации на белых мышах.

5. Индикация токсинов 4-х видов клостридий с использованием авидин-биотинового вариант а ИФА для ранней диагностики газовой гангрены.

Глава 1. Обзор литературы

Клостридиозы - болезни людей и животных, вызываемые патогенными клостридиями, до настоящего времени наносят ощутимый ущерб здоровью населения. Перечень клостридиальных инфекций возглавляют ботулизм, столбняк, газовая гангрена.

Патогенные клостридии широко распространены в природе вследствие размножения их вегетативных форм в желудочно-кишечном тракте человека и животных, длительного сохранения спор в почве и обширного рассеивания с экскрементами животных, пылью и предметами хозяйственной деятельности человека [25,113].

К числу видов клостридии, имеющих первостепенное значение в патологии, относятся С. botulinum, С. perfringens, С. tetani, С. oedematiens, С. septicum, С. histolyticum, С. bifermentans, С. fallax, С. chavoei. Основной биологической особенностью патогенных клостридий является способность продуцировать высокоактивные токсины, которые при воздействии на определенные структуры макроорганизма нарушают нормальную функцию последних, обусловливая тем самым развитие специфических и весьма опасных для жизни патологических состояний [25,37,46,51,99,111].

Газовая гангрена (газовая инфекция или анаэробная инфекция) представляет собой грозное инфекционное осложнение травматических повреждений самого различного характера (ранений, ожогов, обморожений и т.д.). Газовая гангрена относится к числу наиболее острых и летальных инфекционных болезней. Без своевременных методов лечения шансы заболевшего на выздоровление невелики [3,21,25,47,229].

Наиболее часто газовая гангрена наблюдается во время войн, а также при особо грандиозных катастрофах мирного времени, сопровождающихся

большим числом тяжелых травм [3,177]. Впервые эта болезнь была четко определена и описана Н.И. Пироговым во время Крымской войны (1853 - 1856).

Данные о заболеваемости газовой гангреной во время второй мировой войны значительно варьируют. Так, в американской армии анаэробная инфекция наблюдалась у 1,8 % раненых, в английской - 0,73 % случаев, в болгарской - 1,7 %, в советской армии - 1-2 % раненых. Летальность при этом составляла в среднем 36 %, а при тяжелых формах анаэробной инфекции достигала 55 - 60 % [3,14,33,216,217].

В мирное время анаэробная инфекция встречается в виде спорадических случаев [20,21, 113,225,231,259]. Наиболее часто она осложняет производственные, бытовые, уличные травмы и ранения сельскохозяйственными орудиями. При этом клостридии достаточно широко представлены в ранах [52,187,189]. При свежих открытых повреждениях они обнаруживаются в 40,1 %, при бытовой травме - в 10 %, при уличной - в 54 %, при железнодорожной - почти в 100 % случаев [3].

В литературе имеются данные о возрастании роли анаэробов в этиологии госпитальной инфекции [12,19,99,172,217]. При нарушении режима асептики, а также вследствие контаминирования помещений операционной и хирургических инструментов через кондиционеры, газовая гангрена является нередким послеоперационным, в том числе послеродовым или постабортным осложнением, сопровождающимся иногда массивным гемолизом [22,99,172,179].

Зарегистрированы случаи анаэробной клостридиальной инфекции при оперативном вмешательстве на желудочно-кишечном тракте, при таких медицинских процедурах, как взятие крови и инъекции лекарственных препаратов [108,129,217].

Вспышка газовой гангрены может развиваться из дремлющих очагов инфекции в рубцах и грануляционной ткани. Рецидив клостридиальной ин-

фекции иногда наступает даже спустя 20 лет после перенесенной инфекции

[3].

Следует отметить, что гамма клостридиальных инфекций не ограничивается только раневыми инфекциями.

В последние два десятилетия выделилась новая клостридиальная болезнь - бактериемия, вызываемая С. регМг^епБ и С. БерЬсит. Летальность при клостридиальном сепсисе достигает 42-45 % [164,224,237].

Сепсис, вызываемый С. Берйсит, рассматривают как одну из госпитальных инфекций, возникающую у пациентов со злокачественными опухолями кишечной локализации или у больных с лейкемией и пациентов с анти-биотико-индуцированным агранулоцитозом. С. Берйсит обусловливает патогенез кишечных поражений ( изъязвления, геморрагии, некроз) в дистальной части подвздошной или слепой кишки, которые в клинической практике именуют нейтропеническим энтероколитом, влекущим бактериемию со смертельным исходом [226,262,279].

Газовая гангрена обусловлена патогенным действием клостридий в основном 4 видов - С. регй^епБ (70 - 80 %), С. оеёетаиеш (21 - 43 %), С. Берйсит (4-18 %), С. ЫэиЯуисит (4-6 %), которые нередко могут быть в ассоциациях друг с другом и, возможно с некоторыми другими микроорганизмами, не имеющими самостоятельного значения [71]. Как правило, это полибактериальная инфекция. Так, по данным М.М. Цехновицера, у больных газовой гангреной только С. регШг^еш обнаруживается в 20 - 77 % случаев, присутствие двух возбудителей - в 23 - 34 % и наличие трех возбудителей - в 13 - 50 % случаев [201]. В исследованиях Н.Д. Свищевой, из 50 случаев анаэробной инфекции в 34 выделен один из трех возбудителей, в 14 - два и в 3-х - три возбудителя инфекции. Кроме того, в ранах всех больных содержались аэробные бактерии [167].

По сообщению А.Н. Львова, случаи анаэробной инфекции с одним видом возбудителя составляют около 20 % заболеваний [110]. Во всех других случаях они вызываются ассоциациями клостридий.

В настоящее время установлено, что основную роль в патогенезе газовой инфекции играет интоксикация, подчиненную - бактериемия, причем интоксикация обусловливает общие проявления заболевания с вовлечением в процесс центральной нервной системы. Для клостридий основных возбудителей анаэробной газовой инфекции (С.регйтп^епз, С.оеёетайепБ, С. зерйсит, С.Ы51:о1у1псит) характерна способность выделять экзотоксины, вызывающие некроз соединительной ткани и мышц. Другое важное свойство токсинов -способность вызывать гемолиз, тромбоз сосудов, поражение миокарда, печени, почек [25,71,99,102,115,224,268].

Изучению антигенной структуры токсинов основных возбудителей газовой гангрены посвящено исключительно большое количество работ [46,51,62,63,64,72,73,89,111,115,133,230,274]. Установлено, что токсины, продуцируемые С. регй^епз, С. оес1етаиеп8, С. Берйсит, С. ЫзЫуйсит, имеют мозаичную структуру и представляет собой смесь белков (табл.1.1).

Таблица 1.1

Токсины и ферменты основных возбудителей газовой гангрены (С. регЛ-н^еш, С.оескта^ет, С. вер^сит, С. {шйЛМсит)

Виды а (3 У 5 8 е к V

СрегАг^еш типа А + - - - - + + + + +

С.оес1етаиеп8 типа А + - + + + - - - - -

С. БерЬюит + + - - - - - - + -

С. ЫбЫШсшп + + + - - - - - - -

Из 6 основных токсинов, продуцируемых С. регйг^еш типа А ц-токсин (гиалуронидаза), у-токсин (ДНК-аза) - ферменты, токсичность которых не установлена, Э-гемолизин обладает летальным действием, а а-токсин

(фосфолипаза С), к-токсин (коллагеназа) и л-токсин (протеиназа) являются ферментами с выраженными токсическими свойствами. Среди всех токсинов, секретируемых С.регйш^епз типа А, наибольшее значение при газовой гангрене имеет а-токсин, обладающий летальным, дермонекротизирующим, ле-цитиназным и гемолитическим действием [25,37,51,63,64,81,83,115,199].

С. оесктаиепБ типа А вырабатывает а-, у-, 5-, г- токсины: а-токсин обладает летальным, некротическим и цитотоксическим действием; е-токсин (липаза) - летальным и гемолитическим; у-токсин (лецитиназа) - некротическим и гемолитическим; 5-токсин (кислородо-лабильный гемолизин) - гемолитическим действием [25,37,63,64,89,274].

С. Берйюит вырабатывает а-токсин, [3-токсин (ДНК-аза) и и-токсин (гиалуронидаза). а-токсин обладает гемолитическим и летальным действием. Гиалуронидаза вырабатывается у С. верйсит в больших количествах, при этом чем токсичнее штамм, тем в больших количествах он продуцирует гиа-луронидазу [25,51,63,64,78,274].

В культурах С. ЫзЫуисит обнаружено три токсических вещества: а-, р- и у-токсины. а-токсин обладает летальным и некротическим действием, р-токсин является коллагеназой, специфически расщепляющей нативный и денатурированный коллаген, а гамма-токсин представляет собой протеиназу с выраженными желатинолитическими свойствами [25,51,63,64,78,84,86,274].

Подводя итог представленным сведениям, следует отметить, что возбудители газовой гангрены (С. регйт^еш, С. оеёетайепБ, С. Бер^сит, С. 1ш1о1уйсит), продуцируют разнообразные токсины и ферменты, действие которых на организм может быть параллельным или усиливающим друг друга.

В связи с этим, создание ассоциированного препарата, который бы обеспечивал защиту от основных возбудителей газовой гангрены, имеет несомненно практическое значение.

Вопросам ассоциированной иммунизации против газовой гангрены посвящены многочисленные работы, главным образом отечественных авторов [5,34,37,42,43,66,67,77,79,88,101,114,125,136,150,174].

Впервые экспериментальное изучение свойств комплексных препаратов, в состав которых входили анатоксины перфрингенс, эдематиенс, гистоли-тикум и септикум было предпринято сотрудниками НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Г.В.Выгодчиковым, С.А.Зелевинской, З.М.Волковой и др. В опытах на животных была показана эффективность активной иммунизации против газовой гангрены [42,43,77].

Большой вклад в проблему разработки препаратов против анаэробных инфекций внесен коллективом сотрудников НПО «Биомед», возглавляемым Н.П.Ефимовой, которым совместно с сотрудниками Московского и Уфимского НИИВС был создан комплексный препарат - сорбированная брюшнотифозная вакцина с секстаанатоксином, предназначенная для активной иммунизации против брюшного тифа, столбняка, ботулизма и газовой гангрены, внедренный в практику здравоохранени. Однако следует отметить, что в этот препарат вошли анатоксины лишь двух возбудителей газовой гангрены - С. регА-н^еш и С. оеёетаиеш [67,162,163,169].

В литературе имеется небольшое количество работ, посвященных получению токсинов-анатоксинов септикум и гистолитикум [17,65,149].

В.А.Благовещенским и И.П.Майоровой [17] для получения анатоксина септикум была использована следующая схема: С.Берйсит выращивали на среде из ферментативного гидролизата казеина с добавлением кукурузного экстракта и пшена, токсин обезвреживали и полученный анатоксин осаждали соляной кислотой в присутствии хлорида натрия с последующим переосаждением концентрата ацетоном на холоду.

А.А.Пушкаревым [149] из испытанных 5 вариантов питательных сред наилучшие результаты были получены при культивировании С.Берйсит на ка-зеиново-панкреатической среде с гидролизатом мясного фарша: активность

токсина составляла 3-4 Ь+/мл. Обезвреживание токсина проводили путем прибавления к культуре 0,3 % формалина и выдерживанием ее при 25 °С в течение 24 часов с последующей стерилизующей фильтрацией. Для очистки недообезвреженных токсинов использовали двукратное осаждение антигена соляной кислотой при рН 3,7 в присутствии 0,5 % гексаметафосфата натрия. Полученные препараты дообезвреживали 0,01 % формалина при 25 °С в течение 8 суток. Очищенные анатоксины содержали 40-70 ЕС/мл и имели нагрузку от 120 до 250 ЕС на мг белкового азота.

Для получения токсинов-анатоксинов гистолитикум рядом исследователей использовались среды с основой из казеиново-кислотного гидролизата, ферментативного гидролизата казеина [15,31,35,85,89,126], но ни на одной из этих сред титр а-токсина не превышая 800-1000 БЬп/мл. Активность очищенных анатоксинов, полученных рядом исследователей [18,35,82] также была невысока и составляла 25-300 ЕС на мг белкового азота.

Недостаточно высокий уровень токсинообразования и невысокая эффективность использованных способов очистки явились основными причинами низкой удельной активности нативных и очищенных анатоксинов септи-кум и гистолитикум. Очищенные препараты содержали значительное количество пигмента, иммунизирующая доза достигала 0,25-0,5 мл, что не позволяло включить их в ассоциированные препараты.

В Пермском НПО «Биомед» разработан способ изготовления анатоксина гистолитикум, включающий: культивирование С. ЫБЫуйсит на казеи-ново-соево-пепсинной среде, обезвреживание фильтрата культуры формалином, осаждение полученного анатоксина соляной кислотой в присутствии гексаметафосфата натрия с последующей очисткой полученного концентрата на отечественном углеродном сорбенте. Предлагаемый способ обеспечивал получение высокоочищенных препаратов анатоксина гистолитикум с удельной активностью 1070 ± 158,5 ЕС на мг белкового азота [66,151,152].

Вместе с тем, несмотря на положительные данные экспериментальных работ, эффективного препарата для одновременной продуктивной иммунизации против основных возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регМпдепз, С. оес1етаиеп8, С. Берйсит, С. ЫзЫуисит ) не было разработано ни у нас в стране, ни за рубежом. Одновременная иммунизация против ряда возбудителей газовой гангрены возможна только при условии получения анатоксинов указанных микроорганизмов в максимально очищенном и концентрированном виде.

Для получения гангренозных анатоксинов были использованы практически все традиционные методы белковой химии: изоосаждение кислотами, фракционирование сульфатом аммония, ионообменная хроматография, гель-фильтрация [17,18,37,67,82,131,188]. Причем, как правило, для получения очищенных препаратов использовалось сочетание различных методов очистки. Предлагаемые схемы сложны , громоздки и имеют ряд существенных недостатков: необходимость использования больших количеств химических реагентов, многостадийность, трудоемкость, сложность автоматизации и, в качестве нежелательного побочного эффекта - образование значительного количества отходов. Кроме того, фазовые переходы в процессе отделения анатоксина от балласта приводят к тому, что конечный продукт в значительной мере утрачивает антигенную и иммуногенную активность, что естественно отражается на его качестве.

В последнее десятилетие в биотехнологии особое внимание исследователей привлекает мембранная ультрафильтрация, оказавшаяся наиболее удобным, простым и универсальным способом выделения и разделения лабильных биоактивных веществ (вирусы, фрагменты клеток, ферменты, гормоны, различные белки и др.). Она позволяет наиболее гибко совмещать стадии концентрирования и очистки, исключая температурные воздействия и фазовые переходы [57,140,141,169,173,222,238,242,250]. Накопленные фактические материалы показывают, что полупроницаемые мембраны находят широкое при-

менение в различных биотехнологических процессах в сочетании с такими широко распространенными методами разделения как адсорбция, гельфильт-рация и др. [48,69,94,98,140,141,170,184,182,209,261].

В НПО «Биомед» мембранные методы разделения были успешно реализованы в промышленных технологиях изготовления таких бактерийных анатоксинов, как перфрингенс, дифтерийный и стафилококковый. Проведенные исследования показали, что при использовании мембранной ультрафильтрации, анатоксины могут быть очищены и сконцентрированы, причем быстрее и более качественно, чем при использовании других широко распространенных методов [69,169,173].

Этот положительный опыт оказался весьма ценным при проведении исследований по разработке унифицированной технологии получения очищенных гангренозных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения и создания на их основе комплексных прививочных и диагностических препаратов.

Для выбора эффективных специфических средств лечения и профилактики анаэробной газовой инфекции крайне важно своевременное получение бактериологического подтверждения диагноза. Применяемые в настоящее время методы бактериологической диагностики клостридиозов довольно громоздки, проведение их требует специальных сред, оборудования, лабораторных животных, До сих пор основным бактериологическим тестом при клост-ридиозах является нейтрализация токсина in vivo с помощью диагностических сывороток [117]. Многоэтапность бактериологической диагностики обусловливает ее длительность и практически исключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническую практику. Длительность микробиологического анализа составляет, как минимум, несколько дней. В связи с этим традиционные методы бактериологической диагностики анаэробной инфекции ретроспективны.

А.Н.Беркутов [14] указывает, что несмотря на использование всех необходимых средств лечения, 35 % раненых умерли в первые сутки после операции, т.к. диагноз газовой инфекции был установлен слишком поздно.

Н. Schott также считает, что бактериологические исследования имеют значение скорее для эпикриза. Кроме того, из-за сложности диагностики в 20 % случаев газовую инфекцию распознавали только патологоанатомы [132,282].

Быстрое прогрессирование анаэробной инфекции требует проведения диагностических исследований в сжатые сроки. В связи с этим рядом исследователей предпринимались попытки создания экспресс-методов диагностики анаэробной газовой инфекции, в частности вызываемой С. perfringens. Для подтверждения диагноза газовой гангрены разработаны экспресс-методы определения токсинов в раневом отделяемом в реакциях in vitro. Так, стандартизированные методы микроанализа позволяли выявлять фосфолипазу С и гемолизины в течение 5 часов, метод встречного иммуноэлектрофореза - в течение 40 минут [26,90,252,266].

Метод прямой иммунофлюоресценции, основанный на применении коммерческой сыворотки перфрингенс типа А, меченой флюоресцеин-изотиоцианатом, разработанный в лаборатории анаэробов ГИСК им. Л.А.Тарасевича, позволил выявить возбудитель в клиническом материале в течение 1,5 часов. В этой же лаборатории с целью определения видовой принадлежности методом газовой хроматографии были изучены 18 различных видов клостридий по составу спиртов и кислот. Установлено, что по хромато-граммам клеточных кислот С. perfringens отличается от других видов клостридий [90,91]. Газовая хроматография оказалась весьма ценным для микробиологов аналитическим методом, который достаточно полно описан в монографии В. Mitruka (1976). Однако, затраты труда и времени, требующиеся для проведения хроматографического анализа, оказались сравнимыми с аналогии-

ными затратами, необходимыми для проведения микробиологического анализа в целом [99,270].

Стремление устранить недостатки метода жидкостной экстракции и сделать анализ приемлемым в клинических условиях привело к поиску новой хроматографической методики - парофазного хроматографического анализа [32,99,147]. По мнению А.П. Колесова с соавт. [99], - это пока единственно приемлемый метод, которым можно пользоваться клиницистам для экспресс-индикации участия анаэробов в инфекции. Вместе с тем, эти же авторы отмечают, что получение одного только хроматографического результата не позволяет сделать окончательных микробиологических выводов.

Таким образом, несмотря на то, что разработан ряд тестов ранней диагностики газовой гангрены, большинство из них из-за сложности, продолжительности и трудоемкости получения результата не могут быть использованы в практической работе рядовых хирургических учреждений, а тем более на этапах медицинской эвакуации в военное время и во время чрезвычайных ситуаций, которые, к сожалению, в настоящее время имеют тенденцию к росту [75,95,97,176,177].

Интенсификация поиска приемлемых для практики способов диагностики анаэробной газовой инфекции в настоящее время обусловливается тем обстоятельством, что в большинстве регионов индикация газовой гангрены на лабораторных животных вообще не проводится, так как распалась система снабжения животными и они стали очень дорогими, т.е. специфическая диагностика сведена на нет. Вызывает тревогу и тот факт, что в России прекращено производство моноспецифических и поливалентных антитоксических сывороток для диагностики клостридиозов.

Учитывая вышеизложенное, необходимо изыскивать более оперативные и экономичные методы диагностики анаэробной газовой инфекции. Решению этой проблемы в значительной мере могут способствовать методы иммуноферментного анализа, в частности твердофазного, обеспечивающие не

только экспрессную визуализацию результатов, но и повышающие чувствительность определения антигенов и антител до нано- и пикограммовых количеств.

Метод твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), практически в одном и том же варианте, был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: E.Engvall, P.Perlmann в Швеции [236 ], В.К.Van Weemen, A.H.W.M.Schuurs в Нидерландах [288] и K.E.Rubinstein с сотрудниками в США [280]. С этого времени методы ТИФА завоевали прочные позиции в медицинской диагностике, биотехнологии, лабораторной практике, потеснив существующие методы, благодаря ряду явных преимуществ. Об очевидной перспективности метода свидетельствует неиссякающий поток публикаций, в том числе и обзорного типа с обоснованием новых направлений его использования, а также выпуск тест-систем на международный рынок крупнейшими биотехнологическими фирмами

[13,30,40,54,59,61,122,134,137,145,146,204,211,276].

Четкая классификация методов и вариантов ТИФА затруднена вследствие их многообразия [55,60,128,227,228,235,243,245,265,275,281,287], что осложняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной характеристики. Наиболее полная, на наш взгляд, систематизация предложена в обзорах Б.Б.Дзантиева и А.П.Осипова [55], E.Maggio [265], J.L.Gnesdon и S.Avrameas [245], P.Tijssen [287]. Каждый из авторов выделяет практически одну и ту же базовую схему в проведении любой разновидности твердофазного ИФА, состоящую из трех основных стадий. В варианте непрямого анализа на первом этапе происходит «узнавание» анализируемого соединения специфичным ему связывающим агентом, иммобилизованным на том или ином носителе, с образованием иммунного комплекса. Комплекс формируется в количественном отношении, обусловленном сродством АГ-АТ, концентрациями компонентов и кинетическими условиями реакции. Второй основной стадией является выявление образовавшегося иммунного комплекса, соединением ме-

ченным ферментом (конъюгатом). Третьей стадией в ТИФА является «визуализация» ферментной метки в виде соответствующего сигнала, детектируемого различными химико-физическими методами, что достигается путем проведения реакции фермента с субстратами. В варианте прямого анализа определяемое соединение неспецифически сорбируют на твердой фазе, после чего, сразу осуществляют его детекцию меченым соединением с визуализацией последнего соответствующим методом. Таким образом, эффективность ИФА определяется качеством твердой фазы (способностью максимально связывать и стабильно сохранять анти-аналиты), качеством иммуноспецифических реагентов, активностью фермента, являющегося главным компонентом репор-терной системы, а также характеристиками субстратной системы и совершенством региструющей аппаратуры. В этой связи основные направления в совершенствовании методов инструментального ИФА: подбор и физико-химическая модификация твердой фазы с целью увеличения сорбционной емкости и прочности связывания, получение максимально чистых иммунореак-тивных соединений, селекция поли- и моноклональных антител с высоким уровнем сродства, получение диагностических реагентов с метками, способными генерировать усиленный сигнал, подбор хромогенных субстратов, обладающих повышенной цветностью конвертированных продуктов и, наконец, разработка средств аппаратурного обеспечения ТИФА с высоким уровнем чувствительности.

Сочетание специфичности и чувствительности с простотой, безопасностью и хорошей воспроизводимостью делает твердофазный ИФА чрезвычайно эффективным в разнообразных аналитических определениях и, в частности, для определения антигенов в биологических субстратах.

Газовая гангрена относится к числу тяжело протекающих острых инфекций, при которых на ранних стадиях характерна генерализованная антиге-немия, поэтому создание экспресс-методов определения токсинов основных возбудителей анаэробной инфекции (С. регй^еш, С. оеёешаиеш, С.

верйсшп, С. ЫзЫуйсит) существенно значимо как для диагностики, так и особенно для определения эффективных мер экстренной терапии.

В литературе имеется большое количество работ по использованию этого варианта ИФА при определении самых различных антигенов [4,29,44,45,56,74,104,105,109,1 18,130,14], так как он отличается относительной простотой и малым количеством этапов реакции. «Сэндвич»-вариант твердофазного ИФА является перспективным для широкого внедрения в лабораторную и клиническую практику [134,145,228,246,258,275,286].

В Пермском НИИВС накоплен большой опыт по конструированию иммуноферментных тест-систем для определения бактерийных токсинов-анатоксинов. Разработаны тест-системы для индикации стафилококкового, дифтерийного и ботулинических токсинов на основе Р(аЬ)2-фрагментов аф-финноочищенных антител. Иммуноферментные тест-системы широко используются в практике для определения токсигенности дифтерийных культур, при проведении массовых обследований в экстремальных условиях (обследование пострадавших при аварии на газопроводе в районе г. Уфы и лабораторной диагностике ботулизма . Показана высокая специфичность и чувствительность разработанных тест-систем [143,157,180].

Известны экспериментальные работы, выполненные за рубежом, по определению токсинов возбудителей анаэробной инфекции с помощью ИФА [232,251,255,273,283]. Так, у морских свинок, инфицированных токсигенным штаммом С. регйгп^еш типа А, токсин методом ИФА был выявлен в сыворотке крови и мышечной ткани через 12 часов после инфицирования - до развития клинических симптомов. У нас в стране для обнаружения экзотоксинов С. регйтг^еш в культуральной жидкости и клиническом материале предложены уреазный и пероксидазный методы ИФА. Авторы отмечают, что иммуно-ферментный анализ высоко специфичен для экспресс-диагностики клостри-диозов [92,93].

Эти предпосылки оказались весьма ценными при конструировании иммуноферментных тест-систем для определения токсинов основных возбудителей анаэробной газовой инфекции.

Резюмируя представленные данные литературы, приходится констатировать, что анаэробная газовая инфекция, ввиду высокой летальности играет существенную роль в патологии людей.

В этой связи приобретает особое значение вопрос разработки препаратов для активной профилактики клостридиозов, вызываемых основными возбудителями анаэробной газовой инфекции - С. регАг^епБ, С. оеёетайепз, С. Берйсиш, С. ЫзиЯуйсит. Особенно остро стоит проблема ранней диагностики этого раневого осложнения, т.к. традиционные методы бактериологической диагностики ретроспективны.

Учитывая вышеизложенное, представляется важным проведение исследований в области разработки комплексных препаратов для экспресс-диагностики и профилактики клостридиозов, вызываемых основными возбудителями анаэробной газовой инфекции.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

В работе использовали следующие бактерийные препараты, сыворотки, штаммы и питательные среды:

Анатоксины и токсины

2.1.1. Анатоксин перфрингенс готовили в соответствии с регламентом № 8787 [162].

2.1.2. Экспериментальный анатоксин септикум (глава 3.1).

2.1.3. Экспериментальный анатоксин эдематиенс (глава 3.2).

2.1.4. Экспериментальный анатоксин гистолитикум (глава 3.3).

Сыворотки

2.1.5. Экспериментальные гипериммунные лошадиные сыворотки (методы иммунизации и характеристика сывороток приведены в главе 4).

2.1.6. Экспериментальные гипериммунные сыворотки кроликов (глава 4).

2.1.7. Сыворотки диагностические против белков крови и глобулинов лошади, кролика.

Штаммы микроорганизмов

2.1.8. Штамм С. вер^сит № 59 получен из коллекции штаммов ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

2.1.9. Штамм С. ЫзЫуйсит № 5 получен из коллекции штаммов ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

2.1.10. Штамм С. оесктайет № 79 получен из коллекции штаммов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

2.1.11. Штамм С. регМи^еш А-28 ВР 6 К получен из коллекции штаммов ГИСК им. Л.А Тарасевича.

Среды для поддержания и хранения культур

2.1.12. Музейные образцы штаммов С. Берисит, С. регМп^епз хранили при температуре 5+1 °С в запаянных пробирках со средой Китт-Тарроцци на бульоне Поупа с добавлением кусочков мяса, 0,4%-ного раствора желатина, 0,1%-ного раствора агара под слоем вазелинового масла. Музейные образцы штаммов С. ЫзЫуйсит, С. оедетайеш, хранили при температуре 5+1 °С в запаянных пробирках со средой Китт-Тарроцци на пептон-пепсинном бульоне с добавлением кусочков мяса, 0,4%-ного раствора желатина, 0,1%-ного раствора агара под слоем вазелинового масла.

Для поддержания и пассирования штаммов С. верисит, С. Ыз1о1уйсит, С. оес1етаиеп8, С. регйтг^еш 1-2 мл культуры переносили над пламенем спиртовки в пробирки со штаммовой средой. Пробирки с культурой инкубировали в термостате при температуре 37 °С 48-60 часов. Свежепассированная культура использовалась в качестве посевного материала.

Питательные среды.

2.1.13. Штамм С. зерисит № 59 культивировали на казеиново-панкреатической питательной среде. Для ее приготовления использовали казеин специальный для медицинской и биологической промышленности (Зарасайский молзавод), панкреатин медицинский активностью 45 ед. (Московский мясокомбинат), неорганические соли (Ма2НР04, КН2Р04).

Казеиново-панкреатическую среду готовили следующим образом: в реактор со стерильной дистиллированной водой засыпали через люк казеин, смесь перемешивали и нагревали до температуры 40±5 °С. 20%-ным раствором гидроксида натрия устанавливали рН в пределах 9,0±0,5. Растворение казеина вели при перемешивании в течение 3,5+0,5 ч. Затем добавляли панкреатин. Гидролиз вели при температуре

42±2 °С до показателя аминного азота в гидролизате 2,35±0,10 мг/мл. Гидролиз останавливали ледяной уксусной кислотой при рН 4,6СЮ,1. Гидролизат кипятили в течение 20±2 мин, охлаждали и оставляли в течение 19±1 ч. Прозрачный гидролизат декантировали в стерильную емкость. В гидролизате корригировали рН до 8,1+0,1 20%-ным раствором гидроксида натрия, добавляли соли и комплекс сухих витаминов.

2.1.14. Штамм С. ЫзЫуйсиш № 5 культивировали на казеиново-соево-пепсинной питательной среде. Для ее приготовления использовали казеин специальный для медицинской и биологической промышленности, соевый шрот (ГОСТ 12220-66), пепсин для производства антитоксических сывороток (без наполнителя) и медицинский панкреатин. Казеиново-соево-пепсинную среду готовили следующим образом: в реактор заливали дистиллированную воду, засыпали навески казеина и соевого шрота, нагревали до 40±2 °С и устанавливали рН 1,55+0,05 добавлением 5 М раствора соляной кислоты. Растворение казеина и соевого шрота при заданных параметрах вели в течение 4,5±0,5 часов. Добавляли пепсин и вели гидролиз по заданному режиму двое суток до содержания аминного азота в гидролизате 1,2±0,1 мг/мл. Ферментацию останавливали кипячением гидролизата в течение 10 минут, предварительно доведя значение рН 4,5±0,1 добавлением 20%-ного раствора гидроксида натрия. Гидролизат охлаждали и оставляли для отстаивания в течение 19±1 ч. Прозрачный декантат использовали для варки бульона.

В гидролизате устанавливали рН 8,5+0,1 20%-ным раствором гидроксида натрия, добавляли соли и комплекс сухих витаминов.

2.1.15. Штамм С. оеёетаЬет № 79 культивировали на казеиново-кислотной среде в соответствии с регламентом № 141-69 [163].

Прочие материаалы

2.1.16. Пероксидаза хрена (ПХ) высокоочищенная с RZ не менее 2,7 производства НПО «Биолар» (г. Олайне, Латвия) и фирмы «Sigma» (США).

2.1.17. О-фенилендиамин (ОФД) - фирмы «Serva» (ФРГ).

2.1.18. Пепсин для производства антитоксических сывороток Московского мясокомбината.

2.1.19. Планшеты однократного применения фирмы «Nunk» и «Costar».

2.1.20. Авидин-пероксидаза фирмы «Sigma» (США).

2.2 Методы

2.2.1 Определение специфической активности гангренозных токсинов-анатоксинов

Величину минимальной летальной доза (Dlm/мл), показатели антиток-синсвязывающей способности токсинов-анатоксинов (Ь+/мл, ЕС/мл) определяли согласно методам, рекомендованным для определения активности токсинов-анатоксинов [117].

2.2.2 Контроль безвредности очищенных и очищенных сорбированных гангренозных анатоксинов осуществляли на морских свинках согласно Регламенту производства очищенных адсорбированных гангренозных анатоксинов (перфрингенс и эдематиенс) № 141-69 [163].

2.2.3 Контроль стерильности очищенных и сорбированных гангренозных анатоксинов*.

2.2.4 Количественное определение формальдегида в препарате*.

2.2.5 Определение мертиолята в препарате*.

2.2.6 Определение содержания окиси алюминия в сорбированных препаратах*.

2.2.7 Определение общего и белкового азота с реактивом Несслера в анатоксинах*.

*

проводили согласно «Сборнику инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов о токсичности медицинских иммунобиологических препаратов», утвержденному приказом МЗ СССР №31 от 13.01.83.

2.2.8 Методы титрования иммунных сывороток.

Специфическую активность противогангренозных сывороток определяли в реакции нейтрализации токсина на белых мышах [117]. Удельную активность выражали отношением титра сыворотки на 1 мг белка.

2.2.9 Проницаемость мембран (удельную производительность) и приведенную селективность (задерживающую способность), находили по соотношениям (1) и (2):

G = (1) <р - f 1 - —1 х 100 (2),где

Sx At V ai у

AV - объем пермеата, полученного с единицы площади S в единицу времени Ах (пермеат - поток вещества, проходящего через полупроницаемую мембрану в процессе мембранного разделения), ai - специфическая активность в концентрата анатоксина (септикум,

эдематиенс, гистолитикум); 2l2 - специфическая активность в пермеате.

2.2.10 Пептидные фракции в гидролизатах определяли по методу М.А. Торбан с соавт. [194].

2.2.11 Содержание белка определяли спектрофотометрическим методом по величине экстинкции при длине волны 280 нм. Калибровочные графики построены по нативным и ферментированным сывороткам крови лошади и кролика, содержание белка в которых было установлено определением азота по Кьельдалю с пересчетом по коэффициенту 6,25.

2.2.12 Концентрирование белковых растворов в малых объемах вели в диализных трубках Visking («Merk», ФРГ) с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 20000-40000, «Serva», ФРГ) или сефадекса G-200, «Pharmacia», Швеция); в относительно больших объемах - на установке фирмы «Amicon» (Голландия) с использованием фильтрующих мембран.

2.2.13 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили согласно прописи, прилагаемой к прибору для электрофореза (тип № 69) «Reanal», Венгрия). При установлении чистоты и гомогенности выде-

ленных из сывороток антительных препаратов электрофорез в ПААГ проводили в присутствии додецилсульфата натрия по методу K.Weber, MOsborn [289].

2.2.14 Гельхроматографию антительных препаратов проводили на сефадексе G-200 («Pharmacia», Швеция), используя колонки размером 120x2,5 см. Фракции отбирали с помощью автоматического коллектора типа «Multirac» с проточным УФ-детектором «Uvicord Sil» («LKB», Швеция).

2.2.15 Иммуноэлектрофорез проводили по варианту классического метода П.Г.Грабаря [49] в 1%-ном агаровом геле на веронал-мединаловом буферном растворе (pH 8,6), при напряжении 200-250 V в течение 1,5-4,0 часов. Для выделения специфической преципитации пластинки выдерживали во влажной камере при комнатной температуре в течение 18-48 часов.

2.2.16 Ферментолиз иммунных сывороток проводили по методу L. Layton et al. [260], который воспроизводили по следующей прописи: сыворотки разводили 0,9 %-ным раствором хлорида натрия до 3 %-ного содержания белка, добавляли пепсин из расчета 2 г на литр разведенной сыворотки и проводили ферментолиз 10 минут при pH 3,2. Термоденатурацию балластных белков проводили в присутствии сернокислого аммония (140 г на литр) при температуре 58°С в течение 30 минут. Денатурированные белки удаляли фильтрацией, в ферментате доводили pH до 7,2 - 7,4 IN NaOH и проводили диализ против дистиллированной Н20 в течение 24 часов при температуре 4°С. Отдиализованный фер-ментат использовали для выделения Г(аЬ)2-фрагментов антител.

2.2.17 Приготовление моноспецифических иммуносорбентов на основе циан-бромированной сефарозы 4В («Pharmacia», Швеция) производили по инструкции фирмы-изготовителя. Титр (емкость) иммуносорбента рассчитывали по формуле.

УГ-{УхТх-УгТг)

1и - у , 1 АС

с

Ти - титр иммуносорбента; V - исходный объем анатоксина;

Т - исходный титр анатоксина; VI и У2 ~ объемы промывок;

Т] и Т2 - титры промывок; Ус - объем суспензии иммуносорбента

2.2.18 Антитела и антительные препараты выделяли с помощью иммуно-сорбции. Техника иммуносорбции и элюции описаны в главе 4.

2.2.19 Приготовление конъюгатов с пероксидазой хрена (ПХ) производили перйодатным методом [272]. ПХ с RZ не менее 2,7 (НПО «Биолар») растворяли в охлажденной дистиллированной воде, добавляли 0,08 М №104 и перемешивали в затемненном месте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем раствор диализовали в течение 18-20 ч при температуре 4°С против 0,005 М ацетатного буферного раствора с рН 4,4. После диализа рН раствора окисленной пероксидазы доводили до 9,0-9,2 0,2 М ЫаОН и сразу же прибавляли раствор антител (соотношение по белку ПХ-АТ равно 1:1). Смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем добавляли боргидрид натрия (0,4 мг на 1 мг ПХ) для стабилизации конъюгата и выдерживали 2 ч при температуре 4 °С. После этого раствор конъюгата диализовали против 0,01 М К-фосфатного буферного раствора рН 7,2-7,4 и подвергали фракционированию на сефадексе 0-200, уравновешенном этим же буферным раствором. В очищенном конъюгате определяли (соотношение ОД403/ОД280) которое должно быть в пределах 0,4-0,6, добавляли глицерин в соотношении 1:1 и хранили при температуре 4 °С или минус 20 °С. Специфическую активность определяли в иммунофер-ментной реакции.

2.2.20 Постановка иммуноферментной реакции [60]. Основная схема проведения реакции:

1. Сорбция на планшетах антительного препарата осуществлялась внесением 0,1 мл в каждую лунку при концентрации белка 0,01 мг в 1 мл 0,01 М К-фосфатного буферного раствора рН 7,2-7,4.

2. Экспозиция - 18-20 ч при температуре 4 С.

3. Удаление несвязавшихся антител и 3-х кратное промывание планшетов 0,01 М К-фосфатным буферным раствором с 0,05% Твин-20.

4. Внесение исследуемого вещества в соответствующих разведениях по 0,1 мл в каждую лунку.

5. Экспозиция 1,0 ч при температуре 37 °С.

6. Удаление несвязавшегося антигена и 3-х кратное промывание.

7. Внесение конъюгата по 0,1 мл в каждую лунку.

8. Экспозиция 1,0 ч при температуре 37 °С.

9. Удаление несвязавшегося конъюгата и 3-х кратное промывание.

10. Внесение субстратно-индикаторного раствора (ОФД с Н2О2). Результаты реакции учитывали через 30-40 мин на фотометре «Ткег1ек МиШБсап МСС» (Англия) при длине волны 492 нм.

2.2.21 Лабораторные животные. Экспериментальные исследования проведены на кроликах породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг, беспородных белых мышах массой 16-18 г, беспородных морских свинках массой 250300 г, лошадях казахской породы массой 350-400 кг.

2.2.22 Статистические методы. Статистическая обработка результатов исследований проводилась по И.П.Ашмарину, А.А.Воробьеву [9] и Ю.И.Иванову, О.Н.Погорелюку [80].

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Грязнова, Диана Васильевна

Выводы

1. Разработана унифицированная поточная технология изготовления гангренозных анатоксинов (септикум, эдематиенс, гистолитикум) с использованием мембранных методов разделения, обеспечивающая получение препаратов, обладающих высокой удельной и иммуногенной активностью.

2. Получен ассоциированный препарат - тетраанатоксин, обеспечивающий одновременную продуктивную иммунизацию в отношении анатоксинов пер-фрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум. Показана перспективность использования тетраанатоксина для получения высокоактивных антитоксических поливалентных противогангренозных сывороток.

3. Разработана технология получения иммуноферментных тест-систем на основе аффинноочищенных Р(аЬ)2-фрагментов гангренозных антител (сэндвич-вариант, авидин-биотиновый вариант) для определения экзоантигенов основных возбудителей анаэробной инфекции (С. регйтг^еш, С. оеёетаНепз, С. зерйсит, С. 1ш1ю1уйсиш).

4. В экспериментальных и производственных условиях подтверждена высокая информативность, экспрессность и экономичность ИФА для оценки специфической активности гангренозных токсинов-анатоксинов на различных стадиях технологического процесса и разработана методика количественного иммуноферментного определения активности гангренозных токсинов-анатоксинов, обеспечивающая получение результатов, сопоставимых с результатами реакции нейтрализации на белых мышах при хорошей корреляции (г > 0,9).

5. Показана диагностическая ценность авидин-биотинового варианта ИФА для обнаружения токсинов 4-х видов клостридий (С. регйтг^еш, С. оеёетайеш, С. Берйсит, С. ЫзЫуйсит) при экспериментальной газовой гангрене у морских свинок. Метод позволяет воспроизводимо выявлять до 0,02 нг антигенов при высокой специфичности иммуноанализа.

Заключение

Газовая гангрена относится к числу наиболее острых и летальных раневых инфекций. Учитывая то, что в этиологии этого полимикробного заболевания ведущее место принадлежит 4 видам клостридий С. регйтг^еш, С. оеёетайеш, С. эерйсит, С. ЫяШ^Цсит, представляется важным лбеспечение защиты от возбудителей всей этой группы. Особенно остро стоит проблема ранней диагностики газовой гангрены, так как традиционные методы бактериологической диагностики ретроспективны, а быстрое прогрессирование инфекции требует постановки диагноза в сжатые сроки.

В этой связи цель настоящей работы состояла в разработке технологии получения высокоактивных гангренозных моноанатоксинов и создание на их основе комплексных препаратов доя диагностики и профилактики анаэробной инфекции.

Получение высокоактивных препаратов для активной иммунизации, а также серотерапии и серопрофилактики газовой гангрены связано прежде всего с разработкой способов изготовления высокоочищенных анатоксинов, обладающих высокой иммуногенностью и минимальной реактогенностью.

Накопленные фактические материалы показывают, что особенно перспективным методом для создания новых малоэнергоемких технологий в производстве медицинских иммунобиологических препаратов является мембранная ультрафильтрация [48,94,140,141,184]. С использованием мембранных методов разделения была успешно решена задача разработки промышленной технологии получения анатоксина перфрингенс, обладающего высокой удельной и иммуно-генной активностью.

В этой связи было предпринято изучение возможности использования мембранного разделения (ультрафильтрация, диафильтрация) в разработке унифицированной технологии получения гангренозных анатоксинов - септикум, эдематиенс, гистолитикум.

Известно, что успешная раелизация мембранного процесса разделения во многом определяется свойствами используемых мембран и разделяемых веществ, а также механизмом мембранного разделения. Поэтому, приступая к разработке мембранного процесса разделения нативных анатоксинов (септикум, эдематиенс, гистолитикум), мы прежде всего изучили возможность использования для этой цели отечественных ультрафильтров на базе элементов из полых волокон марок ВПУ-15, ВПУ-50, ВПУ-100.

Было установлено, что полые волокна марок ВПУ-50 и ВПУ-100 по производительности в значительной степени превосходят полые волокна марки ВПУ-15, но волокна марки ВПУ-100 обладают недостаточной селективностью (80 - 85 %) по всем изученным препаратам. На основании результатов для ультрафильтрационной очистки гангренозных анатоксинов в дальнейшем использовались полые волокна ВПУ-50, которые обладают высокой селективностью (100 у и высокой производительностью (16 - 18 л/м ч). Для этого типа мембран проводилась оптимизация режимов ультрафильтрации.

Из опыта исследования в области мембранных методов разделения известно, что к числу условий существенно влияющих на процесс ультрафильтрации относится величина рабочего давления, а также степень концентрирования растворенных веществ. В этой связи были проведены исследования по изучению влияния величины указанных параметров на процесс мембранного разделения гангренозных анатоксинов (септикум, эдематиенс, гистолитикум). Было установлено, что для всех изученных препаратов, во избежание потерь целевого продукта величина рабочего давления в первый час ультрафильтрации не должна превышать 0,05 МПа и в последующем - 0,07 МПа. При изучении влияния степени концентрирования на качество мембранного разделения нативных гангренозных анатоксинов (септикум, эдематиенс, гистолитикум) было установлено, что для всех исследованных систем селективность не зависела от степени концентрирования во всем интервале ее изменения. В тоже время с увеличением степени концентрирования производительность процесса в значительной мере снижалась вследствие усиления эффекта концентрационной поляризации. В результате проведенных экспериментов было показано, что оптимальный диапазон, в котором следует проводить ультрафильтрационную очистку гангренозных анатоксинов, не должна превышать 8 - 10-кратную степень концентрирования.

Для достижения более высокой эффективности очистки мы применили принцип диафильтрации. Наилучшие результаты были получены при введении растворителя (дистиллированной воды) в раствор концентрированного анатоксина и отмывании препарата до исчезновения азотистых веществ в пермеате (по показаниям спектрофотометра). При указанном режиме ультрафильтрации в пермеат переходило до 70 % азотистых балластных веществ.

Принимая во внимание, что более глубокой степени очистки можно достичь комбинируя различные методы, нами были проведены исследования процесса очистки ультрафильтрованных анатоксинов (септикум, эдематиенс, гисто-литикум) с помощью осаждения соляной кислотой в присутствии ГМФ№. В результате проведенных исследований был разработан следующий способ дополнительной очистки ультрафильтрованных анатоксинов: осаждение соляной кислотой при рН 3,5 ± 0,2 в присутствии гексаметафосфата натрия при температуре 6 ± 2 °С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия.

Следует отметить, что предложенный нами способ очистки нативных гангренозных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения обеспечивал получение в производственных условиях высокоочищенных гангренозных анатоксинов: коэффициент очистки по общему азоту для анатоксина септикум составлял 273,8 ± 1,6; по белковому - 114,7 ± 1,4; для анатоксина эдематиенс - 49,8 ± 0,9 и 24,3 ±1,1; для анатоксина гистолитикум - 95,8 ± 1,8 и 51,7 ± 0,8. При этом способ характеризовался регулярной воспроизводимостью: средний выход препаратов составлял: для анатоксина септикум - 44,3 ± 3,7 %, анатоксина эдематиенс - 50,9 ± 6,7 %, анатоксина гистолитикум - 55,9 ± 6,5 %.

Таким образом, в итоге проведенных исследований экспериментально обоснована и разработана унифицированная технология получения гангренозных анатоксинов (септикум, эдематиенс, гистолитикум) с использованием мембранных методов разделения. Способ достаточно технологичен, большая площадь волокон, скомпонованных в сравнительно малом объеме, позволяет осуществлять процесс ультрафильтрации в короткое время, что крайне важно для лабильных гангренозных анатоксинов. С помощью ультрафильтрации не только удалось получить высокоочищенные препараты, но и в значительной мере увеличить выход целевого продукта по сравнению с ранее предлагавшимися схемами получения гангренозных анатоксинов [17,18,152,163].

Результаты изучения свойств гангренозных анатоксинов, полученных по разработанному нами способу показали, что по степени очистки, выходу, сорб-ционной способности, стабильности при хранении, безвредности для животных данные препараты соответствуют требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам [10,24].

Известно, что ассоциированные препараты могут быть созданы только при условии получения качественных моноантигенов. Это требование было в полной мере реализовано при использовании в технологии изготовления гангренозных анатоксинов мембранных методов разделения. Были получены препараты, обладающие высокой удельной и иммуногенной активностью, что позволило применить их в небольших объемах в комбинации друг с другом и сконстриуро-вать комплексный препарат следующего состава: анатоксин перфрингенс 15 ЕС/мл, анатоксин эдематиенс - 2,5 ЕС/мл, анатоксин гистолитикум - 10 ЕС/мл, анатоксин септикум - 15 ЕС/мл.

Очевидно, что важнейшим потребительским качеством анатоксинов являются их иммуногенные свойства. В опытах на белых мышах было показано, что тетраанатоксин обеспечивает значительный протективный эффект в отношении абсолютно смертельных доз всех 4-х токсинов (С. perfringens, С. oedematiens, С. septicum, С. histolyticum). Выживаемость мышей, иммунизированных тетраанатоксином, составляла 70 - 90 %, моноанатоксинами - 80 - 93,3 %.

Высокая иммунологическая эффективность разработанного препарата была подтверждена сотрудниками НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (Т.И.Сергеевой с соавт.). На экспериментальной модели раневой инфекции у морских свинок и кроликов показана достаточно высокая иммунологическая (по приросту антитоксинов) и протективная (по устойчивости к раневому заражению возбудителями) эффективность вакцинации тетраанатоксином [177].

С учетом эпидемиологических, этиопатогенетических, иммунобиологических аспектов, Т.И.Сергеевай [176,177] разработана концепция системы активной иммунопрофилактики газовой гангрены с использованием в качестве базового препарата тетраанатоксина.

Для выбора эффективных специфических средств, методов лечения и профилактики газовой гангрены крайне важно своевременное получения диагноза. Классический метод диагностики газовой гангрены, основанный на биопробе, трудоемок, вариабелен (из-за нестандартности животных) и ретроспективен. Этот же метод используется для контроля специфической активности гангренозных токсинов-анатоксинов в процессе производства. В каждой из этих областей имеются свои особенности детекции антигенов, к тому же ставятся разные цели и поэтому предъявляются разные требования к методу определения. Так, при производстве токсинов-анатоксинов важна экспрессность метода и возможность точной количественной оценки, а при диагностике газовой гангрены, наряду с экспрессностью, необходима высокая чувствительность и специфичность анализа.

Следовательно, имеется острая необходимость разработки альтернативного метода определения гангренозных антигенов, приемлемого как для ранней диагностики газовой гангрены, так и для контроля специфической активности токсинов-анатоксинов в процессе производства. В этом отношении ИФА представлялся нам наиболее перспективным для решения этой задачи, так как удачно совмещает высокую чувствительность и специфичность с возможностью автоматизации процесса постановки реакции, что приводит к сокращению сроков получения результата и повышению точности определения испытуемого материала.

В ИФА, рассчитанном на обнаружение антигена, основными индикаторными препаратами являются антитела, поэтому процесс их получения разрабатывался детально. В своих исследованиях мы сочли целесообразным использовать поликлональные антитела, так как ряд авторов обоснованно высказывают мнение, что узкая специфичность моноклональных антител ограничивает их использование в серодиагностике инфекционных заболеваний [11,40,145].

Для реализации цели исследований предполагалось наличие кроличьих и лошадиных специфических антительных препаратов, так как по результатам исследований, проведенных в НПО «Биомед» [143,157,180], использование разно-видовых антительных препаратов в ИФА позволяет исключить неспецифические реакции.

В связи с этим для получения поливалентных противогангренозных сывороток был проведен специальный цикл исследований. В результате экспериментов разработана схема иммунизации животных тетраанатоксином, позволяющая получать высокоактивные кроличьи и лошадиные поливалентные про-тивогангренозные сыворотки. Следует отметить, что в результате иммунизации лошадей нарастающими дозами тетраанатоксина удалось получить поливалентную лошадиную сыворотку с титром антител перфрингенс - 300 МЕ/мл, эдема-тиенс - 500 МЕ/мл, септикум - 250 МЕ/мл и гистолитикум - 400 МЕ/мл, что превосходило показатели, заложенные в регламенте производства поливалентной (3-х валентной) противогангренозной сыворотки - не менее 180 МЕ/мл по каждому компоненту (перфрингенс, эдематиенс, септикум) [161]. Этот положительный опыт может быть использован для получения нового профилактического препарата - 4-х валентной противогангренозной сыворотки. Введение антитоксина гистолитикум в этот препарат должно несомненно повысить его профилактическую и лечебную ценность, так как известно, что при присутствии в ассоциации возбудителя газовой гангрены С. ЫзЫуйсит, заболевание приобретает более злокачественный характер и часто заканчивается летально [41,267,268].

Следующий этап нашей работы заключался в выделении максимально очищенных антительных гангренозных препаратов из иммунных сывороток, так как именно этот путь, по данным литературы [40,55,59,128,134], ведет к достижению наиболее высокой чусвтвительности ИФА. Для выделения гангренозных антител применялись иммуносорбенты на основе окисленной сефарозы СЬ-6В с использованием в качестве лигандов анатоксинов перфрингенс, эдематиенс, сеп-тикум, гистолитикум. Антитоксины выделяли из ферментированных гипериммунных сывороток крови лошади и кролика. В результате проведенных исследований была разработана технология получения высокоочищенных гангренозных антител из поливалентных противогангренозных сывороток, позволяющая из одного сырьевого источника (поливалентной сыворотки) с помощью специфических иммуносорбентов выделять моноантитела перфрингенс, эдематиенс, септи-кум, гистолитикум. Было показано, что предлагаемая схема очистки антител значительно повышает их удельную активность: Р(аЬ)2-фрагменты аффинно-очищенных антител в 16-30 раз активнее исходной нативной сыворотки.

Таким образом, были получены разновидовые аффинноочищенные антительные препараты для сенсибилизации планшетов (кроличьи) и для синтеза конъюгата (лошадиные), которые были использованы при конструировании ИФТС.

В результате проведенных экспериментов были разработаны два вида ИФТС: сэндвич-вариант и авидин-биотиновая модификация сэндвич-варианта. Сравнительные испытания сэндвич-варианта и авидин-биотинового варианта ИФА при определении гангренозных токсинов-анатоксинов в оценочных экспериментах показали, что при сохранении высокой специфичности сэндвич-варианта, авидин-биотиновый вариант ИФА по чувствительности в 30 - 60 раз превосходит сэндвич-метод, выявляя до 0,02 нг антигенов.

Однако оценить информативность и диагностическую ценность разработанных тест-систем мы могли только в результате изучения «натурного» материала.

В связи с тем, что в условиях производства нет необходимости в очень высокой чувствительности метода детекции, в первой серии экспериментов изучалась возможность использования сэндвич-варианта ИФТС для оценки специфической активности гангренозных токсинов-анатоксинов.

Материалом исследования служили образцы гангренозных токсинов-анатоксинов (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум), полученные на разных этапах производства. Образцы исследовались параллельно в ИФА и РН. Разработан алгоритм обработки результатов ИФА, состоящий из 4-х этапов: снятия показания приборов, нахождение значения по градуировочному графику, определение кратности разведения - вычисление по формуле пересчета абстрактных значений в конкретные значения (оптическая плотность раствора - содержание антигена в ЕС/мл, Ь+/мл).

В результате проведенных исследований установлена высокая степень корреляции результатов (г > 0,9) параллельного определения токсинов-анатоксинов в ИФА и РН. Согласно требованиям ВОЗ, замена одного метода на другой возможна при условии, если коэффициент корреляции результатов при использовании сравниваемых методов не менее 0,9.

Таким образом, оценка сэндвич-варианта ИФТС показала принципиальную возможность его использования в условиях производства гангренозных анатоксинов. Этот доступный и экономичный метод дает экспрессную и объективную информацию о количестве целевого продукта и может заменить трудоемкую и дорогостоящую систему биологической оценки препаратов.

В следующей серии опытов, учитывая высокую чувствительность ави-дин-биотинового варианта ИФА, была изучена возможность использования этого метода диагностики анаэробной инфекции на модели газовой гангрены у морских свинок. Материалом исследования служили: раневое отделяемое, а также серозные экссудаты. Пробы исследовались параллельно в РН и ИФА.

Анализ результатов определений в ИФА и сопоставление их с результатами в биопробе показали, что разработанная ИФТС с высокой степенью чувствительности позволяет фиксировать в раневом отделяемом и серозных экссудатах наличие гангренозных антигенов. При этом ИФА позволял выявлять токсин у морских свинок уже в первые сутки после заражения, а биопроба - фиксировать токсин у морских свинок при проявлении симптомов газовой гангрены - на 4-е сутки после заражения. Следует подчеркнуть, что результат анализа был получен на 6-у сутки, в то время, когда животные уже погибли.

Полученные результаты убедительно доказывают преимущества авидин-биотинового варианта ИФА при обнаружении экзотоксинов С. рег£ш^еп8, С. оеёетайеш, С. Бер^сит, С. ЫБ^уйсит, позволяющего получить диагностически значимую информацию в самые ранние сроки при контакте с возбудителем, а универсальный конъюгат - тестировать все определяемые антигены.

Таким образом, на модели экспериментальной газовой гангрены у морских свинок была показана принципиальная возможность использования ави-дин-биотинового варианта ИФА для раннего обнаружения экзоантигенов основных возбудителей газовой гангрены, что существенно значимо как ддя диагностики, так и особенно для определения эффективных мер экстренной терапии.

В заключение следует сказать, что проделанные нами разносторонние исследования позволили экспериментально обосновать возможность получения комплексных препаратов для иммунопрофилактики и иммунодиагностики газовой гангрены.

Разработана уфицированная поточная технология изготовления гангренозного тетраанатоксина с использованием мембранных методов разделения и технология изготовления ИФТС для детекции гангренозных токсинов-анатоксинов.

Логическим продолжением данной работы должно явиться испытание полученных препаратов на людях, а также разработка единой системы иммунодиагностики и иммунопрофилактики газовой гангрены.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Грязнова, Диана Васильевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Экспресс-диагностика анаэробной инфекции у травматологических больных методом газовой хроматографии / Э.С. Акайзин, В.Ф. Кулагин, С.Г. Слюсар и др. // В сб.: Раны и раневая инфекция. - М. - 1993. - С. 298-299.

2. Антитела: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. Т.1-2.

3. Арапов Д.А. Анаэробная газовая инфекция. - М.: Медицина, 1972. -С. 216.

4. Определение поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg) методом иммуноферментного анализа / С.А. Арекалов, М.И. Михайлов, В.А. Ананьев и др. // Вопр. вирусол. - 1984. - Т.29, №3. - С. 319-323.

5. Использование экспериментально-аналитического метода для балансировки жидких питательных сред для роста и токсинообразования С. рег-fringens типа А / В.Д. Артеменко, Л.Г. Иванова, В.П. Ненашев и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1985. -№11.-С. 37-41.

6. Астапенко В.Г., Крыжов В.Д. Анаэробная инфекция после аппендэкто-мии // Здравоохранение Белоруссии. - 1982. - №7. - С. 58-60.

7. Астрожников Ю.В., Феноменов A.M., Еремина Г.В. Современные аспекты лечения газовой гангрены // Научный обзор. - М., 1981. - 66 с.

8. Аффинная хроматография // Под ред. П. Дин, У. Джонсон, Ф. Мидл. -М.: Мир, 1988.

9. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

10. Басканьян И.А. Вакцинно-сывороточное дело. Состояние и перспективы развития. -М., 1979. - С. 11-18.

11. Бектемиров Т.А. Минимальные требования к моноклональным антителам для клинических целей // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №8. - С. 101-107.

12. Госпитальные инфекции / В.Д. Беляков, А.П. Колесов, П.Б. Остроумов и др. - Л.: Медицина, 1976. - 231 с.

13. Березин И.В., Егоров А.М. Новые направления развития иммунофер-ментного анализа // Вестник АМН СССР. - 1987. - №12. - С. 72-78.

14. Беркутов А.Н. Об анаэробной инфекции огнестрельных ран // Военно-мед. журн. - 1972. - №4. - С. 14-20.

15. Бирюкова С.В. Получение токсинов-анатоксинов эдематиенс в казеиновых питательных средах: Дисс. ... канд. мед. наук. - Харьков, 1969.

16. Метод концентрации и очистки анатоксина Cl. perfringens, приготовленных на казеиновых средах. Сообщение 1. Концентрация анатоксина осаждением в изоэлектрической точке и изучение условий адсорбции и элю-ции концентратов / В.А.Благовещенский, Л.Я.Мармалевская, А.П.Кузьмина // Материалы по обмену опытом. - М., 1960. - С.68-75.

17. Концентрация и очистка анатоксина Cl. septicum / В.А. Благовещенский, И.П. Майорова // Материалы по обмену опытом. - М., 1960. - С. 76-80.

18. Благовещенский В.А., Исполатовская М.В. Концентрация и очистка анатоксина С. histolyticum // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1958. - №5. - С.91-94.

19. Бойко Ю.Г. Случай анаэробной газовой инфекции // Здравоохранение Казахстана. - 1980. - №3. - С. 72.

20. Бойко Ю.Г., Дружинина-Рыбкина М.С. Случаи анаэробной газовой инфекции // Клин, медицина. - 1976. - Т. LIV,№7. - С. 135-138.

21. Бондарчук A.C. К вопросу о профилактике и лечении раневой инфекции при открытых диафрагмальных переломах обеих костей голени / В сб.: Раневая инфекция. - ЦИТО. -М., 1973.-С. 114-117.

22. Борисов И.А. Некоторые особенности перитонита, как аэробно-анаэробной инфекции: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Л., 1986.

23. Брок Т. Мембранная фильтрация. - М.: Мир, 1987. - 462 с.

24. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. П.Н. Бур-гасова. - М.: Медицина, 1978. - 439 с.

25. Бургасов П.Н., Румянцев С.Н. Эволюция клостридиозов. - М.: Медицина, 1974.-247 с.

26. Быченко Б. Д., Каплунова О.П., Кур дина Д. С. Определение растворимых антигенов Clostridium perfringens методом ускоренной РПГА / В сб.: Актуальные вопросы производства медицинских иммунобиологических препаратов. - Томск, 1986. - С. 144-146.

27. Быченко Б.Д., Каплунова О.П., Курдина Д.С. Применение газовой хроматографии для идентификации микроорганизмов рода Clostridium // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1988. - №3. -С. 118-119.

28. Быченко Б.Д., Курдина A.C., Каплунова О.П. Диагностика и профилактика клостридиальных раневых инфекций / В сб.: Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. - М. - 1986. - С. 39-40.

29. Диагностика стафилококковых заболеваний с помощью иммунофермент-ной реакции / Н.П. Ванеева, Н.В. Цветкова, Р.Г. Гудкова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - №6. -С. 61-64.

30. Ванеева Л.И., Цветкова Н.В. Иммуноферментный метод, его настоящее и будущее // Иммунология. - 1980. - №22. - С. 13-19.

31. Использование казеиново-растительных сред для получения токсинов возбудителей анаэробных инфекций / И.Н. Виноградова, В.А. Петренко, H.A. Палкина и др. // Анаэробные инфекции: Труды межинститутской конференции. - М., 1960. - Т 9. - С. 101-103.

32. Парофазный газохроматографический анализ в экспресс-диагностике анаэробных инфекций / А.Г. Витенберг, A.B. Столбовой, Б.В. Иоффе и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1986. -№1,-С. 20-24.

33. Вишневский A.A., Шрайбер М.И. Военно-полевая хирургия: Руководство для врачей и студентов. - М: Медицина, 1975. - 319с.

34. Власова Е.В., Ларина И.А. Иммунизация против газовой гангрены и столбняка секстаанатоксином // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1969. -№7. - С. 113-116.

35. Власова Е.В., Цуриков Ф.Ф. Получение на казеиновых питательных средах летального токсина и коллагеназы С. yistolyticum // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1966. - №1. - С. 112-114.

36. Волкова М.А. Выделение стафилококковых антител высокой степени очистки с применением иммуносорбции и ферментолиза // Актуальные проблемы общественных, естественных и технических наук: Тез. докладов 1-й межвузовской конференции. - Пермь, 1980. - С. 204-205.

37. Воробьев A.A., Васильев Н.И., Кравченко А.Т. Анатоксины. - М.: Медицина, 1965.-487 с.

38. Воробьев A.A. Актуальные проблемы иммунологии в свете иммунопрофилактики инфекционных болезней // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1977. - №1. - С. 54-60.

39. Воробьев A.A. Основные направления и пути повышения эффективности иммунопрофилактики // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1977. - №1. - С. 54-60.

40. Воробьев A.A., Виха И.В. Современное состояние и перспективы совершенствования иммуноферментного анализа для решения задач клинической диагностики // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №9. - С. 3-8.

41. Воронов Н.С. Анаэробная инфекция // Военно-медицинский журнал. -1982.-С. 69-70.

42. Выгодчиков Г.В., Волкова З.М., Зелевинская С.А. Ассоциированные препараты для активной профилактики раневых инфекций / В сб. «Ассоции-

ров. профилактич. препараты против раневых инфекций». -М., 1959. -С. 3-19.

43. Комбинированные препараты для активной профилактики анаэробной инфекции / Г.В. Выгодчиков, С.А. Зелевинская, З.М. Волкова и др. //Анаэробные инфекции: Труды межинститутских конференций. - Т.9. -М.: Бюро научной информации. - 1960. - С. 3-13.

44. Разработка диагностической тест-системы для выявления растворимых стафилококковых антигенов иммуноферментным методом / Р.Д. Гаврило-ва, H.A. Семина, Л.И. Фикс и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1985. - №1. - С. 45-48.

45. Результаты использования иммуноферментного метода для индикации вируса клещевого энцефалита / С .Я. Гайдамович, Л.С. Субботина, О.В. Наволокин и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1986. - №6. - С. 103-104.

46. Галаев Ю.В. Патогенные ферменты бактерий. - М.: Медицина, 1968. -116 с.

47. Гиргалов С.С. Инфекционные осложнения огнестрельных ран // В кн.: Опыт Советской медицины в Великой Отечеств, войне 1941-45 гг. - М., 1961.-С. 15-18.

48. Голшмид В.К., Урум Г.В. Применение отечественных трубчатых мембран для очистки столбнячных антигенов // В кн. «Материалы Всес. симп.». - Тбилиси, 1984. - С. 447-449.

49. Грабарь П.Г. Иммуно-электрофоретический анализ белков человеческой сыворотки // Биохимия. - 1957. - Т.22,Вып.1-2. - С.49-59.

50. Гурвич А.Е. Современные методы биохимии. - М., 1964.

51. Далин М.В., Фиш Н.Г. Токсины микроорганизмов / Итоги науки и техники, сер. «Микробиология». - 1977. - Т. 6. - 104 с.

52. Демянчук A.B., Ванат И.М. Газовая гангрена вследствие сельскохозяйственной травмы // Клиническая хирургия. - 1974. - №10. - С. 71-72.

53. Детерман Г. Гель-хроматография: Пер. с англ. - М.: Мир, 1970. - С. 4163.

54. Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // Журн. Всес. хим. об-ва. - 1982. Т.27, №4. - С. 442-449.

55. Дзантиев Б.Б., Осипов А.П. Классификация и характеристика методов иммуноферментного анализа // Итоги науки и техники, сер. «Биотехнология». - М.: ВИНИТИ, 1987. - С. 56-116.

56. Иммуноферментный метод последовательного насыщения для определения антигенов на модели инсулина / В.Б. Дикова, Н.В. Сорокина, Е.М. Гаврилова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №9. - С. 51-57.

57. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М.: Химия, 1975. - 232 с.

58. Дытнерский Ю.И., Кочаров Р.Г. Некоторые проблемы теории и практики использования баромембранных процессов // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1987. - Т.32, №6. - С. 607-614.

59. Егоров A.M. Современный иммунохимический анализ и перспективы его развития // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1988. - Т.33, №5.-С. 494-501.

60. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев и др. - М., 1991. - 286с.

61. Егоров A.M. Новые методы иммуноанализа. - М.: Мир, 1991. - С. 78-79.

62. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. - М.: Наука, 1977.-216 с.

63. Езепчук Ю.В. Патогенность бактерий. - М.: Медицина, 1985. - 238 с.

64. Езепчук Ю.В. Факторы патогеннгости бактерий и проблема протектив-ных антигенов // Вестн. Акад. мед. наук СССР. - 1973. - №11. - С. 58-64.

65. Ефимова М.Г. Токсинообразование в культурах клостридиум септикум на питательных средах разного азотистого состава // Тезисы докладов итоговой научной конференции. - Пермь, 1985. - С. 11-12.

66. Ефимова Н.П. Изучение иммунологической эффективности очищенного сорбированного анатоксина Кл. гистолитикум в моно- и ассоциированных препаратах //Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфекций: Сб. статей под ред. Г.Е. Синельникова -Томск: Томск, ун-т, 1981. - С. 171-172.

67. Ефимова Н.П. Разработка и экспериментальное обоснование производства препаратов против анаэробных инфекций. Дисс. ... докт. мед. наук. -Пермь, 1971.-464 с.

68. А.С. 813966 СССР, МКИ. Способ получения питательной основы для получения токсина Clostridium histolyticum / Н.П.Ефимова (СССР). -№094449; Заявлено 16.04.79.

69. Научные достижения в области производства анатоксинов / Н.П.Ефимова, А.М.Николаева, М.А.Каменева и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - №2. - С.28-32.

70. Ефуни С.Н., Лыскин Г.И. Раны и раневая инфекция. - М., 1990.

71. Жак С.П. Комбинированное действие токсинов основных возбудителей газовой гангрены и фильтратов культур С. sporogenes // Анаэробные инфекции. - Одесса, 1959. - С.178.

72. Жак С.П. Некоторые данные в пользу ферментативной природы токсинов С. perfringens и С. oedematiens // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1965. -№11. - С. 65-68.

73. Жак С.П., Мицкевич О., Шефан Е.Е. Фибринолитическая активность токсинов С. perfringens, oedematiens, septicum при моноинфекции и смешанной газовой инфекции // Мжробюл. ж. - 1969. - Т. 31, №3. - С. 271.

74. Иммуноферментный метод в диагностике менингококковой инфекции / Г.В. Журавлева, A.A. Демина, Т.В. Ильина, Л.И. Ларина // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - №9. - С. 28-32.

75. Раневая газовая инфекция / A.A. Задорожный, Н.Ф. Калиниченко, Ю.Д. Чиркин и др. - М., 1979. - 118 с.

76. Ранняя диагностика и лечение анаэробной инфекции / A.A. Задорожный, Н.С. Катин, Н.М. Кузнецов и др. // Военно-мед. журн. - 1980. - №3. -С. 24-27.

77. Активная иммунизация против газовой гангрены / С.А. Зелевинская, З.И. Волкова, Н.С. Кашинцева и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1960. - №9. - С. 10-15.

78. Земляницкая Е.П., Ермакова М.П., Матвеев К.И. Изучение общих и специфических компонентов токсинов Cl. sepricum и Cl. histolyticum // Журн. гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. - 1978. -Т. 22, №1. - С. 95-101.

79. Зимина О.И., Исаева С.Я., Чернявский В.И. Стимуляция иммуногенеза при иммунизации комплексным препаратом против анаэробных инфекций // Иммунология и аллергия. - Киев, 1975. - Вып. 10.-С. 11-15.

80. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам / Ю.И.Иванов, О.Н.Погорелюк. - М. Медицина, 1990. - 219с.

81. Исполатовская М.В. Структура и функции токсина С. perfringens. // Биохимия. - 1970. - Т.35, №3. - С. 434-439.

82. Исполатовская М.В. Очистка и химическое изучение анатоксина гисто-литикум // Биохимия. - 1957. - Т.22, Вып.6. - С. 1000-1003.

83. Изучение ферментов токсического комплекса С. perfringens их образования и взаимодействия / М.В. Исполатовская, И.Я. Михайловская, Л.В. Климачева и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1965. - №11. - С. 61-65.

84. Каздобина И.С., Левдикова Г.А., Соловьева Н.И. К изучению токсиген-ных свойств С. histolyticum // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1964. - №3. - С. 60-65.

85. Каздобина И.С., Виноградова И.Н., Цуриков Ф.Ф. Опыт получения токсина С. histolyticum на казеиновых питательных средах // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1964. - №8. - С.93-96.

86. Каздобина И.С. Соловьев Н.Н. Морфологические особенности и токси-генные свойства S и R-форм CI. histolyticum // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1964. - №6. - С. 109-115.

87. Калиниченко А.А., Бирюкова С.В., Литвиненко П.М. О газовой гангрене в мирное время / Врачебное дело. - 1968. - №12. - С. 126.

88. Калиниченко Н.Ф. Иммунологическая эффективность тетраанатоксина (С. perfringens, С. oedematiens, С. tetani, С. septicum) в эксперименте // В кн.: Вопросы производства вакцин и сывороток. - Киев, 1968. - С. 56-58.

89. Каменева М.А. Некоторые аспекты получения высокоактивных токсинов CI. oedematiens типа А на казеиновых средах.: Дисс. ... канд. биол. наук. -Пермь, 1974.

90. Каплунова О.П. Экспресс-диагностика клостридиозов, вызываемых Кл. перфрингенс: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 1983. - 21 с.

91. Каплунова О.П. , Курдина Д.С. Клостридиозы и их диагностика / В сб.: Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. -М., 1981. - С. 149-152.

92. Каплунова О.П., Бочарова Н.Г. Обнаружение токсигенных штаммов Кл. перфрингенс при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции с лецитовителлином // В сб.: Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. - М. - 1982. - С. 134-138.

93. Применение пероксидазного метода иммуноферментного анализа для выявления клеток Clostridium perfringens / О.П. Каплунова, Д.С. Курдина,

JI.B. Григорьева и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №8. - С. 62-64.

94. Карбахш М., Перль X. Мембранные процессы в медицине и биотехнологии // Журн. Всес. хим. об-ва. - 1987. -Т. 32,№6. - С. 669-673.

95. Киранова И.Г. Газовая анаэробная инфекция. - София: Медицина и физкультура, 1974.

96. Киселев П.Н. Токсикология инфекционных процессов. - Д.: Медицина, 1971.-359 с.

97. Козин В.Н., Ковальчук Н.В., Кудрявцев Б.П. Об анаэробной инфекции // Советская медицина. - 1981. -№2. - С. 108-110.

98. Козлов М.П., Дубяга В.П. Использование мембранной технологии для разделения компонентов жидких смесей // Пластмассы. - 1982. - №9. - С. 49.

99. Колесов А.П., Столбовой A.B., Кочеровец В.И. Анаэробные инфекции в хирургии. - J1: Медицина. 1989.

100. Комкова O.A. Ускоренная диагностика возбудителей газовой гангрены новыми методами // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1958. - №5. - С. 40-44.

101. Кремлев Т.И., Миронова Т.А., Соловьева М.А. Качество анаэробных анатоксинов и пути их совершенствования // Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфекций: Мат. Всес. научн. конф.-Томск, 1981.-С. 164-169.

102. Раны и раневая инфекция / Под ред. М.И. Кузина, Б.М. Костюченок // М.: Медицина, 1990.-591 с.

103. Лабораторная диагностика клостридиозов / Методические рекомендации. -Харьков, 1979.-20 с.

104. Леонов C.B. Использование Г(аЬ)2-фрагментов антител при создании иммуноферментных тест-систем для определения гемагглютинина и бел-

ка NP вируса гриппа // В сб.: Современные пробл. мед. вирусол. - Рига, 1987.-С. 26.

105. Иммуноферментная тест-система на основе Р(аЬ)2-фрагментов антител для индикации гемагглютинина вируса гриппа / C.B. Леонов, Ю.А. Зако-мырдин, Г.И. Эггерт и др. // Вопр. вирус. - 1987. - Т. 32, №4. - С. 498-502.

106. Лехтцинд Е.В. Синтез новых типов иммуносорбентов на основе целлюлозы // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1982. - 23 с.

107. Лехтцинд Е.В., Гурвич А.Е. // Бюл. экпер. биол. - 1981. - №7. - С.68-70.

108. Анаэробная клостридиальная инфекция операционных ран / Л.И. Лип-ский, В.В. Дроздов, В.В. Хомяков и др. // Хирургия. - 1985. - №5. - С. 110-112.

109. Детекция токсина и оценка степени токсинообразования Corynebacterium diftheriae с помощью иммуноферментного анализа / И.К. Мазурова, Е.Е. Потемкина, В.В. Свиридов и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1989. - №6. - С. 66-70.

110. Львов А.Н. Газовая инфекция. - М.:Медгиз, 1946.

111. Матвеев К.И., Волгин Ю.Б. Анаэробная инфекция. Многотомное руководство по микробиологии, эпидемиологии и клинике инфекционных болезней. - М.: Изд-во мед. литературы, 1966. - Т.7.

112. Мельников В.М., Гладштейн А.И. Роль анаэробных микроорганизмов в развитии инфекции после травм и ортопедических операций // Ортопедия, травматология и протезирование. - 1981. - №4. - С. 45-48.

113. Мельников В.Н., Мельников Н.И. Анаэробная инфекция. - М.: Медицина, 1973.-288 с.

114. Мельников В.Н., Мельников Н.И., Еникеева У.С. Основы профилактики анаэробных инфекций. - Уфа.: Башк. книжн. изд-во, 1971. - 57 с.

115. Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимранов М.Г. Ферменты патогенно-сти и токсины бактерий. - М.: Медицина, 1969.

116. Методические рекомендации по балансированию микробиологических питательных сред. - М., 1987. - 40 с.

117. Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов (ГНКИ им. Л.А.Тарасевича). - М., 1972.

118. Использование иммуноферментного метода ELISA для выявления возбудителя туляремии / И.С. Мещерякова, Н.С. Умнова, К.Л. Шаханина и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1988. - С. 109-112.

119. Минервин С.М., Жак С.П. Влияние протеазы Aspergillus terrícola на летальные свойства токсина CI. perfringens типа А // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1966. - №1. - С. 115-117.

120. Мицкевич А.И. Наблюдение над потенциированием токсинов С. perfringens и С. histolyticum при комбинированном их действии // Микро-биол. журн. - 1967. - Т.29, Вып. 2. - С. 125-129.

121. Мокроусов В.М. Случай анаэробной инфекции // Клин, медицина. - 1982. - Т.Х, №8. - С. 96-97.

122. Иммуноферментный анализ применительно к контролю иммуно препаратов и технологических процессов / И.В. Москвичева, А.К. Барсуков, П.П. Хохлов и др. // В сб.: Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов. - Пермь, 1988. -С. 128-129.

123. Перспективы биоспецифической хроматографии в иммунобиотехнологии / И.В. Москвичева, А.К. Барсуков, Л.Е. Селькина и др. / В сб.: Препара-тив. хроматограф, физ. актив, веществ на полимер, сорбентах. - Л., 1988. -С. 19.

124. Незлин P.C. Строение и биосинтез антител. - М.: Наука, 1972.

125. Перспективы повышения эффективности производства гангренозных анатоксинов / В.П. Ненашев, В.Д. Артеменко, И.И. Кузнецова и др. // Вопр. прикладной иммунологии. - Уфа, 1980. - С. 30.

126. Ненашев В.П., Артеменко В.Д. Получение очищенных анатоксинов С. oedematiens из концентрированных токсинов с использованием казеиновых питательных сред // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1971. -№1. - С. 87-90.

127. Ранняя диагностика В. perfringens при газовых гангренах / М.Р. Нечаев-ская, П.М. Мительман // Анналы Мечниковского института. - Харьков, 1935. - Т.1, Вып.2. - С. 299-310.

128. Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ: общий обзор // Иммунофермент-ный анализ / Под ред. Нго Т.Т., Ленхофра Г.: Пер. с англ. - М.: Мир, 1988.-С. 10-35.

129. Никитин В.М. Методы экспресс-диагностики раневой инфекции // В сб.: Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. - 1986. - С. 47-49.

130. Диагностическая эффективность иммуноферментной тест-системы для определения антигенов дифтерийного токсина в сыворотке крови при клинико-лабораторном испытании / Н.М. Никитюк, Л.Ю. Смурова, Т.С. Шобухова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1990. - №9. - С. 67-70.

131. Николаева A.M. Экспериментальное обоснование и разработка промышленного способа получения очищенного сорбированного стафилококкового анатоксина из очищенного токсина: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - Алма-Ата, 1981. - 16 с.

132. Никольская О.Д. Молниеносная форма анаэробной газовой инфекции // Хирургия. - 1983. - №6. - С. 102-103.

133. Новоселова Г.Н. Экспериментальные материалы к разработке реакторного метода получения токсинов CI. perfringens типа А.: Дисс. ... канд. биол. наук. - Пермь, 1972.

134. Орлов А.Б. Характеристика иммуноферментного метода и оценка возможностей с позиций экспресс-диагностики // Препараты для экспресс-

диагностики: Сб. Московского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.-Л., 1981.-С. 55-71.

135. Молекулярные усилители в иммунохимическом анализе / А.П. Осипов, A.M. Егоров // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1989. -Т.34. - С. 18-23.

136. Осколкова З.И. Оценка иммуногенных свойств секстаанатоксина и моно-сорбированных анатоксинов // Актуальные вопросы производства медицинских иммунобиологических препаратов. - Томск, 1986. - С. 146-148.

137. Падюков Л.Н., Семенов Б.Ф. Перспективы развития средств иммунологической диагностики бактериальных инфекций // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1989. - Т. 34, №1. - С. 11-17.

138. Создание и изучение иммунных антигангренозных препаратов / Г.Ф. Папко, Т.И. Сергеева, М.З. Рудницкая и др. // Гематология и трансфузио-логия. - 1987. - T.XXXII, №7. - С. 20-23.

139. Перепечкин Л.П., Будницкий Г.А. Получение и применение мембран в виде полых волокон // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. -1987. - Т. 32, №6, - С. 633-641.

140. Перепечкина Н.П., Сиротинскийй A.B., Сиротинская Л.А. Мембранное разделение в совершенствовании вакцинных препаратов. Иллюзии и реальность // Современная вакцинология: Тезисы докладов. - Пермь, 1998. -С. 77-78.

141. Некоторые особенности ультрафильтрации иммунобиологических препаратов / Н.П. Перепечкина, А.Н. Мац, Г.Ю. Келлер и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1986. - №6. - С. 48-50.

142. О многоэтапном метрологическом подходе к проблеме оценки результатов количественного иммуноферментного определения антитоксических антител / В.Ф.Петров, А.М.Николаева, В.А.Иванова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - №2. - С.43-46.

143. Петровских В.П. Серологическая индикация и дифференциация ботули-нических токсинов-анатоксинов типов А,В и Е: Дисс. ... канд. биол. наук. - Пермь, 1998. - 144 с.

144. Пинчук J1.M. Неспецифические эффекты в твердофазных иммунофер-ментных методах // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №5. - С. 110-117.

145. Иммуноферментный анализ и его применение в инфекционной патологии / В.И. Покровский, Е.П. Голубинский, H.A. Семина и др. // Обзорная информация. Медицина и здравоохранение. Сер. «Медицинская генетика и иммунология». - М., 1986. - Вып.З. - 74 с.

146. Покровский В.И., Ермолин Г.А., Шабалина C.B. Настоящее и будущее иммуноферментных методов исследования в инфекционной патологии (обзор) // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1983.-№8.-С. 3-7.

147. Пономарева Т.Р., Смоленская А.З., Малахова В.А. Корреляция между бактериологическим и парофазным хроматографическим методами диагностики анаэробной инфекции // В сб.: Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. - М., 1986. - С. 37.

148. Постникова Т.М. Совершенствование методов определения in vitro а-токсина и а-антитоксина Clostridium perfringens типа А: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. -М, 1988.

149. Пушкарев A.A. Сорбированный анатоксин клостридиум септикум и его иммунологические свойства // Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфекций: Сб. статей под ред. Г.Е. Синельникова. - Томск: Томск, ун-т, 1981. - С. 177-179.

150. Пушкарев A.A., Мельников В.Н. Иммунологическая эффективность гангренозных компонентов комплексного препарата в эксперименте / Вопросы иммунологии инфекционных и аллергических заболеваний: Тезисы докладов. - Уфа, 1970. - С. 23-24.

151. Пушкарева E.B. Разработка метода очистки анатоксина Кл. гистолитикум // Материалы научной конференции, посвященной 85-летию ПНИИВС. -Пермь, 1983.-С. 9-10.

152. Пушкарева Е.В. Экспериментальное обоснование и разработка промышленного способа получения очищенного сорбированного анатоксина гистолитикум и изучение его иммунобиологических свойств: Дисс. ... канд. мед. наук. - Пермь, 1988. - 129 с.

153. Опыт последовательного выделения двух видов антител из одной сыворотки / И.И. Райхер, Л.И. Райхер, В.Ф. Петров и др. // Вопросы гигиены, эпидемиологии, микробиологии, вирусологии, инфекционной патологии: научно-практическая конференция, посвященная 60-летию образования СССР. - Пермь, 1982. - С. 46-47.

154. Райхер И.И. Очищенные антитоксины (выделение из противодифтерийных и противостолбнячных сывороток с помощью иммуносорбции, изучение, перспективы, практическое применение): Дисс. ... докт. биол. наук. -Пермь, 1973.-357 с.

155. Райхер Л.И., Райхер И.И. Аффинноочищенные ксеногенные антитела. Перспективы развития, проблемы // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы международного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И.И. Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им.И.И. Мечникова НПО «Иммунопрепарат». -Уфа, 1995. -4.2. - С. 86-91.

156. Современное иммуноферментное обеспечение эпиднадзора за дифтерией / Л.И. Райхер, В.Ф. Петров, Н.П. Ефимова и др. // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями»: Тезисы международного симпозиума. - С-Петербург, 1995.-С. 23.

157. A.C. 11337775. Способ иммуноферментного определения антигенов/ Л.И. Райхер, И.И. Райхер, Е.Х. Хазина, Л.Ю. Смурова, C.B. Шаболина // Опубл. 1987.

158. Проблема чистых антител и ее реализация в работах по созданию имму-ноферментных тест-систем / И.И.Райхер, Л.И.Райхер, Л.Ю.Погнуева и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. -№2. - С.12-14.

159. Раскин Б.М., Голшмид В.К. Зависимость токсинообразования С. tetani от состава питательной среды // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1973. -№11. - С. 145-146.

160. К вопросу об оптимизации процессов приготовления анатоксинов / Г.Л. Ратгауз, А.К. Акатов, А.М. Поверенный и др. // Вопр. прикладной иммунологии. - Уфа, 1980. - С. 54-56.

161. Регламент производства сыворотки противогангренозной поливалентной лошадиной очищенной концентрированной жидкой № 639-97.

162. Регламент производства анатоксина перфрингенс, очищенного, сорбированного № 87-87.

163. Регламент производства получения очищенных адсорбированных гангренозных анатоксинов (эдематиенс, перфрингенс) № 141-69.

164. Руссу В.Г. Актуальные проблемы анаэробного сепсиса // Клин. мед. -1983. - Т.XI, №11. - С. 11-17.

165. Саламова Р.Э., Горина Л.Г., Волкова И.Я. Определение антигенов Mycoplasma pneumoniae и антител к ним иммуноферментным методом у больных с заболеваниями дыхательных путей // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1985. - №7. - С. 48-51.

166. Сборник инструкций по общим методам контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Утвержден приказом МЗ СССР №31 от 13.01.83.

167. Свищева Н.Д. Биологические и серологические свойства возбудителя газовой гангрены: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - М., 1964.

168. Семенова В.Д. Применение полых волокон для концентрации токсина перфрингенс // Тез. докладов итоговой научн. конф. - Пермь, 1984. - С. 11-12.

169. Семенова В.Д. Экспериментальная и технологическая разработка способа получения очищенного анатоксина перфрингенс с использованием мембранных методов разделения: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - М., 1990.

170. Использование мембранных методов разделения в изготовлении анатоксина Clostridium perfringens / В.Д.Семенова, А.М.Николаева, Н.П.Ефимова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - №2. - С.32-36.

171. Апробация иммуноферментной тест-системы на основе F(ab)2-фрагментов противостафилококковых антител для определения стафилококкового а-гемолизина / H.A. Семина, Л.И. Фикс, Л.П. Мусина и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1995. - №3. -С. 96-99.

172. Семина H.A., Прямухина Н.С., Езепчук Ю.В. Госпитальные клостридио-зы // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 1991. — №12. -С. 56-62.

173. Семенова В.Д., Николаева A.M. Концентрирование токсина С. perfringens методом ультрафильтрации // Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов. -Пермь, 1968.-С. 41-42.

174. Гомологичные иммунопрепараты для профилактики и терапии газовой гангрены / Т.И. Сергеева, Г.Ф. Папко, В.А. Бабайцева и др. // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике: Всесоюзная научно-практическая конференция. - М., 1983. - С. 252-253.

175. Метод иммунофлюоресценции для экспрессного определения основных возбудителей газовой гангрены / Т.И. Сергеева, Е.П. Земляницкая, В.А.

Бабайцева и др. // В сб.: Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. - М, - 1983. - С. 166.

176. Сергеева Т.П., Кремлев Г.И., Чирикова Е.В. Методологические основы системы активной иммунопрофилактики газовой гангрены / Материалы VII съезда Всероссийского об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. -М, 1997.-С. 140-142.

177. Сергеева Т.И., Чирикова Е.В., Бабайцева В.А. Экспериментальное обоснование методов экстренной иммунопрофилактики газовой гангрены // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1995. - №5. -С. 9-13.

178. Сергеева Т.П., Бабайцева В.А., Абрамкина Г.А. Экспериментальное обоснование рационализации методов экстренной иммунопрофилактики столбняка и газовой гангрены // В сб.: Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. - М., 1986. - С. 78-80.

179. Сидорин B.C., Петрова С.М., Полоцкая А .Я. Анаэробная клостридиаль-ная инфекция операционных ран // Арх. патологии. - 1982. - T.XLIV, Вып. 12. - С. 69-72.

180. Смурова Л.Ю. Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе F(ab)2- фрагментов «чистых» антител для определения бактериальных токсинов (на модели дифтерийного токсина) // Дисс. ... канд. биол. наук.-М., 1988.

181. Соболев В.Р. Патогенные анаэробы: Учебное пособие. - М., ЦОЛИУВ, 1968.- 16 с.

182. Сойфер Р.Д. Мембранная технология в производстве биологически активных веществ / Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1987. -Т.32, №6. - С. 661-668.

183. Сперанская В.Н. Обоснование и разработка серологических микротестов для определения бактериальных растворимых антигенов на основе реакции коагглютинации: Дисс. ... канд. биол. наук. - Пермь, 1987. - 204 с.

184. Стремовский JI.Jl. Методы интенсификации процессов мембранного разделения суспензионных полидисперсных систем в биотехнологических производствах // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1986. - №6. - С. 472-475.

185. Стремовский Л.Л. Селективность интенсивных мембранных процессов разделения растворенных веществ // Хим.-фарм. журн. - 1976. - №10. -С. 55-72.

186. Стремовский Л.Л., Устюжанина И.Ю., Иванова М.В. Расчет проницаемости мембран в процессе ультрафильтрации суспензионных полидисперсных систем // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1985. - Т.30, №11. -С. 819-823.

187. Сычев М.Д. Тяжелая анаэробная инфекция // Хирургия. - 1981. - №6. - С. 94-95.

188. Сычева Л.П., Матвеева Л.И., Ретник М.Н. Некоторые методы концентрации и очистки анатоксинов Кл. эдематиенс и Кл. перфрингенс // Биологии. препараты и иммунолог, реактивность организма. - Томск, 1973. -Вып. 4. - С. 55-56.

189. Тимофеев В.К., Фисанович Т.И. О лечении больных с анаэробной газовой инфекцией // Воен.-мед. журн. - 1983. - №9. - С. 64.

190. Титова Е.И., Гладкова Т.А., Ванеева Л.И. Использование специфических антител к Bordetella pertussis в иммуноферментном анализе для выявления коклюшного антигена // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №9. - С. 99-103.

191. Ткаченко С.С., Юшманов Г.И. Причины развития, диагностики, лечения и профилактики анаэробных инфекций // Профилактика и лечение гнойных инфекций при механических травмах различной локализации: Мат. Всес. конф. - М., 1985. - С. 156-157.

192. Толстых Л.И., Коган А.Х., Туманский A.B. Анаэробная газовая инфекция // Хирургия. - 1981. - №5. - С. 102-106.

193. Торбан М.А. О механизме обезвреживания токсинов формалином // Биохимия. - 1960. - Т. 25, №1. - С. 28-33.

194. Торбан М.А., Брысова И.И., Панина Н.П. Азотистые продукты в бульонах Глузмана и токсинообразование столбнячной палочки // Сб. научн. тр. Ставроп. НИИВС. - 1958. - С.139-150.

195. Применение иммуноферментного метода на твердофазном носителе для определения туляремийного антигена / Н.С. Умнова, К.Л. Шаханина, И.П. Павлова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - №5. - С. 88-92.

196. Разработка иммуноферментного метода для выявления Franciella tularensis / Н.С. Умнова, К.Л. Шаханина, И.П. Павлова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1986. - №2. - С. 87-91.

197. Иммуноферментная тест-система для определения стафилококкового экзотоксина токсического шока / Ф.С. Флуер, Г.В. Михеева, П.Ф. Пожар и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1990. -№12. - С. 70-73.

198. Технологические аспекты получения препаратов иммунохимически чистых антител / Ю.А.Хавкин, А.В.Корнилова, Т.А.Баталова, И.А.Басченко // Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфекций: Сб. статей под ред. Г.Е. Синельникова. - Томск: Томск, ун-т, 1981.-С. 104.

199. Хазанова В.В. К вопросу об изучении токсикоинфекционных свойств С1. perfringens // Лабор. дело. - 1969. - №3. - С. 164-167.

200. О возможности серодиагностики коклюшной инфекции иммунофермент-ным методом / Н.В. Цветкова, Ю.В. Борисенко, Е.М. Кузнецова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №8. -С. 91-93.

201. Цехновицер М.М. О раневой инфекции // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1944. - №9. - С.3-10.

202. Выявление дифтерийного токсина и продуктов его деградации с помощью иммуноферментного анализа / C.B. Шабалина, Л.И. Райхер, И.И. Райхер и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.

- 1987,-№8.-С. 82-85.

203. Диагностическая тест-система для выявления менингококкового антигена иммуноферментным методом /C.B. Шабалина, H.A. Семина, И.В. Рубцов и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1983.

- №2. - С. 70-73.

204. Применение иммуноферментного анализа в диагностике бактериальных инфекций / C.B. Шабалина, H.A. Семина, Л.И. Фикс и др. // Актуальные вопросы бактериологии и прикладной иммунологии: Материалы Всесо-юзн. симпозиума, посвящен. 60-летию Тбилисского НИИВС. - Тбилиси, 1984.-С. 487.

205. Анаэробная инфекция мирного времени / И.Г. Шаваров, A.C. Шевченко, B.C. Крысько и др. // Клинич. хирургия. - 1982. - №1. - С. 58-59.

206. Шандренко В.Д. Выделение и очистка комплекса противогангренозных антител методом поливалентной иммуносорбции, очистки: Дисс. ... канд. мед. наук. - Пермь. - 1997. - 99 с.

207. Шандренко В.Д., Райхер И.И., Ефимова Н.П. Получение гангренозного антитоксина эдематиенс методом иммуносорбции // Тезисы докладов итоговой научной конференции ПНИИВС. - Пермь, 1985. - С. 15.

208. Шапиро Н.И., Москвичева И.В. К обоснованию общей теории детоксика-ции экзотоксинов / Вакцины и сыворотки. - Вып.16. - М., 1973. - С. 1732.

209. Использование ультрафильтрации при производстве белковых гидроли-затов / Т.П. Широчина, Э.М. Трефилов, Э.М. Ляная и др. // Биотехнология. - 1985. - №5. - С. 32-33.

210. Шкурина Е.А., Ванеева Л.И. Изучение диссоциации комплекса антиген-антитело в аффинной хроматографии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1989. - №3. - С. 85-88.

211. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии / Под ред. докт. мед. наук Н.Г. Тихонова. - Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1990. - 109 с.

212. Янкина Н.Ф., Семенова Г.Б. Получение моноспецифических сальмонел-лезных анти-О-4 антител методом аффинной хроматографии и их использование в иммуноферментных реакциях // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - №8. - С. 79-82.

213. Применение метода аффинной хроматографии для получения моноспецифических антител к сальмонеллам / Н.Ф. Янкина, Т.С. Шобухова, И.П. Павлова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1989. - №3. - С. 74-78.

214. Biotin-avidin amplified ELISA for quantitation of human IgA / Adler Stothz Karen, Dreesman Gordon R., Graham David Y. et al. // J. Immunoassay. -1985,- Vol.6, N1-2.-P. 67-77.

215. Monoclonal antibodies against tetanus toxin and toxoid / G. Ahnert-Hilger, B. Bissini, H. Miller et al. // Med. Microbiol, and Immunol. - 1983. - Vol.172, N2. -P.123-135.

216. Altemeier W.A., Fuller W.D. Prevention and treatment of gas gangren // J. Amer. med. Ass. - 1971. - Vol. 217. - P. 806-813.

217. Problems in the diagnosis and treatment of gas gangrene / W.A. Altemeier, W.R. Culberston, M. Vetto et al. // Arch. Surg. - 1957. - Vol. 74, N6. - P. 3339.

218. Anastasiades K.D., Mullins R.E., Conn R.B. Neuron-specific enolase. Assessment by ELISA in patients with small cell carcinoma of the lung // Amer. J. clin. Pathol. - 1987. - Vol.87, N2. - P. 245-249.

219. Avrameas S., Uriel J. Methode de marquage d'antigens et d'anticorps aves des enzyme et son application en immunodiffusion // C.R.Acad. Sei (D). - 1966. -Vol.2, N262.-P. 2543-2545.

220. Beiz J., Mansfeld Th., von Kroge H. Die endogene Clostridium septicum - infektion // Chir. Prax. - 1994. -Vol. 48, N1. - P. 59-61.

221. Bertil Nilsson. A general reagent for amplifying ELISA // J. Immunological Methods. - 1988. - N114. - P. 89-93.

222. Benjaminson M.A., Satyanarayana T. Rapid purification of fluorescent enzymes by ultrafiltration // Prep. Biochem. - 1983. - Vol.13, N1. - P.41-44.

223. The enzyme-linked immunosorbent assay of meningococcal and some related Escherichia coli polysaccharides / E.S. Beuverg, van R.W. Delft, R.H. Ties-jema, J. Nagel // J.Biol.Stand. - 1983. - Vol.11, N3. - P. 195-204.

224. Brahan Robert B., Kahler Ralph C. Clostridium septicum as a cause of pericarditis and mycotic aneurysm // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol.28, N10. -P. 2377-2378.

225. Brar R.S., Grewal G.S., Sharma D.R. Gangrenous dermatitis spontaneous cases // Arch. vet. - 1990. - N19. - P. 121-126.

226. Carton J.A. Clostridium septicum: Una senal de alerfa // Inferm infeec. y mi-crobiol. clin. - 1990. - Vol.8, N2. - p. 71-73

227. Clark Michael F., Lister Richard M., Bar-Joseph Moshe. ELISA Techniques // Meth. Enzymol. - 1986. - N 118. - P. 742-766.

228. Caastra W. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Meth. Mol. Biol. - 1984.-N1.-P.349-355.

229. Colwill M.R., Maudsley B.H. The management of gas gangrene with hyperbaris oxigen therapy // J. Bone Jt. Sung. - 1968. - Vol. 5, N4. - P.732-742.

230. Danitlson D., Lamdt D.W. Immunology of anaerobic bacterial infections // Immunology of human infection. - New York, London, 1981. - Pt.l. - P. 317343.

231. Darke S.G., King A.M., Slack W.K. Gas gangrene and related infection: classification, clinical features and aethiology, management and mortality: a report of 88 cases // Brit. J. Surg. - 1977. - Vol. 64, N 2. - p. 104-112.

232. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum type A and B toxins in stool samples of infants with botulism / M. Desfuliam, C.L. Hathewy, R.H. Yolken et al. // J. Clin. Microbiol. - 1984. - Vol.20, N3. -P. 379-383.

233. Dise T., Brunnel P.A. Anti-bovine antibody in human sera as a cause of non-specificiti in enzyme immunoassay // J. Clin. Microbiol. - 1987. - Vol.25, N 6. - P. 987-990.

234. Ehrlicher L., Li H.-Z., Habermehl K.-O. Problems of cytomegalovirus-antigen-detection with enzyme immunoassays // Zbl. Bakteriol., Mikrobiol. und Hyg. -1984. - F.258, N4. - P.504-507.

235. Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Biomedical applications of immobilized enzymes and proteins / Ed. Chang T.M.S. - N.Y.: Plenum Press, 1977. - N 2. - P. 87-96.

236. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. - 1971. - Vol. 8, N9.-P. 871-874.

237. Endogenous septicaemia with Clostridium perfringens in a premature infant / H. Fahnestich, R. Duckerhiff, L. Bindl et al. // 11 Eur. Congr. Perinatal. Med., Rome, Apr. 10-13, 1988. - Vol.2. - P. 367-371.

238. Fane A.U., Fell C.J.D., Norm T. Ultrafiltration lactivated sludge system development of a productive voll // Ultrafiltration, membran and application. Plenum Press. - New York, 1980. - P. 631-658.

239. Factors affecting the elaboration by CI. histolyticum of proteinases capable of debriding third degree burn eshars on quinea pigs / S.Berman, J.Loventhal, M.E.Wester et al. // J. Bacterid. - 1961. - Vol.82. - P.582-588.

240. Finegold S.M. Anaerobic bacteria in human disease. - N.Y., San Francisco, London: Acad. Press, 1977.

241. Finegold S.M. Anaerobic infections of lungs and pleura // In: Pulmonary diseases and disorders / Ed. A.P. Fishman. - N.Y., St. Louis, 1980. - Vol.2. - P. 1152-1163.

242. Flaschel E., Wandreu ch. Hula M.-R. Ultrafiltration for the separation of bio-catalysts // Adv. Biochem. Eng. - 1983. -N 26. - P.73-142.

243. Gaastra Wim. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) // Meth. Mol. Biol.,1984 - Vol.1. - P. 349-355.

244. Gorbach S.L., Mayhew J., Bartlett J.G. et al. Rapid diagnosis of anaerobic infection by direct gas-liquid chromatography of clinical specimens. - J. Clin. Invest, 1976. - Vol.57, N2. - P.478-484.

245. Guesdon J.L., Avrameas S. Solid phase immunoassays // Appl. Biochem. Bioeng. - 1981. - Vol. 3. - P. 207-232.

246. Halbert Seymour P., Anken Milton. Sandwich EIA for antigen // Biotechnol. Adv. - 1987. - Vol.5, N1. - P. 166-167.

247. Harmer J.G., Samuel D. The FJTC-anti-FJTC system is a sensitive alternative to biotin-streptavidin in ELISA // J. Immunol. Meth. - 1989. - Vol.122, N1. -P. 115-121.

248. Haun M., Wasi Safia. Biotinylated antibodies bound to streptavidin beads: a versatile solid matrix for immunoassays // Analyt. Biochem. - 1990. - Vol. 191.-P. 337-342.

249. Affinity chromatographic purification of antibody subsets depends on the mode of cross-linking of antigen to the affinity matrix / Hinman Channing L., Green Carolyn L., Denno Donna et al. // Mol. Immunol. - 1985. -Vol.22, N6.-P. 681-688.

250. Hirano J., Funada Т. Применение мембранных процессов в биотехнологии // Юкагаку, 1985. - Vol. 34, N10. - Р. 840-846.

251. Holdsworth Richard J., Parraff David. Development of an ELISA assay for Clostridium perfringens phospholipase (Alpha toxin) // J. Immunoassay. -1994. -Vol.15, N3. - P. 293-304.

252. Holliday Malcolm G. Rapid identification of Clostridium perfringens by counter-immunoelectrophoresis // Med. Lab. Sei. - 1985. - Vol.42, N 4. - P. 322-325.

253. Honda T., Sato M., Miwatani T. Differential detection of cholera enterotoxin and E.coli heat-labile enterotoxin by enzyme-linked immunosorbent assays with antibodies specific to the two toxins // J.Clin.Microbiol. - 1984. - Vol.20, N4. - P.664-667.

254. Characteristics and Evalution of Antibody-Horseradish Peroxidase Conjugates Prepared by Using a Maleimide Compound, Glutaraldehyde and Periodate / M. Imagawa, S. Yoshitake, E. Ischikawa et al. // J.Appl. Biochem. - 1982. -Vol.4, N1,-P. 41-57.

255. Jackson S.G., Yip-Chuck D.A., Brodsku M.H. A double antibody sandwich enzyme-immunoassay for Clostridium perfringens // J.Immunol. Meth. - 1985.

- Vol.83, N1.-P.141-150.

256. KabatE.A., Mayer M.M. Experimental immunochemistry. - Springfield, 1964.

257. Biotin-avidin ELISA quantitation of human IgA / Karen Adler-Storthz, Gordon R. Dreesman, David Y.Gracham et al. // J. of Immunoassay. - 1988. -N6.-P. 67-77.

258. Improved sensitivity and specificity of sandwich, competitive and capture enzyme-linked immunosorbent assays for allergen-specific antibodies / D. Ke-meny, R. Urbaanek, D. Samuel et al. // Int. Arch. Allergy and Appl. Immunol.

- 1985. - Vol.77, N 1-2. - P. 198-200.

259. Kiranov J.G. Die Bedeutung der primarchirurgischen Wundvorsorgung fur den seitpunkt des auftretens der anaeroben gasbrand-infection // Zentralblat fur Chirurgie. - 1969. - N3. - P.23-28.

260. Immunochemical and phisiological composition of hors botulinal antitocsins / L.L.Layton, I.Arimoto, C.Lamanna et al. // Japan. J. Med. Sci. Biol. - 1972. -Vol.25. -P.309.

261. Le M.S., Billigheimer P.J. Membranes in downstream processing / J. Chem. Eng. - 1985. - N416. - P.48-53.

262. Lesna J., Brett. M., Weston B. Diagnosis of clostridial septicaemia at autopsy // J. Pathol. - 1995.- 175. Suppl. - P. 123.

263. Lettl А. Продукция больших количеств клостридиальной коллагеназы и лецитиназы С. // Жури. гиг. эпидемиол. (Прага). - 1973. - Т. 17, №3. -С.357-360.

264. Lettl А. Микробиологические и технологические аспекты продукции сырой коллагеназы // Журн. гиг. эпидемиол. (Прага). - 1974. - Т. 18, №4. -С.477-482.

265. Maggio Е.Т. Enzyme immunoassay // Ed. Maggio E.T. Florida: CRC Press, Boca Raton. - 1981. - P. 5-70.

266. Malcolm G.Holliday. Rapid identification of Clostridium perfringens by counter-immunoelectrophoresis. // Medical Laboratory Sciences. - 1985. -Vol.42.-P. 322-325.

267. McClean D., Rogers H.J. Detection of bacterial enzymes in infection tissues // Lancet. - 1944. - N2. - P.434.

268. McLennan J.D. The histotoxic Clostridial infection of man // Вас. Rev. - 1962. - Vol.26, N 2. - P. 177-276.

269. Megret Francoise, Guesdon Jean-Luc, Alouf Joseph E. Solid phase enzyme immunoassays of pertussis toxin using peroxidase or biotin labeled antibodies // J. Immunoassay. - 1987. - Vol. 8, N1. - P. 43-71.

270. Mitruka B.M. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине: Пер. с англ. - М.: Медицина, 1978.

271. Multer Т., Morgan M., Fabry G. Clostridium septicum gangrene complicating a closed femoral fracture // Acta orthepacol. belg. - 1993. - Vol. 59, N4. - P. 416-419.

272. Nakano P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem., Cytochem. - 1974. - Vol.22, N12. - P. 10841091.

273. Nowalowska Maria, Matras Jadwiga, Bartocze Michal. Zastooosowame testu elisa do wykrywania toksyn Clostriidium perfringens typu A. // Med. dosw. i mikrobiol. - 1988. - Vol.40, N3.- 149-154.

274. Oakley C.L. The toxins of CI. welchii //Bull. Hygiene. - 1943. - Vol. 18, N10. -781-805.

275. Oellerich M. Enzyme-immunoassay: a review // J. Clin. Chem. and Clin. Bio-chem. - 1984. - Vol. 22, N12. - P. 895-904.

276. Oellerich M. Enzyme immunoassay in clinical chemistry. Present status and trend // J. Clin chem. Clin, biochem. - 1980. - Vol. 18. - P. 197-208.

277. Phillips K.D., Tearle P.V., Willis A.T. Rapid diagnosis of anaerobic infection by gas-liquid chromatography of clinical material. - J. Clin. Path. - 1976. -Vol.29, N5. - P.428-432.

278. Поликар А., Цакова А. Комбинированный метод получения высокоочищенного дифтерийного анатоксина в производственных условиях // Епидемиол. микробиол. и инф. бол. -1981. - Т.18, №2. - С. 154-158.

279. Riccio John A., Oberkircher Oscar R. Clostridium septicum sepsis and cele-britis: A rare complication of the hemolytic-uremic syndrome // Pediat. Infec. Disease J. - 1988. - Vol. 7, N5. - P. 342-345.

280. Rubinstein K.E., Schneider R.S., Ullman E.F. "Homogeneous" enzyme immunoassay. A new immunochemical technique // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1972,-Vol.47.-P.846-851.

281. Schuurs A.H.W.M., Van Weemen B.K. Enzyme immunoassays // Clin. Chim. Acta. - 1977. - Vol. 81. - P. 1-40.

282. Schott H. Therapie des Gasodems Ergebnisse und Problem // Chirurg. - 1975. -Vol.46.-S. 15-20.

283. Siegel Lynn S. Human immune response to botulinum pentavalent (ABCDE) toxoid determined by a neutralization test and by an enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26, N11. - P. 2351-2356.

284. Smith L.D.S. The pathogenic anaerobic bacteria // 2nd ed. Sprinfield, Illinois USA: Charles C. Thomas, 1975.

285. Strauch Sonja, Meyer Bianca, Baungart Jürgen. Nachweis von Clostridium perfringens mit der Impedanz-Methode // Fleich Wirtschaft. - 1994. - Vol.74, N10. -P.1107-1108.

286. Suter M., Butler J.E., Peterman J.H. The immunochemistry of sandwich ELISAS. The stoichiometry and efficacy of the protein-avidin-biotin capture (PABC) system // Mol. Immunol. - 1989. - Vol. 26, N 3. - P. 221-230.

287. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. - Amsterdam: Elsevier, 1985. -Vol. 15.-P. 39-279.

288. Van Weemen B.K., Schuurs F.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate // FEBS Lett. - 1971. - Vol. 15. - P. 232-236.

289. Weber K., Osborn M. The reability of molecularweight determinations by do-decyl sulfate-poliacrilamide gel electrophoresis // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 244. -P.4406-4412.

290. Zhou Fang. Practical study on detection and identification by gas chromatography // Microbiology. - 1989. - C.343-347.