Разработка технологии производства антигена Coxiella burnetii для реакции связывания комплемента, метода флуоресцирующих антител и иммунофлуориметрического анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Соснина, Оксана Юрьевна

• Соснина, Оксана Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Соснина, Оксана Юрьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ Coxiella

burnetii И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Микроорганизмы

2.1.2. Антигены •

2.1.3. Сыворотки

2.2. Методы исследования

2.2.1. Реакция связывания комплемента

2.2.2. Реакция угнетения связывания комплемента

2.2.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

2.2.4. Реакция нейтрализации антигена (РНАг)

2.2.5. Метод флуоресцирующих антител (МФА)

2.2.6. Иммунофлуориметрический анализ (ИФМА)

2.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.2.8. Колоночная гель хроматография антигена

2.2.9. Люминесцентная микроскопия

2.2.10. Электронная микроскопия

2.2.11. Определение белка

2.2.12. Стандартизация C.burnetii

2.2.13. Расчет необходимой площади поверхности мембран

2.2.14. Статистическая обработка

Глава 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОГО АНТИГЕНА Coxiella burnetii ШТАММА «М-44», ПРИГОДНОГО ДЛЯ

РАЗЛИЧНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ (РСК, нМФА)

3.1. Апробация различных способов препаративного выделения

корпускулярного антигена C.burnetii и выбор оптимального метода

3.1.1. Получение антигена методом эфирной обработки по М.Ю.Морозовой и его оценка в различных серологических тестах

3.1.2. Выделение антигена по способу В.АЛблонской и его серологическая характеристика

3.1.3. Очистка C.burnetii методом дифференциального центрифугирования и оценка пригодности полученного антигена для РСК, нМФА

3.1.4. Сравнительная оценка апробированных способов очистки

54

3.2. Разработка способа очистки C.burnetii с использованием дифференциального центрифугирования, ферментолиза и микрофильтрации

3.2.1. Стабилизация основных антигенных структур на C.burnetii, штамма «М-44»

3.2.2. Максимальная изоляция C.burnetii из клеток желточной оболочки: гомогенизация и протеолиз трипсином

3.2.3. Изучение возможности использования микрофильтрации для очистки антигена. Выбор мембран

3.2.4. Отработка оптимальных параметров микрофильтрации субстрата C.burnetii

3.2.5. Определение характеристик препарата с помощью метода электронной микроскопии и колоночной гель-хроматографии

3.2.6. Получение антигенов C.burnetii и изучение специфической активности приготовленных антигенов С. burnetii в нескольких серологических реакциях и их стандартизация

3.2.7. Стабилизация антигенов C.burnetii

Глава 4. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДАЛЬНЕЙШЕГО ПРИМЕНЕНИЯ РАЗРАБОТАННОГО АНТИГЕНА С burnetii

4.1. Исследования в области применения антигена C.burnetii для получения диагностических сывороток

4.2. Изучение возможности использования антигенов C.burnetii для выявления антител в ИФМА

4.2.1.Приготовление для оценки антигенов Eu-конъюгатов для прямого и непрямого вариантов ИФМА

4.2.2. Изучение сорбционной способности антигенов на твердофазном носителе

4.2.3. Выявление специфических антител в непрямом ИФМА

57

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

119

ВЫВОДЫ

131

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

АЕ - антигенные единицы

«ЖМ-JIyra» - штамм "Желтогорлая Мышь-Луга"

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ИФРМА - иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФМА - иммунофлуориметрический анализ

нИФМА - непрямой иммунофлуориметрический анализ

ИФМ - иммунофлуоресцентный метод

ИЭД - иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум

КАП - кожная аллергическая проба

КЭ - куриные эмбрионы

ЛАТ - люминесцирующие антитела

ЛПС - липополисахарид

ЖС - нормальная кроличья сыворотка

нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител

пМФА - прямой метод флуоресцирующих антител

ПААГ - полиакриламидный гель

РА - реакция агглютинации

РМА - реакция микроагглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РНАг - реакция нейтрализации антигена

РСК - реакция связывания комплемента

РУСК - реакция угнетения связывания комплемента

ФИТЦ - флуоресцина нзотиоцианат

ЧАЭД - человеческий антигенный эритроцитарный диагностикум

Ig G - иммуноглобулины класса G

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии производства антигена Coxiella burnetii для реакции связывания комплемента, метода флуоресцирующих антител и иммунофлуориметрического анализа»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема зооантропонозных заболеваний, особенно вирусной и риккетсиозной этиологии, постоянно находится в центре внимания российского здравоохранения. Одним из таких заболеваний является коксиеллез (лихорадка Ку) - факультативно-трансмиссивный зооантропоноз с природной очаговостью, повсеместно распространенный на земном шаре, встречающийся в виде спорадической заболеваемости и эпидемических вспышек.

В Российской Федерации коксиеллез регистрируется в 37 регионах из 89 административных территорий, при этом отмечается выраженная неравномерность территориального распределения инфекции. Наибольшее число случаев коксиеллеза по данным Н.В.Рудакова [111] приходится на Поволжский регион (38,8%), Астраханскую область (32,4%) и Западную Сибирь (30,6%>). Анализ эпидемиологических закономерностей распространения данной инфекции в современных условиях позволил установить антропическую трансформацию очагов коксиеллеза, выраженность которой зависит не только от напряженности очага, но и от уровня диагностики заболевания [110]. При эпидобследовании ряда очагов коксиеллеза в России и на Украине было установлено, что реальный уровень заболеваемости превышает данные официальной статистики в десятки раз, что связано с полиморфной картиной клинических проявлений, подострым и бессимптомном течением инфекционного процесса [126, 111, 124,], а также отсутствием диагностикумов для выявления специфических антител к определенным фазовым вариациям возбудителя, появляющихся на разных стадиях инфекционного процесса. В последнее десятилетие отмечен значительный рост числа хронических заболеваний коксиеллезом [120], что

указывает на отсутствие своевременной диагностики и лечения этой инфекции.

Важную роль в повышении эффективности эпиднадзора и совершенствовании предупредительных мероприятий в отношении

коксиеллезной инфекции играет уровень клинической и эпидемиологической диагностики, при этом первостепенная роль отводится лабораторным методам исследования. Достоверность результатов серологического анализа зависит в значительной мере от качества диагностических препаратов, их возможности регистрировать разные фазовые вариации возбудителя или антитела к ним. Создание высокоэффективных и высокочувствительных препаратов, использование единых диагностикумов для нескольких серологических реакций следует рассматривать как одну из ведущих и интенсивно разрабатываемых проблем, определяющих своевременность всего комплекса мероприятий по предупреждению распространения этой природно-очаговой инфекции.

Для проведения полной и достоверной диагностики коксиеллеза должны быть учтены биологические особенности возбудителя, в частности его способность существовать в 2-х фазовых вариациях, что нашло отражение и в образовании специфических антител. При заболевании человека коксиеллезом в остром периоде заболевания образуются антитела к II фазовой вариации возбудителя, при хронизации процесса в сыворотке крови человека превалируют антитела к I фазе Coxiella burnetii. Поэтому ранняя диагностика должна основываться на поиске в крови больных антител ко II фазе инфекции, с последующим определением антител к I фазовой вариации возбудителя.

Для ранней диагностики использовался корпускулярный антиген С.burnetii II фазы, выпускаемый Ташкентским НИИВС, очищенный традиционным методом по J. Cragie [162], основанном на применении эфирной обработки. Следует подчеркнуть, что использование диэтилового эфира в технологическом процессе производства коксиеллезных диагностикумов I и II фазовых вариаций дает неравнозначные результаты. Регламентированный метод обеспечивает стандартность в получении очищенных суспензий С. burnetii лишь I фазы. По данным С.Шрамека с сотр. [220] и М.Ю.Морозовой [83], очистка возбудителя, находящегося в фазе II, дает низкий выход, требует

длительного времени, а полученные суспензии содержат тканевые примеси и обладают недостаточной активностью и специфичностью. Мнения исследователей о качестве диагностических препаратов неоднозначны. П.Ф.Здродовский и Е.М.Голиневич [37] считают, что наличие примесей в корпускулярных антигенах I и II фаз не отражается на достоверности результатов в РСК и РА. Напротив, В.А.Яблонская, И.В.Тарасевич и В.А.Макарова [135] полагают, что наличие тканевых компонентов среды культивирования в диагностических антигенных коксиеллезных препаратах часто ведет к ложноположительным результатам. Использование же этих антигенов в ИФРМА оказалось малоэффективным из-за наличия спонтанных агглютинатов и тканевых компонентов, обусловливающих неспецифические реакции [4, 7, 75]. Наиболее остро проблема очистки коксиеллезных антигенов возникла при использовании их в таких высокочувствительных тестах, как ИФА и ИФМА, что потребовало разработки методических приемов дополнительной очистки коммерческих антигенов [122, 25, 113]. Предложенные исследователями способы очистки при самостоятельном использовании либо не гарантируют полной очистки С.burnetii от тканевых компонентов среды культивирования, либо трудоемки в исполнении и поэтому не вышли за рамки экспериментальных исследований. Отсутствие коммерческих, стандартизованных, высокоочшценных антигенов С.burnetii затрудняет внедрение новых серологических методов в практику здравоохранения.

Изложенное свидетельствует, что до настоящего времени проблема очистки С.burnetii II фазы, максимально очищенного от компонентов среды культивирования и сохраняющего антигенную структуру на уровне нативной клетки еще не решена, что определяет актуальность изысканий в этой области.

Цель работы. Разработка технологии изготовления антигена С.burnetii II фазы штамма «М-44» для создания коксиеллезного диагностикума, пригодного для РСК, нМФА и ИФМА.

Основные задачи исследования.

¡.Разработать метод получения корпускулярного антигена C.burnetii II фазы штамма «М-44», изучить степень его очистки и специфические свойства.

2. Определить диагностическую значимость полученного антигена в РСК и нМФА.

3. Изучить возможность получения высокоэффективной сыворотки к С. burnetii для комплектации препарата.

4. Изучить возможность применения полученного антигена C.burnetii в нИФМА для выявления специфических антител.

5. Оптимизировать технологию к условиям производства.

Научная новизна работы. Разработана технология, позволяющая получать корпускулярный антиген C.burnetii II фазы вакцинного штамма «М-44» без применения эфирной обработки. Использование дифференциального центрифугирования в сочетании с ферментолизом и мембранной микрофильтрацией дает возможность получить высокоочищенный препарат, максимально сохраняющий специфические характеристики, свойственные нативному возбудителю. Изучение специфических и иммуногенных свойств препарата позволило охарактеризовать его как полноценный антиген, пригодный для обнаружения антител к C.burnetii в РСК и нМФА.

Отработана оригинальная схема иммунизации животных для получения диагностической высокоактивной и специфической сыворотки к С. burnetii.

Впервые установлена возможность использования выделенного антигена в новом методе иммуноанализа - ИФМА.

Сконструированы лантанидные конъюгаты для индикации C.burnetii в прямом варианте ИФМА и для нИФМА на основе Fab-фрагментов антивидовых антител против иммуноглобулинов человека.

Разработан оригинальный иммуносорбент на основе геля гидрокиси алюминия и белковых лигандов, иммобилизованных на носителе с помощью

поперечно-сшивающих реагентов для удаления неспецифических примесей из иммуноглобулиновых препаратов.

Изучена сорбционная способность корпускулярных и растворимых антигенов С. burnetii к поверхности полистироловых планшетов, оценена их пригодность для индикации антител в сыворотках больных и лиц, привитых вакциной против лихорадки Ку в нИФМА.

Теоретическое и практическое значение работы. В теоретическом плане проведенное исследование расширяет существующие представления о возможности создания нового типа препарата для лабораторной диагностики коксиеллеза. Полученный фактический материал может быть использован при изучении возможности приготовления единых диагностикумов многоцелевого назначения из риккетсий других таксономических групп. Определен аспект дальнейшего применения разработанного оригинального антигена при конструировании препаратов для нового метода иммуноанализа - нИФМА.

На основании проведенных исследований разработана экспериментально-производственная технология получения корпускулярного антигена С.burnetii штамма «М-44», позволяющая проводить раннюю диагностику коксиеллеза в РСК, нМФА и ИФМА. Разработанная технология способствует увеличению удельной активности препарата в 4-8 раз по сравнению с регламентированной технологией, исключает токсическое воздействие паров эфира на персонал и повышает безопасность работы, что способствует созданию благоприятных санитарно-гигиенических условий в производственных помещениях.

По предложенной оригинальной схеме получена диагностическая сыворотка к С.burnetii, прилагаемая в качестве положительной контрольной сыворотки для комплектации препарата.

На препарат составлена и направлена для утверждения в ГИСК им. Л.А.Тарасевича нормативно-техническая документация в виде экспериментально-производственного регламента, Временной Фармакопейной

статьи и Инструкции по применению на «Диагностикум коксиеллезный Бернета сухой для РСК и МФА».

При непосредственном участии автора проведено освоение препарата в производстве НПО «Биомед».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделение C.burnetii II фазы, штамма «М-44» по безэфирной технологии, сочетающей дифференциальное центрифугирование, ферментолиз трипсином и мембранную микрофильтрацию, обеспечивает получение корпускулярного антигена с сохраненной антигенной структурой, высокой степени очистки и гомогенности, что зафиксировано методом электронной микроскопии и иммунохимического анализа.

2. Разработанный антиген обладает достаточными диагностическими возможностями, позволяя проводить индикацию специфических антител в РСК и нМФА, а также в сыворотках экспериментальных животных к разным штаммам C.burnetii I и II фазы: «Грита», «М-44» и «ЖМ-JIyra». Это явилось основанием для рекомендации полученного антигена для ранней серодиагностики и эпидемиологического надзора за коксиеллезом.

3. Целесообразность использования приготовленного антигена для выявления специфических антител в высокочувствительном тесте - нИФМА. Сконструированная на основе оригинального антигена и индикаторных Fab-фрагментов антител против иммуноглобулинов человека, меченных хлоридом европия, ИФМТС продемонстировала более высокую чувствительность при выявлении специфических антител к С. burnetii по сравнению с РСК и нМФА.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на конкурсе молодых специалистов НПО "Биомед" (апрель 1998г.), на пленарном заседании общества микробиологов и эпидемиологов (19 января 1999г.)

Диссертационная работа прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета Пермского НПО

"Биомед" (24 декабря 1998), на расширенном совместном заседании лаборатории экологической генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, кафедры микробиологии Пермской Медакадемии (4 марта 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и 17 таблицами, вставленными в текст по месту цитирования; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения, выводов и приложения. Список цитируемой литературы включает 251 источник, в том числе 137 отечественных и 114 зарубежных авторов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермского НПО «Биомед» (№ гос. регистрации 01.9.50 005347).

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ Coxiella burnetii И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

Среди патогенных для человека риккетсий возбудитель коксиеллеза занимает особое место в связи с практически повсеместным его распространением. Данное заболевание эндемично для многих местностей Австралии, Америки, Африки, особенно широкое распространение коксиеллезная инфекция получила в Европе [189, 164, 191, 214, 213, 212, 216]. На территории нашей страны лихорадка Ку официально регистрируется с 1957 года. За прошедший период в России было учтено около 11000 случаев коксиеллеза, показатели заболеваемости составляли не более 1,0 на 100 тысяч жителей [109]. Однако фактическая заболеваемость этой инфекцией превышает данные официальной регистрации, что связано с отсутствием в практическом здравоохранении средств диагностики [124, 112]. Выявление и изучение природных и антропургических очагов, предупреждение распространения коксиеллезной инфекции, - одна из основных задач практического здравоохранения России и стран «ближнего» зарубежья [37, 69, 118,32,33,72, 88, 133].

На территории России лихорадка Ку наблюдается чаще в форме спорадических случаев, с активацией эпидемиологического процесса, сопровождающегося вспышками заболеваемости коксиеллезом, преимущественно в районах развитого животноводства. Эпидемиологически заболевание обычно связано с зараженностью коксиеллезом рогатого скота (коровы, козы, овцы) и выделением возбудителя с молоком, мочой, фекалиями, плацентой и околоплодной жидкостью [166, 45, 47]. С целью выявления внутристадных или антропургических очагов лихорадки Ку, рядом экспериментальных лабораторий были обследованы Ярославская, Куйбышевская, Воронежская и др. области, Ставропольский край, районы народохозяйственного освоения Сибири и Дального Востока, и доказано

фактическое формирование очагов коксиеллезной инфекции в условиях специализированных хозяйств, в частности, овцеводческих, где доля животных содержащих антитела к C.burnetii составляла 0,4-31,2% [104,105,107,126].

Таким образом, внутристадные или антропургические очаги коксиеллеза существуют и представляют сегодня реальную эпидемическую угрозу [29, 111]. Это обстоятельство вновь подчеркивает настоятельную необходимость усиления эпидемиологического надзора за данной инфекцией.

Ку-риккетсиоз поддерживается за счет циркуляции возбудителя среди различных видов клещей у многих диких животных, широкой диссеминации этой инфекции среди диких птиц [28, 183]. Для него характерна весенне-летняя сезонность связанная с массовым инфицированием объектов внешней среды возбудителем (окот и отел скота, прилет птиц).

Большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение имеют биологические особенности возбудителя лихорадки Ку, C.burnetii. Возбудитель характеризуется способностью образовывать фильтрующиеся формы, отличается высокой контагиозностью [116, 181, 182, 231], а также повышенной стойкостью во внешней среде как во влажных, так и в сухих субстратах [38, 63]. Наряду с указанным, возбудитель Ку-лихорадки обнаруживает значительную устойчивость к нагреванию и действию ультрафиолетового облучения, проявляет пародоксальную резистентность в отношении многих дезинфицирующих веществ [46, 67, 39].

Заражение различных объектов внешней среды выделениями больных животных способствует широкому разносу стойкого возбудителя Ку-лихорадки за пределы мест их обитания, что в свою очередь провоцирует заболевания среди людей, не имевших контакта с больными животными. Случаи таких «заносных» вспышек коксиеллеза обнаруживаются на мясокомбинатах, молочных заводах, ковровых, хлопчатобумажных,

шерстеобрабатывающих фабриках и связаны с зараженной щерстью, хлопком и зерно-фуражом [215, 68, 62, 121].

Трудности постановки клинического диагноза коксиеллезной инфекции и недостатки в обеспечении серологического контроля нередко приводят к генодиагностике лихорадки Ку как у людей, так и у животных. Повсеместное распространение этой болезни, тяжесть ее течения, склонность к хронизации [157, 160, 168], и, наконец, материальные потери, обусловленные ущербом здоровью людей и сельскохозяйственных животных, ставят вопрос о новых подходах к разработке способов профилактики, диагностики и лечения этого риккетсиоза.

С учетом изложенного решающую роль в диагностике лихорадки Ку играют серологические методы исследования. Общепринятыми методами серодиагностики коксиеллезной инфекции являются РСК, РА [115]. По данным литературы [167, 26, 113] более информативными являются серологические тесты, такие как МФА, ИФА, ИФМА. Вместе с тем, что перечисленные высокочувствительные реакции не могут быть использованы практическим здравоохранением, так как медицинской промышленностью не выпускаются антигены для МФА и ИФА, а имеющиеся научные разработки не вышли за рамки экспериментальных исследований. В настоящее время практическое здравоохранение испытывает острую необходимость в препаратах для распознавания коксиеллеза. В связи с распадом СССР, прекратились поставки Ташкентским НИИВС единственного коммерческого препарата, применяемого для выявления коксиеллезных антител в РСК. Поэтому создание новых и усовершенствование выпускаемых средств серологической диагностики лихорадки Ку стало актуальной задачей.

Трудности в создании качественных коксиеллезных диагностических препаратов обусловлены наличием у С. burnetii двух фазовых вариаций физиологического состояния бактериальных клеток [229, 230].

По данным ряда авторов [15, 98, 239] в зависимости от особенностей среды культивирования С.burnetii происходит преимущественное размножение и накопление того или иного варианта, по своим биологическим свойствам соответствующего I или II фазе изменчивости. Штаммы возбудителя, выделенные от естественно-инфицированных клещей, диких и домашних животных, человека находятся в I фазе развития и остаются в ней, если культивируются на восприимчивых лабораторных животных: кроликах, морских свинках, белых мышах, а также в организме переносчика, в культуре ткани. В процессе многократного пассирования I фазы возбудителя в желточных оболочках развивающихся куриных эмбрионов [14], накапливаются С.burnetii II фазы развития, отличающиеся структурными изменениями в липополисахаридном и белковом составе клеточной стенки [27, 138, 241, 245, 196], что приводит к снижению патогенных свойств возбудителя [151, 53, 103, 96, 117]. В целях усиления иммуногенных свойств, культуры С.burnetii II фазы применяют метод поэтапного пассирования штамма на куриных эмбрионах, а затем в тканях лабораторных животных [14,76]. Существуют методы накопления биомассы С.burnetii в клетках тканевой культуры [217, 78, 43], смешанное пассирование штамма в развивающихся КЭ и в жидкой агаровой среде [50].

Общепринятыми методами культивирования, нашедшими в дальнейшем широкое применение, являются методы размножения С.burnetii в селезенках белых мышей и на куриных эмбрионах [150, 19, 54, 16,137,124].

В свою очередь, разработка методов массового накопления этих облигатных внутриклеточных микроорганизмов потребовала создания методов выделения возбудителя из различных биологических субстратов и его очистку от белков и тканей куриного эмбриона, селезенок белых мышей. Для этой цели были предложены разнообразные методические приемы, основанные на использовании как физических, так и химических методов очистки. Из всего разнообразия методов, предложенных для очистки

эмбриональных антигенов, наиболее распространенными в производственной практике до сего времени является метод Craiqie J. [162]. Основу метода составляет использование органического растворителя, в частности, этилового эфира, для удаления жирорастворимых и тканевых примесей среды культивирования из содержащей риккетсии смеси. Методика проста и обеспечивает при соответствующих параметрах выделение риккетсий, свободных от клеточного дебриса хозяина [101, 82]. В настоящее время эфирная обработка применяется для очистки С.burnetii и получения корпускулярных антигенов С.burnetii I и II фаз для РСК, РА, КАП [81, 165, 121, 186]. Очищенные таким способом корпускулярные антигены С.burnetii являются и по настоящее время основным компонентом получения профилактических корпускулярных вакцин, предназначенных для предупреждения коксиеллезной инфекции [93, 187, 103, 137, 188, 124].

Рядом зарубежных исследователей [146, 218, 208, 193,] были использованы методы дифференциального центрифугирования взвесей инфицированных желточных мешков в физиологическом растворе, в линейном градиенте сахарозы или сахарозо-глютаматной среде и получены очищенные риккетсии. Применение равновесного метода градиентного центрифугирования [177] позволяет не только проводить очистку С.burnetii, но и концентрировать каждую фазовую вариацию в определенной зоне согласно ее плотности. Сущность этого физического метода заключается в дифференциальном центрифугировании с последующим разделением фаз С. burnetii от компонентов тканей хозяина в градиенте раствора хлористого цезия.

Заслуживают внимания и модификации метода дифференциального центрифугирования, предусматривающие проведение очистки С.burnetii в гипертонических растворах хлористого калия или хлористого натрия [159, 206]. Высокие концентрации солей повышают растворимость белковых

примесей и позволяют перевести их из взвешенного состояния в растворимую фракцию супернатанта, что способствует их последующей элиминации.

В целях лучшей очистки коксиеллезной взвеси применяют метод ультрацентрифугирования в градиенте среды генетрон [163], который позволяет наряду с увеличением выхода корпускулярного антигена как I, так и II фазовой вариации С. burnetii сохранить иммунодоминантные структуры на поверхности клетки. Кроме того, указанный метод по данным авторов не уступает по степени очистки методу эфирной обработки.

Существуют способы очистки С.burnetii, а также других видов риккетсий от балластных примесей термическими методами [100, 55], в частности, пятикратным быстрым замораживанием и оттаиванием при комнатной температуре и центрифугированием коагулированных белков. Изложенный метод не дает достаточной очистки от среды культивирования, но позволяет получать высокий выход корпускулярного антигена в связи с разрушением эпителиальных клеток желточных оболочек.

Известны методы очистки риккетсий, в том числе и С.burnetii, с использованием метода адсорбции посторонних примесей из риккетсиальной взвеси с помощью целита [221, 247, 159, 16], кизельгура [152], глутаральдегида [242], преципитацией с альбумином бычьей сыворотки [147], антисывороток к антигенам среды культивирования [246]. Эти методы трудоемки и используются лишь в специализированных лабораториях при проведении аналитических работ, в частности выделения ДНК [129].

Разработан ряд методов иммунохимического анализа таких, как адсорбция на анионообменных или катионообменных смолах-амберлитах [248, 177], позволяющих путем фракционирования отделить сорбируемые примеси от риккетсий.

Особый интерес вызывает использование для очистки риккетсий протеолитических ферментов, в частности трипсина [247, 240, 48], который в данных условиях не гидролизует белки целых живых риккетсиальных клеток.

Разрушая белки среды культивирования трипсином, исследователи получали корпускулярные антигены достаточной, для поставленной задачи степени очистки.

Наиболее широкое применение получили такие химические методы, как обработка риккетсий 0,5% фенолом в течение 48 часов, осаждение инфекционного агента из среды культивирования ацетатным буфером при рН 4,5 [55]. Были также апробированы «щадящие» методы химической обработки с применением слабых кислот, в частности угольной кислоты [99]. Было установлено, что пропускание через риккетсиозную смесь тока углекислого газа, получаемого в аппарате Кипа, уже в течение нескольких минут вызывает значительное освобождение антигена от белка и тканевых частиц, не изменяет при этом концентрации риккетсий, а также не сопровождается значительными сдвигами кислотности антигенов. Авторами констатировано, что получение гомогенных антигенных препаратов для РМА, значительно освобожденных от белка и тканевых примесей происходит как при обработке взвесей без консерванта, так и с консервантом (формалин, мертиолят).

Однако, несмотря на высокий выход и однородность получаемых антигенов, перечисленными методами может быть достигнута лишь относительная очистка исходного материала. Ни один из описанных в литературе методов, примененных самостоятельно, не позволяет одновременно провести полное освобождение C.burnetii от тканей хозяина и обеспечить высокий выход очищенного корпускулярного антигена.

Наилучшая степень очистки риккетсий достигалась при комбинации нескольких методов в определенной последовательности.

Модифицированная технология получения корпускулярных антигенов была предложена Голиневич Е.М. в 1952 году [18]. Технология предусматривала применение консервантов, препятствующих деструкции риккетсиальной клетки, очистку риккетсий методом дифференциального

центрифугирования в сочетании с двукратной эфирной обработкой и последующую стабилизацию очищенного препарата методом лиофильного высушивания в 5% растворе сахарозы. При этом для изготовления корпускулярного антигена С.burnetii II фазы (особенно авирулентного штамма «М-44») с целью повышения выхода препарата автору пришлось видоизменить методику приготовления антигена путем сокращения процесса очистки коксиеллезных суспензий. Это связано с тем, что штаммы II фазы характеризуются рядом особенностей физических свойств и, в частности, склонностью к спонтанной агглютинации, что приводит при эфирной обработке суспензий к концентрации агглютинатов С. burnetii в тканевом слое и, следовательно, к большим потерям при изготовлении антигена [37].

Очищенные по модифицированной методике антигены I и II фазы развития С.burnetii использовали в РСК для выявления комплементфиксирующих антител в сыворотках поздней реконвалесценции и в реакции агглютинации для ранней диагностики заболевания [43, 69, 103]. Однако антигены II фазовой вариации не получили широкого применения в РА из-за склонности к спонтанной агглютинации, приводящей к ложноположительным результатам при проведении скрининга сывороток.

Оригинальная работа чехословацких ученых [219, 220] по искусственному получению антигена II фазовой вариации посредством химического разрушения липополисахаридного компонента клеточной стенки С.burnetii I фазы с помощью перйодата калия, позволила получить стабильный препарат, не склонный к спонтанной агглютинации, и использовать его в РА для детекции постинфекционных и поствакцинальных антител против лихорадки Ку в сыворотках людей [186]. В настоящее время, корпускулярный антиген II фазы полученный по оригинальной методике используется авторами в таких высокочувствительных и информативных тестах как ИФА и МФА [192].

Широкое распространение в серологической диагностики Ку-риккетсиоза приобрела реакция микроагглютинации с корпускулярными антигенами I фазы, маркированными различными красителями, в частности гематоксилином [165, 144]. Позднее на основе корпускулярных антигенов была разработана технология флуоресцирующих риккетсиозных диагностикумов [7, 74, 73, 4]. Технологический процесс их приготовления включал дополнительную очистку корпускулярного коммерческого антигена и последующую маркировку флуоресцирующим красителем. При этом оптимальные результаты очистки антигена от содержащихся в нем крупных тканевых частиц, обеспечивающие не только минимальные потери, но и возможность удаления основной массы тканевого балластного материала, были достигнуты при обработке взвеси корпускулярного антигена центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин [75].

Незначительный выход корпускулярного антигена и его высокая стоимость стимулировали поиски получения простого в изготовлении высокоактивного растворимого антигена C.burnetii.

По данным ряда авторов N.H.Topping и C.C.Shepard [221] метод эфирной экстракции, применяемый для получения растворимых антигенов из риккетсий [37], оказался практически не эффективным в отношении возбудителя Ку-лихорадки в силу его устойчивости к действию эфира. Незначительный выход растворимой фракции антигена Бернета I фазы удалось получить посредством солюбилизации коксиеллезной взвеси органическими растворителями, такими, как диметилсульфоксид и диметилацетамид [207]. Полученная растворимая фракция по иммуногенным свойствам оказалась незначительно слабее корпускулярного антигена, а также менее реактогенна.

Более широкое применение получил метод экстракции растворимого компонента коксиеллезной взвеси I фазы посредством обработки трихлоруксусной кислотой [150, 140, 148, 149]. Отечественными авторами

[57,59] данный метод был модифицирован и включал несколько стадий: очистку коксиеллезной взвеси дифференциальным центрифугированием, эфирной обработкой с последующим экстрагированием очищенных С. burnetii трихлоруксусной кислотой. Полученный растворимый антиген подвергали диализу против дистиллированной воды, а осадок подвергали повторной обработке ТХУ с удлинением экспозиции до 16 часов. Данная методика позволила значительно повысить выход растворимой фракции. Кроме того, в опытах на животных была доказана равнозначность иммуногенных свойств растворимого компонента и корпускулярного антигена С.burnetii I фазы, что позволило рекомендовать его в качестве основы для химической вакцины [60, 103, 170]. Следует отметить и значительную активность растворимого антигена С.burnetii. По данным авторов [94], общее количество растворимого антигена (с учетом удельной активности в РСК и объема) до 8 раз превышает общее содержание антигена в препаратах, очищенных С. burnetii. В РСК со стороны корпускулярного антигена участвуют только те антигенные группировки, которые расположены на поверхности микробной клетки. При обработке С. burnetii ТХУ поверхность антигена, реагирующая в РСК, увеличивается, в результате чего титр антигена (при сохранении исходного объема) значительно возрастает. Опыты по применению антигена, экстрагированного ТХУ в иммуноферментном анализе [188, 26] показали, что растворимый антиген позволяет регистрировать более высокие титры антител в гомологичных сыворотках по сравнению с корпускулярным антигеном I фазы.

Дальнейшее изучение ТХУ-фракции С.burnetii I фазы [58] методом иммунохимического анализа позволило констатировать неоднородность состава, различия в электрофоретической подвижности белковых фракций, выявленных в зональном электрофорезе, наличие значительного количества посторонних белков среды культивирования. Для их элиминации использовали осаждение сернокислым аммонием, сернокислым натрием,

соляной кислотой с добавлением гексаметафосфата натрия, депротенизацию смесью хлороформа и метанола, осаждение этанолом [93, 102, 20, 149,] фракционирование на ДЕАЕ-целлюлозе [153, 70], применение гельхроматографии [228]. Использование этих методов позволяло исследователям повысить удельную активность очищенных препаратов до 28 раз по сравнению с исходным растворимым антигеном, что свидетельствовало о значительной очистке препаратов от балластных компонентов. Однако рекомендуемые методы не нашли широкого применения в виду многоэтапности процесса очистки, низкого выхода антигена и необходимости применения дорогостоящих реактивов.

Используя для разрушения C.burnetii дозированное воздействие ультразвука, исследователям [143, 125, 55, 250] удалось получить специфическую антигенную фракцию, не связанную с корпускулами C.burnetii, которая обладала иммуногенными свойствами. Выход растворимого антигена при соответствующих условиях достигал 25-50% общего количества антигена в суспензии. При таком разрушении C.burnetii I фазы освобождается антигенная фракция, которая адсорбируется на нормальных бараньих эритроцитах. Небольшое количество этой фракции было обнаружено и в обработаных ультразвуком C.burnetii II фазовой вариации с помощью реакции торможения гемагглютинации [67]. Однако данный способ не получил широкого применения.

Таким образом, рядом авторов была продемонстрирована возможность изоляции растворимого антигена C.burnetii I фазы с применением методов химической экстракции с помощью ТХУ, органических растворителей или обработки ультразвуком. Выделенный ими антиген, являющийся полисахаридно-белковым комплексом, обладал иммуногенной активностью, равнозначной корпускулярному антигену I фазы C.burnetii, и был лишен токсических и аллергизирующих свойств, что позволило авторам рекомендовать его в качестве растворимого компонента вакцины [156, 59, 60].

Неудовлетворительные результаты по выходу растворимого антигена стимулировали усилия исследователей на поиски более эффективного способа его экстракции, в частности, с помощью ионных детергентов. При сопоставлении лизирующего действия двух детергентов - додецилсульфата натрия (SDS) и дезоксихолата натрия [16], наблюдался наибольший выход солюбилизата при использовании 2% SDS при температуре 65°С. С этой целью коксиеллезные взвеси из инфицированных желточных оболочек куриных эмбрионов и селезенок белых мышей подвергали дифференциальному центрифугированию, адсорбции на целите, с последующей солюбилизацией очищенного корпускулярного антигена 2% раствором детергента (SDS), затем одну часть солюбилизата подвергали осаждению 96° этанолом, а другую - обработке 70% фенолом. Было установлено, что содержание белка в изолированной фракции «SDS-этанол» превышает концентрацию белка по отношению к растворимому антигену, экстрагированному с помощью ТХУ, в 4,3 и фракции «SDS-фенол» в 13,9 раза. Позднее M.Lukacova и J.Kazar [198] подтвердили, что применение комбинации детергента и фенола являются улучшенным методом изоляции ЛПС С. burnetii.

Менее эффективным оказалось использование другого детергента-Empigen ВВ [197]. Этот детергент не обеспечивает полного освобождения изолированного из внешней мембраны иммунодоминантного белка 29 кД от ЛПС, что позволило авторам сделать вывод о прочном связывании последнего с этим белком. Тем не менее выделенный детергентом комплекс ЛПС-белок при иммунизации лабораторных животных показал высокий иммуногенный и протективный эффект.

Значительное повышение выхода растворимой фракции С.burnetii, экстрагируемой другим детергентом - тритоном Х-100, явилось основанием для включения этого метода в процесс получения диагностических

препаратов [52]. Однако использование этих препаратов на сегодняшний день не вышло за рамки лабораторного изучения их значимости.

Для получения высокоочищенных растворимых антигенов в условиях производства [203] рекомендуют метод горячей обработки водной суспензии дереватов тканей C.burnetii в щелочных условиях. Водные элюаты (поверхностный антиген, частично разрушенный) подвергали дальнейшей обработке органическим растворителем. Экстракция была наиболее эффективной при 50°С и выше. Концентрированная растворимая фракция антигена представляла собой высокоочищенный препарат. Авторы предлагали использовать антигенный препарат в иммуноферментном анализе для диагностики лихорадки Ку.

Углубленное изучение некоторых аспектов применения растворимого антигена показало, что выделенная фракция C.burnetii I фазы не уступает корпускулярному антигену по иммуногенности и обеспечивает устойчивость к заражению вирулентной культурой [60, 94, 207], с другой стороны в литературе приводятся факты высокой реактогенности химической вакцины [103, 151]. При разработке инактивированных вакцин против коксиеллезной инфекции особое внимание исследователей было обращено на возможность детоксикации C.burnetii за счет экстракции фосфолипида (ФЛ) в результате обработки смесью хлороформа и метанола [96, 123]. Если интактные C.burnetii закономерно вызывали некрозы в печени через 7-14 сутки после введения, то после удаления ФЛ из клеточной мембраны C.burnetii характерны сниженные иммуноморфологические реакции, что позволяет рекомендовать данный метод для приготовления антигена в качестве основы для вакцины.

Получение риккетсиальных, в том числе и коксиеллезных антигенов, не ограничилось рамками выделения их в виде корпускулярных и растворимых форм. Еще в 1962 году R.Brezina. и J.Urvolgyi [150] отметили, что обработка фенолом коксиеллезных взвесей приводит растворимый антиген к конверсии

в гаптен, который хорошо регистрируется в РСК с соответствующей антисывороткой и обнаруживает иммунизирующие свойства в опытах на животных [155]. Количество антигенного материала, экстрагированного фенолом, было в 2-4 раза выше, чем количество антигена, экстрагированного ТХУ. Изолированные специфические компоненты коксиеллезной клетки -полисахаридные антигены (гаптены) С. burnetii I фазы с успехом использовали для приготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов, предназначенных для выявления коксиеллезных антител в РИГА [154].

Методика выделения и очистки полисахаридного антигена для приготовления коксиеллезного эритроцитарного диагностикума сводится к следующему: из гомогената селезенок белых мышей, инфицированных суспензией C.burnetii, осаждают С.burnetii, которые обрабатывают диэтиловым эфиром с целью выделения очищенных C.burnetii. Полученную суспензию C.burnetii промывают этанолом и эфиром, суспендируют в дистиллированной воде и смешивают с равным объемом 90% фенола, диализуют. Сенсибилизацию акролеинизированных бараньих эритроцитов ЛПС проводят в концентрации 1 мг/мл. Антиген C.burnetii, приготовленный по данному методу, пригоден лишь для сенсибилизации как нативных, так и акролеинизированных эритроцитов [122], т;е. обладает узкой направленностью.

Более широким спектром применения обладают ЛПС, выделенные из C.burnetii I фазы методом сочетающим термическую и фенольную обработку [235, 224, 237, 245]. Применение данного метода позволяет изолировать антиген наиболее полноценный по химическому составу [235, 223]. Исследования химической структуры выделенного антигена различных родов С. burnetii при электрофорезе в ПААГе с применением SDS показали наличие ЛПС и основных полипептидов оболочки коксиеллезной клетки от 10 до 17 Юа с незначительными примесями белков в зоне 29kDa. Рядом авторов [235, 224, 237] доказано, что значительных различий по специфичности между

липополисахаридами разноименных родов C.burnetii нет: выделенные липополисахаридные комплексы не реагировали с сыворотками гетерологичных видов риккетсий. Методом иммуноблотинга с использованием моноклональных антител выявлен общий эпитоп (10-14kDa) для ЛПС шести штаммов C.burnetii.

Идентификация по химической структуре ЛПС показала, что клетки I фазы содержат большее количество липополисахаридов, чем клетки II фазовой вариации [234, 233, 236]. ЛПС II фазы имели относительно простой состав в нем, помимо глюкозамина и соединения родственного 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоте (КДО), в больших количествах присутствовали лишь альдозы. ЛПС I фазы, помимо этих Сахаров, содержали еще 8-9 различных компонентов [241]. Сопоставляя ЛПС I и II фазы C.burnetii по химическому составу при электрофорезе в ПААГе [138] было показано, что профиль ЛПС I фазовой вариации многокомпонентный и состоял из 6 полос, в то время как ЛПС II фазы был представлен одной полосой, что свидетельствует об относительной однородности химического состава. Вероятно, поиск коксиеллезных препаратов, обладающих полноценной антигенной структурой, следует проводить, опираясь на данные о функциональных свойствах антигенных субъединиц С. burnetii.

Сравнению диагностической значимости ЛПС и белковых антигенов посвящена работа Williams J.S., Hoover Т.А., Waag D.M. et al. [245]. Авторы предполагают, что протективный эффект выделенных ЛПС I и II фазовой вариации возможен частично из-за наличия в выделенной фракции небольшого количества пептидов. Препаратом сравнения для ЛПС служила изолированная фракция белкового антигена с молекулярной массой 62 kDa, кодируемого Htp В геном C.burnetii. Белковая фракция обладала высокой иммуногенной активностью. Интересно, что анализируемый антиген не обнаружен на поверхности коксиеллезных клеток I стадии, в то же время был широко представлен на поверхности клеток II стадии. Серологические

исследования показали, что данный антиген активен с сыворотками больных в период реконвалесценции и хронизации процесса и не выявляет заболевание в острой фазе.

В то же время ряд авторов утверждают, что основополагающий белок поверхности клеток C.burnetii I фазы представлен полипептидом с молекулярной массой 29,5 kDa. Как показали эксперименты, белок прочно связан с пептидогликановым слоем клеточной стенки. Следует отметить, что иммунизация лабораторных животных белком 29,5 kDa индуцировала образование антител как против ЛПС I фазы, так и против нативной клеточной взвеси I фазы, а также способствовала формированию устойчивого иммунитета, защите животных при введении вирулентной культуры.

Несколько иные данные получили Banerjee-Bhatnagar Bolt и J.C. Williams [144]. Они указывают, что основные олигомеры внешней мембраны массой 2xl04kDa включают полипептиды на 29,5 kDa и 31 kDa, которые не только являются доминантными антигенами в индукции определенных защитных и иммунных реакций, но и несут функцию барьера проницаемости через цитоплазматическую мембрану, способствуя активному транспорту глюкозы. Данное предположение было доказано экспериментальными исследованиями: в результате применения специфических моноклональных антител были заблокированы активные центры, эпитопы белков и полностью прекращена функциональная деятельность поринов.

Таким образом, использование методов молекулярной биологии позволило исследователям раскрыть функциональную значимость основных полипептидов мембраны в клетке C.burnetii [176] и подчеркнуть важную роль белков внешней оболочки в иммунитете против коксиеллезной инфекции.

Среди методов современной диагностики коксиеллезной инфекции широкое распространение получили исследования с помощью моноклональных антител [249, 211, 232]. Данный метод обладает высокой специфичностью, на уровне молекулярной генетики позволяет обнаруживать

эпитопы белков внешней мембраны как I, так и II фазы С.burnetii, но в то же время не приемлем для дифференциации хронической и острой стадии заболевания [222].

С точки зрения детекции C.burnetii и их фазовой дифференциации интересны методы современной генодиагностики, в частности широкое распространение в диагностике инфекционных болезней получила полимеразная цепная реакция (ПЦР) [227, 243, 244, 142, 169, 30]. Применение данного метода облегчает работу исследователей с пробами инфекционного материала, содержащими исчезающе малые количества возбудителя, не требует дорогостоящих и сложных, многоэтапных способов очистки [30]. Данный комплекс методов позволяет обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Клонирование ДНК инфекционного агента позволяет за несколько часов из 1 копии получать 107-

о

10 копий, что значительно облегчает дальнейшие исследования. В то же время достижения молекулярной генетики могут быть использованы лишь в хорошо оснащенных, современных иммунологических центрах, так как высокая стоимость ингредиентов реакции и отсутствие праймеров не позволяет вести массовую диагностику коксиеллезной инфекции.

Несмотря на значительное количество исследований по разработке методов выделения, очистки C.burnetii и получению корпускулярных антигенов, а также их растворимых фракций, производственный выпуск диагностических препаратов для распознавания коксиеллеза в нашей стране отсутствует. Как уже отмечалось, после распада СССР прекратились поставки в Россию единственного диагностического препарата - коксиеллезного диагностикума для РСК, производящегося в Ташкентском НИИВС.

Таким образом, изложенный обзор свидетельствуе, что наличие спорадических заболеваний коксиеллезом, вызывающих эпидемические вспышки в антропургических очагах этой природно-очаговой инфенкции,

особенностью которой является высокая контагиозность возбудителя [180], отсутствие средств диагностики требует неотложного решения проблемы по созданию научно-обоснованного производства диагностических препаратов. Исходя из особенностей возбудителя, индуцирующего при инфицировании людей, образование антител ко II фазовой вариации при конструировании препаратов для ранней диагностики коксиеллеза целесообразно использовать С.burnetii II фазы. Для этих целей могут быть использованы C.burnetii штамма «Грита» II фазовой вариации (прошедшие более 11 пассажей на КЭ), или искусственно полученные C.burnetii II фазы из патогенного штамма I фазы путем обработки его перйодатом калия [219, 220], или C.burnetii II фазы вакцинного штамма «М-44» [83]. Последний и был нами избран для приготовления диагностического препарата, поскольку в НПО «Биомед» осуществляется выпуск вакцины для профилактики лихорадки Ку. Получение диагностического и профилактического препаратов из одного сырья позволило бы повысить экономический эффект производства.

Отличительной особенностью C.burnetii II фазы от I фазовой вариации является четко выраженные физико-химические различия, что проявляется, в частности, седиментацией их в градиенте плотности, количественном выходе в водную фазу при обработке взвеси C.burnetii эфиром, в формировании различных по характеру осадков при центрифугировании, неодинаковой авидности к красителям, тенденции C.burnetii II фазы (особенно штамма «М-44») к спонтанной агглютинации [98].

С учетом этих особенностей, а также последних достижений по изучению антигенной структуры C.burnetii представлялось возможным решение данного вопроса при использовании щадящих методов очистки, исключающих воздействие органических реагентов на микроорганизм. К методу выделения C.burnetii были предъявлены следующие требования:

-щадящие условия выделения, позволяющие максимально сохранить антигенную структуру возбудителя;

-выделение С.burnetii, не содержащих тканевых и растворимых компонентов среды культивирования;

-сохранение способности выявлять специфические антитела в различных серологических реакциях;

-простота выделения и возможность обработки значительного по объему материала (технологичность).

При разработке технологии производста антигена С.burnetii было решено использовать для изоляции бактерий из инфицированных взвесей сочетание физических методов: дифференциальное центрифугирование и микрофильтрацию.

Экспериментальному обоснованию поставленных задач приготовления корпускулярного антигена С. burnetii, обеспечивающего выявление антител в различных серологических тестах и оптимизацию технологии в условиях производства, посвящены следующие разделы работы.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Соснина, Оксана Юрьевна

выводы

1. Разработан безэфирный метод получения корпускулярного антигена С.burnetii II фазы, штамма «М-44», обеспечивающий приготовление многопрофильного препарата, пригодного для основных серологических тестов: РСК и нМФА. Доказана гомогенность и высокая степень очистки антигена от компонентов среды культивирования методом электронной микроскопии и иммунохимического анализа.

2. Подтвержден значительный спектр диагностических возможностей разработанного препарата, позволяющего проводить индикацию специ фических антител в сыворотках экспериментальных животных к разным штаммам С.burnetii I и II фазы: «Грита», «ЖМ-JIyra», «М-44» в титрах сопоставимых с референс-препаратом.

3. Разработана оригинальная схема иммунизации антигеном С.burnetii II фазы животных с целью приготовления диагностических сывороток. Получены высокоактивные и специфические сыворотки для комплектации препарата.

4. Обоснована принципиальная возможность создания иммунофлуориметрической тест-системы с использованием полученного антигена и сконструированных лантанидных конъюгатов на основе Fab-фрагментов иммуноглобулинов против глобулярных белков крови человека для тестирования сывороток больных и вакцинированных людей.

5. Проведено масштабирование разработанного метода в условиях экспериментального производства. Достигнута экологическая безопасность технологии использованием вакцинного штамма С.burnetii, предварительной, полной и контролируемой инактивацией культур, исключением эфирной обработки препарата. Технологическая схема изготовления препарата, включающая дифференциальное центрифугирование, ферментолиз трипсином, мембранную микрофильтрацию, обеспечивает щадящие условия выделения и очистки антигена и увеличивает удельную активность препарата в 4-8 раз по сравнению с регламентированной технологией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Актуальность проблемы разработки специфических иммунопрепаратов определяется высокой значимостью лабораторных методов в диагностике коксиеллезной инфекции. Использование для конструирования препаратов С.burnetii II фазы штамма «М-44» было обусловлено особенностями течения коксиеллезной инфекции у людей, а именно, образованием на начальных стадиях заболевания антител к бактериальным клеткам II фазы. Исходя из этого, для детекции специфических антител был необходим диагностический препарат, приготовленный из С.burnetii II фазы. Кроме того, немаловажную роль в выборе штамма играло и повышение экономической эффективности производства. В связи с тем, что на предприятии производится выпуск вакцины на основе С. burnetii II фазы штамма «М-44», приготовление из одного сырья профилактических и диагностических препаратов способствовало бы увеличению рентабельности производства.

В настоящее время препараты, предназначенные для проведения эпиднадзора за этой повсеместно распространенной инфекцией, изучения иммунного статуса в очагах коксиеллеза, выявлениия больных и контроля за эффективностью вакцинопрофилактики, отсутствуют.

Поэтому целью наших исследований явилась разработка и получение препарата для распознавания коксиеллеза, оценки его диагностических возможностей и масштабирование его в условиях производства с последующим выпуском для практического здравоохранения.

В научном аспекте предполагалось разработать методику изоляции антигена С.burnetii II фазы штамма «М-44», обеспечивающего получение высокоочищенного препарата, сохранившего антигенные свойства нативного возбудителя. Антиген с такими свойствами мог бы быть использован в нескольких серологических реакциях: РСК и нМФА для определения специфических антител к разным штаммам С.burnetii, в том числе и природным.

Достоинства РСК и нМФА неоспоримы, практика их применения показала, что результаты серологического анализа во многом зависят от качества специфических антигенов [184, 132, 127, 42, 44, 106, 131, 119, 108, 77, 22]. Следовательно, используемые в реакциях диагностикумы должны быть полноценными в антигенном отношении, обеспечивать выявление антител к разным штаммам С.burnetii и не содержать примесей среды культивирования.

Кроме того, получение антигена высокой степени очистки является обязательным условием для детекции антител в таком чувствительном тесте -нИФМА.

С этих позиций представляется целесообразным обобщить[полученные в работе результаты и подвести основные итоги наших исследований.

При выборе подходов к разработке методики мы исходили из данных литературы научно-теоретического и прикладного характера. Последние достижения в области молекулярной биологии свидетельствуют о том, что основными антигенными структурами С.burnetii I и II фазовой вариации, ответственными за индукцию антител в организме человека и животного являются белки внешней мембраны с молекулярной массой 62kDa, 31kDa, 27kDa-29,5kDa и 12,5kDa [197, 201, 196, 245, 144, 176]. Поэтому, учитывая выраженную антигенную и иммуногенную значимость этих белков, представлялось целесообразным зафиксировать их на поверхности коксиеллезной клетки в состоянии близком к нативному возбудителю.

В исследованиях по фиксации поверхностного слоя клеток С. burnetii мы использовали основные принципы метода, предложенного В.А.Яблонской и сотр. [134] для получения высокоочищенного антигена R.prowazekii для МФА. Основу этого оригинального метода составляло использование 0,5-1,0 М раствора хлорида калия и фиксация формальдегидом клеток возбудителя, находящегося в желточных оболочках куриных эмбрионов до стадии их гомогенизации.

При изучении возможности использования этого метода для инактивации овокультуры С. burnetii нами были уточнены такие параметры, как количество инактивирующего раствора на определенный вес биомассы, продолжительность воздействия и влияние инактиватора на специфическую активность С. burnetii.

Контроль каждого этапа очистки проводили по специфической активности (в РСК, нМФА), степени очистки (в нМФА), выходу антигена по удельной активности.

В этих исследованиях нами было показано, что оптимальными условиями для обезвреживания биомассы является проведение инактивации в 0,5% формалинизированном растворе IM KCl из расчета 10 мл на 1 г желточных оболочек КЭ при продолжительности воздействия - 15 дней. Установлено, что такая продолжительная инактивация в гипертоническом растворе 1МКС1 не изменяет специфическую активность С.burnetii. Последние данные согласуются с результатами исследований D. Raoult и J.C. Laurent [211], показавших, что воздействие формальдегида не влияет на реактогенную способность поверхностных антигенных структур клеток С.burnetii. Обезвреживание материала, инфицированного С.burnetii, до стадии гомогенизации обеспечивало безопасность работы на специализированном производстве.

При выполнении исследований по гомогенизации желточных оболочек, содержащих клетки С. burnetii, были изменены параметры дезинтеграции инактивированной коксиеллезной взвеси. Установлено, что наибольший выход фиксированных клеток С. burnetii по сравнению с применяемой на предприятии дезинтеграцией тканей с помощью стеклянных бус наблюдается при разрушении тканей и клеток желточных оболочек куриных эмбрионов с помощью размельчителя тканей Оптимальный режим гомогенизации соответствовал 5000 об/мин 5 мин при температуре 20-22° С.

Выбор методики в наших исследованиях определялся следующими требованиями: получение антигена максимально очищенного от среды культивирования и обладающего активностью в РСК и нМФА;

- безопасностью получения препарата;

- простотой изготовления, обеспечивающей высокий выход препарата (технологичностью и экономической эффективностью)^

Из известных методов выделения антигенов С.burnetii нами были апробированы три, позволяющие получать антигены в препаративных количествах: регламентированная технология в модификации М.Ю.Морозовой [83], способ получения антигена R.prowazekii по В.А.Яблонской и сотр. [134] и метод дифференциального центрифугирования по R.Ormsbee [206]. В ходе проведенных исследований ни один из этих методов не соответствовал основным требованиям, предъявляемым для приготовления антигена С.burnetii, пригодного в РСК и нМФА. В частности, видоизмененная М.Ю.Морозовой [83] регламентированная технология не обеспечивала полного удаления из антигенов тканевых структур, что затрудняло интерпретацию результатов в нМФА. Получение высокоочищенного антигена С.burnetii по способу В.А.Яблонской и сотр. [134] обеспечивало весьма низкий выход антигена. Метод дифференциального центрифугирования в ряде опытов не давал удовлетворительных результатов, и только увеличение циклов дифференциального центрифугирования обеспечивало надлежащую очистку антигена, но это вело к дополнительным энергозатратам и потерям антигена [129].

При разработке методики, учитывая результаты проведенных исследований, а также тенденцию С.burnetii II фазы к спонтанной агглютинации и образованию конгломератов при обработке этиловым эфиром, нами был исключен этот органический растворитель и использован метод дифференциального центрифугирования. Исследование полученных осадков в нМФА показало наличие клеток С. burnetii в «заформалинизированных» тканях. Для высвобождения С.burnetii II фазы штамма «М-44» было необходимо разрушить тканевые структуры. Это явилось основанием для применения протеолиза с целью разрушения тканевых структур и высвобождения С. burnetii.

Основанием к использованию ферментов послужили результаты исследований ряда авторов о резистентности С. burnetii к воздействию трипсина [144, 201, 139] и его разрушающем действии на белки и ткани среды культивирования [247, 51, 129, 240, 204, 78, 48]. Следует подчеркнуть, что в этих исследованиях авторы использовали живую культуру С.burnetii высоковирулентных штаммов «Грита» и «Nine Mile».

Отличительной особенностью настоящих исследований является то, что ферментативному гидролизу подвергали инактивированные и заформалинизированные взвеси С.burnetii II фазы штамма «М-44». Поэтому для полной дезинтеграции «заформалинизированных» тканевых структур необходимо было выбрать эффективный фермент и определить оптимальные условия его воздействия. Нами были испытаны такие протеолитические ферменты, как пепсин, папаин и трипсин.

В модельных опытах была проведена оценка действия разных ферментов при различных условиях и выбран фермент - трипсин. Именно этот фермент расщеплял тканевые структуры и обеспечивал полную изоляцию клеток С. burnetii из ткани, при этом не оказывал воздействия на антиген, сохраняя его специфические свойства на уровне исходного антигена.

Следует отметить, что в процессе протеолиза образовавшиеся крупно-, средне- и мелкодисперсные частицы «загрязняли» препарат. Применение низкоскоростного центрифугирования обеспечивало удаление лишь крупных частиц. Это обстоятельство стимулировало поиски более эффективных способов очистки.

Для удаления средне- и мелкодисперсного побочного материала нами был использован щадящий метод микрофильтрации, применяемый для очистки риккетсий [91]. Следует подчеркнуть, что применительно к очистке ферментированной взвеси клеток C.burnetii этот метод не был использован. Предстояло определить оптимальные параметры проведения мембранной фильтрации коксиеллезной взвеси, обеспечивающие очистку изолированных C.burnetii от растворимых белков и примесей среды культивирования.

В процессе изучения пригодности использования микрофильтрации для выделения полноценных антигенов C.burnetii нами были оценены микрофильтрационные мембраны «Millipore», «Synpore», «Владипор». В модельных опытах с использованием флуоресцирующих C.burnetii была определена мембрана, обеспечивающая прохождение в фильтрат максимального количества (88%) антигенного материала. Такой выход антигена обеспечивала мембрана типа «Владипор» с размерами пор 3,5 мкм.

В серии экспериментов были исследованы и определены оптимальные параметры фильтрации для ферментированной и неферментированной взвесей. При определении оптимальной концентрации неферментированной взвеси в диапазоне от 5% до 30% максимальное разделение смеси наблюдалось при концентрации 10%. С целью обеспечения фракционирования всего объема фильтрацию проводили под давлением 0,15 - 0,2 мПа. Замедление скорости потока, наблюдающееся при пропускании взвеси через мембрану, было обусловлено образованием концентрационного поляризующего слоя и вело к уменьшению количества клеток C.burnetii в фильтрат. Процесс фильтрации взвесей, обработанных папаином, также требовал применения градиента давления, величина которого колебалась от 0,05 до 0,1 мПа.

Иные результаты получены при проведении микрофильтрации взвесей ферментированных пепсином и трипсином. В ходе исследований нами были выявлены количественные и качественные изменения коксиеллезной взвеси, подвергнутой протеолитическому расщеплению этими ферментами.

Установлено, что пепсинизированные и трипсинизированные коксиеллезные взвеси свободно проходили через мембраны типа «Владипор» с размером пор 3,5 мкм. Это позволило значительно упростить процесс фильтрации, так как из технологического процесса исключалось оборудование для создания градиента давления. Такое свободное прохождение через мембраны ферментированных трипсином и пепсином коксиеллезных смесей предположительно связано со снижением их вязкости, что позволило увеличить концентрацию фильтруемой суспензии до 20% и следовательно уменьшить объем взвеси в 2 раза. Микрофильтрация такой взвеси через отечественные полимерные дисковые мембраны «Владипор» марки МФАС с размером пор 3,5 мкм в микрофильтрационной ячейке с механическим перемешиванием, при отработанных нами оптимальных параметрах, обеспечивала получение клеток С.burnetii, максимально очищенных от ткани желточных мешков куриных эмбрионов.

Определяя выход С. burnetii, изолированных с помощью разных ферментов, мы убедились, что максимальное количество антигенного материала при использовании пепсина значительно возрастает - до 90%. Однако, применение данного гидролизующего агента, наряду с уменьшением тканевых структур, существенно снижало и специфическую активность С. burnetii в нМФА.

Обработка коксиеллезной взвеси папаином, напротив, не обеспечивала полного разрушения тканей и клеток среды культивирования, но позволяла сохранять поверхностные антигенные структуры клеточной стенки С. burnetii, что было зарегистрировано при просмотре в люминесцентном микроскопе препаратов С. burnetii, окрашенных флуоресцирующими Fab-фрагментами. Однако выход антигена составлял лишь 62,3%.

Использование для гидролитического расщепления тканевого дебриса трипсина не только позволило увеличить выход С. burnetii до 75%, но и сохранить их специфические свойства на исходном уровне, о чем свидетельствовали результаты изучения полученного антигена в РСК и нМФА. Полученные данные подтверждаются результатами исследований

B.А.Яблонской и сотр. [135], применявших трипсин для очистки риккетсиальных взвесей.

На основании проведенных сравнительных исследований установлено, что наилучшие результаты были получены при использовании трипсина, применительно к которому были определены оптимальные параметры ферментолиза. К ним относятся: концентрация трипсина 1%; концентрация коксиеллезной взвеси, взятой для протеолиза - 20%; температура инкубирования (37+1 )°С; продолжительность протеолиза - 25 мин.

В результате исследований на основе физических и иммунохимических методов нами был разработан способ, включающий изоляцию клеток С. burnetii из среды культивирования с помощью ферментативного гидролиза с последующей очисткой методом дифференциального центрифугирования в сочетании с мембранной микрофильтрацией.

Следующим этапом работы явились исследования по стандартизации коксиеллезной суспензии. Исследования, проведенные в этом направлении, показали, что стандартизацию очищенного антигена С.burnetii применительно к условиям производства следует проводить, исходя из двух критериев серологической активности препарата в РСК со стандартной сывороткой к

C. burnetii и измерения концентрации клеток С.burnetii, определяемой по оптическому стандарту мутности ГИСК на 10 единиц. К числу важных критериев, определяющих качество диагностических препаратов, относится стабильность их свойств в условиях длительного хранения.

В ходе исследований по стабилизации препарата было установлено, что лиофильное высушивание с 10%-ной сахарозой в качестве наполнителя позволяет сохранять специфические свойства диагностикума при температуре (4±1)°С в течение 5 лет (срок наблюдения).

Таким образом, была разработана оригинальная безэфирная технология получения корпускулярного антигена С.burnetii, включающая дифференциальное центрифугирование, ферментативный гидролиз, мембранную микрофильтрацию, стандартизацию полученного препарата и стабилизацию методом лиофильного высушивания. По данной технологии получено 22 лабораторных и 3 экспериментально-производственных серий корпускулярного антигена С. burnetii штамма «М-44»

При сравнении препаратов, полученных по разным методам, установлено, что предлагаемая технология обеспечивала получение антигена С. burnetii с более высокой удельной активностью 29+5,4 АЕ/мг белка.

Главным разделом работы явились исследования, характеризующие специфические свойства экспериментальных антигенов С. burnetii и их иммуногенную активность.

Развернутая характеристика специфической активности антигенов была получена в результате испытания их в различных серологических реакциях: РСК и МФА. В этих исследованиях было установлено, что экспериментальные антигены обладали специфической активностью, выявляемой в изучаемых серологических тестах. В опытах по сравнению референс-препарата с разработанными антигенами зафиксирована большая активность последних. Так, в РСК средняя геометрическая величина титров экспериментальных диагностикумов с сыворотками к С.burnetii составляла 1:32, при исследовании референс-антигена С. burnetii для РСК - 1:26. В опытах с сыворотками к разным штаммам С.burnetii была продемонстирована способность антигенов взаимодействовать с сыворотками к природноочаговым и к культивируемым штаммам. При оценке специфической активности экспериментальных антигенов с сыворотками к штамму «ЖМ-JIyra» и штамму «Грита» в РСК среднее геометрическое значение титра антигенов составляла 1:12 и 1:28 соответственно, в то время как с коммерческими диагностикумами эти величины были 1:38,1 и 1:26,5 соответственно.

Весьма важным для характеристики свойств препаратов является их диагностическая ценность в плане выявления специфических антител в РСК, нМФА. При титровании сывороток к С.burnetii штаммов: «ЖМ-JIyra», «Грита» и «М-44» в РСК с экспериментальным корпускулярным антигеном и референс-препаратом средняя геометрическая величина титров специфических антител, определяемых в иммунных сыворотках к С.burnetii была сопоставима. Результаты этих наблюдений свидетельствуют о возможности регистрации специфических антител к разным штаммам при применении разработанных антигенов. При оценке испытуемых антигенов в РСК и непрямом варианте МФА с сыворотками здоровых людей (доноров), интактных животных, с сыворотками экспериментальных животных к R.prowazekii, R.sibirica,

B. quintana, а также к компонентам желточной оболочки куриного эмбриона были получены негативные результаты. Эти данные согласуются с результатами многочисленных экспериментальных, клинических и эпидемиологических исследований большинства авторов, как отечественных [71], так и зарубежных [202, 194, 167], свидетельствующих об обособленности

C.burnetii и отсутствии у них перекрестно-реагирующих антител с риккетсиями других групп.

Таким образом, полученный корпускулярный антиген обладал достаточной серологической активностью и специфичностью. Для характеристики иммуногенной активности приготовленный антиген использовали для иммунизации морских свинок по оригинальной схеме.

Полученные в результате иммунизации сыворотки морских свинок имели титры комплементфиксирующих антител 1:640-1:1280, не реагировали в РСК с желточным антигеном и риккетсиями гетерологичного вида. При исследовании в РСК и нМФА сывороток морских свинок, кроликов, инфицированных С. burnetii, а также сывороток больных коксиеллезом было показано, что применение антигена С.burnetii позволяет достоверно регистрировать специфические антитела в динамике иммуногенеза в титре от

1:20 до 1:5120. Эти данные позволили рекомендовать антиген, полученный разработанным нами способом, для использования в нескольких серологических реакциях: РСК и МФА. В результате проведенных исследований было выявлено, что во всех серологических реакциях единый антиген С.burnetii обладал более выраженной антигенной активностью в сравнении с препаратами, полученными по другим технологиям. Это позволило предположить, что экспериментальные антигены, очищенные по разработанному методу, обладают более полным набором антигенных детерминант, чем препараты, полученные в результате очистки с применением эфирной обработки.

С целью определения перспектив дальнейшего изучения и практического использования разработанного антигена С.burnetii были проведены исследования по применению его в новом высокочувствительном методе иммуноанализа. В специальной серии экспериментов изучена возможность использования единого антигена в ИФМА. Значительная работа методического характера была выполнена при разработке иммуноглобулиновых компонентов нИМФА - конъюгатов.

Для конструирования высокоэффективных конъюгатов использовали иммуноглобулины, не содержащие примесей посторонних белков. С этой целью были отработаны методические приемы приготовления иммуносорбента, позволяющие элиминировать нежелательные белковые примеси из иммуноглобулинов. Основу этого иммуносорбента составлял гель гидрокиси алюминия, а в качестве лиганда применяли иммуноглобулин против альбумина сыворотки крови лошади, зафиксированный вокруг матрицы с помощью глутаральдегида. Показано, что приготовленный иммуносорбент обеспечивал полную деконтаминацию иммуноглобулинов от побочных белков. Очищенные иммуноглобулины использовали для приготовления Fab-фрагментов, маркированных флуорохромом - хлоридом европия.

В серии опытов было показано, что разработанные антигены C.burnetii обладают достаточно высокой сорбционной способностью к твердофазному носителю, что дало возможность исследовать методом нИФМА сыворотки крови (экспериментальных животных) людей (доноров, больных коксиеллезной инфекцией, сыворотки крови работников специализированных производств, вакцинированных против лихорадки Ку). Параллельно сыворотки изучали в РСК и нМФА. При сопоставлении результатов исследований показано, что в нИФМА корпускулярные антигены, полученные по разработанной технологии, регистрируют специфические антитела в величинах, превышающих титры антител, определяемые в РСК в 25 раз, в нМФА -20 раз.

Таким образом, полученные результаты позволили определить перспективу дальнейшего использования единого корпускулярного антигена C.burnetii - нИФМА. Наиболее полно преимущества нИФМА были реализованы при использовании растворимых антигенов, полученных из единого корпускулярного антигена с помощью обработки неионным детергентом тритоном Х-100. Чувствительность метода повысилась в 100 раз по сравнению с РСК и в 50 раз в сравнении с нМФА. Возможность получения активного растворимого антигена из C.burnetii, штамма «М-44» позволила наметить перспективы их дальнейшего использования в качестве сенситинов для конструирования тест-систем для ИФА и ИФМА.

Совокупность представленных наблюдений определила возможность практического использования разработанного коксиеллезного диагностикума в качестве единого для различных методов серологического анализа: РСК, нМФА и нИФМА. Результаты исследований были реализованы в виде Экспериментально-производственного регламента, Временной Фармакопейной Статьи и Инструкции по применению на «Диагностикум коксиеллезный Бернета сухой для РСК и МФА». При непосредственном участии автора проведено освоение препарата в производстве НПО «Биомед».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Соснина, Оксана Юрьевна, 1999 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 .Александрова Л.В., Пантюхина А.Н., Коробов В.П., Юркова H.A. Изучение возможности получения очищенного корпускулярного антигена риккетсий Провачека//Теорет. и приклад, исследования в иммунологии: Тезисы докл.научно-практ. Конф. молодых ученых. - Пермь, 1990. - С.23-24.

2. Александрова Л.В., Пантюхина А.Н., Коробов В.П. Усовершенствование технологии получения риккетсиальных антигенов//Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. - Томск, 1991. -С.130-131.

3.Александрова Л.В. Усовершенствование технологии приготовления корпускулярного антигена риккетсий Провачека/Автореф. дис. канд. биол. наук. - Пермь, 1997. - 23 с.

4.Амосенкова Н.И., Николаева Т.А., Хавкин Т.Н. Получение и испытание флуоресцирующего корпускулярного антигена из риккетсий Провачека/Сб. научн.тр.ин-та эпид. и иммунобиол. им. Пастера.- Л., 1966. - №29. - С.206-211.

5. Артемов Н.С. Аппараты и установки для мембранных процессов//Учебно-методическое пособие. - М., 1994. - 239 с.

6.Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - М., 1962. - 177 с.

7.Барбан П.С., Мирский В.Я. Иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации риккетсий. Сообщение 1. Микроагглютинация риккетсий Провачека и Музера//Лаб. дело. - 1973. - №1. - С.28-30.

8.Барбан П.С., Мисенжников A.B. Конструирование стабильных иммуноглобулиновых эритроцитарных диагностикумов: Сообщение 1. Фиксация эритроцитов и их сенсибилизация специфическими иммуноглобулинами//Журн. микробиол., эпидемиол. и имунобиол. - М., 1976. -№ 4. - С.50-56.

9.Барбан П.С., Пантюхина А.Н., Власова Л.В. К методике получения антивидовых иммунных сывороток многоцелевого назначения//Материалы научн. конф., посвящ. 85-летию ПНИИВС. - Пермь, 1983. - С.20-22.

Ю.Барбан П.С., Пшеничнов P.A., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. - Свердловск: УрО АН СССР, 1988. - 175 с.

П.Барбан П.С., Пантюхина А.Н. Способ получения препаратов флуоресцирующих Fab- фрагментов антириккетсиозных лошадиных иммуноглобулинов//Авторское свидетельство № 1519369 приоритет от 30 марта, 1987г.

12.Барнард, Д. Д.Р., Уильяме Д. Л., Пейтон А.К., Шах Г.П. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением//Новые методы иммуноанализа/Пер. с англ. У.П.Коллинз. - М.: Мир, 1991. - С.150 - 167.

13.Брок Т. Мембранная фильтрация. - М., 1987. - С.39-41, 128-157.

14.Гениг В.А. Живая вакцина 1/М - 44 против Ку лихорадки для преорального применения//Журн. гигиены, эпид., микробиол. и иммунол. -Прага, 1968. -№12. - С.31-38.

15.Гениг В.А. Гетерогенные популяции риккетсий Бернета и их селекционный анализ//Вестник АМН СССР. - М., 1969. - №10. - С.40-51.

16.Гениг В. А., Фрязинова И.Б. Изучение антигенной структуры вирулентных и малопатогенных штаммов риккетсий Бернета//Вопросы инфекционной патологии и иммунологии. - М., 1976. - С.171-186.

17.Гениг В.А., Гудима О.Ю. Биологические свойства вакцинного штамма М-44 С. burnetii, длительно пассируемого в культурах клеток//В опросы риккетсиологии. -Вып.2. -М, 1981. - С.8-9.

18.Голиневич Е.М. Сухие корпускулярные антигены из риккетсий//Журн. микробиол. - 1955. - №6. - С.35-38.

19.Голиневич Е.М. Культивирование риккетсий в куриных эмбрионах по Коксу//Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. - М., 1965.-С.513.

20.Голиневич Е.М., Фрязинова Н.Б. Антигенные и иммуногенные фракции "цельных" антигенов из яичных культур риккетсий//Вестник АМН СССР. - 1964. - №3. - С.49-57.

21.Гольдин Р.Б., Амосенкова Н.И. Изучение экспериментальных риккетсиозов при помощи флуоресцирующих антител//Вопр. Вирусол. - М., 1961. - №5. - С.591-597.

22.Гольдин Р.Б., Амосенкова Н.И. Изучение и диагностика риккетсиозов при помощи метода флуоресцирующих антител//Метод. Пособие. - JL, 1961. -С.50.

23.Гольдин Р.Б., Волкова JI.A. Унификация и повышение эффективности серологической диагностики риккетсиозов и орнитоза при помощи непрямого метода люминесцирующих антител//Военно - медицинский журнал. - 1967. -№9. - С.74-79.

24.Гольдин Р.Б., Белецкая Р.В., Крюкова И.Н., Шаханина K.JI. Иммунофлуоресцентный анализ в изучении и диагностике вирусных инфекций и риккетсиозов//Иммунолюминесценция в медицине. - М., 1977. - С. 80 -144.

25.Горбачев E.H., Токаревич Н.К., Федоров Д.Н. Выявление антител к антигенам коксиелл Бернета в иммуноферменьном анализе//Риккетсиозы: Тр. Ин-та им. Пастера. - Л, 1989. - т 66. - С. 127-136.

26.Горбачев E.H., Токаревич Н.К.,Вербов В.И. и др. Иммуноферментный метод индикации антигенов Coxiella burnetii!УЖурн. микробиол. - М., 1991. -№2. - С. 56-60.

27.Гулевская С.А., Куделина Р.И. Особенности субмикроскопического строения I и II фаз риккетсий Бернета//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1967. - №12. - С. 133-134

28.Дайтер А.Б., Токаревич Н.К„ Рудаков Н.В., Носков Ф.С. Применение антигена из Coxiella burnetii 1-й фазы и эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума для повышения эффективности эпидемиологической разведки в отношении Ку - риккетсиоза//Журн. микробиол. - М., 1985. - №10. - С.105-106.

29.Дайтер А.Б., Рыбакова Н.А., Токаревич Н.К. и др. Эпидемиологическая проекция внутристадных очагов лихорадки Ку//Журн. микробиол. - М., 1988. -№11. -С.51-56.

30.Демкин В.В., Рыдкина Е.Б. Быстрый метод очистки риккетсий от тканей желточного мешка куриных эмбрионов для целей изучения хромосомных ДНК возбудителя методом ДНК зондирования//Вопр. риккетсиологии: Сб. научн. тр. - М., 1994. - С.57-61.

31.Дерягин Б.В., Чураев Н.В., Муллер В.М. Поверхностные силы. - М., 1985.-256 с.

32.Джалилов К.Д. Заболеваемость лихорадкой Ку в Узбекской ССР//В кн.: Современные проблемы зоонозных инфекций. - М., 1981. - С.77-79.

33.Друганова Л.П., Барвитенко Н.Г., Красильникова В.Р., Круглова Ю.М. Основная эпидемиологическая характеристика лихорадки Ку в Воронежской области//Вопросы риккетсиологии. - М., 1981. - Вып.2. - С.15-17.

34.Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. -М., 1975.-229 с.

35.Дытнерский Ю.И. Баромембранные процессы. - М., 1986. - 271 с.

36.Емельянов В.В. Методы получения мембранных фракций и полипептидный состав внешней мембраны Rickettsia prowazekii//Вопросы риккетсиол.: Мат. IV Всесоюзн. конф. "Актуальные вопросы эпид. Диагностики, лечения и профилактики риккетсиозов." - М., 1980. - С.4-7.

37.3дродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. -М., 1972. - С.92-140., 495.

38.3убкова Р.И. Выживаемость риккетсий Бернета в молоке и молочных продуктах//Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - М., 1957. - №9. - С.42-46.

39.Игнатович В.Ф. К вопросу о сохраняемости риккетсий Бернета на предметах внешней среды//Журн. микробиол., эпид. и иммунобиол. - М., 1959. - №5. - С.125-126.

40.Игумнов А.И. О сохраняемости антигена Ку - лихорадки//Лаб. Дело. -М., 1960, -№3. -С.35-37.

41.Кавакацу Такахиро. Микропористые мембраны: применение в биотехнологии//Маки - mtaibrane. -1991.-16.- №2. - С.87-88.

42.Камбаратов П.И., Куделина Р.И., Гаврилов Н.А., Львова К.С. Диагностическое значение РСК с антигенами риккетсий Бернета фазы I и II при лихорадке Ку//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - М., 1970. - №9. - С. 87-91.

43.Канбай И.Г. Сравнительная оценка двух методов приготовления антигена для диагностики лихорадки С)//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунолог. - М., 1967. - №7. - С. 139.

44.Канбай И.Г. Динамика накопления комплементсвязывающих антител с антигенами из риккетсий Бернета I и II фазы, выделенных в Азербайджане//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - М., 1968. - №7. -С.121-126.

45.Каракулов И.К., Борисов В.Д. Эпидемиология эпизоотология и лабораторная диагностика лихорадка Ку. - Алма-Ата: Наука, 1966. - С. 101-114.

46.Касаткина И.Л. Ку - лихорадка. - М., 1963. - С.15-33.

47.Кассирский И.А., Плотников H.H. Болезни жарких стран. - М., 1964. -С.338-341.

48.Кононова O.A., Тарасевич И.В., Помазанов В.В. и др. Новый метод очистки риккетсий//Вопр. Риккетсиол.: Сб. Научн. Трудов. - М., 1984. - С.56 -59.

49.Ковачева Е. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) - тест для диагностики лихорадки Ку (сравнение его с РСК и методом иммунофлуоресценции)//Риккетсиозы: Тр. Ин-та им. Пастера. - Л., 1989. - т.66. - С.119-127.

50.Костромина Е.Е. Использование комбинированного яично - тканевого метода культивирования риккетсий Бернета в производстве антигена Ку//Лаб. дело. - М., 1961. - №1. - С.42-43.

51 .Костромина Е.Е. Лихорадка Ку на Западном Урале (эпидемические и лабораторные наблюдения)/Автореф. дис. канд. мед. наук. - Пермь, 1964. -11 с.

52.Кротов A.B., Пантюхина А.Н., Петров В.Ф. Антигенные и иммуноглобулиновые препараты для диагностики коксиеллеза в системе сопряженных однонаправленных серологических реакций//Журн. микробиол. -1998. -№2.-С.68-72.

53.Куделина Р.И., Федорова Н.И. Об иммуногенности различных фаз риккетсий Бернета//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунолог. - М., 1967. -№5. - С. 17-21.

54.Куделина Р.И., Федорова Н.И. О вирулентности различных фаз риккетсий Бернета//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - М., 1967. -№7. С.114-118.

55.Куделина Р.И., Федорова Н.И., Степанченок Г.И. О получении растворимого антигена риккетсий с помощью ультразвука//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - М., 1968. - №11. -С. 141.

56.Куделина Р.И. Изучение аллергенных свойств растворимого антигена риккетсий Бернета в эксперименте//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунолог. - М., 1969. - №4. - С.95.

57.Куделина Р.И. Растворимая фракция риккетсий Бернета, ее получение и антигенные свойства//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунолог. - М., 1969.-№5.-С.9-13.

58.Куделина Р.И., Степанченок Г.И., Краснобаева З.И. Иммунохимическое изучение растворимого антигена риккетсий Бернета I фазы//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунолог. - М., 1969. №6. - С.59-62.

59.Куделина Р.И., Камбаратов П.И. Применение растворимого антигена в качестве аллергена для диагностики лихорадки Ку у людей//Журн. микробиол., эпидемиол. и микробиол. -М., 1969. - №9. - С. 81-85.

60.Куделина Р.И. Иммунологическая характеристика растворимого антигена Бернета//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунолог. - М., 1970. -№1. - С.84-88.

61.Кузнецова А .Я., Яблонская В. А., Тарсевич И.В. Использование иммуноферментного метода в диагностике риккетсиозов//Вопр. риккетсиологии: Сб. научн.тр. - М., 1985. - С. 31-34.

62.Кулагин С.М., Кекчеева Н.Г. Изучение Ку - лихорадки в СССР//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - М., 1954. - №5. - С.48.

63.Кулагин СМ., Федорова Н.И., Соколова Н.Ф. К вопросу о выживаемости риккетсий Бернета в воде и методах ее обеззараживания//Журн.микробиол., эпидем.,иммунобиол. - М., 1958. - №2. -С.62.-65.

64.Кульберг А.Я., Тарханова И.А., Бадаева Н.М. Иммунологические свойства ферментированных папаином антибактериальных и антириккетсиозных кроличьих сывороток//Бюл. экспер. биол. - 1961. - №12. -С.66-69.

65.Кушнир З.Г., Климчук М.Б., Максимович O.A. и др. Эпидемиологические проявления лихорадки Ку в Прикарпатье//Вопросы риккетсиологии. - М., 1994 - С.21-24.

66.Лагутенков A.B. Плоскорамная мембранная установка для ультра- и микрофильтрации//Матер. Всесоюзн. конф. "Мембранная техн. в мед. и биотехнологии - М., 1991.

67.Леннет Э„ Шмидт И. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний/Пер. с англ. - М., Медицина, 1974. - С.672-707.

68.Лобан K.M. Важнейшие риккетсиозы человека. - Л., 1980. - С.309-321.

69.Лобан K.M. Лихорадка Ку. - М., Медицина, 1987. - 128 с.

70.Лукин Е.П., Васильев H.H., Воробьев A.A., Шевелев В.М. Изучение иммунологических свойств растворимого антигена риккетсий Провачека. Сообщение II: Выделение при помощи ДЕАЕ-целлюлозы растворимого антигена риккетсий Провачека и его иммунологическое изучение//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1965. - №5. - С.114-119.

71.Мартынюк Ю.В., Эмдина И.А., Титов М.Б. и др. О специфичности РСК при диагностике Ку-лихорадки//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М.,1970. - №4. - С.55-59.

72.Меренкова A.M., Климчук Н.Д., Компанцев Н.Ф., Федорова Л.И. Состояние проблемы лихорадки Ку в Украинской ССР//Вопросы риккетсиологии. - М., 1981. - Вып.2. - С.43-44.

73.Мирский В.Я., Ильина М.И. Применение иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации для дифференциальной диагностики заболеваний группы сыпного тифа//Вопр.риккетсиологии: Сб.научн. тр. Пермск. мед. ин-та. -Пермь, 1974. - Т.124.-С.105-108.

74.Мирский В.Я. К технологии изготовления люминесцирующих диагностикумов из корпускулярных антигенов риккетсий//Вопр.риккетсиол.: Сб.научн. тр. Пермс. мед. ин-та. - Пермь, 1974. - Т.124.- С.103-104.

75.Мирский В.Я. Иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации как метод серологической диагностики риккетсиозов/Автореф. дис. канд. мед. наук. - Челябинск, 1981. - 6 с.

76.Михайлов В.В., Воробьев A.A., Махлай A.B., Халтаева Г.Г., Суворова Т.А., Краснянский В.П. Экспериментальное изучение иммуногеных и протекивных свойств штамма М-44 С. burnetii и живой энтеральной вакцины против лихорадки Ку//Журн.микробиол. - 1996.- №1. - С.38-42.

77.Миролюбова JI.B., Воронцова Т.А. Выявление антител против риккетсий Бернета при помощи люминесцентного - серологического метода при массовом обследовании населения//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1968. - №8. - С.47-51.

78.Мирютова Т.Д. Получение и культивирование первично-трипсинизированных клеточных культур. - Томск: Изд-во Томского НИИ вакцин и сывороток, 1974. - Вып.31. - 17 с.

79.Мисенжников A.B., Бривкальн H.A. Реакция нейтрализации антигена, как метод исследования антисывороток к риккетсиям Провачека//Вопр. риккетсиологии: Сб. научн.тр. - Пермь, 1974. - Вып.1 - Т.124.-С.90-93.

80.Мисенжников A.B. Разработка и применение реакции нейтрализации антигена для серодиагностики некоторых риккетсиозов//Вопр. риккетсиологии: Сб. научи, тр. - М.,1979. - Вып.1. - С.66-67.

81.Морозова М.Ю. Аллергическая и внутрикожная проба у больных и переболевших Ку-лихорадкой//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -М., 1955. - №6. - С.28.

82.Морозова М.Ю. Риккетсиозные антигены и риккетсиозные вакцины: Культивирование риккетсий и приготовление диагностических препаратов//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1968. - №9. -С.57.

83.Морозова М.Ю. Риккетсиозные антигены и вакцины (по опыту производственной лаборатории)/Автореф. дис. канд. мед. наук. - М., 1971. -37с.

84.Мчедлишвили Б.В. Ядерные фильтры в процессах разделения биополимеров//Тр. Всеросс. семинара по колл. хим. и физ.-хим., мех. пищ. и биоактив, дисперсн. систем. - М., 1993. -С. 15-34.

85.Начинкин О.И. Полимерные микрофильтры. - М., 1985. - 148 с.

86.Незлин P.C. Биохимия антител. - М.: Наука, 1966. - С.54-101.

87.Общие требования к риккетсиозным штаммам, предназначенным для производства диагностических и профилактических препаратов, и методам их контроля. - ОСТ 42 ШТ-1-85. -М.: МЗ СССР, 1985.-21 с.

88.Павловская Н.И., Морозова A.B., Точилова Т.А., Ячменев Н.И. Материалы иммунологической разведки на наличие Ку лихорадки в Калининградской области//Проблемы инфекционной патологии-Калининград, 1976. - С.44-45.

89.Пантюхина А.Н., Александрова JI.B., Юркова H.A. Диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный сухой для РСК, РНАг, МФА/УЭкспериментально-производственный регламент. - Пермь, 1992. - 150 с.

90.Пантюхнна А.Н., Александрова JI.8., Тупицын A.B. и др. Унификация технологии приготовления риккетсиальных препаратов//Экспериментальная и прикладная иммунология. - Пермь, 1991. - С.25-26.

91.Пантюхина А.Н., Петров В.Ф., Александрова JI.B. Основные принципы конструирования риккетсиальных антигенных препаратов и перспективы их совершенствования//Журн. микробиол. - М., 1998. - №2. -С.51-54.

92.Пантюхина А.Н. Поверхностные белковые антигены R.prowazekii, R. typhi, R.sibirica, С.burnetii - как основа для создания новых диагностических и профилактических препаратов/Автореф. дис. доктора мед. наук. - Челябинск, 1998.-39 с.

93.Паутов В.М., Лукин Е.П., Воробьев A.A. Специфическая профилактика риккетсиозов. - М.,1969..Медицина. - С.20-39.

94.Паутов В.Н., Воробьев A.A. Современное состояние иммунопрофилактики Ку-риккетсиоза//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1969. - №8. - С.37-41.

95.Паутов В.Н. Изучение антигенной структуры вакцинного штамма М-44 риккетсий Бернета//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1973. - №10. - С.139.

96.Полоцкий Ю.Е., Дайтер А.Б., Ефремов В.Е. и др. Реакция хозяина на введение различных компонентов С. burnetii!УЖурн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- М.,1991. - №9. - С.70-75.

97.Применение полупроницаемых мембран Владипор для очистки и концентрирования биопрепаратов//Методические рекомендации /Под. ред. Н.П.Перепечкиной, А.Н.Маца, В.И.Трубициной, Е.Е.Каталевского. - М, 1979. -27 с.

98.Пшеничнов В.А., Воробьев A.A., Балаева Н.М. Аттенуация вирусов и риккетсий. - М., Медицина, 1976. - С.82-99.

99.Райхер Л.И. Применение углекислоты для очистки риккетсиозного антигена.//Мат. конф. по рик. и вир. инф. человека. - Пермь, 1957.-С.35-36.

ЮО.Райхер Л.И., Мирисеева Е.Е. Очистка риккетсиозного антигена для реакции связывания комплемента по методу Казальса//Мат конф. по рик вир. инф. человека. - Пермь, 1957. - С.39-40.

101.Райхер Л.И., Костромина Е.Е. Опыт получения цельно-растворенных эфирных антигенов из вшей, зараженных сыпным тифом, для реакции связывания комплемента//Мат. конф. по рик. вир. инф. человека.- Пермь, 1957. -С.41-42.

102.Райхер Л.И. К вопросу использования растворимого антигена риккетсий Провачека в РСК при сыпном тифе//Лаб. дело. - М.,1963. - №10. -С.46-49.

ЮЗ.Решл М., Василенко А.Ж., Лесный М., Пропнер П. Динамика морфологических изменений в тканях после подкожного введения вакцин против Ку-лихорадки//Журн. микробиол. - М.,1991. - №1. - С.40-43.

104.Рудаков Н.В., Камышева В.Ф., Стрыгина Н.П. Природно-очаговые инфекции в районах народохозяйственного освоения Сибири и Дальнего Востока/В сб.: Природноочаговые болезни человека. - Омск, 1983. - С. 139-147.

105.Рудаков Н.В., Шайман М.С., Камышева В.Ф. и др. Болезни с природной очаговостью//Тр. НИИЭпид. и микр. - Л. Д983.-Т.60.- С.58-63.

106.Рудаков Н.В. Микрометод реакции угнетения связывания комплемента и его применение при Ку-риккетсиозе//Лаб. дело. - М.,1984.-№10.-С.624-625.

107.Рудаков Н.В., Шайман М.С., Камышева В.Ф. и др. Современные эпидемиологические особенности на Юге Сибири/В сб.: Природноочаговые болезни человека. - Омск, 1985. - С.94-105.

108.Рудаков Н.В., Токаревич Н.К. Опыт применения некоторых современных методов изучения лихорадки Ку//Природноочаговые болезни человека: Респ сб. научн. работ. - Омск, 1987. - С.66-73.

109.Рудаков. Эколого-эпидемические аспекты антропической трансформации очагов лихорадки Ку и клещевого риккетсиоза//Вопр. риккетсиологии. - М., 1994. - С.30-34.

11 О.Рудаков Н.В., Фетисова Н.Ф., Сыскова Т.Г. Коксиеллез в Российской Федерации//ЗНиСо (бюллетень). - 1994. - №2. - С.10-12.

Ш.Рудаков Н.В. Эколого-эпидемио логическая характеристика антропической трансформации очагов лихорадки Ку и клещевого риккетсиоза/Автореф. дис.д-ра мед. наук. - М., 1995. -44 с.

112.Рыбакова H.A. Зооантропозные болезни на европейском севере России//Ветеринария.- М.,1998. - №2- С.18-22.

ПЗ.Рыбкина P.A., Напалкова Г.М., Голосев Ю.А. и др. Диагностика лихорадки Ку методом лантанидного иммунофлуоресцентного анализа//Мат. докл. Всерос. научно-пр. конф. - Махачкала, 1994.-СЛ 70.

114.Самитова В.И., Токаревич Н.К. Антиген из коксиелл Бернета для реакции микроагглютинации/В сб.: Природноочаговые болезни человека. -Омск, 1985.-С.112-115.

115.Серологические методы диагностики ,риккетсиозов//Методич. Рекомендации/Сост.: Тарасевич И.В., Яблонская В.А., Лобанов A.B. и др. -М.,1988. -48 с.

116.Суворова Т.А., Пшеничнов В.А., Грабарев П.А. Патогенез Ку-лихорадки при интратрахеальном инфицировании морских свинок.//Журн. микробиол. - М. 1991.-№12.-С.48-50.

117.Суворова Т.А., Пшеничнов В.А., Грабарев П.А. Сравнительное изучение различающихся по вирулентности штаммов Coxiella burnetii при интратрахеальном инфицировании морских свинок//Журн. микробиол. - М., 1997. -№2. -С.14-17.

118.Сухопяткина A.A., Бат О.С., Левицкая A.B., Потапова В.Г. Клинико-эпидемическая характеристика Ку-лихорадки в Прикарпатье//Журн. микробиол. - М.,1985. - №4. - С.80-81.

119.Тарасевич И.В. Диагностика лихорадаи Ку при помощи реакции угнетения связывания комплемента//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М., 1962. - №2. - С.92-96.

120.Тарасевич И.В., Токаревич Н.К., Фаталиева С.Ф. и др. Специфическая профилактика лихорадки Ку: (Итоги и перспективы)/В сб.: Совр. вакцинология: тезисы докладов. - Пермь, 1998. - 256 с.

121.Токаревич Н.К., Друганова Л.П., Дайтер А.Б., и др. Сочетанное применение серологических тестов с целью диагностики и изучения Ку-риккетсиоза//Журн. микрсбиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М.,1979. - №12. -С.90-95.

122.Токаревич Н.К., Шрамек С., Баяр Г.А. Испытание эритроцитарного антигенного диагностикума для выявления антител к коксиеллам Бернета//Журн. микробиол., энидемиол. и иммунобиол. - М., 1985. - №4. - С.51-55.

123.Токаревич Н.К., Просверницын С.А., Карцева H.A., Кузина R.A. Морфологические изменения в организме морских свинок в ответ на введение различных антигенов Coxiella burnetii!ГЖурп. микробиол. - М., 1994. - №5. -С.53-56.

124.Токаревич Н.К. Биологические аспекты взаимоотношения коксиелл Бернета и организма млекопитающего как основа совершенствования диагностики и специфической профилактики Ку- лихорадки/Автореф. дис. д-ра мед.наук. - С.-Пб., 1997.-46 с.

125.Ураков H.H. Изучение реактогенных и иммуногенных свойств растворенного антигена R.burnetii, получаемого при помощи ультразвука//Вопр. вирусологии. - М.,1962. - №1. - С.104-108.

126.Федоров Э.И., Токаревич Н.К., Дайтер А.Б. Внутристадные очаги Kv-риккетсиоза (эпидемиолого-эпизоотологическая характеристика)/® сб.: Природноочаговые болезни человека. - Омск, 1985. - С. 106-111.

127.Федорова И.И., Куделина Р.И., Дюйсалиева Р.Г. и др. Значение для диагностики лихорадки Ку реакции связывания комлемента с антигеном из риккетсий Бернета 1 фазы//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -М., 1967.-№9.-С.44-48.

128.Финдлей Дж.Б. Выделение и модификация мембранных белков и пептидов//Биологические мембраны. Методы: пер.с англ./Под ред. Д.Б. Финдлея, У.Г.Эванза. -М.: Мир, 1990. - С.251-308.

129.Фрязинова И.Б., Гениг В.А. Очистка риккетсий Бернета и выделение из них ДНК//Вопросы инфекционной патологии и иммунологии. -М.:Медицина, 1976. - Вып. 5. - С.267-274.

130.Хванг С.Т., Каммермайер К. Мембранные процессы разделения. -М., 1981.-464 с

131.Эмдина И.А. Реакция угнетения связывания комплемента - метод лабораторной диагностики лихорадки Ку//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммнобиол. - М., 1967. -№4. - С.94-98.

132.Эмдина И.Э., Мартынюк Ю.В. О возможности использования фазовой изменчивости риккетсий Бернета в серологической диагностике лихорадки Ку//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - М.,1969. - №5. -С.24-28.

133.Яблонская В.А., Панфилова С.С. К вопросу о регистрации заболеваний лихорадкой Ку на территории СССР//Проблемы экологии и мед. географии Казахстана. - Алма-Ата, 1976. - Вып.5. - С.111-114.

134.Яблонсакя В.А., Тарасевич И.В., Дюйсалиева Р.Г., Барбан П.С. Риккетсиозные антигены для нМФА//Вопросы риккетсиологии: Сб.науч. тр.-М., 1984.-Вып.З - С.87-89.

135.Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Макарова В.А. Способ получения антигена риккетсий//Авт. Свидетельство №1392689. М., 1986.

136.Яблонская В.А. К вопросу о стандартизации коксиелл Бернета/УВопросы риккетсиологии. - М., 1989. - С.160-164.

137.Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф., Умнова Н.С., Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Карцева Н.А., Воробьева М.С., Еликоев К.А. Результаты изучения комбинированной инактивированной вакцины из С. burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение 1//Вопросы риккетсиологии -М., 1994. - С.114-118.

138.Amano К., Williams J.S. Chemical and immunological characterization of lipopolysaccharides from phase I and phase II Coxiella burnetii!! J .B&ctQno\. - 1984. - 160 (3). -P:994-1002.

139.Amano K., Williams J.S., Mc Caul T.F., Peacock M.G. Biochemical and immunological properties of Coxiella burnetii cell wall and peptidoglycan - protein complex fractions//J.Bacteriol. - 1984. - 160 (3). - P: 982-988.

140.Anacker R. Antigenic and skin-reactive properties of fractions of Coxiella burnetii!! J Immunol. - 1962. - V.89. - N 1. - P: 145-152.

141.Baca O., Paretsky D. Q fever and Coxiella burnetii!IMicrobiol. Rev. -1983. -V.47 - P:127-199.

142.Baga В., Frazier M.T., Mallavia L.P., Semuel J.E//Patent PI USA 5258283. - 1993.

143.Bakemeier R.F. A study of phase variation in Coxiella burnetii employing hemagglutination tests//J.Immunol. - 1965. - V.95. - N 5 - P:880-886.

144.Banerjee-Bhatnagar N., Bolt C.R., Williams J.C. Pore-forming activity of Coxiella burnetii outer membrane protein oligomer comprised of 29,5- and 31 kD polypeptides. Inhibition of porin activity by monoclonal antibodies 4E8 and 4D6//Ann.N.Y.Acad.Sci. - 1996. - 791. - P:378-401.

145.Bodzek M., Bohdziewicz I. Membrany w biotehnologii//Zesz.nauk. Inz.srod. PSI. - 1993. - N35. - P:l-256.

146.Bovarnick M., Snyder I. Respiration of typhus rickettsial//J.Exp. Med. -1949.-V.89.-P:561.

147.Bovarnick M.R., Miller I.C. Oxidation and transamination of glutamate by typhus rickettsial//J.biol.Chem. - 1950. - V.184. - P:661-676.

148.Brezina R., Urvolgyi I. Выделение I фазы антигена Coxiella burnetii трихлоруксусной кислотой/ZActa virol. - 1961. - V.5. - P:193-195.

149.Brezina R., Schramek S., Urvolgyi I. Изучение антигенной структуры Coxiella burnetii II. Очистка I фазы антигенного компонента, полученной с помощью трихлоруксусной кислоты//Acta virol. - 1962. - V.6. - N3. - Р:278-279.

150.Brezina R., Urvolgyi I. Изучение антигенной структуры Coxiella burnetii I. Получение антигенного компонента I с помощью трихлоруксусной кислоты/ZActa virol. - 1962. - V.6.-P:84-88.

151.Brezina R., Schramek S., Urvolgyi I. Изучение антигенной структуры Coxiella burnetii III. Пирогенное действие фазы I антигена на подопытных морских свинок//Ас1а virol. - 1965. - Т.9. - V.2. - Р: 180-185.

152.Brezina R., Kazar J. Изучение антигенной структуры С.burnetii!IActa virol. - 1965. - T.9. - V.3. - P: 268-274.

153.Brezina R., Schramek S. Antigenic structure of Coxiella burnetii YI. Chromatographic analysis of phase I antigen of Coxiella burnetii on diethylaminoethyl-cellulose//Acta virol. - 1968. - T.12. - V.l - P:68-72.

154.Brezina R., Pospisil V., Schramek S. Изучение антигенной структуры Coxiella burnetii YII. Свойства антигенного компонента, экстрагированного фенолом из фазы I Coxiella burnetii!'!Acta virol. - 1970.- T.14. - V.4. - P:295-301.

155.Brezina R., Pospisil V. Изучение антигенной структуры Coxiella burnetii YIII. Иммуногенность антигенного компонента экстрагированного фенолом, из организмов фазы I//Acta virol. - 1970. - T.14. - V.4. - Р:302-306.

156.Brezina R. Antigeny a imunita pri Q horucke. - Bratislava: Veda, 1977. -

116c.

157.Brougui P., Dumler J.S., Raoult D. Immunohistologic demonstration of Coxiella burnetii in the valves of patients with Q-fever endocarditis//Amer.J.Medicine. - 1994. - N.97. - V.5. - P:451-458.

158.Ciampor F., Schramek S., Brezina R. Электронномикроскопическое изучение риккетсий Coxiella burnetii фазы I и II, окрашенных рутением KpacHbiM//Acta virol. - 1972.- T.16. - V - 6. - P:503-506.

159.Colter I.S., Brown R.A., Bird H.U., Cox U.R. Preparation of a soluble immunizing antigen from Q-fever rickettsiae//J.ImrmmoL - 1956. - V.76. - P:270-274.

160.Cottalorda I., Jouve I.L., Bollini G. et al. Osteoarticular infectiondue to Coxiella burnetii in children//J.Pediatric orthopaedics-PART. - 1995. - V.4 - N2. -P:219-221.

161.Cowley R., Fernandez F., Freemantle W., Rutter D. Enzyme immunoassay for Q fever: comparison with complement fixation and immunofluorescence tests and dot immunoblotting//J.Clin.Microbiol. - 1992. - 30.- №4. -P:2451-2455.

162.Craigie J. Application and control of ethyl-ether-water interfase effects to the separation of rickettsiae from yolk sac suspensions//Canad. J.Res. - 1945. - V.23. - P: 104-114.

163.Dubois D.R., Cutchins E.C., Berman S. et al. Preparation of purified suspensions of Coxiella burnetii bu Genetron extraction followed by ctntinuous-flow ultracentrifugation//Appl.Microbiol. - 1972. - 23(5). - P:841-845..

164.Dupont H.T., Brougui P., Faugere В., Raoult D. Prevalence of antibodies to Coxiella burnetii, Rickettsia conorii and Rickettsia typhi in 7 African countries//Clin.Inf.Dis. - 1995. - T.21. - V.5. - P:1126-1133.

165.Fiset P., Ormsbee R., Silberman R., Peocock M., Spielman S. A microagglutination technigue for detection and measurement of rickettsial antibodies//Acta virol. - 1969. - 13 -P:60-66.

166.Fishbein D.B., Raoult D. A cluster of Coxiella burnetii infections associated nith exposure to vaccinated goats and their unpasteurized Dairy-Products//Amer.J.Trop.Med.Hyg. - 1992. - V.47. - N1. - P:35-40.

167.Finidori I.P., Raoult D., Bornstein N., Fleurette I. Study of cross-reaction between Coxiella burnetii and Legionella pneumophila using mdircct immunofluorescence assay and immunoblotting//Acta virol. - 1992. - V.36. - N5. -P:459-465.

168.Fournier P.E., Casalta I.P., Piguet P. et al. Coxiella burnetii infection of aneurysms ork vascular grafts: Report of seven cases and review//Clin. Infect. Diseases. - 1998. - 26. - 1 - P:116-121.

169.Fritz E., Thiele D., Willems H. Wittenbrink M.-M. Quantification of Coxiella burnetii by polymerase chain reaction (PCR) and a colorimetrie microtiter plate hybridization assay (CMHA)//Eur. J. Epidemiol. 1995. - 11. - P:549-557.

170.Gajdosova E., Kovacova E., Toman R. et al. Immunogenicity of Coxiella burnetii whole cells and their outer membrane components//Acta virol. - 1994. -38(6). -P:339-344.3

171.Glauert A.M., Thornley M.Y. Glutaraldegyde fixation of gramnegative bacteria//J.Roy. microscop. sos. - 1966. - V.85. -P:449-454.

172.Halle S., Dasch G.A., Weiss E. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies against typhus rickettsia, Rickettsia prowazekii and Rickettsia tuphi//J.Clin. Microbiol. - 1977. - 2. - P: 101-110.

173.Halonen P., Meurman O., Pettersen U.G. et al. New Developments in diagnosis of virus infections//In: Control of virus diseases. Ed. By E. Kurstak, and Marusyk, Marcel Dekker. Inc., New York and Basel. - 1984. - P:501-520.

174.Helmcke J.G. Новые данные о структуре мембранных фильтров//Ко1№. Zs. - 1954. -V.135. -Р:29-43.

175.Hemmila J., Dakubu S., Mukkava V-M. et al. Europium as a label in time-resolved immunofluorometris assay//Anal. Biochem. - 1984. - 137. - P:335-343.

176.Heinzen R.A., Scidmore M.A., Rockey D.D., Hackstadt Т. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of C.burnetii and chlamydia-trachomatis//Infection and Immunity. - 1996. -64.-3 - P:796-809.

177.Ноуег В., Bolton E., Ormsbee R. et al. Mammalian viruses and Rickettsia//Science. - 1958. - V.127. - P:859-863.

178.Hoyer В., Ormsbee R., Fiset P., Lackman D. Differentiation of phase I and II Coxiella burnetii by equilitrium density gradient sedimentation//Nature. - 1963. -197. -P:573-574.

179.Hou K., Gerba C.P., Goyal S.M., Zerba K.S. Задержка фильтрами с измененным зарядом латексных пузырьков, бактерий, эндотоксина и вирусов//Арр1. Environ.Microbiol. - 1980. - 40. - Р:892-896.

180 Jager С., Willems Н., Baljer G. Erfahrungsbericht zur Diagnostik, Klinik und Epidemiologie der aktuellen Q-Fieber-Ausbruche in Hessen//4. Medizinische B-Shutz-Tagung des BMVg am 22 und 23 Oktober, 1997. - Abstract.

181 Johnson J.E., Kadull PJ. Laboratory acguired Q fever a report of fifti cases//Am. J. Med, 1966. - 41. - P:391-403.

182Johnson J.E, Kadull P.J. Rocky mountain spotted fever acguired in a laboratory//New. Engl. Y. Med, 1967. - 277. - P:842-847.

183.Kaaserer B, Rehacek I, Urvolgyi I. et al. First isolation of the Q-fever agent, Coxiella burnetii in ixodes ricimus: Ticks in Tyrol (Austria)//Berichte des Naturwissenschaftlich- Medizinischen Vereins in Innsbruck. - 1994. - P-.223-227.

184.Kazar J, Brezina R, Kovacova E, Urvolgyi I. Сравнительное исследование способности антигенов С. burnetii в фазе I и фазе II индуцировать образование антител и связывать антител a//Acta virol. - 1973. -Т.17. - V.6. -Р:512.

185.Kazar J, Schramek S, Brezina R. Исследование антителобразования и иммуноглобулинов в сыворотках кроликов и морских свинок, иммунизированных Coxiella burnetii//Acta virol, - 1977. - 21. -3. - P:246-255.

186.Kazar J, Brezina R, Schramek S. et al. Пригодность реакции микроагглютинации для определения постинфекционных и поствакцинальных антител к лихорадки Ку в сыворотках человека/VActa virol. - 1981. -Т.25. - V.4. -Р:235-240.

187.Kazar J, Kovacova Е. Failure of Q-vefer phase I corpuscular vaccine to influence the persistence and reactivation of Coxiella burnetii infection in mouse and guinea -pig tissues//Acta virol. - 1983. -V.27. -5. - P:418-428.

188.Kazar J, Gajdosova E, Kovacova E, Valkova D. Immunogenicity and protective ability of corpuscular and soluble vaccines prepared from different Coxiella burnetii phase I strains//Acta virol. - 1995. - V.39. - (5-6) - P:243-249.

189.Kazar J. Q vefer//Rickettsiae and Rickettsial Diseases. -Bratislava: Veda, 1996.-P:353-362.

190.Kordova N, Brezina R. Multiplication dynamics of phase I and II Coxiella burnetii in different cell cultures//Acta virol. - 1963. - №7. -P:84-87.

191.Kovacova E, Vavrecova M, Lukacova M. et al. Immunochemical and antigenic characterization of Coxiella burnetii strains isolated in Europe and Mongollia//Eur. J. Epid. - 1994. -V.10. - N.l. -P:9-15.

192.Kovacova E, Kazar J, Spanelova D. Analysis of antibody response in humans and goats with the use of different Coxiella burnetii antigenic preparations//Rickettsiae and Rickettsial Diseases. -Bratislava: Veda, 1996. - P:463-468.

193.Kruszewska D, Rumin W, Tylewska - Wierzbanowska S. Properties of phase I purified cellular antigen of Coxiella burnetii![Medycynz Doswiadezalna i Mikrobiologia. - 1989. -41 (3-4). -P: 170-175.

194.Lascola B, Raoult D. Serological cross-reactions between Bartonella -Quintana, Bartonella - Henselae, and Coxiella burnetii//].Clin. Microbiol. - 1996. -34(9). - P:2270-2274.

195.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4//Nature. - 1970. - 227. - P:680-685.

196.Lukacova M, Kazar J, Gajdosova E, Vavrekova M. Phase variation of lipopolysaccharide of Coxiella burnetii, strain Priscilla durig chick embryo yolk sac passaging//FEMS Microbiol. Lett. -1993. - 113. -P:285-290.

197.Lukacova M, Gajdosova E, Skultety L. et.al. Characterization and protective effect of a 29 kDa protein isolated from Coxiella burnetii by detergent Empigen BB//Eur. J. Epidemiol. - 1994. - 10. P:227-230.

198.Lukacova M, Kazar J. Improved metod of isolation of Coxiella burnetii proteins//Acta virol. - 1996. - 40. - 1 - P:55-58.

199.Martin J. Depth filters in downstream processing. An efficient through-flow filtration method//Bio Technology. - 1993. -11. -№7. - P:843-845.

200.Michaels Stephen L. Ultrafilters for fast and easy process development in the laboratory//Amer. Biothechnol. Lab. - 1994. - 12. - N.2. - P: 14-16.

201.Mueller H.P, Schmeer N, Rantamaki L. et al. Isolation of a protein antigen from Coxiella burnetii!/Zentrall. Bakteriol, Mikrobiol, hyg. SerA. - 1987. -265 (3-4) - P:227-289.

202.Musso D, Lascola B, Raoult D. Serological cross - reactions between Coxiella burnetii and Legionella micdadei//Clin. Diag. Lab. Immunology. - 1997. -V.4.N.2.-P:208-212.

203.Nakagawa Masanori, Maehara Takashi. Production of fever antigen//Patent abstracts of Japan, JP 09178750 - 1997.

204.Nischida Jasukuni, Kiyoshida Tatasuo, Haschimoto Takasui, Isurumizu Takaschi//Patent, Japia. - 1990, (22.02.). - JP02053458.

205.Nissonoff A, Wissler P, Lipman L. Separation of univalent fragmente from the bivalent robbit antibody molechle by reduction of disulfide bonde//Arch. Bioch. andBiophys, - I960.- 89.- 2. -P:230-235.

206.0rmsbee R.A. A metod of purifying Coxiella burnetii and other pathogenic Rickettsiae//J.Immunol. - 1962 - V.88. - N.l. - P:100-108.

207.0rmsbee R.A, Bell E.J, Lackman D. Antigens of Coxiella burnetii I. Extraction of antigens with novagueous organic solvent//J.Immunol. - 1962. -V.88. -N.6. - P:741-749.

208.0rmsbee R.A, Peacock M, Philip R. et al. Serologic diagnosis of epidemie typhus fever//J.Epidemiol. - 1977.- 105 (3). - P:261-271.

209.Peter О., Dupuis G., Peacock M.G, Burgdorfer W. Comparison of enzim -linked immunosorbent assay and complement fixation and indirect flurescent-antibody test for detection of Coxiella burnetii antibody//J. Clin. Microbiol. - 1987. -25. - 6. - P:1063-1067.

210.Q-fever serodiagnosis by an Immuno-enzymatic (ELISA) test//Cracea E., Constantinesku S., Dumitrescu A. et. al. Proc.3-rd. Intern. Symp. On Rickettsia and Rickettsial diseases. - Bratislava: Veda, 1984. - P:54.

21 l.Raoult D., Laurent J.C., Mutillod M. Monoklonal - antibodies to Coxiella burnetii for antigenic detection in cell-cultures and in paraffin - embedded tissues//Amer. J. Clin. Pathol. - 1994. - V.101. - N.3. - P:318-320.

212.Rehacek J., Urvolgyi I., Kocianova E. et al. Extensive examination of different tick species for infestation with Coxiella burnetii in Slovakia//Eur. J. Epid. -1991.-7.-3. - P:229-303.

213.Rehacek J., Krauss H., Kocianova E. et al. Studies of the prevalence of Coxiella burnetii, the agent of Q-fever, in the foothills of the soutnern Bavarian forest, Germany//ZBL Bakt. - Int. J. Med. M. -1993. - 278. - 1 - P; 132 -138.

214.Rehacek J., Kaaserer В., Urvolgyi I. et al. Isolation of Coxiella burnetii and of an unknown rickettsial organism from ixodes- ricinus tick collected in Austria//Eur. J. Tpid. - 1994. - V.10. - N.6. - P:719-723.

215.Rehacek J., Kocianova E., Kovacova E. Problems of contamination of some areas in Slovakia by Coxiella burnetii strains imported from abroad/TV et. Med. - 1996. - V.41. - N.6. - P:173-176.

216.Rhode C., Kelly P.J. Raoult D. Dairy cows as reservoirs of Coxiella burnetii in Zimbabwe//Zent. Afr J. Mtd. - 1993. - 39 (10) - P:208-210.

217.Rosenberg M., Kordova N. Размножение Coxiella burnetii в клетках тканевой культуры Дейтройт - 6//Acta virol. - 1962. - Т.6. - V.2. -Р: 176-180.

218.Ribi Е., Hoyer В.Н. Purification of Q-fever Riskettsiae by Density -Gradient Sedimentation//! Immunol. - 1960. - V.85. - P:314-318.

219.Schramek S., Brezina R., Pospisil V. Усовершенствованный метод приготовления антигена Coxiella burnetii фазы II для микроагглютинации//А^а virol. - 1970. - 14.-Р:415.

220.Schramek S., Brezina R., Urvolgyi J. Новый метод приготовления диагностического антигена из возбудителя лихорадки Ky//Acta virol. - 1972. -Т.16. - V.6.-P:487-492.

221.Shepard C.C. and Topping N.H. Preparation of suspensions of rickettsia from in fected yolk sacs without the use of ether//J.Immunol., - 1947. - V.55. - N. 1. P:97

222.Sekejova Z., Kovacova E., Kazar J. et al. Monoclonal antibodies to Coxiella burnetii that cross-react with strain Nine Mille//Clin. Diag. Lab. Immun. -1995.-2 (5).-P:531-534.

223.Skultety L., Toman R. Comparison of various methods of lipopolysaccharide isolation from Coxiella burnetii strain priscilla in the virulent phase I//Acta virol. - 1994. - 38 (4). - P:209-213.

224.Skultety L., Toman R., Patoprsty V. Studies on composition of lipopolysaccarides from two Coxiella burnetii strains associated with acute and chronic Q fever//Rickettsiae and Rickettsial diseases. - Bratislava: Veda, 1996. -P:423-428.

225.Sladek K.J., Leahy T.J. Retention of bacteria by membrane filters//Monreal, Canada, Proceeding Second word Congress of Chemical Engineering. -1981.- V.I.V. - P: 158-161.

226.Sobsey M.D., Jones B.Z. Концентрирование полиовируса из водопроводной воды с помощью положительно заряженных микропористых фильтров//Арр1. Environ. Microbiol. - 1979. - 37. -Р:588-595.

227.Stein A. Raoult D. Detection of Coxiella burnetii by DNA amplification using polymerase chain-reaction//J. Clin. Microbiol. - 1992. - V.30. - N.9. - P:2462-2466. .

228.Sting R., Westphal K. Purification of Coxiella burnetii antigen by gel-chromatography for use in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)//Z. Veterinarmed. Reihe B. - 1993. - 40. - P:690-696.

229.Stoker M. Serological evidence of Q-fever in Great Britain//Lancet. -1949.-256.- 178.

230.Stocker M., Fiset P. Phase variation of the Nine Mile and other strains of C.burnetii// Canad.J.Microbiol. - 1956. - 2 - P: 310.

231.Sulkin S.E., Pike R.M. Survey of laboratory - acguired infections//Am. J. Publ. Hlth., 1951.- 41.- P:769-781.

232.Thiele D., Willems H., Glas M. Immunoblot analysis of IGG subclass antibody - response against Coxiella burnetii in Balb/C Mice//Acta virol. - 1992. -36. - 1.-P:73-78.

233.Toman R., Skultety L., Kazar I. On the determination of "Kdo-like substance' in the lipopolysaccharide from Coxiella burnetii, strain Nine Mile in phase II//Acta virol. - 1993.- 37 (2-3). - 196-198.

234.Toman R., Skultety L. Analysis of the 3-Deoxy-D-Manno-2-Octulosonie acid region in a lipopolysaccharide isolated from Coxiella burnetii strain Nine Mile in phase II//Acta virol. - 1994. - 38 (4). - P:241-243.

235.Toman R., Sekeyova Z., Skultety L., Kovacova E. Chemical and immunological studies on lipopolysaccharides from various strain and isolates of Coxiella burnetii//Rickettsiae and Rickettsial diseases. - Bratislava: Veda, 1996. -P:435-440.

236.Toman R., Skultety L. Structural study on a lipopolysaccharide from Coxiella burnetii strain Nine Mile in avirulent phase II//Carbohydrate Research. -1996.-283.-P-.175-185.

237.Toman R., Skultety L., Kovacova E., Patoprsty V. Some characteristics of a smcoth type lipopolysaccharide of Chlamydia psittaci//Acta virol. - 1997. - 41 (1). - P:55-56.

238.Urvolgyi I., Brezina R. Сравнение различных антигенных препаратов Coxiella burnetii, используемых для обнаружения продукции антител у морских CBHHOKK>//Acta virol. - 1978. - 22. - Р:491-496.

239.Urvolgyi I. The effect of serial passage of Coxiella burnetii in chick embryos on pathogen phase variability//Tp. ин-та им. Пастера. - 1989. - 66. С. 154175.

240. Weiss Е, Rees H.B, Hayes I.R. Metabolie activity of purified suspensions of Rickettsia rickettsi//Nature. - 1967. - 213. - P: 1020-1022.

241.Weiss E, Dobson M.E, Dasch G.A. Биохимия риккетсий: последние домтиженияю/VActa virol. - 1987. - V.31. - P:271-286.

242.Willems H, Thiele D, Glas A.B. et al. Immunoblot technigue for Q fever//Eur. J. Epidemiol. - 1992. - 8 (1). - P: 103-107.

243.Willems H, Thiele D, Krauss H. Plasmid based differentiation and detection of Coxiella burnetii in clinical - samples//Eur. J. Epid. - 1993. - 9. - 4. -P:411-418.

244.Willems H, Thiele D, Frolichritter R, Krauss H. Detection of Coxiella burnetii in cows milk using the polymerase chain-reaktion (PCR)//J.Vet. Med. -1994. -41.-9. -P:580-587.

245.Williams I.S, Hoover T.A, Waag D.M., Banerjee-Bhatnagar N. et al. Antigenic structure of Coxiella burnetii. A comparison of lipopolysaccharide and protein antigens as vaccines against Q fever//Ann. N. Y. Acad. Sei. - 1990. - 590. -P:370-380.

246.Winkler H.U. Rickettsial permeability//J. Liol. Chem. - 1976. - 251. -P:389-396.

247.Wisseman C.L, Jackson E.B, Hahn F.E. Metabolic studies of Rickettsiae. I. The effects of antimicrobial substances and enzyme inhibitors on the oxidation of glutamate by purified Rickettsiae//J. Immunob. - 1951. - 67. - P:123-136.

248.Yamamoto T, Kawamura А, Нага H. et. al. Partial purification of Rickettsiae with a cation exchange resin. I Method of purification Japan//J. Exp. Med.- 1958.-28.-P-.329-336.

249.Yu X.J, Raoult D. Serotyping Coxiella burnetii isolates from acute and chronic Q-fever patients by using monoclonal -antibodies//FEMS Microb. Letter. -1994. - 117. - l.-P:15-19.

250.Zhang S, Zhang T, Du F. et. al. Isolation and purification of ribosomes of Coxiella burnetii//Zhonghua Weishengwuxue He Mianyixye Zazhi. - 1985. - 5 (5). -P:299-302.

251.Zierdt C.H. Прилипание бактерий, дрожжевых и кровяных клеток, а также латексных шариков к крупнопористым мембранным фильтрам//Арр1. Environ. Microbiol. - 1979. - 39. - P:1166-1172.

Выражаю свою искреннюю благодарность генеральному директору НПО «Биомед», профессору, доктору медицинских наук, академику РЭА и МАНЭБ Вениамину Филипповичу Петрову за предоставленную возможность выполнить на базе ПНИИВС НПО «Биомед» диссертационную работу, а также научное руководство и неоценимую помощь при оформлении работы.

Выражаю глубокую признательность заведующей лаборатории эндемических риккетсиозов НПО «Биомед», доктору медицинских наук Анне Николаевне Пантюхиной за научное руководство, ежедневную помощь в работе, ценные советы и труд по редактированию рукописи.

Благодарю заведующую лабораторией электронной микроскопии и радиоизотопных исследований ИЭГМ УрО РАН, кандидата биологических наук Надежду Станиславовну Чурилову за цроведение совместных исследований.

Благодарю начальника цеха риккетсиозно-диагностических препаратов, к.б.н. Александра Викторовича Тупицына и микробиологов цеха Наталью Михайловну Шандренко и Нину Анатольевну Ларинину за проведение этапа культивирования С.ЬитеШ и помощь в работе при освоении препарата в производстве НПО "Биомед".

Считаю своим долгом выразить признательность заведующему лабораторией биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, кандидату биологических наук Владимиру Павловичу Коробову за ценные практические советы и рекомендации.

Сердечно благодарю всех сотрудников лаборатории эндемических риккетсиозов НПО «Биомед» за помощь и участие в научных экспериментах.