Поиск веществ с ноотропной и нейропротективной активностью с использованием традиционных методов скрининга и аналитической компьютерной программы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат биологических наук Галаева, Ирина Петровна

• Галаева, Ирина Петровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Галаева, Ирина Петровна

5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фармакология ноотропных препаратов.

1.2. Цереброваскулярные и нейродегенеративные расстройства и их фармакологическая коррекция.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Изучение влияния веществ на обучение.

2.1.1. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной сколол амином.

2.1.2. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком.

2.2. Методика обучения условной реакции активного избегания (УРАИ), в условиях модели челночная камера.

2.3. Исследование анксиолитических и анксиогенных свойств новых веществ.

2.3.1. Методика конфликтной ситуации.

2.3.2. Методика приподнятого крестообразного лабиринта.

2.4. Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности в условиях методики открытое поле.

2.5. Оценка миорелаксантных свойств.

2.5.1. Исследование нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня.

2.5.2. Оценка миорелаксации в тесте подтягивание на горизонтальной перекладине

2.5.3. Тест залезания на сетку.

2.6. Оценка неврологического дефицита.

2.7. Оценка противогипоксического эффекта.

2.7.1. Изучение противогипоксического эффекта на модели гипобарической гипоксии в барокамере.

2.7.2. Изучение противогипоксического эффекта на модели гемической гипоксии

2.7.3. Изучение противогипоксического эффекта на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.

2.8. Моделирование интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта).

2.9. Методика моделирования холинергического дефицита у крыс.

2.10. Определение содержания моноаминов в мозге животных.

2.11. Морфологические исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ПОИСК ВЕЩЕСТВ С НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

3.1. Изучение производных 4-фенилпирролидона.

3.1.1. Изучение антиамнестического эффекта новых соединений.

3.1.2. Изучение влияния веществ на обучение УРАИ.

3.1.3. Исследование противогипоксического эффекта производных 4- фенилпирро-лидона.

3.1.4. Изучение общего спектра фармакологической активности производных пиррол и до на.

3.2. Исследование ингибиторов пролилэндопептидазы.

3.2.1. Изучение антиамнестических свойств веществ.

3.2.2. Исследование анксиолитической активности ингибиторов пролил -эндопептидазы.

3.2.3. Исследование общего спектра фармакологической активности ингибиторов пролилэндопептидазы.

3.2.4. Изучение нейрохимического механизма действия ИФ 8.

3.3. Изучение новых соединений с заданными свойствами (по программе PASS).

3.3.1. Антиамнестический эффект соединений.

3.3.2. Изучение противогипоксической активности новых соединений на моделях гипобарической и гемической гипоксий.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ СОЕДИНЕНИЙ.

4.1. Исследование эффективности веществ на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта).

4.1 Л. Исследование неврологического дефицита и гибели крыс с ГИ.

4.1.2. Изучение особенностей поведения и памяти крыс с геморрагическим инсультом.

4.1.3. Морфологические исследования (морфоконтроль).

4.2. Изучение влияния веществ на поведение и память крыс с дефицитом холинергической системы.

4.2.1. Влияние веществ на обучение У РАИ.

4.2.2 Изучение влияния веществ на обучение УРПИ крыс с дефицитом холинергической системы.

4.2.3. Влияние веществ на эмоциональное состояние и анксиогенез у крыс с дефицитом холинергической системы в условиях методики ПКЛ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск веществ с ноотропной и нейропротективной активностью с использованием традиционных методов скрининга и аналитической компьютерной программы»

Актуальность темы: В последние годы в связи с ростом числа заболеваний, протекающих с нейродегенеративными изменениями и сопровождаемых нарушениями когнитивных функций (инсульты, сенильные деменции, в том числе болезнь Альцгеймера, старческое слабоумие, травмы мозга, интоксикации, инфекционные поражения центральной нервной системы) осуществляется активный поиск новых эффективных препаратов с ноотропным и нейропротективным действием. Одним из наиболее распространенных методов поиска является модификация структуры пирацетама (родоначальника группы ноотропов), путем изменения размеров цикла, строения боковой цепи, заместителей при экзоциклическом азоте (Воронина Т.А., 2000; Gumine, 1987), поиск среди антагонистов NMDA (Chazot and Hawkins, 1999; Brauner-Osborne, 2000; Hatton, 2001) и AMPA (Filial et. al., 1998; Brauner-Osborne, 2000) рецепторов глутаматергической системы, модуляторов AMPA рецепторов (ампакины) (Раевский К.С., 2002; Ingvar et. al., 1997; Hampson, 1998), среди лигандов мускариновых и никотиновых рецепторов холинергической системы (Levin, 1998; Hglen, 2001; Lachowicz et. al., 2001). Исследуются вещества, влияющие на различные стадии глутамат - кальциевого каскада, вызванного инсультом (Скворцова В.И., Гусев Е.И., 2001; Takasago et. al., 1998; Danbolt, 2001; Floyd et. al., 2002), в том числе антагонисты глутаматергической системы, блокаторы кальциевых каналов L-типа (Taya et. al., 2000; Cano-Abad et. al., 2001; Bogaert et. al., 2001), ингибиторы кальций -активируемых нейрональных протеиназ (Wang and Yuen, 1994; Kinloch et. al., 1999), ингибиторы цитокинов (Kinloch et. al., 1999), вещества, влияющие на нейротрофил ингибирующий фактор (Yiang et. al, 1999) и др.

В ГУ НИИ фармакологии в течение ряда лет осуществляется поиск веществ с ноотропным и церебропротективным типом действия (Середенин С.Б., Воронина Т.А 2000). Найдены эффективные вещества среди производных пирролидона, пептидных аналогов пирацетама, ингибиторов пролилэндопептидазы, производных 3-оксипиридина, аминокислотных производных оксиникотиноилуксусной кислоты, и ряда других химических соединений. (Воронина Т.А., 2000; Гудашева Т.А. и соавт., 2002; Островская Р.У. и соавт., 1994; Середенин С.Б., Воронина Т.А 2000). Внедрен в клиническую практику антиоксидант мексидол, обладающий ноотропной, анксиолитической и нейропротективной активностью (Дюмаев К.М. и соавт., 1994; Воронина Т.А., 2002). На стадии клинических испытаний находятся препараты нооглютил (Воронина Т.А. и соавт., 1992; Гарибова Т.Л., 2000) и дипептид ноопепт (Ostrovskaya et.al, 1994; Gudasheva, Voronina, Ostrovskaya, 1996).

Последнее десятилетие для отбора наиболее перспективных потенциальных лекарственных препаратов используются разнообразные компьютерные программы. В частности с помощью QSAR, 3D молекулярного моделирования, методов молекулярного сходства и кластеризации, успешно прогнозируют биологическую активность химических соединений. Одной из таких программ является PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) (Авидон В.В., 1974; Поройков В.В. и соавт., 1996; Hansch, 1993; Brown et. al., 1996; Lagunin, 2000; Douglas et. al., 2001). Прогноз компьютерной системы PASS основан на анализе взаимосвязей «структура-активность» (structure-activity relationships - SAR) с использованием обучающей выборки, содержащей большое количество разнородных химических соединений с различными видами биологической активности (более 1000 видов, включая основные фармакологические эффекты, механизмы действия и нежелательные свойства -мутагенность, канцерогенность, тератогенность и др.). Будучи обученной, PASS позволяет прогнозировать спектры биологической активности для новых веществ по их структурным формулам. С помощью программы PASS и биологической оценки, выявлены вещества с противоязвенным, антигипертензивным и ангиогензивным эффектами (Мартынова Н.Б. и соавт., 2000; Филимонов Д.А., 2000; Лагунин А.А, 2001).

Методология изучения фармакологической активности потенциальных ноотропов и нейропротекторов хорошо разработана и включает исследование влияния веществ на обучение и память, в том числе нарушенные различными факторами; гипоксии; состояния, вызванные экспериментальными ишемическими нарушениями и травмами мозга, холинергическим дефицитом и другие (Воронина Т.А., 2000; Мирзоян Р.С., 2000; Voronina, 1994; Smith et al., 1997; Camps, 2002). Между тем, у большинства экспериментальных моделей имеются существенные недостатки, в связи с этим представляется целесообразным разработка новых методов исследования. Особенно сложно моделирование геморрагических повреждений мозга, так как они приводят к высокой летальности животных, а используемые в эксперименте субарахноидальные геморрагии, не всегда адекватны патологиям, наблюдаемым у людей с интрацеребральными геморрагиями (Choi, 1995; Hickenbottom et. al., 1998).

Целью настоящей работы является поиск веществ с ноотропной и пейропротективной активностью при использовании традиционных методов и аналитической компьютерной программы.

Были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить поиск веществ с антиамнестическим и противогипоксическим действием среди новых N-алкильных и N-ацильных производных 4-фенилпирролидона и ингибиторов пролилэндопептидазы;

2. Исследовать ноотропную активность веществ с высокой прогностической активностью полученных с использованием программы PASS;

3. Разработать систему тестов оценки нарушений функций ЦНС при нейродегенерации, вызванной интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом);

4. Изучить нейропротективный эффект наиболее перспективных соединений на модели геморрагического инсульта;

5. Исследовать свойства веществ на модели нейродегенеративпой патологии, вызванной дефицитом холинергической системы;

6. Провести изучение эффектов нооглютила на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы и холинергического дефицита.

Научная новизна исследования: Модификация молекулы 4-фенилпирролидона, путем введения N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с антиамнестическим эффектом в 45% случаев. Наиболее высокой антиамнестической и противогипоксической активностью обладает соединение под шифром ГИЖ 283 - N-алкильное производное 4-фенилпирролидона-2 (анилид-2-оксо-4-фенил-пирролидин-1-уксусной кислоты).

Впервые показана высокая прогностическая значимость компьютерной программы PASS, для поиска веществ с ноотропной активностью. Показано, что из 14 синтезированных соединений, различной структуры, с выявленным при использовании PASS высоким уровнем вероятности, наличия ноотропной активности (Pi<05), 12 веществ (85,7 %) обладают антиамнестическими свойствами на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином. При этом 56 % соединений удовлетворяли жесткому критерию оценки антиамнестического эффекта — достоверному увеличению процента животных с полным сохранением памятного следа.

Разработан новый методический подход к оценке поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, вызванной деструкцией мозговой ткани в области capsula interna. Показано, что наиболее значимыми и отчетливыми нарушениями являются изменение неврологического статуса, ослабление процессов обучения, памяти и гибель животных; при этом 7 динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения. Выявлены новые соединения (AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8), которые введенные однократно через 4 часа после операции обладают способностью уменьшать гибель, ослаблять неврологические дефициты, улучшать процессы обучения и памяти у животных с ИПГ, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте. По своей активности новые соединения не уступают, а в некоторых случаях и превышают действие нимодипина.

На модели нейродегенеративных нарушений, вызванных дефицитом холинергической системы (субхроническое введение скополамина) показана способность новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8) улучшать когнитивные функции и устранять тревожность животных.

Впервые показано, вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ8. Вещество в дозе 1 мг/кг (ноотропной) увеличивало содержание 5-ОИУК, а в дозе 5 мг/кг (анксиолитической) снижал уровень метаболита.

Впервые показано, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях патологий: интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы, вызванной повторным введением скополамина.

Научно-практическая значимость работы: В результате проведенного исследования выявлены новые перспективные соединения, различной структуры (ГИЖ 283, ИФ 8, AG 4а, AG 4b), обладающие антиамнестическими свойствами. Методика оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой позволяет оценить комплекс патологических изменений возникающих у животных после операции и может применяться для разработки и создания современных лекарственных средств, эффективных при лечении повреждений мозга. Получены данные, расширяющие показания для клинического применения нооглютила.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Галаева, Ирина Петровна

выводы

1. Установлено, что среди новых производных 4-фенилпирролидона с N-алкильными и N-ацильными заместителями 45% соединений обладают антиамнестической активностью в дозах 1 и 10 мг/кг на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином.

2. Показано, что среди выявленных с помощью компьютерной программы PASS (версия 1,603 в интерпретации Pharma Expert) четырнадцати соединений с уровнем вероятности наличия ноотропной активности (Ра>0,5) 85,7% веществ в дозах 1 и 10 мг/кг обладают антиамнестическими свойствами.

3. Разработан новый методический подход оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом). Показано, что у крыс после инсульта, вызванного деструкцией мозговой ткани в области capsula interna, наиболее выраженными нарушениями являются дефициты неврологического статуса, ослабление процессов обучения и памяти и гибель животных. При этом динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения.

4. Выявлено, что новые соединения под шифрами AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8, а также нимодипин снижают гибель, ослабляют неврологический дефицит, улучшают процессы обучения и памяти у животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте.

5. Установлено, что соединения ГИЖ 283, ИФ 8 позитивно влияют на нарушения когнитивных функций в условиях методики амнезии условного рефлекса активного и пассивного избегания, а также на тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте у крыс с дефицитом холинергической системы.

6. Показано вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ 8.

7. Экспериментально установлено, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном исследовании были использованы три подхода для поиска веществ и ноотропной и нейропротективной активностью. Это модификация молекулы родоначальника группы ноотропов пирацетама, исследование ингибиторов пролилэндопептидазы - веществ, воздействующих на одно из патогенетических звеньев нарушений мнестических и эмоционально - поведенческих функций, а именно пептидергического механизма, а также поиск эффективных веществ на основе компьютерного прогнозирования с использованием программы PASS.

Показано, что модификация молекулы 4-фенилпирролидона с введением N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с выраженной антиамнестической активностью. Установлено, что 7 из 9 (77 %) изученных соединений обладают в дозах от 1 до 10 мг/кг антиамнестическим эффектом на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамииом. При исследовании побочных, нежелательных эффектов в диапазоне доз от 1 до 50 мг/кг у соединений не было выявлено угнетения ориентировочно-исследовательского поведения, двигательной активности, нарушений координации движений. Наиболее высокой антиамнестической активностью, способностью улучшать обучение УРАИ и противогипоксическим эффектом обладало вещество ГИЖ 283 - анилид 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-уксусной кислоты. Эффект этого вещества как потенциального ноотропа выявлялся в дозе 1-5 мг/кг, что значительно превосходит эффект пирацетама и не уступает анирацетаму.

Исследование ингибиторов пролилэндопептидазы показало, что вещества под шифрами ИФ 8 и ИФ 11 в дозах 0,5 и 1 мг/кг обладают выраженным антиамнестическим эффектом, а при увеличении дозы до 5 мг/кг антиамиестические свойства вещества ослабевают, а выявляется анксиолитическая активность. В отличие от бензодиазепиновых анксиолитиков соединения ИФ 8 и ИФ 11 в дозах превышающих эффективные в 2-20 раз не проявляют седативного и миорелаксантного эффектов. Более эффективным по антиамнестическому и анксиолитическому действию оказалось соединение ИФ 8. Подобное сочетание антиамнестического и анксиолитического действия отмечается и у ряда других препаратов. Например, антиоксидант производное 3-оксипиридина мексидол (Дюмаев и соавт., 1995), дипептид ноопепт (Островская Р.У., 2001; Гудашева Т.А., 2002). Механизм ноотропного и нейропротективиого действия мексидола, в значительной степени определяется его антиоксидантными свойствами, а анксиолитический эффект связан с модулирующим влиянием на ГАМК бензодиазепиновый рецепторный комплекс за

105 счет мембранотроиного действия препарата (Воронина Т.Л., 1998). Известно, что серотонинергическая система участвует в реализации анксиолитического эффекта ряда препаратов. В проведенных исследованиях показано, что соединение ИФ 8 повышало содержание норадреналина и дофамина в коре и серотонина в стриатуме. Однако это повышение, хотя и было отчетливо регистрируемым, имело низкий уровень достоверности. Наиболее выраженный дифференцированный по дозам эффект вещества выявлялся в гипиокампе. Так, в малой дозе, 1 мг/кг ИФ 8 достоверно увеличивал, а в дозе 5 мг/кг снижал содержание серотонина и его метаболита 5-ОИУК. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ИФ 8.

Как отмечалось в обзоре литературы, для отбора соединений наиболее перспективных в качестве лекарственных средств используется разнообразные компьютерные методы. В частности для прогноза биологической активности и отбора веществ используют методы QSAR и 3D, методы молекулярного сходства и кластеризации. В настоящем исследовании применялась компьютерная программа PASS версия 1,603, основными составляющими которой являются: предоставление биологической активности, описание структуры химических соединений, база данных и знаний взаимосвязей структура - активность, алгоритм прогноза спектров биологической активности (Поройков и соавт., 2000). Предсказание спектра биологической активности осуществлялось группой исследователей во главе с профессором Поройковым В.В. на основе анализа взаимосвязей структура -активность, данные о которых хранятся в базе знаний SAR Base программы PASS. В рамках этой программы все соединения обучающей выборки представлены в виде набора MNA дескрипторов, и перечня видов биологической активности, проявляемых у каждого соединения. Для тестируемого соединения, в соответствии с набором его дескрипторов, вычислялись вероятности принадлежности к классу веществ, проявляющих / не проявляющих определенный вид биологической активности. Обучающая выборка PASS 1,603 включает 35154 химических соединений, описываемых 35712 различными MNA дескрипторами. Результат предсказания выдавался в виде списка названий видов биологической активности с соответствующими значениями вероятностей проявить (Ра) или не проявить (Pi) определенный вид активности. При этом если в прогнозе некоторый вид биологической активности был предсказан с вероятностью Ра>0,7, то, скорее всего, данное соединение проявит этот вид биологической активности в эксперименте, однако шанс, что это вещество является анатогом известного лекарственного

106 соединения, может оказаться также значительным. Если 0,5<Ра<0,7, то существует большая вероятность, что данное соединение проявит определенный вид биологической активности в эксперименте, но она будет меньшей, чем в первом случае, и это вещество менее схоже с известными лекарственными соединениями. Если Ра<0,5, то вероятность того, данное вещество проявит заданный вид биологической активности в эксперименте - меньше, но если ее наличие экспериментально подтвердится, то такое вещество может оказаться принципиально новой базовой структурой. В качестве тестовой выборки в программе была использована база данных биологически активных соединений MDDR (MDL Drug Data Report) 99,2 фирмы MDL Information System Inc, которая содержит структуры и данные по биологической активности веществ, используемых и разрабатываемых в качестве потенциальных лекарственных средств. В MDDR представлена информация из патентов, конференций, журналов и сообщений компаний о 105372 соединениях, которые включают 98184 оригинальных структур. Согласно программе гранта INTAS (№ 00-711) химиками синтетиками были предложены около 1000 структур соединений, с предполагаемой иоотропной и нейропротективной активностью, а аналитики осуществили с помощью программы PASS прогноз их спектров биологической активности. Были отобраны и синтезированы 14 соединений различной структуры с заданными ноотропными и нейропротективными свойствами с Ра от 0,51 до 0,75. При изучении антиамнестического эффекта этих соединений установлено, что 98% (13 из 14) веществ обладают антиамнестическими свойствами - ослабляют амнезию УРПИ, вызванную скополамином. При этом восемь из четырнадцати соединений (56%) удовлетворяют жесткому критерию оценки эффекта в условиях этой модели - статистически достоверному увеличению количества животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса. Показатель 56% соответствует коэффициенту вероятности биологической активности Ра>0,5.

Анализ возможного механизма, антиамнестического эффекта изученных соединений, с помощью PASS показал, что все соединения имеют структурное сходство с веществами, механизм действия которых опосредуется через холинергическую систему, с уровнем вероятности от 15 до 47%. Однако корреляционной зависимости между выраженностью антиамнестического эффекта и показателями уровня вероятности участия. холинергической системы в механизме антиамнестического действия соединений не было выявлено (г=0,25). Вместе с тем, согласно прогнозу PASS в механизме антиамнестического действия изученных соединений могут принимать участие и другие системы, ответственные за процессы обучения и памяти, например ГАМК-ергическая и глутаматергическая.

107

Как отмечалось в обзоре литературы, наиболее распространенной формой когнитивных расстройств являются деменции альцгеймеровского типа. Болезнь Лльцгеймера характеризуется хронически прогрессирующим течением и проявляется неукоснительным снижением когнитивных функций и умственных способностей. В процессе течения болезни морфологически регистрируется атрофия головного мозга, отложение сенильных бляшек, состоящих, в основном, из р-амилоида, нейрофибриллярные клубки, утрата синоптических связей, дегенерация преимущественно холинергических нейронов в ядрах базальных отделов переднего мозга. Согласно современной литературе предполагается, что процесс дегенерации нейронов запускается в результате нарушения регуляции различных нейротрофических факторов или их рецепторов, и это приводит к прекращению нейротрофической стимуляции определенных популяций нейронов. Факторы роста нейронов представляют собой белки, которые обладают способностью вызывать дифференцировку нейронов и поддерживать специфические функции нервных клеток. Отсутствие поступления в клетку таких факторов приводит к стимуляции экспрессии генов, которые запускают активный процесс клеточной смерти (апоптоз).

В связи с ключевой ролью холинергической системы в патогенезе ряда когнитивных расстройств, в экспериментальной медицине для моделирования амнезии используются различные модели нарушения функций этой системы, одной из наиболее адекватных моделей болезни Лльцгеймера может быть билатеральное повреждение ядер Мейнерта с помощью нейротоксина AF-64, различные модели скополаминовой амнезии (Prestor et al., 1988; Molchan et al., 1992). В настоящем исследовании для моделирования амнезии был использован М-холиноблокатор скополамин, который как при однократном, так и при субхроническом двухнедельном применении вызывал нарушение обучения и памяти, это согласуется с данными литературы (Izquierdo, 1989; Magnani et al., 1992). В настоящее время выявлено пять подтипов мускариновых рецепторов М1-М5 (Wess, 1996). Многие исследования, основанные на поведении животных свидетельствуют о том, что изменения обучения и памяти опосредуются через М| подтип мускариновых рецепторов (Hanter,. 1988;

Messer et al., 1990). Известно, что мускариновые М| рецепторы локализованы постсинаптически и их активация прямыми или не прямыми агонистами уменьшает ослабление когнитивных функций, связанных с ранними признаками болезни

Лльцгеймера (Farlow et al., 1992; Soncrant et al., 1993). В ЦНС мускариновые рецепторы Мг подтипа распространены преимущественно на пресинаптических терминалях ацетилхолиновых рецепторов и являются ауторецепторами (регулируют высвобождение ацетилхолина), т.е. их стимуляция приводит к уменьшению

108 холинергической нейропередачи (Pohorecki et.al., 1988; Stillman et.al., 1996). Альтернативный механизм через который можно осуществить усиление холинергической нейропередачи это облегчение высвобождения ацетилхолина из пресинаптических терминалей путем блокады Мг подтипа мускариновых рецепторов селективными антагонистами, в частности, ингибиторами обратного захвата. Показано, что блокада мускариновых рецепторов М2 подтипа вызывает увеличение выброса ацетилхолина и тем сильнее, чем большим аффинитетом к Мг рецептору обладает антагонист (в мозге крыс) (Billard et al., 1995). Скополамин - неселективный мускариновый антагонист в дозах (0,1-10 мг/кг, в/б.) вызывает дозо-зависимое увеличение выброса ацетилхолина в сриатуме (показано с помощью микродиализа) (Carey et al., 2001). Хотя скополамин и увеличивает выброс ацетилхолина он вызывает нарушение когнитивных функций за счет блокады постсинаптических М| рецепторов (Garey et al., 2001).

В настоящем исследовании была использована методика получения дефицита холинергической системы путем длительного двадцатидневного введения скополамина с последующей десятидневной отменой (схема 2.2, материалы и методы). Согласно данным Бурова Ю.В. и соавторы, (1991) пик снижения функций холинергической системы наблюдается только через десять дней после отмены скополамина, а непосредственно после окончания длительного введения скополамина отмечалось не ухудшение, а улучшение памятного следа. Существует предположение (Островская Р.У., 1995), что происходит это в связи с тем, что вследствие длительной блокады холинергических рецепторов, в результате включения механизмов обратной связи, развивается повышение плотности и афинности холинорецепторов, а к 10-му дню, после отмены скополамина, в результате ускоренного связывания наличного ацетилхолина развивается холинергический дефицит, приводящий к выраженному длительному нарушению познавательных функций и, как показано в нашем эксперименте, к ухудшению условно-рефлекторной деятельности. Не исключено, что в этом процессе принимают участие не только постсинаптические, но и пресинаптические М2 рецепторы, блокада которых скополамином (Carey, 2001) приводит к нарушению захвата ацетилхолина.

В проведенных исследованиях на модели длительного применения скополамина было показано, что у крыс с дефицитом холинергической системы регистрируются нарушения обучения, памяти и повышенная тревожность. Нооглютил, пирацетам и его аналог новое соединения ГИЖ 283, а также ингибитор пролилэндопептидазы ИФ 8 оказывали позитивное действие на нарушенные когнитивные функции на моделях УРПИ и УРАИ у крыс с холинергическим

109 дефицитом. Кроме того, ИФ 8 устранял тревожность животных при тестировании в ПКЛ.

Известно, что пирацетам широко применяется в комплексной терапии у больных с ишемическим инсультом (Nikenbottom, 1998; Orgagozo, 1999; Ricci et.al., 2000), черепно-мозговой травмой (Goscinsski et al., 1998) и при последующей реабилитационной терапии (Huber, 1999; Kessler et.al., 2000), а также в качестве поддерживающей терапии при некоторых нейродегенеративных процессах (старческом слабоумии, болезни Альцгеймера и др.). Экспериментальные исследования подтверждают способность пирацетама оказывать нейропротективный эффект, механизм которого, в основном, связан с увеличением под его влиянием потребления глюкозы и кислорода в ишемизированной поврежденной зоне ЦНС (Goscinski et al., 1998; Gulieave, 1998). С другой стороны предполагается, что причиной нейродегенеративных заболеваний, подобных деменциям альцгеймеровского типа могут быть нарушения энергетического метаболизма. Эта теория подтверждается тем, что у больных страдающих болезнью Альцгеймера определяется пониженный уровень экспрессии гена GLUT-1 - соединения, которое является транспортером глюкозы через гематоэнцефалический барьер. Это приводит к снижению уровня доставки глюкозы к головному мозгу, т.е., к дефициту питатеьного субстрата, который необходим для его нормального функционирования. Устойчивый дефицит энергии может привести к продолжительному высвобождению возбуждающих нейротрансмиторов, таких как глутамат. И это в свою очередь может вызвать возникновение ряда эксайтотоксических реакций, связанных, например, с внутриклеточным накоплением кальция и с избыточной продукцией свободных радикалов и, в конечном счете, может привести к гибели клеток. В связи с вышеизложенным, помимо терапии f направленной на восполнение дефицита ацетилхолина при деменциях альцгеймеровского типа используют ноотроиные препараты, в частности пирацетам и родственные ему соединения, которые повышают интенсивность церебрального метаболизма глюкозы и за счет снабжения головного мозга энергией происходит улучшение ряда когнитивных характеристик.

Клинический эффект пирацетама реализуется, как правило в больших дозах (до 24 гр./день). В экспериментальных исследованиях в опытах на животных, в основном используются дозы от 200 до 800 мг/день. Наиболее эффективным соединением из группы производных 4-фенилпирролидона было вещество под шифром ГИЖ 283. Помимо выраженных антиамнестического и противогипоксического эффектов это соединение ослабляло нарушения поведения и памяти крыс на фоне холинергического дефицита. Причем позитивный эффект регистрировался в дозе 1 мг/кг. Таким образом,

НО полученные данные свидетельствуют о преимуществах нового соединения перед пирацетамом, как потенциального ноотропа и нейропротектора.

Известно, что процесс нейродегенерации при болезни Лльцгеймера распространяется на корковые глутаматергические нейроны, а также на различные пептидергические нервные клетки. Несмотря на то, что установлена прямая связь между утратой холинергической инервации и расстройствами обучения и памяти, есть доказательства возможности возникновения на ранних этапах болезни первичной дегенерации корковых глутаматергических нейронов, что может привести к вторичной дегенерации холинергической системы (Maragos 1987; Terry 1994; Jellinger, 1994). Вследствие этих представлений, можно предположить почему нооглютил, механизм действия которого опосредуется глутаматергической системой эффективен на модели холинергического дефицита. Эффективность ИФ 8 в этих условиях, по-видимому, обусловлена его взаимодействием с пролилэндопептидазой. Об этом свидетельствуют данные, полученные Золотовым Н.Н. и соавторами (1992, 1995) в которых показано повышение активности ПЭП в коре и гиппокампе мозга крыс, а также установлена связь между этим явлением и состоянием холинергической системы (Zolotov, 1993).

Как отмечалось в обзоре литературы, для оценки нейропротективного действия веществ разработаны и используются модели глобальной, локальной ишемии мозга, модели геморрагического инсульта, различных травм мозга. (Воронина Т.Д., 2000; Мирзоян Р.С., 2000; Yackowski et al., 1990; Smith et al., 1997). В настоящем исследовании была использована новая модель оценки нейропротективного действия веществ - модель интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта), разработанная Макаренко Л.Н. и соавторами (1990). В результате проведенных исследований показано, что у крыс с ГИ наблюдались выраженный неврологический дефицит, нарушение координации движений, ослабление процессов обучения и памяти, гибель животных. При этом отмечалось углубление патологической симптоматики к 14-му дню наблюдения. Динамика ухудшения состояния и гибели крыс с ГИ может свидетельствовать о скрытой недостаточности компенсаторных реакций организма, нарастающих в определенные критические дни (3, 7, 14 сутки) послеоперационного периода и развитии сопутствующих осложнений (отек, набухание тканей, нарушение интрацеребральной гемодинамики, повышенного внутричерепного давления, ишемии мозга), (Макаренко Л.Н., 1990; Jackowski et al., 1990). В настоящем исследовании, ложно оперированные животные демонстрировали существенные отличия почти по всем регистрируемым показателям, как от интактньгх животных, так и от крыс с ГИ что связано, по-видимому, с реакцией на травмирование покровных тканей и черепа, при проведении

III ложной операции. Вместе с тем, при сравнении ложно оперированных животных и крыс с ГИ, у последних отмечалось существенной ухудшение состояния и нарастание тяжести симптоматики. Это подтверждает определяющее значение геморрагического компонента в общей картине моделируемой патологии. Морфологические показатели также свидетельствовали о нейродегенеративных изменениях в зоне поражения.

Нооглютил, при введении животным однократно через 3-3,5 часа после операции обладал выраженным нейропротективным действием, предотвращая гибель крыс и существенно ослабляя нарушения неврологического статуса, улучшая память животных с посттравматической гематомой. При этом в дозе 20 мг/кг препарат обладал более отчетливым эффектом, предупреждая нарушения, памяти, а в дозе 10 мг/кг - сильным протективным действием в отношении неврологического дефицита и гибели животных, что сочеталось с менее выраженным влиянием на процессы обучения и памяти. Расслоение эффектов нооглютила в зависимости от дозы у животных с ГИ может свидетельствовать об особенностях моделируемой патологии, стадийности процесса и о наличии у нооглютила широкого спектра нейропротективного действия.

В неврологической клинике фармакотерапия последствий ГИ направлена на нормализацию гемокаогуляции и гемореологии, защиту нервной ткани в условиях нарастающей гипоксии, предотвращение нейротоксического действия медиаторов, предупреждение развития дезинтеграции головного мозга, восстановление баланса нейромедиаторов и другие (Е.И. Гусев, 2001; Jackowski, 1990; Choi, 1995; Obrenovitch, 1996). Нооглютил в условиях различных моделей церебральной патологии (ишемия мозга, черепно-мозговая травма, гипоксии мозга, вызванные различными факторами) обладает противоотечным действием, нормализует кровоснабжение мозга, устраняет межполушарную асимметрию кровоснабжения, корректирует биоэлектрическую активность при ишемии (Новиков В.Е, 1997; Алиев И.И., 1999; Воронина Т.А, 2000). Совокупность имеющихся в литературе данных и полученных в настоящем исследовании результатов позволяет заключить, что нооглютил осуществляет свой нейропротективный эффект, воздействуя различные звенья патологической системы, формирующейся вследствие острых нарушений мозгового кровообращения при ишемических и геморрагических инсультах. Нейропротективное действие нооглютила подтверждено в исследованиях срезов головного мозга крыс с ГИ, получавших нооглютил.

Как отмечалось в обзоре литературы нейрохимический, механизм действия нооглютила опосредован взаимодействием с глутаматергической системой. Широкое представительство глутаматергических рецепторов в гиппокампе и новой коре

112 структурах напрямую связанных с формированием, хранением и извлечением следа памяти и механизмами обучения, явилось основой изучения влияния глутаматергических соединений на процессы обучения и память (Абрамец И.И., 1994, Lisman, 1999; Lee et al., 2000). Показано, что преимущественная активизация не NMDA рецепторов при низкочастотной стимуляции, соответствует «нормальным» условиям деятельности мозга, в то время как высокочастотная стимуляция приводит к активации NMDA рецепторного комплекса и связанна с переходом нейрона к иному уровню функциональной зависимости, необходимому для фиксации памяти. Было установлено так же, что высокочастотная спайковая активность афферентных волокон гиппокампа наблюдается: и в естественных условиях, когда требуется пластическая перестройка нейрона (фиксация новой информации, эмоциональная реакция и т.д.). В экспериментах с использованием селективных антагонистов различных подтипов глутаматных рецепторов выявлено преимущественное участие в этом процессе NMDA рецепторного комплекса (Collingridge, 1990). Характер ответов нейронов на высокочастотную стимуляцию носит двоякий характер: часть клеток (физического типа) на длительное время (часы, минуты) переходит в состояние эпилептиформной активности, более характерное для работы в условиях отсутствия факторов, подавляющих активность NMDA рецептора (ионы Mg2+, ингибирующие влияние ГАМК). У другой части нейронов (тонического типа) после нескольких спайковых разрядов возникала стойкая деполяризация мембраны, сохраняющаяся на протяжении нескольких часов и даже суток. Этот тип реакции клеток гиппокампа получил название долговременной потенциации (LTP) и лег в основу объяснения процессов нейрональной пластичности и фиксации памятного следа (Мотин В., 2000; Burgard, 1993, Danysz et al., 1995, Parsons et al., 1998).

Позитивное фармакологическое воздействие ноотропных препаратов на когнитивные функции в опытах на; поведенческих моделях имеет электрофизиологические корреляты не только в форме усиления транскаллозальных вызванных потенциалов, но и в виде облегчения потенциации и пролонгирования LTP в гиппокампе. Нооглютил, как и ряд других ноотропов (пирацетам, этимизол) в срезах гиппокампа пролонгировал NMDA - зависимую LTP в синапсах, образованных аксонами перфорантного пути и на нейронах зубчатой извилины (Абрамец И.И., 1994; Комиссаров И.В., 2001). Этими же авторами выявлен АМРА модулирующий эффект нооглютила. Так, под влиянием препарата, в концентрациях близких к эффективным антиамнестическим (4, 6, 30 мкМ) при записи возбуждающего постсинаптического потенциала нейронов зубчатой извилины, вызванного электростимуляцией перфорантного пути, регистрировался существенный прирост максимальных амплитуд

113 потенциала. В этом отношении нооглютил сходен с рацетамами: пирацетамом, анирацетамом (Абрамец И.И., 1994; Gouliaev, 1994).

Таким образом, основной механизм действия нооглюгила опосредован влиянием на АМРА подтип глутаматных рецепторов и неспецифическим связыванием с NMDA подтипом. АМРА потенциирующий эффект ноотропов зависит от концентрации и при достижении максиматьных позитивных значений снижается. В связи с этим, в высоких концентрациях ноотропы обладают депотенциирующим действием и этим исследователи объясняют, почему эти препараты не только не усиливают, но и противодействуют нейродегенеративным (эксайтотоксическим) повреждениям мозга, наблюдаемым при избыточной функции глутаматергических процессов (Комиссаров И.В., 2001).

Согласно данным литературы вещества, механизм действия которых связан с модулирующим влиянием на АМРА рецепторы глутаматной системы ампакины, обладают в эксперименте на животных ноотропными свойствами, Улучшают процессы обучения и памяти (Arai et al., 1994; Hampson et al., 1998). Нооглютил условно можно также отнести к препаратам такого типа действия. Выявленный у нооглютила нейропротекторный эффект открывает перспективу поиска нейропротективной активности у известных ампакииов.

Показано, что выраженным нейротропным эффектном обладает и ингибитор пролилэндопептидазы, соединение под шифром ИФ 8. Вещество ослабляло, вызванные интрацеребральной посттравматической гематомой нарушения обучения и памяти и неврологический дефицит. Кроме того, ИФ 8 улучшат память и уменьшат повышенную тревожность у крыс с холинергическим дефицитом. Полученные результаты позволяют предполагать, что у этого соединения помимо ноотропного определяется и нейропротекторное действие. Согласно данным литературы релизинг фактор тиротропного гормона, являющийся одним из физиологических субстратов пролилэндопептидазы оказывает положительное влияние на течение болезни Альцгеймера через взаимодействие с холинергической системой. Взаимодействие TRH с холинергическими нейронами включает, по-видимому, как пре-, так и постсинаптические эффекты: на пресинаптическом уровне пептид облегчает холинергическую нейропередачу, стимулируя скорость оборота ацетилхолина, на постсинаптическом - TRH усиливает возбуждающий эффект ацетилхолина на уровне нейронов коры (Winokur, 1978; Renaudet al., 1979). По данным Nikajima и соавторов, (1992) стимулирующий эффект ингибиторов пролилэндопептидазы на TRH -индуцированное высвобождение ацетилхолина может оказывать положительное влияние при пониженной функции ацетилхолинергической системы мозга. В свете

114 этих представлений, позитивный эффект ИФ 8 на модели холинергического дефицита может быть связан с его опосредованным влиянием через пролилэндопептидазы, на TRH индуцированное высвобождение ацетилхолина. Кроме того, среди препаратов, которые оказывают положительный эффект на течение болезни Альцгеймера есть и эндогенные нейропептиды - вещество Р и TRH (Kowall et al., 1990; Nakajima et al, 1992). Последние, являются еще и субстратом для пролилэндопептидазы и дипептидилпептидаз (Bauer, 1987).

В полученных в настоящем исследовании результатах существенный нейропротективный эффект отмечался на модели интрацеребральной посттравматической гематомы у известного препарата нимодипина. Нейропротективный эффект нимодипина отмечается как в клинических условиях, так и на различных экспериментальных моделях, сопровождающихся нейродегенеративными процессами (Yacewicz et al., 1990; Korenkov et al., 2000). По данным ряда авторов эффект препарата обусловлен его способностью блокировать кальциевые каналы и таким способом осуществлять нейропротекцию (Triggle, 1991; Casno-Abad et al., 2001). Эффективность нимодипина на модели интрацеребральной посттравматической гематомы может косвенно свидетельствовать об адекватности этой модели для анализа состояния и поведения животных после геморрагического инсульта.

Таким образом, проведенные исследования показали, что все три использованных подхода для поиска препаратов с ноотропным типом действия результативны и позволили выявить активные соединения, обладающие избирательным антиамнестическим эффектом. Кроме того, у ряда веществ обнаружена противогипоксическая активность, которая может быть прогностическим признаком нейропротективного действия (Воронина Т.А., 2000). Исследование возможного нейропротективного эффекта новых соединений, а также пирацетама, нооглютила и нимодипина на новой модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и в условиях скополаминовой модели холинергического дефицита позволило выявить у новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8), а также пирацетама, нооглютила и нимодипина. в разной степени выраженную способность ослаблять гибель, неврологический дефицит, нарушения обучения и воспроизведения памятного следа, повышенную тревожность животных.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Галаева, Ирина Петровна, 2004 год

1. Абрамец И.И., Комиссаров И.В., Король Т.И., Самойлович И.И. Исследования влияния ноотропных средств на глутаматергическую синаптическую передачу в срезах гиппокампа крыс // Архив клинической и экспериментальной медицины, т. 3, с. 3- 18,(1994)

2. Абрамец И.И., Самойлович И.И., Кузнецов Ю.В. Нейрофизиологические механизмы депотенциации синаптической передачи // Нейрофизиология, т. 30, с. 113- 121,(1998)

3. Авидон В.В. Критерии сравнения химических структур и принципы построения информационного языка для информационно-логической системы // Хим. фарм. журн., т. 8, № 8, с. 22 - 25, (1974)

4. Авидон В.В., Аролович B.C., Козлова С.П. Кодирование циклических фрагментов для анализа сходства химических структур органических соединений // НТИ. Сер. 2.№ 12, с. 21 -23, (1974)

5. Авидон В.В., Аролович B.C. Анализа сходства химических структур на основе дескрипторного языка ФКСП // НТИ. Сер. 2, № 5, с. 26 31,(1975)

6. Акопян Н.С. Электрофизиологическое исследование деятельности мозга при гипоксии // Ереван: Айастан, с. 100 119, (1987)

7. Алиев О.И., Плотникова Т.М., Воронина Т.А., Плотников М.Б. Влияние нооглютила на локальный мозговой кровоток и ЭЭГ крыс в условиях ишемии мозга// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, приложений 1, с. 12 -15,(1999)

8. Ашмарин И.П., Каменский А. А., Шелехов С. А. Действие фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ4.10) на обучение белых крыс при положительном подкреплении // Докл. Акад. наук. СССР, т. 240, № 5, с. 1245 1247, (1978)

9. Ашмарин И.П., Антонова Л.В., Титов С.А., Максимова Л.А., Каменский А.А. Возможные механизмы разнонаправленного действия АКТГ 4-10 и его аналога, содержащего D-изомер фенилаланина, на поведение // Ж. Высш. Нервн. Деят., т. XXX, №6, с. 1196- 1296, (1980)

10. Ашмарин И.П., Каразева Е.П. Нейропептиды // В книге: Нейрохимия под ред. Ашмарина И.П., Москва, с. 296 — 333, (1996)

11. И. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые • принципы поиска. Москва: Наука, (1986)12