Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Борзенко, Татьяна Владимировна

• Борзенко, Татьяна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Борзенко, Татьяна Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Иммунная система собак: основные понятия.

2.2. Иммуноглобулины и гуморальный иммунный ответ у собак.

2.3. Особенности иммунопрофилактики инфекционных болезней собак.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Экспериментальные животные.

3.2. Гематологические методы.

3.3. Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини.

3.4. Реакция непрямой гемагглютинации.

3.5. Реакция торможения гемагглютинации.

3.6. Реакция нейтрализации.

3.7. Иммуноферментные тест-системы.

3.8. Электрофорез в ПААГ-ДСН.

3.9. Иммуноблоттинг.

3.10.Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Отработка методов непрямого твердофазного ИФА для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак.

4.2. Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

4.2.1. Гематологические исследования экспериментальных животных.

4.2.2. Количественная характеристика иммуноглобулинов сыворотки крови вакцинированных собак.

4.2.3. Характеристика вирус-специфического гуморального иммунного ответа у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

4.2.3.1. Динамика содержания антител к вирусу чумы собак.

4.2.3.2. Динамика титра и оценка распределения

§М- и специфических антител в иммунном ответе к парвовирусу собак.

4.2.3.3. Динамика титра и оценка распределения IgM- и IgG-специфических антител в иммунном ответе к аденовирусам собак.

4.2.3.4. Корреляционный анализ результатов РИД и ИФА.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза»

В разработке методов диагностики и средств специфической профилактики болезней животных основополагающая роль принадлежит иммунологии - науке, изучающей механизмы формирования иммунного ответа, иммунологической памяти и межклеточной кооперации лимфоцитов и базирующейся на современных представлениях об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает взаимодействие антиген-антитело (J.E.Barlough and N.C.Pedersen, 1995; L J.Gershwin et al, 1995; N.T. Gorman, 1995; Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, 1998, 2000 и др.). При этом важную роль в оценке иммунологического состояния организма на различных этапах онто- и иммуногенеза, обусловленного процессами, возникающими в организме животных в ответ на иммуногены различной этиологии, играет анализ гуморальных факторов иммунного ответа.

Несмотря на то, что к настоящему времени опубликован ряд работ отечественных и зарубежных авторов, посвященных изучению иммунного статуса собак в норме и при патологи (О.А.Верховский с соавт. 1996, 1998; А.А.Лисицина, 1997; М.В.Даниловский, 2000; А.Д,Середа с соавт., 2000; М.В.Мезенцева с соавт., 2001; И.В.Чуваев, 2001; T.R.Phillips et al., 1989; T.Miyamoto et al., 1995; G.Mazza et al., 1994; P.B.Hill et al., 1995; A.Tipold et al., 2001; C.Leandro et al., 2001; A.Strasser et al., 1998, 2000, 2003; D.E.Mouzin et al., 2004 и др.) остаются неосвещенными многие вопросы, связанные с изучением структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов собак, изменением уровня иммуноглобулинов и изотип-специфических антител в процессе постинфекционного и поствакцинального иммуногенеза. Кроме того, отсутствие отечественных тест-систем, предназначенных для оценки характера иммунного ответа и иммунологического статуса собак, сдерживает научные исследования, направленные на разработку и эффективное применение средств иммунокоррекции и иммунопрофилактики.

В настоящее время это особенно актуально, поскольку насчитывается большое количество иммунобиологических препаратов, находящихся в производстве и используемых практической ветеринарной службой России. К ним относятся, прежде всего, отечественные и зарубежные вакцины против основных вирусных болезней собак, включающих чуму, парвовирусный энтерит, инфекционный гепатит и аденовироз. Эти болезни занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии собак, представляют наибольшую опасность и часто заканчиваются гибелью животных или оставляют в их организме длительные, а иногда и необратимые повреждения органов и тканей (В.И.Уласов, Л.В.Кириллов, 1999). В большинстве стран мира вакци-нопрофилактика является важнейшим звеном в системе мер борьбы и самым эффективным методом эпизоотического контроля за этими болезнями. Повсеместное применение вакцин накладывает жесткие требования к их производству и методам биологического контроля. Сложная этиологическая структура инфекционных болезней собак, широкое их распространение и необходимость вакцинации животных одновременно против нескольких наиболее распространенных болезней, обуславливают разработку и применение эффективных поливалентных вакцин, обеспечивающих формирование напряженного иммунитета (D.H.Davies, S.Pidford, 1991; J.A.Roth, 1991; R.D. Schultz, 1998; L.E.Carmichael, 1999 и др.). При этом необходимо решить сложные задачи по конструированию таких препаратов из антигенов различной природы, учитывая возможность их интерференции в организме животных в процессе иммуногенеза. Кроме того, создание поливалентных вакцин требует наличия методов контроля антигенных и иммуногенных свойств каждого компонента вакцины с использованием чувствительных и специфичных тест-систем. В этой связи анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-специфического распределения антител и количественного определения уровня иммуноглобулинов позволяет изучить динамику появления, нарастания и длительности сохранения поствакцинальных антител, что является основным показателем антигенной активности вакцины (А.В.Васильев, 2000; О.Ь.МсМШеп е1 а1., 1995; А.Рга1еШ (Л а\., 2000 и

ДР-)

Поэтому вопросы, связанные с разработкой и совершенствованием аналитических методов иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител, также как и с их использованием для изучения поствакцинального гуморального иммунного ответа у собак, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес, как в научном, так и в практическом аспектах. Результаты подобных исследований будут иметь не только прикладное значение, но и представлять значительный интерес для ветеринарной науки в целом, способствуя дальнейшему изучению инфекционных болезней и иммунной регуляции у собак.

Цель работы. Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Основные задачи исследований:

1. Отработать методику постановки, условий проведения и учета результатов реакции иммуноферментных тест-систем (ИФА), предназначенных для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу (СРУ-2) и аденовирусам собак (САУ-1 и САУ-2) в сыворотке крови животных.

2. Провести сравнительное изучение диагностической ценности традиционных серологических методов и отработанных тест-систем на основе непрямого твердофазного ИФА при оценке антигенной активности вирусных антигенов, входящих в состав отечественных поливалентных вакцин, используемых для профилактики инфекционных болезней собак.

3. Изучить динамику формирования В- клеточного иммунного ответа у щенков, вакцинированных отечественными биопрепаратами. Для этого провести исследования, направленные на оценку изотип-специфического распределения антител и количественное определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

4. Изучить взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов и титром противовирусных специфических антител соответствующего изотипа в сыворотке крови иммунных щенков.

Научная новизна работы.

Отработаны чувствительные и специфичные методы непрямого твердофазного ИФА, предназначенные для выявления IgG- и IgM- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных. С использованием разноплановых методов (РИД, ИФА, РН, РНГА, РТГА, гематологические методы) впервые проведены комплексные исследования по изучению динамики формирования иммунного ответа на вирусные антигены различной природы. Получены новые данные о количественных изменениях IgG, IgM, IgA и динамике титров вирусспецифических IgG-и IgM- антител в сыворотке крови подопытных щенков на отдельных этапах поствакцинального иммуногенеза.

Впервые проведены сравнительные исследования и установлена высокая корреляционная связь между концентрацией IgG, IgM и титром противовирусных IgG-, IgM- специфических антител в сыворотке крови иммунных щенков.

На основании сравнительных исследований подтверждены некоторые закономерности изменений гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак и показана ведущая роль IgG и вирусспецифических IgG-ан-тител в процессе формирования поствакцинального иммунного ответа.

Практическая значимость исследований.

Методы непрямого твердофазного ИФА целесообразно использовать для оценки напряженности иммунитета, определения содержания материнских антител у щенков с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин. Кроме того, данные тест-системы могут служить дополнительным методом исследований в системе комплексной диагностики парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у собак. Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по отработке ИФА для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак;

• результаты комплексных исследований по изучению динамики формирования гуморального иммунного ответа у щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• Научно- практической конференции «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии», Краснодар, 2001;

• IV региональной конференции посвященной проблемам профилактики и лечения домашних животных и птицы, Владимир, 2001;

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005. Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений,-списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 8 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 140 источников (30 отечественных и 110 зарубежных авторов).

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Борзенко, Татьяна Владимировна

6. выводы

1. Отработаны методы непрямого твердофазного ИФА, предназначенные для выявления и 1§М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных. Получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что ИФА является высокочувствительным, специфичным, информативным и воспроизводимым методом определения вирус-специфических антител определенного изотипа.

2. Впервые проведены комплексные исследования с использованием РИД, ИФА, традиционных гематологических и серологических методов и установлены закономерности в развитии поствакцинального гуморального иммунного ответа у щенков, вакцинированных отечественными поливалентными вакцинами, предназначенными для профилактики чумы, парвовирус-ного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак. Показано, что используемые вакцины не обладают иммуносупрессивным действием и могут применяться для массовой вакцинопрофилактики. Во всех случаях установлены статистически достоверные различия между уровнем антител у щенков до и после применения препаратов (Р < 0,001).

3. В опытах по определению специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РТГА г= 0,77; 0,9 и 0,79 соответственно).

4. Дана количественная характеристика 1§0,1§М, ^А в сыворотке крови подопытных животных и установлено, что концентрация была максимальной на 10-е сутки после первой вакцинации (3,47 ± 0,21 мг/мл), а и 1§А - на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины (9,70 ± 0,50 и 0,66 ± 0,12 мг/мл соответственно). Показано, что одно- и двукратная вакцинация двухмесячных щенков отечественными поливалентными препаратами приводила к значительному повышению уровня сывороточного

5. В экспериментальных исследованиях изучена динамика и определены сроки повышения и максимального содержания 1§0- и ^М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза. Установлено, что в ранние сроки первичного иммунного ответа (4 - 10-е сутки) достоверно возрастает содержание вирус-специфических антител 1§М- изотипа. После второй вакцинации и ревакцинации щенков в 6-ти месячном возрасте их роль в гуморальном иммунном ответе является незначительной. Установлено закономерное нарастание титров вирусспецифических ^в-антител после каждой инъекции вакцин и их ведущее значение в поствакцинальном иммуногенезе.

6. Установлена высокая корреляционная связь между концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови иммунных щенков и титром противовирусных специфических антител соответствующего изотипа. Так у подопытных животных установлена положительная корреляция результатов между количественным содержанием и титром специфических антител к парвовирусу собак (г = 0,9, Р < 0,05), аденовирусу первого (г = 0,6, Р < 0,05) и второго (г = 0,76, Р < 0,05) серотипов. Аналогичная высокая корреляционная связь установлена между количественным уровнем 1§М и титром ^М-специфических антител к СРУ-2 (г = 0,87, Р < 0,05), САУ-1 (г = 0,69, Р < 0,05) и САУ-2 (г = 0,75, Р < 0,05) соответственно.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Тест-системы на основе непрямого твердофазного ИФА могут быть рекомендованы в качестве методов оценки иммунного статуса, контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин, а также в качестве дополнительных методов диагностики парвови-русного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Всестороннее изучение формирования гуморального иммунного ответа у млекопитающих (в т.ч. и собак) и птиц в процессе постинфекционного и поствакцинального иммуногенеза является важным направлением ветеринарной иммунологии. Поскольку иммуноглобулины являются важнейшей составной частью гуморальной иммунной системы, то их количественный анализ и оценка распределения антител, относящихся к их основным изотипам, дают важную информацию об иммунологическом состоянии организма на различных этапах иммуногенеза. Многие вопросы специфической профилактики, диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний невозможно решать без глубокого знания природы и функциональных свойств иммуноглобулинов каждого изотипа, динамики их изменений в норме и в процессе иммуногенеза и той роли, которую они играют в иммунном ответе.

Несмотря на то, что имеются работы отечественных и зарубежных авторов, посвященные изучению иммунного статуса собак, до настоящего времени остаются неосвещенными многие вопросы, связанные с изучением структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных данного вида, изменением уровня иммуноглобулинов и изотип-специфических антител в норме и в процессе иммуногенеза.

Решение проблемы, связанной с изучением природы и функций иммуноглобулинов различных изотипов, обнаруженных в иммунной системе собак, представляет глобальный интерес не только для фундаментальной ветеринарной иммунологии, но также способствует дальнейшему изучению инфекционных болезней, разработке и совершенствованию методов иммунодиагностики, поиску и применению средств иммунокоррекции и иммунопрофилактики животных (ЬЛ.ОегзЬлут е1 а1, 1995; Ы.Т.Оогшап, 1995; ГЯ.'Пгагс!, 2003 и др.).

Для проведения подобных исследований необходимы высокоспецифические реагенты на основе поли- и моноклон ал ьных антител к отдельным классам иммуноглобулинов, которые позволяют не только выявлять, но и количественно определять содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови и распределение специфических антител по отдельным изотипам Ig's. Наличие таких реагентов и очищенных антигенов способствует разработке и совершенствованию разноплановых диагностических тест-систем, предназначенных для оценки состояния гуморального звена иммунитета, что имеет не только прикладное значение, но и представляет значительный интерес для ветеринарной науки в целом, способствуя дальнейшему изучению инфекционных болезней и иммунной регуляции у животных.

В настоящее время в клинико-лабораторных исследованиях помимо традиционных серологических тестов (РН, РНГА, РТГА и др.), направленных на выявление вирусспецифических антител, большое практическое значение приобрел метод ИФА (В.Н.Сазонкин, В.И.Уласов, 1995; G.Mazza et al. 1994; T.Gemma et al. 1996; R.D.Jones et al., 2000; C.Leandro et al., 2001; T.Waner et al. 1998, 2003 и др.). За рубежом уже появились коммерческие ИФА-наборы, предназначенные для обнаружения IgG- и IgM- специфических антител к вирусу чумы и парвовирусу собак (фирмы Biogal Galed Labs., Израиль; Ingenaza, Испания и др.).

В результате проведенной ранее работы, в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ были получены и охарактеризованы моноспецифические реагенты к иммуноглобулинам собак. Опытным путем была показана принципиальная возможность их использования в тест-системах на основе РИД и ИФА для оценки распределения и количественного анализа изотипов иммуноглобулинов и определения уровня изотип- специфических антител к вирусным антигенам в иммунном ответе (А.А.Лисицина, 1997; О.А.Верхов-ский, 1998).

В связи с этим основной целью нашей работы был анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-специфического распределения антител и количественного определения уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови собак в процессе поствакцинального иммуногенеза после применения отечественных биопрепаратов. Кроме того, эти исследования определяли возможность использования методов ИФА для характеристики антигенных свойств вирусных компонентов, входящих в состав вакцинных препаратов использовавшихся в наших опытах и широко распространенных на ветеринарном рынке России.

Исходя из этого, на первом этапе нашей работы решались следующие основные задачи: отработка методов получения и идентификации вирусных антигенов, характеристика поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам собак и отработка на их основе методов РИД и ИФА для количественного и качественного анализа изотипов ^'э. Методологической основой служил опыт отечественных и зарубежных исследователей в этой области (О.А.УегкЬоУБку е1 а1., 1996; В.В.Вахромеева, 2000; Б-А^сив ег а1., 1985; Р.ЬЛЧага а1., 1983; Ь.А.Наггеш^еп е1 а1., 1997; Т.\\Ъпег & а1., 1998, 2003 и ДР-)

При отработке иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления и 1§М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных, были использованы соответствующие вирусные антигены, полученные с помощью ультрацентрифугирования в линейном градиенте плотности 1,32 - 1,45 г/л СбС1 или после очистки методами гидрофобной и анионообменной хроматографии. Идентификацию и определение антигенной активности полученных и используемых в ИФА препаратов проводили методом электрофореза в ПААГ-ДСН с последующим иммуноблоттингом с использованием соответствующих контрольных сывороток и ранее полученных моноклональных антител. В качестве конъюгатов были использованы моноспецифическая антисыворотка к и монокло-нальные антитела к ^М собак, меченные пероксидазой хрена, обладающие высокой степенью аффинности и сохраняющие свои иммунобиологические свойства после перйодатного окисления. Результаты проведенных исследований показали, что полученные конъюгаты строго моноспецифичны по отношению к и 1§М соответственно и не обладают перекрестной активностью по отношению к другим изотипам иммуноглобулинов собак. При отработке условий постановки ИФА были установлены рабочие разведения им-мунопероксидазных конъюгатов (анти- собаки - 1:2000 и анти- 1§М собаки - 1:500) и концентрации каждого вирусного антигена, составляющие 2 мкг/мл для СРУ-2 и 1 мкг/мл для САУ-1 и САУ-2. Далее были подобраны условия сорбции основных иммунологических реагентов при постановке ИФА. Так для сенсибилизации вирусных антигенов в лунках полистироловых микропанелей был использован 0,05 М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6, для разведения испытуемых проб и конъюгатов был выбран стандартный фосфатно-буферный раствор, в качестве промывочного буфера использовался этот же буфер, содержащий 0,05% твина-20. В качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика, был выбран ФБРТ, содержащий 2% БСА.

Для характеристики отработанных тест-систем были исследованы сыворотки крови собак (п=81) с определенным титром специфических антител в РТГА и известным анамнезом. Анализ результатов исследований по выявлению ^в-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в испытуемых пробах с помощью ИФА и вирус-специфических антител в РТГА свидетельствует о том, что в большинстве случаев наблюдалось совпадение в интерпретации результатов ИФА и РТГА. Так, все РТГА- положительные пробы (п=69) были положительными и в ИФА, а из 12 РТГА- отрицательных проб в ИФА 3 пробы были положительными на СРУ-2 и в двух пробах присутствовали антитела к аденовирусам собак обоих серотипов.

Для количественного определения уровня иммуноглобулинов трех основных изотипов в испытуемых сыворотках крови был отработан метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (С.Мапсни е1 а1., 1965) с использованием моноспецифических антисывороток к и к ^А и МкА 1Г4 к ^М собак. Опытным путем были установлены оптимальные разведения моноспецифической антисыворотки к собак -1:30, моноспецифической антисыворотки к ^А собак - 1:20 и концентрация моноклональных антител 1Г4 — 4 мкг/мл. Для определения концентрации и ^М объем вносимой пробы в агарозный гель составлял 1 мкл/ лунку и для определения концентрации ^А - 2 мкл/лунку. При постановке РИД в качестве стандартных препаратов были использованы иммунохимически чистые препараты ^М и ^А собак полученные и охарактеризованные ранее в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ (О.А.Верховский, 1998).

Таким образом, в результате проведения первого этапа нашей работы была отработаны методики постановки ИФА по обнаружению ^О- и ^М-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак и РИД для определения концентрации 1§М и 1§А в сыворотке крови животных. Эффективность использования аналогичных методов при изучении иммунной системы собак в норме и после экспериментального заражения и/или воздействия биопрепаратов была продемонстрирована в ряде работ зарубежных исследователей (Р.Ь.Ыага е1 а1., 1983; Т.Я.РЫШрз & а1., 1989; Ь.А.НаггепБ^еп е1 а1., 1997; Я-О.-Гопез ег а1., 2000; А.Т1роМ е1 а1., 2001; M.E.Griot-Wenk е1 а1., 2001; Т.8ота а1., 2003; H.HogenEsch & а1., 2002, 2004 и др.).

Поскольку отработанные тест-системы на основе РИД и ИФА предназначены для количественного и качественного анализа изотипов иммуноглобулинов собак, наши основные эксперименты были посвящены характеристике В-системы иммунитета у щенков в процессе иммуногенеза, обусловленного воздействием отечественных поливалентных вакцин применяемых для профилактики инфекционных болезней.

В качестве опытных моделей было использовано 20 двухмесячных беспородных щенков и помесей, сформированных в группы по принципу аналогов и иммунизированных отечественными поливалентными вакцинами, содержащими в своем составе аттенуированный вирус чумы и инактивирован-ные возбудители парвовирусного энтерита, аденовироза и лептоспироза собак. Для проведения исследований использовали цельную кровь и сыворотки крови щенков, полученные на 0, 4, 7, 10, 14, 21-е сутки после первичной вакцинации и на 5, 9, 14 и 21-е сутки после вторичной. У пяти ревакцинированных через 4 месяца щенков, кровь была взята непосредственно перед инъекцией вакцины, далее на 3-е, 7-е и 14-е сутки п.и. соответственно.

Анализ гематологических показателей подопытных животных позволил установить, что вакцинация отечественными препаратами не вызывала нарушений в иммунной системе щенков и они оставались клинически здоровыми в течение всего эксперимента. После первой вакцинации было отмечено достоверное увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов, после второй и третьей - их содержание достоверно не изменялось. При этом было показано, что в процессе поствакцинального иммуногенеза средние значения содержания лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов в периферической крови оставалось практически без изменений.

По результатам проведенных опытов было установлено, что содержание 1§М и ^А в сыворотке крови щенков до опыта составляло 5,35 ± 0,52, 1,68 ± 0,24 и 0,40 ± 0,06 мг/мл соответственно, что сопоставимо с данными отечественных и зарубежных исследователей, определивших средние величины количественного содержания сывороточных иммуноглобулинов у собак аналогичного возраста (К.М.БсЬшайгшап, 1984; Я.М.Ье^чз и С.А.Рюи!:, 1989; О.А.Верховский, 1998; Ю.Н.Федоров с соавт., 2000 и др.). При этом первичный, вторичный и третичный поствакцинальный иммунный ответ у щенков приводил к изменению иммуноглобулинового профиля в крови животных.

Так, первичный иммунный ответ характеризовался достоверным увеличением общего количества 1§М и 1§А, пик которых зарегистрирован на 10-е сутки п.и. При вторичном иммунном ответе в сыворотке крови иммунных щенков не происходило достоверных изменений концентраций иммуноглобулинов данных изотипов. После ревакцинации щенков было отмечено увеличение содержания иммуноглобулинов данных изотипов, однако эти изменения не являлись статистически достоверными и лишь отражали динамику формирования иммунного ответа.

Анализ полученных результатов показал, что наблюдалась выраженная зависимость содержания 1§0 от сроков формирования поствакцинального иммунного ответа. Так его концентрация в сыворотке крови подопытных щенков достоверно увеличилась на 14-21-е сутки после первой вакцинации и достигла максимальных значений (9,70 ± 0,50 мг/мл) на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины. Через 4 месяца уровень незначительно снизился, а к 14-м суткам после проведения ревакцинации вновь увеличился до 9,12 ± 0,31 мг/мл (срок наблюдения).

Результаты наших исследований по определению концентрации 1§М и 1§А в сыворотке крови двухмесячных щенков показали, что в поствакцинальный иммуногенез вовлечены иммуноглобулины всех трех изотипов, при этом ведущую роль в количественном отношении играет

Подобные исследования на щенках ранее не проводились, однако, есть результаты, опубликованные А.Зйгаззег с соавт. (2003), свидетельствующие о том, что вакцинация собак приводила к повышению концентрации 1§С и усилению гемолитической активности комплемента. В опытах, проведенных H.HogenEsch с соавт. (2002, 2004), вакцинация взрослых собак (старше 2-х летнего возраста) приводила к увеличению содержания в сыворотке крови только ^Е.

Повсеместное использование вакцин в качестве основного звена в системе мер борьбы против инфекционных болезней собак предопределяет разработку и совершенствование методов оценки их иммунологической эффективности, напряженности иммунитета и осуществления иммунологического мониторинга. Поэтому, исходя из цели и задач нашей работы, заключительная часть исследований была посвящена определению динамики титров антител к СБУ, СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 с помощью традиционных серологических тестов и определению динамики содержания ^М- и специфических антител к СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 в ИФА в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства подопытных двухмесячных щенков в сыворотке крови были обнаружены антитела ко всем вирусам, выявляемые как в ИФА, так и в РНГА, РН и РТГА. Однако их уровень не достигал необходимого протективного значения, обеспечивающего защиту от вирулентного возбудителя. После проведения первой и второй вакцинации у всех исследованных животных формировался выраженный гуморальный иммунный ответ. Было установлено, что во всех случаях специфические антитела к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов являлись доминирующим изотипом антител, как при первичном, так и при последующих иммунных ответах (вторичном и третичном). При этом максимальный титр ^О- антител к СРУ-2 был установлен на 21-е сутки после первой вакцинации, на 14-21-е сутки после второй и на 14-е сутки после третьей. Поствакцинальный гуморальный иммунный ответ к САУ-1 и САУ-2 характеризовался достоверным увеличением содержания ^О- антител на 10-е сутки после первой вакцинации, на 9 — 14-е сутки после второй и на 7 - 14-е сутки после третьей.

Во всех экспериментах достоверное увеличение содержания вирусспе-цифических 1§М- антител происходило только на ранней стадии первичного иммунного ответа. При этом максимальный титр антител данного изотипа к СРУ-2 установлен на 10-е сутки, к САУ-1 - на 7-е сутки и к САУ-2 - на 7-10-е сутки после первой вакцинации.

Наши результаты по изучению первичного иммунного ответа в значительной степени совпадают с результатами Т.\\/апег с соавт. (2003), которые изучали динамику содержания 1§С- и 1§М- специфических антител к СБУ и СРУ-2 в сыворотке крови 10 щенков, однократно иммунизированных поливалентной вакциной. По их данным, полученным с помощью дот- ИФА, высокий уровень ^М-антител к СРУ-2 был зафиксирован на 7-е сутки, а антител аналогичной специфичности - на 9-е сутки после вакцинации. При этом ^М-антитела к СБУ были обнаружены в высоком титре на 9-е сутки п.и., и затем достигали своего максимального значения на 12-е сутки п.и. антитела к СБУ были выявлены в сыворотке крови подопытных щенков на 9-е сутки после вакцинации.

Во всех случаях результаты ИФА сопровождались результатами традиционных серологических тестов, также свидетельствовавших о формировании поствакцинального гуморального иммунного ответа у щенков. Во всех случаях установлена статистически достоверные различия между уровнем антител у животных до и после вакцинации (Р < 0,01). Высокая положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РТГА, была установлена при определении титра антител к СРУ-2 (г=0,77, Р < 0,05), САУ-1 (г=0,9, Р < 0,05) и САУ-2 (г=0,79, Р < 0,05).

Результаты наших экспериментов по определению специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов методами ИФА и РТГА, показавшие положительную корреляцию результатов, полученных с помощью этих двух методов, сопоставимы с результатами исследований проведенных ранее зарубежными авторами. Так З.А.Пвсш с со-авт. (1985) предложили конкурентный вариант ИФА с использованием моно-клональных антител для выявления антител к парвовирусу собак. Авторы установили высокую степень корреляции результатов, полученных с помощью ИФА, РН и РТГА. В их опытах в ИФА отрицательными оказались 87,9% сывороток крови, имеющих титры < 1:4 в РН и 1:10 в РТГА, положительными в ИФА были 94,4% сывороток с титрами > 1:64 в РН и 1:80 в РТГА. На основе полученных данных авторы рекомендовали ИФА для мониторинговых исследований щенков, направленных на обнаружение материнских антител к парвовирусу и определения сероконверсии у собак после вакцинации.

В заключение нами впервые был проведен корреляционный анализ динамики содержания общего количества иммуноглобулинов в- и М- изотипов и титров и 1§М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в процессе формирования поствакцинального противовирусного гуморального иммунного ответа у щенков. Установлена высокая корреляционная связь между количественным уровнем 1§0, определенным в РИД, и титром

-специфических антител к СРУ-2 (г = 0,9, Р < 0,05), к САУ-2 (г = 0,76, Р < 0,05) и к САУ-1 (г = 0,6, Р < 0,05) определенными в ИФА. Аналогичные данные были получены при вычислении корреляционной связи между содержанием 1§М и титром вирусспецифических ^М- антител. При этом цифровые значения коэффициента корреляции составили в системе концентрация ^М / титр ^М-специфических антител к СРУ-2 - 0,87, концентрация ^М / титр 1§М-специфических антител к САУ-2 — 0,75 и концентрация ^М / титр ^М-специфических антител к САУ-1 - 0,69.

Таким образом, суммируя весь изложенный в настоящей работе материал, можно сделать общее заключение о том, что в результате проведенных исследований дана оценка эффективности и показана принципиальная возможность использования разработанных тест-систем на основе непрямого твердофазного ИФА для определения уровня изотип-специфических антител к антигенам СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 в сыворотке крови щенков. С их помощью можно проводить сравнительный анализ и достоверную оценку иммунологических процессов, возникающих в организме собак в ответ на имму-ногены разной природы.

Методами ИФА и РИД изучена динамика содержания вирус-специфических и 1§М- антител и количественных изменений трех основных изотипов иммуноглобулинов в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Результаты данных исследований имеют важное значение, как для фундаментальной ветеринарной иммунологии, так и в прикладных аспектах. В частности, данные методы могут быть использованы для изучения действия различных биопрепаратов на иммунную систему собак, при проверке антигенных свойств соответствующих вирусных компонентов, входящих в состав поливалентных вакцин, применяемых в нашей стране для специфической профилактики инфекционных болезней собак. При этом использование разработанных тест-систем, предназначенных для оценки состояния гуморального звена иммунитета, будет способствовать дальнейшему изучению инфекционных болезней плотоядных и иммунной регуляции у собак.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Борзенко, Татьяна Владимировна, 2005 год

1. Васильев A.B. Разработка и совершенствование экспресс-методов для серодиагностики вирусных инфекций животных. Дисс.докт. биол. наук, М., 2000, 51 с.

2. Вахромеева В.В. Антигенная структура и анализ межштаммовых различий парвовирусов плотоядных. Автореф. дисс.канд. биол. наук, Покров, 2000, 29 с.

3. Верховская JI.B. Изучение антигенов аденовирусов и разработка иммуноферментной диагностики аденовирусных инфекций сельскохозяйственных животных. Дисс.канд. биол. наук, М., 1992, 152 с.

4. Верховский О.А, А.А.Лисицина, Ю.Н.Федоров. Количественная характеристика иммуноглобулинов сыворотки крови собак в норме и при патологии // Сельскохозяйственная биология, 1996, 4, с. 103-109.

5. Верховский O.A., Ю.Н.Федоров, А.А.Лисицина, Т.Ю.Клюева. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови собак при демодекозе и дерматитах//Ветеринария, 1998,6, с.33-38.

6. Даниловский М.В. Лечение чумы и парвовирусного энтерита плотоядных химиопрепаратами и иммуностимуляторами. Автореф. дисс.канд. вет. наук, Ульяновск, 2000, 19 с.

7. Захарова Е.Д. Серологическая диагностика инфекционного гепатита собак. Автореф. дисс.канд. вет. наук, М., 1993, 20 с.

8. Захарова Е.Д., О.А.Верховский, В.И.Уласов. Антигенные свойства штаммов аденовирусов собак // Сборник научн. трудов ВГНКИ, 1995, т.57, с.28-36.

9. Захарова Е.Д., В.И.Уласов. Диагностика и профилактика аденовирусных инфекций у собак // Сборник докладов Биологического научно-практического центра «Чин», Санкт-Петербург, 1995, с.36-43.

10. Захарова Е.Д., В.И.Уласов, Ю.И.Могильный, О.А.Верховский, Л.А.Дудников, И.И.Розанова, В.Г.Чулкова. Лабораторная диагностика аденовирусных инфекций собак // Тез. докл. Межд. конф., посвящ. 80-летию МГАВМиБ, М., 1999, с.200-201.

11. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии // Под ред. И.П.Кондрахина и др.- М., Агропромиздат, 1985, 57-61.

12. Лисицина A.A. Биохимические и иммунологические показатели сыворотки крови собак при демодекозе. Дисс.канд. биол. наук, М., 1997, 149 с.

13. Мезенцева М.В., О.В.Калинчук, А.Н.Наровлянский, Ф.И.Ершов, В.А.Бурлаков. Интерфероновый статус при трансмиссивной венерической саркоме у собак. // Ветеринария, 2001, №3, с.53-55.

14. Петров Р.В. Иммунология.//М., Медицина, 1982, 368 с.

15. Сергеев В.А. Вирусные вакцины // Киев: Урожай, 1993. 368 с.

16. Середа А.Д., И.В.Ногина, К.Е.Гаврилов, Л.Г.Фугина. Иммунный статус у больных и вакцинированных против чумы собак // Тезисы докл. Всероссийской науч.-практ. конф-ции, Щелково, 2000, 233-235.

17. Слугин B.C. Совершенствование профилактики инфекционных болезней пушных зверей. // Ветеринария, 2003, №7, с.3-6.

18. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных //М., ВНИТИБП, 1998. 928 с.

19. Уиллард М., Тведтен Г., Торнвальд Г. Лабораторная диагностика в клинике мелких домашних животных. Пер. с англ. // М., Аквариум, 2004.

20. Уласов В.И., Кириллов Л.В. Проблемы вакцинопрофилактики плотоядных // Сборник мат. научной сессии Россельхозакадемии «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России»,'М., 1999, т. И, с.293-295.

21. Уласов В.И., Т.Л.Черниченко, Э.И.Элизбарашвили. Эпизоотология вирусного энтерита норок. // Ветеринария, 2004, №8, с.25-28.

22. Федоров Ю.Н., О.А.Верховский, И.В.Слугин. Основы иммунологии и иммунопатологии собак // М., Изд.-инф. центр ООО «Информ-12», 2000,248 с.

23. Федоров Ю.Н., О.А.Верховский. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии // Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с. 114-124.

24. Чуваев И.В. Развитие колострального иммунитета против чумы плотоядных (у собак). // Мат-лы IV региональной конф-ции «Золотое кольцо России», посвящ. Проблемам профил-ки и леч-я домашних жив-х и птиц, Владимир, 2001, с.20-21.

25. Agbandje M., Parrish C.R., Rossmann M.G. The recognition of parvovirus capsids by antibodies. Seminars in Virology, 1995, 6(4), 219-231.

26. Appel, M. J. G., Pearce-Kelling, S. & Summers, B. A. 1992. Dog lymphocyte cultures facilitate the isolation and growth of virulent canine distemper virus. J. Vet. Diagn. Invest. 4, 258-263.

27. Barlough J.E. and Pedersen N.C.- The immune system and disorders. In: Book of dogs. Ed. M.Siegal. Herper Collins Publishers., 1995, 321- 337.

28. Binn, L.N., Marchwicki, R.H., Stephenson, E.H., 1980. Establishment of a canine cell line: derivation, characterization, and viral spectrum. Am. J. Vet. Res., 41: 855-860.

29. Blixenkrone-M0ller, M., Svansson, V., Have, P., Orvell, C., Appel, M., Pedersen, I. R., Dietz, H. H. & Henriksen, P. 1993. Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population. Vet. Microbiol., 37, 163-173.

30. Bohm M, Thompson H, Weir A, Hasted AM, Maxwell NS, Heritage ME. Serum antibody titres to canine parvovirus, adenovirus and distemper virus in dogs in the UK, which had not been vaccinated for at least three years. Vet. Rec., 2004, 154 (15): 457-63.

31. Brenner, J., Markus, R., Klopfer-Orgad, U., Trainin, Z., 1989. The possible enhancement of parvovirus vaccination on the mortality rate of diseased dogs. J.: Vet. Med., 36: 547-550.

32. Buonavoglia C, Tollis M, Buonavoglia D, Puccini A. Response of pups with maternal derived antibody to modified-live canine parvovirus vaccine. -Vet. Rec., 1986, 118(14): 385-7.

33. Campbell K.L. and Felsburg P.J.- IgA deficiency and skin disease. In: R.W.Krik (Ed.), Current Veterinary Therapy XI: Small Animal Practice.-W.B.Saunders, PA, 1992, 528-531.

34. Carmichael LE. Canine viral vaccines at a turning point- a personal perspective. Adv. Vet. Med., 1999, 41: 289-307.

35. Chang, S.-F., J.-Y. Sgro, and C. R. Parrish. 1992. Multiple amino acids in the capsid structure of canine parvovirus coordinately determine the canine host range and specific antigenic and hemagglutination properties. J. Virol., 66, 6858-6867.

36. Chapman MS, Rossmann MG. Structure, sequence, and function correlations among parvoviruses. Virology, 1993,194(2): 491-508.

37. Curran, M. D., Clarke, D. K. & Rima, B. K. 1991. The nucleotide sequence of the gene encoding the attachment protein H of canine distemper virus. -J. Gen. Virol., 72,443-447.

38. Curran, M. D., O'Loan, D., Kennedy, S. & Rima, B. K. 1992. Molecular characterization of phocine distemper virus: gene order and sequence of the gene encoding the attachment (H) protein. J. Gen. Virol., 73, 1189-1194.

39. Davies, D.H., Pidford, S., 1991. Vaccination of dogs with multi-component vaccines. Austral. Vet. J., 68: 183-184.

40. Day M. Mechanisms of immune-mediated disease in small animals. -In Practice, 1998,20 (2), 75-86.

41. Dhein, C.R., Gorham, J.R., 1986. Host response to vaccination. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract., 16: 1227-1245.

42. Diallo, A. 1990. Morbillivirus group: genome organization and proteins. Vet. Microbiol., 23,155-163.

43. Fiscus SA, Mildbrand MM, Gordon JC, Teramoto YA, Winston S. Rapid enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to canine parvovirus. Am. J. Vet. Res., 1985, 46(4): 859-63.

44. Foley, J.E., Orgad, U., Hirsh, D.C., Poland, A., Pedersen, N.C., 1999. Outbreak of fatal salmonellosis in cats following use of a high-titer modified-live panleukopenia virus vaccine. J. Am. Vet. Med. Ass., 214: 67-70.

45. Frick, O.L., Brooks, D.L., 1983. Immunoglobulin E antibodies to pollens augmented in dogs by virus vaccines. Am. J. Vet. Res., 44: 440-445.

46. Friedlander, J. M., Summers, B. A. & Appel, M. J. G. 1985. Persistence of virulent canine distemper virus in lymphoblastoid cell lines. Arch. Virol., 86,47-62.

47. Geissler K, CR Parrish, W Hermanns, and G Siegl. No evidence for a role of modified live virus vaccines in the emergence of canine parvovirus J. Gen. Virol., 1998, 79: 1153-1158.

48. Gemma, T., Iwatsuki, K., Shin, Y.-S., Yoshida, E., Kai, C. & Mikami, T. 1996b. Serological analysis of canine distemper virus using an immunocapture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Vet. Med.Sci., 58, 791-794.

49. Gemma, T., Miyashita, N., Shin, Y.-S., Okita, M., Mori, T., Iwatsuki, K., Mikami, T. & Kai, C. 1995. Serological survey of canine distemper virus infection using enzyme-linked immunosorbent assay. J. Vet. Med. Sei., 57, 761-763.

50. Gemma, T., Watari, T., Akiyama, K., Miyashita, N., Shin, Y.-S., Iwatsuki, K., Kai, C. & Mikami, T. 1996a. Epidemiological observations on recent outbreaks of canine distemper in Tokyo area. J. Vet. Med. Sei., 58, 547-550.

51. Gershwin L.J., Rrakowka S., Olsen R.G.- Immunology and Im-munopathology of Domestic Animals.-Mosby, St.Louis/ Baltimore/ Boston/ Chicago/London/Madrid/Philadelphia/ Sydney/Toronto, 1995, 195p.

52. Gorman N.T.- Immunology. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Eds. S.J.Ettinger and E.C.Feldman. W.B. Saunders Co., Philadelphia/ London/ Toronto/ Montreal/ Sydney/Tokyo, 1995, vol.2, 1978.

53. Gösset, K.A., MacWilliams, P.S., Enright, F.M., Cleghorn, B., 1983/84. In vitro function of canine neutrophils during experimental inflammatory disease. Vet. Immunol. Immunopathol,, 5: 151-159.

54. Haas, L., Hofer, H., East, M., Wohlsein, P., Liess, B. & Barrett, T. 1996. Canine distemper virus infection in Serengeti spotted hyaenas. Vet. Microbiol., 49, 147-152.

55. Halliwell R.E.W. and Gorman N.T.- Veterinary Clinical Immunology.- W.B.Saunders Company, Philadelphia /London/ Toronto/ Montreal/ Sydney/ Tokyo, 1989, 449-466.

56. Harder, T. C., Kenter, M., Appel, M. J. G., Roelke-Parker, M. E., Barrett, T. & Osterhaus, A. D. M. E. 1995. Phylogenetic evidence of canine distemper virus in Serengeti's lions. Vaccine, 13, 521-523.

57. Harrenstien LA, Munson L, Ramsay EC, Lucash CF, Kania SA, Pot-gieter LN. Antibody responses of red wolves to canine distemper virus and canine parvovirus vaccination. J. Wildl. Dis., 1997, 33(3): 600-5.

58. Hill P.B., Moriello K.A., DeBoer D.J.- Concentration of total serum IgE, IgA, and IgG in atopic and parasitized dogs. Vet.Immunol.Immunopathol., 1995,44, 105-113.

59. Hirayama, N., Senda, M., Nakashima, N., Takagi, M., Sugiyama, M., Yoshikawa, Y. & Yamanouchi, K. 1991. Protective effects of monoclonal antibodies against lethal canine distemper virus infection in mice. J.Gen.Virol., 56, 28272830.

60. HogenEsch H, Dunham AD, Scott-Moncrieff C, Glickman LT, De-Boer DJ. Effect of vaccination on serum concentrations of total and antigen-specific immunoglobulin E in dogs. Am. J. Vet. Res., 2002, 63 (4): 611-6.

61. HogenEsch H, Thompson S, Dunham A, Ceddia M. and Hayek M. Effect of age on immune parameters and the immune response of dogs to vaccines: a cross-sectional study. Vet.Immunol.Immunopathol., 2004, 97, 77-85.

62. Iwatsuki, K., Okita, M., Ochikubo, F., Gemma, T., Shin, Y.-S., Miya-shita, N., Mikami, T. & Kai, C. 1995. Immunohistochemical analysis of the lymphoid organs of dogs naturally infected with canine distemper virus. J. Compar. Pathol., 113, 185-190.

63. Janeway C.A., Travers P, Walport M., Capra D.J. Immunobiology. The Immune System in Health and Disease.- Current Biology Ltd/Churchill Livingstone/Garland Publishing Inc., 1999, 63 5p.

64. Jayakumar, R., Ramadass, P., 1990. Studies on cell-mediated immune response to rabies virus immunization in dogs. Vaccine, 8: 304-305.

65. Jayakumar, R., Ramadass, P., 1991. Immunoglobulin response to rabies virus immunization in dogs. Vaccine, 9: 611-612.

66. Jones RD, Offutt DM, Longmoor. Capture ELISA and flow cytometry methods for toxicologic assessment following immunization and cyclophosphamide challenges in beagles. Toxicol. Lett., 2000, 115(1): 33-44.

67. Kai, C., Ochikubo, F., Okita, M., Iinuma, T., Mikami, T., Kobune, F. & Yamanouchi, K. 1993. Use of B95a cells for isolation of canine distemper virus from clinical cases. J. Vet. Med. Sci., 55, 1067-1070.

68. Kherli, M.E., Burton, J.L., Nonnecke, B.J., Lee, E.K., 1999. Effects of stress on leukocyte trafficking and immune responses: implications for vaccination. Adv. Vet. Med., 41:61-81.

69. Khesl, M.L., Neil, D.H., 1983. Combined MLV canine parvovirus vaccine: immunosuppression with infective shedding. Vet. Med. Small Anim. Clinic., 78:687-691.

70. Kobune, F., Sakata, H., Sugiyama, M. & Sugiura, A. 1991. B95a, a marmoset lymphoblastoid cell line, as a sensitive host for rinderpest virus. — J. Gen. Virol., 72, 687-692.

71. Kolbl., S., Tschabrun, S., Schuller, W., 1995. Untersuchungen zur humoralen Immunantwort bei Junghunden nach Grundimmunisierung mit verschiedenen Kombinationsimpfstoffen. II. Parvoviruskomponente. Kleintierpraxis 40:909-918.

72. Krakowka S, Olsen RG, Axthelm MK, Rice J, Winters K. Canine parvovirus infection potentiates canine distemper encephalitis attributable to modified live-virus vaccine. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1982, 180(2): 137-9.

73. Kurzawa, H., Wysocka, M., Aruga, E., Chang, A.E., Trinchieri, G., Lee, W.M., 1998. Recombinant interleukin 12 enhances cellular immune responses to vaccination only after a period of suppression. Cancer Res., 58: 491-499.

74. Kyhse-Andersen J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J. Biophys. Biochem. Meth., 1984, 10, 203-209.

75. Larson LJ, Schultz RD. Comparison of selected canine vaccines for their ability to induce protective immunity against canine parvovirus infection. -Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1992, 15(4): 281-3.

76. Lewis R.M., Picut C.A.- Veterinary Clinical Immunology. From classroom to clinics. Lea & Febiger, Philadelphia* London, 1989, 207-228.

77. Lewis, D.C., Dhein, C.R., Evermann, J.F., 1988. Current concepts in vaccination programs for dogs, cats and ferrets, part 2. Companion Animal Pract. 2/12:21-29.

78. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurment with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem., 1951, 193,265-275.

79. Mancini, G., Carbonara, A.O., Heremans, J.F., 1965. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry, 2: 235.

80. Mansfield KL, Burr PD, Snodgrass DR, Sayers R, Fooks AR. Factors affecting the serological response of dogs and cats to rabies vaccination. Vet. Rec., 2004, 154 (14): 423-6.

81. McCaw DL, Tate D, Dubovi EJ, Johnson JC. Early protection of puppies against canine parvovirus: a comparison of two vaccines. — Am. J. Vet. Res., 1997, 58(4): 360-3.

82. McCaw DL, Thompson M, Tate D, Bonderer A, Chen YJ. Serum distemper virus and parvovirus antibody titers among dogs brought to a veterinary hospital for revaccination. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1998, 213(1): 72-5.

83. McDonald, L.J., 1992. Factors that can undermine the success of routine vaccination protocols. Vet. Med., 87: 223-230.

84. McMillen, G.L., Briggs, D.J., McVey, D.S., Phillips, R.M., Jordan, F.R., 1995. Vaccination of racing greyhounds: effects on humoral and cellular immunity. Vet. Immunol. Immunopathol., 49: 101-113.

85. Medical Immunology. Eds. by D.P.Stites, A.I.Terr, T.G.Parslow.-APPLETON & LANGE, Stamford, Connecticut, 1997, 73-210.

86. Miyamoto, T., Taura, Y., Une, S., Yoshitake, M., Nakama, S., Wata-nabe, S., 1992. Changes in blastogenic responses of lymphocytes and delayed type hypersensitivity responses after vaccination in dogs. J.Vet.Med. Sci., 54: 945950.

87. Miyamoto, T., Taura, Y., Une, S., Yoshitake, M., Nakama, S., Wata-nabe, S., 1995a. Immunological responses after vaccination pre- and post-surgery in dogs. J. Vet. Med. Sci., 57: 29-32.

88. Miyamoto, T., Taura, Y., Une, S., Yoshitake, M., Nakama, S., Wata-nabe, S., 1995b. Immunological responses to polyvalent canine vaccines in dogs. -J. Vet. Med. Sci., 57: 347-349.

89. Morell, V. 1994. Serengeti's big cats going to the dogs. Science, 264, 1664.

90. Morell, V. 1996. New virus variant killed Serengeti cats. Science, 271, 596.

91. Mouzin DE, Lorenzen MJ, Haworth JD, King VL. Duration of serologic response to five viral antigens in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc., 2004, 224 (1): 55-60.

92. Nakamura K, Ikeda Y, Miyazawa T, Tohya Y, Takahashi E, Mochi-zuki M. Characterization of cross-reactivity of virus neutralising antibodies induced by feline panleukopenia virus and canine parvoviruses. Res Vet Sci, 2001, 71 (3): 219-22.

93. Nara PL, Winters K, Rice JB, Olsen RG, Krakowka S. Systemic and local intestinal antibody response in dogs given both infective and inactivated canine parvovirus. Am. J. Vet. Res., 1983, 44(11): 1989-95.

94. O'Brien SE. Serologic response of pups to the low-passage, modified-live canine parvovirus-2 component in a combination vaccine. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1994, 204 (8): 1207-9.

95. Olson P, Hedhammar A, Klingeborn B. Canine parvovirus infection, canine distemper and infectious canine hepatitis: inclination to vaccinate and antibody response in the Swedish dog population. Acta Vet. Scand. 1996, 37(4): 43343.

96. Olson P, Klingeborn B, Hedhammar A. Serum antibody response to canine parvovirus, canine adenovirus-1, and canine distemper virus in dogs with known status of immunization: study of dogs in Sweden. Am. J. Vet. Res., 1988, 49(9): 1460-6.

97. Orvell, C. 1980. Structural polypeptides of canine distemper virus. -Arch. Virol., 66, 193-206.

98. Parrish C.R. The emergence and evolution of canine parvovirus-an example of recent host range mutation. Seminars in Virology, 1994, 5(2), 121-132.

99. Phillips, T.R., Jensen, J.L., Rubino, M.J., Yang, W.C., Schultz, R.D., 1989. Effects of vaccines on the canine immune system. Can. J. Vet. Res., 53: 154-160.

100. Phillips, T.R., Schultz, R.D., 1987. Failure of vaccine or virulent strains of canine parvovirus to induce immunosuppressive effects of the immune system of the dog. Viral Immunol., 1/2: 135-143.

101. Porro M, Viti S., Antoni G. Ultrasensitive silver-stain method for the detection of proteins in polyaciylamide gels and immunoprecipitates on agarose gels. Anal. Biochem., 1982, 127, 316-321.

102. Pratelli A, Cavalli A, Normanno G, De Palma MG, Pastorelli G, Mar-tella V, Buonavoglia C. Immunization of pups with maternally derived antibodies to canine parvovirus (CPV) using a modified-live variant (CPV-2b). Am. J. Vet. Res., 1997,58(4): 360-3.

103. Ramadass, P., Jayakumar, R., Khader, T.G.A., 1983. Immunosuppression in distemper vaccinated dogs by canine parvovirus. Ind. Vet. Med. J., 7: 129131.

104. Roth, J.A., 1991. The principles of vaccination: The factors behind vaccine efficacy and failure. Vet. Med., 86: 406-414.

105. Schultz K.T.- Immune suppressive viral infections of dogs and cats. -Vet. Allergy & Clin.Immunol., 1995, 3 (2), p.59-60.

106. Schultz R.D.- Current and future canine and feline vaccination programs. Comp. Animal Pract., 1998, 233-245.

107. Schwartzman R.M.- Immunologic studies of progeny of atopic dogs. -AmJ.Vet.Res., 1984,45 (2), 375-378.

108. Smith JR, Johnson RH. Observations on the use of an inactivated canine parvovirus vaccine. Vaccine, 1997, 15(6-7): 720-9.

109. Soma T, Ishii H, Hara M, Ohe K, Hagimori I, Ishikawa Y, Taneno A. Detection of canine distemper virus antigen in canine serum and its application to diagnosis. Vet. Rec., 2003, 153(16):499-501.

110. Strasser A., May B., Teltscher A., Wistrela E., Niedermuller H. Immune modulation following immunization with polyvalent vaccines in dogs.- Vet. Immunol. Immunopathol., 2003, 94: 113-121.

111. Strasser, A., Kalmar, E., Niedermuller, H., 1998. A simple method for the simultaneous separation of peripheral blood mononuclear and polymorphonuclear cells in the dog. Vet. Immunol. Immunopathol. 62: 29-35.

112. Strasser, A., Teltscher, A., May, B., Sanders, C., Niedermuller, H., 2000. Age-associated changes in the immune system of German shepherd dogs. J. Vet. Med. A., 47: 181-192.

113. Taura, Y., Ishi, K., S., Nagami, M., Mikasa, N., Nakaichi, M., Na-kama, S., 1995. Changes in lymphocyte proliferation and DTH responses after vaccination immediately before surgery in puppies. J. Vet. Med. Sci., 57: 899904.

114. Thompson J.P.- Immunological diseases. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Eds. SJ.Ettinger and E.C.Feldman.- W.B. Saunders Co., Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo, 1995, vol.2, 2002-2029.

115. Tipold A, Vandevelde M, Wittek R, Moore P, Summerfield A, Zur-briggen A. Partial protection and intrathecal invasion of CD8(+) T cells in acute canine distemper virus infection. Vet. Microbiol., 2001, 83 (3): 189-203.

116. Tizard I.R.- Veterinary Immunology. An Introduction.- W.B.Saunders Co., Philadelphia/London/Toronto/Montreal/ Sydney Tokyo, 2003, 890 p.

117. Tratschin JD, GK McMaster, G Kronauer and G Siegl. Canine parvovirus: relationship to wild-type and vaccine strains of feline panleukopenia virus and mink enteritis virus Virol., 1995, 69, 7274-7277.

118. Waner T, Mazar S, Nachmias E, Keren-Kornblatt E, HarrUs S. Evaluation of a dot ELISA kit for measuring immunoglobulin M antibodies to canine parvovirus and distemper virus. Vet. Rec., 2003, 152(19): 588-91.

119. Waner T, Naveh A, Ben Meir NS, Babichev Z, Carmichael LE. Assessment of immunization response to canine distemper virus vaccination in puppies using a clinic-based enzyme-linked immunosorbant assay. Vet. J., 1998, 155(2): 171-5.

120. Yamashita, K., Fujinaga, Т., Hagio, M., Miyamoto, Т., Izumisawa, Y., Kotani, Т., 1994. Bioassay for interleukin-1, interleukin-6, and tumor necrosis factor-like activities in canine sera. J. Vet. Med. Sci., 56: 103-107.