Первичные физико-химические механизмы токсического действия меди на бактерии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук в форме науч. докл. Лебедев, Владимир Сергеевич

• Лебедев, Владимир Сергеевич
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Лебедев, Владимир Сергеевич

Актуальность проблемы.

Устойчивый интерес к различным аспектам токсического действия тяжелых металлов на микроорганизмы сформировался уже к началу XX века и был связан прежде всего с поиском и созданием на их основе эффективных лекарственных препаратов против инфекционных заболеваний. Актуальность этого направления исследований в настоящее время не только не утрачена, но даже возросла в связи с обнаружением лекарственной устойчивости у микроорганизмов после длительного применения антибиотиков в медицинской практике.

Вместе с тем в последние десятилетия результаты деятельности человека характеризуются резким возрастанием в окружающей среде различных токсичных веществ и соединений, среди которых тяжелые металлы занимают одно из первых мест. В этой связи проблема прогнозирования отрицательных последствий антропогенного загрязнения тяжелыми металлами как индивидуально, так и в комбинации с другими воздействиями, приобретает особую актуальность.

Кроме того, в последнее время микроорганизмы широко применяются для очистки сточных вод от тяжелых металлов и в качестве тест-организмов для определения качества воды. Можно надеяться, что более глубокое понимание физико-химических механизмов взаимодействия клетки с металлами позволит эффективнее использоппть микроорганизмы для решения этих прикладных задач.

Среди группы наиболее токсичных металлов для различных организмов (А£, Си, Щ) медь привлекает в последнее время наиболее пристальное внимание исследователей. Во-первых, это связано с широкими масштабами загрязнения среды указанным металлом, источником поступления которого является не только промышленность и энергетика, но и сельское хозяйство, где медь широко используется в качестве фунгицидного препарата. Во- вторых, это единственный элемент из данной группы металлов, '•ущест-венно необходимый для жизнедеятельности многих организмов.

В настоящее время накоплена обширная литература по различным аспектам токсического действия меди на клетки и отдельные биологические структуры. Установлены первичные химические реакции, запускающие процессы повреждения различных биологических макромолекул. На целых клетках различных типов и органеллах показано ингибирование медью различных биохимических процессов, включая АТФазу, цикл трикарбоновых кислот, синтез белков и нуклеиновых кислот, глутатионредуктазы, дыхания, снижение общего уровня восстановленных тнолов и ввН в клетках. Установлено также нарушение барьерных свойств мембраны. Однако, несмотря на широкий круг проведенных исследований, цельная картина развития медь-индуцированных нарушений в клетках до сих пор отсутствует.

Основная проблема заключается в том, что при действии тяжелых металлов на клетки (ЗюЬв, Bagch¡, 1995), как и при других типах воздействия (Владимиров, 1975), многие из зарегистрированных функциональных нарушений могут иметь вторичное происхождение, тогда как локализация и механизмы повреждения первичных мишеней в клетке, определяющих специфику развития патологического процесса, оставались неизвестными.

ПсрПН'ШЫМ жшнмолсПетпиям моли о клеточной шшорхносгмо »ПОЛОМ II о нисншсй стороной цитоплазматической мембраны в частности, которые, по-видимому, и должны формировать направление развития процесса повреждения, до сих пор уделяли слишком мало внимания. В значительной степени это связано с получившей широкое распространение точкой зрения, согласно которой активный транспорт меди в микроорганизмы с помощью спсцяалюмроййнноП системы прсдетптмется необходимым уелоин-ем се токсического действия на клетки (Ховрычев, 1974; ОзЬшш й а), 1987).

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы заключалась в изучении первичных механизмов действия меди ва структурно-функциональное состояние бактериальной мембраны (клеточной поверхности) и формировании на их основе концепции развития шшрежлемнй Оймфрнинмшй »метки шжелммн мяшшями пик индминдунныю, Iми и н комбинации с другими факторами внешней среды.

Задачи исследования.

1. Сравнительное исследование основных факторов токсического действия различных неорганических соединений металлов (ПДП, пшроксиди, соли).

2. Исследование мест связывания меди бактериями во взаимосвязи с профилем электрического потенциала на клеточных структурах и в зависимости от энергетического состояния клеток.

3. Изучение физико-химических механизмов мсдь-нпдуцироишиюИ проводимости мембраны и характеристика проводящих путей.

4. Обоснование наиболее общих принципов усиления активности тяжелых металлов в комбинации с другими факторами внешней среды.

Положения, преде: авлеиные к защите.

К защите представлены выдвинутые в работе положения, согласно которым первичные механизмы токсического действия различных неорганических соединений меди (в том числе и ВДП) включают в себя 2 этапа:

• Взаимодействие ионов с мишенями 1 типа (восстановленными тиолами, экспонированными на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны) с образованием вонов Си*.

• Взаимодействие ионов Си* с мишенями 2 типа с последующей активацией динамических неселективных проводящих путей (каналов) в мембране с эффективным радиусом - 0,5 нм, проницаемых для самой меди и других гидрофильных ионов и молекул. При этом специфический профиль электрического потенциала на мембранных структурах бактерий обеспечивает преимущества для индуцированного транспорта в цитоплазму различных веществ катионной природы, в том числе и лекарственных препаратов.

В соответствии с развиваемыми представлениями мстолл-индуцированный транспорт и цитоплазму рассматривается как один из наиболее общих принципов развития патологического процесса при контакте бактерий с тяжелыми металлами и усиления активности антимикробных препаратов при комбинированном воздействии.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований впервые установлено, что медь-индуцированные ионные утечки через цитоплазматическую мембрану — результат ее модификации при двухстадийном взаимодействии ионов Си2* с тиолами на внешней стороне мембраны, а не следствие активного транспорта меди в цитоплазму.

Впрвые выявлено, что истинная причина энергетической зависимости накопления меди в клетках и ее токсичности заключается в энергозависимой активности восстанавливающих центров на внешней поверхности мембраны.

Впервые показано, что большая часть накопления бактериями меди в цитоплазме осуществляется в процессе автоиндуцированного транспорта катионов металла через индуцированные в мембране проводящие пути.

Впервые установлена динамическая природа медь-индуцированных проводящих путей в мембране и охарактеризованы их основные свойства (эффективный радиус ~ 0,5 нм, низкая ионная селективность). Показано,.что через эти пути может осуществляться транспорт в цитоплазму различных токсикантов, причем при прочих равных условиях вещество катионной природы транспортируется более эффективно в соответствии с градиентом электрического потенциала между внешней средой и цитоплазмой, обеспечивая элекгронейтральность цитоплазмы в процессе массивной потери клетками катионов К*. Отрицательный доннановский потенциал в периплазме способствует проявлению катионной селективности процесса накопления, эффективно концентрируя катионы из среды и обеспечивая их высокий начальный градиент на цнтоплазматическоА мембране.

На основании проведенных исследований впервые предложена и научно обоснована физико-химическая модель индукции проводимости мембраны бактерий, согласно которой редокс-процсссы ш> ее внешней стороне с учпетием меди н белкоп управляют проводимостью встроенных в нее каналов и в конечном итоге определяют развитие патологического процесса в цитоплазме в результате автоиндуцированного транспорта меди к чувствительным мишеням в этом отсеке бактериальной клетки.

Проведенные исследования привели к заключению о том, что в основе усиления активности антимикробных препаратов тяжелыми металлами прежде всего может лежать облегчение их транспорта к мишеням действия через металл-индуцированные проводящие пути в мембране.

Научно-практическое значение работы.

Вскрытые в работе первичные механизмы токсического действия меди на клетку открывают реальные перспективы для прогнозирования эффективности комбинированных воздействий с участием тяжелых металлов и могут быть использованы при прогнозировании последствий комплексного антропогенного загрязнения окружающей среды, фиксируя шшмлпио ия то* споПстлях дополнительных потлеПстпнП. которые могут окп-зать решающее влияние на эффективность суммарного действия с участием меди и, возможно, других тяжелых металлов.

Проведенные исследования открывают также подходы к направленному поиску эффективных металлсодержащих композиций для дезинфекции ран, санитарной обработки питьевой йоды, профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на Украинской республиканской конференции "Применение радиоэлектроники и псслсдошшии сперхслмЛмх свечений биологических объектов"(Киев, 1978), Международной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест, 1980), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Республиканской конференции "Ферменты, металлы, металлоферменты в диагностике и лечении" (Ивано-Франковск, 1982), 16-й Международной конференции ФЕБО (Москва, 1984), I Советско-германском международном симпозиуме "Микроскопическая фотометрия и акустическая микроскопия в науке" (Москва, 1985), Всесоюзной конференции "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве" (Ташкент, 1986), Республиканской конференции "Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней" (Харьков, 1987), Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности" (Москва, 1988), Международном симпозиуме по биофизической химии "Успехи биоэлектрохимии биополимеров и мембран" (Йена, 1988), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" ((Пупшно, 1989), Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1990), 2 Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1995).

Личный вклад автора. Все вошедшие в диссертацию результаты получены лично автором либо при его непосредственном участии. Рад теоретических расчетов и экспериментов осуществлен в творческом сотрудничестве с коллегами из ИХФ, которым автор выражает искреннюю признательность.

Объем работы. По представленным на защиту материалам автором опубликовано 46 печатных работ.

II, КРАТКОЙ СОДЕРЖАНИЙ ПРЕДСТАВЛЕННЫХ К ЗАЩИТЕ МАТЕРИАЛОВ

Глава 1. Сравнительная характеристика токсичности тяжелых металлов в ионной форме и в виде высокодисперсного порошка (ВДП). Основные факторы, определяющие токсичность ВДП меди для бактерий в водной среде [1-16,19,21-23,29].

Интерес к всестороннему изучению биологической активности ВДП металлов был связан с выдвижением в конце 70-х годов идеи использовать их для создания в организме животного искусственного депо металлов, способного после однократного введения длительное время обеспечивать поступление необходимого элемента с целью коррекции обмена веществ или ликвидации дефицита металла в организме, возникшего в связи с тем или иным заболеванием(Федоров и др., 1979). В ходе дальнейших исследований продемонстрирована пониженная токсичность металлов при такой форме их введения в организм животных и высокая биологическая активность как в норме, так и при некоторых экспериментальных заболеваниях. При этом обычно полагают частицы ВДП биологически инертными, способными проявлять активность исключительно путем генерации ионов металла в процессе саморастворения в биологической среде. Наличие такого пути проявления активности ВДП не вызывает сомнения. Вместе с тем далеко не очевидно, что этот путь единственный. Действительно, процесс саморастворения металлов может сопровождаться образованием активных форм кислорода (ОЬапс1еЬап е( а1., 1976), участие которых в патологических процессах на различных уровнях организация биологических систем надежно установлено, и изменять состав среды (рН и содержание Ог). Кроме того, малый размер частиц (~10 от) и высокая кривизна поверхности могут существенно повлиять на скорость и направление реакций, протекающих в среде, при контактных взаимодействиях с ВДП (Морохов и др., 1977). Представленные ниже данные сравнительного изучения токсического действия ряда металлов в виде растворимых солей и ВДП на бактерии в значительной степени проясняют эту проблему.

1.1. Влияние металлов в виде солн и ВДП иа рост бактерий.

Анализ влияния на рост клеток представляет собой простой и удобный метод интегральной оценки биологической активности различных препаратов. В опытах использовали 18-ти часовую культуру бактерий Escherichia coli В, выращенную на синтетической глюкозоминеральной среде М9 в стационарных условиях при 37°С. ВДП металлов Ag, Си, Zn, AI с размером частиц -100 нм были получены в Институте химической физики АН СССР. Навески ВДП диспергировали ультразвуком в дистиллированной воде. П исходной суспензии концентрация металла составляла 1мг/мл. Для сравнения использовали растворы солей AgNO). CuCh, ZnClAICI3 и супернатанты исходных суспензий порошков.

Опыты с добавками металлов в ростовую среду показали, что алюминий не оказывал влияния на рост бактерий ни в виде соли, ни в виде ВДП даже при максимальной концентрации металла в среде. Влияние остальных металлов, вводимых в виде ноаов или ВДП, зависело от их концентрации в ростовой среде. При низких концентрациях часто наблюдалась стимуляция роста культуры. Сравнительную эффективность металлов характеризуют данные, представленные в таблице 1.1.

Та&чица 1.

Эффективность подавления роста Е. coll В в среде М9 металлами в виде ВДП и солей.

Ингибированне роста бактерий, % Концентрация металла в солн я порошке, мкг/мл

AgNO, Ag CuCl, Си ZnCl, Zn

50 0,06 15 0.27 0,7 — —

25 — — —

Как видно из таблицы, эффективность подавления роста бахтерий ионами металлов снижалась в ряду А^*>Сиг*>2пг*>А13*, что находится в согласии с данными других исследователей. Активность ВДП металлов была ниже, чем соответствующих ионов из солей. В ряду убывания токсичности металлов Си>А%>2п>А1 в сравнении с аналогичным рядом для ионов медь и серебро поменялись местами.

Как показали специальные исследования, количество новов первоначально присутствующее в суспензиях ВДП было явно недостаточно для того, чтобы за счет них объяснить наблюдаемое бактериосгатическое действие порошков. Основной эффект, очевидно, обусловлен действием самих ВДП металлов. Растворимость ВДП меди в воде была выше, чем ВДП серебра. Возможно, именно поэтому ВДП меди обладал наибольшей активностью, хотя в ионной форме активность этого металла уступала серебру.

Таким образом, представленные здесь данные предполагают два необходимых условия биологической активности ВДП металлов:

1. ВДП металлов должны растворяться в среде инкубации клеток.

2. Ионы этих металлов должны обладать биологической активностью.

1.2. Особенноств нарушения энергетических функций клетки тяжелыми металлами.

Индивидуальные особенности действия металлов на клетки лучше проявляются на начальных этапах повреждения бактерий, связанных с нарушением тех или иных функций мембраны. К одной из наиболее чувствительных функций у микроорганизмов относят энергозависимый выброс протонов из бактерий при метаболизме глюкозы (Hugo, 1976). На рисунке 1 представлены кинетические кривые выброса протонов из голодающих клеток, суспендированных в дистиллированной воде (плотность культуры составляла ~1010 кл/мл), в контрольном опыте (кривая 1) и после преинкубации в течение 30 мин с различными ТМ (кривые 2-4). н 1 4 Ч

Концентрация соли, Мкм

Рис. 1.1. Влияние ТМ на кинетику лихом протонов ю бактерий при метаболизме глюкозы ( стрелками МиГ указаны соответственно моменты введения в суспензию Е. coli металлов и глюкозы): 1 — контроль; 2—14 мкМ AgHOi или 56 мкМ Hg(CH£00),; 3 — 64 мкМ СиСЫ 4—120 мкг/мл ВДП меди.

Рис. 1.2. Изменение средней скорости выброса протонов из бактерий при метаболизме глюкозы под действием солей тяжелых металлов: 1 — AgSOf, 2 — Hg(CH!COO)J\ 3 — CuCl,.

Видно, что все изученные металлы тормозили энергозависимый выброс протонов из бактерий, однако характер торможения зависел от вида металла. Если замедление выброса протонов из бактерий под действием солей серебра и ртути начиналось непосредственно с момента введения глюкозы в суспензию, то под действием меди в виде соли или ВДП на начальном этапе выброс протонов происходил обычно с той же скоростью, что и в контроле, а через 1-2 минузы торможение прогрессивно усиливалось. Это различие четко прослеживается и на концентрационных зависимостях эффективности торможения выброса протонов (Рис. 1.2). Ряд эффективности металлов (Ag>Hg>Cu) был таким же, как и в опытах по выживаемости, однако медь в отличие от серебра и ртути была не способна полностью подавить энергозависимый выброс протонов из бактерий. Остаточный уровень энергизации сохранялся даже при увеличении концентрации меди в среде до 1 мМ. Эти факты указывают на то, что доступность чувствительных мишеней, ответственных за энергозависимый выброс протопоп из бпктериП, для Ag* и tlg3' не заниеит, а для Си1* зависит от внешних источники» энергии, что не противоречит известным представлениям о роли клеточной энергетики в токсическом действии на микроорганизмы серебра и меди (Ховрычев, 1974; Голубович, 1975).

Нами получены также данные, указывающие на определенные различия в действии меди в виде соли и ВДП на энергозависимый выброс протонов из бактерий. Несмотря на внешнее качественное сходство характера подавления выброса протонов при метаболизме глюкозы ионами меди и ВДП (рис. 1.1), предельная эффективность подавления выброса протонов последним была по крайней мере в 3 раза выше [16]. Это означает, что действие ВДП меди на бактерии не можег быть сведено исключительно к генерации ионов металла в среду в процессе электрохимического растворения, и одновременно указывает на наличие каких-то иных форм биологической активности ВДП металла, реализующихся в процессе его растворения.

К середине 80-х годов сложились достаточно четкие представления об электрохимическом растворении меди в водных растворах (Лаврентьев, Хидекель, 1983). Процесс происходит с кислородной деполяризацией и сопровождается защелачнванием среды по суммарному уравнению: 2Си° + О? + 2НтО —> 2Си2* + 40Н~, которое может быть представлено совокупностью следующих элементарных стадий:

С учетом того, что растворение ВДП меди в воде подчиняется тем же самым закономерностям [15], генерация ионов Си" при инкубации ВДП с бактериальной суспензией должна сопровождаться:

• Защелачнванием среды инкубации в процессе растворения ВДП (что отчетливо видно на рис. 1.1);

• Снижением содержания в среде кислорода;

• Образованием в среде активных форм кислорода;

• Промежуточным образованием в процессе растворения меди- ионов Си'.

Действие любого из этих факторов может в принципе внести свой вклад в токсичность ВДП (Gadd, Griffiths, 1980; Passow et al, 1961; Самойленко и др., 1983). Реальное представление об их влиянии на энергозависимый выброс протонов при взаимодействии ВДП меди с бактериями получено в работе [29]. Показано, что защелачивание среды с одновременной генерацией ионов Си** при растворении ВДП в суспензии бактерий хорошо моделирует Си(ОН)2. Скорее всего такой эффект вызван сдвигом равновесия Cu(OH)i <-+ Си2* + 20Н~ вправо при связывании Си2* с бактериями. Установившееся значение рН зависело от концентрации Си(ОН)2 и физиологического состояния бактерий. Процессы потребления О2 и генерации #?£>?, происходящие при электрохимическом растворении ВДП, п дшшой системе отсутствуют, облегчая интерпретацию донных. Отмечено следующее отличие в действии CuCl) и Си(ОН)2 на энергозависимый выброс Н* из Е. coli. Некоторое замедление скорости выброса Н* из бактерий гидро-ксидом меди в сравнении с контролем могло осуществляться непосредственно с момента добавления глюкозы, тогда как CuCh на начальном этапе такого действия не оказы-нает(рис. 1.1).

Си0 Си + е~, Си' + О; -* Си2' + О/ , Н* + 02~-+Н0% НО°} + НО°2 ->Н202 + 02.

1) (2)

Эффективности ингибирования выброса Н*, рассчитанные, как в работе [16], приведены в таблице 1.2 (ч.1). Как уже было отмечено выше, этот показатель достигает насыщения в опытах с CuCh уже при концентрации 12,8 мкг/мл (по металлу), тогда как с увеличением содержания в суспензии Cu(OH)i он продолжает возрастать. Особенно отчетливо это проявляется в опытах на свежесобранной культуре, где при использовании одинаковых концентраций CuCh и Си(ОН)2 (25,6 мкг/мл) эффективность последней в 3,7 раз выше и это не предел. Отсутствие эффекта насыщения в опытах с Си(ОН)г в той области концентраций, где он отчетливо проявляется у CuCh, и более высокая активность гидроксида указывают на наличие иных закономерностей действия последнего на активный выброс it из К coli, в сравнении с CuCh. В их основе может лежать известное влияние pH на токсичность различных металлов (Gadd, Griffiths, 1980), обусловленное либо отличием в токсичности Си2* и Cu(OH)i, либо опосредованное через увеличение реакционной способности мишеней на клеточной поверхности и/или ростом трансмембранного и поверхностного потенциалов клетки при подщелачивании среды инкубации с соответствующим ростом связывания металла с бактериями. Независимо от конкретного механизма влияния pH очевидно, что аналогичным образом может формироваться и более высокая токсичность ВДП меди в сравнении с CuCh.

Поскольку стехиометрия образования Си2* и ОН при растворении ВДП и Си(ОН)г одинакова, появляется возможность проанализировать количественное соответствие активности указанных соединений меди при одинаковой степени их растворения. С этой целью через 30 мин после введения 240 мкг/мл ВДП в аэрируемую суспензию бактерий перед добавлением глюкозы регистрировали квазиравновесное pH в среде инкубации. В параллельном опыте добивались установления такого же значения pH среды титрованием культуры клеток суспензией Cu(OH)i, после чего сравнивали эффективность ингибирования выброса Я* из £ coli указанными соединениями. Эквивалентные концентрации Cu(OH)i для одной и той ж концентрации ВДП сильно варьировали в различных сериях экспериментов, однако обычно проявлялось хорошее соответствие между действием на клетки ВДП и Си(ОИ)з. При этом максимальные эффекты были отмечены на свежесобранной культуре. В таблице 1.2 (ч.2) приведены типичные данные таких опытов. Анализ причин отмеченной вариабельности показал, что она в значительной степени связана с различной скоростью старения Е. coli в разных опытах, как было установлено по кинетике изменения pH суспензии клеток при аэрации по методике, предложенной в работе (Конев и др., 1982). Данные представленных опытов указывают на то, что в условиях аэрация активность ВДП меди обусловлена главным образом его растворением с одновременным увеличением pH среды инкубации.

Об этом же свидетельствуют опыты, показавшие отсутствие влияния НзОг на активность Сг/2* (таблица 1.2, ч.З). Из представленных в ней данных видно, что добавки к CuCh Я fit в количествах, способных образоваться при электрохимическом растворении ВДП, не изменяют активности Си'*, несмотря на известную способность tf^Oj повреждать мембрану бахтерий (Самойленко и др., 1983). Возможно, такая концентрация H-ßj недостаточна для ее повреждения.

В условиях ограниченного доступа?воздуха к суспензии бактерий токсичность меди может быть модифицирована расходованием кислорода на электрохимическое растворение ВДП. Это следует из того факта, что в условиях анаэробиоза эффективность действия меди на энергозависимый выброс протонов из бактерий резко увеличивается (таблица 1.2, ч.З).

Таким образом, из приведенных данных следует, что в основе более высокой предельной способности ВДП меди подавлять энергозависимый выброс протонов из Е. coli в сравнении с CuCh лежат следующие причины:

• Иные закономерности действия меди на бактерии при повышенных pH, создающихся в процессе электрохимического растворения ВДП.

• Снижение концентрации кислорода в суспензии при растворении ВДП.

Тойтца 1.

Эффективность подавления энергозависимого выброса Н* из £ coli различными соединениями меди в зависимости от состояния культуры и наличия в среде Hfi,

Номер Ингибнрующее соединение Концентрация меди, мкг/мл Эффективность ,отн. ед. Состояние культуры

CuCI, 12,1 1,0 ±0,05 Свежесобранная

Cud, 25,6 1,0 ±0,

Си(ОН), 12,8 U ±0,

1 Си(ОН)} 25,6 3,7 ±0,

Cud, 12,8 1,0 ±0,04 Голодаюшал

CuCI} 25,6 1.

Си(ОН)г 12,8 1,1 ± 0,

Си(ОН), 25,6 2,1 ±0,

Си(ОН), 30,7 5,7 ±0,17 Свежесобранна*

2 ВДП 30,7* 5.2 ±0,

Си(ОН), 12,3 1,1±0,06 Голодающая

ВДП 12,3* 1,1± 0,

CuCI, 16 1.0 ±0,03 Голодающая

3 CuCI, + НОмкМНгО, 16 1,1 ± 0,

CuCI, 16 >10 Голодающая анаэробная Указаны эквивалентные концентрации Cu(OH)h обеспечивающие такое же подщелачнвание суспензии, как 240 мкг/мл ВДП.

Иначе говоря, с точки зрения ингибирования выброса Я* из Е coli при метаболизме глюкозы ВДП можно рассматривать как генератор Си(ОН)2 с одновременным поглощением кислорода из среды инкубации.

Интересно отметить, что энергетические требования, отчетливо проявляющиеся при ингибировании выброса Н* ю Е. coli под действием CuCh, существенно снижаются при защелачивании среды инкубации и совершенно отсутствуют в анаэробных условиях. В последнем случае качественные различия по этому показателю между Ag", Hg2* и Си2*, характерные для аэробных условий, практически снимаются.

1J. Структурные изменеиия клеточной поверхности бактерий под действием ТМ.

После приведения в контакт с клетками тяжелые металлы, как и любые другие химические реагенты, должны в первую очередь взаимодействовать с легкодоступными структурами оболочки бактерий, экспонированными в окружающую среду (Passow et al, 1961, Hugo, 1976). Результаты такого взаимодействия ТМ с поверхностью Е. coli прослеживаются в структурных изменениях оболочки бактерий, выявляемых методом хе-милюминесцентного (ХЛ) зонда.

Этот метод основан на анализе кинетики ХЛ, сопровождающей проникновение 0,1% КМпО< в микробные клетки [3,7,10]. ХЛ возникает преимущественно в реакции между Мп(111) и карбоксильными группами белков. Кинетика ХЛ, представленная на врезке рис. 1.3, включает в себя быструю 00 и медленную (Ь) компоненты, отражающие соответственно количество и реакционную способность карбоксильных групп белкой, доступных для окислителя с наружной и внутренней стороны цитоплазматической мембраны. Развитие медленной компоненты ХЛ во времени, оцениваемое по параметру т (время достижения амплитудного значения медленной компоненты ХЛ), служит показателем проницаемости мембраны для окислителя.

0,0039 0.

Концентрация соли, мМ

0.0039 0,

Концентрация соли, мМ

Рис. 13. Влияние солей тяжелых металлов на параметры ХЛ бактерий: II (А) и 1/т (Б), возникающей под действием КМпО» 1 — Л^Оу, 2 — Н^^И^ОО),-, 3 — СиС1>

Влияние солей тяжелых металлов на параметры ХЛ Е. соН (I) и 1/т) под действием КМп04 представлено на рис. 1.3. Из него видно, что все изученные соли, начиная с некоторой концентрации, увеличивают проницаемость клеток (1/т) для окислителя. По эффективности действия на т они располагаются в следующий ряд: А^О) > Н^(СНзСОО)з > СиСЬ. Причем рост 1/т под действием Аг1Ю} характеризуется отчетливо выраженной Э-образной формой зависимости от концентрации соли.

Интересно отметить, что однонаправленным изменениям проницаемости бактерий сопутствует качественно различный характер влияния указанных выше солей на 1| (рис. I .ЗА). А^О} уже в малых концентрациях увеличивает доступность и/или реакционную способность ХЛ центров на внешней поверхности клеток. Под действием Hg(CHзCOO)2 этот показатель также увеличивается, но это происходит практически параллельно с ростом проницаемости бактерий, тогда как СиС1г в области концентраций, увеличивающих проницаемость оболочки бактерий для окислителя, снижает 1ь по-видимому, путем экранирования медью внешних ХЛ центров от окислителя [7]. Такое отличие действия О/С/? на реакционную способность ХЛ центров от солей серебра и ртути хорошо согласуется со способностью ионов Си3*, но не Ag* и Н^*, координировать кислород при связывании с биологическими структурами (Эйхгорн, 1978) в том числе и на внешней поверхности микроорганизмов (КЖп е( а!., 1987). Примечательно, что энергизация глюкозой бактерий, преинкубиро ванных с 125 мкМ CuCh, (условия активации ингибнрующего действия меди на энергозависимый выброс протонов из Е coli) вызывала освобождение от меди центров связывания металла на внешних структурах и активировала рост проницаемости клеток для XJ1 зонда [21].

Таким образом, несмотря иа определенные различия в связывании ТМ с внешней поверхностью бактерий, их действие на проницаемость клеток для ХЛ зонда имеет аналогичный характер. Как следует из сопоставлекня кинетических кривых ХЛ при обратимых и необратимых повреждениях мембраны бактерий [7, 10]. зарегистрированные нами изменения проницаемости Е coli под действием ТМ носят обратимый характер и могут рассматриваться в качестве одной из наиболее ранних стадий повреждения клеток тяжелыми металлами.

1.4. Эффективность комбинирования ТМ с различными лекарственными препаратами.

Сделанные выше предположения о первичном характере структурно-функциональных изменений в оболочке 'бактерий под действием ТМ были проверены нами по изменению чувствительности К coli к различным лекарственным препаратам в условиях роста клеток в синтетической среде в присутствии ТМ. В основе этого подхода лежит идея, впервые выдвинутая рядом ученых (Nikaido, 1976, Williams, 1979; Кузнецова, 1983), согласно которой различные антибиотики проникают в клетку к своим мишеням действия различными путами. Причем в зависимости от характера структурных изменений в оболочке под действием ТМ возможно изменение чувствительности клеток к определенной группе лекарственных препаратов.

В экспериментах использовали водные растворы AgNO} и CuCl¡, ВДП меди и лекарственные вещества: стрептомицин (СТР), неомицин (НЕО), тетрациклин гидрохлорид (ТРЦ), эритромицин (ЭРМ), левомицетика сукцинат (ЛВМ), грамицидин С (ГТМ), ак-рифлавин (АКР) — различающиеся физико-химическими свойствами (молекулярной массой, сродством к линидам, электрическим зарядом на молекуле) и механизмом действия на микробную клетку. Все лекарства использовали в суббакгериосгатических концентрациях, концентрациями металлов варьировали для получения различной степени подавления роста культуры Б. coli.

Экспериментальные данные по эффективности подавления роста Е. coli В при совместном использовании ТМ в суббактериостатических концентрациях и лекарственных веществ представлены на диаграмме 1.1. В качестве критерия эффективности использована величина К„ которая показывает во сколько раз подавление роста в опыте больше аддитивного от лекарства и металла.

Видно, что величина К, существенно зависит как от типа использованного лекарственного препарата, так и от металла. Однако, наличие общих закономерностей при комбинировании всех исследованных ТМ с лекарствами не вызывает сомнений. Так для ЭРМ, ЛВМ, ТРЦ значения К, для любого из испытанных ТМ близки к 1. Это указывает на аддитивный характер их взаимодействия с суббактериостатическими концентрациями ТМ. Сопмсщснис остальных лскарстнсннмх псщестя с ТМ приводило к увеличению К,. Эти препараты по эффективности совместного действия с ТМ располагаются в следующем порядке: UEO » СТР > АКР > ГРМ.

Диаграмма 1.

Эффективность подавления роста Е. coli при комбинировании ТМ и лекарственных препаратов (I)

1,5 2 2,

К эффективности, отн. ед.

С увеличением концентрации ТМ в пробах (диаграмма 1.2) для НЕО, СТР, АКР. ГРМ синергидное действие сохраняется, несколько меняясь в цифровом выражении, в то время как для ЭРМ, ЛВМ, ТРЦ наблюдаемый эффект зависит от типа использованного металла. Для высокой дозы СиСЬ сохраняется аддитивный характер взаимодействия с указанными препаратами, тогда как для ВДП меди ТРЦ становится синергидным препаратом, а для А%ЫОз синергидное действие распространяется также на ЭРМ и ЛВМ.

Диаграмма 1.

Эффективность подавления роста Е. coll при комбинировании TM е лекарственными препаратами (II)

4 в а

К эффективности, отн. ед.

Указанные факты могут означать, что низкие дозы использованных ТМ имеют идентичный механизм воздействия ва бактерии, сохраняющийся неизменным с увеличением дозы CuCh и способный модифицироваться с ростом концентрации ВДП меди и AgNO}, по-видимому за счет подключения дополнительных мишеней бактериальной клетки, чувствительных к повышенным дозам последних.

Анализ физико-химических свойств и мишеней действия в клетке исследованных лекарственных соединений, представленных в табл. 1.3, показывает, что в группу препаратов, синергидно действующих с низкими концентрациями ТМ, входят соединения с различной молекулярной массой и сродством к липидам. Мишени их действия в клетке также различаются. Единственное свойство, которое их объединяет — высокий положительный заряд на молекуле в растворе (£+2). В группу препаратов, неэффективных при комбинировании с низкими концентрациями ТМ, напротив, входят препараты с отрицательным зарядом (ТРЦ, ЛВМ) и ЭРМ с зарядом +1 на молекуле. Низкая эффективность последнего при комбинировании с металлами возможно связана с тем, что в отличие от других положительно заряженных препаратов, использованных в работе, для ЭРМ основное препятствие ва пути к мишеням в клетке представляет внешняя, а не цитоплазматическая мембрана бактерий Е. coli.

Таблица-1.}

Физико-химические характеристики исследованных лекарственных соединений.

Лекарственное соединение Молекулярная масса Сродство к липндам Мишень Заряд неоншшн 615 гидрофильный рибосомы + стрептомицин 581.6 гидрофильный рибосомы + акрифлавин 224 амфифильиый ДНК + грамицидин С 1100 амфифипьный мембрана + тетрациклин 479 амфифильиый рибосомы левомицетина сук-цинат натрия 428 амфифнльный рибосомы эритромицина фосфат 734 гидрофобный рибосомы +

Из представленных выше данных следует, что наличие положительного заряда на молекуле лекарства — скорее всего необходимое условие достижения высокой антимикробной активности при его комбинировании с препаратами меди и серебра. С учетом того факта, что для большинства из изученных соединений мишени расположены в цитоплазме бактериальной клетки, увеличение чувствительности бактерий к катион-ным лекарствам под действием ТМ может быть обусловлено влиянием, этих металлов на процессы транспорта указанных соединений в микроорганизм.

На нуги транспорта лекарств из внешнего раствора к расположенным в цитоплазме мишеням (ДНК и рибосомы) лежат два основные препятствия: внешняя и цитоплазматическая мембраны(рис. 1.4). Первая из них представляет собой липидный бислой, покрытый липополиспхприлами и пронизанный белковыми каналами с диаметром пор ~1 им. Л шорня - лшшдиый Спелой с пстросплмми м него белками, расположенными на его поверхности или пронизывающими его.

С точки зрения проницаемости для различных молекул эти мембраны существенно отличаются друг от друга. Благодаря белковым каналам внешняя мембрана легко проницаема для гидрофильных молекул и ионов малого размера. С увеличением гидрофобно-сти растворенных в окружающей среде веществ сопротивление каналов для них резко увеличивается. Через липидные гидрофобные участки внешней мембраны такие вещества не могут проникать, поскольку обычно доступность этих участков сильно ограничена расположенными на внешней стороне липополисахаридами. внешняя мембрана каналы \ периплазма внешней мембраны белки рибосомы \ цитоплазматическая липополисахариды цитоплазма мембрана

Рис. 1.4. Схема бактериальной клетки с мишенями действия исследованных лекарств.

В то же время цитоплазматическая мембрана легко проницаема для гидрофобных веществ через липидный бислой и представляет существенное препятствие для гидрофильных молекул и ионов. Транспорт таких соединений через нее обычно требует энергии, освобождаемой клетками в процессе обмена веществ. С учетом того, что в процессе жизнедеятельности клеток между цитоплазмой и внешней средой возникает разность электрических потенциалов (Дф «150 мв) со знаком "-" внутри, которая, как полагают, может быть движущей силой для транспорта катионов в клетки, влияние свойств обеих мембран на транспорт катионных лекарств в бактерии качественно можно описать простой эквивалентной электрической схемой (рис. 1.S).

Окружающая среда

Соотношение сопротивлений мембран для разных ионов

Гидрофильные катионы малого К.„«К1Ш1( размера

Амфифильные катионы

Гидрофобные катионы К.„»К„„.

Цитоплазма

Рис. 1.3. Эквивалентная электрическая схема транспорта катионов в клетку.

Где Дф — разность электрических потенциалов между цитоплазмой и внешней средой; R,M — сопротивление внешней мембраны потоку катионов; ■Миш — сопротивление ци-топлазматической мембраны потоку катионов. При этом величина тока в цепи эквивалентна потоку катионных лекарств по градиенту электрического поля. Различия в лроницаемостн мембран для гидрофильных и гидрофобных ионов, рассмотренные выше, можно учесть, задавшись соотношением R»„ и Ru™, приведенным на рис. 1.4 с учетом свойств внутренней и внешней мембран.

В рамках этой модели возможны следующие основные механизмы влияния металлов на потоки катионных лекарств в клетку:

• Под действием Ag и Си может увеличиваться Д(|>. Гиперполяризация биологических мембран под действием различных металлов по литературным данным весьма возможна.

• Обработка клеток металлами может уменьшать R«.

• Под действием металлов может уменьшаться Rum,.

В первом случае согласно эквивалентной схеме поток лекарства в клетку в, следовательно, его токсичность должны увеличиваться независимо от сродства к липидам и заряда катиона. Из приведенных выше данных видно, что такие закономерности в действительности отсутствуют. По мере увеличения гидрофобности катионных лекарств эффективность их комбинирования с медью снижается.

Если бы металлы работали по второму механизму (снижая R,M), увеличение антимикробной активности должно быть наименьшим для гидрофильных лекарств, т.к. для них и неповрежденная внешняя мембрана обладает низким сопротивлением. Однако в действительности комбинирование гидрофильных антибиотиков с Ag я Си — наиболее эффективно.

Полученные данные находятся в наилучшем согласии с моделью, если допустить, что под действием ТМ уменьшается Ящы. Действительно, согласно модели, по мере увеличения гидрофобности катионов ЦПМ в отсутствие металлов оказывает все меньшее сопротивление потоку лекарства в сравнении с ВМ. Поэтому эффективность комбинирования катионных лекарств с металлом должна уменьшаться с ростом их гидрофобности, что находится в полном сог ласии с экспериментом. Ряд снижения гидрофильности и эффективности комбинирования катионных соединений с Ag я Си качественно совпадают:

СТР*ШО>АКР«ГРМ>ЭРМ

Таким образом, исходя из предложенного механизма действия суббактериостатических концентраций ТМ на бактериальную клетку, наибольшей эффективности при комбинировании с Agil Си следует ожидать от гидрофильных катионных лекарств с низкой молекулярной массой, способных легко проникать через каналы внешней мембраны. При этом величина заряда не играет решающей роли.

Необходимо отметить, что с ростом дозы ТМ проанализированные выше закономерности сохраняются в прежнем виде только в присутствии CuCl} (см. диагр. 1.2), а для AgNOj и Си-ВДП группа синерпцных лекарств расширяется, по-видимому, за счет включения дополнительных механизмов воздействия на клетки этими препаратами. Доказательства включения таких механизмов при действии на клетки ВДП меди получены нами в следующем разделе.

1.5. Чувствительность к ВДП меди мутантов Е. coli В, резистентных к CuClj.

Как уже отмечалось выше, ионы Си2*, выделяемые в процессе растворения ВДП. — только одни из факгоров биологического действия металлической меди. Выявить значимость других факторов, сопутствующих растворению- ВДП, — задача, требующая специальных подходов. В основу выбранного нами подхода положено изучение, биологического действия ВДП-Сн на мутанты бактерий, резистентные к ионам металла.

В работе использовали спонтанные и индуцированные нитрозометилмочевиной мутанты Е. coli В, устойчивые к солям меди (Сир1 мутанты). Для разделения мутантов на группы с различным механизмом устойчивости к CuCh анализировали влияние Си2* на чувствительность бактерий к СТР. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.4.

Таблица 1.

Рост Сир* мутантов и исходного штамма Е colt В в среде М-9 с препаратами меди, СТР и их композицией

Содержание Рост клеток Рост (•/• к контролю) в присутствии препаратов, мкг/мл

Номер мутанта CuCl, в селективной среде, мкг/мл в контроле, А, 630 CuCh 30 ВДП-Си 10 СТР 1 СТР+СиС/, 1+

1* J76 0,402 121 ±8 3,0 ±0,5 99 ±4 2,4 ± 0,

2* J76 0,433 64±5 2,8 ±0,3 95 ± 5 7,8 ±0,

3* 384 0,420 99±6 5,5 ±0,6 98 ±5 3,8 ± 0,

4* 384 0,417 109 ±4 4,6 ±0,7 97 ±2 2,4 ± 0,

5 192 0,538 105 ±7 5,4 ±0,5 82 ±6 2,0 ± 0,

6 192 0,510 90±6 ИД ±0,8 88 ±3 1,2 ±0,

7 192 0,550 104 ±3 10,5 ±0,4 96 ±4 4,0 ±0,

8 192 0,454 99±5 9,5 ±0,7 95 ± 5 4,0 ±0,

20 192 0,515 105 ±8 20,2 ± 1,7 89 ±6 99,0 ±

Исходный штамм 192 0,640 — — 90 ±4 2,8 ± 0,

Примечание. Концентрации СиС1] указаны в пересчете на металл. Для исходного штамма в присутствии 1,2 мкг/мл СиС11 рост составлял 2,1% от контроля; при совмещении с СТР в синергидмой композиции концентрация СиС!г составляла 0,6 мкг/мл. — индуцированные мутанты

Из приведенных в ней данных видно, что резкое подавление роста исходного штамма Е. coli В наблюдается уже при содержании 1,2 мкг/мл СиС12 в среде, в то время как рост Сир* мутантов существенно не отличался от контрольного при наличии 30 мкг/мл CuClj в среде. Высокая устойчивость к CuCh была характерна как для спонтанных, так и для индуцированных мутантов.

У большинства мутантов (Сыр* 1 — 8) чувствительность к композиции, составленной из суббактериостатических концентраций СТР и CuCh, была значительно выше, чем к отдельно взятым ее компонентам, как и у клеток дикого типа. Мутант СирR 20 в этом отношении резко отличался от остальных отсутствием синергидного эффекта. Отличие этого мутанта проявлялось и в окраске колоний при выращивании бактерий на селективных средах. В этих условиях темная окраска колоний появлялась только у мутантов Сир* 1 — 8. Совокупность этих свойств предполагает различный механизм резистентности к CuCl} У указанных групп Сир" мутантов:

• Повышенный синтез медьхелатирующих соединений в клетке у СирЙ 1 — 8.

• Изменения в мембране бактерий у Сир" 20.

Из приведенных в таблице данных видно, что все мутанты Е coli чувствительны к ВДП-Cu. Мутанты первой группы (1 — 8) по этому показателю значительно варьировали. В среднем спонтанные мутанты (5 — 8) оказались более устойчивыми, чем индуцированные (1 — 4). Причины такой дифференцировки мутантов по их устойчивости к ВДП-Cu в настоящее время неясны. Однако очевидно, что для всех мутантов без исключения их чувствительность к ВДП-Cu нельзя отнести за счет генерации ионов Си2* в процессе электрохимического растворения металла. Действительно, максимальное количество ионов меди, способных образоваться при полном растворении ВДП-Cu, составляет 10 мкг/мл. Такая концентрация Си2* явно недостаточна для подавления роста Сир" мутантов, резистентных к 30 мкг/мл CuCh в пересчете на металл. Следовательно, в основе токсического действия ВДП-Сы на СирR мутанты Е coli должны лежать другие причины. Главная из них, по-видимому, связана с токсическим действием активных форм кислорода, эффективно образующихся в процессе растворения ВДП-Cu.

Резюме.

Таким образом, представленные здесь данные указывают на два необходимых условия биологической активности ВДП металлов:

1. ВДП металлов должны растворяться в среде инкубации клеток.

2. Ионы этих металлов должны обладать биологической активностью.

На ранней стадии повреждения бактерий действует только ионный фактор токсичности ВДП-Cu, эффективность которого зависит от pH среды и содержания в ней кислорода. Рост pH и снижение концентрации кислорода в суспензии при растворения ВДП лежит в основе более высокой предельной способности последнего подавлять энергозавнсн-мый выброс протонов из Е. coli в сравнении с CuCh. Токсичность активных форм кислорода, образующихся в процессе растворения ВДП, на ранних стадиях повреждения клеток нами не выявлена. По-видимому, она проявлялась только при высоких концентрациях ВДП (опыты по комбинированию ВДП с лекарственными препаратами и Сир" мутантами Е. coli).

Начальная стадия повреждения бактерий различными TM (Ag, Hg, Си) имеет идентичный характер и отчетливо проявляется в ивгибировании клеточной энергетики, сопровождающейся обратимыми структурными изменениями клеточной поверхности, выявляемыми по росту проницаемости клетки для XJI зонда и ряда лекарственных препаратов. Наиболее важное отличие в действии Си на покоящиеся бактерии заключается в том, что ее токсичность эффективно реализуется только в присутствии энергетического субстрата в среде инкубации. Важно отметить, что энергетические требования существенно снижались при защелачивании среды инкубации и не проявлялись в анаэробных условиях.

На основании проведенных исследований предложена простейшая модель ТМ-индуцированного увеличения чувствительности бактерий к лекарственным препаратам катнонной природы. В рамках этой модели существенными элементами первичных структурно-функциональных изменений в клетке под действием Ag, Hg, Си может быть модификация электрических свойств микроорганизма и/или барьерных свойств клеточной поверхности (прежде всего цитоплазматической мембраны).

Глава 2. Медь-индуцированные ионные потоки в бактериях [18,20, 24-27,30-391.

В рамках предложенной выше модели на ранних этапах повреждения бактерий тяжелыми металлами можно ожидать изменения их электрических и/или барьерных свойств, направленного ва эффективное дополнительное накопление клетками катионов из среды инкубации. Для экспериментальной проверки этой модели необходимы исследования медь-индуцированных ионных потоков в бактериальных клетках с учетом изменения электрических характеристик микроорганизма.

2.1. Электрические свойства бактерий Escherichia coli.

Важная роль электрических свойств клеток при нормальном функционировании и развитии патологических процессов в различных организмах в настоящее время не вызывает сомнения. Действительно, трансмсмбршшый потенциал пн энсргосолряппоших мембранах выступает в качестве первичной формы энергии, запасаемой клеткой в процессе метаболизма (Скулачев, 1989), и достигает в бактериях значений порядка 180 мв (со знаком внутри). Потенциалы на внешних структурах клетки формируют ионное окружение макромолекул, контактирующих с окружающей средой и могут участвовать в транспорте катионов в микроорганизмы (Theuvenet, Borst-Pauwels, 1983). Важно отметить, что при различных воздействиях ( в том числе и под действием ТМ) электрические характеристики клеток могут изменяться (Кульский и др., 1982), хотя причины, лежащие в основе этих изменений часто остаются неизвестными. Интерпретация такого рода данных затруднена тем обстоятельством, что исследователи в этих работах обычно оперируют с каким-либо одним электрическим параметром клеток, оставляя без внимания другие электрические характеристики, участвующие в формировании профиля электрического потенциала клетки. Следует отметить, что до недавнего времени представления о нем носили фрагментарный характер. Наиболее полные исследования профиля электрического потенциала в бактериях К coli В были проведены в нашей лаборатории в рамках исследования первичных механизмов токсического действия меди на бактерии [ 18,20,27,31 ].

Экспериментально измеренные нами электрические потенциалы нп различных участках клеточной структуры с использованием методов флюоресцентных зондов, электрофореза н проникающих через мембраны липофильных и гидрофильных катионов позволили рассчитать профиль электрических потенциалов (рис. 2.1) и оценить возможности его изменения при различных воздействиях.

Необходимо отметить, что электрическое ноле клетки формируется двумя категориями (разновидностями) электрических потенциалов:

1. Потенциал, создаваемый электрогеннымн насосами, встроенными в цитоплазмати-ческую мембрану, в процессе жизнедеятельности бактерий путем выброса катионов из цитоплазмы в окружающую среду против градиента их концентрации. Этот потенциал ПШвППнт роль мерпичиом) источника »иарпш кишки, xnpnKtcpittyoi рпГ><>. ту по переносу заряда из внешней среды в цитоплазму бактерий и обычно называется трансмембранным потенциалом клетки.

2. Друга* разновидность потенциалов » клетке формируется электрическими зарядами, встроенными в различные клеточные структуры (заряженные лиииды п цитошшзмп-тйчмшй и внешней мемЛршшн и шжии'мяярпдм а моямомПряшшм пртчртичпе, называемом периплазмой). Распределение и плотность этих зарядов не претерпевает сколько-нибудь существенных изменений при истощении бактерий и поэтому задаваемое ими электрическое поле имеет консервативный характер, не зависящий от энергетического состояния клеток.

Рис. 2.1. Профиль метрических потенциалов в бактерии £ cnli при двух значении ионной силы:

1—20 мМ; 2 — 200 мМ.

Писшнсс электрическое поло клетки (с пнсшнеП стороны цитоплйзмягичоской мембраны) формируется доннановским потенциалом периплазмы (рис. 2.1) и электрическими зарядами липополисахаридов, расположенных на наружной стороне внешней мембраны. Это поле концентрирует катионы среды на внешних структурах клетки, обеспечивая ей условия для нормального функционирования. В то же время его величина сача находится под эффективным контролем ионного состава окружающей среды в хорошем соответствии с уравнениями Доннана для периплазмы и Чепмена для наружной стороны внешней мембраны (рис. 2.1). Следует отметать, что емкосп. периплазмы для катионов значительно превышает эффективную емкость поверхностного слоя зарядов на мембране. Поэтому первично накопленные клетками катионы из среды инкубации под действием внешнего электрического поля концентрируются главным образом в периплазме даже в том случае, когда величина электрического потенциала на указанных структурах близка по абсолютной величине (например, при высокой ионной силе в среде).

В свою очередь внутриклеточное поле формируется трансмембранным потенциалом и высоким зарядом внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Это поле изолировано от прямого воздействия на него гидрофильных ионов окружающей среды (рис. 2.1) из-за барьерных свойств цитоплазматической мембраны. Его участие в транспорте жизненно важных ионов через эту мембрану, таких как К*, S'a*, M<¿*, Ce?*, находится под контролем клеточных процессов, регулирующих работу специализированных транспортных систем. Катионная емкость цитоплазмы по порядку величины близка к емкости периплазмы. Основной катион цитоплазмы — К*. Его концентрация в обычных условиях достигает 300 — 400 мМ.

Тпким oвнутриклеточного поля к процессу неселективного накопления гидрофильных катионов возможно либо в случае нарушения барьерных свойств цитоплазматической мембраны, либо при активации неселективных каналов в мембране. Наличие последних в мембране бактериях в настоящее время не доказано, хотя имеются веские основания предполагать, что протонный канал — далеко не единственный канал в бактериальной мембране (ХагаХй, РейоШ, 1988; "акт ег а1„ 1989; Ое1соиг М а1., 1989).

Из проведенного анализа электрических свойств клетки следует, что в принципе неселективное увеличение накопления катионов бактериями может быть реализовано различными путями (например, увеличением плотности отрицательных зарядов на внешних структурах клетки с соответствующим увеличением электрического потенциала в данной области или ростом трансмембранного потенциала при условии наличия небольшой фоновой проводимости мембраны для данного класса катионных препаратов). Однако очевидно, что наиболее эффективно этот процесс может быть запущен увеличением неселективной проводимости цитоплазматической мембраны для катионов. В этом отношении детальный анализ возможных путей активации неселективного накопления катионов бактериями не противоречит упрощенной модели, представленной в главе 1 для объяснения причин увеличения чувствительности бактерий к катионным лекарственным препаратам под действием суббакгериостатических концентраций меди и других тяжелых металлов.

12. Медь-нндуцированное накопление клетками различных катионов.

Основные положения о механизме влияния меди на чувствительность бактерий к катионным лекарствам, вытекающие из предложенной модели, были проверены нами экспериментально. С этой целью изучали накопление катионных лекарств (СТР и АКР) покоящимися клетками, суспендированными после выращивания в не содержащем питательных веществ 10 мМ Трис-НС1 буфере (рН1,2), >й истощенными 2,4-динитрофенолом (ДНФ). Первые, как известно, способны длительное время (обычно более суток) поддерживать большую разность электрических тггенциплоп между цитоплазмой и внешней средой (Д<|> = -130 — 150 мв). Тогда как вторые в значительной степени деполяризованы ( при этом Д

Экспериментальные данные по накоплению покоящимися клетками стрептомицина (рис. 2.2) не противоречат предсказаниям модели. Действительно, из представленных на нем данных видно, что в отсутствие меди кривые связывания СТР клетками с различным Д

Вместе с тем после 30 мин преинкубации с медью клетки указанных типов резко отличались по способности накапливать катионы лекарства. У истощенных ДНФ бактерий она сохранялась на уровне контроля (в отсутствие меди). Покоящиеся клетки в этих условиях накапливали СТР значительно эффективнее. Очевидно, что процесс трансформации накопительной способности для катионов лекарства как-то связан с наличием у последних эндогенных энергетических ресурсов.

Рис. 2.2 Рис. 2.

Рис. 22. Накопление стрептомицина клетками £ coli в зависимости от концентрации препарата, введенного в суспензию, при различном содержании в среде инкубации СиС/г: 1,1"—0;2,2' — 5,0; 3,3' — 10 мкг/мл; 1 — 3 — свежесобранные £. coli-, Г — 3' — истощенные ДНФ.

Рис. 23. Изменение трансмембранного потенциала £ coli под действием 130 мкМ CuCI, (1) и при одновременном введении 130 мкМ СиС1} и 200 мкг/мл стрептомицина (2); момент введения препаратов показан стрелкой.

На энергетические затраты клетки в присутствии меди указывает кинетика изменения Дф после контакта бактерий с металлом (рис. 2.3, кривая 1). Из представленных на нем данных видно, что под действием меди часто наблюдаемый кратковременный рост Дф на начальной стадии воздействия сменяется устойчивой деполяризацией клеток. Новое равновесное значение устанавливалось через 25 — 30 мии и было на 50 — 60 мв ниже первоначального уровня. Модификация условий опытов (одновременное введение лекарства и меди в суспензию бактерий) приводила к устранению начальной пшерполя-ризации (рис. 2.3, кривая 2). При этом деполяризация клеток происходила значительно эффективнее. Поскольку равновесное значение Д

Важно отметить, что выявленная нами способность меди индуцировать накопление клетками катионов СТР оказалась в значительной степени неспецифичной к типу катиона. Так в аналогичных условиях медь индуцировала накопление бактериями £ coli катионов акрифлавина, магния и кальция с близкой эффективностью (Табл. ? 1) [25, 26).

Представленные в таблице данные получены исходя из предположения, что при контакте клеток с медью в ЦПМ образуются каналы с неспецифической проводимостью, подключающие Д

Таблица 2.

Эффективность индуцированного СиС1г накопления различных катионов покоящимися бактериями £ coll.

J6 Катион MB

1 СТР2*

2 АКР3*

3 Afe"

4 Со"

В свете изложенных выше данных о медь-шщуцировшшом неспецифическом накоплении покоящимися бактериями различных катионов интересно проанализировать характеристики связывания меди бактериями в состоянии покоя и после их истощения ДНФ, тнчтпмгтитииеь речупм«1-ймй нитей рйОтм |15|, иредогйппениымм на |ик<, 7 4, и которой количество связанного металла определяли методом итомно-абсорбционпой спектрофотометрии.

Рис. 2.4. Характеристики накопления меди бактериями Е со/1 а коорлиютах Скегчарл» (10 «М !)'«>* Оуфер, ¡М1,)У о — покоящиеся клетки; • — истощенные бактерии.

Указанные характеристики определены для концентрации клеток, эквивалентной оптической плотности культуры Оис "5,0 на длине волны 630 нм.

20 40 [Си '*],„, мкг/нл

На этом рисунке приведены данные по связыванию меди в координатах Скетчарда, которые обычно применяют для анализа характеристик связывания малых молекул и ионов с биологическими структурами. По оси абсцисс отложена концентрация связанного металла, а по оси ординат — отношение концентраций связанной клетками меди к находящейся в окружающей среде. Из представленных данных видно, что во всех опытах плавный ход кривых нарушается наличием экстремальных точек (локальных максимумов), обусловленных наличием локальных кооперативных участков связывания на мембране (Тапако, Берман, 1983). Не принимая во внимание локальных максимумов, что соответствует их автоматическому включению в число тех мест связывания меди. которые преимущественно заполняются металлом в области проявления экстремальных точек на графике Скетчарда, были проведены расчеты параметров связывания металла с бактериями в различном физиологическом состоянии. Согласно этим расчетам истощенные бактерии (нижняя кривая) имеют 2 типа независимых мест связывания меди. Для первого типа число мест NI-2.79X10*5 м/л и константа связывания Ki«l,79x10s М"1. Соответственно для второго типа мест: N¿=6,4x10"* м/л и Kj=5,63xl02 М"'. Параметры, определенные для сипьносвязывающих мест (1-й тип), сохраняют свои значения при переходе к покоящимся бактериям (верхняя кривая), тогда как места, слабосвязываю-щие медь (2-й тип), ведут себя как кооперативные с коэффициентом Хилла п=1,8 [32]. Эффективность связывания меди этими местами в неистощенных клетках значительно выше, чем в истощенных бактериях (рис. 2.4). Этот факт находится в полном согласии с представлениями о том, что накопление меди бактериями находится под контролем клеточной энергетики (Baldry, Dean, 1980), однако, представляется маловероятным, что в его основе лежит активный транспорт меди в клетку в классическом понимании этого процесса. Действительно, основное назначение систем активного транспорта микроэлемента заключается в том, чтобы обеспечить клетку необходимым количеством этого элемента в условиях его низкого содержания в окружающей среде. Однако, в наших опытах мы не нашли различий в эффективности накопления меди покоящимися и истощенными бактериями в таких условиях (см. рис. 2.4). Только после достижения в среде некоторой пороговой концентрации металла эффективность его накопления покоящимися клетками резко возрастала. Кроме того, эта эффективность находилась под контролем ионной силы среды инкубации [32] и резко снижалась с увеличением последней. С учетом того, что медь в таких концентрациях индуцировала также неспецифическое накопление клетками различных катионов, как уже говорилось выше, обнаруженное нами явление эффективного энергозависимого связывания меди местами 2-го типа следует очевидно рассматривать как энергозависимый автоиндуцировааяый транспорт меди в бактериальную клетку, природа которого, по-видимому, аналогична той, которая имеет место при медь-индуцированном неспецифическом накоплении других катионов.

2.3. Ионные утечки из клеток под действием меди.

Выше было показано, что медь вызывает деполяризацию бактерий и индуцирует перераспределение ионов между клеткой и внешней средой. Для понимания сущности происходящих процессов важно понять в какой степени в них принимают участие главные яоны цитоплазмы: анионы неорганического фосфата и катионы К*.

Содержание Р„ в клетках достигает 40 — 80 мМ (Otto et al., 1984), обеспечивая 1000-кратный градиент, направленный против электрического поля в мембране. В связи с этим утечку фосфатов из клеток по градиенту электрического поля можно рассматривать как постоянно действующий деполяризующий фактор. Способность серебра индуцировать утечку фосфатов из Е coli хорошо известна (Schreurs, Rosenberg, 1982). Ниже экспериментально проверена способность меди модифицировать мембрану подобным образом. Результаты проверки представлены на рис. 2.5.

Из приведенных на нем данных видно, что покоящиеся бактерии не могут длительное время удерживать Р„ на первоначальном уровне. Примерно через 1 ч скорость выхода фосфатов достигает своего максимального значения (20 мкМ/ч по приросту Рн в среде инкубации), постепенно снижаясь с увеличением времени инкубации (кривая 1). В присугствин 100 мкМ Ag* выход этого аниона из клеток происходит без начальной задержки н с более высокой скоростью (кривая 2). Уже через 2,5 ч концентрация фосфата в среде достигала своего предельного значения, величина которого указывала на полное снятие концентрационного градиента этого аниона па мембране £ coli [37].

При обработке покоящихся бактерий медью кинетиха выхода фосфатов из клеток (кривая 3) сохраняет такой же вид, как и в контроле (кривая 1). В этом случае скорость утечки даже несколько понижена. Очевидно, что нарушение барьерных свойств мембраны под действием CuCh, проявляющееся в снижении Л<?, не затрагивает путей утечки Д.

Присущая покоящимся клеткам утечка фосфата предотвращались в присутствии энергетического субстрата (кривая S). В начальный момент после введения глюкозы содержание Рн в среде несколько снижается, очевидно, за счет его поглощения клетками, а затем восстанавливается и долго поддерживается на исходном уровне. Приведенные данные показывают, что для длительного поддержания большого градиента концентрации фосфата через мембрану требуется непрерывный приток в клетку метаболической энергии. В присутствии CuCfe он, по-видимому, прекращается через несколько минут, поскольку именно за это время происходит полное ингибнрование медью энергозависимого выброса Н* из бактерий, связанного метаболизмом глюкозы (см. раздел 1.2). Наблюдаемый рост утечки фосфата в данном случае (кривая 4), скорее всего, — следствие прекращения притока энергии в клетку от метаболизма глюкозы, а не дополнительного повреждения медью мембраны энергизованных бактерий. В пользу этого предположения свидетельствует и то, что после обработки медью утечка фосфата из покоящихся и энергизованных клеток характеризуется одной а той же кривой.

Таким образом, проведенные исследования показали, что медь в отличие от серебра не увеличивает проницаемость мембраны £ coli для Р„. Дополнительная утечка фосфата из £ coli отсутствовала при воздействии CuCh как на покоящиеся клетки, так и па бактерии, энергизованные глюкозой, и, по-видимому, не могла служить причиной индуцированной медью частичной деполяризации бактерий, отмеченной нами ранее.

Утечку калия из микроорганизмов вообще и из бактерий в частности могут вызывать самые различные воздействия. .Тяжелые металлы, в том числе и медь, известны своей способностью индуцировать утечку К* из клеток. Одно время полагали, что утечка калия при действии на микроорганизмы тяжелых металлов характеризует необратимую гибель клеток (Passow, Rothstein, i960), однако в более поздних исследованиях на различных металлах эта гипотеза не нашла подтверждения (Kuypers, Roomans, 1979; Cabrai, 1989). Сам факт индукции медью утечки калия настолько хорошо известен, что вызывает удивление отсутствие в отечественной и зарубежной литературе работ, посвященных выяснению хотя бы наиболее общих закономерностей этого процесса во взаимосвязи с другими изменениями в клетке, вызванными тяжелым металлом. Проведенные нами исследования восполняют этот пробел.

В этом исследовании мы исходили из принципа сохранения электронейтральности цитоплазмы в процессе утечки К* из бактерий. Поскольку главный противоион калия — Р„ не покидает пределов клетки под действием меди, а различные катионы из среды инкубации, напротив, под действием меди накапливаются более эффективно, как было показано выше, утечку К* из бактерий целесообразно было проанализировать в рамках медь-индуцированного обмена катионами между клетками и внешней средой. Этому вопросу посвящен следующий раздел наших исследований.

2.4. Катионный обмен между клетками и внешней средой как основная форма медь-индуцированной проводимости цитоплазматической мембраны бактерий.

Сопоставляя результаты наших исследований по медь-индуцированному накоплению различных катионов с многочисленными литературными данными о способности меди вызывать утечку 1С из клеток, естественно было предположить наличие определенной взаимосвязи между этими процессами. И действительно, дальнейшие исследования показали, что СиСЬ в концентрациях, вызывающих дополнительное поглощение катионов из среды инкубации, индуцирует утечку из клеток К*. Результаты одного из опытов, в котором одновременно изучали кинетику выхода из клеток К* и поглощение ы* под действием 100 мкМ СмС/г, представлены на рис. 2.6.

Рис. 2.6. Кинетика изменения содержания в среде инкубации катионов Со" и /Г при индуцированной СиС!} утечке ¡С ю Е. coli. Стрелками без сопроводительных надписей ухазаны моменты введения в суспензию 200 мкМ CoC/j.

4 8 12 18 t, мин

Из него следует, что после введения 200 мкМ СаСЬ в суспензию интактных клеток (кривая 1) концентрация Со1* в среде скачком возрастает от фонового значения (20 мкМ в данном опыте) до 72 мкМ и далее не изменяется. Это означает, что -75% добавденного Са2' быстро поглощается клетками. Высокая скорость процесса в совокупности с известной способностью систем активного транспорта Са1* у бактерий выбрасывать его из цитоплазмы (Rosen, 1987) указывают на то, что катион поглощается внешними относительно ЦПМ структурами клетки. И уровень его накопления скорее всего в основном должен определяться доннавовским потенциалом периплазмы К. col! (смотри |кидел наотииий (wCUtm),

После введения в среду CuCl¡ концентрация Са1' в ней скачком увеличивается еще на 12 мхМ, очевидно, за счет его частичного замещения в клетках медью, а затем с некоторой задержкой начинается поглощение Са2* бактериями. Йа начальном этапе этот процесс протекает емнхрошш и утечкой из клеток К*. Однако часто на заключительной стадии отмеченная синхронность нарушается, и ва фоне продолжающейся утечки К* из клеток шшровленве движения Са3* обращается а некоторое количество этого катиона выходит из бактерий. Введение в эту же пробу после установления равновесия новой порции CuCl] приводит к дополнительной утечке К* и поглощению Са2* (показано на рни. 2.6 пунктиром): Тйкйя vHHK|imiiK(« tti уктымя НЙ пяннчме инределешшН некими связи между потоками этих ионов. Вместе с тем жесткое сцепление между ними отсуг-ствует.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Лебедев, Владимир Сергеевич

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Руденко А.П., Лебедев B.C., Цибанова И.В. Исследование хемилюминесценции, сопровождающей каталитическое разложение перекиси водорода в присутствии сульфата трехвалентного железа в водном растворе. \Журнал физической химии. 1975, Т.49, С. 776-777.

2. Лебедев B.C., Лысов В.Д. Схема счета фотонов. \Приборы и техника эксперимента. 1975, №6, С. 97-98.

3. Лебедев B.C., Чернышева Т.М. О природе инициированной КМпОч хемилюминес-ценции бактериальных клеток. Научные доклады высшей школы. \Биологические науки. 1976, №5 С. 24-27.

4. Лебедев B.C., Каланин Ю.Т., Комаровских К.Ф.,Чернышева Т.М. Использование хемилюминесцентных свойств электронномикроскопичесхих фиксаторов для исследований структуры поверхности микроорганизмов. УГстисы докладов Всесоюзного совещания по хемилюминесценции, Запорожье, 1976, С. 35-36.

5. Лебедев B.C., Цибанова И.В. Исследование хемилюминесценции, сопровождающей окисление аминокислот перманганатом калия в водном растворе. \Журнал физической химии, 1977, № 6, С. 1392-1395.

6. Лебедев B.C., Цибанова И.В. Исследование кинетики хемилюминесценции аспара-гиновой кислоты под действием перманганата калия в водном растворе при 20 С. Журнал физической химии, 1977, Ks 9, С. 2230-2233.

7. ВеселовскиЙ В.А., Лебедев B.C. Хемилюминссцениия бактерий иод действием КМп04. Научные доклады высшей школы, биологические науки, 1978, №12, С. 4448,

8. ВеселовскиЙ В.А., Лебедев B.C. О взаимосвязи между индуцированной КМп04 хе-милюминесценцией бактериальных клеток и их физиологическим состоянием. \Тезясы докладов Укр. республ. конференции "Применение радиоэлектроники в исследовании сверхслабых свечений биологических объектов". 1978, С. 120-122.

9. Veselova T.V., Veselovski V.A., Lebedev V.S., Marencov V.S. Chemiluminescent probe studied of ioninduced conformachional changes of in vivo surface proteins in bacteria. Untemacbional conference on water and ions in biological sistems. Absracts. Bucharest, Romania, June 25-27 1980, P. 137.

10. Veselova T.V., Veselovski V.A., Lebedev V.S., Marencov V.S. Chemiluminescent probe studied of ion-induced conformachional changes of in vjvo surface proteins in bacteria. \Studia biophysica, 1981, No.3, P. 209-210.

11. Лебедев B.C., Кулаховсхая Л .И., Федоров Ю.И. Изучение проницаемости Е. coli в стрессовых ситуациях методом хемилюминесцентного зонда. УГезисы докладов стендовых сообш. I Всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982, Т. 1, С. 202.

12. Федоров Ю.И., Володина Л.А., Кузовникова Т.А., Лебедев B.C. Изучение факторов антимикробной активности высокодисперсных металлических порошков. УГезисы докладов стендовых сообщ. I Всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982, Т.З.С.57.

13. Лебедев B.C. Особенности взаимодействия тяжелых металлов (серебра, ртути и меди) с поверхностью кишечной палочки. \Тезисы докладов республ. конф. "Ферменты, металлы, металлоферменты в диагностике и лечении". 19-21 октября 1982 г. 1982, С. 124.

14. Федоров Ю.И., Володина Л.А., Кузовникова Т.А., Лебедев B.C. Сравнительное изучение влияния металлов Ag, Си, Zn, Al в виде высокодисиерсного порошка и соли на рост Escherichia coli. \Известия АН СССР, серия биологическая, 1983, № 6, С. 948950.

15. Федоров Ю.И., Ильченко Л.Н., Лебедев B.C. Сравнительное изучение кинетики растворения массивного образца и высокодисперсного порошка меди в воде. \Хнмическая физика, 1983, № б, С. 833-837.

16. Федоров Ю.И., Володина Л.А., Кузовникова Т.А., Лебедев B.C. О механизме влияния высокодисперсного порошка меди на энергетические процессы у Е. coli В. \Известия АН СССР, серия биологическая, 1984, № 1, С. 153-156.

17. Лебедев B.C., Корнев А.П., Федоров Ю.И. О взаимодействии флуоресцентного зонда 1-анилино-8-нафталенсульфоната с интактной культурой Escherichia coli. УГезисы докладов 16-ой конференции ФЕВО, Москва, 1984, С. 355.

18. Лебедев B.C., Корнев А.П., Федоров Ю.И. Взаимосвязь электрокинетического потенциала и флюоресценции 1 -анилино-8-нафталенсульфоната в истощенной и неистощенной культуре Escherichia coli. \Биофизика, 1984, > 6, С. 1001-1004.

19. Лебедев B.C., Кузовникова ТА. Федоров Ю.И. Исследование закономерностей си-нергидного действия солей тяжелых металлов (Си, Ag) и лекарственных препаратов. \Доклады АН СССР, 1984, № 2, С. 491-4Н

20. Lebedev V.S., Komev А.Р., Fedoiov Yu. I. Microelectroohoretic study of copper ions binding with Escherichia coli cells. \In: Prec. of the Ferst Joint soviet - w. gemani int. symp. on microscope photon etry and acoustic microscopy in science, Moscow, 1985. 1985, P. 211-215.

21. Лебедев B.C. Особенности действия тяжелых металлов на мембрану Escherichia coli. Шзвестия АН СССР, серия биологическая, 1986, №3, С. 370-377.

22. Лебедев B.C., Озрина Р.Д., Кулаковская Л.И., Федоров Ю.И. Может ли хемиломи-несцептный зонд (KUnOi) проникать через клеточную мембрану с помощью систем транспорта неорганического фосфата? SB сб. "Теоретические и методические основы биохемилюминесценции", М., Наука, 1986, С. 120-123.

23. Кузовникова Т.А., Федоров Ю.И., Лебедев B.C. Чувствительность к высокоднсперс-ному порошку меди мутантов Escherichia coli В, резистентных к CuCh. Шзвестия АН СССР, серия биологическая, 1987, №2, С. 286-289.

24. Лебедев B.C., Кузовникова Т.А., Корнев АЛ., Федоров Ю.И. Закономерности индуцированного медью транспорта стрептомицина в Escherichia coli. \Биофизнка. 1987, Т.32, № 4, С. 638-641.

25. Лебедев B.C., Кузовникова Т.А., Федоров Ю.И. Основные закономерности синер-гидного действия тяжелых металлов и лекарственных препаратов. \В сб. "Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней" (отв. ред. Воляиский ЮЛ.), Харьков, ХНИИМВС, 1987. 1987, С. 174-175.

26. Лебедев B.C. Усиление антимикробной активности катионкых лекарственных препаратов тяжелыми металлами. Модельные исследования индуцированного медью транспорта катионов в бактерии, всесоюзный семинар "Современные проблемы антибиотикорезистентности", М., 1988 г., С. 18-19.

27. Лебедев B.C., Корнев А.П., Федоров ЮЛ. Влияние поверхностного в мембранного потенциала иа связывание 1 -анилин о-8-нафталенсульфоната с мембраной £ coli. \Биофизика, 1988, Т.ЗЗ, № 5, С. 800-803.

28. Lebedev V.S., Fedorov Yu.I. Elecrophysical model of Cu2+-induced uptake of cations in bacteria. Wl-th Jena Symposium on Bioph. Chem.: Trends in bioelectrochemisry of biopolimers and membranes. Sept 19-24,1988, Weimar/ GDR. Abstr. 1988, C. 73.

29. Лебедев B.C. Особенности токсического действия высокодисперсного порошка меди на энергетические процессы у Escherichia coli В. Шзвесткя АН СССР, серия биологическая, 1989, № 1, С. 151-155.

30. Лебедев B.C. Индуцированный медью обмен катионов в бактериях Escherichia coli. Журнал физической химии, 1989, Т.63, № 2, С. 459-466.

31. Лебедев B.C., Корнев А.П., Федоров Ю.И. Измерение плотности заряда на внутренней стороне цитоплазмвтической мембраны Escherichia call. \Биологические мембраны, 1989, Т.6, №6, С. 625-628.

32. Лебедев B.C., Володина ЛА., Федоров Ю.И. Роль поверхностного и трансмембранного потенциалов в связывании меди клетками Escherichia coli. \Известия АН СССР, серия биологическая, 1989, №3, С. 435-441.

33. Лебедев B.C. Основные характеристики Си2+-иидуцированной проводимости мембраны Escherichia coli для ионов. \Регуляция микробного метболизма. Тезисы докладов Всесоюзной конф. Пущино, 1989 г. 1989, С. 101-102.

34. Лебедев B.C., ВеселовскиЙ A.B., Дейнега Е.Ю., Савпук О.С., Федоров Ю.И. Роль травсмембранного потенциала в Си"*-индуцированной проводимости мембраны Escherichia coli. \Регуляция микробного метболизма. Тезисы докладов Всесоюзной конф. Пущино, 1989 г. 1989, С. 102.

35. Лебедев B.C., ВеселовскиЙ A.B., Федоров Ю.И. Автоиндуцированный транспорт меди в Escherichia coli. \Регуляция микробного метболизма. Тезисы докладов Всесоюзной конф. Пущино, 1989 г. 1989, С. 92-93. ,

36. Лебедев B.C. Анализ доннановского и осмотического рапнопссия в Escherichia coli при индупированном CuCh плазмолизе бактерий. \Журнал физической химии, 1989, Т.63,№6, С. 1557-1562.

37. Лебедев B.C., ВеселовскиЙ A.B., Федоров Ю.И. Влияние CuCh на утечку неорганического фосфата из Escherichia coli. \Известия АН СССР, серия биологическая,

1989, №6, С. 934-936.

38. Лебедев B.C., Дейнега Е.Ю., Савлук О.С., Федоров Ю.И. Роль трансмембранного потенциала в Ci/"-индуцированном нарушении барьерных свойств цитоплазмати-ческой мембраны Escherichia coli. \Биологические мембраны, 1989, Т.6, № 12, С. 1313-1316.

39. Лебедев B.C., Володина Л.А., Федоров Ю.И. Медь-зависимое накопление магния в Escherichia coli. \Известия АН СССР, серия биологическая, 1990, № 4, С. 635-638.

40. Лебеаев B.C., ВеселовскиЙ A.B., Федоров Ю.И. Роль кислорода в ингибировании дыхания Escherichia coli ионами меди. Шзвестия АН CCCR, серия биологическая,

1990, №5, С. 782-785.

41. Володина Л.А., Лебедев B.C. ЭПР-исследование мест связывания меди при CuJ+-индуцйрованном повреждении мембраны Escherichia coli. \ VIII Всесоюзная конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород. Май 1990 г. 1990, С. 125.

42. Лебедев B.C., Володина Л.А,, Федоров Ю.И. Аипяиз мест спязмшшия меди с ин-тактными и модифицированным N-этилмалеимидом бактериями Escherichia coli методом ЭПР. \Биофизика, 1991, Т.36,Xsl,С. 91-96.

43. Лебедев B.C., ВеселовскиЙ A.B., Федоров Ю.И. О первичном механизме токсического действия меди нп мембрппу Escherichia coli. биологические мембрпны, 1991. Т.8, №3, С. 261-265.

44. Лебедев B.C., Володина Л.А. Люминесцентный анализ структурных изменений в мембране Е. coli под действием меди. \ IV Всесоюзное совещание "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратное обеспечение". Тез. докл. Честь П. Май 1992 г. 1992, С. 4

45. ВеселовскиЙ A.B., Лебедев B.C. Выживаемость бактерий Escherichia coli в присутствии различных количеств ионов Си2* в среде. \ 2 Международный симпозиум

Механизмм ясйстви» саерхмалых доз". Тезисы. 23-26 ми 1995 г. Москпа. 1995, С. 90-91.

46. Володина ЛА., Бур&ев Д.Ш-. Мороз И.А., Лебедев B.C. Исследование методом электронного парамагнитного резонанс! центров меди в местах ее сильного связывания с цитоолазматической мембраной бактерий Escherichia coli. \Биофизика, 1996, Т.41,№5, С. 1075-1081.

47. Лебедева B.C., Дейнега Е.Ю., Кузовнивовой Т.А., Федорова Ю.И. Характеристика Си - индуцкровашю£ проницаемости питоплазматической мембраны Escherichia coli. \Биофизюса, 1997. (в печати).

48. Лебедев B.C. Весел оккий A.B., Дейнега Е.Ю., Федоров Ю.И. Восстанавливающие центры на поверхности бактерий Escherichia coli и их роль в медь-индуцированной проницаемости плазмггическоё мембраны. \Бнофизика, 1997, (в печати).

-70-

С пн сок сокращений

АК- аскорбиновая кислота ТХУ- тетрахлоруксусная кислота

АКР- акрифлавин ХЛ- хемилюминесценция

ЛФК- активные формы кислорода ЦПМ • цитоштзмптичеекпя мембрп-на вдп- высокодисперсный порошок ЭДТА - Эгилендиаминтетраацетат им - циешняя мембране ЭРМ- эритромицин вэ- восстановительные эквиваленты ЭПР- электронный парамагнитный резонанс

П'М - грамицидин С днк- дезоксирибонуклеиновш) кислота

АИФ = 2,<1*Аййптр<1феп<»л асег- КярГнтштиниид^М' хлорофенилгилразон дтп- 2Д'-дитиопиридин Сир"- устойчивые к меди мутанты бактерий лим. певомицошня суицтт! Я11, АII ' мышиные параметры параллельной СТС сигнала ЭПР

НЕО- неомнпин УЕМ- И-этилмалеимид пол - псрекисное окмслсиис лштдоп иоортмимсскиП фосфя| пэв- перенос энергии возбуждения ТРР- тетрафенилфосфоний

СОД- супероксиддисмугаза ук- скорость утечки К* из клеток

СТР- стрептомицин стс- сверхтонкая структура сигнала ЭПР тм- тяжелые металлы

ТРЦ- тетрапиклин гидрохлорид Дпериплазмы

Трис - Трис(гидроксиметил)метал-амин т - время индукции проводящего состояния мембраны

Заключение

Хорошо известно, что медь обладает широким спектром действия и токсична для микроорганизмов различных таксономических групп. Установлено, что токсичность этого металла имеет неспецифический характер и может быть следствием повреждения генетического аппарата, нарушения процессов биосинтеза и/или структурно-функциональных изменений клеточных мембран. В то же время большинство из зарегистрированных функциональных изменений в опытах на целых клетках необязательно связано с прямым действием меди на соответствующие структуры, поскольку характерны для широкого круга повреждающих воздействий и могут быть следствием развитая -патологического процесса и реакции клетки как целого в ответ на первичное повреждение (Владимиров, 1975). Важность установления первичных механизмов повреждающего действия и определения роли первичного повреждения в развитии патологического процесса на клеточном уровне в настоящее время общепризнанна независимо от природы воздействия. Вместе с тем накопленный в этой области исследований опыт показывает, что в цепи функциональных изменений, выявленных при повреждении клеток, часто трудно установить какие из них являются определяющими в развитии патологического процесса или, иначе говоря, какие из них являются причиной, а какие — следствием. В настоящей работе, чтобы избежать неопределенностей такого рода, был проведен поиск обратимых изменений в бактериальных клетках при действии на них малых доз тяжелых металлов (суббакгериостатические концентрации), устойчиво влияющих на чувствительность бактерий к другим соединениям внешней среды. Такой подход позволил выявить наиболее фундаментальные изменения свойств бактериальных клеток при контакте с металлом на уровне взаимодействия с внешней средой и послужил отправной точкой для достижения поставленной цели.

В работе представлены исчерпывающие доказательства того, что центральным событием в развитии патологического процесса является индукция медью гидрофильных каналов проводимости в цитоплазматической мембране при взаимодействии с мишенями, расположенными на ее внешней поверхности. Ключевая роль этих каналов непосредственно вытекает из их свойств. Большой эффективный диаметр каналов (-1 нм) открывает принципиальный путь для поступления в цитоплазму из среды инкубации различных соединений с молекулярной массой до 600 — 800 единиц. На практике далеко ве все соединения с подходящей молекулярной массой способны проникать в цитоплазму. Клетка эффективно селектирует их по электрическому заряду, пропуская через каналы преимущественно катионы. В настоящее время мы не знаем обладают ли селективными свойствами медь-иидуцированные каналы, однако не вызывает сомнения, что профиль электрического потенциала на внешних структурах клетки и доинановские свойства периплазмы представляют собой мощный фактор селекции катионов на пути из внешней среды в цитоплазму. В итоге индукция каналов проводимости под действием меди приводит к эффективному транспорту в цитоплазму различных катионов из периплазмы и внешней среды по градиенту электрического потенциала и концентрации. Электронейтральность цитоплазмы при этом поддерживается встречным потоком ионов 1С. Согласно нашим данным именно таким путем осуществляется автоиндуциро ванный транспорт меди в цитоплазму к новым мишеням действия, переводя тем самым развитие патологического процесса на качественно новый уровень. Аналогичная причина лежит и в основе обнаруженного нами увеличения чувствительности бактерии к кати-онным формам лекарственных препаратов под действием меди.

Другое важное свойство медь-индупмропаииых кинплоп — их лишшичеека« природа. При действии ионов Си'' на клетки каналы открываются, но находятся в этом состоянии ограниченное время. Необходимое условие поддержания их в открытом состоянии наличие определенной концентрации меди во внешней среде. Если в процессе индуцированного обмена катионами концентрация меди в среде падает ниже некоторого критического уровня (независимо от того, каким путем это произошло: введением ком-плексона в среду инкубации или в результате автоиндуцированного транспорта меди в цитоплазму), каналы переходят в закрытое состояние. Если же начальная концентрация меди в среде выбрана достаточно высокой и не могла сильно измениться в процессе индуцированного обмена, каналы все равно закрывались после завершения активной фазы обмена, когда связанное с обменом сжатие клеток прекращалось. Механическим аналогом такого поведения канала может быть подпружиненный клапан, разделяющий два сосуда. Когда давление на клапан газа или жидкости превышает давление пружины, канал открывается, а после выравнивания давлений в сосудах пружина возвращает клапан на место. Истинная природа медь-нндуцированных проводящих путей в настоящее время неизвестна, однако легкость, с которой канал в различных ситуациях возвращается в непроводящее состояние, плохо ассоциируется с понятием "повреждение мембраны". В любом случае медь-индуцированная проводимость мембраны не может служить непосредственной причиной гибели клеток под действием меди. Скорее всего она выполняет роль спускового механизма, обеспечивающего доступ к чувствительным мишеням в цитоплазме для меди и других токсических соединений внешней среды.

В результате проведенных исследований установлено, что в обычных условиях на внешней поверхности цитоплазматической мембраны имеется два типа мишеней, взаимодействие которых с медью приводит в конечном итоге к активации каналов проводимости в мембране. Мишени первого типа представляют собой тиолсодсржшцис центры сильного связывания меди на клеточной поверхности. На этих центрах происходит восстановление ионов Си2* до Си и формируется пул прочносвязанной меди. Важно отметить, что восстанавливающая способность этих центров зависит от уровня эндогенных энергетических ресурсов и в свежесобранных бактериях многократно превосходит реальный уровень клеточных тиолов. Такое свойство предполагает постоянный энергозависимый приток восстановительных эквивалентов с внутренней стороны мембраны на внешние восстанавливающие центры и обеспечивает постоянный приток свободных ионов Си* в периплазму после заполнения сильносвязываюших мест. С точки зрения индукции проводящего состояния мембраны основная функция мишеней 1 типа обеспечивать постоянный приток в периплазму ионов Си*, взаимодействие которых с мишенями 2 типа и приводит в конечном итоге к открытию медь-индуцированных каналов. Мишени 2 типа не чувствительны к катионам Си2*, но взаимодействуют с Си* и А%*. С учетом данных флюоресцентных исследований представляется весьма вероятным, что эти мишени поддерживаются клеткой в окисленном состоянии и содержат в активном центре дитиольные связи, разрыв которых при взаимодействии с Си* или Ag* активирует каналы в мембране. Возвращаясь к механическому аналогу медь-индуцированного канала — подпружиненному клапану, роль возвратной пружины в клетках могла бы играть система окисления тиолов в мишенях 2 типа после их восстановления при взаимодействии с ионами Си*.

В рамках предложенной физико-химической модели активации и инактивации кшшлл представляется весьма вероятной возможность управления его состоянием самой клеткой путем переноса восстановительных эквивалентов в нужном направлении. Конечно, на основании полученных нами данных нельзя с уверенностью утверждать, что медь и серебро активируют природные каналы в мембране бик герий. Однако, такое предположение кажется нам предпочтительным. Во всяком случае оно не противоречит представлениям о том, что редокс-взаимодействия важны как в обеспечении функционирования природных ионных каналов, так и в их регуляции лигандами (Маринов и др., 1992). Более того, потенциальные участники предполагаемой нами системы редокс-контроля проводимости канала недавно генетически идентифицированы (Bardwell et al., 1993; Dailey, Berg, 1993). В бактериях Е. coli это прежде всего периплазматический — DsbA и мембранный белок DsbB, катализирующие образование внутри- и межбелковых дисульфндных связей, стабилизирующих конформацию белков клеточной поверхности. Первый из них чрезвычайно реактивен и действует in vivo как дисульфндоксида-за, а второй необходим для реокисления DsbA.

Идентифицированы также еще два белка, принимающие участие в редокс-превращениях белков клеточной поверхности. DsbC — периплазматический белок, активность которого связывают с реорганизацией дисульфндных связей в периллазмати-ческом пространстве (в определенных условиях этот белок может замещать функция DsbA) (Bardwell, 1994; Sone et al., 1997) и DsbD (DsbZ) — мембранный белок, обладающий свойствами тиоредоксинредукгазы, работающей в периплазматическом пространстве, и поставляющий восстановительные эквиваленты, необходимые, как полагают (Missiakas et al., 1995; Rietsch et «1., 1996), для работы DsbC и поддержания определенных редокс-условий в периплазме бактерий. Важно отметить, что в интактных клетках белки типа DsbD скорее всего не могут непосредственно восстанавливать DsbA (Loferer et al., 1995) и нарушать тем самым работу последнего. Однако, отмеченные выше свойства этого белка позволяют рассматривать его в качестве реального кандидата ни tt tututttt Си'4 а игрмилмчме ftntHoiwtt, tt omita ичередк ионы Cu1 могут нарушить систему поддержания критических тиолов клеточной поверхности в окисленном состоянии либо путем прямого их восстановления, либо опосредованно через восстановление DsbA. Способность внешних восстановителей обращать оксидаз-ную активность DsbA в модельных опытах легко достижима (Kishigami et al., 1995).

Предложенная модель не дает полной картины развития патологического процесса в клетке, акцентируй внимание только на его начальной стадии. Вместе с тем она обладает несомненными достоинствами, вскрывая истинные причины энергозависимого накопления и токсичности меди. В ее рамках находят естественное объяснение экспериментальные факты, наблюдавшиеся другими исследователями при изучении отдельных сторон токсического действия ионов Си2* на бактерии, такие как снижение эффективности накопления меди с увеличением плотности клеток в суспензии (Baldry, Dean, 1980), зависимость размеров медь-ивдуцированной утечки катионов К* из бактерий от ионного состава среды инкубации (Cabial, 1989), увеличение токсичности меди в анаэробных условиях (McBrien, Hassel, 1967; Schleiler et al., 1985). И, наконец, выявленные нами первичные механизмы токсического действия меди на бактерии хорошо согласуются с обширным экспериментальным материалом, представленным в настоящей работе.

Проведенные исследования установили тесную взаимосвязь между эффективностью повреждения бактерий медью и свойствами внешней среды и в ряде случаев позволяют прогнозировать по крайней мере направление изменения токсичности, например при изменении окислительно-восстановительного потенциала среды или при комбинированном действии на микроорганизмы меди с другими токсичными соединениями кати-онной природы. Этим открываются перспективы использования развиваемых в работе положений в прогнозировании отрицательных последствий комбинированного антропогенного загрязнения среды с участием тяжелых металлов. Другая возможная область применения результатов работы — направленный поиск новых эффективных средств для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, основанных на комбинаций лекарственных препаратов с тяжелыми металлами.